CN105073975B - 从发酵微生物中回收细胞内组分的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种在发酵/培养之后，回收生物来源材料例如酵母、藻类、细菌和/或霉菌的细胞内组分的方法，其包括经由雾化的热溶解处理，并且使用雾化溶剂，该溶剂能够在雾化完成时萃取所述细胞内组分。

Description

从发酵微生物中回收细胞内组分的方法
本发明涉及一种回收生物来源材料例如酵母、藻类、细菌和/或霉菌的细胞内组分的方法。
本领域已知细胞微生物的悬浮液可以通过扰动和破坏细胞膜例如通过改变渗透压力来溶解。例如，简单的降低液体环境的离子力，或者加入表面活性剂并且适度搅拌悬浮液，会使得细胞溶胀和使得它们溶解。另一方面，在其他情况中，需要强力搅拌该悬浮液，同时施加强的热、机械或声波作用来破坏细胞膜，这伴随着细胞溶解成本的增加。例如，细菌、酵母和藻类的细胞是明显更耐受的，并且将它们溶解来回收细胞内组分是困难的，因此必须诉诸于比渗透更有效的方法来获得它们。
在“Disruption of microbial cells for intracellular products”，EnzimMicrob Tech.，1986，第8卷中，提出了破坏细胞壁的主要方法，其是：
a)机械方法：
-依靠细胞和固体材料之间的摩擦力，例如使用珠磨机或者X-压碎器或者Hughes压碎器；
-依靠在细胞悬浮液中的摩擦力，例如用超声波或者用高压均化器或者用所谓的费氏压碎器。
b)非机械方法：
-依靠酶、化学溶解(使用清洁剂、溶剂或者抗生素)或者物理溶解(渗透性冲击或者压力)。
在工业方法中(其在发酵结束时提供了微生物的收集和它们的细胞破坏或者溶解来释放细胞内产物)，油性和含水酶相经常伴随着细胞的残留物。
工业上从种子中萃取油的一种方案是使用这样的处理装置(揉捏法)，其具有通过螺旋桨搅拌的足够的体积，该螺旋桨以20-30rpm的速率旋转，并且确保了用于释放油性液泡的破碎方法的充足停留时间(1-2或更多小时)。该方法在低温(20-30℃)在空气中进行。
工业设施通常可以包括串联(在这种情况中，经常叠加来限制阻碍空间)或者并联布置的更多个捏合机，依靠水力系统机械装入离开碾碎机的油糊剂。该方法产生了温和的热溶解(其与该糊剂缓慢的再混合有关)，允许释放油相，其然后通过浮选法来分离。该技术对于尺寸大于几十微米的微生物是有效的，但是它对于耐受性微生物例如一些但不仅是油脂酵母(Lypomyces)、红酵母(Rhodotorula)和隐球酵母(Cryptococcus)种类是无效的。用于指示该方法的技术参数是操作的温度和持续时间。温度对于随后的萃取中的产率是基本的，并且与细胞内容物的释放阶段严格相关。时间参数与运行模式相关联。
对于需要剧烈的温度和压力条件的细胞溶解的情况来说，另一类型的能够进行该方法的工业机器是由固定的或者旋转的汽缸组成的机器，其装备有能够混合、破坏和伴随待溶解的细胞的内叶片或者混合器。该机器在食品工业中用于热水解，并且有时用于硫酸的酸性环境(参见例如Anco-Eaglin Inc的机器)。
美国专利申请US2010/0006515A1描述了一种用于热机械细胞溶解的机器，其充当了螺杆压碎器，用于大于5巴的压力和高于120℃的温度。在说明书中，它显示了该机器还能够在用于细胞产品的热溶解方法过程中，用特征为强的热/机械破坏强度的膜来进行细胞液体的分离。
使用玻璃或者陶瓷珠磨机允许强力摇动和破坏该糊中待溶解的细胞。该方法已经使用了多年，并且被认为可用于酵母和真菌、微细菌、孢子和微藻类的生物族。最近已经用于土壤样品以及植物和动物组织的小样品。
虽然两种方法(基于磨机和基于螺旋转鼓的那些)对于某些类型的细胞是有效的，但是它们的特征在于高的操作成本以及装置成本。后者来源于进行溶解作用所必需的时间，以及有时候，归因于伴随着细胞微生物的生长环境的化学品侵蚀，如在藻类的情况中，其中氯的存在需要使用高耐受性材料例如主要基于镍和铬的合金。
