ITMI20000974A1 - Flavonoidi interferenti con il processo di aggregazione della proteina beta-amiloide. - Google Patents

Description

Descrizione dell'invenzione industriale avente per titolo:

"FLAVONOIDI INTERFERENTI CON IL PROCESSO DI AGGREGAZIONE DELLA PROTEINA BET A- AMILOIDE”

La presente invenzione è relativa a flavonoidi, alle composizioni farmaceutiche che li contengono ed al loro utilizzo nel trattamento o prevenzione dei disordini associati ad una abnorme produzione di proteina β-amiloide, in particolare la malattia di Alzheimer.

TECNICA ANTERIORE

La malattia Alzheimer (AD) rappresenta un problema crescente della salute pubblica. Negli Stati Uniti si registrano ogni anno circa 170.000 morti attribuibili alla demenza di Alzheimer ponendo questa malattia al terzo posto (7.1% del totale dei decessi) come causa di morte (Ewbank D.C. Am. J. Public Health 1999; 89: 90-92). Il costo annuale della malattia negli Stati Uniti è stimato essere di 100 miliardi di dollari (Schumock G.T. Am. J. Health Syst. Pharm 1998; 55 Suppl 2: SI 7-21).

Nella malattia di Alzheimer il deposito di proteina β-amiloide (βΑ) nel parenchima cerebrale e sulle pareti vascolari è una delle caratteristiche istopatologiche della malattia. Sebbene non sia del tutto esclusa la possibilità che i depositi di βΑ, in forma Fibrillare o come placche neuritiche, rappresentino un fenomeno secondario, è certo che la AD si identifichi con la loro diffusa presenza. Inoltre, come recentemente confermato (Lippa C.F. et al. Lancet 1998; 352: 1117-1 118), la comparsa dei depositi di β-Α precede sempre le altre manifestazioni patologiche della malattia.

Oltre a queste lesioni istopatologiche esistono deficienze di alcuni neurotrasmettitori, principalmente lacetilcolina, ma anche la serotonina, la noradrenalina, la dopamina, il glutammato e la sostanza P (Price D.L. et al. Annals New York Acad. Sci. 1985; 457: 35-51).

Gli approcci farmacologici mirati ad elevare i livelli di acetilcolina cerebrale, principalmente per mezzo degli inibitori dell’acetilcolinesterasi, hanno prodotto risultati modesti dal punto di vista clinico, non in grado di influenzare la storia naturale della malattia (Davies P. J. Amer. Med. Assn.

1999; 281: 1433-1434). Per questo motivo negli ultimi anni la ricerca è stata orientata a comprendere e influenzare i meccanismi di formazione delle uniche lesioni patologiche riscontrate nel cervello di un malato di Alzheimer: le placche neuritiche e gli intrecci neurofibrillari.

Le placche neuritiche e gli intrecci neurofibrillari sono costituiti principalmente da aggregati di una proteina a 39-43 amminoacidi denominata β-amiloide (Selkoe D.J. et al. J. Neurochem. 1986; 146: 1820-1834).

La proteina β-amiloide è un prodotto metabolico di una complessa glicoproteina transmembranica (Kang J. et al. Nature 1987; 325: 503-507) denominata proteina precursore dell’amiloide (APP), di cui costituisce una piccola parte del dominio extracellulare.

La via metabolica più importante della APP coinvolge l’enzima cc-secretasi che taglia la APP all’interno della sequenza β-amiloide (Esch F.S. et al. Science 1990; 24S: 1 122-1 124) permettendo il rilascio della sua porzione transmembranica. Questa via metabolica non è amiloidogenica poiché preclude la formazione della β-amiloide e porta al rilascio della APPa che sembra svolgere un’attività neuroprotettiva (Mattson M.P. et al. Neuron 1993a; 10: 243-254).

La via metabolica, definita amiloidogenica, che porta alla formazione di β-amiloide coinvolge l’enzima β-secretasi che libera ΑΡΡβ più un frammento proteico di 12 KDa, che a sua volta è processato dall’enzima γ-secretasi (Selkoe D.J. et al. Celi 1993; 75: 1039-1042) per dare luogo alla βΑ in forma solubile.

