BR112015011696B1 - Método para recuperação de componentes intracelulares a partir de uma suspensão de microorganismos - Google Patents

Abstract

MÉTODO PARA RECUPERAÇÃO DE COMPONENTES INTRACELULARES DE MICROORGANISMOS FERMENTADOS. A presente invenção refere-se a um método para a recuperação de componentes intracelulares de materiais de origem biológica, tais como leveduras, algas, bactérias e / ou bolores, após a fermentação / cultura, que compreende um tratamento de lise térmica através de nebulização e o uso de um solvente de nebulização capaz de extrair os referidos componentes intracelulares uma vez que a nebulização foi concluída.

Description

[0001] A presente invenção refere-se a um método para a recuperação de componentes intracelulares de materiais de origem biológica, tais como leveduras, algas, bactérias e/ou bolores.

[0002] É conhecido na arte que as suspensões de micro-organismos celulares podem ser lisadas por perturbação e ruptura da membrana celular, por exemplo, por variações na pressão osmótica. A simples redução da força iônica do meio líquido, por exemplo, ou a adição de um agente surfactante com agitação moderada da suspensão, permite as células serem inchadas e permitindo a elas serem lisadas. Em outros casos, por outro lado, uma agitação vigorosa da suspensão é necessária, em conjunto com uma forte ação térmica, mecânica ou sonora para romper as membranas celulares, com um aumento nos custos da lise celular. As células de bactérias, leveduras e algas, por exemplo, são muito mais resistentes e a sua lise para recuperar os componentes intracelulares é difícil de modo que o auxílio deve ser feito com métodos mais eficazes do que a osmose para obtê-los.

[0003] Em “Disruption of microbial cells for intracellular products”, Enzim Microb Tech., 1986, vol. 8, os principais métodos são descritos para a ruptura da parede celular, que são: a. Métodos mecânicos: • por meio de forças de atrito entre as células e material sólido, por exemplo, com moinhos de bolas ou prensas-X ou prensas Hughes; • por meio de forças de atrito em uma suspensão de células, por exemplo com ultra-sons ou com homogeneizadores de alta pressão ou com as chamadas prensas francesas. b. Métodos não-mecânicos: • por meios de lise enzimática, química (com detergentes, solventes ou antibióticos) ou lise física (choque ou pressão osmótica.

[0004] Em processos industriais que, no final da fermentação, proporcionam para a coleta de microorganismos e a sua quebra ou lise de células a fim de liberar o produto intracelular, uma fase oleosa e aquosa enzimática muitas vezes acompanha os resíduos da célula.

[0005] Uma abordagem para a extração de óleos de sementes seguido pela indústria é a utilização de unidades de processamento (malaxação) com um volume adequado agitado por lâminas helicoidais que rodam a uma velocidade de 20-30 rpm e garantem um tempo de residência adequado (1-2 ou mais horas) para o processo de interrupção para libertação dos vacúolos oleosos. Este processo é realizado a uma baixa temperatura (20-30 ° C) no ar.

[0006] Uma planta industrial pode geralmente compreender mais amassadores dispostos em série (neste caso geralmente sobrepostos a fim de limitar o espaço de oneração) ou em paralelo, carregado mecanicamente, por meio de um sistema hidráulico, com a pasta de óleo saindo do triturador. Este processo produz uma lise térmica branda que, associada a uma remistura lenta da pasta, permite que a fase oleosa seja liberada, que é em seguida separada por processo de flutuação. Esta tecnologia é eficaz para microrganismos que têm dimensões maiores do que algumas dezenas de mícrons, mas não é eficaz para micro-organismos resistentes, tais como alguns, mas não somente, da espécie Lypomyces, Rhodotorula e Cryptococcus. Os parâmetros técnicos indicados para este processo são a temperatura e a duração da operação. A temperatura é fundamental para o rendimento da extração subsequente e é estritamente relacionada com a fase de liberação de parte do conteúdo da célula. O parâmetro de tempo é correlacionado com o modo operatório.

[0007] Outro tipo de máquina industrial capaz de efetuar este processo para casos de lise de células que requerem condições de temperatura e de pressão drásticas, é uma máquina que consiste de um cilindro fixo ou rotativo, equipado com lâminas ou misturadores internos capazes de misturar, quebrando e acompanhando as células sendo lisadas. Esta máquina é usada na indústria alimentar para a hidrólise térmica e, por vezes em ambientes ácidos de ácidos sulfúrico (ver, por exemplo máquinas da Anco-Eaglin Inc).

[0008] O pedido de patente americano US 2010/0006515 A1 descreve uma máquina para a lise celular termomecânica que atua como uma prensa de parafuso para pressões superiores a 5 bar e temperaturas superiores a 120 °C. Na descrição, é indicado que esta máquina pode também realizar uma separação dos líquidos celulares durante o processo de lise térmica para produtos celulares com membranas caracterizadas por uma força de quebra térmica/mecânica forte.

[0009] A utilização de moinhos de bolas de cerâmica ou vidro permite uma agitação vigorosa e quebra das células em que a pasta possa ser lisada. O método tem sido utilizado durante anos e é considerado como sendo aplicável para o grupo biológico de leveduras e fungos, micobactérias, esporos e micro-algas. Ele foi mais recentemente aplicado às amostras de solo e pequenas amostras de legumes e tecido animal.

[0010] Embora ambos métodos, aqueles baseados em moinhos e na bateria de parafuso, são eficazes para certos tipos de células, que são caracterizados por um elevado custo operacional e também o custo do equipamento. Este último provém dos tempos necessários para efetuar a ação de lise e, por vezes, devido à agressividade química dos ambientes de crescimento que acompanham os microrganismos celulares, como no caso de algas, em que a presença de cloro requer o uso de materiais altamente resistentes, como ligas com base principalmente em níquel e cromo.

[0011] Mais recentemente, métodos baseados em processos de lise sônicos ou magnéticos têm sido utilizados, o que implica um custo de energia final inferior.

