IT202100019544A1

IT202100019544A1 - Nuovi agonisti sintetici del recettore tlr 4 - new synthetic agonists of tlr4 receptor

Info

Publication number: IT202100019544A1
Application number: IT102021000019544A
Authority: IT
Inventors: Francesco Peri; Alessio Romerio
Original assignee: Univ Degli Studi Di Milano Bicocca
Priority date: 2021-07-22
Filing date: 2021-07-22
Publication date: 2023-01-22

Description

"NUOVI AGONISTI SINTETICI DEL RECETTORE TLR4"

DESCRIZIONE

La presente invenzione si riferisce a nuove molecole sintetiche con attivit? agonista del Toll-Like Receptor 4 (TLR4) umano, composizioni che le comprendono ed i loro usi, in particolare per il trattamento di malattie per cui ? utile indurre o incrementare una risposta immunitaria.

ARTE ANTERIORE

L?immunit? innata ? la prima linea di difesa degli organismi superiori contro i patogeni ed i danni cellulari. Essa ? basata sul riconoscimento di specifiche strutture molecolare associate a patogeni o danni cellulari (rispettivamente PAMPs e DAMPs) da parte di specifici recettori proteici. Detti recettori sono noti come pattern recognition receptor (PRR) e possono essere di varie tipologie, in dipendenza della loro posizione all?interno della cellula, nel citosol o sulla membrana, e della loro funzione.

Tra i recettori pi? studiati ci sono quelli della famiglia Toll-Like Rceptor (TLR), il cui ruolo principe ? di riconoscere differenti PAMPs, allertando l?organismo della presenza di patogeni attraverso l?infiammazione, reclutando altre cellule immunitarie per combattere l?infezione e quindi iniziando il processo di sviluppare l?immunit? adattativa, che ? la difesa pi? appropriata e specifica per tali minacce.

Infatti, la risposta immunitaria innata ai patogeni pu? essere decisiva nel determinare sia la natura sia l?intensit? della risposta immunitaria adattativa.

Per questa ragione, lo sviluppo di attivatori (agonisti) dei TLR ha una rilevanza farmaceutica laddove uno stimolo infiammatorio ? benefico da un punto di vista terapeutico: sono degli esempi i farmaci per l?immunoterapia del cancro e gli adiuvanti vaccinali. Nel primo caso, un?attivit? proinfiammatoria pu? condurre alla riattivazione del sistema immunitario nell?ambiente tumorale, che pu? pertanto distruggere il tumore (Bhatia S, Miller NJ, Lu H, et al. Intratumoral G100, a TLR4 agonist, induces antitumor immune responses and tumor regression in patients with Merkel cell carcinoma. Clin Cancer Res.2019;25(4):1185-1195. doi:10.1158/1078-0432.CCR-18-0469).

Nel secondo caso, un?attivit? proinfiammatoria ? vantaggiosa poich? i vaccini moderni non usano pi? dei patogeni interi inattivati, ma delle lorosottounit?, che non sono in grado di stimolare una corretta risposta infiammatoria senza adiuvanti. Finora, ci sono varie piccole molecole capaci di legare ed attivare i recettori TLR, ed alcuni di essi sono usati come adiuvanti, come ad esempio: imidazochinoline agoniste dei TLR7/8, come imiquimod e resiquimod, cos? come agonisti del TLR2/TLR6 tipo Pam2CS ed agonisti del TLR4 come il monofosforil lipide A (MPL) e l?aminoalchil glucosaminide-4-fosfato (AGPs, anche noti come composti Corixa, CRX).

Tra i TLR, il TLR4 ? di grande interesse farmacologico: la sua ttivazione ? la maniera pi? efficiente di stimolare le immunit? innata ed adattativa. Infatti, il TLR4 esibisce due diversi e distinti meccanismi di funzionamento cellulari che conducono al rilascio di un pi? largo ed eterogeneo insieme di citochine proinfiammatori, causando una risposta immunitaria pi? completa

L?agonista naturale del TLR4 ? il lipopolisaccaride (LPS), il componente principale dellamembrana esterna dei batteri Gram-negativi. Esso pu? essere diviso in tre parti: una lunga catena polisaccaridica, chiamata O-Antigene, un pi? corto oligosaccaride chiamato Core ed infine il Lipide A (lpd A), la porzione immunogenica della molecola, formato da due glucosammine a cui sono comunemente legati due fosfati ed un numero variabile di catene aciliche.

L?attivit? agonistica del Lipide A ? basata sulla sua affinit? di legame (abilit? di legare) al corecettore del TLR4, il Myeloid Differentiation factor 2, MD-2, con la conseguente formazione del complesso (TLR4/MD-2/LPS)2 sulla superficie delle cellule dell?immunit? innata, per esempio macrofagi e cellule dendritiche.

Il processo di attivazione del recettore TLR4 da parte dell?LPS comincia con l?interazione tra singole molecole di LPS o aggregati in soluzione con la Lipid Binding Protein (LBP), che forma un complesso con una molecola di LPS. Dopodich?, la molecola di LPS ? trasferita da LBP al corecettore CD14, che a sua volta la trasferisce a MD-2.

Tuttavia, lpd A ? tossico anche in quantit? dell?ordine del picogrammo, e conseguentemente non pu? essere usato farmacologicamente (Molinaro A, Holst O, Lorenzo F Di, et al. Chemistry of lipid a: At the heart of innate immunity. Chem - A Eur J.

2015;21(2):500-519. doi:10.1002/chem.201403923).

Molecole sintetiche e naturali aventi una struttura simile a quella del lpd A, ma con una endotossicit? attenuata, sono candidati interessanti come adiuvanti vaccinali nella prospettiva di mantenere l?attivit? immunostimulatoria eliminando gli effetti tossici.

Il Monofosforil lipide A (MPL) ? una molecola identica al lpd A, eccetto per l?assenza del gruppo C1 fosfato. Nonostante sia cos? simile, l?attivit? infiammatori ? solo lo 0,1% di quella della molecola naturale ed il suo profilo farmacologico ? talmente buono che ? stata approvata dall?FDA per l?uso come adiuvante vaccinale. La molecola ? attualmente usata nei vaccini Cervarix e Fendric. Tuttavia, l?adiuvante MPL usato attualmente ? chimicamente eterogeneo, poich? prodotto direttamente dall?LPS naturale.

In aggiunta, la sintesi di tali composti disaccaridici ? molto lunga e complessa, risultando in cun costo finale di circa 200 eur/mg. Per tali ragioni, ? di interessa sviluppare ulteriori analoghi del lpd A aventi una struttura monosaccaridica, che condividano le stesse vantaggiose caratteristiche degli analoghi noti o che siano addirittura migliori, preferibilmente ottenibile attraverso una via sintetica pi? semplice.

Un esempio di analogo monosaccaridico del lpd A noto allo stato dell?arte ? rappresentato dai composti sintetici chiamati AGPs (noti anche come adiuvanti CRX, Corixa) comprendenti un?unit? monosaccaridica legata tramite glicosilazione ad un?unit? di un aglicone amminoalchilico N-acilato..

Gli AGPs sono potenti agonisti del TR4 e sono chimicamente omogenei, essendo prodotti per sintesi chimica.

Ulteriori, pi? semplici, analoghi del lpd A che sono comunque efficaci nell?attivazione del TLR4 comprendono dei derivati monosaccaridici monofosforilati che mimano la portione riducente o la porzione non riducente del lpd A (schema in basso).

Un altro esempio di composti noti allo stato dell?arte ? rappresentato dai composti GLA 63 e GLA 60 (schema sopra) comprendenti uno scheletro glucopiranoside, fosforilato in positione C4, una catena lineare di 14 carboni in C2 ed una catena ramificata in C3 (14+14 in GLA 63 e 14+12 in GLA 60) (Motohiro Matsuura, Makoto Kiso and Akira Hasegawa Infect. Immun.1999, 67(12), 6286-6292).

Tali monosaccaridi che mimano parzialmente il lpd A e mimano il monosaccaride lipide X, che ? un precursore sintetico del lpd A, sono attivi nello stimolare la produzione delle citochine TNF-? e IL-6 dipendenti dal TLR4, in cellule sia murine sia umane.

Anche il composto SDZ MRL 953, noto allo stato dell?arte, ha dimostrato una potente attivit? nello stimolare il rilascio di citochine infiammatorie come l?interleuchina-6 (IL-6), l?interleuchina-8 (IL-8) e TNF-? in macrofagi murini ed in granulociti neutrofili, esibendo in concomitanza una tossicit? ridotta di almeno un fattore 10<4 >in topi sensibilizzati alla galattosammine quando comparata con l?endotossina genitrica (Salmonella abortus equi).

In modelli sperimentali di infezione microbica, il composto ha provato di possedere un grande effetto protettivo quando amministrato profilatticamente o una o tre volte in topi mielosoppressi od immunocompetenti.

La dose efficace per raggiungere il 50% di risposta con SDZ MRL 953 varia in dipendenza dell?agente infettivo e del modo di somministrazione. In tutti i casi, comunque, le EC50 ottenute sono circa 10<3 >maggiori di quele ottenute con l?endotossina di Salmonella abortus equi.

Tuttavia, grazie alla bassa tossicit?, gli indici terapeutici di questa molecola, espressi ad esempio come LD25/ED75, sono significativamente migliori rispetto all?endotossina e variano da 5 a >500, a seconda dell?agente infettivo e del modo di somministrazione. Il composto ? anche efficace nell?indurre tolleranza alle endotossine: dosaggi ripetuti del composto inducono una resistenza transiente (?1 settimana) ai rischi letali dovuti all?endotossina.

Tutti questi risultati positivi sono anche stati confermati in un modello di sepsi avanzata causata da Escherichia coli, in cui la terapia antibiotica si era gi? provata inefficiente: un pretrattamento con una dose di SDZ-MRl 953 un giorno prima della inoculazione microbica ha accresciuto drammaticamnte gli effetti curativi degli antibiotici somministrati. Per questa ragione, la sopravvivenza a lungo termine ? stata significativamente accresciuta con dosi incrementali dell?immunostimulante in una terapia combinata.

