KR20200099174A - 신선한 조류의 연속 단계 가공 방법 - Google Patents
신선한 조류의 연속 단계 가공 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 조류에 삼투압 충격을 가하는 단계 및 파괴된 조류를 세포벽 분해 효소를 포함하는 효소 조성물로 처리하는 단계에 의해 주위 온도에서 신선한 조류를 가공하는 방법에 관한 것이다. 이러한 주위 온도에서의 온화한 과정은 우수한 용해도, 또한 염의 존재에서 우수한 발포, 유화 및 물 결합 특성을 갖는 조류 단백질의 단리를 허용한다. 또 다른 장점은 단백질 단리에 이어서 높은 수율의 청정한 바이오가스 및 혐기성 소화에서 미네랄 농후 물 스트림을 생성하기 위해 탄수화물 분해 효소를 사용한 잔류 바이오매스가 처리될 수 있으므로, 이러한 단백질 단리 방법이 연속 단계의 바이오정제를 허용한다는 것이다.
Description
본 발명은 조류 단백질 및 바이오가스를 회수하기 위한 조류 가공 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 가공에 의해 회수된 단백질에 관한 것이다.
조류는 다당류, 단백질, 광물 및 오일의 가치 있는 공급원이다. 이러한 가치 있는 성분을 조류로부터 분리하기 위해, 조류는 가공될 필요가 있다. 담수 조류는 수확되고 현지에서 가공될 수 있다. 이른바 해초인 해수 조류의 경우, 수확 및 가공이 별도의 위치에서 일어난다. 해초는 연안에서 수확되고, 본토로 수송된 다음 내륙에서 가공된다. 가공이 시작될 때마다, 해초의 분해 또는 열화가 시작된다. 결과적으로, 조류는 집중적인 가공 또는 상당한 양의 항미생물 보존제 사용 후가 아닌 경우, 식품, 제약 또는 화장품 응용분야에 더 이상 사용될 수 없다. 또한, 조류를 내륙으로 가져 오는 동안 많은 물이 수송되는데, 이는 매우 무겁고 비용이 많이 든다.
대안으로, 조류는 연안에서 수확되고, 가공 전에 저장 또는 보존 수명을 연장시키기 위해 또한 연안에서 보존된다. 이후 보존된 해초는 추가의 가공을 위해 내륙으로 수송된다. 이는 많은 물의 수송을 피하지만, 단백질과 같은 조류 성분의 손상을 피하지는 못한다. 보존은 흔히 건조 또는 냉동 형태이다. Vilg & Undeland (2017) J. Appl. Phycol. 29:585는 냉동된 또는 동결 건조된 해초로부터의 단백질 추출을 설명한다. Postma et al J Appl Phycol (2018) 30:1281은 건조된 해초로부터의 상이한 단백질 추출 방법의 연구이다. Maehre et al. 2016 Mar. drugs 14:196은 건조된 해초로부터의 최적화된 알칼리성 단백질 추출을 설명한다. Harnedy & FitzGerald 2013 Food Sci technol 51:375는 오븐 건조된 팔마리아 팔메이트(Palmaria palmate)로부터의 또 다른 최적화된 알칼리성 단백질 추출을 설명한다. 보존, 특히 해초 건조에 사용되는 열은 단백질 변형 또는 변성을 초래하여 기능성 및 관련된 유용물을 감소시킬 수 있다. 또한, 다량의 습윤 조류 바이오매스를 건조시키기 위한 가열은 상당한 양의 (비용이 많이 드는) 에너지를 필요로 한다. 또 다른 단점은 보존제가 전형적으로 조류 바이오매스에 첨가된다는 것이다. 이러한 보존제는 최종 식품 제품에 남을 수 있거나 산 (주입(ensiling)) 처리의 경우에 조류 성분을 파괴할 것이고, 이는 바람직하지 않다.
양질의 기능성이고 전형적으로 온전한 단백질 생성물을 산출하는, 더욱 효율적이고 더욱 경제적이며 더욱 온화한 해초 가공 방법을 갖는 것이 바람직할 것이고 이는 식품 응용분야에서 사용될 수 있고 단백질 단리 후 잔여하는 바이오매스로부터 추가의 유용물 추출을 가능하게 한다.
도 1
수확 및 세척 유닛 2; 효소 소화를 위한 가공 유닛 3, 단백질의 단리 및 농축을 위한 회수 유닛 4, 혐기성 소화 가공 유닛 6, 6으로부터의 생성물의 회수를 위한 회수 유닛 7 및 회수 유닛 4 또는 7로부터의 생성물 8의 제형화를 위한 제형화 유닛 5를 포함하는 본 발명에 따른 장치의 한 구체예.
발명의 상세한 설명
한 양태에서, 본 발명은 조류 가공 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 (i) 조류에 삼투압 충격을 가하는 단계; (ii) 충격받은 조류를 세포벽 분해 효소를 포함하는 효소 조성물로 처리하는 단계; (iii) 효소 처리된 조류를 고체상 및 액체상으로 분리하는 단계를 포함하고, 여기서 조류의 효소 처리는 수확 후 세 시간 이내에 시작되고 단계 (i) 내지 단계 (iii)의 온도는 4 내지 30 ℃의 범위이다.
통상적인 산업에서, 수확 및 가공이 여러 장소에서 일어나는 경우, 바이오매스는 전형적으로 수확 장소로부터 가공 장소로 수송된다. 본 발명에 따른 방법에서, 수확된 바이오매스를 가공 장소로 가지고 가는 대신, 가공 플랜트를 바이오매스를 가능한 한 신선하게 가공하기 위하여 바이오매스를 수확하는 장소로 옮겨, 성분의 최고의 기능성 가치를 산출한다. 본 발명에 따른 방법에서, 조류는 수확 장소에서 또는 매우 가까운 곳에서 가공된다. 이는 조류가 주요 가공 장소 이외의 다른 장소, 예를 들어 전형적으로, 해초 또는 대형조류로도 지칭되는 해조류의 사례인 연안에서 수확되는 경우에 특히 유리하다. 본 발명의 공정을 사용하면, 가공이 시작되기 전에 조류가 분해되거나 열화될 가능성이 거의 없다. 예를 들어 해초를 가공 플랜트로 가져오기 위한 물 수송(해초는 90% w/w 초과의 물로 구성됨)의 고비용이 또한 회피된다. 그러므로, 조류로부터 수득된 단백질은 기능적 특성, 예를 들어 우수한 용해도를 나타내는 우수한 품질의 것이며, 더욱 경제적으로 생성될 수 있고 식품 응용분야에 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 방법의 또 다른 장점은 단백질의 추출 후, 잔여하는 바이오매스가 추가의 유용물 추출을 위해 사용될 수 있다는 것이다. 예를 들어, 바이오매스는 바이오가스의 생성 또는 광물의 회수에 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 한 구체예에서, 단백질의 추출 후 잔여하는 바이오매스는 당을 방출시키기 위해 카르보하이드레이스 효소 혼합물에 노출된다. 이후 탄수화물이 농후한 가수분해된 바이오매스는 혐기성 소화조에 공급되어 바이오가스 및 미네랄이 농후한 물 스트림을 생성한다. 후자는 비료 조성물로서 또는 비료 조성물 중에서 사용될 수 있으며, 이 또한 본 발명의 일부이다. 이러한 탄수화물 농후 분획으로부터 예를 들어 당, 알기네이트, 카라기난 및 후코이단과 같은 다른 식품 성분이 또한 회수될 수 있다.
비록 상기 방법이 해조류 가공에 매우 유리하기는 하지만, 상기 방법은 해안 또는 연안에서 임의의 유형의 조류 가공에 사용될 수 있다. 한 구체예에서, 상기 방법은 조류, 특히 해초 또는 대형조류를 단백질로 연안 가공하기 위해 사용되고, 단백질 회수 후 잔여하는 조류 바이오매스로부터 바이오가스 또는 비료 조성물을 추가로 생성하는 것이 임의로 이어진다. 용어 "바이오가스"는 바이오매스의 혐기성 소화 또는 혐기성 발효의 생성물을 지칭한다. 바이오가스는 주로 메탄 및 이산화탄소를 포함하며 소량의 황화수소, 수분 및 실록산을 가질 수 있다.
본 발명의 방법은 바이오매스의 즉각적인 가공을 허용하기 때문에, 가공 장소 및 수확 장소가 멀리 떨어진 상황에서, 조류와 같은 바이오매스 수확 시 특히 유리하다. 가공은 전형적으로 조류가 공기 또는 산소에 노출되는 시간을, 예컨대 수확으로부터 30 분 이내, 60 분 이내, 90 분 이내, 2 시간 이내, 2.5 시간 이내 또는 3 시간 이내로 최소화하기 위하여 신속하게 시작된다.