Esistono diverse varianti della proteina β-amiloide che si formano per rottura proteolitica della APP in diverse posizioni e differiscono solo per il dominio C-terminale: βΑ 1-39, βΑ 1-40, βΑ 1-42 e βΑ 1-43. Le forme a 40 e 42 amminoacidi sono predominanti nelle placche neuritiche, mentre la forma a 39 amminoacidi è la componente predominante dei depositi cerebrovascolari (Selkoe D. et al. J. Biol. Chem. 1992; 267: 17082-17086; Frangione B. et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1988; 151: 1150-1155).

La presenza di mutazioni APP, e di mutazioni su altre proteine di recente identificazione denominate preseniline (PS-1 e PS-2), associate alle forme familiari di Alzheimer (FAD) ad esordio precoce, hanno come conseguenza fenotipica un’iperproduzione di βΑ o almeno della sua forma a 42 amminoacidi (Sherrington R. et al. Nature 1995; 375: 754-760, Sherrington R. et al Nature 1995; 376: 775-77S). Diversi studi hanno inoltre dimostrato come alla presenza dell’aìlele ε 4 della apolipoproteina E, noto fattore di rischio in AD, sia associata im’iperproduzione di βΑ. Tutti questi dati sembrano indicare nell’aumento di proteina β-amiloide il comune denominatore delle alterazioni genetiche associate ad AD.

La sintesi di peptidi omologhi alla proteina β-amiloide e di alcuni suoi frammenti hanno contribuito alla elucidazione del meccanismo di formazione dei depositi di βΑ e del loro ruolo nella patogenesi dell’AD.

La struttura primaria delia βΑ, caratterizzata dalla presenza di alcuni amminoacidi idrofobici, ne determina una struttura secondaria detta a “foglietto β” (β-sheet) responsabile del processo di aggregazione della proteina stessa e della sua neurotossicità.

L’unità base per la formazione delle fibrille di β-amiloide sarebbe costituita da due filamenti a foglietto-β, derivati dal ripiegamento della proteina, collegati da un gomito a struttura α-elica (Soto C. et al. J. Neurochem. 1994; 63: 1191-1198). La deposizione di aggregati di proteina β-amiloide è strettamente correlata alla sua struttura secondaria a foglietto-β (Soto C. et al. Neurosci. Leti. 1995; 200: 105-108).

La fibrillogenesi della proteina β-amiloide è un processo di polimerizzazzione a due stadi: un iniziale processo di “nucleazione” seguito dalla fase di “elongazione del polimero” che origina il protofilamento, costituente base delle fibrille (Jarrett J.T. Celi 1993; 73: 1055-1058). L’allineamento dei protofilamenti genera le fibrille di β-amiloide.

Gli inibitori dell’aggregazione della proteina β-amiloide rappresentano un importante target nella cura della malattia di Alzheimer. Negli ultimi anni sono state descritte numerose molecole in grado di inibire il processo di aggregazione della βΑ: peptidi (WO 96/39834, WO 97/21728, WO 98/30229), peptidi modificati (WO 96/28471 , WO 98/08868), antraciclinoni (WO 96/04895, WO 98/32754, WO 99/253, WO 99/46254), coloranti come il Congo Rosso ed analoghi lipofili (WO 94/01 1 16, Klunk W.E. et al. Neurobiol. Aging 1994; 15: 691-198) ed altre molecole organiche non peptidiche (WO 99/42102, WO 99/18794, US 5,869,500, Howlett D.R., Biochem. J. 1999; 340: 283-289). I composti della presente invenzione sono flavonoidi ad attività antiaggregante della proteina β-amiloide.

I flavonoidi sono composti polifenolici che si trovano in natura nelle piante e negli alimenti; con più di 4000 differenti composti, costituiscono il gruppo più grande e studiato di composti fenolici di origine vegetale. La loro struttura base permette una moltitudine di variazioni originando sottoclassi di prodotti quali: flavonoli (quercetin, kaempferolo, miricetina), flavoni (apigenina, luteolina), flavanoni (catechina, epicatechina), antocianidine e isoflavonoidi (genisteina, daidzeina). Nelle piante esplicano un’attività antiossidante (protezione dalle radiazioni UV), protezione da insetti, funghi e batteri.