Per via della tollerabilit? dimostrata da SDZ MRL 953 negli animali ed in vitro, questo composto ? stato successivamente testato in modelli umani.

Sulla base della nota attivit? antitumorale dell?endotossina di Salmonella abortus equi legata alle sue propriet? immunostimulanti,

Blood, 1997, 1673-1683) hanno condotto uno studio a doppio cieco casuale di fase I con mezzo di controllo, somministrando SDZ MRL 953 in pazienti affetti da tumore al fine di definire dapprima i suoi effetti biologici e la sua sicurezza per la somministrazione umana e poi la suainfluenza sulla reazione di una aggiunta successiva di endotossina (LPS).

La somministrazione SDZ MRL 953 si ? dimostrata sicura e avente eccellente tollerabilit?. Sempre SDZ MRL 953 aumenta il numero di granulociti ed i livelli di G-CSF ed interleuchina-6 (IL-6) nel siero, ma non quelli delle citochine proinfiammatorie TNF-?, IL?1?, and IL-8.

Pertanto, SDZ-MRL 953 possiede tre caratteristiche rilevanti: 1) un?alta tollerabilit? ed una bassa tossicit?, 2) l?abilit? di indurre la produzione di G-CSF e, come risultato, 3) l?abilit? di stimolare una resistenza immunitaria aspecifica espressa da un?accresciuto novero di difese primarie nelle cellule.

Nonostante questi risultati positivi che incoraggiano l?uso clinico di SDZ MRL 953, il meccanismo d?azione di questa molecola non ? stato ancora studiato nel dettaglio molecolare.

La sintesi di SDZ MRL 953 ? complessa per via del fatto che il nucleo glucosamminico lega, in posizione C2, C3 e C4, catene di acido 3(R)-idrossimiristico enantiomericamente puro. L?acido3-idrossimiristico ? commercialmente disponibile come racemo, pertanto ? necessario isolare l?enantiomero puro di acido 3(R)-idrossimiristico prima dell?uso nella sintesi di SDZ MRL 953.

WO2019/092572 palesa un?ulteriore classe di composti, con una monofosforil glucosammina triacilata ed un gruppo fosfato in posizione C1, in particolare il composto FP112.

FP112 ? un composto simile all?estremit? riducente del lpd A ed a SDZ MRL 953, ma con tre catene aciliche totalmente saturate e non sostituite. Questo composto ? significativamente pi? semplice da sintetizzare di quelli noti allo stato dell?arte, poich? per la sintesi non ? richiesta la produzione di catene aciliche otticamente pure.

FP112 ha un profilo farmacologico eccellente, poich? ? in grado di stimolare il rilascio di numerose citochine proinfiammatorie, le pi? notevoli delle quali sono IL-1?, IL-1?, IL-6, TNF-? e IFN?.

FP112 ? stato studiato estensivamente in vitro su cellule Hek-Blue, Raw-Blue e THP-1, dimostrando sempre una bassa tossicit? ed una buona attivit? proinfiamamtoria gi? alla concentrazione di 10 ?M.

SOMMARIO DELL?INVENZIONE

Gli autori della presente invenzione hanno identificato un gruppo di nuovi composti aventi un nucleo monofosforil glucosamminico triacilato, differente da quelli noti allo stato dell?arte, che sono efficienti agonisti del recettore TLR4. Vantaggiosamente, detti nuovi composti sono pi? versatili di quelli descritti nello stato dell?arte siccome possono essere funzionalizzati con vari gruppi funzionali di interesse. Gli autori della presente invenzione hanno anche sviluppato un nuovo metodo di sintesi di detti nuovi composti cos? come di altri composti noti allo stato dell?arte, che ? pi? semplice, veloce ed economico dei metodi noti allo stato dell?arte.

Gli autoi della presente invenzione forniscono qui di seguito i nuovi composti di formula 1.

(Formula 1)

In cui R1 ? una catena alchilica satura C5-C15 opzionalmente sostituita,

in cui R2 ? una catena alchilica satura C5-C15 opzionalmente sostituita,

in cui R3 ? una catena alchilica satura C5-C15 opzionalmente sostituita,

in cui R4 ? un qualsiasi sostituente conosciuto dalla persona esperta nel settore che pu? essere legato per mezzo di un legame tra C6 e un atomo adatto e/o qualsiasi sostituente che possiede un atomo di ossigeno o di azoto che pu? legarsi a C6.

Detti composti sono apparentemente simili ai composti divulgati da WO2019/092572, ma ha numerosi vantaggi rispetto ad essi. Un primo vantaggio ? rappresentato dal fatto che la struttura molecolare dei composti di formula 1 li rende pi? stabili: infatti, il gruppo fosfato, che ? noto per essere uno dei migliori gruppi uscenti in chimica organica, nella posizione C4 nel composto di formula 1 ha dimostrato di essere molto pi? stabile del gruppo fosfato in posizione C1, presente nei composti dello stato dell?arte discussi precedentemente.

Per esempio, composti di formula 1 sono pi? stabili nella reazione di desililazione (reaczione 5 della sintesi di FP20 e reazione 6 della sintesi di FP11).

Durante la sintesi di FP112 la labilit? del fosfato in C1 era uno dei maggiori problemi e si osservava la degradazione del fosfato anche operando in condizioni blande, con la formazione di due importanti sottoprodotti defosforilati (mostrati nella sezione sperimentale). In aggiunta, la resa ? inferiore nel caso di FP11, attestandosi in media attorno al 50%.

In FP20 la desililazione avviene con buone rese attorno al 90%, senza il problema della rottura del fosfato anomerico, e una formazione di sottoprodotti trascurabile.

Un secondo vantaggio ? il pi? semplice metodo fornito per la sintesi chimica dei composti dell?invenzione, che richiede solo sei passaggi sintetici per ottenere il composto finale; peraltro, nel metodo dell?invenzione, possono essere sufficienti solo tre purificazioni tramite colonna cromatografica, evitando cos? lo spreco di grandi quantit? di solventi di purificazione. Conseguentemente, questa sintesi ? pi? economica ed ? pertanto possibile sintetizzare maggiori quantit? a livello di laboratorio cos? come facilitare la scalabilit? industriale del processo.

Infine, un grande vantaggio del composto della presente invenzione ? la possibilit? di modificare la molecola di base con vari gruppi funzionali in posizione C6, permettendo cos? di ottenere molecole in cui sono combinate l?attivit? di agonista del TLR4 e ulteriori funzioni addizionali. La diversa struttura dei nuovi composti dell?invenzione fornisce una maggiore stabilit? al composto e la possibilit? di funzionalizzare la posizione C6.

In FP11 la funzionalizzazione in C6 ? impegnativa: la maggioranza dei reagenti chimici per la funzionalizzazione stacca il fosfato in C1, similmente a quanto avviene durante la desililazione. Nel caso del composto FP20 e dei suoi derivati, il fosfato anomerico ? mancante e la funzionalizzazione in C6 ? possibile. Ci? permette all?esperto del settore di modificare il composto ottimizzandolo per specifiche attivit? desiderate tramite la modifica del gruppo funzionale in C6, per esempio aumentando la sua solubilita e/o biodisponibilit?, aggiungendo sostituenti specifici per un determinato obiettivo o coniugando la molecola con altri sostituenti funzionali.

Pertanto, oggetto dell?invenzione sono:

1. Un composto di formula 1

In cui R1 ? una catena alchilica satura C5-C15 opzionalmente sostituita,

in cui R2 ? una catena alchilica satura C5-C15 opzionalmente sostituita,

in cui R3 ? una catena alchilica satura C5-C15 opzionalmente sostituita,

Un adiuvante vaccinale costituito dal composto di formula 1

Una composizione vaccinale comprendente il composto di formula 1, almeno un veicolante farmaceuticamente accettabile e almeno un antigene immunogenico farmaceuticamente accettabile.

Una composizione farmaceutica comprendente il composto di formula 1 e almeno un eccipiente e/o un veicolante farmaceuticamente accettabile.

Un intermedio di formula 1i

In cui R1 ? una catena alchilica satura C5-C15 opzionalmente sostituita.

Un metodo per la preparazione del composto di formula 1i In cui R1 ? una catena alchilica satura C5-C15 opzionalmente sostituita

Comprendente i seguenti passaggi

1) Acilazione selettiva del gruppo amminico in posizione C2 della glucosamina cloridrato per reazione con cloruro di acile in presenza di bicarbonato di sodio.

2) Protezione mediante sililazione selettiva dell'idrossile in posizione C6 per reazione con terz-butildimetilsilil cloruro (TBDMSCl) in presenza di imidazolo.

Un metodo per la preparazione di un composto di formula 1,

in cui R1 ? una catena alchilica satura C5-C15 opzionalmente sostituita,

in cui R2 ? una catena alchilica satura C5-C15 opzionalmente sostituita,

in cui R3 ? una catena alchilica satura C5-C15 opzionalmente sostituita,

in cui R4 ? un qualsiasi sostituente conosciuto dalla persona esperta nel settore che pu? essere legato per mezzo di un legame tra C6 e un atomo adatto e/o qualsiasi sostituente che possiede un atomo di ossigeno o di azoto che pu? legarsi a C6, comprendente i seguenti passaggi:

1) Acilazione selettiva del gruppo amminico in posizione C2 della glucosamina cloridrato per reazione con cloruro di acile in presenza di bicarbonato di sodio;

2) Protezione mediante sililazione selettiva dell'idrossile in posizione C6 per reazione con terz-butildimetilsilil cloruro (TBDMSCl) in presenza di imidazolo, ottenendo cos? l'intermedio definito nella rivendicazione 20;

3) Acilazione selettiva degli idrossili nelle posizioni C1 e C3 per reazione con cloruro di acile in presenza di trietilammina e N, N-dimetil aminopiridina (DMAP);

4) Fosforilazione degli idrossili in posizione C4 per reazione con dibenzil N, N-diisopropilfosfaramidito in presenza di triflato imidazolio, seguita da ossidazione del fosfito a fosfato tramite acido metacloroperbenzoico;

5) Deprotezione dell'idrossile dal silano in posizione C6 attraverso la presenza di acido solforico in quantit? catalitica; e

6) Deprotezione del fosfato da benzili in posizione C4 e opzionalmente deprotezione di benzili su qualsiasi sostituente in posizione C6 attraverso idrogenazione catalizzata da Palladio su carbonio (Pd/C).

