ITMI20002299A1 - Proteine di fusione utili per il trattamento di immunizione della malattia di alzheimer - Google Patents

Description

Descrizione del brevetto per invenzione industriale avente per titolo:

“PROTEINE DI FUSIONE UTILI PER IL TRATTAMENTO DI IMMUNIZZAZIONE DELLA MALATTIA DI ALZHEIMER"

La presente invenzione si riferisce a proteine di fusione ottenute dalla condensazione della proteina β-amiloide e di una heat shock protein, alle composizioni farmaceutiche che le contengono ed al loro utilizzo nel trattamento o prevenzione dei disordini associati ad una abnorme produzione di proteina β-amiloide, in particolare la malattia di Alzheimer.

TECNICA ANTERIORE

La malatti .a di. Alzhei.mer rappresenta un problema crescente della salute pubblica. Negli Stati Uniti si registrano ogni anno circa 170.000 morti attribuibili alla demenza di Alzheimer ponendo questa malattia al terzo posto (7.1% del totale dei decessi) come causa di morte ( Ani J Public Health 1999; 89: 90-92). Il costo annuale della malattia negli Stati Uniti è stimato essere di 100 miliardi di dollari (Am J Health Syst Pharm 1998; 55: S17-S21). Ad ogni paziente è associato un costo di 195.000 dollari, con una importante parte di questa cifra attribuibile alla perdita di produttività del paziente e del caregiver e alle spese vive sostenute dalla famiglia. Il costo medio annuale per la cura dei pazienti con una forma iniziale, intermedia e avanzata della malattia si aggira rispettivamente sui 19.000, 31.000 e 37.000 dollari. E’ stato calcolato che se si disponesse di farmaci in grado di rallentare la progressione della malattia si realizzerebbe un risparmio annuale di circa 25.000 dollari per paziente per la sola assistenza medica {Health Aff \99&\ 17: 206-216).

Dal punto di vista anatomico la malattia di Alzheimer è caratterizzata da atrofia della corteccia cerebrale e da una massiccia perdita di neuroni corticali e delle proiezioni colinergiche dai nuclei basali verso la corteccia. Dal punto di vista istopatologico si riscontra una diffusa presenza nel parenchima cerebrale dei pazienti di placche neuritiche a livello extracellulare e perivasale e di intrecci neurofibrillari a livello intracellulare.

Oltre a queste lesioni istopatologiche esistono deficienze di alcuni neurotrasmettitori, principalmente l’acetilcolina, ma anche la serotonina, la noradrenalina, la dopamina, il glutammato e la sostanza P {Ann NY Acad Sci 1985; 457: 35-51). Gli approcci farmacologici mirati ad elevare i livelli di acetilcolina cerebrale, principalmente per mezzo degli inibitori dell’acetilcolinesterasi, hanno prodotto risultati modesti dal punto di vista clinico comunque non in grado di influenzare significativamente la storia naturale della malattia {JAMA 1999; 281: 1433-1434). Per questo motivo negli ultimi anni la ricerca è stata orientata a comprendere e influenzare i meccanismi di formazione delle principali lesioni patologiche riscontrate nel cervello di un malato di Alzheimer: le placche neuritiche e gli intrecci neurofibrillari.

Le placche neuritiche sono costituite principalmente da aggregati di una proteina a 39-43 amminoacidi denominata β-amiloide {J Neurochem 1986; 146: 1820-1834). La proteina β-amiloide è un prodotto metabolico di una complessa glicoproteina transmembranica {Nature 1987; 325: 503-507) denominata amyloid precursor protein (APP), di cui costituisce una piccola parte del dominio extracellulare. La via metabolica più importante della APP coinvolge l’enzima α-secretasi che scinde la APP all’interno della sequenza β-amiloide ( Science 1990; 248: 1122-1124) permettendo il rilascio della sua porzione transmembranica. Questa via metabolica non è amiloidogenica poiché preclude la formazione della β-amiloide e porta al rilascio della APPa che sembra svolgere un’attività neuroprotettiva ( Neuron 1993a; 10: 243-254). La via metabolica, definita amiloidogenica, che porta alla formazione di β-amiloide coinvolge l’enzima β-secretasi che libera ΑΡΡβ più un frammento proteico di 12 kDa, a sua volta sottoposto ad un ulteriore processo di scissione ad opera dell’enzima γ-secretasi ( Celi 1993; 75: 1039-1042) per dare luogo alla βΑ in forma solubile.