본 맥락에서 용어 "가공"은 세포벽 분해 효소를 사용한 조류 세포의 파괴 또는 조류 바이오매스의 처리를 포함하는 과정을 지칭한다. 세포의 추가의 파괴 없이 또는 효소 처리 없이 조류 바이오매스를 단지 건조하는 것은 가공의 시작으로 간주되지 않는다.
본 발명의 맥락에서, "연안"은 바다, 대양, 강어귀, 강 또는 호수, 해안 또는 강둑과 같은 해양 또는 담수 위치를 지칭한다. 한 구체예에서, 해양 또는 담수 위치는 해변, 해안 또는 강둑으로부터 적어도 1 km 떨어져 있고, 예컨대 해변, 해안 또는 강둑으로부터 1 내지 200 km, 1 내지 50 km 또는 50 내지 200 km 떨어져 있다. 연안은 육상의 연못 또는 수로를 지칭하지 않는다.
가공 동안의 온도가 30 ℃를 결코 초과하지 않고 바람직하게는 4 내지 30 ℃ 5 내지 25 ℃ 또는 15 내지 25 ℃이므로, 조류로부터 단리된 단백질은 변형 도는 변성을 거치지 않고 예를 들어 용해도와 같은 기능적 특성을 유지한다. 본 발명에 따른 방법을 사용하여, 건조 또는 농축된 액체 조류 단백질을 수득할 수 있다.
신선한 조류가 본 발명에 따른 방법에서 사용된다. 본 발명의 맥락에서, "신선한 조류"는 건조 및 냉동과 같은 추가의 가공이 없는 수확한 그대로의 조류를 지칭한다. 그러므로 용어 "신선한 조류"는 건조, 분말, 재수화, 냉동, 주입 또는 해동 조류를 포함하지 않는다. 신선한 조류는 전형적으로 80 내지 95% w/w 범위의 수분 함량을 갖는다. 신선하게 수확된 조류는 네 시간 미만 전에, 예컨대 세 시간 전, 두 시간 전 또는 한 시간 전에 수확된다.
조류 이외에도, 수확물은 바람직하게는 조류 가공 전에 제거되는 작은 해양 생물 또는 다른 고체, 예컨대 플라스틱을 포함할 수 있다. 조류는 수확에서 해양 생물의 86% 내지 100% w/w를 구성할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 조류는 수확에서 해양 생물의 90% 내지 100% w/w 또는 99% 내지 100% w/w를 구성한다. 수확은 호수, 강 또는 바다, 강어귀 또는 대양과 같은 해양 또는 담수 위치로부터 조류를 회수하는 것과 같이, 주변의 물로부터 조류를 분리하는 것을 지칭한다. 조류는 임의의 적합한 수단에 의해, 예를 들어 자유 부유 조류를 수집하거나 조류를 파종하여 재배한 그물 및 로프로부터 조류 바이오매스를 절단하거나 벗겨내어 수확될 수 있다. 한 구체예에서, 조류 또는 해초는 재배 로프에 파종된다. 이후 수확은 로프로부터 조류 또는 해초를 벗겨내는 것을 포함한다.
해양 또는 담수 위치에서 조류를 수확한지 30 분 내지 두 시간 또는 세 시간 이내에, 조류는 삼투압 충격을 받고 이는 조류의 파괴 및 세포 내용물의 해방을 유발한다. 삼투압 충격은 세포 내용물을 부분적으로 또는 완전히 해방시킬 수 있다. 삼투압 충격은 모든 조류 세포 또는 조류 세포의 일부, 예를 들어 적어도 50%, 적어도 60% 또는 적어도 75%의 조류 세포를 파괴할 수 있다. 삼투압 충격은 임의의 적합한 수단에 의해, 예컨대 온도가 30 ℃를 절대 초과하지 않는 한 물을 사용하여 수행될 수 있다. 삼투압 충격 동안의 온도는 바람직하게는 4 내지 30 ℃ 5 내지 25 ℃ 또는 15 내지 25 ℃이다. 한 구체예에서, 탈염수가 해초에 삼투압 충격을 주기 위해 사용된다. 탈염수는 바람직하게는 습윤 조류의 중량을 기준으로 1:1 내지 1:10의 조류:물의 비율로 사용된다. 삼투압 충격 처리는 전형적으로 5 내지 60 분, 바람직하게는 5 내지 20 분 동안 지속된다.
조류가 삼투압 충격을 받기 전에, 조류는 절단 또는 슬라이싱에 의해 또는 블렌더 또는 절단기에 넣어져 작은 조각이 될 수 있다. 한 구체예에서, 조류는 탈염수에서 작은 조각이 되는데, 이는 조류가 삼투압 충격을 받는 동안 작은 조각이 됨을 의미한다.
수확 직후 또는 거의 직후, 삼투압 충격을 받기 전에, 조류는 물고기, 갑각류 및 게와 같은 작은 해양 생물을 제거하고, 플라스틱, 유목 또는 부표와 같은 잔해물을 제거하기 위해 세척될 수 있다. 세척을 위해, 예를 들어 4 내지 30 ℃의 온도의 과량의 해수가 사용될 수 있다.
수확 직후 또는 거의 직후, 삼투압 충격을 받기 전에, 부착된 해수가 제거될 수 있다. 부착된 해수는 조류를 손상시키기 않기 위해 저속 원심분리에 의해 제거될 수 있다. 한 구체예에서, 부착된 해수는 100-500 rpm, 바람직하게는 100 내지 200 rpm 또는 200-300 rpm에서 원심분리에 의해 제거된다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "조류"는 단세포 또는 다세포 광합성 진핵성 비혈관 수생 유기체의 군을 지칭하며, 이는 해수, 염수 또는 담수에 살고 농업, 화장품 산업, 식품 또는 사료 산업 또는 제약 산업에서 사용되는 다양한 생물활성 화합물을 함유한다. 특히 해초에는 항미생물, 항산화 또는 항바이러스 활성을 나타내는 다당류가 풍부하다. 해초는 단백질, 비타민, 포자 성분, 폴리페놀, 요오드, 알긴산 및 유도체, 카라기난, 클로로필, 카로테노이드 및 한천과 같은 가치 있는 분자를 함유한다. 본 발명에 따른 방법은 조류, 특히 해초 또는 대형조류로도 지칭되는 해조류, 예컨대 홍조류 (로도피타(Rhodophyta), 녹조류 (클로로피타(Chlorophyta)) 및 갈조류 (오크로피타(Ochrophyta), 파에오피세아에(Phaeophyceae))를 가공하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 방법에서 사용될 수 있는 조류는 알라리아(Alaria) 종, 아스코필룸(Ascophyllum) 종, 카울레르파(Caulerpa) 종, 콘드루스(Chondrus) 종, 두르필라에아(Durvillaea) 종, 엔테로모르파(Enteromorpha) 종, 푸쿠스(Fucus) 종, 그라실라리아(Gracilaria) 종, 라미나라(Laminara) 종, 펠베티아(Pelvetia) 종, 피로피아(Pyropia) 종, 포르피라(Porphyra) 종, 사르가숨(Sargassum) 종, 사카리나(Saccharina) 종, 울바(Ulva) 종 및 운다리아(Undaria) 종을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 특히 관심있는 것은 아스코필룸 노도숨(Ascophyllum nodosum), 콘드루스 크리스푸스(Chondrus crispus), 엔테로모르파 인테스티날리스(Enteromorpha intestinalis), 푸쿠스 스피랄리스(Fucus spiralis), 푸쿠스 베시쿨로수스(Fucus vesiculosus), 그라실라리아 부르사-파스토리스(Gracilaria bursa-pastoris), 그라실라리아 크라사(Gracilaria crassa), 그라실라리아 두라(Gracilaria dura), 그라실라리아 롱가(Gracilaria longa), 그라실라리아 베루코사(Gracilaria verrucosa), 라미나리아 디지타타(Laminaria digitata), 라미나리아 오크롤레우카(Laminaria ochroleuca), 라미나리아 팔리다(Laminaria pallida), 레소니아 니그레센스(Lessonia nigrescens), 마크로시스티스 인테그리폴리아(Macrocystis integrifolia), 마크로시스티스 피리페라(Macrocystis pyrifera), 네마시스투스 데시피엔스(Nemacystus decipiens), 네레오시스티스 루에트케아나(Nereocystis luetkeana), 팔마리아 팔마타(Palmaria palmata), 포르피라 푸르푸레아(Porphyra purpurea), 포르피라 움빌리칼리스(Porphyra umbilicalis), 사카리나 자포니카(Saccharina japonica), 사카리나 라티시마(Saccharina latissima), 사카리나 롱기크루리스(Saccharina longicruris), 사카리나 세실리스(Saccharina sessilis), 사르가숨 필리펜둘라(Sargassum filipendula), 사르가숨 푸시포르메(Sargassum fusiforme), 사르가숨 무티쿰(Sargassum muticum), 울바 인테스티날리스(Ulva intestinalis), 울바 콤프레사(Ulva compressa), 울바 락투카(Ulva lactuca) 및 운다리아 피난티피다(Undaria pinantifida)이다. 한 구체예에서, 상기 종 중 하나 이상 또는 언급된 종 중 둘 이상의 조합이 본 발명에 따른 방법에서 가공된다. 바람직한 구체예에서, 녹조류, 특히 울바 종, 보다 특히 울바 락투카가 가공된다.