Le proprietà antiossidanti di numerosi flavonoidi sono state ampiamente documentate in vitro ed in vivo (Hamada H. et al. Arch. Biochem. Biophys.

1993; 306: 261-266, Saija A. et al. Free Radicai Biol. Med. 1995; 19: 481-486, Wang H. et al. Free Radicai Biol. Med. 1999; 27: 683-694). Alla loro capacità di inibire la generazione e gli effetti di specie radicaliche vengono correlate, almeno in parte, numerose attività biologiche a loro riconosciute. Crisina, quercetina, morina, rutina ed altri flavonoidi inibiscono l'ossidazione di lipoproteine a bassa densità (LDL) (DeWhalley C.V. et al. Biochem. Pharmacol. 1990; 39: 1743- 1750, Yan L.J. et al. Biochem. Biophys. Res. Commini. 1995; 212: 360-366) ed interferiscono con il processo di sviluppo di lesioni aterosclerotiche. A questa attività ed al potere antitrombotico di una serie di flavonoidi (Gryglewski R.J et al. Biochem. Pharmacol. 1987; 36: 317-322, Pace-Asciak et al. Clin. Chini. Acta 1995; 235: 207-219) sembra associata la diminuzione del rischio di insorgenza per malattie coronariche ed ischemiche (Hertog M.G.L et al. Lancet 1993; 342: 1007-1111, Rimm E.R. et al. Arch. Interri. Med. 1996; 125: 384-389). Il potere antiossidante e la capacità di interferire con la metabolizzazione dell'acido arachidonico, inibendo le lipossigenasi e le ciclossigenasi, vengono indicati fra i meccanismi alla base delle proprietà antinfiammatorie ed antiallergiche di numerosi flavonoidi (Ferrandiz M.L. Agents Actions 1991; 32: 283-288, Gabor M. Prog. Clin. Biol. Res. 1986; 213'. 471-480, Yoshimoto T. et al. Biochem. Biophys. Res. Commini. 1983; 116: 612-618, Homma M. et al 2000; 66: 88-91, Cruz T. Life Sci. 1998; 62: 687-695). In un recente brevetto (WO 00/02561) è inoltre riportato che le proprietà vasoattive di β-amiloide 1-40 e 1-42 sembrano dipendere dall'attivazione della via metabolica della fosfolipasi A2 (PLA2). Quercetina e 2’-ammino-3’-metossiflavone (PD98059), interferendo nel processo di metabolizzazione dell'acido arachidonico, sono in grado di inibire la vasocostrizione indotta da β-amiloide. Agendo come inibitore della ‘mitogen-activated protein kinase’ (MAPK), PD98059 previene inoltre la degenerazione neuritica indotta da β-amiloide fibrillare in neuroni di ippocampo (Rapoport M. et al. J. Neurochem. 2000; 74: 125-133). Secondo quanto riportato in letteratura, alcuni flavonoidi sono in grado di interferire con la replicazione virale (Konoshima T. et al. Chem. Phctnn. Bull. 1992; 40: 531-533). La baicalina, ad esempio, inibisce in maniera dose-dipendente la replicazione del virus dell'immunodeficienza di tipo 1 (HIV-1); la sua efficacia sembra legata, almeno in parte, alla capacità di inibire la trascrittasi inversa (Kitamura K.. et al. Antiviral. Res. 1998; 37: 131-140). Per alcuni flavonoidi è stato suggerito un possibile ruolo nella terapia preventiva di particolari tumori (Duthie S.J. et al Eur. J. Nutr. 1999; 38: 28-34). La quercetina, ad esempio, si è rivelata attiva nell'inibire l'espressione dell'oncogene p2ì-RAS in linee cellulari umane di tumore del colon (Ranelletti F.O. et al Ini. J. Cancer 2000; 85: 438-445). In un recente brevetto apigenina e crisina vengono indicati come efficaci ansiolitici privi di effetti sedativi (US 6,004,998).