La presenza di mutazioni APP, e di mutazioni su altre proteine di recente identificazione denominate preseniline (PS-1 e PS-2), associate alle forme familiari di Alzheimer ad esordio precoce, hanno come conseguenza fenotipica una iperproduzione di β-amiloide o almeno della sua forma a 42 amminoacidi {Nature 1995; 375: 754-760, Nature 1995; 376: 775-778). Diversi studi hanno inoltre dimostrato come alla presenza dell’allele ε 4 della apoi ipoproteina E, noto fattore di rischio nella malattia di Alzheimer, sia associata una iperproduzione di β-amiloide. Tutti questi dati sembrano indicare nell’aumento di proteina β-amiloide il comune denominatore delle alterazioni genetiche associate alla malattia di Alzheimer.

Esistono diverse varianti della proteina β-amiloide che si formano per rottura proteolitica della APP in diverse posizioni e differiscono solo per il dominio C-terminale: βΑ39, βΑ40, βΑ42 e βΑ43. Le forme a 40 e 42 amminoacidi sono predominanti nelle placche neuritiche extracellulari, mentre la forma a 39 aminoacidi è la componente predominante dei depositi cerebrovascolari (J Biol Chem 1992; 267: 17082-17086, Biochem Biophys Res Commun 1988; 151: 1150-1155). La sequenza amminoacidica (struttura primaria), caratterizzata dalla presenza di alcuni amminoacidi idrofobici, fa si’ che la proteina β-amiloide possa esistere sia nella configurazione elicoidale (α-elica) che in quella detta a “foglietto β” ( β-sheet ). Benché nel diagramma di Ramanchandran le due strutture risultino approssimativamente isoenergetiche, a causa di fattori non ancor del tutto chiariti, nella malattia di Alzheimer la proteina tende ad assumere la conformazione β-sheet. A differenza della forma ad α-elica che è solubile nel parenchima cerebrale, la forma β-sheet dà origine agli aggregati responsabili della neurotossicità della proteina. L’unità base per la formazione delle fibrille di β-amìloide sarebbe costituita da due filamenti a foglietto β, derivati dal ripiegamento della proteina, collegati da un gomito a struttura α-elica ( J Neurochem 1994; 63: 1191-1198). La deposizione di aggregati di proteina β-amiloide è pertanto strettamente correlata alla sua struttura secondaria a foglietto β ( Neurosci Leti 1995; 200: 105-108). La fibrillogenesi della proteina β-amiloide è un processo di polimerizzazione a due stadi: un iniziale processo di “nucleazione” seguito dalla fase di “elongazione del polimero” che origina il protofilamento, costituente base delle fibrille ( Celi 1993; 73: 1055-1058). L’allineamento dei protofilamenti genera le fibrille di β-amiloide.

La relazione tra lesioni istopatologiche, morte neuronaie e deficit cognitivo nella malattia di Alzheimer rappresenta la base per diverse ipotesi eziopatogenetiche. L’ipotesi amiloide sostiene che i depositi di β-amiloide nel cervello dei pazienti rappresentino la causa della malattia. Importanti evidenze supportano questa ipotesi: (1) L’analisi autoptica di cervelli di malati di Alzheimer rivela sempre depositi di β-amiloide ( Neurology 1984; 34: 939-944). (2) Tutte le mutazioni autosomiche dominanti associate alle forme familiari precoci della malattia di Alzheimer sono caratterizzate dal punto di vista istopatologico da una iperproduzione di β-amiloidel-42 {Nature 1992; 360: 672-674, Nat Med 1996; 2: 864-870, Science 1999; 264: 1336-1340, Nat Med 1997; 3: 67-72, Neuron 1996; 17: 1005-1013). (3) La formazione di placche di β-amiloide precede i sintomi della malattia ( Lancet 1998; 352: 1117-1118). (4) La clearance di β-amiloidel-42 nel cervello dei pazienti risulta ridotta (Ann Neurol 1995; 38: 643-648).

