IT9067865A1 - Procedimento per la purificazione di un polipeptide ricombinante hdag equivalente, polipeptide hdag equivalente e saggi immunologici che lo utilizzano - Google Patents
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Description
DESCRIZIONE dell'invenzione industriale dal titolo: "Procedimento per la purificazione di un polipeptide ricombinante HDAg equivalente, polipeptide HDAg equivalente e saggi immunologici che lo utilizzano"
DESCRIZIONE
La presente invenzione si riferisce alla produzione ed alla purificazione di un polipeptide ricombinante ad attività HDAg-equivalente,dotato di determinate caratteristiche strutturali e di immunoreattivìtà e, in particolare, all' utilizzazione di tale polipeptide ricombinante quale sostituto degli antigeni naturali per 1' allestimento di dosaggi. immunologici per la ricerca di marcatori sierologici dell' infezione da HDV, quali le .immunoglobuline totali (Ig) e immunoglobuline M (J.gM) anti-HDV.
Il virus dell' epatite delta (HDV) e' un agente patogeno co-trasmissibil durante 1' infezione da parte del virus della epatite virale di tipo B (HBV). L' espressione e la replicazione del virus e' dipendente da HBV, La scoperta del. virus dell' epatite delta è stata descritta nel 1977 da Rizzetto (1); il clonaggio del genoma e l'identificazione del gene codificante per 1 'antigene HDAg (gene 0RF5) e' stata descritta nel 1986 da parte di Wang (H) . Il virione dell' HDV e' costituito da una molecola di RNA circolare a singola elica di circa 1.7 kJb (/?.—4) e da una fosfoproteina altamente basica (HDAg) (5r 6). legata specificamente al genoma di HDV, Il complesso HDV/HDAg e' assemblato all'interno del capside composto dall'antigene di superficie di HBV ed .il virione risultante e' .localizzato all'interno del nucleo dell' epatocita ospite. Tale localizzazione e' consistente con il fatto che 1' antigene contiene un dominio di. 8-10 aminoacidi molto slmile alla sequenza di riconoscimento nucleare del recettore del. glucocorticalde (7). Le osservazioni sopra riportate fanno ritenere che 1' antigene intervenga nel processo di replicazione virale. In particolare in un recente studio si avanza 1' ipotesi che 1' antigene svolga una funzione di regolazione nella replicazione e nella sintesi del proprio mRNA7 in analogia al ruolo esercitato dalle proteine codificate da altri virus, quale quello dell'influenza e della stomatite vescicolare (8).
Per quanto riguarda l'aspetto epidemiologico e sanitario, e' nota da tempo (9) l'importanza della rivelazione dell' antigene e degli anticorpi contro esso diretti come marcatori dell' infezione avvenuta. Infatti la diagnosi dell' infezione da HDV e' fatta in base alla rivelazione, nel siero, dell'antigene circolante e/o delle immunoglobuline totali 0 IgM anti-HD. Per diagnosticare la risposta anticorpale contro 1' HDV sono stati sviluppati saggi di tipo "radioimmunoassays” (RIA) e "enzyme imunoassays" (EIA), basati su metodi per competizione o per "cattura" (10-1f?). I saggi per competizione misurano .il decremento del legame di immunoglobuline ant.i-HD, marcate con I o coniugate con un enzima, dovuto alla attività antiHD presente nel siero. I saggi per "cattura" misurano la frazione delle IgM sieriche specifiche anti-HD estratte e insolubilizzate da un anticorpo specifico anti IgM umane e successivamente rivelate tramite un ponte immunologico costituito dall'antigene e dal corrispondente anticarpo marcato con 1 o coniugato con un enzima. La maggior parte di questi saggi usa preparati virali da tessuto epatico di scimpanzé o di marmotta infettati con HDV,
Uno scopo dell' invenzione è quello di risolvere i problemi. attuali derivanti dall' utilizza, nei saggi diagnostici esistenti, sia dell' antignene naturale sia di sostituti ricombinanti. I problemi derivanti dall' utilizzo dell' antigene naturale sono di ordine tecnico, economico e di sicurezza e sono tra loro intimamente connessi. Per quanto riguarda l'aspetto tecnico i. problemi principali relativi all'utilizzo dell' antigene naturale sono la bassa concentrazione negli estratti epatici, e l'estrema instabilità, anche in condizioni estremamente denaturanti (6M guanidinio cloruro, 8m urea). che causa la formazione di pept.idi a più basso peso molecolare, parzialmente attivi dal punto di. vista immunologi co, con diminuzione dell'attività specifica della preparazione. Allo scopo di utilizzare il reagente .in test immunelogici distribuibili commercialmente si. rende quindi. necessario, per soddisfare gli standard di qualità minimi, utilizzare costosi processi, di liofilizzazione. Dal punto di vista economico riveste inoltre una notevole importanza la stabulazione degli animali infetti, che comporta un notevole costo di gestione e problemi di si curezza per gli operatori.