最近，已经使用了基于声学或者磁性溶解过程的方法，这意味着较低的最终能量成本。
液体的强超声作用例如产生了声波，其在液体介质中以交替的高压和低压循环来传播。在低压循环期间，在液体中产生了高浓度的小尺寸真空泡。因此使用空穴方法来内破该液体泡，其由此允许产生能够机械破坏细胞结构的剪切力。这种效应被用于从藻类中萃取脂质。为了有效地从水相和细胞碎片中分离油相/脂质相，需要添加溶剂，因为否则该细胞碎片也将保持吞噬在油相/脂质相中。
其他方法包含依靠将高压(20,000-30,000psi，或者140-210MPa)送过具有窄口的阀来压碎细胞。该流体因此经历了高剪切力，因此破坏了细胞。用于优化细胞的破裂的剪切力通过控制压力来限定。该系统需要高能量和冷却样品，这需要穿过该系统的多个步骤。
机械均化包括在这些机械方法中，其在高压条件下操作，并且使用了高能密度，其基于使用压力和微阀来分开颗粒，直到它们已经减少到最小尺寸(低于1微米)。均化阀是分尺寸的，以在最低可能的压力时获得期望的微粉化和分散度，这取决于不同的应用。它们是连续的工业机器，其也可以使用低的比能来管控大体积流量(例如这样的机器，其需要等于315kW的功率来在1,500巴的过压时处置6m3/h的液体流量)。
用于热溶解的另一方案描述在名称为“Hydrothermal treatment”的文献中，其实验上可用于藻类的溶解，并且提出用于萃取油性种子中所含的脂质。该方法提供了用于释放藻类中所含的脂质的实验数据。操作由在压力(200大气压)和250-300℃的温度，在液-固悬浮液上的热溶解机构组成。脂质从固体的溶解的细胞物质中最终萃取用正己烷来进行。用于由该在后技术所形成的问题的技术方案，与使用增压均化系统的那些相同，也需要昂贵的工业应用，尤其是对于所用的材料，其必须确保对于包含在溶解方法条件下待处理的悬浮液的物理化学系统应有的耐受性(“Hydrothermal processing of high-lipidbiomass to fuels”Johnson，Michael C.，Ph.D.Massachusetts Institute ofTechnology.Dept.of Chemical Engineering Massachusetts Institute of TechnologyIssue Date：2012)。
国际专利申请WO99/15638涉及一种改变微生物、真核生物或者原核生物、脂质体、囊泡或者存活细胞的脂质膜例如双脂质层的结构的方法。具体地，该方法产生了脂质结构的不稳定(扰动)，其允许融合脂质膜，而不包括细胞的溶解。
WO99/15638中所述的方法提供了使用低温喷雾干燥机，来将液体介质例如生理溶液、牛奶、血液、血清、发酵培养液和水(含有脂质结构)雾化成液滴，将其高速引入处于受控温度的含有蒸气的环境中。
在WO99/15638的方法中，用于在雾化过程中悬浮待融合的细胞或脂质结构的液体介质通过在这些的部分上的溶解，而促进细胞膜的融合过程。所用的液体介质必须因此不有利于这些膜的破坏，而是有利于它们的聚集。WO99/15638的方法的目标不是破坏两种或更多种不同细胞体的膜，而是保持未改变的源细胞的特性，因此使得细胞膜部分融合。以此方式，该方法产生了分子聚集体，其合并了多细胞混合物中的聚集细胞的特性。
在细胞的溶解中，想要从进行了发酵或者培养的微生物中回收该过程的产物，并且必须首先进行溶解或者破坏，例如在过程体积或者反应器中，在适于获得高于120℃的温度下，在至少5巴的压力和适度搅拌下用热方式进行10分钟到4-5小时的时间，即微生物溶解所必需的条件。随后必需：开启反应器冷却；从反应器中萃取作为固体残留物、油、水和其他细胞内产物的悬浮液的物质；和最后必须添加有机或无机溶剂或者其混合物，通过随后进行增溶和液体与固体分离操作，来获得发酵或者培养过程所产生的细胞内容物。