Un importante progresso per la ricerca sull’ Alzheimer è rappresentato dallo sviluppo e dall’uso di topi transgenici portatori di uno o più mutazioni familiari per la APP ( Science 1996; 274: 99-102, Nature 1995; 373: 523-527, Hum Mol Genet 1997; 6: 1535-1541, Ann N Y Acad Sci 1996; 777: 82-88). Questi animali transgenici presentano una iperproduzione di APP e quindi di β-amiloide, che porta alla diffusa deposizione di β-amiloide a livello cerebrale con conseguente distrofia neuritica e perdita di sinapsi similmente a quanto osservato nella malattia di Alzheimer. Recentemente è stato descritto un topo transgenico che esprime anticorpi per il fattore di crescita nervoso (NGF) e accumula a livello corticale e ippocampale sia proteina β-amiloide che proteina τ iperfosforilata (J Neurosci 2000; 20: 2589-2601). Gli animali transgenici anti-NGF anziani mostrano un’estensiva perdita neuronaie nella corteccia, deficit colinergico nei nuclei basali e deficit cognitivi e comportamentali (Proc Nati Acad Sci USA 2000; 97: 6826-6831). Questi animali sono estremamente utili per testare nuove ipotesi terapeutiche che hanno lo scopo di modificare la storia naturale della malattia.

Attualmente si stanno sviluppando diversi approcci terapeutici che si basano sulla ipotesi amiloide della malattia di Alzheimer (Figura). Uno di questi riguarda l’individuazione di inibitori selettivi della γ-secretasi (/ Med Chem 1998; 41: 6-9, Neuron 1995; 14: 651-659) o della β-secretasi ( Proc Nati Acad Sci USA 1999; 96: 11049-11053) che dovrebbero bloccare la formazione di proteina β -amiloide con una riduzione delle placche di amiloide e la conseguente diminuzione della disfunzione e morte neuronaie. Un altro approccio prevede l’inibizione dell’aggregazione della proteina β-amiloide con prodotti che alterano la struttura secondaria della proteina o che si legano a regioni specifiche della proteina stessa (Nat Med 1998; 4: 822-826, J Neurobiol 1999; 39: 371-382, Biochemistry 1999; 38: 6791-6800).

Recentemente, nella domanda di brevetto intemazionale WO 99/27944 a nome Athena Neuroscience è stato rivendicato, nella prevenzione e nel trattamento di patologie amiloidogeniche e della malattia di Alzheimer in particolare, l’impiego della stessa //-amiloide o di un suo frammento attivo, in qualità’ di agente in grado di indurre la risposta immunogena verso la βamiloide. Un gruppo di ricercatori della Elan Pharmaceuticals ha mostrato che l’immunizzazione con β-amiloidel-42 di topi transgenici esprimenti una forma mutante di APP (PDAPP) inibisce la formazione di placche di amiloide e le conseguenti lesioni istopatologiche (Nature 1999; 400: 173-177). L’immunizzazione di animali giovani porta alla quasi completa assenza di deposizione di β-amiloide nell’età avanzata con una significativa inibizione dello sviluppo di distrofia neuritica (un marker della disfunzione neuronaie) e di astrogliosi (un marker deH’infiammazione cerebrale). L’immunizzazione di animali anziani (11-12 mesi) portatori di diffuse placche di β-amiloide cerebrali determina rarresto della progressione delle lesioni istopatologiche e addirittura una loro parziale regressione. Le placche di amiloide residue vengono attivamente metabolizzate dalle cellule microgliali, suggerendo che l’immunizzazione può, oltre a prevenire la deposizione di nuova amiloide, portare all’ eliminazione dei depositi già esistenti. L’effetto di clearance della proteina β-amiloide avverrebbe attraverso un meccanismo di fagocitosi esercitato da parte dei monociti della microglia. Questi risultati aprono la possibilità di vaccinazione dei malati di Alzheimer mediante la proteina β-amiloidel-42.