Un metodo per la preparazione di un composto di formula X

in cui R1 ? una catena alchilica satura C5-C15 opzionalmente sostituita,

in cui R2 ? una catena alchilica satura C5-C15 opzionalmente sostituita,

in cui R3 ? una catena alchilica satura C5-C15 opzionalmente sostituita,

in cui R4 ? OH e in cui ciascuno di R1, R2 e R3 ? privo di sostituenti -OH in posizione C2 comprendente i seguenti passaggi:

2) Protezione per sililazione selettiva dell'idrossile in posizione C6 per reazione con terzbutildimetilsilil cloruro (TBDMSCl) in presenza di imidazolo ottenendo l'intermedio di formula 1i come definito nelle forme di realizzazione precedentemente descritte.

3) Acilazione completa degli idrossili nelle posizioni C1, C3 e C4 per reazione con cloruro di acile in presenza di trietilammina e N, N-dimetil aminopiridina (DMAP).

4) diacilazione selettiva della posizione C1 per reazione con etilendiammina in presenza di acido acetico

5) Fosforilazione dell'idrossile in posizione C1 per reazione con dibenzil N, N-diisopropilfosfaramidito in presenza di triflato imidazolio, seguita da ossidazione del fosfito a fosfato tramite acido metacloroperbenzoico

6) Deprotezione dell'idrossile dal silano in posizione C6 attraverso la presenza di acido solforico in quantit? catalitica.

7) Deprotezione del fosfato da benzile in posizione C4 e opzionalmente deprotezione di benzile su qualsiasi sostituente in posizione C6 attraverso idrogenazione catalizzata da Palladio su carbonio (Pd/C).

L?uso di un composto intermedio come definito nella rivendicazione 22 per la sintesi dei composti di formula 1,

In cui R1 ? una catena alchilica satura C5-C15 opzionalmente sostituita,

in cui R2 ? una catena alchilica satura C5-C15 opzionalmente sostituita,

in cui R3 ? una catena alchilica satura C5-C15 opzionalmente sostituita,

E,

L?uso di un intermedio di formula 1i come definito in una qualsiasi delle forme di realizzazione qui divulgate per la sintesi dei compoti di formula X

in cui R1 ? una catena alchilica satura C5-C15 opzionalmente sostituita,

in cui R2 ? una catena alchilica satura C5-C15 opzionalmente sostituita,

in cui R3 ? una catena alchilica satura C5-C15 opzionalmente sostituita,

in cui R4 ? OH e in cui ciascuno di R1, R2 e R3 ? privo di sostituenti -OH in posizione C2.

DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELLE FIGURE

Figura 1 Attivit? dei composti FP su TLR4 e TLR2. Cellule

Figure 1 Attivit? dei composti FP su TLR4 e TLR2. Le cellule HEK-BlueTM hTLR4 (A) e HEK-BlueTM TLR2 (B) sono state trattate con le concentrazioni indicate dei composti FP20, FP21, FP22, FP23 e FP24, MPLA, LPS (100 ng/mL) e Pam2CSK4 (1 ng/mL) e incubate per 16-18 ore. I risultati sono stati normalizzati rispetto alla stimolazione con il solo LPS (A) o Pam2CSK4 (B) e sono stati espressi come percentuale della media ? SEM di almeno tre esperimenti indipendenti. (Trattato Vs non trattato: *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001; ****P<0.0001).

Figura 2 Attivit? dei composti FP su macrofagi umani e murini. Le cellule THP-1-X BlueTM (A) e RAW-BlueTM (B) sono state trattate con le concentrazioni indicate dei composti FP20, FP21, FP22, FP23 e FP24, MPLA e LPS (100 ng/mL) e incubate per 16-18 ore. I risultati sono stati normalizzati rispetto alla stimolazione con il solo LPS e sono stati espressi come percentuale della media ? SEM di almeno tre esperimenti indipendenti. (Trattato Vs non trattato: *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001; ****P<0.0001).

Figura 3 Vitalit? cellulare. Le cellule THP-1 differenziate in macrofagi sono state trattate con concentrazioni crescenti di FP20, FP21, FP22, FP23 e FP24 (0.1-50 ?M) e LPS (100 ng/mL). ? stato inserito il veicolo (DMSO) alle stesse concentrazioni (0.1-50 ?M) per valutare la tossicit? del solvente. I dati sono stati normalizzati rispetto al controllo (non trattato) e sono stati espressi come percentuale della media ? SEM di almeno tre esperimenti indipendenti. (Trattato Vs non trattato: *P<0.05; **P<0.01;

***P<0.001; ****P<0.0001).

Figura 4 Vitalit? cellulare. Le cellule RAW-Blue sono state trattate con concentrazioni crescenti di FP20, FP21, FP22, FP23 e FP24 (0.1-50 ?M) e LPS (100 ng/mL). ? stato inserito il veicolo (DMSO) alle stesse concentrazioni (0.1-50 ?M) per valutare la tossicit? del solvente. I dati sono stati normalizzati rispetto al controllo (non trattato) e sono stati espressi come percentuale della media ? SEM di almeno tre esperimenti indipendenti. (Trattato Vs non trattato: *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001; ****P<0.0001).

Figura 5 Cellule HEK-Blue hTLR4, HEK-Blue Null e HEK-Blue hTLR2 sono state trattate come indicato ed incubate per 18h. Sono stati raccolti I surnatanti e quantificati I livelli di SEAP tramite il metodo QUANTI-blue. I dati sono stati normalizzati rispetto alla stimolazione con S-LPS (A, B), IL-1? (C) o PAM2CSK4 (D) ed espressi come percentuale media ? SD di tre esperimenti indipendenti. (trattati versus non trattati: **p<0.01; ***p<0.001).

Figura 6 A) Peso corporeo dei topi durante i 7 giorni successive all?amministrazione degli adiuvanti (n=4 per trattamento). B) Risposta di anticorpi all?immunizzazione rispetto OVA usando MPLA, FP112 ed FP11 come adiuvanti dopo la prima (22 giorni dopo l?immunizzazione) e la seconda immunizzazione (19 giorni dopo) (n=8 per trattamento). L?area sotto la curva ? stata esaminata per la comparazione statistica tramite i test ANOVA di Brown-Forsythe and Welch One-way con un?alfa di 0.05.

Figura 7<1>H NMR del compost 25 (impurezza 1 della reazione 6 nella sintesi di FP11), in cui ? possible notare la mancanza del fosfato in C1 dalla molteplicit? (d) del segnale a 6.04 ppm. In presenza di un fosfato in C1, H-1 avrebbe una molteplicit? di tipo dd per via dell?accoppiamento H-P.

Figura 8<1>H NMR del compost 26 (impurezza 2 della reazione 6 nella sintesi di FP11), in cui ? possible notare la mancanza del fosfato in C1 dalla molteplicit? (d) del segnale a 6.04 ppm. In presenza di un fosfato in C1, H-1 avrebbe una molteplicit? di tipo dd per via dell?accoppiamento H-P. In questo caso, anche il silano ? stato staccato, come si nota dalla mancanza dei segnali a 0 ppm ed a 0.85 ppm.

Figura 9<13>C NMR del composto 26 (impurezza 2 della reazione 6 nella sintesi di FP11), che conferma la struttura del composto 26 come descritta in figura 8.

Figure 10 Attivit? del composto difosfato FP200 su macrofagi umani. Cellule THP-1-X BlueTM Sono state trattate con le concentrazioni indicate dei composti FP11, FP112, FP20, FP200, FP21, MPLA and LPS (100 ng / mL) ed incubate per 16-18 ore. I risultati sono stati normalizzati rispetto alla stimolazione con il solo LPS e sono stati espresso come percentuale della media ? SEM di almeno tre esperimenti indipendenti (Tattato Vs non trattato: * P <0.05; ** P <0.01; *** P <0.001; **** P <0.0001).

GLOSSARIO

Nella presente descrizione, il termine ?agonista del recettore TLR4? indica un composto che lega selettivamente il recettore TLR4 inducendo un cambiamento conformazionale del detto recettore, generando di conseguenza una stimolazione intracellulare tramite lo scatenamento di una risposta simile a quella indotta dal legante naturale di detto recettore. Nel caso del TLR4, le sostanze descritte come agoniste si legano al corecettore MD-2, a sua volta legato non covalentemente al TLR4, generando quindi un complesso recettoriale (TLR4/MD-2/agonista)2, che a partire dalla superficie cellulare causa una cascata di segnali che porta all?attivazione di fattori di trascrizione nucleare ed alla sintesi di citochine proinfiamamtorie (principalmente TNF-? e vari tipi di interleuchine).

Nella presente descrizione, il composto identificato come FP112 ? un composto avente la formula rappresentata di seguito

In cui R1 = R2 = R3 = C=OC11H23 and R4 = H, divulgato come FP112 in WO2019/092572. Nella presente descrizione, il legame in C1 come rappresentato nella formula 1 seguente ha il significato comunemente inteso nella chimica organica

Formula 1

ed indica che il composto pu? essere sia nella configurazione ? sia in quella ? del centro anomerico.

Nella presente descrizione, il legame in C1 come rappresentato nella formula 1? seguente il significato comunemente inteso nella chimica organica

Formula 1?

ed indica che il composto ? nella configurazione anomerica ?.

Nella presente descrizione, il legame in C1

Formula 1?

ed indica che il composto ? nella configurazione anomerica ?.