该方法的特征在于萃取发酵过程产物的整个方法所需能量的超过90％归因于在发酵的微生物上所进行的热溶解。
所以非常令人感兴趣的是寻找一种获得发酵的生物材料的细胞内组分的新方法，其中整个方法的能量需求远低于常规方法的能量需求。
本发明涉及一种热溶解方法，用于回收(萃取)生物来源材料的细胞内组分，所述生物来源材料例如培养的酵母、藻类、细菌和/或霉菌，或者具体地发酵的产品，其使得所述生物产业过程的溶解方法所用的操作成本和装置成本最小化。
本发明的方法包括：
-将至少两种物流共同进料到雾化器，其中第一物流包含待溶解的细胞微生物的含水悬浮液，第二物流包含液态或气态溶剂(雾化溶剂)；
-在一定环境中雾化含有所述微生物和它们的热细胞溶解物的悬浮液，该环境的特征为高交换表面和因此特征为在小处理体积或反应器中的低接触时间，这通常实现装置相对较低的成本；
-将细胞内组分与来源于溶解的细胞残留物进行分离。
与悬浮液中的细胞或者雾化溶剂一起使用的液体通常是水和/或另一化学化合物，其促进细胞膜的破裂过程，以释放出细胞的内容物。因此，所用的溶剂必须有利于这些膜的破坏，以及有利于细胞内产物与其余固体基质的分离。雾化溶剂的具体例子是有机溶液，例如烃、醇、酯、醚。当雾化溶剂是液体水溶液时，则无机酸也可以加入其中。
微生物悬浮液的雾化在含有惰性气体、水蒸气、二氧化碳和/或气相有机溶剂的膨胀室(雾化室或热溶解装置)中，在高温进行。该雾化室可以已经处于溶解温度，即90℃-180℃，优选120℃-160℃和甚至更优选130℃-150℃。
本发明的优点实际上在于它可以在与本领域已知的溶解方法中通常所用的温度相比更低的温度操作。
由于雾化而产生的与高接触表面的相互作用，允许将动能快速转移到雾化的悬浮液，这引起了雾化液滴中存在的微生物的细胞壁和/或细胞膜通过膨胀而机械破坏。因此获得了通过培养或者特别是通过发酵所产生的细胞内内容物的释放，其然后可以沿着热溶解装置之后的处理装置来回收。
随后的处理装置存在于第一雾化室之后，例如积聚槽、旋风分离器或者表面冷凝器，其保持在铸件降低的温度，并且沿着其观察到多相悬浮液(其包含细胞内的内容物、固体(细胞碎片)、含水液体和油性液体)的分离，这归因于雾化室的部分大气压蒸气的冷凝，后者归因于溶剂(其与细胞的悬浮液和细胞内内容物或脂质一起共同供给)。
含水相包含：水、培养或发酵培养液的残留物、盐、溶剂和少量增溶的脂质。该脂质或油性相包含：有机溶剂、脂肪酸、脂质、水和它们的盐。该固体相包含由细胞聚集体(细胞碎片)剩余的固体残留物，其可以仍然包含非萃取的脂质，并且其可以任选地进行以下一种或多种另外的溶解操作：通过随后的雾化操作和在同一装置中完成溶解，通过与主进料一起再循环，到雾化室的顶部，或者进入随后的溶解装置。
在雾化室中所产生的多相悬浮液然后进行通过重力或离心分离的分离，以将水和固体与含有溶剂和脂质的油性相进行分离。所用的溶剂(初始雾化溶剂)的性质也影响该操作，因为它会产生起泡的悬浮液形式的相，其难以处理。因此雾化溶剂的选择也必须有利于溶解后所获得的悬浮液组分的可分离性。
雾化溶剂的回收步骤总是存在于固体相与液体相的分离步骤的下游，类似于溶剂萃取的化学方法。
所回收的脂质可以直接使用或者送到打算用于其最终用途的处理，例如处于用作生物燃料的范围内、氢化或者酯交换处理。
所关注的细胞内内容物依靠重力分离或者离心分离与溶剂/含水相分离。在该分离系列的终点，水可以部分保持为蒸气形式和部分保持为冷凝形式。水总是存在的，因为它来源于细胞内初始存在的水。
具体地，本发明的方法可以用于作为在糖基底上生长的酵母中的细胞内化合物而获得的脂质的生产方法。这些细胞生物体例如酵母油脂酵母、红酵母和隐球酵母具有细胞壁，其也特别耐受对应于甚至高于1000巴的压力的强机械/热应力的作用。
雾化作用降低了整体方法的能量需求，因为雾化所形成的高热交换表面和穿过细胞的高热曲线所诱导的空穴现象有利于基于溶解方法的热交换。