I problemi derivanti dall 'utilizzo dei sostituti ricombinanti, sono dovuti, alla scelta diffusa di purificare la frazione dei polipeptidi ricombinanti organizzati. come corpo d' inclusione con rischio di perdita delle reattività immunologi che. .Inoltre il fenomeno di instabilità dell' antigene naturale con formazione di frammenti peptidici a parziale attività è presente anche nei sostituti, rizombi nanti . Anche nel caso di tali peptidi ricombinanti i.l risultato finale e' quello di una piil bassa attività immunologica.
Un ulteriore scopo della presente invenzione è quello di fornire reagenti ad attività immunologica HDAg equivalente, aventi migliorate prestazioni in test immunoligici parti colarmente per la ricerca di marcatori sierologici dell'infezione da HDUT quali le .immunoglobuline totali Ig) e immunoglo buiine M (I.gM) anti.-HDV.
E ' fondamento della presente invenzione l'osservazione originale che 1 'antigene HDAg si organizza come struttura nucleocapsidica.
E' stato così possibile ottenere poli.peptidi rizombi nanti HDAg equivalenti, organizzati in particelle ordinate e solubili in ambiente acquoso e delineare una strategia di purificazione ed un impiego di tali polipeptidi in saggi immunologie! che si. avvalgono delle proprietà chimico-fisiche identificate, vale a dire la struttura particellare e la solubilità.
Costituisce un primo oggetto dell'invenzione un procedimento per la preparazione e purificazione di un polipeptide ricombinante avente atti vità immunogenica HDAg equivalente da un estratto cellulare ottenuto dalla fermentazione di cellule in grado di esprimere detto polipeptide, in cui il poli.pepti.de è separato dall'estratto mediante un procedimento che sfrutta la struttura particellare di detto polipeptide.
.Idonei esempi dei procedimenti di separazione, che verranno descritti piii compiutamente nel seguito, sono la ultracentrifugazione in gradienti o cuscini di saccarosio e/o Cs„SO. e/o CsCl e la cromatografia di gel-filtrazione, che risultano idonei a separare la frazione antigenica particellare da contaminanti. batterici e/o polipeptidi non strutturati.
Secondo un altro aspetto l'invenzione fornisce un procedimento per la preparazione e purificazione di un palipeptide ri combinante , comprendente una sequenza aminoacidi,ra HDAg equivalente. interposta tra una prima e una seconda sequenza aminoacidi ca non HD antigenica, in cui la separazione di detto po.lipeptide dall'estratto cellulare è effettuata mediante cromatografia di immunoaffinità comprendente, in un primo stadio, l'alimentazione dell'estratto includente detto polipepti.de ad una colonna di immunoaffini tà comprendente un sopporto solido a cui è legato un primo anticarpo monoclonale in grado di legarsi specificatamente ad un determinante non HD antigenico di una di dette prima o seconda sequenze non HD antigeniche di detto poiipepti.de, e, in un secondo stadio, l'alimentazione del materiale legato ed eluito da detta prima colonna ad una seconda colonna di immunoaf finità comprendente un sopporto solido a cui è legato un secondo anticorpo monoclonale in grado di legarsi selettivamente ad un determinante non HD antigenico dell'altra di dette prima o seconda sequenza.