Nella presente descrizione, il termine ?quantit? catalitica? significa una quantit? o concentrazione di una sostanza usata in una reazione chimica tale da ottenere un effetto catalitico. In particolare, nella descrizione il termine ?quantit? catalitica? pu? essere sostituito da ?un intervallo di concentrazione volume/volume dallo 0.5% allo 0.1%.

DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL?INVENZIONE

La presente invenzione si riferisce ad un composto di formula 1

(Formula 1)

In cui R1 ? una catena alchilica satura C5-C15 opzionalmente sostituita,

in cui R2 ? una catena alchilica satura C5-C15 opzionalmente sostituita,

in cui R3 ? una catena alchilica satura C5-C15 opzionalmente sostituita,

Pertanto, in accordo alla presente descrizione, ogni catena alchilica, R1, R2, o R3, pu? essere una catena alchilica C5, C6, C7, C8, C9, C10, C11, C12, C13, C14, C15.

In accordo alla presente descrizione ognuna di R1, R2, and R3 pu? essere una catena alchilica uguale o differente come descritto sopra.

In una forma di realizzazione dell?invenzione, almeno due tra R1, R2, e R3 sono identiche.

In accordo alla presente descrizione una o pi? tra R1, R2, e R3 sono sostituite o non sotituite.

In una forma di realizzazione dell?invenzione, almeno una tra R1, R2, e R3 ? sostituita.

Quando una o pi? delle catene R1, R2, e R3 sono sotituite, in accordo con una forma di realizzazione dell?nvenzione detta catena pu? essere libera da sostituenti -OH in posizione C2. L?assenza di ossidrili in posizione C2 permette una via sintetica vantaggiosamente pi? breve ed efficiente, eliminando vari passaggi di protezione e deprotezione di tale gruppo ossidrile, riducendo il costo della sintesi e rendendo il processo sintetico scalabile ed industrializzabile per la produzione di farmaci.

Come descritto sopra, la catena R4 in posizione C6 pu? essere funzionalizzata da ogni sostituente di interesse fintanto che l?attivit? agonistica sul TLR4 non sia inficiata.

Secondo un esempio non limitante, R4 pu? essere un gruppo idrossile (OH), un gruppo fosfato (PO4<2->), un gruppo azide (N3), un gruppo amminico (NH2), un gruppo acile (O(C=O)R) o un gruppo alchilico (OR) o un gruppo glicosilico.

La convenienza di R4 in posizione C6 di essere funzionalizzabile ? una caratteristica estremamente vantaggiosa dei composti dell?invenzione. Come descritto precedentemente, ? infatti possibile fornire molecole in cui la funzione di agonista del TLR4 possa essere combinata con una qualsiasi altra funzione di interesse, a seconda del sostituente selezionato per R4. Per esempio, ? sorprendentemente possibile ottenere un aumento della solubilit? e della biodisponibilit? usando un grupp fosfato (PO4<2->). Infatti, in accordo con gli insegnamenti dello stato dell?arte (WO2019/092572) la presenza di due gruppi fosfati nell?agonista l? descritto risultava nell?assenza di attivit? agonistica sul TLR4. Al contrario, i nuovi composti dell?invenzione mantengono sorprendentemente l?attivit? agonistica sul TLR4 anche con un secondo gruppo fosfato, migliorando in questo modo la solubilit? del composto stesso. Come noto all?esperto del settore, una migliore solubilit? ? un notevole vantaggio poich? migliora il trasporto, la biodisponibilit? del composto e la stabilit? di una furmulazione che lo comprenda. Pertanto, la semplice presenza di un fosfato aggiuntivo in C6 pu? migliorare significativamente l?efficacia di una formulazione farmaceutica o vaccinale.

Un ulteriore importante vantaggio della possibile funzionalizzazione in C6 dei composti dell?invenzione ? che, quando usati come adiuvanti vaccinali, ? anche possibile coniugarli ad un antigene o ad un epitopo antigenico, o coniugarli ad un altro adiuvante per migliorarne ed allargarne l?attivit?.

Inoltre, il composto pu? essere coniugato ad una molecola specifica per un obiettivo, cos? da migliorarne il trasporto ad un sito preferenziale.

Ulteriormente, quando usato in una formulazione antitumorale, il composto dell?invenzione pu? essere funzionalizzato legandolo adiversi farmaci aggiuntivi, in modo da migliotarne l?efficacia.

Per esempio, ? possibile usare sostituenti senza atomi di idrogeno in grado di formare legami ad idrogeno per migliorare l?effetto lipofilico, o sostituenti caratterizzati dalla presenza di atomi di idrogeno in grado di formare legami ad idrogeno per aumentarne la solubilit? in acqua, che ? inversamente proporzionale alla lipofilicit?.

Un ulteriore vantaggio derivante dalla possibilit? di sfruttare una grande variet? di sostituenti come R4 ? l?effetto sterico che pu? derivare ad esempio dall?uso di un sostituente che tenda a limitare la libera rotazione attorno a legami singoli, e quindi a ridurre il numero di conformazioni energeticamente accessibili.

Quando fra tali conformazioni ve n?? una bioattiva, l?effetto ?irrigidente? pu? aumentare l?affinit? della molecola per il suo recettore.

Un altro importante esempio pu? essere rappresentato dalla funzionalizzazione con un linker in posizione C6. Un esempio non limitante di linker appropriato ? rappresentato da un disolfuro (R-S-S-R), un idrazone (R?R??C=N-NH2), un peptide od un tioetere (r?SR??) o simili.

Linker come quelli appena descritti permettono la preparazione di un coniugato anticorpo-farmaco (Antibody-Drug-Conjugate, ADC), una molecola complessa comprendente un anticorpo legato ad un farmaco anticancerogeno attivo biologicamente (come il composto dell?invenzione), che permette di ottenere una combinazione di effetti tra l?anticorpo ed il composto della presente invenzione.

Un ulteriore interessante esempio ? la possibilit? di inserire un gruppo glicosile in C6, poich? il composto risultante avrebbe due vantaggi: una migliore solubilit? per via della presenza del gruppo idrofilico glicosile e teoricamente una migliore affinit? per il recettore, per via della comiglianza alla regione di Core del LPS.

Secondo la presente invenzione, il composto di formula 1 pu? essere un anomero ? avente formula 1? od un anomero ? avente formula 1?.

(Formula 1?)

Secondo alcune forme di realizzazione non limitanti, il composto di formula 1 pu? essere selezionato fra composti nella forma anomerica ? o ? dei composti di formula 1, in cui

R1 = R2 = R3 = C11H23 e R4 = OH, o

R1 = R3 = C13H27 ; R2 = C11H23 e R4 = OH, o

R1 = R2 = R3 = C9H19 e R4 = OH, o

R1 = R2 = R3 = C13H27 e R4 = OH, o

R1 = R3 = C9H19 ; R2 = C11H23 e R4 = OH, o

R1 = R2 = R3 = C11H23 e R4 = PO4<2>,-o

R1 = R2 = R3 = C9H19 e R4 = PO4<2>,-o

R1 = R2 = R3 = C13H27 e R4 = PO4<2>, o

R1 = R2 = R3 = C11H23 e R4 =OC3H7, o

R1 = R2 = R3 = C11H23 e R4 = O(C=O)C6H8(OH)3, o

R1 = R2 = R3 = C11H23 e R4 =NH2.

In unaforma di realizzazione preferita, i composti sono anomeri ? dei composti di formula 1, come:

Composto FP20: con R1 = R2 = R3 = C11H23 R4 = OH

(Formula 2)

Composto FP21: con R1 = R3 = C13H27 R2 = C11H23 R4 = OH

(Formula 3)

Composto FP22: con R1 = R2 = R3 = C9H19 R4 = OH

(Formula 4)

Composto FP23: con R1 = R2 = R3 = C13H27 R4 = OH

(Formula 5)

Composto FP24: con R1 = R3 = C9H19 R2 = C11H23 R4 = OH

(Formula 6)

Composto FP200: con R1 = R2 = R3 = C11H23 R4 = PO4<2->

(Formula 7)

Composto FP202: con R1 = R2 = R3 = C9H19 R4 = PO4<2->

(Formula 8)

Composto FP203: con R1 = R2 = R3 = C13H27 R4 = PO4<2->

(Formula 9)

Ulteriori forme di realizzazione in accordo alla presente invenzione, in cui il composto di formula 1 abbia un sostituente addizionale in posizione C6 possono essere selezionati fra i seguenti:

Composto FP204: con R1 = R2 = R3 = C11H23 R4 = OC3H7

(Formula 10)

Composto FP205: con R1 = R2 = R3 = C11H23 R4 = O(C=O)C6H8(OH)3

(Formula 11)

Composto FP206: con R1 = R2 = R3 = C11H23 R4 = NH2

(Formula 12)

In una forma di realizzazione, si preferisce il composto avente formula 2.

Nella presente descrizione, ci si riferisce a tale composto anche come FP20 in cui R1, R2 e R3 sono -C11H23 e R4 ? -OH.

I dati riportati nella sezione Esempi mostrano le peculiari caratteristiche vantaggiose dei composti sopra riportati.

Secondo la presente descrizione, e sulla base dei dati sperimentali ottenuti, ? evidente che i composti come descritti e rivendicati sono degli efficaci agonisti del recettore TLR4. Per ?agonista di un recettore? si intende ci? che ? comunemente definito nella letteratura, ossia una sostanza in grado di legare uno specifico recettore nel sito di legame del legante endogeno. Pertanto, come il nome suggerisce, il primo compete col secondo per il legame in detto sito.

A seguito del legame del legante naturale, il recettore va incontro a cambiamenti conformazionali tali da mediare la sua attivit? biologica a livello cellulare. Gli agonisti sono molecole aventi un?attivit? tale da mimare gli effetti del legante. Quando si legano al recettore, causano dei cambiamenti conformazionali di natura simile a quelli causati dal legame col legante naturale.

Nel caso della presente descrizione, ciascun agonista ? mostrato e rivendicato come un agonista selettivo per il recettore TLR4.