[0012] A sonicação intensa de líquidos, por exemplo, gera ondas sonoras que se propagam em meios líquidos alternando com ciclos de alta e de baixa pressão. Durante o ciclo de baixa pressão, uma alta intensidade de pequenas bolhas de vácuo é criada no líquido. Um processo de cavitação é, portanto, utilizado para a implosão das bolhas de líquido, o qual assim permite que as forças de cisalhamento sejam geradas que são capazes de romper mecanicamente a estrutura celular. Este efeito é utilizado para a extração de lípidos a partir de algas. De forma que a separação da fase oleosa/lípidica a partir da fase aquosa e os resíduos celulares sejam eficazes, a adição de um solvente é necessária, tal como de outro modo os fragmentos celulares também permaneceriam englobados na fase oleosa/lipídica.

[0013] Outros métodos compreendem o esmagamento das células por meio de passagem de alta pressão (20.000-30.000 psi ou 140-210 MPa) por meio de uma válvula que tem um orifício estreito. O fluido é, por conseguinte, sujeito a forças de cisalhamento elevadas com a consequente ruptura das células. A força de cisalhamento para otimizar a ruptura da célula é definido através do controle da pressão. O sistema requer altas energias e um resfriamento para amostras que requerem múltiplos passos através do sistema.

[0014] A homogeneização mecânica está incluída nestes métodos mecânicos, que opera sob condições de alta pressão e com a utilização de uma densidade de energia elevada, que é baseada no uso da pressão e microválvulas para dividir as partículas até que tenham sido reduzidas a dimensões mínimas (abaixo de um mícron). As válvulas de homogeneização são dimensionadas para a obtenção do grau de micronização e de dispersão desejado na pressão mais baixa possível, dependendo das diferentes aplicações. Elas são máquinas industriais contínuas que também podem gerenciar taxas de vazão volumosas com baixas energias específicas de uso (por exemplo, uma máquina que manipula vazões líquidas de 6 m3/h, com sobrepressões de 1.500 bar, requer uma potência igual a 315 kW).

[0015] Outra abordagem para a lise térmica está descrita na literatura sob o nome de "tratamento hidrotérmico", que é aplicado experimentalmente para a lise de algas, e é proposto para a extração de lipídeos contidos em sementes oleaginosas. O processo é fornecido com os dados experimentais para a liberação dos lipídeos contidos em algas. A operação consiste de um mecanismo de lise térmica de uma suspensão sólido-líquido sob pressão (200 atm) e a uma temperatura entre 250 e 300 °C. A última extração dos lipídeos a partir da massa de células lisadas sólida, é conduzida com n-hexano. A abordagem ao problema tecnológico desenvolvido por esta última tecnologia, como também aqueles que utilizam sistemas de homogeneização pressurizados, requerem aplicações industriais caras, sobretudo para os materiais utilizados, que devem garantir a resistência devido ao sistema físico- químico composto da suspensão a ser tratada sob as condições do método de lise (“Hydrothermal processing of high-lipid biomass to fuels” Johnson, Michael C., Ph. D. Instituto de Tecnologia de Massachusetts. Dept. de Engenharia Química do Instituto de Tecnologia de Massachusetts Data da edição: 2012).

[0016] O pedido de patente internacional WO 99/15638 refere-se a um método para modificar a estrutura das membranas lipídicas, tais como camadas duplas de lipídeos de micro-organismos, eucariotas ou procariotas, lipossomas, vesículas ou células vivas. Em particular, este método cria uma instabilidade (perturbação) da estrutura lipídica que permite a fusão das membranas lipídicas sem lise das células envolvidas.

[0017] O método descrito no documento WO 99/15638 proporciona a utilização de um secador de pulverização a baixa temperatura) para atomização em pequenas gotas de um meio líquido, tal como, por exemplo, uma solução fisiológica, leite, sangue, soro, caldos de fermentação e água, contendo a estrutura lipídica, que são introduzidos a uma velocidade elevada em um ambiente contendo vapor a uma temperatura controlada.

[0018] No método de WO 99/15638, o meio líquido utilizado para suspender as células ou as estruturas de lipídeos para ser fundido durante a nebulização, favorece o processo de fusão das membranas celulares por lise por parte destes. O meio líquido usado por conseguinte, não deve favorecer a quebra destas membranas, mas a sua agregação. O objetivo do processo da Patente WO 99/15638 não é destruir as membranas de duas ou mais entidades de células diferentes, mas para manter as características das células originais inalteradas, permitindo assim uma fusão parcial das membranas celulares. Desta forma, o método produz agregados moleculares que combinam as características das células agregadas na mistura multicelular.

[0019] Na lise de uma célula, um quer recuperar o produto do processo a partir de micro-organismos submetidos a fermentação ou a cultura, e a lise ou ruptura deve em primeiro lugar ser efetuada, por exemplo termicamente, em um volume de processo, ou reator, adequado para a obtenção de temperaturas mais elevadas do que 120 °C, a uma pressão de pelo menos 5 bar, para um tempo que varia desde 10 minutos até 4-5 horas, sob agitação moderada, isto é, as condições necessárias para a lise dos micro-organismos. É posteriormente necessário: iniciar o resfriamento do reator; extrair a massa do reator como uma suspensão de resíduos sólidos, óleos, água e outros produtos intracelulares; e, finalmente, um solvente orgânico, ou inorgânico deve ser adicionado, ou misturas dos mesmos, a fim de obter, com as operações subsequentes de solubilização e separação dos líquidos dos sólidos, o conteúdo da célula produzido do processo de fermentação ou de cultura.

[0020] Este método é caracterizado pelo fato de mais de 90% das necessidades de energia do processo de extração global do produto do processo de fermentação é devido à lise térmica realizada sobre os microrganismos fermentados.

[0021] É, por conseguinte, de grande interesse encontrar um novo método para a obtenção de componentes intracelulares de materiais biológicos fermentados, no qual os requisitos de energia do processo global são muito menores do que os dos processos convencionais.

[0022] A presente invenção refere-se a um método de lise térmica para a recuperação (extração) de componentes intracelulares de materiais de origem biológica, tais como leveduras cultivadas, algas, bactérias e/ou bolores, ou em particular, os produtos fermentados, que permite que os custos de exploração e os custos do equipamento usados no processo de lise dos referidos processos de bio- indústria, sejam minimizados.