Numerosi fiavonoidi sono presenti in natura come derivati glicosidici; secondo quanto riportato in letteratura, la loro coniugazione con zuccheri ne migliora l'assorbimento (Hollman P.C.H. et al. Am. J. Clìn. Nutr. 1995; 62: 1276-1282, Hollman P.C.H. et al. Cancer Leti. 1997b; 114: 139-140, Wakui Y. et al. J. Chromatogr. 1992; 575: 131-136). Per tali composti, il passaggio della barriera gastrointestinale potrebbe essere favorito dal legame reversibile con molecole carrier presenti a livello intestinale. In particolare, un meccanismo di diffusione facilitata, che utilizza carrier specifici per il trasporto degli zuccheri (Bell G.I. et al J. Biol. Chem. 1993; 268: 19161-19164), potrebbe spiegare il miglior assorbimento di fiavonoidi glicosilati. Si è ipotizzato, ad esempio, che il sistema di cotrasporto sodio-glucosio (SGLT1) abbia un ruolo nel facilitare l'assorbimento della quercetina 4'-glucoside (Hollman P.C.H. et al. FEBS Leti.

1997a; 418: 152-156). Né si può escludere un'interazione dei fiavonoidi glicosilati con le isoforme GLUT5 e GLUT2 presenti nel piccolo intestino e responsabili del trasporto sodio-indipendente degli zuccheri (Davidson N.O. et al. Ani. J. Physiol. 1992; 262: 795-800). La coniugazione con zuccheri viene indicata fra le strategie per consentire o facilitare il passaggio di sostanze attraverso la barriera emato-encefalica (BEH). L'isoforma GLUT1 , presente nelle cellule dell'endotelio capillare che costituiscono la BEE, media il trasporto di glucosio al tessuto cerebrale (Pardridge W.M. et al. J. Biol. Chem.

1990; 265: 18035-18040). E' stato dimostrato che analoghi glicosilati della enkefaline sono in grado di penetrare la BEE e, somministrati per via intraperitoneale, producono un effetto analgesico di tipo centrale. Si suppone che il loro passaggio attraverso la BBE venga facilitato dal legame con Tisoforma GLUT1 (Polt R. et al. Proc. Nati. Acad. Sci. 1994; 91 : 71 14-7118).

DESCRIZIONE DELL’INVENZIONE

La presente invenzione riguarda composti aventi formula generale (I).

dove R1, R2, R3, R4, R5, R1, R2, R3’, R4’, R5’ uguali o differenti sono idrogeno, idrossi, metossi, ammino, O-saccaride, C-saccaride, come farmaci ad attività antiaggregante della proteina β-amiloide.

Si è infatti trovato che i composti aventi formula generale (I), sono in grado di inibire l’aggregazione della proteina β-amiloide e la neurotossicità indotta dagli aggregati, e come tali sono utili nel trattamento della malattia di Alzheimer.

L’invenzione riguarda anche le composizioni farmaceutiche contenenti come principio attivo un composto di formula (I) ed il suo uso per la preparazione di medicamenti per il trattamento o prevenzione dei disordini associati ad un accumulo di proteina β-amiloide, in particolare la malattia di Alzheimer.

DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL’INVENZIONE Nei composti di formula I, il termine saccaride si riferisce sia a monosaccaridi che a polisaccaridi, in particolare disaccardi.

Un gruppo preferito di composti di formula generale (I) è quello in cui: R1, R2, R3, R4J uguali o differenti, sono idrogeno, idrossi o O-saccaride;

Rs, R1 ’, R2’ sono idrogeno;

R3’ è idrogeno, idrossi, metossi, ammino;

R4’, RJ’, uguali o differenti, sono idrogeno, idrossi o ammino;

il saccaride essendo scelto fra quelli di seguito rappresentati:

Quest’invenzione include anche tutti i possibili isomeri di formula (I) e miscele di essi.

La presente invenzione comprende anche i sali dei composti di formula (I) che possiedono gruppi che possono essere salificati, in particolare il gruppo carbossilico ed il gruppo amminico.