Alcuni aspetti di questo approccio necessitano però un approfondimento prima dell’applicazione al malato di Alzheimer ( Nature 1999; 400: 116-117). Prima di tutto si è osservato che per ottenere l’effetto osservato nel topo sono necessarie alte concentrazioni di anticorpi per la β-amiloidel-42. E’ quindi possibile che la somministrazione del vaccino nell’uomo non induca una risposta immunitaria sufficiente. E’ possibile inoltre che nell’uomo, diversamente dal topo, si verifichi un fenomeno di tolleranza poiché il sistema immunitario potrebbe non reagire contro una proteina appartenente al proprio organismo (la proteina p-amiloidel-42). Ancora, è necessario che l' antigene somministrato come vaccino, si mantenga nella struttura secondaria solubile: fattori endogeni potrebbero infatti favorire processi di transconformazione e/o denaturazione a discapito della durata di attività. Infine, la tecnica di immunizzazione utilizzata dai ricercatori dell’Elan prevede l’utilizzo di un coadiuvante immunitario costituito da un’emulsione di un Micobatterio inattivato con il calore ( Incomplete e Complete Freund’s Adjuvant) che ha lo scopo di aumentare la risposta anticorpale. La forma completa del coadiuvante di Freund è purtroppo gravato da una serie di effetti tossici anche gravi (Lab Anim Sci 1989; 39: 400-405, Res Immunol 1992; 143: 478-483, Exp Celi Res 1999; 246: 368-375, Contact Dermatitis 1996; 35: 127-128, Clin Exp Reumatol 1996; 14: 633-641, Brain Res 1999; 832: 84-96). La forma incompleta è ben tollerata nell’uomo ma non è in grado di aumentare la risposta immunitaria di tipo cellulare (Adv Drug Deliv Rev 1998; 32: 173-186).

Le heat shock protein (Hsp), denominate anche stress protein, sono state per la prima volta descritte nella Drosophila come proteine rilasciate in risposta ad uno shock termico ( Experientia 1962; 18: 571-573). Successivamente si è constatato che il loro rilascio è legato anche a stress o insulti di altro tipo (ipossia, chimico, etc.). Le Hsp sono classificate in almeno quattro famiglie in base alla loro dimensione: Hsp90 (90 kDa), Hsp70 (70 kDa), Hsp60 (60 kDa) e small Hsp (< 20 kDa). Le Hsp agiscono come chaperon intracellulari di proteine facilitandone il trasporto tra i diversi compartimenti, la modificazione della struttura secondaria e terziaria e l’assemblaggio di multimeri (Science 1990; 248: 850-854). Recentemente si è riconosciuto anche un importante ruolo immunogenico sia di tipo umorale che cellulare (Biotherapy 1998; 10: 173-189). Le loro potenti proprietà immunostimolanti hanno aperto importanti possibilità terapeutiche in campo infettivo e tumorale. Le Hsp90 e Hsp70 sono state valutate come vaccini anticancro.

E’ stato dimostrato che nel cervello dei malati di Alzheimer esiste una aumentata produzione di Hsp, in particolare della famiglia Hsp70, in risposta all’insulto neurotossico esercitato dalla proteina β-amiloide e dalla proteina τ iperfosforilata (Mol Brain Res 1991; 11: 249-254, Ann N Y Acad Sci 1993; 695:194-197, J Neural Transm Suppl 1999; 57: 315-322). E’ stata anche dimostrata un’aumentata espressione di Hsp27 a livello degli astrociti degenerativi delle aree cerebrali ricche di placche senili in risposta al processo infiammatorio {Acta Neuropathol 1994; 87: 511-519).