[0023] O método da invenção compreende: • co-alimentação de pelo menos duas correntes para um nebulizador, em que a primeira corrente compreende a suspensão aquosa de microrganismos celulares a serem lisadas e a segunda corrente compreende um solvente líquido ou gasoso (solvente de nebulização); • nebulização da suspensão contendo os referidos microrganismos e sua lise celular térmica em um ambiente caracterizado por uma superfície de troca elevada e, portanto, caracterizado por um baixo tempo de contato em um pequeno volume de tratamento ou reator, o que normalmente conduz a um custo relativamente mais baixo do equipamento; • separar os componentes intracelulares a partir dos resíduos celulares resultantes da lise.

[0024] O líquido que acompanha as células em suspensão, ou solvente de nebulização, é normalmente água e/ou outro composto químico que favorece o processo de laceração da membrana das células para liberar o conteúdo da célula. O solvente usado deve, portanto, favorecer a ruptura destas membranas e também favorece a separação dos produtos intracelulares a partir da matriz sólida remanescente. Os exemplos específicos de solventes são soluções de nebulização orgânicas, tais como, por exemplo, hidrocarbonetos, álcoois, ésteres, éteres. Quando o solvente de nebulização é uma solução aquosa líquida, ácidos inorgânicos também podem ser adicionados ao mesmo.

[0025] A nebulização da suspensão de microorganismos ocorre em uma câmara de expansão (câmara de nebulização ou unidade de lise térmica), contendo um gás inerte, vapor de água, dióxido de carbono e/ou um solvente orgânico em fase gasosa, a temperaturas elevadas. A câmara de nebulização pode já estar na temperatura de lise, isto é, que varia entre 90 °C a 180 °C, de preferência entre 120 °C a 160 °C e ainda mais preferivelmente desde 130 °C a 150 °C.

[0026] A vantagem da presente invenção é, de fato, que é possível operar em temperaturas mais baixas em relação às que são habitualmente utilizados nos processos de lise conhecidos na arte.

[0027] A interação com uma superfície de contato alta, criada graças à nebulização, permite uma rápida transferência de energia cinética para a suspensão nebulizada o que provoca a ruptura mecânica da parede celular e/ou membranas das células dos microrganismos presentes nas gotas nebulizadas, por expansão. A liberação dos conteúdos intracelulares produzidos por cultura ou, em particular por fermentação assim é obtido, o qual pode em seguida ser recuperados ao longo das unidades de processo seguintes da unidade de lise térmica.

[0028] Unidades de processo subsequentes estão presentes após a primeira câmara de nebulização, tal como, por exemplo, tanques de acumulação, ciclones ou condensadores de superfície, que são mantidos a uma temperatura progressivamente decrescente e ao longo do qual a separação de uma suspensão multifásica é observada, os compostos de conteúdo intracelular, sólidos (restos celulares), um líquido aquoso e oleoso devidos à condensação de uma parte dos vapores na atmosfera da câmara de nebulização, estas últimas devido aos solventes que são co- alimentados em conjunto com a suspensão de células, e os conteúdos intracelulares ou lipídeos.

[0029] A fase aquosa contém: água, os resíduos da fermentação ou caldo de cultivo, sais, solventes e alguns lipídeos solubilizados. A fase lipídica ou oleosa contém: solventes orgânicos, ácidos graxos, lipídeos, água, e os seus sais. A fase sólida compreende os resíduos sólidos remanescentes dos agregados celulares (detritos celulares), que ainda pode conter lipídeos não extraídos, e que pode ser opcionalmente submetido a uma ou mais operações adicionais de lise por meio de operações subsequentes de nebulização e conclusão de lise no mesmo equipamento, através da reciclagem juntamente com a alimentação primária, para a cabeça da câmara de nebulização, ou em uma unidade de lise subsequente.

[0030] A suspensão multifásica, produzida na câmara de nebulização, é então submetida a separação por gravidade ou por centrifugação, a fim de separar a água e os sólidos a partir da fase oleosa contendo os solventes e lipídeos. A natureza do solvente (solvente de nebulização inicial) utilizado também influencia esta operação uma vez que pode criar fases sob a forma de suspensões espumosas que são difíceis de tratar. A escolha do solvente de nebulização deve, por conseguinte, também favorecem o separabilidade dos componentes da suspensão obtida após a lise.

[0031] Uma etapa de recuperação do solvente de nebulização está sempre presente a jusante do passo de separação das fases sólida das fases líquidas, de forma análoga aos processos químicos de extração com solvente.

[0032] Os lipídeos recuperados podem ser utilizados como tal ou enviados a um tratamento destinado para a utilização final do mesmo, por exemplo, dentro da faixa de utilização como biocombustíveis, hidrogenação ou tratamento de transesterificação.

[0033] Os conteúdos intracelulares de interesse são separados da fase solvente/aquosa por meio de separação gravimétrica ou centrifugação. No fim do trem de separação, a água pode permanecer parcialmente na forma de vapor e parcialmente na forma condensada. A água está sempre presente, a medida que deriva da água inicialmente presente no interior das células.

[0034] Em particular, o método da invenção pode ser utilizado em processos de produção de lipídeos obtidos como compostos intracelulares em leveduras cultivadas em substratos de açúcar. Estes organismos celulares, tais como, por exemplo, as leveduras Lypomyces, Rhodotorula e Cryptococcus, têm uma parede celular que é particularmente resistente também para as ações de um forte esforço mecânico/ térmico correspondente à pressão ainda mais elevada do que 1000 bar.

[0035] A ação de nebulização reduz os requisitos de energia do processo global, tal como a troca de calor na base do processo de lise é favorecida pela alta superfície de troca de calor, que é formada com os fenômenos de cavitação e de nebulização induzidos pelos altos perfis térmicos através da célula.

[0036] O ambiente criado pela nebulização é, na verdade, caracterizado por uma elevada transferência de energia na interface celular, tal como é observado um aumento na troca de calor entre a fase gasosa e a fase líquida. A troca de calor entre a fase gasosa e a fase líquida é devido ao fato de que a interface entre as duas fases é maior, quanto menor o diâmetro das gotas da suspensão sólido-líquido, e a taxa de transferência de energia através das membranas celulares aumenta consideravelmente em relação a um aumento da superfície de contato da atmosfera líquido/gás que é inversamente proporcional ao diâmetro da gota e que, portanto, aumenta a sua eficácia em cerca de três unidades de medida em relação aos casos de evaporação do liquido a partir de uma superfície de separação gravitacional. Os valores típicos do coeficiente de troca de calor convectiva liminar, h, para a água e o ar são: h = 10-100 W / m2K; água = 500-10000 W / m2K.