Date le caratteristiche tecniche osservate per i composti di formula (1) come definiti nella presente descrizione e nelle rivendicazioni, detti composti sono utili come principi attivi o come adiuvanti nel trattamento di condizioni mediche che beneficino da un?attivazione del TLR4, ad esempio in malattie in cui un?attivazione del sistema immunitario, ed in particolare dell?immunit? innata, abbia effetti terapeutici o profilattici.

Pertanto, tra le condizioni mediche che richiedano o beneficino da un?attivazione del recettore TLR4 sono incluse tutte quelle per le quali i trattamenti o la prevenzione siano migliorate dall?attivazione del recettore TLR4 e dall?attivazione della risposta immunitaria innata scatenata da detto recettore.

Un esempio non limitante di tale condizione medica ? rappresentato da tumori, allergie, malattie infettive come infezioni virali, malattie cardiovascolari, malattie metaboliche dipendenti dall?obesit?, degenerazione neurale, apoptosi, infezioni batteriche, malattie autoimmuni. Esempi di malattie autoimmuni sono IBD, morbo di Chron o artrite reumatoide.

Il composto di formula 2, qui anche definito come composto FP20, pu? essere comparato con l?attivit? del composto di formula FP112 avente la formula rappresentata di seguito

In cui R1 = R2 = R3 = C=OC11H23 R4 = H, divulgato in WO2019/092572, l? chiamato FP112, per via del fatto che hanno gli stessi sostituenti R1, R2, R3 e R4, ma in FP112 il gruppo fosfato ? in posizione C1, mentre in FP20 ? in C4.

Esperimenti in vitro condotti per FP112 su cellule Hek-Bluer, Raw-Blue e THP-1 brevemente riportati di seguitp dimostrato una bassa tossicit? ed una buona attivit? proinfiammatoria ad una concentrazione di 10 ?M. In aggiunta, esperimenti in vivo condotti su FP112 per provare la sua tollerabilit? ed efficacia come adiuvante vaccinale non hanno mostrato alcun danno collaterale all?amministrazione di 10 ?g di FP112, ed hanno dimostrato un?efficacia come adiuvante vaccinale comparabile a quella di MPLA. La sezione degli Esempi mostra che, per esemperimenti condotti su cellule Hek-Blue, Raw-Blue e THP-1, l?attivit? dei composti dell?invenzione ? comparabile a quella degli agonisti riportati in WO2019/092572, che sono anche stati dimostrati essere non citotossici ed efficaci come adiuvanti vaccinali in vivo.

In aggiunta, i composti della presente invenzione sono migliorati rispettoa quelli divulgati in WO2019/092572 per via della ri-allocazione del gruppo fosfato in C1 nello stato dell?arte, in posizione C4 nella presente invenzione, permettendo di posizionare la catena alchilica in C1 nei composti della presente invenzione piuttosto che in C4, il che ? risultato in una migliore attivit? del sostituente in C6. Infatti WO2019/092572 mostra nell?Esperimento 2 che il composto l? chiamato FP111, ha due fosfati uno in posizione C1 e l?altro in posizione C6, si ? dimostrato del tutto inattivo come agonista del TLR4 in una prova condotta su cellule Hek-Blue hTLR4. In WO2019/092572 si era ipotizzato che l?assenza di attivit? era dovuta dalla presenza di due gruppi fosfati nella molecola e che il numero di fosfati nella molecola non dovesse essere superiore ad uno per mantenere l?attivit? da agonista del TLR4.

Sorprendentemente, gli autori della presente invenzione hanno scoperto che i composti presentati e rivendicati nel presente brevetto, come, per esempio, i composti di formula 7, 8 e 9, che portano due gruppi fosfti, uno in posizione C4 e l?altro in posizione C6, mantengono inaspettatamente l?attivit? da agonista del TLR4 negli stessi test in cui il composto FP111 riportato in WO2019/092572 risultava completamente inattivo. Questa scoperta era inaspettata e dimostra un vantaggio rilevante dei composti dell?invenzione rispetto ai precedenti nello stato dell?arto in quanto dimostra che la posizione dei gruppi fosfato in una monofosforil glucosammina triacilata pu? influenzare significativamente l?attivit? di tali composti.

L'invenzione, pertanto, fornisce anche il composto di formula 1 in cascuna delle forme di realizzazione riportate nella descrizione o nelle rivendicazioni come adiuvante vaccinale.

La rilevanza di adiuvanti della risposta immunitaria nella composizione di vaccini ? nota.

Gli adiuvanti vaccinali, infatti, accrescono sensibilmente l?efficacia dei vaccini e lo sviluppo dell?immunit? verso gli antigeni presenti nel vaccino, nei soggetti a cui sono somministrati,

Pertanto, ? oggetto della presente invenzione anche una formulazione vaccinale comprendente il composto di formula 1 come definita in qualsivoglia delle forme di realizzazione nella descrizione o nelle rivendicazioni od una loro combinazione.

Una composizione vaccinale secondo l?invenzione pu? pertanto comprendere il composto di formula 1 come definito in una qualsiasi delle forme di realizzazione sopra elencate o una sua miscela, almeno un veicolante farmaceuticamente accettabile e almeno un antigene immunogenico farmaceuticamente accettabile.

Veicolanti vaccinali adeguati sono noti all?esperto del settore.

I veicolanti farmaceutici possono essere selezionati per assistere il rilascio del/i componente/i dell?antigene dalla composizione durante un esteso periodo di tempo. Il veicolante pu? includere una sostanza idrosolubile o non idrosolubile.

Una sostanza idrosolubile ? una sostanza avente un ruolo nel controllare l?infiltrazione di acqua negli interstizi della dispersione del farmaco.

Pu? essere usata una sostanza idrosolubile, od una combinazione di due o pi? sostanze idrosolubili.

La sostanza idrosolubile nello specifico pu? essere selezionata fra uno o pi? gruppi consistenti di polimeri sintetici (cfr. polietilen glicole, polietilen polipropilen glicole), zuccheri (cfr. saccarosio, mannitolo, glucosio, condroitina sodio solfato), polisaccaridi (cfr. destrano), amminoacidi (cfr. glicina ed alanina), Sali minerali (cfr. sodio cloruro), Sali organici (cfr. citrato di sodio) e proteine (cfr. gelatina, collagene o loro miscele).

In aggiunta, quando la sostanza idrosolubile ? una sostanza anfifilica, che si dissolve cio? sia in solventi organici sia in acqua, essa ha un effetto sul controllo del rilascio di, ad esempio, un farmaco lipofilico, alterandone la solubilit?. Una sostanza anfifilica pu? essere scelta fra, ad esempio ma non limitatamente, polietilen glicole o suoi derivati, poliossietilene, poliossipropilen glicole e derivati, esteri di acidi grassi e alchilsolfati sodici di zuccheri, e, pi? specificatamente, polietilen glicole, poliossi stearato 40, poliossietilen poliossipropilen glicole, sodio lauril solfato, sodio oleato, sodio cloruro, sodio desossicolato, i cui pesi molecolari sono superiori a 1500 Da.

In aggiunta, la sostanza idrosolubile pu? includere sostanze selezionate fra uno o pi? gruppi consistenti in farmaci, peptidi, proteine, glicoproteine, polisaccaridi o sostanze antigeniche usate come vaccini.

Un veicolante non idrosolubile, qualora presente, pu? includere una sostanza che abbia un ruolo nel controllare l?infiltrazione d?acqua negli interstizi di una dispersione farmaceutica.

Pu? essere usata una sostanza non idrosolubile, od una combinazione di due o pi? di esse.

Una specifica sostanza non idrosolubile pu? essere selezionata fra uno o pi? gruppi di polimeri non idrosolubili, resine, e reticoli inclusi acrilati non idrosolubili, metacrilati ed altri carbossi polimeri, cere, lipidi inclusi fosfolipidi e lipoproteine.

L'esperto del settore conosce il quantitativo di veicolante ed ulteriori eccipienti opzionali comunemente usati in una formulazione farmaceutica o vaccinale.

In una forma di realizzazione, il veicolante farmaceutico pu? costituire approssimativamente da circa 1% fino a 20% in peso, preferibilmente fra il 10% ed il 20% in peso, basato sul perso totale della formulazione vaccinale.

La composizione secondo l?invenzione pu? comprendere uno dei composti come qui definiti e rivendicati od una loro miscela.

La composizione dell?invenzione pu? essere preparata come singola miscela di adiuvante ed antigene o come diverse miscele per la somministrazione contemporanea o sequenziale dei componenti.

In una forma di realizzazione particolare, il composto di formula 1 descritto nella presente invenzione ? l?unico adiuvante preente nella composizione vaccinale.

La presente invenzione ? anche relativa ad una composizione farmaceutica, comprendente un composto di formula descritto in cascuna delle forme di realizzazione fornite nella descrizione o nelle rivendicazioni od una loro miscela ed almeno un eccipiente e/o veicolante farmaceuticamente accettabile.

La composizione pu? inoltre comprendere uno o pi? principi attivi terapeuticamente attivi. Detta composizione farmaceutica pu? anche essere formulata nella forma di una pluralit? di principi attivi.

La composizione farmaceutica dell?invenzione pu? comprendere come unico principio attivo uno o pi? composti di formula 1 in accordo a cascuna delle forme di realizzazione fornite nella descrizione o nelle rivendicazioni, o pu? anche comprendere principi attivi aggiuntivi, come principi attivi antitumorali, inibitori delle chinasi, composti citotossici ed almeno un eccipiente e/o veicolante farmaceuticamente accettabili.

La composizione farmaceutica pu? essere formulata per somministrazione orale, parenterale, nasale, aerosolo, sublinguale, rettale, vaginale, topica, endovenosa o sistemica.

L?esperto del settore pu? selezionare un veicolante e/o eccipiente appropriato per sospensione, emulsione, unguento, crema, spray, granulato, polvere, soluzione, capsula, pillola, compressa, prodotto liofiliffato, pastiglia, aerosol, nebulizzazione, iniezione od altri

Ulteriore oggetto della presente invenzione ? la composizione farmaceutica in accordo a ciascuna delle forme di realizzazione quivi divulgate per l?uso nel trattamento, o come adiuvante nel trattamento, di condizioni mediche che richiedano o beneficino da immunostimolazione da attivazione del recettore TLR4.