수확 후 두 시간 또는 세 시간 이내에, 파열된 조류 바이오매스는 세포벽 분해 효소를 포함하는 조성물로 처리된다. 조성물은 세포벽 및 세포 소기관과 같은 다른 세포 덩어리와 연결되거나 관련된 단백질 방출에 사용된다. 한 구체예에서, 효소 조성물은 효소 조성물의 총 중량을 기준으로 적어도 0.10% w/w의 세포벽 분해 효소, 예를 들어 0.10% w/w 내지 100% w/w, 0.20% w/w 내지 95% w/w, 0.50% w/w 내지 90% w/w, 1.0% w/w 내지 90% w/w, 1.0% w/w 내지 10% w/w,1.0% w/w 내지 20% w/w, 10% w/w 내지 20% w/w , 20% w/w 내지 65% w/w, 70% w/w 내지 95% w/w 또는 80% w/w 내지 95% w/w를 포함하고, 모두 효소 조성물의 총 중량을 기준으로 한다. 다른 구체예에서, 효소 조성물은 세포벽 분해 효소로 이루어진다.
효소 조성물에 존재할 수 있는 적합한 세포벽 분해 효소는 셀룰레이스 (EC 3.2.1.4), 자일라네이스 (EC 3.2.1.8 및 EC 3.2.1.32), 베타-글루카네이스 (EC 3.2.1.6), 아밀레이스 (EC 3.2.1.1 및 EC 3.2.1.2), 피테이스 (EC 3.1.3.8 및 EC 3.1.3.26), 포스포리페이스 (PLA1, PLA2, PLB, PLC, PLD, EC 3.1.1.4, EC 3.1.4.11 및 EC 3.1.4.4) 및 폴리갈락투로네이스 (EC 3.2.1.15)를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 한 구체예에서, 세포벽 분해 효소는 효소 조성물에서 주요 활성이고, 다른 구체예에서 세포벽 분해 효소는 효소 조성물에서 부차적 활성이다. 효소 조성물은 이들 세포벽 분해 효소 중 하나 이상을 포함한다. 당업자는 최적의 효소 혼합물이 조류 유형 및 계절에 따라 달라질 수 있음을 이해할 것이다. 그러므로, 세포벽 분해 효소의 임의의 혼합물이 신선한 또는 신선하게 수확된 조류에 대해 사용되는 한 사용될 수 있다. 한 구체예에서, 파열된 조류는 셀룰레이스, 엔도-자일레네이스, 베타-글루카네이스, 알파-아밀레이스, 베타-아밀레이스, 피테이스, 폴리갈락투로네이스 및 포스포리페이스 PLA2의 조합을 포함하는 효소 조성물로 처리된다. 또 다른 구체예에서, 파열된 조류 바이오매스는 피테이스 (EC 3.1.3.8) 및 포스포리페이스 (PLA1, PLA2, PLB, PLC, PLD, EC 3.1.1.4, EC 3.1.4.11 및 EC 3.1.4.4)를 포함하는 효소 조성물로 처리된다. 또 다른 구체예에서, 파열된 조류 바이오매스는 엔도-자일레네이스 (EC 3.2.1.8) 및 포스포리페이스 (PLA1, PLA2, PLB, PLC, PLD, EC 3.1.1.4, EC 3.1.4.11 및 EC 3.1.4.4)를 포함하는 효소 조성물로 처리된다. 한 구체예에서, 셀룰로스, 자일란, 베타-글루칸, 아밀레이스, 피테이트, 펙틴, 갈락투론산 또는 인지질에 대한 활성을 갖는 효소를 포함하는 효소 조성물이 사용된다. 또 다른 구체예에서, 베타-글루카네이스, 피테이스, 폴리-갈락투로네이스 및 포스포리페이스를 포함하는 효소 조성물이 사용된다. 또 다른 구체예에서 적어도 20 000 AVJP/g의 활성을 갖는 폴리갈락투로네이스; 적어도 80 BGLU/g의 활성을 갖는 엔도 1, 3 베타 글루카네이스; 적어도 100 000 BGF/g의 활성을 갖는 진균 베타 글루카네이스; 적어도 7500 U/g의 활성을 갖는 박테리아 아밀레이스; 적어도 5000 FTU/g의 활성을 갖는 피테이스; 포스포리페이스 A2, 및 자일레네이스를 포함하는 효소 조성물이 사용된다. 사용하기 전에 이들 효소는 1:1:1:1:1:1의 비율로 혼합되고 혼합물은 1000 kg 100% 건조 물질 바이오매스당 500 ml로 주입된다. 이들 효소는 예를 들어 네덜란드의 DSM, Delft로부터 상업적으로 입수 가능하다.
효소 조성물 중의 세포벽 분해 효소는 예컨대 식물, 진균 또는 박테리아로부터의 단리에 의해, 데 노보(de novo) 합성에 의해 또는 공지된 효소의 돌연변이유발에 의해 수득될 수 있다.
세포벽 분해 효소는 다른 세포 물질과 연결되거나 연관된 것을 포함하여 일부 또는 전부의 세포내 단백질을 방출시키기 위해 사용된다. 한 구체예에서, 적어도 30% w/w, 적어도 40% w/w, 적어도 50% w/w, 적어도 60% w/w, 적어도 70% w/w, 적어도 80% w/w, 적어도 90% w/w, 예컨대 30% w/w 내지 60% w/w, 45% w/w 내지 70% w/w 또는 50% 내지 90% w/w의 세포내 단백질이 방출된다.
임의의 적합한 주입량의 효소 제제가 사용될 수 있다. 한 구체예에서, 1000 kg 100% 건조 물질 바이오매스당 0.001% w/w 내지 5% w/w, 0.005% w/w 내지 2% w/w 또는 0.01% w/w 내지 1% w/w 세포벽 분해 효소 조성물이 사용된다. 조류의 건조 물질 함량은 당해 분야에서 공지인 임의의 방법에 의해 결정될 수 있고 전형적으로 물의 증발에 의해, 예를 들어 오븐에서 대표적인 조류 샘플을 건조시키는 것에 의해 조류의 샘플 또는 조류 중의 모든 수분을 제거하는 단계 및 건조 전 및 후에 샘플을 칭량하는 단계를 포함한다.
효소 주입량에 따라, 일부 또는 전부의 세포내 단백질을 이용 가능하게 만들기 위해 약 5 분 내지 50 시간, 30 분 내지 48 시간, 6 시간 내지 24 시간, 18 시간 내지 30 시간 또는 30 시간 내지 50 시간이 소요될 수 있다. 한 구체예에서, 파열된 조류 바이오매스는 24 시간 내지 48 시간 동안 효소 처리된다. 효소 처리 동안 온도는 30 ℃를 초과하지 않고 바람직하게는 4 내지 30 ℃ 5 내지 25 ℃ 또는 15 내지 25 ℃이다.
과정의 어느 단계에서나 pH를 조정할 필요가 없다. 그대로의 pH가 사용되고 전형적으로 pH 5.5 내지 pH 7.5, 예를 들어 pH 6.0 내지 7.5의 범위이다.
효소 처리 후, 고체상 및 액체상이 바람직하게는 원심분리 또는 여과에 의해 분리된다 (단계 (iii)). 원심분리를 사용하여, 펠릿 및 단백질 함유 상청액이 수득된다. 여과를 사용하여, 잔류물 및 단백질 함유 여과액이 수득된다.
단백질은 상청액 또는 여과액으로부터, 전형적으로 농축에 의해 회수될 수 있다. 온도가 30 ℃를 초과하지 않고 바람직하게는 4 내지 30 ℃ 5 내지 25 ℃ 또는 15 내지 25 ℃인 한, 한외여과, 원심분리, 침전 또는 나노여과와 같은 임의의 적합한 수단에 의해 농축될 수 있다. 농축된 단백질은 사용될 때까지 저장될 수 있다. 농축된 단백질은 다른 위치로, 예를 들어 수확 및 가공이 연안에서 일어나는 경우 해안으로 쉽게 수송될 수 있다. 신선한 조류로부터 단리된 단백질은 건조된 조류로부터 빈번하게 제조되는 상업적 조류 단백질보다 더 우수한 기능성을 가지며, 식품 산업, 사료 산업, 화장품 산업 또는 제약 산업에서와 같은 단백질 또는 조류 단백질에 대한 공지된 응용분야에서, 예를 들어 발포제, 겔화제, 증점제, 유화제, 착색제, 안료, 항산화제 또는 항미생물제로서 사용될 수 있다.