[0037] Os solventes usados para a extração e subsequente nebulização dos componentes intracelulares de leveduras, algas, bactérias e/ou bolores são solventes orgânicos polares, tais como álcoois, ésteres, cetonas, em particular o metanol, etanol, isopropanol e/ou acetato de etila são os preferidos, são preferidos solventes orgânicos apolares tais como alcanos, em particular, hexano e/ou isooctano, cortes de refinaria caracterizado por uma curva normal de ebulição que varia entre 50 °C a 180 °C, de preferência 100 °C, misturas de várias substâncias orgânicas de refinaria, tal como éter de petróleo, naftas e/ou gasolinas alquilados, ou misturas dos solventes acima mencionados.

[0038] A câmara de nebulização em que a suspensão que contém os microorganismos é efetuada, pode conter um gás inerte, tal como, por exemplo, nitrogênio, hélio, argônio, dióxido de carbono, além de vapor de água ou vapores saturados ou superaquecidos dos solventes orgânicos acima indicado como solventes de nebulização. Isto permite tanto a lise do microorganismo e a extração em solvente dos componentes intracelulares de interesse.

[0039] A extração dos líquidos intracelulares a partir da matriz sólida do microorganismo é favorecida pelo solvente pressurizado. A extração é então melhorada através de uma ação centrífuga que favorece a extração de diferentes densidades das fases sólida e líquida da suspensão formada.

[0040] A fim de obter a lise térmica, a temperatura na câmara de nebulização está dentro da faixa de 90 °C a 180 °C, de preferência compreendida entre 120 °C a 160 °C e ainda mais preferivelmente desde 130 °C a 150 °C.

[0041] Em particular, este último é o preferido para a faixa de leveduras, em particular as leveduras Lypomyces, Rhodotorula e Cryptococcus.

[0042] A mistura do solvente de nebulização com a suspensão celular antes da nebulização poderia melhorar o rendimento global do processo de lise, como poderia atuar quimicamente na camada lipídica dupla, que forma a membrana celular, tal como observado nas soluções técnicas da arte anterior. Na técnica, na verdade, um tempo de contato prolongado entre o solvente e as células a serem submetidas a lise é um fator importante, juntamente com a temperatura e pressão para se obter a lise dos microorganismos.

[0043] Este tempo de contato prolongado, no entanto, representa um custo adicional de energia, enquanto que o presente invento tem por objetivo reduzir estes custos e, por conseguinte, é caracterizado por tempos de residência de contato baixo do solvente com as células a serem lisadas, tanto quando o solvente é colocado em contato com as células antes de ser introduzido no nebulizador, e também quando o solvente está presente na câmara de nebulização onde a suspensão de microorganismos a que o solvente não tiver sido adicionado anteriormente, foi nebulizada.

[0044] O dimensionamento do volume de nebulização para o método que está na base da presente invenção resulta da aplicação do conceito da separação da suspensão contendo as fases sólido-líquido, derivadas da ação de lise celular a partir dos vapores liberados após nebulização. Este conceito também prevê a utilização, necessário por vezes, de várias câmaras de separação, dispostas em série em relação ao fluxo de gás, que são necessários para favorecer a separação do conteúdo da célula em adição aos resíduos sólidos da célula lisada.

[0045] A forma da câmara de nebulização deve favorecer a separação dos vapores de suspensão e a saída e coleta do último a partir da parte inferior da mesma. Formas cilíndricas, também colada por redutores de velocidade em grade ou lamelar, com um terminal tronco-cônico para recolher as suspensões, são preferidas formas da câmara de nebulização.

[0046] A situação onde há um perfil térmico crescente entre a primeira e subsequentes câmaras, não influencia a ação de lise, quando estas temperaturas são inferiores aos valores de temperatura e pressão projetadas pelo método. Pode geralmente dizer-se que as temperaturas mais elevadas nas câmaras seguintes a câmara de nebulização pode ser contraproducente em termos de efeitos químicos sobre os líquidos lisados.

[0047] O perfil térmico, ao longo da linha de processo que se inicia a partir do volume de nebulização, o qual é definido pela troca de calor efetuado na parede ou por meio de encaixes de troca nos volumes de separação, geralmente influência, por outro lado, a liberação de solventes a partir da suspensão resultante da lise. Este perfil é definido pela vazão dos gases liberados e arrastamento permitido do conteúdo da célula devido ao equilíbrio físico-químico líquido/vapor e ação das velocidades de gás.

[0048] A câmara de nebulização pode já estar à temperatura de lise ou a temperaturas mais elevadas, a fim de favorecer as altas taxas de fluxo de tratamento na lise, e contém os gases ou vapores acima mencionados, a uma temperatura igual ou superior à temperatura à qual a lise e extração devem ser efetuados.

[0049] A suspensão que contém os microrganismos a serem lisadas pode entrar na câmara de nebulização, a uma temperatura mais baixa do que aquela em que a lise é realizada. Neste caso, o solvente entra com uma vazão e nível térmico que são susceptíveis de atingir, em conjunto com a substância a ser lisadas, as condições de lise no nebulizador.

[0050] Parte da água celular endo/exo presente e parte, ou todo, do solvente possivelmente alimentado com a suspensão de microorganismos, evapora na câmara de nebulização, pela diminuição da temperatura, que estava presente na câmara de nebulização antes que a suspensão de microorganismos fosse alimentada, liberando líquidos de alto ponto de ebulição, tais como lipídeos intracelulares, que são separados nas paredes da câmara juntamente com os resíduos celulares.

[0051] Um possível aumento na temperatura nos volumes de separação, após a câmara de nebulização, tem um efeito negativo sobre os lípideos, aumentando a quota de ácidos graxos contidos na suspensão. Este aumento, no entanto, pode favorecer a extração a partir da matriz sólida.