Malattie che richiedano o beneficino da immunostimolazione da attivazione del recettore TLR4 sono note nel settore e comprendono cancro, allergie, malattie infettive, malattie cardiovascolari, malattie metaboliche dipendenti dall?obesit?, degenerazione neuronale, malattie apoptotiche, disordini autoimmuni, infezioni virali, infezione batteriche, malattie autoimmuni. Un esempio di malattie autoimmuni ? rappresentato da IBD, morbo di Chron od artrite reumatoide.

Secondo l?invenzione, la composizione pu? comprendere da 0,01 a 50 mg di composto dell?invenzione o di una sua miscela come dose giornaliera, per esempio 0.01 fino a 50 mg di sostanza per Kg di peso corporeo (test sugli animali).

L?invenzione fornisce anche un nuovo metodo per la sintesi di composti di formula 1 come qui definiti cos? come per la sintesi dei composti presentati in WO2019/092572, di formula X

Formula X

in cui R1 ? una catena alchilica satura C5-C15 opzionalmente sostituita,

in cui R2 ? una catena alchilica satura C5-C15 opzionalmente sostituita,

in cui R3 ? una catena alchilica satura C5-C15 opzionalmente sostituita,

in cui R4 ? OH e in cui ciascuno di R1, R2 e R3 ? privo di sostituenti -OH in posizione C2, e per la sintesi dell?intermedio di formula 1i

Formula 1i

in cui R1 ? una catena alchilica satura C5-C15 opzionalmente sostituita.

Il composto di formula 1, cos? come i composti presentati in WO2019/092572, possono essere sintetizzati in modo pi? semplice e scalabile industrialmente in confronto ai metodi sintetici noti allo stato dell?arte per i composti di WO2019/092572 cos? come per SDZ MRL 953. Quest?ultimo richiede l?inserimento di tre catene aciliche di acido (R)-3-idrossimiristico. Il composto otticamente puro (enantiomero R) non ? commercialmente disponibile, dal momento che ? venduta solo la miscela racemica. Inoltre, l?acido (R)-3-idrossimiristico necessita di una reazione di protezione del gruppo ossidrilico in posizione 3 prima della reazione di consensazione con lo zucchero. Il metodo presentato in WO2019/092572 per la sintesi di composti di formula X, come definiti precedentemente, per quanto gi? semplificato rispetto al metodo sintetico presentato per SDZ MRL 953, per via dell?assenza dei sostituenti sulle catene aciliche, comprende comunque 10 passaggi, numerose purificazioni tramite colonna cromatografica ed alcuni passaggi critici, come la formazione di un?azide a basso peso molecolare. In aggiunta, il metodo presentato in WO2019/092572 ha una resa estremamente bassa (circa 8-9%) che rende l?intero processo antieconomico.

Il composto presentato nella presente invenzione mostra un?attivit? biologica comparabile, se non addirittura migliore, dei composti noti nel settore e pu? essere sintetizzato in modo pi? semplice e scalabile industrialmente.

Pertanto, ? oggetto della presente invenzione un metodo per la preparazione dell?intermedio di formula 1i

in cui R1 ? una catena alchilica satura C5-C15 opzionalmente sostituita, comprendente i seguenti passaggi

Pertanto, la presente invenzione ? relativa anche ad un intermedio di formula 1i

in cui R1 ? una catena alchilica satura C5-C15 opzionalmente sostituita,

Inoltre, la presente invenzione ? anche relativa ad un metodo per la preparazione dei composti di formula 1 come definiti nelle forme di realizzazione precedenti e nelle rivendicazioni

In cui R1 ? una catena alchilica satura C5-C15 opzionalmente sostituita,

in cui R2 ? una catena alchilica satura C5-C15 opzionalmente sostituita,

in cui R3 ? una catena alchilica satura C5-C15 opzionalmente sostituita,

in cui R4 ? un qualsiasi sostituente conosciuto dalla persona esperta nel settore che pu? essere legato per mezzo di un legame tra C6 e un atomo adatto e/o qualsiasi sostituente che possiede un atomo di ossigeno o di azoto che pu? legarsi a C6. comprendente i seguenti passaggi:

2) Protezione mediante sililazione selettiva dell'idrossile in posizione C6 per reazione con terz-butildimetilsilil cloruro (TBDMSCl) in presenza di imidazolo, ottenendo cos? l'intermedio definito nella formula 1i;

4) Fosforilazione degli idrossili in posizione C4 per reazione con dibenzil N, N-diisopropilfosfaramidite in presenza di triflato imidazolio, seguita da ossidazione del fosfito a fosfato tramite acido metacloroperbenzoico;

Il metodo pu? alternativamente cominciare dall?intermedio di formula 1i come definito in precedenza e nelle rivendicazioni e pu? comprendere i passaggi 3-6.

In una forma di realizzazione, il metodo di sintesi precedentemente descritto pu? comprende un passaggio 5i) aggiuntivo dopo il passaggio 5) e prima del passaggio 6): 5i) Fosforilazione dell?idrossile in posizione C6 per reazione con dibenzil N, N-diisopropilfosfaramidite in presenza di triflato imidazolio, seguita da ossidazione di fosfito a fosfato tramite acido metacloroperbenzoico in cui l'R4 risultante ? un gruppo fosfato (PO4<2->).

Quando portato a termine, tale metodo conduce a composti di formula 1, in cui R4 ? un gruppo fosfato, come nei composti di formula 7, 8 e 9.

In alternativa, il metodo di sintesi pu? inoltre comprendere un passaggio 5ii) al posto del passaggio 5i) dopo il passaggio 5) e prima del passaggio 6):

5ii) Acilazione dell?idrossile in posizione C6 per reazione con un acido carbossilico in presenza di un agente condensante e di un catalizzatore adatti, come 1-etil-3-(3-dimetilamminopropil) carbodiimmide (EDC) e N,N-dimetilamminopiridina (DMAP), o con cloruro di acile in presenza di un catalizzatore adatto, come N,N-dimetilamminopiridina (DMAP), in cui l'R4 risultante ? un gruppo acilico.

Quanto portato a termine, questo metodo conduce all?ottenimento di composti di formula 1 in cui R4 ? un gruppo acilico, come i composti di formula 10 e 11.

In una forma di realizzazione preferita, detto agente condensante e catalizzatore adatto sono N,N-dimetilamminopiridina (DMAP).

In alternativa, il metodo di sintesi pu? inoltre comprendere un passaggio 5iii) al posto del passaggio 5i) e 5ii) dopo il passaggio 5) e prima del passaggio 6):

5iii) glicosilazione dell'idrossile in posizione C6 per reazione di un donatore di glicosile cloruro in presenza di ossido di argento (I) come attivatore, di acido triflico come catalizzatore e di setacci molecolari in cui l'R4 risultante ? un gruppo glicosilico.

In alternativa, il metodo di sintesi pu? inoltre comprendere un passaggio 5iv) al posto del passaggio 5i), 5ii) e 5iii) dopo il passaggio 5) e prima del passaggio 6):

5iv) alchilazione dell?idrossile in C6 per reazione di un cloruro alchilico stabilizzato in presenza di ossido di argento (I) come attivatore, di acido triflico come catalizzatore e di setaccio molecolari adatti in cui l'R4 risultante ? un gruppo n alchilico.

In alternativa, il metodo di sintesi pu? inoltre comprendere un passaggio 5v) ed un passaggio 5vi) al posto del passaggio 5i), 5ii), 5iii) e 5iv) dopo il passaggio 5) e prima del passaggio 6):

5v) Tosilazione della posizione C6 per reazione con tosil cloruro in resenza di trietilammina come base e DMAP come catalizzatore

5vi) Inserzione di un azide in posizione C6 per reazione con sodio azide in presenza di tetrabutilammonio ioduro, in cui l?R4 risultante ? un gruppo azide.

In accordo alla presente descrizione, le acilazioni descritte nelle reazioni 1), 3), 5ii) possono essere effettuate tramite metodi comunemente usati dai tecnici del campo chimico. Per esempio, le acilazioni possono essere effettuate usando cloruri acilici o acidi carbossilici in presenza di altri comuni agenti condensanti, la 1-etil-3-(3-dimetilamminopropil) carbodiimmide (EDC) o dicicloesilcarbodiimmide (DCC)

Le condensazioni a cui ci si riferisce nelle reazioni 1) e 3) possono effettuate usando catene aciliche di differente lunghezza, tra i 5 e 15 atomi di carbonio, cos? da ottenere diversi derivati della molecola descritta dalla formula 1.

La protezione in C6 descritta dalla reazione 2) pu? essere effettuata in accordo alle pi? comune tecniche note agli esperti di chimica. Una di tali tecniche comuni ? la sililazione in presenza di varie basi non nucleofile, come trietilammina, diisopropiletilammina o bicarbonato di sodio e catalizzatori come la N,N-dimetil amminopiridina (DMAP).

La fosforilazione del C4 descriita dalla razione 4) pu? essere effettuata in accordo alle pi? comuni tecniche note agli esperti di chimica, come l?inserzione di un fosfito in presenza di diversi tamponi pH acidi, come, ma non limitatamente a, tetrazolo o 4,5-dicianoimidazolo. La successiva reazione di ossidazione pu? essere effettuata per reazione con diversi blandi ossidanti, come, ma non limitatamente a, dimetildiossirano (DMDO) o terz-butil perossido (tBuOOH).

La deprotezione di C6 descritta dalla reazione 5) pu? essere effettuata in accordo alle pi? comuni tecniche note agli esperti di chimica, come la desililazione in presenza di tetrabutilammonio fluoruro (TBAF), acido acetico (AcOH) o vari tipi resine acidiche, cfr. IRA 120 H<+>, IRC 120 H<+ >o Dowex? 50W.