L'invenzione fornisce inoltre uno specifico polipepti.de ricombinante denominato JB-HDAg-T, parti colarmente vantaggioso, sia nei procedimenti di purificazione sopra descritti, sia nei saggi immunologici che lo utilizzano, un vettore plasmidico includente la sequenza di DNA che codifica per detto polipeptide e cellule ospiti trasformate con detto vettore plasmidico , idonee all 'espressione di detto polipeptide.
Più. in particolare, l'invenzione fornisce un vettore plasmidico (pLACDELTA, figura 1A). che permette l'espressione in E.coli del l'antigene delta mancante degli ultimi sei aminoacidi, sotto forma di proteina di fusione (B-HDAg-T, ca. 35 KD) costituita dai primi otto aminoacidi della beta-galactosidasi , quattro aminoacidi usati come linker, da 309 aminoacidi dell'HDAg e da un peptide di 89 aminoacidi, caratterizzato da una struttura secondaria costituita prevalentemente da due domini strutturali rispettivamente a conformazione "tu.rn" ed a conformazione "extended" (figura 1B) . Il plasmi de di espressione ΗΒc 27 in cui è stato clonato 1'antigene delta, é un derivato di pBR322 descritto da Stahl et al (13) e in US 4.7.58.507, (figura 1C). Il promotore che controlla la trascrizione del mRNA codificante per la proteina chimerica è il lac UV5 inducibile con IPTG, ed il “riho sornai hinding site" (RBS) è quello della beta-galactosidasi .
Il polipeptide ricombinante B-HDAg-T purificato mediante i procedimenti di separazione precedentemente descritti, risulta antigeni cariente completo, solubile in ambiente fisiologico, con struttura nativa e particolarmente puro. Ciò che si ottiene è infatti una proteina omogeneamente purificata, priva di peptidi parzialmente attivi e strutturata come capside I. vantaggi relativi all'impiego dei procedimenti di separazione sopra descritti si estendono a poiipeptidi ricombinanti equivalenti a B-HDAg-T.
Un ulteriore vantaggio specifico del polipeptide B-HDAg-T è associato alla fusione dell' HDAg con la regione amino- terminale della beta-galactosidasi , che risulta aumentare signifirati,vamente la stabilità di. un poli.pepti.de ricombinante in E,coli.
Nell'ambito della presente invenzione sono stati inoltre sviluppati anticorpi monoclonali specificatamente reattivi. contro sequenze non HD antigeniche del polipeptide B-HDAg-T, che risultano particolarmente idonei, sia nel procedimento di purif irazione per cromatografia di immunoaffinità per la purificazione di detto polipeptide, sia in saggi per competizione e a cattura che utilizzano tale poli peplide. In particolare risultano vantaggiosi anticarpi monetetonaii specificatamente reattivi contro le sequenze TGLLLNAGVA e WRLYRRHr poste nella regione carbo ssiterminal e del pol.ipeptide ricombinante B-HDAg-T. L'utilizzo di tali anticorpi. monocl nnali. comporta, sia nello schema analitico per competizione (dosaggio degli anti corpi totali), sia in quello a cattura (dosaggio degli anticorpi IgM), il vantaggio che il reagente anti genico viene presentato (o riconosciuto, nel secondo caso) senza .interferire con i siti di legame specifico con gli anticorpi umani anti-HOV.
L‘ invenzione verrà ora descritta più. dettagliatamente , mediante gli esempi che seguono: Esempio 1: preparazione del plasmide ricombinante pl.ACDELTA .