임의로, 단백질은 바람직하게는 즉석 건조 방법, 예컨대 분무 건조에 의해 내륙 또는 연안에서 건조된다. 한 구체예에서, 단백질은 상자 건조기(Sanovo technology A/S, Odense, Denmark)를 사용하여 분무 건조에 의해 즉석 건조된다. 상자 건조에 적합한 조건은 예를 들어 175 내지 185 ℃ 범위의 입구 온도 및 90 내지 97 ℃ 범위의 출구 온도이다. 단백질은 건조 전 또는 동안에 농축될 수 있다.
본 발명에 따른 방법을 사용하여, 단백질이 높은 수율로 수득될 수 있고, 예를 들어 신선한 조류 중의 총 단백질을 기준으로 적어도 65% w/w, 적어도 70% w/w, 적어도 75% w/w, 적어도 80% w/w, 적어도 85% w/w 또는 적어도 90% w/w의 수율로 수득될 수 있다.
단백질 분리 후 단계 (iii)에서 수득된 고체상, 예를 들어 펠렛 또는 잔류물은 당을 포함하는 탄수화물, 지방, 오일 및 미네랄을 함유한다. 고체상의 주요 성분인 탄수화물은 바이오가스, 바이오에탄올 또는 바이오플라스틱과 같은 재생 가능 에너지의 생성에 사용될 수 있다. 미네랄은 비료로서 사용될 수 있다. 지방 및 오일은 사료, 식품, 화장품 또는 제약 응용분야에 사용될 수 있다. 단백질의 추출 후, 잔여 바이오매스는 추가의 유용물 추출에 사용될 수 있다.
혐기성 소화에 의해 바이오매스로부터 바이오가스를 생성하는 많은 적절한 방법, 예컨대 하나의 반응기를 사용하는 1-단계 과정 및 둘의 반응기를 사용하는 2-단계 과정이 공개되었고, 두 과정 모두 (a) 가수분해 및 산성화 단계 및 (b) 아세테이트 생성(acetogenesis) 또는 메탄 생성(methanogenesis) 단계를 포함한다. 2 단계 과정에서, 단계 (a) 및 (b)는 별도의 반응기 또는 구획에서 수행된다. 이들 단계는 모두 미생물로 수행될 수 있다. 대안적으로, 단계 (a)는 효소 제제를 사용하여 효소적으로 수행되고, 단계 (b)는 예를 들어 WO2013/000928에 기재된 바와 같이 미생물적으로 수행된다. 바이오가스 생성을 위한 바람직한 구체예에서, 단백질 추출 후 남아 있는 고체상이 2-단계 과정을 거치고 메탄 생성 유기체에 의한 미생물 소화 전에 효소 처리를 먼저 거친다. 효소 조성물에 존재할 수 있는 적합한 탄수화물 분해 효소는 아밀레이스 (EC 3.2.1.1 및 EC 3.2.1.2), 글루코스 옥시데이스 (EC 1.1.3.4), 셀룰레이스 (EC 3.2.1.4), 자일라네이스 (EC 3.2.1.8 및 EC 3.2.1.32), 베타-글루카네이스 (EC 3.2.1.6), 피테이스 (EC 3.1.3.8 및 EC 3.1.3.26), 포스포리페이스 (PLA1, PLA2, PLB, PLC, PLD, EC 3.1.1.4, EC 3.1.4.11 및 EC 3.1.4.4) 및 폴리갈락투로네이스 (EC 3.2.1.15)를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 효소 조성물은 하나 이상의 탄수화물 분해 효소를 포함할 수 있다. 당업자는 최적의 효소 혼합물이 조류 유형 및 계절에 따라 달라질 수 있음을 이해할 것이다. 그러므로, 신선한 또는 신선하게 수확된 조류로부터 단백질을 추출한 후 수득된 바이오매스에 사용되는 한, 탄수화물 분해 효소의 임의의 혼합물이 사용될 수 있다. 한 구체예에서, 세포 탄수화물 분해 효소는 효소 조성물에서 주요 활성이고, 다른 구체예에서 세포 탄수화물 분해 효소는 효소 조성물에서 부차적 활성이다. 모든 효소는, 예를 들어 네덜란드의 DSM, Delft로부터 상업적으로 입수 가능하다. 임의의 적합한 용량의 효소 제제가 사용될 수 있다. 한 구체예에서, 적어도 3500 CMC U/g의 활성을 갖는 셀룰로스, 적어도 100 000 BGF/g의 활성을 갖는 글루카네이스, 적어도 120 000 \AVJP/g의 활성을 갖는 자일레네이스 및 적어도 5000 FTU/g의 활성을 갖는 피테이스를 포함하는 효소 혼합물이 사용되고, 바람직하게는 1:2:2:1의 중량비로 효소를 포함하고, 혼합물은 단백질 추출 후 바이오매스 습윤 중량 kg당 0.05 ml으로 주입된다.
바람직하게는, 탄수화물의 효소적 가수분해 및 미생물 소화는 별도의 반응기 또는 별도의 구획에서 일어난다. 임의의 적합한 반응기 구성, 예를 들어 연속 교반 탱크 반응기(continuously stirred tank reactor, CSTR), 연속 회분식 반응기(sequential batch reactor, SBR) 또는 혐기성 막 생물반응기(anaerobic membrane bioreactor, AnMBR)이 본 발명에 따른 바이오가스 생성에 사용될 수 있다. 바람직하게는, 상향류 혐기성 슬러지 블랭킷(upflow anaerobic sludge blanket, UASB) 또는 확장 과립 슬러지층(expanded granular sludge bed, EGSB)과 같은 더욱 정교한 시스템이 사용된다.
단백질 분획이 먼저 제거된 신선한 조류로부터의 바이오가스 생성은 단백질이 효소 처리 전에 제거되지 않는 종래의 바이오가스 공정과 비교하여 더 높은 수율의 바이오가스 및 더 적은 질소 불순물을 함유하는 더 청정한 바이오가스를 유발하기 때문에 매우 유리하다. 바이오가스 수율은 약 12 시간 체류 시간 후 60% 내지 80%, 예컨대 70% 메탄에서 대략 250 내지 600 Nm3, 예컨대 300 내지 500 Nm3 또는 400 내지 500 Nm3 바이오가스/ 1000 kg 100% 건조 중량 조류일 수 있다. 한 구체예에서, 70% 메탄에서 460 Nm3 바이오가스/1000 kg 100% 건조 중량 해초가 12 시간 체류 시간에 생성되었다.
그러므로 대부분의 또는 모든 조류 단백질의 제거 후 신선한 해초로부터 생성된 청정한 바이오가스가 발명의 또 다른 양태이다. 당업자는 바이오가스 생성을 위해 고체상을 분리한 후 단백질 함유 액체상으로부터 단백질이 추출되거나 추출되지 않을 수 있음을 이해할 것이다. 어느 경우든 청정한 바이오가스가 수득될 것이다. 한 구체예에서, 그러므로 본 발명은 다음 방법에 관한 것이다
(i) 조류에 삼투압 충격을 가하는 단계;
(ii) 충격받은 조류를 세포벽 분해 효소를 포함하는 효소 조성물로 처리하는 단계;
(iii) 효소 처리된 조류를 고체상 및 액체상으롱 분리하는 단계, 여기서 조류의 효소 처리는 수확 후 세 시간 이내에 시작되고 단계 (i) 내지 단계 (iii)의 온도는 4 내지 30 ℃의 범위임
(iv) 바람직하게는 탄수화물 분해 효소를 사용한 효소 가수분해에 이어서 미생물 메탄생성반응에 의해 바이오가스를 생성하기 위해 단계 (iii)에서 수득된 고체상을 사용하는 단계,
(v) 임의로, 단계 (iii)에서 수득된 액체상으로부터 단백질을 회수하는 단계.
바이오가스는 바람직하게는 카르보하이드레이스 효소 제제를 사용하는 고체상의 효소 가수분해에 이어서 미생물 메탄생성반응을 포함하는 2 단계 과정에 의해 생성된다. 대안으로, 고체상은 당해 분야에 공지인 가스화 공정을 사용하여 합성가스로 전환될 수 있다.