Il processo di sintesi secondo l?invenzione permette di produrre il composto di formula 1 in un modo semplice ed industrialmente scalabile.

Come precedentemente dichiarato, l?invenzione comprende sia l?anomero ? sia il ? del composto di formula 1 s definito. Gli inventori hanno sorprendentemente scoperto che, a seconda della temperatura e della quantit? di un catalizzatore adatto nell?acilazione al passagio 3, si pu? ottenere l?anomero ? o ?.

Pertanto, quando si desidera l?anomero ?, l?acilazione al passaggio 3) ? effettuata ad una temperatura compresa fra -78 ?C e 0 ?C e con una quantit? di DMAP compresa fra 0,05 e 0,2 equivalenti.

In una forma di realizzazione preferita, per sintetizzare l?anomero ?, l?acilazione al passaggio 3) ? effettuata a -20 ?C con 0,1 equivalenti di DMAP.

Al contrario, quando si desidera l?anomero ?, l?acilazione al passaggio 3) ? effettuata ad una temperatura compresa fra 20 ?C e 50 ?C con una quantit? di DMAP compreso fra 2 e 2,5 equivalenti.

In una forma di realizzazione preferita, per sintetizzare l?anomero ?, l?acilazione al passaggio 3) ? effettuata ad una temperatura di 30 ?C e con 2,02 equivalenti di DMAP. I metodi quivi definiti permettono la sintesi di ciascuna delle forme di realizzazione dei composti di formula 1 (come i composti 2-12) come presentati nella presente specificazione. L?esperto sapr? quali sostituenti usare sulla base del sapere comune in chimica organica.

Vantaggiosamente, l?invenzione fornisce anche un metodo per la sintesi di un composto di formula X

in cui R1 ? una catena alchilica satura C5-C15 opzionalmente sostituita,

in cui R2 ? una catena alchilica satura C5-C15 opzionalmente sostituita,

in cui R3 ? una catena alchilica satura C5-C15 opzionalmente sostituita,

5) Fosforilazione dell'idrossile in posizione C1 per reazione con dibenzil N, N-diisopropilfosfaramidite in presenza di triflato imidazolio, seguita da ossidazione del fosfito a fosfato tramite acido metacloroperbenzoico

La presente invenzione ? anche relativa all?uso di un composto intermedio di formula 1i, come definita in ciascuna delle forme di realizzazione quivi presentate, per la sintesi di composti di formula 1

(Formula 1)

In cui R1 ? una catena alchilica satura C5-C15 opzionalmente sostituita,

in cui R2 ? una catena alchilica satura C5-C15 opzionalmente sostituita,

in cui R3 ? una catena alchilica satura C5-C15 opzionalmente sostituita,

La presente invenzione ? anche relativa all?uso di un composto intermedio di formula 1i, come definita in ciascuna delle forme di realizzazione quivi presentate, per la sintesi di composti di formula X

in cui R1 ? una catena alchilica satura C5-C15 opzionalmente sostituita,

in cui R2 ? una catena alchilica satura C5-C15 opzionalmente sostituita,

in cui R3 ? una catena alchilica satura C5-C15 opzionalmente sostituita,

in cui R4 ? OH e in cui ciascuno di R1, R2 e R3 ? privo di sostituenti -OH in posizione C2

Oggetto dell?invenzione ? anche un processo per la preparazione di composizioni farmaceutiche o composizioni vaccinali comprendenti i passaggi del processo precedente ed almeno un passaggio in cui il prodotto ottenuto al passaggio 6) in qualit? farmaceuticamente accettabile ? miscelato con almeno un veicolante e/o eccipiente farmaceuticamente accettabile.

In ogni parte della presente descrizione e rivendicazioni, il termine comprendente pu? essere sostituito dal termine ?consistente in?

In accordo con l?Art.170bis della legge italiana sui breveti, si dichiara quivi che: tutti gli esperimenti coinvolgenti cellule sono stati effettuati su cellule commercialmente disponibili

In riferimento ai modelli murini usati negli esperimenti descritti, sono stati rispettati gli obblighi derivanti dalle regolazioni nazionali ed europee, ed in particolare dalle disposizioni riferide al paragrafo 6 del decreto-legge n.206 del 12 aprile 2001 e n.224 dell?8 luglio 2003.

ESEMPI

Chimica

Tutti I reagenti e solventi sono stati acquistati da fonti commerciali ed usati senza ulteriori purificazioni, quando non indicato diversamente. Le reazioni sono state monitorate tramite cromatografia su strato sottile (thin-layer chromatography, TLC) effettuata su lastre Silica Gel 60 F254 (Merck?). Le purificazioni in colonna cromatografia flash sono state effettuate su gel di silice 6060-75 ?m da fonte commerciale

Gli spettri NMR 1H e 13C sono stati registrati tramite Bruker Advance 400 con software TopSpin?, o con NMR Varian 400 con software Vnmrj.

Gli spostameti chimici sono espressi in ppm rispetto al Me4Si; le costanti di accoppiamento sono espresse in Hz. La molteplicit? negli spettri 13C ? stata dedotta tramite esperimenti APT.

Sintesi di 13

Glucosammina cloridrato 12 (10 g, 46,5 mmol, 1 eq.) e NaHCO3 (10,54 g, 126 mmol, 2,7 eq.) si sciolgono in acqua (120 ml). poi, una soluzione preparata precedentemente di lauroil cloruro (11,20 g, 51,2 mmol, 1,1 eq.) in THF (120 ml) viene gocciolata nella soluzione a 0 ?C. la reazione ? mantenuta in agitazione per 5h, poi si filtra la soluzione. Si ottiene un solido bianco, che si lava con acqua a 4 ?C e THF. L?acqua in eccesso si coevapora con toluene a pressione ridotta, cos? da ottenere il prodotto desiderato 13 in forma di polvere bianca con una resa del 60% (10,10 g). il composto si usa senza ulteriore purificatione.

1H NMR (400 MHz, DMSO) ? 7.68 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.52 (d, J = 7.7 Hz, 3H), 6.46 (d, J = 6.3 Hz, 1H), 6.37 (d, J = 4.0 Hz, 3H), 4.97 ? 4.86 (m, 7H), 4.81 (d, J = 4.7 Hz, 1H), 4.62 (d, J = 5.0 Hz, 3H), 4.53 (t, J = 5.7 Hz, 1H), 4.43 (dd, J = 9.5, 4.3 Hz, 4H), 3.73 ? 3.42 (m, 18H), 3.34 ? 3.22 (m, 2H), 3.16 ? 3.09 (m, 3H), 3.04 (d, J = 14.1 Hz, 2H), 2.13 ? 2.03 (m, 8H), 1.56 ? 1.37 (m, 9H), 1.26 (d, J = 14.5 Hz, 67H), 0.86 (t, J = 6.8 Hz, 13H).

13C NMR (101 MHz, DMSO) ? 173.31, 172.82, 96.11, 91.05, 77.21, 74.74, 72.49, 71.59, 71.32, 70.83, 61.58, 57.57, 54.73, 40.59, 40.38, 40.17, 39.96, 39.75, 39.54, 39.33, 36.18, 35.74, 31.77, 29.53, 29.49, 29.43, 29.37, 29.23, 29.18, 29.14, 25.78, 22.56, 14.42.

Sintesi di 14

Ad una soluzione di 13 (3g, 8,3 mmol, 1 eq.) ed imidazolo (850 mg, 12,4 mmol, 1,5 eq.) in dimetilsolfossido (166 ml, 0,05 M) sotto atmosfera inerte ed in bagno di ghiaccio si gocciola una soluzione di TBDMSCl (1,4 g, 9,1 mmol, 1,1 eq.) in DCM (15 ml).

Successivamente, si permette alla soluzione di tornare a temperatura ambiente e si lascia in agitazione durante la notte. La reazione, monitorata tramite TLc (DCM/MeOH 9:1), ? stata poi fermata e la soluzione concentrata a pressione ridotta. Poi, si diluisce in AcOEt e si lava tre volte con NH4Cl. La fase organica cos? ottenuta viene anidrificata con Na2SO4 e si rimuove il solvente tramite rotavapor. Il prodotto grezzo cos? ottenuto (3,65 g) ? stato risospeso in EtPet a 0 ?C per 30 min. Poi, si filtra la sospensione sotto vuoto e si recupera il prodotto desiderato sotto forma di solido bianco. Dopo la purificazione, si ottengono 3,5 g di prodotto 14 sotto forma di solido biancastro, con una resa dell?85%

1H NMR (400 MHz, DMSO) ? 7.62 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 6.43 (d, J = 6.4 Hz, 1H), 4.90 (t, J = 6.5 Hz, 1H), 4.77 (t, J = 9.1 Hz, 1H), 4.42 (t, J = 7.0 Hz, 1H), 3.86 (d, J = 10.8 Hz, 1H), 3.66 (dd, J = 11.0, 4.6 Hz, 1H), 3.30 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 3.14 ? 2.98 (m, 1H), 2.06 (t, J = 7.4 Hz, 1H), 1.48 (s, 1H), 1.24 (s, 3H), 0.94 ? 0.74 (m, 2H), 0.05 (d, J = 3.0 Hz, 1H).

13C NMR (101 MHz, DMSO) ? 173.21, 95.93, 77.09, 74.83, 70.82, 63.61, 57.54, 40.61, 40.40, 40.20, 39.99, 39.78, 39.57, 39.36, 36.20, 31.78, 29.54, 29.51, 29.45, 29.39, 29.20, 29.14, 26.41, 25.76, 22.57, 18.64, 14.41, -4.66, -4.67.