Il plasmide ricombinante e' stato costruito nel seguente modo: il plasmide HBc27 (fig. IO e' stato tagliato con EcoRI. e BamHI. Tale digestione produce un frammento di 1011 bp corrispondente al gene codificante per 1' antigene C dell' epatite B ed il plasmide di espressione pLAC linearizzato (4300 bp). Nel pL.AC un sito di restrizione EcoRI e' posizionato immediatamente a valle del "ribosomal binding site" della B-galattosidasi e dei primi B aa della B-galattosi.dasi stessa. Un sito BamHI si trova invece a circa 350 bp a valle del 5' del gene che conferisce la resistenza alla tetraciclina. Il frammento BamH.T./Rsa.T. di 627 bp codificante per 1' HDAg e' stato ottenuto dal plasmide pORF5 (fig. 1D) (EP-A-25 1.575) e dopo riempimento delle estremità "appiccicose" il frammento e' stato clonato nel pLAC dove i siti EcoR.I. e BamHI erano stati resi blunt". Il plasmide cosi.' ottenuto (pLACDELTA, fig.lA) e' stato trasformato nel ceppo di E. coli W3 110 J.Q (ATCC 27325).
Esempio 2; procedura d.i crescita.
L.a procedura di crescita in fermentatore del ceppo batterico W3 1110 IQ ,trasformato con pLACDELTA prevede i seguenti passaggi.:
- l'intero contenuto di un criotubo contenente il ceppo rivendicato viene cresciuto per 16 ore a 37C in terreno Luria-Bertani con Ampicillina 50ug/ml . L' indomani la coltura viene reinoculata in fermentatore da 14L contente terreno Luria-Be rtan.i in presenza di Atripicillina 50ug/ml. Vengono controllati in continuo i seguenti parametri:
- velocità di agitazione:
400 rpm
L.a crescita batterica viene monitorata a 590nm. Quando la viene raggiunto il valore di 0-5 OD/m.l viene aggiunto alla coltura il reagente IPTG (iso-propi1-tio-galattoside ) alla concentrazione di 1mM finale, l.a temperatura viene abbassata a 30C , le rpm portate a 1300 e la coltura viene continuata per 3 ore- L.' aggiunta del. IPTG ha lo scopo di dereprimere il promotore lac e permettere la trascrizione del gene eterologo. Trascorso il tempo di induzione le cellule vengono raccolte per centrifugazione, lavate con PBS e processate come segue.
Esempio 3: purificazione del polipeptide B-HDAg-T a) Una procedura di purificazione caratterizzata da una estrazione cellulare con tampone 50mM TrisHCl pH 7.5, 1mM EDTA , 1mM PMSF, 0.F7. Triton X-100, sanicazione a 4 KC allo scopo di. rompere le cellule e frammentare gli acidi nucleici, centrifugazione a 40 a 10000 rpm su rotore JA17 Beckman per 10 min. Il supernatante viene caricato su un gradiente di saccarosio dal 10-50'/. e sottoposto ad ultracentri— fugaci cine su rotore SW40, 16 ore, 35000rpm a AC. Il polipeptide ricombinante viene raccolto .in fondo al gradiente in forma nucleo capsidica , ad un grado di purezza >85-90%.
Il polipeptide ricombinante B-HDAg-T purificato attraverso utracentri fugazione in gradiente di saccarosio dal 10-507. ad una purezza >857, è stato colorato negativamente con urani 1 acetato. Le fotografie al microscopio elettronico sono state prese con i.l modello Philips EM301 nella fig. 2 è mostrato una lastra con X50000 di magnificazione, b) Alternativamente l'estratto cellulare, preparato come in a) viene applicato ad. una colonna contenente Sepharose AB-CN.Br attivata a cui viene legato un antic.orpo monoclonale murino che riconosce la sequenza "leader" Beta-galattosidasi, Dopo eluizione del materiale legato con alto sale, la preparazione, contenente una miscela di poiipeptid.i ricombinanti a diverso peso molecolare, viene applicata ad una seconda colonna d'affinità, in cui il legante dato da un anticorpo monoclonale murino che riconosce la sequenza peptidica WRLYRRH all' interno della sequenza "trailer" di B-HDAg-T. Dopo eluizione in alto sale, si ottiene .il polipeptide B-HDAg-T puro all' apparente omogeneità.