다른 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 과정에 의해, 즉 신선한 조류 가공으로부터 수득 가능한 조류 단백질 제제에 관한 것이다. 신선한 조류로부터 수득된 조류 단백질 제제는 예를 들어 용해도와 같은 우수한 기능성 단백질 특성을 가질 것이다. 이의 용해도는 전형적으로, 보존된, 예컨대 건조된 해초로부터 제조된 단백질의 용해도보다 에컨대 두 배 또는 세 배 더 우수하다. 한 구체예에서, 신선한 조류로부터 수득된 단백질 제제는 pH 3 내지 10 범위의 pH에서 분산된 총 단백질을 기준으로 적어도 55% w/w 적어도 60% w/w, 적어도 65% w/w or 적어도 70% w/w의 용해도를 갖는다. 용해도는 또한 NaCl의 존재에서 우수하며 전형적으로, 보존된, 예컨대 건조된 해초로부터 제조된 단백질의 용해도보다 에컨대 세 배 또는 네 배 더 우수하다. 한 구체예에서, 신선한 조류로부터 수득된 단백질 제제는 NaCl의 존재에서 분산된 총 단백질을 기준으로 적어도 55% w/w 적어도 60% w/w, 적어도 65% w/w, 적어도 70% w/w, 적어도 75% w/w 또는 적어도 80% w/w의 용해도를 갖는다. 한 구체예에서, 본 발명에 따른 단백질은 0.05 내지 3% w/v NaCl 범위의 임의의 NaCl 농도에서 1 mg/ml의 용해도를 갖는다. 한 구체예에서, 본 발명에 따른 단백질은 pH 3 내지 10 범위의 임의의 pH에서 적어도 55% w/w 적어도 60% w/w, 적어도 65% w/w, 적어도 70% w/w, 적어도 75% w/w or 적어도 80% w/w의 용해도 및 0.05 내지 3% w/v NaCl의 존재에서 적어도 55% w/w 적어도 60% w/w, 적어도 65% w/w, 적어도 70% w/w, 적어도 75% w/w 또는 적어도 80% w/w의 용해도를 갖는다. 여러 상이한 pH 값 또는 NaCl 농도에서의 용해도는 예를 들어 일정량의 건조 생성물을 탈염수에 분산시킨 후, 인산 또는 수산화 나트륨으로 pH를 설정하거나, NaCl로 염 농도를 설정하고, 그 다음 분산액/용액을 원심분리하여 결정될 수 있다. 이후 상청액 중의 가용화된 단백질이, 예를 들어 Pierce™ BCA Protein Assay Kit (Thermo Scientific, Bleiswijk, the Netherlands)와 같은 상용 키트를 사용하고 분광계에서 562 nm에서의 흡광도를 측정하여 측정될 수 있다. 단백질은 7.5 내지 8.5 범위의 pH에서 등전점을 가질 수 있다.
당업자는 수득된 단백질의 정확한 아미노산 조성이 해초 유형마다 다를 수 있지만 본 발명에 따른 단백질이 높은 수준, 예를 들어 총 아미노산의 중량을 기준으로 적어도 10% w/w 또는 적어도 15% w/w의 아스파라긴 또는 글루타민을 가질 수 있음을 이해할 것이다. 이는 또한 상당한 양, 예를 들어 총 아미노산의 중량을 기준으로 적어도 5% w/w, 적어도 7% w/w 또는 적어도 10% w/w의 글리신, 프롤린 또는 알라닌을 가질 수 있다.
단백질은 또한 우수한 영양적 및 기능적 특성, 예컨대 발포, 유화 또는 수분 결합 특성을 가질 수 있으며, 많은 응용분야, 특히 식품, 제약 및 화장품뿐만 아니라 사료 응용분야에서도 사용될 수 있다.
한 구체예에서, 본 발명은 다음 특징 중 둘 이상을 포함하는 조류 단백질 또는 단백질 제제에 관한 것이다:
a) 총 아미노산의 중량을 기준으로 적어도 10% w/w 또는 적어도 15% w/w 아스파라긴 또는 글루타민을 포함함;
b) 총 아미노산의 중량을 기준으로 적어도 5% w/w, 적어도 7% w/w 또는 적어도 10% w/w 글리신, 프롤린 또는 알라닌을 포함함;
c) pH 3 내지 10 범위의 임의의 pH에서 적어도 55% w/w 적어도 60% w/w, 적어도 65% w/w, 적어도 70% w/w, 적어도 75% w/w 또는 적어도 80% w/w의 용해도를 포함함;
d) 0.05 내지 3% w/v NaCl 범위의 임의의 NaCl 농도에서 적어도 55% w/w 적어도 60% w/w, 적어도 65% w/w, 적어도 70% w/w, 적어도 75% w/w 또는 적어도 80% w/w의 용해도;
e) 0.05 내지 3% w/v NaCl 범위의 임의의 NaCl 농도에서 적어도 1 mg/ml의 용해도를 포함함;
f) pH 7 내지 pH 9 범위의 pH에서 등전점을 포함함;
g) 달걀 단백질에 필적하는 유화 특성을 포함함.
한 구체예에서, 본 발명에 따른 조류 단백질 또는 단백질 제제는 이러한 모든 특징을 갖는다.
다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 가공 방법에 따른 조류 가공 장치 1 (도 1)에 관한 것이다. 장치 1은 이동식이므로 수확 장소로 이동하거나 옮겨질 수 있다. 장치는 수확, 세정 및 세척을 위한 수확 유닛 2; 수확물의 효소 소화를 위한 가공 유닛 3; 및 단백질의 단리 및 농축을 위한 회수 유닛 4를 포함한다. 장치는 혐기성 소화 가공 유닛 6, 6으로부터의 생성물 회수 및 임의로 농축을 위한 회수 유닛 7 및 회수 유닛 4 또는 7로부터의 생성물의 제형화를 위한 제형화 유닛 5를 임의로 추가로 포함할 수 있다. 장치는 조류가 번성, 성장하거나 양식되는 장소, 예를 들어 배, 바지선 또는 대형 선박으로 항해할 수 있거나 견인될 수 있는 이동식 유닛을 포함하거나 이에 설치될 수 있다. 이러한 방식으로, 조류는 일년 중 특정 시간에 조류가 존재하는 특정 장소에서 수확될 수 있다.
한 구체예에서, 본 발명은 조류 가공 방법에 관한 것이고, 여기서 상기 방법은 다음 단계를 포함한다
(i) 조류에 삼투압 충격을 가하는 단계;
(ii) 충격받은 조류를 세포벽 분해 효소를 포함하는 효소 조성물로 처리하는 단계;
(iii) 효소 처리된 조류를 고체상 및 액체상으롱 분리하는 단계, 여기서 조류의 효소 처리는 수확 후 세 시간 이내에 시작되고, 단계 (i) 내지 단계 (iii)의 온도는 4 내지 30 ℃의 범위임;
(iv) 단계 (iii)의 액체상을 바람직하게는 분무 건조에 의해 건조하여 단백질을 수득하는 단계;
(v) 임의로, 바이오가스, 바이오플라스틱 또는 바이오에탄올 생성을 위해 단계 (iii)에서 수득한 고체상을 사용하는 단계,
여기서 단계 (i) 내지 단계 (v)는 본 발명에 따른 이동식 장치에서 연안에서 수행된다.
당업자는 위에 언급된 구체예가 조합되어 새로운 구체예를 형성할 수 있음을 이해할 것이다. 가공 방법에 대해 언급된 구체예 및 바람직한 구체예는 또한 본 발명에 따른 방법의 생성물, 예컨대 단백질, 바이오가스, 미네랄 스트림 및 이동식 장치에 적용될 수 있으며, 그 역도 마찬가지이다.
실시예
재료 및 방법
효소 제제 A
세포 내용물의 방출에 사용된 효소 제제는 다음 효소(달리 명시된 것을 제외하고 모두 네덜란드의 DSM, Delft로부터 입수)를 함유했다:
- 2 ml 셀룰레이스 (Filtrase BRX)
- 2 ml 자일레네이스 (Filtrase NLC),
- 2 ml 아밀레이스 (MATS classic),
- 2 ml 피테이스 (Phytase 5000L),
- 2 ml 포스포리페이스 A2 (Purifinae PLA2), 및
- 90 ml 탈염수
- 온화한 교반하에 액체 형태의 앞서 언급된 효소에 용해된 2 g 베타-글루카네이스/엔도 자일레네이스 (Battonage, Oenobrands, Montferrer-sur-lez, France).
희석된 효소 제제의 경우, 효소 제제를 탈염수로 희석했다.