通过雾化所产生的环境实际上的特征在于作为气相和液相之间热交换的增加而观察到的细胞界面处的高能量转移。气相和液相之间的热交换归因于这样的事实，即两相之间的界面越大，液体-固体悬浮液的液滴的直径越小，并且穿过细胞膜的能量的转移速率相对于液态/气态大气接触表面的增加而言相当大的增加，所述接触表面与液滴的直径成反比，其因此相对于重力分离表面的液体蒸发的情况而言，使它的效率增加约三个测量单位。对于水和空气来说，阈限对流热交换系数h的典型值：h＝10-100W/m2K；水＝500-10,000W/m2K。
用于雾化和随后萃取酵母、藻类、细菌和/或霉菌的细胞内组分的溶剂是：极性有机溶剂，例如醇、酯、酮，特别地优选甲醇、乙醇、异丙醇和/或乙酸乙酯，非极性有机溶剂，例如烷烃，特别优选己烷和/或异辛烷，特征为正常沸腾曲线是50℃-180℃、优选100℃的炼厂馏分，不同有机炼厂物质的混合物，优选石油醚、石脑油和/或烷基化汽油，或者上述溶剂的混合物。
除了水蒸气之外，含有微生物的悬浮液在其中进行雾化的雾化室可以包含惰性气体，例如氮气、氦气、氩气、二氧化碳，或者上述作为雾化溶剂的有机溶剂的饱和的或者过热的蒸气。这能够溶解微生物，并且能够在所关注的细胞内组分的溶剂中萃取。
通过增压溶剂来促进从微生物的固体基质中萃取细胞内液体。该萃取然后通过离心作用来改进，其促进了所形成的悬浮液的不同密度的固相和液相的分离。
为了获得热溶解，雾化室中的温度范围为90℃-180℃，优选120℃-160℃和甚至更优选130℃-150℃。
具体地，后者的范围对于酵母，特别是酵母油脂酵母、红酵母和隐球酵母是优选的。
雾化溶剂与细胞悬浮液在雾化之前混合能够改进溶解方法的整体产率，因为它化学作用于形成细胞膜的双脂质层上，如现有技术的技术方案中所观察到的那样。在本领域中，实际上，在溶剂和待溶解的细胞之间的长接触时间与温度和压力都是获得微生物溶解的重要因素。
但是，当溶剂在引入雾化器之前与细胞接触，以及当溶剂存在于雾化室中(这里在溶剂加入其中之前，微生物的悬浮液已经进行了雾化)这两种情况中，该长接触时间代表了进一步的能量成本，而本发明的目标是降低这些成本，和因此特征在于溶剂与待溶解的细胞的低接触停留时间。
用于本发明方法的雾化体积的减少来源于应用了这样的构思，即来源于细胞溶解作用的含有固体-液体相的悬浮液与雾化后所释放的蒸气分离。这种构思也预期了在需要时，使用相对于气体流动来说串联布置的不同的分离室，其是除了溶解的细胞的固体残留物之外，促进细胞内容物的分离所必需的。
雾化室的形式必须有利于悬浮液与蒸气的分离以及悬浮液从其底部的流出和收集。圆柱形式(其同时还夹入了栅格状或者层状减速器，具有用于收集悬浮液的截顶圆锥形端部)是雾化室的优选形式。
在第一和随后的室之间存在着渐增的热曲线的情况中，当这些温度低于所述方法预期的温度和压力值，其不影响溶解作用。通常据称，雾化室之后的室中较高的温度可以在对溶解的液体产生化学作用方面起反作用。
在另一方面，热曲线(沿着从雾化体积开始的工艺管线，其通过在壁处施加的热交换或者依靠分离器体积中的交换嵌件来限定)通常影响了溶剂从来源于溶解的悬浮液中的释放。该曲线通过细胞内容物所释放和所允许携带的气体流速来限定，这归因于物理化学液体/蒸气平衡和气体速度的作用。
雾化室可以已经处于溶解温度或者处于更高的温度，以促进溶解中的高处理流速，并且包含上述气体或者蒸气，其所处的温度等于或者高于进行溶解和萃取时的温度。
该含有待溶解的微生物的悬浮液可以在比进行溶解的温度更低的温度进入雾化室。在这种情况中，该溶剂以一定的流动和热水平进入，从而与待溶解的物质一起达到雾化器中的溶解条件。
在微生物悬浮液进料之前，部分的细胞内/细胞外存在的水和部分的或者全部的溶剂(其可能与微生物悬浮液一起进料)在雾化室中通过降低雾化室中存在的温度来蒸发，释放出高沸点液体例如细胞内脂质，其在所述室的壁上与细胞碎片一起分离。
在雾化室之后的分离体积中可能的升温对于脂质具有不利的影响，增加了悬浮液中所含的脂肪酸的份额。但是，这种增加可以促进从固体基质中的萃取。