I sali fisiologicamente tollerati sono ad esempio, nel caso di molecole contenenti gruppi acidi, sali di metalli alcalini o alcalino terrosi, come sodio, potassio, litio calcio, magnesio, o sali formati con ammine organiche o amminoacidi, ad esempio l’arginina. Nel caso di molecole contenenti gruppi basici i sali possono essere di acidi inorganici, come acido cloridrico e acido solforico, e di acidi organici sia mono- che dicarbossilici, come acido acetico, acido tartarico ed acido metansolfonico.

I composti I sono di per sé noti e sono per lo più disponibili in commercio oppure possono essere ottenuti con metodi noti di sintesi o di estrazione da fonti che li contengono. Oltre ai composti puri, possono essere utilizzati anche gli estratti che li contengono.

Per i previsti impieghi terapeutici, i composti della presente invenzione saranno formulati in opportune composizioni farmaceutiche ricorrendo a tecniche ed eccipienti convenzionali. Le composizioni dell’invenzione saranno ad esempio somministrabili per via orale, parenterale, rettale, transdermica in forme quali ad esempio capsule, compresse soluzioni, supposte pomate e simili. La posologia dipenderà da più fattori quali tipo di patologia e condizioni (peso, sesso, età) del paziente, e sarà determinata con metodi standard sulla base delle caratteristiche farmacocinetiche e tossicologiche di ogni singolo composto. Si può comunque prevedere una somministrazione giornaliera compresa tra 0.1 e 10 mg/Kg.

SPERIMENTAZIONE FARMACOLOGICA

ATTIVITÀ’ ANTIFIBRILLOGENICA NEL TEST DELLA

TIOFLAVINA-T

La capacità dei prodotti di formula generale (I) di inibire la formazione di aggregati di β-amiloide (attività antifibrillogenica) è stata inizialmente valutata mediante il test della tioflavina-T (LeVine III H. Protein Sci. 1993; 2: 404-410, Naiki H. et al. Lab. Invest. 1996; 74: 374-383), utilizzando proteina β-amiloide 1-42. La metodica misura 1’emissione di fluorescenza generata dal legame della tioflavina-T con le fibrille di β-amiloide. Il legame della tioflavina-T alle fibrille produce uno “shift” nel suo spettro di emissione: l’intensità del segnale di fluorescenza misurato è direttamente proporzionale alla massa di fibrille formatasi.

La proteina β-amiloide 1-42 (U.S. Peptide) viene sciolta alla concentrazione di 0.22 mM in tampone TRIS-HCl 100 mM, ottenendo una soluzione finale a pH 7.4. La soluzione così ottenuta viene incubata a 37°C per cinque giorni singolarmente (controllo), od in presenza del composto da analizzare sciolto nelle medesime condizioni. Il rapporto molare fra il peptide ed il composto analizzato è di 1 :1.

Terminata l’incubazione, i campioni vengono centrifugati a 13000 rpm per 5 minuti, il sumatante viene eliminato ed il precipitato lavato con 500 pL di acqua e ricentrifugato a 13000 rpm per 5 minuti.

Le fibrille presenti nel precipitato vengono evidenziate per aggiunta di 300 pL di una soluzione 2 μΜ di tioflavina-T, ottenuta sciogliendo la tioflavina in tampone glicina-NaOH 50 mM e portando il pH a 9.4 per aggiunta di NaOH in pastiglie. Dopo 5 minuti a temperatura ambiente si prelevano 250 pL del campione, si pongono in una cuvetta di quarzo e si effettua la misura della fluorescenza (Fluorimetro Perkin Elmer LS-3) ad una lunghezza d’onda di eccitazione di 420 nm e di emissione a 480 nm. Le misure sono espresse come unità di fluorescenza arbitrarie e la percentuale di inibizione dell’aggregazione è valutata come diminuzione percentuale della fluorescenza rispetto al dato ottenuto per il peptide da solo (controllo).

In Tabella 1 sono riportate le inibizioni percentuali ottenute con questo metodo per alcuni composti rappresentativi.

Tabella 1. Attività antifibrillogenica determinata con il test della tioflavina-T.

ATTIVITÀ’ ANTIFIBRILLOGENICA NEL TEST DI RESISTENZA

ALLE PROTF.ASI

Un altro metodo utilizzato per determinare l 'attività antifibrillogenica valuta la resistenza della proteina β-amiloide alla digestione con tripsina. Questa tecnica consente, rispetto a quella con tioflavina-T, di valutare l’effetto antiamiloidogenico dei prodotti in un contesto più fisiologico.