실시예 1
본 발명에 따른 방법을 사용한 녹조류의 가공
신선한 녹조류(울바 락투카, 5 kg)를 수확하고 최대 20 ℃ 온도의 과량의 신선한 해수를 사용하여 세척했다. 부착된 물을 저속 원심 분리에 의해 제거했다. 이후 5 리터의 탈염 냉각수를 첨가하고 혼합물을 대략 1 sq mm의 조각이 얻어질 때까지 블렌더에서 잘게 썰었다. 슬라이스된 바이오매스를 두 부분으로 나누었다. 대조군인 한 부분에 25 ml 탈염수를 첨가했다. 다른 부분은 수확 후 한 시간 이내에 세포 내용물의 방출을 위해 25 ml의 열 배 희석된 효소 제제 A와 함께 인큐베이션되었다.
두 부분 모두 24 시간 동안 실온(실제로 < 20C)에서 교반된 다음 4 ℃, 4500 rpm에서 10 분 동안 원심분리되고 상청액이 수집되었다. 펠렛을 탈염수에 재현탁시키고, 다시 원심분리하고 상청액을 수집하고 첫 번째 상청액에 첨가했다. 수집된 상청액은 추가 분석까지 동결되었다. 추가의 분석은 상청액이 단백질을 함유함을 보여주었다. 이는 단백질이 조류 본 발명에 따른 온화한 공정을 사용하여 단리될 수 있음을 보여준다. 단백질은 상청액을 분무 건조하여 건조되고 추가의 분석을 위해 저장되었다.
실시예 2
본 발명에 따른 방법을 사용한 홍조류의 가공
신선한 홍조류(그라실라리아, 5 kg)를 수확하고 최대 20 ℃ 온도의 과량의 신선한 해수를 사용하여 세척했다. 부착된 물은 저속 원심분리에 의해 제거되고 대략 1 sq. mm의 조각으로 절단되고 수확 후 두 시간 이내에 효소 처리를 포함하여 실시예 1에 기재된 바와 같이 추가로 처리되었다. 수집된 상청액은 추가 분석까지 동결되었다. 추가의 분석은 그라실라리라의 상청액이 단백질을 함유했음을 나타냈다. 또한 다른 유형의 홍조류인 신선한 콘드루스를 수확하고 수확 후 두 시간 이내의 효소 처리를 포함하여 실시예 1에 기재된 바와 같은 프로토콜을 사용하여 가공했다 수집된 상청액은 추가 분석까지 동결되었다. 추가의 분석은 콘드루스(Chondrus)의 상청액이 단백질을 함유했음을 나타냈다. 이는 단백질이 본 발명에 따른 온화한 과정을 사용하여 홍조류로부터 단리될 수 있음을 나타낸다.
실시예 3
본 발명에 따른 방법을 사용한 갈조류의 가공
신선한 갈조류(푸쿠스)를 수확하고 최대 20 ℃ 온도의 과량의 신선한 해수를 사용하여 세척했다. 부착된 물은 저속 원심분리에 의해 제거되고 조류는 대략 1 sq. mm의 조각으로 절단되고 수확 후 두 시간 이내에 효소 처리를 포함하여 실시예 1에 기재된 바와 같이 추가로 처리되었다. 수집된 상청액은 추가 분석까지 동결되었다. 추가의 분석은 상청액이 단백질을 함유함을 보여주었다. 이 실시예는 본 발명에 따른 과정이 또한 갈조류로부터의 단백질 단리에 사용될 수 있음을 나타낸다.
실시예 4
연속 단계 가공에서 단백질의 단리 및 바이오가스의 생성을 위한 신선한
울바
의 대규모 가공.
녹조류(울바 락투카, 5 kg)를 수확하고 최대 20 ℃ 온도의 과량의 신선한 해수를 사용하여 세척했다. 부착된 물을 저속 원심 분리에 의해 제거했다. Portions of 1 kg 해초를 1 리터의 탈염수와 혼합하고 Robot Coupe Cutter R10에서 대략 1 sq. mm의 조각으로 잘게 잘랐다. 추가의 1 리터의 탈염수로써 잘게 자른 해초를 깨끗한 새 1000 리터 IBC에 넣었다. 총 76 kg의 울바를 수확 후 세 시간 이내에 일정한 온화한 교반하에 24 시간 동안 600 리터의 탈염수와 함께 인큐베이션했다. 24 시간 인큐베이션 기간의 시작에서 효소 제제 A(500 ml 효소 혼합물 / 1000 kg 100% 건조 물질 바이오매스)를 첨가했다. 인큐베이션 기간 후 남은 해초 고형물을 4 번 접힌 치즈 직포에서 전체 슬러리의 여과에 의해 제거했다. 치즈 직포를 통과한 액체의 단백질 함유 분획인 여과액을 수집하고 단백질을 180 ℃의 입구 온도 및 94 ℃의 출구 온도를 갖는 상자 건조기(Sanovo technology A/S, Odense, Denmark)를 사용하여 상청액 분무 건조에 의해 건조했다. 이후 분무 건조된 단백질은 하기 실시예에 기재된 바와 같이 특징규명되었다.
본 발명에 따른 방법에 대한 단백질 추출 효율은 표 1에 제시되고 건조 중량을 기준으로 출발 물질에 존재하는 총 단백질의 백분율로서 약 81% w/w였다. 단백질은 BCA 분석법(Thermo Scientific, Bleiswijk, the Netherlands)을 사용하여 측정되었다.
| 출발 재료 (신선한 울바) | 추출 효율 | 수율 (GOA 생성물) | ||
| 76 | 해초 Kg | |||
| 14% | w/w 건조 물질 | |||
| 10.6 | Kg 건조 물질 | 4.5 | 생성된 단백질 농후 분말 Kg | |
| 12% | 건조 물질 중의 단백질 | 23% | 단백질 | |
| 1.28 | 존재하는 단백질 Kg | 1.04 | 생성된 단백질 Kg | |
| 81% w/w | ||||
이후 치즈 직포에 남은 고형분은 가능한 한 많은 탄수화물을 용액으로 가수분해 하기 위해, 1:2:2:1의 중량비로 셀룰레이스 Methaplus L100 (> 3500 CMC U/g) / 글루카네이스; Axiase 100 (>120000 AVJP/g) / 자일레네이스; Filtrase NLC (>100000 BGF/g) 및 피테이스; Maxamyl P (> 5000 FTu/g) (모두 네덜란드의 DSM. Delft로부터의 효소)를 포함하고 단백질 추출 후 습윤 바이오매스 kg 당 0.05 ml (혼합물)으로 주입된 카르보하이드레이스 효소 제제와 함께 48 시간 동안 재인큐베이션되었다. 이러한 가수분해된 고체는 바이오가스 및 미네랄 농후 물 스트림의 생성을 위해 혐기성 소화조(EGSB-skid of Hydrothane)로 옮겨졌고, 미네랄 스트림은 비료로서 사용될 수 있다. 바이오가스 전환은 pH 안정화제 또는 추가 영양소가 필요하지 않으며 12 시간의 체류 시간에서 70% 메탄에서 460 Nm3 바이오가스 / 1000 kg 100% 건조 중량 해초의 결과가 달성될 수 있음을 나타냈다. 이는 모든 미생물 과정이 사용될 때, 즉 효소 처리가 없이, 또는 최초의 단백질 추출이 없이 전체 해초가 사용될 때 예상될 수 있는 것보다 훨씬 더 높은 수율이다.
실시예 5
본 발명의 방법에 따라 단리된 GOA 단백질의 SDS Page 분석.
실시예 4에서 수득된 분무 건조된 단백질이 SDS-PAGE를 사용하여 분석되었다. Laemmli (1970) Nature 227:5259에 따라 전기영동이 수행되었다. 해초를 고온 공기를 사용하여 건조시키고, 이를 플레이크로 분쇄하고 단백질을 단리하기 전에 8 주 동안 저장하여 울바로부터 수득한 단백질 샘플(Hello Seaweed, Fuzhou Beautiful Agricultural development Co, China)을 기준으로 했다. SDS-PAGE 분석을 위해, 두 샘플 모두 담수에 노출되었다. 모두 온화한 교반 하에, 건조된 해초 샘플은 수 시간의 재수화 시간을 가졌으며 GOA 샘플은 재용해하기 위한 동일한 시간을 가졌다.