[0052] Após a lise, os componentes intracelulares de interesse de natureza lipídica, tais como triglicerídeos, mono e diacil glicerídeos de ácidos graxos, fosfolipídios, fitóis, colesteróis, são liberados em uma suspensão de óleos de alto ponto de ebulição (lipídios tem um ponto de ebulição à temperatura ambiente superior de 300 °C) em conjunto com os resíduos celulares sólidos. A suspensão de óleos de elevado ponto de ebulição é então separada do solvente de nebulização, se este pode ser separado do referido óleo, tais como, por exemplo, quando o solvente é aquoso ou polar, e é enviado para a separação dos resíduos celulares sólidos (restos); como já foi indicado anteriormente, esta separação pode ser efetuada por gravimetria, por densidade, centrifugação ou filtração, por exemplo, com um hidrociclone, decantador ou de decantador de três vias ou por destilação, por meio de membranas ou por evaporação do produto a partir de nebulização/extração do solvente.

[0053] A água presente na câmara de expansão, de uma origem intracelular ou derivada da suspensão de células ou do vapor de alta temperatura, eventualmente adicionado para efeito de troca de calor, em conjunto ou separadamente com a suspensão a ser lisada, é de preferência removido da suspensão para facilitar a separação líquido/sólido subsequente, evitando espumas e suspensões que interagem de forma negativa sobre a subsequente separação dos produtos celulares. O solvente de nebulização é opcionalmente alimentado em conjunto com vapor de água sob pressão, a fim de controlar a temperatura de lise no nebulizador. Esta methodolgy operatória é usada se houver uma separação água/solvente fácil em fase líquida. Nestes casos, o vapor, contendo o solvente e a água, é enviado para uma segunda câmara, e uma vez separado da água, é reciclado para o nebulizador, onde é integrada com solvente fresco.

[0054] O equipamento que pode ser utilizado para a nebulização é basicamente análogo ao ou o mesmo que foi utilizado para a operação de nebulização de uma suspensão líquida de um sólido (secador por pulverização). Um secador por pulverização é uma combinação de aparelhos constituídos por uma bomba de alimentação de um líquido contendo uma suspensão, um sólido inorgânico ou não, um gás ou fonte de vapor, tal como um transportador de energia térmica e mecânica, um atomizador, um aquecedor, um espaço de dispersão da mistura vapor/líquido/sólida deixando o atomizador, ou câmara de secagem, em adição a sistemas de tratamento/condensação da mistura de gases de escape /de vapor e recuperação de possíveis pós. O composto sólido seco é extraído à temperatura da câmara de secagem.

[0055] Tomando em consideração as condições necessárias para a lise térmica dos microrganismos e condições de extração do produto a partir da substância celular na qual este é retido, de uma série de condições de funcionamento pode ser especificada para a lise e recuperação do sólido, líquido, ou o lipídio solubilizado no solvente, se este for utilizado.

[0056] Os materiais a serem utilizados para aplicações de lise devem ser definidos em relação às condições de funcionamento, ou seja, em relação à temperatura nominal de funcionamento e da pressão, e em respeito à resistência às condições de agressividade do ambiente, por sua vez em relação aos solventes e conteúdo nos líquidos que acompanham as células.

[0057] O método de aplicação, objeto do presente pedido de patente, permite uma economia considerável sobre os custos variáveis e CAPEX (Capital Expenditure) das plantas para efetuar operações de lise de células e de extração dos compostos intracelulares, devido ao fato de que, graças ao método da invenção, há uma economia de energia significativa, como aparelhos para termicamente ou mecanicamente lisar as células em uma primeira fase com unidades de extração de lipídio subsequentes dispendiosas, não são mais necessários.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0058] Figura 1: A Figura 1 mostra o rendimento da extração (% peso seco) dos lipídios em relação ao peso seco, em relação à temperatura de nebulização das suspensões de leveduras Lypomyces (G), Rhodotorula (R) e Cryptococcus (C).

[0059] Figura 2: A Figura 2 mostra a comparação entre termogramas das células de levedura Lypomyces após a nebulização, mas antes da extração com solventes de lipídios contidos nas mesmas, pelo aumento da temperatura da nebulização.

[0060] Figura 3: A Figura 3 mostra o termograma das células de levedura Lypomyces secas em um forno a 105 °C; curva de peso residual % (escala à esquerda) e curvas de derivadas (D% / DT) podem ser observadas.

[0061] Figura 4: A Figura 4 mostra o espectro IR de trioleina (Figura 4a) e o extrato SOX107 (a 150 °C) (Fig. 4b).

[0062] Figura 5: na Figura 5, o esquema de planta de uma solução de ciclo fechado é representado, para a execução do método da invenção.

[0063] Figura 6: na Figura 6, a Tabela 4 é ilustrada, que indica o material e o balanço de energia do exemplo relativo de uma Rhodotorula tratada via fermentação de açúcar.

EXEMPLOS EXEMPLO 1

[0064] Três suspensões de leveduras em água do tipo Lypomyces, Rhodotorula ou Cryptococcus (biomassa) foram utilizadas para a recuperação dos componentes intracelulares de acordo com o método da invenção. Nenhum outro solvente foi adicionado à suspensão na fase de nebulização.

[0065] No presente exemplo, o objetivo é apenas definir a capacidade de lise do processo proposto. A lise eficaz é então avaliada a posteriori com análises clássicas por meio de uma unidade de extração de sólido-líquido Soxhlet.

[0066] Para a nebulização da suspensão, um Mini Spray Dryer 190 do fornecedor BUCHI foi utilizado, o qual, como um secador, foi capaz de evaporar cerca de 100500 g / h de água com um fluxo de N2 de 700-1000 NL / h que pode ser aquecido a uma temperatura máxima de 250 °C, e que é, portanto, capaz de produzir cerca de 1100 g / h de pó seco tendo um tamanho de partícula na ordem de 0,2-10 mícrons.

[0067] O tempo total usado pela biomassa para a "parte quente" seguinte do circuito até o bico de nebulização, foi de 10-30 segundos. Todo o circuito de gás alimentado para a câmara de nebulização, tanto quanto a câmara de nebulização ou pulverização, está sob um ligeiro vácuo, a título indicativo, 0,97 atm.

[0068] Nitrogênio estava presente como gás inerte na câmara de nebulização em que a suspensão a ser tratada foi pulverizada, cuja temperatura foi mantida a aproximadamente o mesmo valor que na entrada do separador de ciclone (temperatura à qual a amostra é imediatamente posta após o bocal por evaporação da água e a suspensão foi constantemente monitorada tal como indicado na Tabela 1).