在溶解后，所关注的脂质性质的细胞内组分例如甘油三酸酯、单和二酰基甘油酯脂肪酸、磷脂、叶绿醇、胆固醇与固体细胞残留物一起释放到高沸点油的悬浮液中(在室温，脂质的沸点高于300℃)。如果这可以与所述油分离，例如当该溶剂是含水的或者极性的时，则该高沸点油的悬浮液然后与雾化溶剂分离，并且送去分离固体细胞残留物(碎片)；如前面已经指出的那样，该分离可以通过重力、密度、离心分离或者过滤来进行，例如用水力旋流器、倾析器或者三相卧螺离心机(tricanter)来进行，或者通过蒸馏，依靠膜或者通过产物的蒸发来与雾化/萃取溶剂分离。
膨胀室中存在的细胞内来源或者来源于细胞悬浮液或者高温蒸气的水可能与待溶解的悬浮液一起或者分别加入来用于热交换，并且优选从该悬浮液中除去以促进随后的固体/液体分离，避免了泡沫和悬浮液，其会对随后的细胞产物的分离产生不利的相互作用。雾化溶剂任选地与加压的水蒸气一起进料，以控制雾化器中的溶解温度。如果在液相中存在容易的水/溶剂分离，则使用该操作方法。在这些情况中，将含有溶剂和水的蒸气送到第二室，并且一旦与水分离后，则再循环到雾化器，在这里它与新鲜溶剂整合。
可以用于雾化的装置基本上与固体的液体悬浮液的雾化分离所用的装置(喷雾干燥器)类似或者相同。喷雾干燥器是设备的组合，其包括含有悬浮液、无机固体或者不含、气体或者蒸气源例如热和机械能载体的液体的供给泵，雾化器，加热器，离开雾化器的蒸气/液体/固体混合物的分散空间，或者干燥室，还有蒸气/废气混合物的处理/冷凝系统和可能的粉末回收。该固体混合物在干燥室的温度干燥萃取。
考虑微生物热溶解所必需的条件和从保留产物的细胞物质中萃取该产物的条件，如果使用，则可以规定一系列的作用条件，用于固体、液体或者溶剂中增溶的脂质的溶解和回收。
将要用于溶解应用的材料必须与操作条件相关来限定，即与名义作用温度和压力相关，以及与对环境的侵蚀条件的耐受性相关，并且又与伴随着细胞的液体中的溶剂和内容物相关。
本专利申请的应用方法能够可观地节约用于进行细胞的溶解操作和细胞内化合物的萃取的设施的改变和CAPEX成本(资金支出)，归因于这样的事实，即由于本发明的方法，存在显著的能量节约，因为不再需要用于热或者机械溶解第一相中的细胞的设备，和随后昂贵的脂质萃取单元。
附图说明
图1：图1显示了脂质相对于干重的萃取产率(dw％)，其与酵母油脂酵母(L)、红酵母(R)和隐球酵母(C)的悬浮液的雾化温度有关。
图2：图2显示了在雾化之后但在溶剂萃取其中所含的脂质之前，随着雾化温度的增加，油脂酵母酵母细胞之间的温谱图的比较。
图3：图3显示了在105℃的烘箱中干燥的油脂酵母酵母细胞的温谱图；可以观察到残留物重量％曲线(左边的刻度)和导出的曲线(D％/DT)。
图4：图4显示了三油精(图4a)和萃取物SOX107(在150℃)(图4b)的IR光谱。
图5：在图5中，表示了用于实施本发明方法的闭合循环方案的设施方案。
图6：在图6中显示了表4，其表示经由糖发酵处理的红酵母的相关实施例的材料和能量平衡。
实施例
实施例1
将油脂酵母、红酵母或者隐球酵母(生物质)类型的酵母在水中的三种悬浮液用于根据本发明的方法来回收细胞内组分。没有其他溶剂加入到雾化相中的悬浮液。
在该实施例中，目标仅是定义所提出的方法的溶解能力。然后根据经验，通过常规的分析，依靠索格斯利特萃取器(Soxhlet)液体-固体萃取装置来评价有效的溶解。
对于悬浮液的雾化，使用了供应商BUCHI的MINI Spray Dryer190，其作为干燥器，能够用700-1,000Nl/h的N2流(其可以加热到最大温度250℃)蒸发约100-500g/h的水，并且其因此能够产生约1-100g/h的粒度处于0.2-10微米量级的干粉。
生物质从该回路的“热部分”直到雾化喷嘴所用的总时间是10-30秒。进料到雾化室直到雾化或者喷雾室的整个回路的气体处于轻微的真空下，表示为0.97大气压。