Al supporto insolubile, ad esempio piastre da microtit0lazione, precedentemente sensibilizzato con 1' anticorpo monoclonale reattivo contro la sequenza WRLYRRH, viene aggiunto il peptide B-HDAg-T ad una concentrazione di 1 ug/ml. In alternativa, il poiipeptide ricombinante biotinilato (0.1 ug/ml) viene aggiunto al supporto insolubile precedentemente sensibilizzato con streptavi dina. La piastra viene quindi incubata per 18 ore a temperatura ambiente, risciacquata con un tampone a base fisiologica e risulta pronta per 1 esecuzione dell' analisi, vera e propria che prevede I ' aggiunta in rapida successione del siero in esame (10 ul) e di una predeterminata quantità, in 100 ul, di un anticorpo poli clonaie specifico ant.i-HDV marcato con perossidasi di rafano (HRP1. Al termine di una .incubazione di 3 ore a 37 xC, i reagenti all' interno dei pozzetti della piastra vengono allontanati attraverso una procedura di lavaggio e si procede all' evidenziazione del policlanale perossidato eventualmente legatosi alla fase solida attraverso 1' aggiunta di un substrato ed un colorante sensibili,all' azione dell' enzima, ad esempio una miscela di H2O2 e Tetrametilbenzidina. La reazione colorimetrica viene bloccata con 1' aggiunta di acido solforico 1 M e la colorazione dei pozzetti viene misurata a 630 nm e 450 nm. Il delta di densità ottica (OD450-DD630) risulterà inversamente proporzionale all' attività anticorpale anti-HDV presente nel campione di saggio e quindi massimo nei campioni privi di attività anticorpale specifica, per i quali il coniugato ant i-HDV-HRP , non aver subito competizioni nel legarsi all' antigene ricombinante in fase solida.
Esempio 5: Schema di saggio per la determinazione di immunoglobuline di classe IgM anti-HDV.
Al supporto insolubile, ad esempio piastre da microt.ito.lazione precedentememte sensibilizzate con anticorpi specifici anti-IgM umane, viene aggiunto il siero da analizzare, opportunamente diluito dopo una incubazione a 37 °C per 1 ora, seguita dal lavaggio della piastra, vengono aggiunti in rapida sequenza quantità predeterminate di anti corpo poli clonaie anti-HDV coniugato a perossidasi di Rafano (HRP) e di anti.gene B-HDAg-T; alternativamente, al posto del coniugato policlonale anti HDV-HRP, pub essere efficacemente usato un anticorpo monoclonale specifico contro la sequenza WRLYRRH, anch 'essa coniugato a perossidasi. Dopo un' incubazione di 2 ore a 37 xC, i reagenti vengono allontanati attraverso lavaggio e si procede alla evidenziazione del. policlonale perossidato (o del monoclonale perossidato) eventualmente legatosi alla fase solida attraverso 1' aggiunta di un substrato ed un colorante sensibili all' azione dell' enzima, ad esempio una miscela di H2O2, bloccata dopo 30 minuti con 1' aggiunta di acido solforico 1M e la colorazione dei pozzetti viene misurata a 630 nm ed a 450 nm. Il delta di densità ottica (OD450-OD63Q ) risulterà direttamente proporzionale all' attività anticorpale di classe IgM anti-HDV presente nel campione di saggio.