Recentemente sono state sintetizzate proteine di fusione (Ag-Hsp) ottenute mediante legame covalente di una proteina antigene (Ag) e di una heat shock protein (Hsp) allo scopo di aumentare la risposta immunitaria dell’antigene {Proc Nati Acad USA 1997; 94: 13146-13151). A differenza degli antigeni proteici che agiscono tramite l’attivazione dei linfociti T helper CD4<+ >generando una risposta immunitaria umorale, queste proteine di fusione Ag-Hsp sono in grado di attivare i linfociti T citotossici CD8<+ >generando una risposta immunitaria cellulare (J Exp Med 2000; 191: 403-408).

OGGETTO DELL’INVENZIONE

I composti della presente invenzione sono proteine di fusione (βΑ-Hsp) (III) formate dalla coniugazione covalente della proteina β-amiloide (βΑ) (I) e una heat shock protein (Hsp) (II). Le proteine di fusione βΑ-Hsp (III) possiedono attività immunizzante contro la proteina β-amiloide e sono pertanto utili nel trattamento di tutte le condizioni patologiche che presentano un’abnorme produzione e deposizione di β-amiloide, come in particolare la malattia di Alzheimer.

βΑ Hsp → βΑ-Hsp

(I) (Π) (HI)

Secondo quanto recentemente riportato in letteratura {Nature 1999; 400: 173-177), l’immunizzazione di topi transgenici, che accumulano spontaneamente β-amiloide a livello cerebrale, ottenuta mediante la somministrazione sistemica di proteina β-amiloide (I) di origine umana (βΑ42) e di un appropriato coadiuvante immunitario ( Freund ), previene la deposizione di β-amiloide cerebrale negli animali giovani e arresta l’ulteriore deposizione della proteina negli animali anziani che hanno già sviluppato placche senili. All’effetto inibitorio sulla deposizione intracerebrale di β-amiloide si accompagna un’attenuazione delle anomalie istopatologiche (distrofia neuritica e astrogliosi) che accompagnano la deposizione della proteina.

I prodotti (III), e le loro composizioni farmaceutiche, sono in grado di generare una risposta immunitaria contro la proteina β-amiloide e di inibire e prevenire le manifestazioni neuropatologiche indotte dagli aggregati della proteina, e come tali sono utili nel trattamento e nella prevenzione della malattia di Alzheimer. La scelta della heat shock protein da legare alla frazione peptidica della proteina βamiloide può essere opportunamente modulata al fine di stabilizzare la struttura secondaria e terziaria del frammento peptidico della proteina β-amiloide oltre che di aumentarne il potere immunogenico e di favorirne il trasporto cellulare.

Benché nella domanda di brevetto WO 99/27944 sia previsto l’impiego di molecole coniugate ad Αβ quali la tossina colerica, un’immunoglobulina o la tossina difterica CRM 197 attenuata, come carrier per favorirne il rilascio e/o la risposta immunitaria, e benché sia anche genericamente previsto l’utilizzo di una proteina di fusione, non erano stati prima d’ora descritti i vantaggi derivanti dall’ impiego di un carrier in grado di stabilizzare la struttura secondaria della proteina.

Nei prodotti (III) βΑ può essere la proteina β-amiloide-l42 umana o una sua frazione peptidica, e Hsp è una heat shock protein a basso (Hsp25, Hsp27, Hsp28, etc.) o alto peso molecolare (Hsp60, Hp70, Hsp90, etc.). Sia la frazione peptidica che la heat shock protein possono essere opportunamente scelte per ottenere: i) la migliore risposta immunogenica possibile; la maggiore tollerabilità; la struttura conformazionalmente più stabile.