원심분리 후, 펠렛을 처분하고 단백질 함유 상청액을 회수했다. 각각의 샘플로부터의 분취량을 상청액으로부터 피펫팅한 다음, 유사한 단백질 농도까지 추출 버퍼(1.5% SDS, 20% 글리세롤 및 0.01% 브로모페놀 블루)로 희석했다. 겔 단백질 밴드가 신속-착색 즉시 사용 가능 겔(SERVA electrophoresis GmbH, Germany)에서 발생했다. 겔 분석은 프리웨어: GelAnalyzer 2010를 사용하여 수행되었다. 6 kDa - 67 kDa의 마커 세트가 사용되었다. SDS-PAGE 분석은 신선한 울바 해초로부터 수득된 GOA 단백질 샘플이 건조된 물질로부터 수득된 울바 기준 샘플보다 40kDa 더 큰 분자 크기를 갖는 더 많은 단백질을 함유함을 나타냈다. GOA 샘플은 거의 두 배의 양의 27-30 kDa 단백질을 갖고 더 작은 크기 6 kDa 범위를 갖는 더 적은 단백질을 함유한다 (표 2). 이러한 결과는 신선한 해초로부터 수득된 단백질 샘플이 건조된 해초로부터의 샘플보다 더 온전한 단백질 및 덜 분해된 단백질을 함유함을 나타낸다. 더 온전한 단백질은 또한 더 기능성인 단백질을 의미한다. 단백질의 분해는 유화, 점도 및 열경화 겔화와 같은 기능적 특성에 해롭다.
| kDa 영역 | GOA-단백질 프로파일 (신선한 울바로부터) | 단백질 프로파일 (건조된 울바로부터) | 비율 신선한 물질 대 건조된 물질 |
| 58-62 | 2.5% | - | N.A |
| 50-55 | 9.5% | 8% | 1.2 |
| 40-45 | 14% | 7.5% | 1.9 |
| 27-30 | 71% | 39% | 1.8 |
| 18-22 | - | 18.5% | N.A |
| <6 | 3% | 27% | 0.1 |
실시예 6
본 발명에 따른 단백질 샘플의 아미노산 조성
실시예 4의 분무 건조된 단백질 샘플의 아미노산 조성이 산 가수분해 및 HPLC에 의해 결정되었고 표 3에 제시된다. 단백질은 높은 수준의 아스파라긴 (총 아미노산의 15%) 및 글루타민 (아미노산의 20%) 뿐만 아니라 상당한 양의 글리신, 프롤린 및 알라닌을 함유했다
| 아미노산 | g/kg | 전체 중 % |
| 트립토판 | ||
| 알라닌 | 17.4 | 10.5 |
| 아르기닌 | 4.3 | 2.6 |
| 아스파라긴 | 25.1 | 15.1 |
| 시스테인 | 2.7 | 1.6 |
| 글루타민 | 34.1 | 20.6 |
| 글리신 | 12.5 | 7.5 |
| 하이드록시프롤린 | 1.8 | 1.1 |
| 히스티딘 | 1.7 | 1.0 |
| 이소루신 | 6.3 | 3.8 |
| 루신 | 6.6 | 4.0 |
| 라이신 | 5.0 | 3.0 |
| 메티오닌 | 2.1 | 1.3 |
| 페닐알라닌 | 6.9 | 4.2 |
| 프롤린 | 10.0 | 6.0 |
| 세린 | 5.9 | 3.6 |
| 트레오닌 | 6.5 | 3.9 |
| 티로신 | 5.9 | 3.6 |
| 발린 | 10.9 | 6.6 |
| 전체 | 165.7 | 100% |
실시예 7
상이한 pH 값에서의 단백질 용해도
실시예 4에서 수득된 분무 건조된 단백질 샘플(GOA 샘플)의 단백질 용해도를 분석하기 위해, GOA 단백질 샘플의 1g 건조 생성물을 100 ml 탈염수에 분산시켰다. 건조 및 분쇄된 울바로부터 수득된 샘플이 동일한 실험에서 시험되었다. 테스트에서 유사한 양의 단백질 부하를 갖기 위해 울바 샘플 중에서, 2g 건조 울바/100 ml 탈염수를 사용했다. 분산액은 인산 (저 pH) 및 수산화 나트륨 (고 pH)을 사용하여 pH 3, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9에서 설정되었다. 이후, 분산액/용액을 원심분리했다.
100 마이크로리터 분취량을 각각의 시험관의 상청액으로부터 피펫팅하고 562nm에서 Shimadzu UV/VIS 분광계를 사용하여 Pierce™ BCA Protein Assay Kit (네덜란드, Thermo Scientific, Bleiswijk)로 가용성 단백질 분석에 적합한 농도 범위까지 희석했다. 이후 측정된 단백질 mg/ml를 BCA 분석에서 사용된 사용된 샘플 중량 및 희석 계수에 대해 보정한다. 해초 단백질의 용해도는 거의 변동을 나타내지 않았으며 비교적 일정했다. 표 4는 울바 및 GOA 단백질의 용해도의 비교이며 GOA 단백질 샘플의 용해도가 울바 기준 샘플의 용해도보다 3 내지 12 배 더 높음을 명확하게 나타낸다. 평균 단백질 용해도는 GOA 단백질 샘플보다 5 배 더 높다. 결과는 또한 울바에 대한 38%의 변동성 대 GOA에 대한 단지 5%의 변동성을 나타내고, 이는 울바가 GOA보다 pH에 훨씬 더 민감하며, 울바가 pH 6에서 최소 용해도를 나타냄을 보여 준다. 이는 신선한 해초로부터의 단백질 단리가 훨씬 더 높은 용해도를 갖고 건조된 해초로부터의 단백질 샘플보다 전체 pH 범위에 걸쳐 훨씬 더 일정한 단백질 샘플의 제조를 허용함을 의미한다.
| pH | 건조된 것으로부터의 가용성 단백질 % | 신선한 것으로부터의 가용성 단백질 % | 신선/건조 비율 |
| 울바 | GOA | ||
| 3 | 22 - 24 | 75 - 77 | 3.3 |
| 4 | 16 - 18 | 78 - 80 | 4.6 |
| 4.5 | 13 - 15 | 73 - 76 | 5.3 |
| 5 | 16 - 18 | 76 - 77 | 4.5 |
| 6 | 5 - 7 | 73 - 74 | 12.1 |
| 7 | 11 - 13 | 72 - 73 | 6.0 |
| 8 | 18 - 19 | 66 - 69 | 3.7 |
| 9 | 26 - 28 | 75 - 77 | 2.8 |
제시된 결과는 또한 세 가지 단백질 샘플에 대한 상이한 등전점을 나타낸다. 용해도 하락은 등전점을 나타낸다. 이러한 방식으로, GOA 샘플에 대한 등전점은 pH 8 부근이고 울바 기준 샘플에 대해서는 pH 6 부근이다. 이러한 결과는 신선한 해초로부터의 단백질 단리가 적용에서 상이한 등전점 및 따라서 상이한 pH 거동을 갖는 단백질을 유발함을 나타낸다.
| 샘플 | 추정된 등전점 (pH) |
| 달걀 알부민 | 4.5 |
| 건조된 울바 | 6 |
| GOA 샘플 발명 | 8 |
실시예 8
신선한 해초로부터의 단백질 샘플의 염 민감도
상이한 농도의 NaCl의 존재에서 단백질 용해도를 분석하기 위해, 실시예 4에서 수득된 1g의 분무 건조된 단백질 샘플(GOA 샘플)을 100 ml 탈염수에 분산시켰다. 달걀 알부민 (EA) 샘플 및 건조 및 분쇄된 울바로부터 수득된 샘플이 동일한 실험 기준에서 시험되었다. 울바 샘플 중에서, 테스트에서 유사한 양의 단백질 부하를 갖기 위해 2g을 사용했다. GOA, 울바 및 EA로부터의 가용화된 단백질을 탈염수에 희석하여 샘플의 염 효과를 감소시켰다. 이후 희석된 샘플은 0 - 3%의 NaCl 농도로 설정되었다. 단백질 용액을 원심분리하고 100 μl을 562nm에서 Shimadzu UV/VIS 분광계를 사용하여 Pierce™ BCA Protein Assay Kit (네덜란드, Thermo Scientific, Bleijswijk)로 가용성 단백질을 분석하기 위해 각각의 샘플의 상청액으로부터 피펫팅했다. 이후 측정된 단백질 mg/mL를 BCA 분석에서 사용된 사용된 샘플 중량 및 희석 계수에 대해 보정했다. 측정은 이중으로 이루어졌다. 모든 염 농도에서, GOA 단백질 샘플은 울바 샘플보다 훨씬 더 높은 용해도를 갖는다. 울바의 경우 평균 44 ± 12 mg 단백질이 염 백분율 증가에 비해 가용성이었다. GOA의 경우 192 ± 11 mg 단백질이 염 백분율 증가에 비해 가용성이었다. NaCl의 존재에서 용해도 백분율이 표 6에 나타난다. 평균 단백질 용해도가 울바보다 GOA에 대해 4 배 더 높고, 울바에 대한 변동성은 GOA에 대한 단지 6%의 변동성에 비해 27%이며, 이는 울바가 염 농도 변화에 더 민감함을 나타냄을 알 수 있다. 이는 신선한 해초로부터 본 발명에 따라 수득된 단백질 샘플이 건조된 해초로부터의 단백질 샘플보다 더 높은 용해도를 갖고, 안정성이 높은 염 농도에 영향을 받지 않음을 나타낸다.