[0069] Um aparelho de Soxhlet foi utilizado para a extração dos lipídios a partir dos sólidos celulares. Um cartucho de papel foi lavado com o solvente de extração e em seguida trazido a um peso constante em um forno a 105 °C. O sólido a ser tratado (3-20 g) foi carregado no cartucho. O solvente de extração (150-200 ml) foi carregado para dentro do balão, cuja tara foi determinada com precisão. Nos casos exemplo descritos nas Tabelas 1 e 2, foram utilizados os seguintes produtos: hexano, caracterizado por um ponto de ebulição de 69 °C e uma densidade de 0,655 g / mL, índice de polaridade 2, acetato de etila, caracterizado por um ponto de ebulição 77 °C e uma densidade de 0,90 g / ml, de etanol, caracterizado por um ponto de ebulição de 79 °C e uma densidade de 0,789 g / mL, índice de polaridade 24. Caldeiras foram introduzidos no frasco e o frasco foi aquecido com um banho de óleo . O solvente foi re-condensado com um condensador de água na parte superior do Soxhlet. Cerca de 10 ciclos de extração foram efetuados, no fim do último ciclo, o cartucho foi removido e colocado em um forno a 105 °C até um peso constante ser obtido.

[0070] De modo a separar o solvente de extração a partir do extrato de lipídios, o Soxhlet foi substituído com um Claisen, e o solvente foi removido por destilação, primeiro sob pressão atmosférica e em seguida sob vácuo a cerca de 0,005 atm. O extrato de lipídeos permanece no frasco.

[0071] Um microscópio ótico foi utilizado para determinar a morfologia das partículas antes e depois da operação de nebulização e uma termobalança (Perkin Elmer) foi utilizada para caracterizar o grau de umidade e de teor de cinzas dos pós obtidos.

[0072] Análises espectrofotométricas de transformada de Fourier (FT-IR) foram realizadas para caracterizar o extrato lipídico. Os extratos foram caracterizados por meio de análise por FT-IR (Nicolet Nexus 670) dentro da faixa de 4,000 - 1,000 cm (1 a 2 cm-1) em transmissão por vazamento do extrato como tal em um comprimido de CaF2.

[0073] As nebulizações indicadas na Tabela 1 abaixo foram realizadas utilizando o método descrito acima.

[0074] O teste SD100 foi efetuado com uma alimentação diluída de cerca de 1: 3 em H2O desmineralizada em relação aos outros. Os três ensaios diferem em que a temperatura da câmara de nebulização (T out na Tabela 1 abaixo) e, em particular, 95 °, 130 ° e 150 °C. Deve notar-se que o Cryptococcus utilizado para o teste SD104, indicado na tabela antes da secagem no secador por pulverização, foi submetido a diafiltração com a adição de água desmineralizada e ultrafiltração para separar / recolher as células de levedura e deixar os açúcares presentes inicialmente com a levedura em água, a fim de remover a glicose residual da fermentação. Tabela 1 - condições de nebulização

Chave para Tabela 1: Teste = código do teste Peso (g) = quantidade de suspensão de levedura nebulizada Peso seco (dw%) = quantidade de levedura na suspensão nebulizada Nitrogênio (l/h) = taxa de fluxo na alimentação de gás quente para a câmara de nebulização Vácuo(atm) = pressão absoluta do nitrogênio após o ciclone no qual a levedura seca é separada e coletada Set point da bomba = seletor de taxa de fluxo da alimentação de bomba da suspensão de levedura na câmara de nebulização (3 = baixo, 4 = médio, 5 = alto) T entrada (°C) = temperatura do nitrogênio na entrada da câmara de nebulização, entretanto, antes da introdução da suspensão a ser nebulizada T saida (°C) = temperatura da câmara de nebulização após a introdução de suspensão de leveduras peso f (g) = quantidade de leveduras secas coletadas no ciclone após a câmara de nebulização Recuperação estimada (%) = peso das leveduras coletadas no ciclone em relação à quantidade de leveduras alimentada na suspensão.

[0075] As leveduras coletadas no ciclone posicionado depois da câmara de nebulização provam ter sido secas, uma vez que têm um teor de água residual inferior a 5 %. Estas leveduras secas foram caracterizadas por meio de análise termogravimétrica. A termogravimetria consiste de um registo da evolução do peso no ar entre a temperatura ambiente e 930 °C, com um gradiente de 10 ° C / min. As amostras submetidas a termogravimetria são aquelas listadas na Tabela 2 abaixo. Tabela 2

[0076] A operação normal de nebulização do presente instrumento utilizado como Secador de pulverização até uma temperatura de 95 °C, produz uma secagem eficaz da suspensão destas leveduras (a água residual nos sólidos é inferior a 5 %), mas não é eficaz em contemporaneamente efetuar a lise de uma membrana celular. Só a partir de uma temperatura mais elevada, em que a amostra permanece durante cerca de 10-20 segundos. a T superior ou igual a 120 °C, foi obtido um rendimento significativo em termos de percentagem de extrato, no processo de extração seguinte efetuado na unidade de Soxhlet, que aumenta progressivamente com o aumento da temperatura de nebulização.

[0077] Em resumo, uma correlação direta e inequívoca é evidente entre o aumento da temperatura de nebulização e a lise efetiva do microrganismo. Durante os testes de verificação dos lipídios extraídos, foi de fato demonstrado que o efeito de lise aumenta com um aumento na temperatura do processo de nebulização, devido ao valor da temperatura e rapidez do aumento de temperatura no pulverizador, o que provoca a quebra da membrana amostra.

[0078] A Figura 1 indica o rendimento da extração (% dw) dos lipídios, em relação à temperatura de nebulização das suspensões de leveduras Lypomyces (G), Rhodotorula (R) e (C) Cryptococcus leveduras.

[0079] Como pode ser observado na figura 1, a percentagem de rendimento de extração, com o mesmo solvente usado, aumenta com o aumento da temperatura de nebulização dos microrganismos.

[0080] A Figura 2 mostra os termogramas que indicam os resultados obtidos com o método da invenção.

[0081] Em particular, a figura 2 mostra uma comparação entre os termogramas de células de levedura Lypomyces após nebulização no aumento da temperatura de nebulização, ou seja, a 95 ° C, 130 ° C e 150 ° C, mas antes da extracção com solvente de lipídeos nele contidas.