氮气作为雾化室中的惰性气体存在，在雾化室中喷入待处理的悬浮液，它的温度保持在与旋风分离器的入口大致相同的值(在喷嘴后，通过悬浮液水的蒸发立即将样品带到该温度，并且其是恒定监控的，如表1所示)。
使用索格斯利特萃取器装置从细胞固体中萃取脂质。将纸套筒用萃取溶剂清洗，然后在105℃的烘箱中获得恒定重量。将待处理的固体(3-20g)装入该套筒中。将萃取溶剂(150-200ml)装入烧瓶中，它的皮重已经进行了精确的测定。在表1和2所述的实施例中，使用了以下产品：己烷，其特征在于沸点是69℃和密度是0.655g/ml，极性指数是2，乙酸乙酯，其特征在于沸点是77℃和密度是0.90g/ml，乙醇，其特征在于沸点是79℃和密度是0.789g/ml，极性指数是24。将蒸发器引入该烧瓶中，并且将该烧瓶用油浴加热。在索格斯利特萃取器上部将溶剂用水冷凝器再冷凝。进行了约10个萃取循环，在最后一个循环结束时，将该套筒移走，并且置于105℃的烘箱中，直到获得恒定重量。
为了从脂质萃取物中分离该萃取溶剂，将索格斯利特萃取器替换为克莱森瓶(claisen)，并且首先在大气压，然后在约0.005绝对大气压的真空下蒸馏该溶剂。该脂质萃取物保留在该烧瓶中。
使用光学显微镜来测定雾化操作之前和之后的颗粒的形态，和使用热天平(Perkin Elmer)来表征所获得的粉末的湿度和灰分含量。
进行傅里叶变换分光光度分析(FT-IR)来表征脂质萃取物。该萃取物通过将该萃取物直接流延到CaF2片上，依靠FT-IR分析(Nicolet Nexus 670)在4,000-1,000cm-1(在2cm-1)的透射范围内来表征。
下表1所示的雾化使用上述方法来进行。
测试SD100在软化H2O中，相对于其他为约1:3的稀释进料来进行。三个测试的不同在于雾化室的温度(下表1中的T出)，并且具体是95℃、130℃和150℃。应当注意的是在喷雾干燥器中干燥之前，表中所示的用于测试SD104的隐球酵母通过添加软化水来进行渗滤和进行超滤来分离/收集酵母细胞，并且留下初始时与酵母一起存在于水中的糖，目的是除去发酵的残留葡萄糖。
表1–雾化条件
(续表1)
表1的关键词：
测试＝测试代码
重量(g)＝雾化的酵母悬浮液的量
干重(dw％)＝雾化的悬浮液中酵母的量
氮气(l/h)＝在进料到雾化室的热气中的流速
真空(大气压)＝在旋风分离器后的氮气的绝对压力，其中已经分离和收集了干燥的酵母
设定点泵＝雾化室中酵母悬浮液的进料泵的流速选择器(3＝低，4＝中，5＝高)
T入(℃)＝雾化室入口处氮气的温度，所以其是在待雾化的悬浮液引入之前的温度
T出(℃)＝引入了酵母悬浮液之后雾化室的温度
f重量(g)＝在位于雾化室之后的旋风分离器中所收集的干酵母的量
估计回收率(％)＝相对于进料到悬浮液中的酵母的量，在旋风分离器中所收集的酵母的重量。
在位于雾化室之后的旋风分离器中所收集的酵母被证明是干燥的，因为它们的残留水含量小于5％。这些干燥的酵母依靠热重分析来表征。热重分析法由在室温和930℃之间，以10℃/分钟的梯度，记录空气中重量的变化来组成。进行了热重分析的样品是下表2中所列的那些。
表2
在用作喷雾干燥器的高至95℃温度的本发明仪器上的正常雾化操作，产生了这些酵母悬浮液的有效干燥(固体中残留水含量小于5％)，但是同时进行细胞膜的溶解不是有效的。仅从较高温度开始，其中样品保持了约10-20秒。在高于或者等于120℃的温度，在索格斯利特萃取器装置中进行的以下萃取方法中，获得了以萃取物百分比计的显著产率，其随着雾化温度的增加而逐渐增加。
简言之，在雾化温度的增加和微生物有效溶解之间的直接的和明确的关联性是明显的。在所萃取的脂质的确认测试过程中，它实际上证实了溶解效果随着雾化过程的温度的增加而增加，这归因于喷雾器中的温度值和急速的升温，其导致样品膜破坏。
图1显示了脂质的萃取产率(dw％)，其与油脂酵母(L)、红酵母(R)和隐球酵母(C)酵母的悬浮液的雾化温度有关。
在图1中可观察到，使用相同的溶剂时，萃取产率百分比随着微生物雾化温度的增加而增加。