Un gruppo preferito di composti (VI) si ottiene per condensazione di β-amiloidel-42 (βΑ42) (IV) e una heat shock protein di peso molecolare 70 kDa (Hsp70) (V):

βΑ42 + Hsp70 → βΑ42-Η3ρ70

(IV) (V) (VI)

Quest’invenzione include anche tutti i possibili isomeri dei composti aventi formula generale (III) e (VI) e miscele di essi.

La presente invenzione comprende anche i sali di quei composti di formula generale (III) e (VI) che possiedono gruppi che possono essere salificati, in particolare il gruppo carbossilico e il gruppo amminico.

I sali fisiologicamente tollerabili sono ad esempio, nel caso di molecole contenenti gruppi acidi, sali di metalli alcalini o alcalino terrosi, come sodio, potassio, litio, calcio, magnesio, o sali formati con ammine organiche o amminoacidi, come l’arginina. Nel caso di molecole contenenti gruppi basici i sali possono essere di acidi inorganici, come acido cloridrico e acido solforico, e di acidi organici sia mono- che dicarbossilici, come acido acetico, acido tartarico ed acido metansolfonico.

La presente invenzione comprende anche le preparazioni comprendenti i composti di formula generale (III) e (VI) che contengano coadiuvanti immunitari come per esempio quello di Freund (completo o incompleto), Jung, Gerbu, etc.

DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL’INVENZIONE

Le caratteristiche ed i vantaggi delle nuove proteine di fusione aventi formula generale (III) ad attività immunizzante contro la proteina β-amiloide, con i relativi procedimenti per la loro preparazione, verranno descritti nel corso della seguente descrizione dettagliata.

I nuovi composti (III) sono ottenibili per condensazione di un peptide β-amiloide (I) β -amiloidel-28, β-amiloide-l38, 3-amiloidel-40, β-amiloidel-42, β-amiloidel 5-20, β-amiloide22 -35, β-amiloide5 -35, βamiloide31-35, etc.) con una proteina appartenente ad una delle famiglie di heat shock protein (Hsp) (II) a basso (Hsp25, Hsp27, Hsp28, Hsp32, etc.) o alto peso molecolare (Hsp60, Hsp70, Hsp90, etc.).

La condensazione tra le due proteine avviene utilizzando un ponte bifunzionale quale MBS (estere m-maleimidobenzoil-N-idrossisuccinimmidico), sulfo-MBS (estere m-maleimidobenzoil-N-idrossisulfosuccinimmidico), SMPD [succinimmidil 4-(p-maleimidofenil)butirrato], sulfo-SMPD [sulfosuccinimidil 4-(p-maleimidofenil)butirrato], GMBS [estere Ν-(γmaleimidobutirrilossi)succinimmidico], sulfo-GMBS [estere N-(y-maleimidobutirrilossi)sulfosuccinimmidico] .

In tale tipo di ponte, la funzionalità esterea può essere attaccata da gruppi amminici, mentre il doppio legame maleimidico è in grado di reagire molto selettivamente con peptidi contenenti gruppi SH liberi.

La proteina di fusione βΑ-Hsp (III) può quindi essere ottenuta per:

1) Attivazione di Hsp (II) mediante l’attacco sul legame estere del ponte dei gruppi amminici laterali di lisine localizzate sulla superfìcie della Hsp;

2) Inserimento di un gruppo SH libero nella βΑ (I) mediante la preparazione di cisteinil β-amiloide; oppure

3) Condensazione di βΑ e Hsp mediante l’attacco del gruppo SH della cisteinil β-amiloide sul doppio legame del ponte nella Hsp attivata.

ESEMPIO

Sintesi della proteina di fusione βΑ42-Η5ρ70 (IV)

La sintesi della proteina di fusione formata dalla proteina β-amiloidel-42 (βΑ42) e la heat shock protein di peso molecolare 70 kDa (Hsp70) è realizzata in tre passaggi descritti di seguito e riassunti nello Schema.