[0082] Os termogramas da figura 2 representam as curvas de peso % residual (escala da esquerda) e curvas de derivados (% D / DT) obtidas por aquecimento das amostras nebulizadas em uma atmosfera de ar com um perfil de aquecimento de 10 °C / min, a temperaturas de 95 °C, 130 °C e 150 °C.

[0083] A temperatura à qual é observada a principal perda de peso no termograma, está dentro da faixa de 280-380 °C. Esta perda de peso indica a ruptura da membrana e está correlacionada, no gráfico, com a temperatura a qual a amostra foi nebulizada. Em particular, pode ser observado a partir desta comparação que uma temperatura de nebulização superior das suspensões inicial (como indicado na Tabela 1, a amostra SD100 foi nebulizada em 95 ° C (T = a 95 ° C), a amostra SD101 a 130 ° e a amostra SD102 C a 150 ° C) conduz a uma temperatura mais baixa no que diz respeito à perda de peso (de rotura da membrana) da amostra analisada.

[0084] Para fins de comparação, a Figura 3 mostra o termograma de uma suspensão de levedura Lypomyces seca em um forno a 105 °C, a partir do qual pode deduzir-se que a perda de peso, isto é, a medição de uma lise hipotética devido ao efeito de secagem térmica por si só, não ocorre a estas temperaturas, que são as normalmente utilizadas na tecnologia de secagem de um secador por pulverização. Apenas com temperaturas muito mais elevadas, e tempos de tratamento mais longos por algumas ordens de grandeza no que diz respeito a cerca de dez microssegundos, pode conduzir a lise térmica à ruptura das membranas da levedura usada no exemplo de nebulização. Os termogramas da Figura 2 mostram também a forma como o teor de umidade residual nas amostras produzidas com nebulização foi menor do que 5 % (perda de peso a uma temperatura de 105 °C, menos do que 5 %) e como havia um teor de cinzas modesto, menos de 4% (peso residual a uma temperatura de 600 ° C). O início do fenômeno de degradação significativa é indicado pela perda de peso que é observada a cerca de 220 °C.

[0085] Para fins de comparação, a Figura 3 mostra o termograma de uma suspensão de levedura Lypomyces seca em um forno a 105 °C, a partir do qual pode deduzir-se que a perda de peso, isto é, a medição de uma lise hipotética devido ao efeito de secagem térmica por si só, não ocorre a estas temperaturas, que são as normalmente utilizadas na tecnologia de secagem de um secador por pulverização. Apenas com temperaturas muito mais elevadas, e tempos de tratamento mais longos por algumas ordens de grandeza no que diz respeito a cerca de dez microssegundos, pode conduzir a lise térmica à ruptura das membranas de levedura usada no exemplo de nebulização. Os termogramas da Figura 2 mostram também a forma como o teor de umidade residual nas amostras produzidas com nebulização foi menor do que 5 % (perda de peso a uma temperatura de 105 °C, inferior a 5 %) e como havia um teor de cinzas modesto, menos de 4 % (peso residual a uma temperatura de 600 °C). O início do fenômeno de degradação significativa é indicada pela perda de peso que é observada a cerca de 220 °C.

[0086] A perda de peso entre 280 °C e 380 °C começa a temperaturas mais baixas com um aumento na temperatura de nebulização de amostra, o que indica uma maior facilidade de libertação de substâncias endocelulares para o ambiente exterior. As outras perdas de peso observadas, em particular a cerca de 250 °C, 420 °C e 500 °C, que são outros componentes celulares, tais como, por exemplo, carboidratos, não parecem ser influenciadas, pelo contrário, o tratamento por nebulização a qual a amostra foi submetida.

[0087] A Figura 4 mostra a curva do espectro IR do extrato SOX107 (a 150 °C) (fig. 4b) (mais uma vez com referência às amostras indicadas nas Tabelas 1 e 2), e para efeitos de comparação direta, o espectro IR de um triglicerídeo de referência , ou seja, com trioleína (fig. 4a). A partir de uma comparação, pode-se deduzir que os espectros obtidos com o método da invenção são aqueles de triglicerídeos, com a banda característica de carbonila a 1750 cm-1. Há também a presença de ácidos graxos livres (banda de 1705 cm-1) derivadas a partir da hidrólise dos lipídios (triglicerídeos).

EXEMPLO 2

[0088] Um esquema de planta é ilustrado abaixo para a utilização do método da invenção, em que os lipídios contidos em uma levedura da família Rhodotorula, foram extraídos.

[0089] No presente exemplo, a substância a ser submetidas a lise, em suspensão na água de fermentação, é tratada na lise em conjunto com n-hexano como solvente, necessário para a extração dos lipídios do sólido.

[0090] A Figura 5 representa o esquema de planta de uma solução de ciclo fechado, em que a nebulização é obtida com um pulverizador-secador industrial habitual, na qual as especificações das operações estão em linha com os dados referidos no Exemplo 1 e variam de acordo com o produto a ser lisado, em relação às condições de temperatura e solvente utilizados. Uma vasta gama de câmaras de nebulização e de sistemas de injeção de acordo com a tecnologia de secagem por pulverização específica está disponível no catálogo.

[0091] A Tabela 3 abaixo fornece uma chave dos símbolos do esquema de planta da figura 5: Tabela 3

[0092] O esquema representado na Figura 5 é composto por uma bomba P-100, o qual transporta um solvente para a extração do produto intracelular, sob pressão a um valor adequado para a operação de permuta de calor e lise na câmara de nebulização. Aqui, uma temperatura especifica para o rompimento das células do microrganismo e um tempo de residência da suspensão nebulizada na faixa de 5-300 segundos, de preferência cerca de 10 segundos, deverá ser obtido.

[0093] O líquido (fluxo "12") passa através de um permutador sem mudar de fase, e, em seguida, entra em um misturador estático grade onde se encontra e arrasta a suspensão ou a solução turva para ser lisadas (fluxo "1") para um secador pulverizador (nebulizador).