图2显示了温谱图，其显示了用本发明的方法所获得的结果。
具体地，图2显示了在增加的雾化温度(即在95℃、130℃和150℃)雾化之后，但是在溶剂萃取其中所含的脂质之前，油脂酵母酵母细胞的温谱图之间的比较。
图2的温谱图代表了残留物重量％曲线(左边刻度)和推导曲线(D％/DT)，其通过在空气气氛中，以10℃/分钟的加热曲线在95℃、130℃和150℃的温度加热雾化的样品来获得。
在温谱图中所观察到的主要重量损失时的温度是280-380℃。该重量损失指示了膜的破坏，并且在图中与样品雾化的温度有关。具体地，从该对比中可以观察到初始悬浮液较高的雾化温度(如表1所示，样品SD100在95℃(T出＝95℃)雾化，样品SD101在130℃和样品SD102在150℃雾化)导致了与所分析的样品的重量损失(膜的破坏)有关的较低的温度。
为了对比的目的，图3显示了在105℃的烘箱中干燥的油脂酵母酵母的悬浮液的温谱图，从其可以推断出在这些温度(其是通常用于喷雾干燥器的干燥技术中的那些温度)没有发生重量损失(即由于单独的热干燥效应而引起的假设的溶解的测量)。仅使用明显更高的温度和更长的处理时间(相对于约10微秒几个量级)时，热溶解才会导致雾化实施例中所用的酵母膜的破坏。图2的温谱图还显示了用雾化所生产的样品中的残留含湿量如何低于5％(在105℃温度的重量损失小于5％)和如何存在着小于4％的适度灰分含量(在600℃温度的残留物重量)。明显的降解现象的开始用重量损失来指示，观察到其处于约220℃。
在280℃和380℃之间的重量损失在较低的温度开始，并且样品雾化温度增加，其指示了在将细胞内物质向外部环境释放中较大的便利性。所观察的其他重量损失，特别是在约250℃、420℃和500℃的重量损失，其是其他细胞组分例如碳水化合物，相反地，其看起来没有受到该样品所经历的雾化处理的影响。
图4显示了萃取物SOX107的IR光谱曲线(在150℃)(图4b)(同样参考表1和2所示样品)，并且为了直接比较，显示了参考的甘油三酸酯的IR光谱(即使用三油精)(图4a)。从比较中，可以推断出用本发明的方法所获得的光谱是甘油三酸酯的那些，其具有在1750cm-1的羰基谱带特征。还存在着游离脂肪酸(在1705cm-1的谱带)，其来源于脂质的水解(甘油三酸酯)。
实施例2
下面显示了用于本发明方法的设施方案，其中萃取了红酵母族的酵母中所包含的脂质。
在该实施例中，将发酵水中的悬浮液中待溶解的物质与作为溶剂的正己烷一起在溶解中处理，正己烷是从固体中萃取脂质所必需的。
图5表示了闭合循环方案的设施方案，其中雾化用常规的工业喷雾干燥器来获得，其中操作的说明符合实施例1中所列的数据，并且根据待溶解的产物而变化，其与所用的温度条件和溶剂有关。符合具体的喷雾干燥技术的宽范围的雾化室和注射系统可在该目录中获得。
下表3提供了图5的设施方案的符号关键词：
表3
图5所示的方案包括泵P-100，其携带有溶剂，用于在适于雾化室中的热交换和溶解操作的压力值下萃取细胞内产物。这里，必须获得用于微生物的细胞破裂的具体温度和雾化的悬浮液的5-300秒、优选约10秒的停留时间。
液体(流“12”)经过交换器，无相变，然后进入静态栅格混合器，在这里它遇到和携带待溶解的悬浮液或者浑浊溶液(流“1”)到喷雾干燥器(雾化器)。
该混合器中的紊流径向混合机构降低了待混合的单相聚集体的径向速度和尺寸，增加了接触表面和激励了热和化学品浓度交换，改进了混合。分散器所需的长度取决于所需的接触时间。对于质量转移过程(其中快速建立了平衡)，5倍直径的长度通常是足够的。
本领域存在着诸多的不同类型的气动雾化器应用，其可以根据进料的浓度和/或粘度特性来使用。例如可以提及下面的：
-同心管雾化器
-交叉流动雾化器
-DIN(直接注射雾化器)
-穿孔盘雾化器
-“V形槽”和“锥体喷雾”形式的Babington雾化器
-“平行路径”雾化器。
在工业系统中，产物的雾化用不同的喷雾干燥器，在受控的温度和空气流动条件下进行，其可以旋转以改进室V-100的均化。