1. Attivazione Hsp70

Operando come indicato qui di seguito, si ottiene l’attivazione di 14-15 catene amminiche laterali di lisine presenti sulla superficie della proteina Hsp70.

A 6 mg di Hsp70 (purezza 85%, 0.07 pinoli), disciolti in 1 mL di tampone fosfato a pH=7 a 20°C, si aggiungono 0.83 mg di sulfo-MBS (2.1 pinoli) sciolto in 15 pL di DMSO e diluito a 0.5 mL con tampone fosfato a pH=7. Si ottiene così un volume finale di 1.5 mL di tampone fosfato, contenente 1’ 1 % di DMSO, in cui la concentrazione della proteina è circa 50 pM. Si lascia reagire a 20°C per 30 min. La proteina attivata viene quindi purificata caricando il grezzo di reazione su Kwik Sep Dextran Desalting Column da 5 mL, eluendo con tampone fosfato 0.02M, e monitorando le frazioni da 1 mL raccolte all’UV a 280 nm. Le frazioni contenenti la proteina attivata sono riunite ed immediatamente usate per la fusione con cisteinil-A42 (passaggio 3).

2. Preparazione di cisteinil-A42

0.5 mmoli di cisteinil-A42 vengono sintetizzate secondo la procedura standard di Merrifield, su resina MBHA (p-metil-benzidrilammino-polistirene) seguendo la strategia che prevede l’utilizzo del gruppo protettore Boc. Il distacco finale del peptide dalla resina è compiuto in HF liquido. Dopo purificazione in HPLC preparativo su colonna RP C-18 Vydac (6 cm diametro, 30 cm altezza), il prodotto è liofilizzato ed analizzato con ES-MS {electrospray mass spectrometry). La purezza è controllata in RP-HPLC ed elettroforesi capillare.

3. Preparazione della proteina di fusioneA42-Hsp70

A 0.07 pinoli di proteina Hsp70 attivata in 2-3 mL di tampone fosfato 0.02 M, si aggiungono 1.4 pmoli di cisteinil-A42 (6.44 mg) disciolte in una miscela di 0.3 mL di acetonitrile e 0.7 mL di tampone fosfato 0.02 M (pH=7). La miscela di reazione è incubata a 20°C per 2 ore e quindi dializzata contro tampone bifosfato per rimuovere i reagenti a basso peso molecolare. Il prodotto è analizzato con la tecnica electrospray mass spectrometry per la determinazione della massa molecolare e per il controllo dell’omogeneità molecolare della proteina di fusione.

Il prodotto può essere conservato come soluzione ghiacciata a -80°C o come polvere liofilizzata a -20°C. _

1. Attivazione di HSP 70

2. Preparazione di Cisteinil β-Amiloide 1-42

3. Sintesi della Fusion Protein HSP-70 β-Α 1-42

Schema. Schema di sintesi della proteina di fusione formata dalla proteina β-amiloidel-42 (βΑ42) e la heat shock protein 70 (Hsp70).

Claims (1)

1. RIVENDICAZIONI 1. Una proteina di fusione di formula :

   5. Una composizione farmaceutica comprendente come principio attivo un composto delle rivendicazioni 1-4, in grado di generare una risposta immunitaria contro la proteina β-amiloide, con conseguente diminuzione della formazione di fibrille, precipitati o depositi di β-amiloide, in combinazione con diluenti, coadiuvanti immunitari o eccipienti farmacologicamente accettabili. 6. Una composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 5, in cui il coadiuvante immunitario è scelto tra quelli di Freund, Jung, Gerbu. 7. L’uso delle proteine di fusione delle rivendicazioni 1-4, eventualmente salificate, in combinazione con diluenti, coadiuvanti o eccipienti farmacologicamente accettabili, per la preparazione di medicamenti per il trattamento o prevenzione dei disordini associati ad una abnorme produzione di proteina β-amiloide, in particolare la malattia di Alzheimer.