Claims (1)
- RIVENDICAZIONI Peptide ricombinante B-HDAg-T avente la struttura illustrata in figura 1B. 2^ Vettore plasmidico includente la sequenza di DNA che codifica per il peptide B-HDAg-T. Vettore plasm.idico secondo la rivendicazione 2, comprendente il promotore lac UV5, il RBS. ATG e la sequenza codificante per i primi 7 residui aminoacidi della beta—galattosidasi in 5' e 267 nucleo tidi derivanti dalla sequenza di pBR322 in 3' rispettivamente a monte e a valle del gene eterologo. Cellula ospite, trasformata con un vettore plasmidico secondo le rivendicazioni 2 o 3. Procedimento per la produzione e purificazione di un polipeptide ricombinante avente attività immunogenica HDAg equivalente da un estratto cellulare ottenuto dalla fermentazione di cellule che esprimono detto polipeptide , .in cui detto polipepti.de è separato da detto estratto mediante un procedimento che sfrutta la struttura particeli are di detto polipeptide. Procedimento secondo la rivendicazione 5, in cui detto polipeptide ricombinante è separato da detto estratto cellulare mediante ultracentrifugazione . Procedimento secondo la rivendicazione 5. in cui detto pol.ipeptide ricombinante è separato da detto estratto cellulare mediante cromatografia di ge l-fiItrazione . Procedimento secondo la rivendicazione 6, in cui detto polipeptide è purificato dal prodotto di fermentazione , mediante estrazione cellulare e soni cazione per causare la rottura delle cellule e la frammentazione degli acidi nucleici, centrifugazione del prodotto cosi ottenuto con separazione del surnatante e ultracent r.ifugazione in gradienti di saccarosio Cs2SO4 e/o CsCl di detto surnatante. Procedimento per la preparazione e purificazione di un poiipeptide ricombinante, avente attività immunogenica HDAg equivalente, da un estratto cellulare ottenuto dalla fermentazione di cellule che esprimono detto polipepti.de, detto polipeptide comprendendo una sequenza aminoacidica HDAg equivalente interposta tra sequenze aminoacidiche non H.D antigeniche, in cui la separazione di detto polipepti.de dall' estratto cellulare è effettuata mediante cromatografia di immunoaffinità comprendente, in un primo stadio, l'alimentazione dell'estratto cellulare includente detta polipeptide ad una colonna di immunoaffinità comprendente un supporto solido a cui è legato un primo anticorpo monoclonale, in grado di legarsi specif iratamente ad un determinante non HD antigenico di una di dette prima o seconda sequenza non antigeniche di detto poli putide e, in un secondo stadio, l'alimentazione del materiale legato ed eluito da detta prima colonna ad una seconda colonna di immunoaffinità comprendente un supporto solido a cui è legato un secondo anticorpo monoclonale in grado di legarsi specificatamente ad un determinante non HD antigenico dell'altra di dette sequenze. 10.procedimento secondo la rivendicazione 9, in cui detto polipeptide è il polipeptide B-HDAg-T. avente la struttura di figura 1B, in cui detto primo anticorpo monoclonale è in grado di legarsi specificatamente ad un determinante della sequenza leader della beta-galattosidasi di detto poli putide e in cui detto secondo anti corpo monoclonale è in grado di legarsi specificatamente ad una sequenza scelta dal gruppo che consiste di TGLLLNAGVA e WRLYRRH poste nelle regioni carbossiterminal i di detto polipeptide. Saggio diagnostico per la determinazione di anti corpi anta HDV in un campione sospettato di contenere detti anticorpi comprendente l'incubazione di detto campione con un polipeptide ricombinante ottenuto mediante puri ficazione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 5 a IO. 12. Saggio diagnostico in cui detto polipeptide è il polipeptide B-HDAg-T. Corredo diagnostico per la determinazione di anticorpi anti HDV\ includente un polipeptide ricombinante ottenuto mediante un procedimento di purificazione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 5 a 10. Corredo diagnostico secondo la rivendi cazione 13,· in cui detto polipeptide è il polipeptide B-HDAg-T „ Anticorpi monoclonali specificatamente diretti contro i determinanti TGLLLNAGVA o WRLYRRH.
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