[0094] O mecanismo de mistura radial turbulento no misturador reduz as velocidades radiais e as dimensões dos agregados monofásicos a serem misturados, aumentando a superfície de contato e estimulando a troca concentração química e térmica, melhorando a mistura. O comprimento dos dispersores necessários depende do tempo de contato necessário. Para os processos de transferência de massa em que o equilíbrio é rapidamente estabelecido, um comprimento de 5 diâmetros é geralmente suficiente.

[0095] Existe um vasto estado da técnica em vários tipos de nebulizadores pneumáticos para aplicações que podem ser utilizadas de acordo com a concentração e / ou características de viscosidade da alimentação. Os seguintes podem ser mencionados, por exemplo: • Nebulizadores de tubo concêntrico • Nebulizadores de fluxo cruzado • DIN (Nebulizador de Injeção Direta) • Nebulizadores de disco perfurado • Nebulizadores Babington nas versões "Ranhura V" e "cone-spray" • Nebulizadores de "caminho paralelo".

[0096] Em sistemas industriais, a nebulização dos produtos é efetuada com vários secadores de pulverização, sob condições de temperatura e de fluxo de ar controladas, que podem ser rotativos para uma melhor homogeneização da câmara de V-100.

[0097] O líquido, ou gás liquefeito para as condições de operação, introduzido no misturador, sai de um bocal e é disperso por um difusor em forma de aerossol. A suspensão é dividida em gotas nebulizadas, que, em seguida, entram em contato com o vapor de água no presente exemplo, para o controle da temperatura da câmara de nebulização V-100 e expande-se. A temperatura da câmara é mantida acima do limiar de lise por um fluxo vapor adicional e de parede.

[0098] A evaporação de parte ou todo o solvente líquido e de água que acompanha o produto a ser lisado, liberta as células de uma suspensão de óleos de elevado ponto de ebulição (tal como já foi indicado, os lipídios têm um ponto de ebulição normal superior a 300 °C).

[0099] Os vapores evacuam a câmara V-100 sob condições de temperatura e fluxo controlado. A suspensão de resíduos sólidos e lipídios é continuamente descarregada, por ação da gravidade e da pressão, da câmara de nebulização, e pode ser enviada para a separação dos resíduos celulares (isto é o fluxo indicado com "4" no esquema na figura 5). O fluxo "2" representa um fluxo de vapor de água para o controle da temperatura da câmara de nebulização.

[0100] Após resfriamento até abaixo de 100 °C, os vapores são enviados para uma coluna de recuperação do solvente, C-100, que é então reciclado em conjunto com um fluxo de composição para a bomba P-100.

[0101] A água separada (correntes "6" e "7") é enviada para uma estação de tratamento antes de ser eliminada.

[0102] A Tabela 4 fornecida na figura 6, indica o material e energia de equilíbrio do exemplo relativa a uma Rhodotorula tratada através de fermentação de açúcar.

[0103] O sistema foi desenvolvido para uma concentração de sólidos para ser lisados a 30% em peso na solução turva a ser tratada. As condições de especificação para a operação de lise são indicadas na Tabela 4. A este respeito, 1,52 kg de vapor são necessárias a 30 bar e 21 kg de água de refrigeração por kg de solução turva a serem lisados. As outras trocas são compensadas internamente.

[0104] A operação de extração é então efetuada com um tridecantador usando hexano.

[0105] Se a alimentação, resultante de uma filtração, relacionada com uma solução turva a 70 % em peso de microorganismos, os consumos característicos iriam cair para um extremamente conveniente 0,37 kg de vapor e 4,25 kg de torre de água por kg de solução turva a serem lisados.

Claims (16)

1. Método para a recuperação de componentes intracelulares a partir de uma suspensão de microorganismos, caracterizado por compreender: • co-alimentar pelo menos duas correntes para um nebulizador, em que a primeira corrente compreende a suspensão aquosa de microrganismos celulares a serem lisados e a segunda corrente compreende um solvente líquido ou gasoso; • nebulizar a referida suspensão em uma câmara de nebulização mantida a uma temperatura variando de 120 °C a 180 ° C, de modo a obter-se a lise das paredes das células dos microorganismos com a formação de uma suspensão que contém os componentes intracelulares e os resíduos celulares resultantes da lise, e uma fase de vapor que compreende o solvente orgânico; • separar os componentes intracelulares a partir dos resíduos celulares resultantes da lise.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o solvente ser um solvente orgânico polar.

3. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o solvente orgânico polar ser selecionado de álcoois, cetonas, ésteres ou suas misturas,.

4. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por o solvente orgânico polar ser selecionado de metanol, etanol, isopropanol e/ou acetato de etila.

5. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o solvente ser um solvente orgânico apolar.

6. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o solvente orgânico apolar ser alcano.

7. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o solvente orgânico apolar ser selecionado a partir de hexano e / ou iso-octano, cortes de refinaria, tendo como característica uma curva normal de ebulição que varia de 50 °C a 180 °C, de preferência 100 °C, éter de petróleo, naftas e gasolinas / ou alquilados, ou suas misturas.

8. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a nebulização da suspensão de microrganismos cultivados acontecer em uma câmara de nebulização contendo um gás inerte, selecionado a partir de vapor de água, dióxido de carbono ou o solvente nebulização em fase gasosa.

9. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a temperatura da câmara de nebulização variar de 120 °C a 160 °C, de preferência de 130 °C a 150 °C.

10. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os microrganismos serem leveduras, algas, bactérias e / ou bolores.

11. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que os microrganismos cultivados serem leveduras, selecionadas a partir de: Lypomices, Rhodotorula e Cryptococcus.

12. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os componentes intracelulares serem lipídios intracelulares produzidos pelos microrganismos cultivados seguindo a fermentação de açúcar.

13. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a separação dos componentes intracelulares a partir dos resíduos celulares resultantes da lise ser efetuada por gravimetria ou por centrifugação.

14. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a suspensão que contém os componentes intracelulares e os resíduos celulares resultantes da lise ser submetida a pelo menos uma operação de lise adicional pela reciclagem da mesma suspensão.

15. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a reciclagem da suspensão contendo os componentes intracelulares e os resíduos celulares resultantes da lise ser efetuada em conjunto com a suspensão inicial a ser lisada, a montante da câmara de nebulização.

16. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a reciclagem da suspensão contendo os componentes intracelulares e os resíduos celulares resultantes da lise ser efetuada no sentido de uma unidade de lise a jusante da câmara de nebulização.

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