| NaCl % | 건조된 것으로부터의 가용성 단백질 % |
신선한 것으로부터의 가용성 단백질 %
|
신선/건조 비율 |
| 울바 | GOA | ||
| 0 | 20 - 20 | 77 - 79 | 3.9 |
| 0.1 | 25 - 27 | 83 - 85 | 3.2 |
| 0.5 | 20 - 21 | 74 - 75 | 3.6 |
| 1 | 11 - 13 | 69 - 70 | 5.8 |
| 1.5 | 28 - 29 | 80 - 82 | 2.8 |
| 2 | 15 - 15 | 76 - 77 | 5.1 |
| 2.5 | 20 - 21 | 77 - 79 | 3.8 |
| 3 | 18 - 19 | 72 - 74 | 4.0 |
실시예 9
스폰지 케이크의 제조
표준 레시피 (이탈리안 케이크 버전): 9 그램 전란분, 221 그램 물, 210 그램 설탕, 150 그램 밀가루 및 75 그램의 감자 전분. 전란분은 대두, 유장, 해바라기 또는 본 발명에 따른 GOA-단백질과 같은 단백질로 대체되었다. 혼합물을 Hobart N50을 사용하여 반죽으로 치댔다. 반죽을 10 cm의 원으로 절단하여 케이크를 형성했다. 케이크가 멋진 금색/황색을 가질 때까지 반죽을 180 ℃ 오븐에서 22 분 동안 구웠다. 케이크를 오븐에서 꺼내 냉각시켰다. 해초 (GOA) 단백질로부터 제조된 케이크는 전란 단백질의 케이크와 비교하여 매우 양호한 외관을 가졌다. (GOA) 해초 케이크는 만졌을 때 부서지거나 매우 거친/고르지 않은 표면을 갖는 대두, 유장 및 해바라기 단백질과 같은 다른 단백질의 케이크와 달리, 둥근 형태를 유지하고 부서지지 않았다. 이는 반죽 점조도 및 베이킹 특성에 있어서 GOA (해초) 단백질이 전란분의 대체물로 사용될 수 있음을 보여준다.
실시예 10
75% 마요네즈의 제조
표준 레시피(Sanovo 에그 그룹)를 사용했다; 15% 난황분, 107 그램의 물, 2 그램의 소금 375 그램의 (카놀라) 오일 및 10 그램의 식초. 모두를 부드럽게 연이은 순서로 첨가하고 스피드 믹서(Bosch 300W type 4179 또는 Hobart N50)를 사용하여 혼합했다. 에멀젼을 24 시간 동안 2-5 ℃에서 보관하여 안정화시켰다. 24 시간 후 점도를 측정했다. 비교를 위해 난황분을 GOA (해초) 단백질, 대두, 완두콩, 해바라기 단백질로 대체했다. 또한 혼합 (50/50) 전란분 / GOA (해초) 단백질을 테스트했다.
실시예 4에서 수득한 해초 (GOA) 단백질의 마요네즈는 점조도가 우수했다. 대두 단백질 - 마요네즈 에멀젼 또는 완두콩 단백질 - 마요네즈 에멀젼은 형성되기도 전에 파괴되었다. 이는 GOA 단백질이 난황에 필적하는 우수한 유화 특성을 갖는다는 것을 보여준다. 또한 GOA 단백질 에멀젼의 우수한 떠짐성(scoopability) 및 발림성(smearability)을 보여준다. 전란분/GOA 단백질의 혼합물은 개별적인 순수한 단백질보다 더 나쁜 성능을 나타내지 않았다.
GOA 단백질에 대해 관찰된 주요 차이는 에멀젼의 매우 낮은 배액(syneresis)에서 나타났다. 후자는 GOA 단백질이 전란분에 비해 그리고 대두, 완투콩 또는 해바라기 단백질의 다른 테스트된 에멀젼보다 명백하게 더욱 안정한 에멀젼을 형성함을 보여준다. 2-5 ℃에서 4 주 동안 냉장 보관한 후, GOA (해초) 단백질 에멀젼에는 여전히 배액에 없었지만, 다른 모두는 거의 액체가 되었다. 모든 샘플에서 곰팡이 형성으로 인해 실험을 중단했다.
결론적으로, a) 본 발명에 따른 방법에 의해 단리된 단백질은 우수한 에멀젼 제형화를 허용한다; b) 본 발명에 따른 단백질 및 계란의 혼합물은 에멀젼의 특성을 손상시키지 않았다; c) 본 발명에 따른 단백질은 대두 단백질, 유장 단백질, 해바라기 단백질 또는 완두콩 단백질과 같은 테스트된 단백질보다 훨씬 더 낮은 배액을 나타내고, 이는 식품 응용분야에서 그러한 에멀젼의 사용에 대한 새로운 기회를 제공한다.
Claims (18)
- 다음 단계를 포함하는 조류 가공 방법에 있어서:
(i) 조류에 삼투압 충격을 가하는 단계
(ii) 충격받은 조류를 세포벽 분해 효소를 포함하는 효소 조성물로 처리하는 단계;
(iii) 효소 처리된 조류를 고체상 및 액체상으롱 분리하는 단계;
조류의 효소 처리가 조류 수확 세 시간 이내에 시작되고 단계 (i) 내지 단계 (iii)의 온도는 4 내지 30 ℃ 범위임을 특징으로 하는 방법. - 제1항에 있어서, 조류 가공은 5 내지 25 ℃ 범위의 온도, 바람직하게는 15 내지 25 ℃ 범위의 온도에서 일어남을 특징으로 하는 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 삼투압 충격은 5 내지 20 분이 소요됨을 특징으로 하는 방법.
- 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 가공 동안의 pH는 조정되지 않고 바람직하게는 pH 5.5 내지 7.5임을 특징으로 하는 방법.
- 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 조류는 해조류임을 특징으로 하는 방법.
- 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 세포벽 분해 효소 조성물은 셀룰레이스, 자일라네이스, 베타-글루카네이스, 알파-아밀레이스, 베타-아밀레이스, 피테이스, 폴리갈락투로네이스 및 포스포리페이스 중 하나 이상을 포함함을 특징으로 하는 방법.
- 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 단백질을 수득하기 위해, 바람직하게는 분무 건조에 의해 단계 (iii)의 액체상을 건조하는 단계를 추가로 포함함을 특징으로 하는 방법.
- 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 수율은 조류 중 총 단백질을 기준으로 적어도 65% w/w임을 특징으로 하는 방법.
- 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 바이오가스, 바이오플라스틱, 바이오에탄올, 미네랄, 지방 또는 오일을 생성하기 위해 단계 (iii)에서 수득된 고체상을 사용하는 단계를 추가로 포함함을 특징으로 하는 방법.
- 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 바이오가스는 탄수화물 분해 효소 제제를 사용한 가수분해에 이어서 미생물 메탄생성반응을 포함하는 2-단계 혐기성 소화 과정에 의해 단계 (iii)에서 수득된 고체상으로부터 생성됨을 특징으로 하는 방법.
- 제10항에 있어서, 혐기성 소화는 회수되는 미네랄 스트림을 생성함을 특징으로 하는 방법.
- 전술한 청구항 중 어느 한 항에 의해 수득된 단백질.
- 제12항에 있어서, pH 2 내지 10 범위의 pH 또는 0.05 내지 3% w/v NaCl 범위의 NaCl 농도에서 총 단백질 중량을 기준으로 적어도 60% w/w의 용해도를 갖는 것을 특징으로 하는 단백질.
- 식품 산업, 사료 산업, 화장품 산업 또는 제약 산업에서의 제12항 또는 제13항에 따른 단백질의 용도.
- 제11항에 따른 방법에서 수득된 미네랄 스트림.
- 제9항 내지 제11항에 따른 방법에 의해 생성된 바이오가스.
- 전술한 청구항 중 어느 한 항에 따른 방법에서 사용하기 위한 조류 수확을 위한 수확 유닛 (2)을 포함하는 이동식 장치에 있어서, 조류의 효소 소화를 위한 가공 유닛(3) 및 조류로부터의 단백질의 단리를 위한 회수 유닛 (4)을 추가로 포함함을 특징으로 하는 이동식 장치.
- 제17항에 있어서, 혐기성 소화 유닛 (6), 혐기성 소화 유닛 (6)으로부터의 생성물의 회수를 위한 회수 유닛 (7) 및 회수 유닛 (4) 또는 (7)로부터의 생성물의 제형화를 위한 제형화 유닛 (5)을 추가로 포함함을 특징으로 하는 이동식 장치.
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