引入到混合器中的用于所述操作条件的液体或者液化气离开喷嘴，并且通过扩散器以气溶胶形式分散。该悬浮液被分成雾化的液滴，其然后与本实施例的水蒸气接触，用于雾化室V-100的温度控制和膨胀。该室的温度通过另外的和壁蒸气的流而保持在溶解阈值以上。
部分的或者全部的液体溶剂和水(其伴随着待溶解的产物)的蒸发，释放了高沸点油的悬浮液中的细胞(如已经所示的，脂质的正常沸点高于300℃)。
蒸气在受控的温度和流动条件排出室V-100。通过重力和压力来从雾化室中连续排出固体残留物和脂质的悬浮液，并且可以送去分离细胞残留物(这是在图5中的方案中用“4”表示的流)。流“2”代表了用于控制雾化室温度的水蒸气流。
在冷却到低于100℃后，将蒸气送到溶剂回收塔C-100，其然后与补充流一起再循环到泵P-100。
在处置之前，将所分离的水(流“6”和“7”)送到处理设施。
图6中提供的表4显示了与经由糖发酵处理的红酵母有关的实施例的材料和能量平衡。
开发了该方案，用于以30重量％的浓度溶解在待处理的浑浊溶液中的固体。表4中表示了用于溶解操作的规格条件。在这方面，1.52kg的蒸气是在30巴和21kg的冷却水/kg待溶解的浑浊溶液所必需的。其他交换在内部补偿。
萃取操作然后在三相卧螺离心机上使用己烷来进行。
如果由过滤所形成的进料涉及到70重量％微生物的浑浊溶液，则特征消耗量将下降到极其有利的0.37kg蒸气和4.25kg塔水/kg待溶解的浑浊溶液。

Claims (16)

1.从微生物的悬浮液中回收细胞内组分的方法，其包括：
-将至少两种物流共同进料到雾化器，其中第一物流包含待溶解的细胞微生物的含水悬浮液，第二物流包含液态或气态溶剂；
-在保持于120℃-180℃温度的雾化室中用5-300秒雾化所述悬浮液，以获得该微生物细胞壁的溶解，并且形成含有细胞内组分和来源于溶解的细胞残留物的悬浮液，和包含有机溶剂的气相；
-将该细胞内组分与该来源于溶解的细胞残留物进行分离。
2.根据权利要求1所述的方法，其中该溶剂是极性有机溶剂。
3.根据权利要求2所述的方法，其中该极性有机溶剂选自醇、酯、酮或者其混合物。
4.根据权利要求3所述的方法，其中该极性有机溶剂选自甲醇、乙醇、异丙醇和/或乙酸乙酯。
5.根据权利要求1所述的方法，其中该溶剂是非极性有机溶剂。
6.根据权利要求5所述的方法，其中该非极性有机溶剂是烷烃。
7.根据权利要求5所述的方法，其中该非极性有机溶剂选自己烷和/或异辛烷，特征为正常沸腾曲线是50℃-180℃的炼厂馏分，石油醚，石脑油和/或烷基化汽油，或者其混合物。
8.根据权利要求1所述的方法，其中经培养的微生物的悬浮液的雾化在雾化室中进行，该雾化室含有惰性气体，该惰性气体选自水蒸气、二氧化碳或者气相的雾化溶剂。
9.根据权利要求1所述的方法，其中该雾化室的温度是120℃-160℃。
10.根据权利要求1所述的方法，其中该微生物是酵母、藻类、细菌和/或霉菌。
11.根据权利要求8所述的方法，其中该经培养的微生物是选自以下的酵母：油脂酵母、红酵母和隐球酵母。
12.根据权利要求1所述的方法，其中该细胞内组分是细胞内脂质，其通过该经培养的微生物依照糖发酵而产生。
13.根据权利要求1所述的方法，其中将该细胞内组分与该来源于溶解的细胞残留物进行分离通过重力或者通过离心分离来进行。
14.根据权利要求1所述的方法，其中含有该细胞内组分和该来源于溶解的细胞残留物的该悬浮液通过再循环该悬浮液，来经过至少一次另外的溶解操作。
15.根据权利要求14所述的方法，其中含有该细胞内组分和该来源于溶解的细胞残留物的该悬浮液与待溶解的初始悬浮液一起在该雾化室上游进行再循环。
16.根据权利要求14所述的方法，其中含有该细胞内组分和该来源于溶解的细胞残留物的该悬浮液的再循环朝向该雾化室下游的溶解单元进行。
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