β-amiloide 1-42 (US Peptide) viene sciolta, alla concentrazione di 1 mg/mL, in una miscela di H2O/CH3CN in rapporto 1 : 1. La soluzione così ottenuta viene aliquotata in campioni da 60 μg ciascuno e liofilizzata over night così da eliminare la quantità di TFA che rimane dopo la sintesi del peptide.

Il peptide viene solubilizzato con 15 μ L di NaOH 0.1 M e portato a pH 7.4 aggiungendo in successione 15 pL di tampone TRIS-HCl e 30 pL dello stesso tampone contenente o meno il composto di cui si vuole testare l'attività antifibrillogenica.

La concentrazione finale del peptide risulta essere 0.22 mM, quella della sostanza antifibrillogenica 0.88 mM.

I campioni cosi preparati vengono incubati a 37°C per 5 giorni. In queste condizioni, il peptide modifica la sua struttura da “random-coil” a “βsheet”, dando origine ad aggregati fibrillari. Al termine dell'incubazione si aggiungono ad ogni campione 2.4 pg di tripsina; dopo agitazione, si centrifugano i campioni alla velocità di 13000 rpm per 1 minuto e si prosegue l'incubazione per 1 ora a 37°C. Si centrifugano quindi i campioni a 13000 rpm per 5 minuti; dopo aver eliminato il surnatante (~50 pL), il precipitato viene solubilizzato con 40 pL di HCOOH e 10 pL di TFA 0.1% in acqua. Si effettua quindi l'analisi quantitativa dei campioni in HPLC (Beckman, Sistem Gold interfacciato con rivelatore UV). L'analisi viene condotta iniettando 20 pL di campione in colonna (Plymer Laboratories; PLRP-S 8 pm; 100 À; 150 x 4.6 mm.). La fase mobile è costituita da H2O 0.1% TFA (solvente A) e CH3CN 0.08% TFA (solvente B). Si utilizza un gradiente lineare che prevede un incremento della concentrazione del solvente B dal 15% al 60% in un intervallo di tempo di 30 minuti. Il rilevatore UV è impostato alla lunghezza d’onda di 2 14 nm.

La quantità di peptide resistente all’azione dell'enzima proteolitico è valutata comparando l'area del picco de! campione, contenente il composto da testare, con quella del picco del campione contenente il peptide incubato da solo (controllo). L'attività antiaggregante del composto viene espressa come percentuale di inibizione dell'aggregazione rispetto al campione controllo. In Tabella 2 sono riportate le inibizioni percentuali ottenute con questo metodo per alcuni composti rappresentativi.

Tabella 2. Attività antifibrillogenica determinata con il test di resistenza alla proteasi.

Claims (5)

1. RIVENDICAZIONI 1 . Un composto di formula generale (I)

   dove R1 R2, R3, R4, R5, R1, R2’, R3’, R4’, R5’, uguali o differenti, sono idrogeno, idrossi, metossi, ammino, O-saccaride, C-saccaride, per l’uso nel trattamento o prevenzione dei disordini associati ad una abnorme produzione di proteina β-amiloide.
2. 2. Un composto secondo la rivendicazione 1 in cui: R1, R2, R3, R4, uguali o differenti, sono idrogeno, idrossi, O-saccaride; R5, R1 ’, R2’ sono idrogeno; R3’ è idrogeno, idrossi, metossi o ammino; R4, R5’ uguali o differenti sono idrogeno, idrossi o ammino.
3. 3. Un composto secondo la rivendicazione 1 o 2 in cui il gruppo O-saccaride è scelto tra quelli di formula:
4. 4. Una composizione farmaceutica contenente come principio attivo un composto della rivendicazione 1 od un suo sale, in combinazione con diluenti ed eccipienti farmacologicamente accettabili.
5. 5. L’uso dei composti della rivendicazione 1 e dei suoi sali, per la preparazione di medicamenti per il trattamento o prevenzione dei disordini associati ad una abnorme produzione di proteina β-amiloide, in particolare la malattia di Alzheimer.