Sintesi di 15

Il composto 14 (2,0 g, 4,2 mmol, 1 eq.) e 4-dimetilammino piridina (26 mg, 0,2 mmol, 0,05 eq.) si dissolvono in THf anidro (84 ml, 0,05 M) sotto atmosfera di Ar. SI gocciolano trietilammina (2,4 ml, 17,2 mmol, 4,1 eq.) e lauroil cloruro (2,10 ml, 8,5 mmol, 2,0 eq.) a -20 ?C. Si lascia la reazione in agitazione per due ore a -20 ?C, poi si controlla tramite TLC (EtPet/AcOEt 6:4). Successivamente, la soluzione viene diluita in AcOEt e lavata con HCl 1M. La fase organica cos? ottenuta viene anidrificata con Na2SO4 e si rimuove il solvente tramite rotavapor. Si purifica il prodotto grezzo cos? ottenuto (4 g) usando la cromatografia in colonna flash (Tol/AcOEt 9:1). dopo la purificazione, si ottengono 2,1 g di composto 15, con una resa del 50%.

1H NMR (400 MHz, DMSO) ? 7.80 (d, J = 9.5 Hz, 1H), 5.56 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 5.38 (d, J = 5.9 Hz, 1H), 4.92 (dd, J = 10.6, 8.6 Hz, 1H), 3.83 (dd, J = 10.4, 5.8 Hz, 2H), 3.76 ? 3.70 (m, 1H), 3.38 (dd, J = 14.3, 8.5 Hz, 2H), 2.30 ? 2.14 (m, 7H), 1.94 (t, J = 7.3 Hz, 2H), 1.44 (dd, J = 25.9, 6.4 Hz, 10H), 1.24 (d, J = 2.4 Hz, 75H), 0.90 ? 0.81 (m, 24H), 0.07 ? -0.01 (m, 6H).

13C NMR (101 MHz, DMSO) ? 174.93, 172.72, 172.34, 171.74, 92.49, 77.48, 75.66, 67.73, 62.54, 52.26, 40.65, 40.44, 40.23, 40.02, 39.82, 39.61, 39.40, 36.08, 34.13, 33.94, 31.78, 31.74, 29.59, 29.52, 29.50, 29.44, 29.39, 29.35, 29.30, 29.19, 29.00, 28.93, 28.75, 26.26, 25.70, 24.95, 24.77, 22.55, 18.54, 14.39, 14.36, -4.71, -4.78.

Sintesi di 16

Il composto 15 (2,12 g, 2,4 mmol, 1 eq.) e imidazolio triflato (1,4 g, 5,4 mmol, 2,25 eq.) vengono sciolti in DCM (121 ml, 0,02 M) sotto atmosfera ineste. Dibenzil N,N-diisopropilfosfaramidito (1,83, 5,3, 2,2 eq.) viene aggiunto alla soluzione a 0 ?C. La reazione si monitora tramite TLC (EtPet/acetone 9:1); dopo 30 min, si nota la scomparsa del substrato. Si porta quindi la soluzione a -20 ?C e si gocciola una soluzione di acido metaclororoperbenzoico (1,66 g, 9,7 mmol, 4 eq.) in 17 ml di DCM. Dopo 30 min, si lascia tornare la reazione ad RT e si lascia in agitazione durante la notte.

Dopo analisi TLC, si spegne la reazione con 15 ml di soluzione satura di NaHCO3 e si concentra la soluzione al rotavapor. La miscela viene quindi diluita con AcOEt e lavata 3 volte con NaHCO3 satura e 3 volte con una soluzione 1M di HCl. La fase organica viene recuperata, anidrificata con Na2SO4 ed il solvente rimosso tramite rotavapor. Il grezzo cos? ottenuto si purifica tramite cromatografia in colonna flash (EtPet/acetone 9:1). Si ottengono 2,41 g di composto 16 puro sotto forma di olio giallo con una resa del 91%

1H NMR (400 MHz, CDCl3) ? 7.34 ? 7.25 (m, 10H), 5.61 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 5.44 (d, J = 9.6 Hz, 1H), 5.16 (dd, J = 10.8, 9.1 Hz, 1H), 5.00 (dd, J = 8.1, 2.8 Hz, 2H), 4.96 ? 4.91 (m, 2H), 4.53 (q, J = 9.2 Hz, 1H), 4.23 (dt, J = 10.8, 9.5 Hz, 1H), 3.91 (dd, J = 11.9, 1.8 Hz, 1H), 3.78 (dd, J = 11.9, 4.6 Hz, 1H), 3.56 (ddd, J = 9.6, 4.4, 1.7 Hz, 1H), 2.31 (td, J = 7.5, 3.5 Hz, 2H), 2.19 (t, J = 7.7 Hz, 2H), 2.07 ? 2.01 (m, 2H), 1.61 ? 1.37 (m, 6H), 1.33 ? 1.10 (m, 50H), 0.92 ? 0.83 (m, 19H), 0.03 ? -0.03 (m, 6H).

13C NMR (101 MHz, CDCl3) ? 174.43, 172.75, 172.40, 135.52, 128.60, 128.56, 127.88, 127.83, 92.59, 77.31, 77.00, 76.68, 76.23, 76.16, 72.94, 72.89, 69.56, 69.51, 69.46, 61.63, 52.79, 36.76, 34.08, 33.94, 31.89, 29.65, 29.60, 29.49, 29.47, 29.43, 29.37, 29.33, 29.25, 29.11, 29.01, 25.82, 25.58, 24.63, 24.58, 22.66, 18.32, 14.07, -5.19, -5.32.

Sintesi di 17

Il compost 16 (2,41 g, 2,4 mmol, 1 eq.) si scioglie in acetone (48 ml, 0,05 M) e si aggiunge ad RT una soluzione 5% v/v di H2SO4 in H2O (480 ?l, 1% v/v). La soluzione viene lasciata in agitazione per 8 h e monitorata tramite TLC (EtPet/acetone 8:2). Dopo il completamento della reazione, si diluisce la soluzione in AcOEt e si lava 3 volte con una soluzione satura di NaHCO3. La fase organica cos? ottenuta viene anidrificata con Na2SO4 e si rimuove il solvente tramite rotavapor. Il prodotto grezzo cos? ottenuto viene purificato tramite cromatografia in colonna flash ( EtPet/acetone 85:15). Dopo la purificazione, si ottengono 2,1 g di composto 17 sotto forma di solido bianco con una resa del 90%.

1H NMR (400 MHz, CDCl3) ? 7.40 ? 7.27 (m, 1H), 5.63 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 5.45 (d, J = 9.6 Hz, 1H), 5.18 (dd, J = 10.7, 9.3 Hz, 1H), 5.08 ? 4.91 (m, 1H), 4.54 (q, J = 9.5 Hz, 1H), 4.26 (dd, J = 19.9, 9.3 Hz, 1H), 3.87 ? 3.74 (m, 1H), 3.47 (d, J = 9.7 Hz, 1H), 2.40 ? 2.24 (m, 1H), 2.10 ? 1.91 (m, 1H), 1.61 ? 1.46 (m, 1H), 1.46 ? 1.33 (m, 1H), 1.33 ? 1.01 (m, 5H), 0.92 ? 0.83 (m, 1H).

13C NMR (101 MHz, CDCl3) ? 174.11, 172.77, 172.49, 128.94, 128.84, 128.72, 128.66, 128.26, 127.95, 92.61, 77.33, 77.01, 76.69, 75.90, 75.87, 72.46, 72.42, 72.15, 72.10, 70.23, 70.17, 70.10, 60.23, 52.78, 36.71, 34.03, 33.71, 31.90, 29.67, 29.62, 29.49, 29.44, 29.38, 29.34, 29.32, 29.26, 29.23, 29.04, 29.01, 25.56, 24.59, 24.48, 22.66, 14.09.

Sintesi di 1

Il composto 17 (50 mg, 0,05 mmol, 1 eq.) viene sciolto in una miscela di DCM (2,5 ml) e MeOH (2,5 ml) e posto sotto atmosfera di Ar. Si aggiunge quindi il catalizzatore di Pd/C (10 mg, 20% m/m). Si rimuove quindi il gas dall?ambiente di reazione, che viene successivamente posto sotto atmosfera di H2. Si lascia in agitazione la soluzione per 2 h, poi si rimuove H2 e si monitora la reazione tramite TLC (EtPet/acetone 8:2).

Si aggiunge quindi trietilammina (100 ?l) alla reazione, che viene lasciata in agitazione per 15 min. La soluzione viene successivamente filtrata su filtri per siringa PALL 4549T Acrodisc 25 mm with GF/0.45 ?m Nylon per rimuovere il catalizzatore di Pd/C ed i solventi vengono evaporati tramite rotavapor. Il prodotto grezzo viene risospeso in una soluzione di DCM/MeOH e si aggiunge IRA 120 H<+>. Dopo 30 min di agitazione, si filtra IRA 120 H<+>, rimuovono i solventi tramite rotavapor, si risospende il grezzo in DCM/MeOH) e si aggiunge IRA 120 Na<+>. Dopo 30 min in agitazione, si filtra IRA 120 Na<+ >e si rimuovono I solventi tramite rotavapor.

Si ottengono 45 mg di 1 sotto forma di polvere bianca con una resa quantitativa.

1H NMR (400 MHz, cd3od) ? 5.75 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 5.28 (t, J = 9.8 Hz, 1H), 4.28 (q, J = 9.7 Hz, 1H), 4.06 (t, J = 9.6 Hz, 1H), 3.89 ? 3.74 (m, 2H), 3.62 (t, J = 9.2 Hz, 1H), 2.42 ? 2.25 (m, 5H), 2.09 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 1.56 (d, J = 6.4 Hz, 7H), 1.29 (s, 53H), 0.90 (t, J = 6.6 Hz, 9H).

13C NMR (101 MHz, MeOD) ? 174.69, 173.32, 172.00, 92.16, 76.22, 76.17, 72.81, 72.78, 72.20, 72.14, 60.30, 52.82, 48.23, 48.02, 47.81, 47.59, 47.38, 47.17, 46.96, 36.05, 33.64, 33.55, 31.67, 31.66, 29.45, 29.39, 29.38, 29.35, 29.26, 29.20, 29.19, 29.14, 29.07, 29.05, 29.02, 28.92, 28.74, 25.58, 24.38, 22.31, 13.00.

Sintesi di 18

Il composto 17 (2,36 g, 2,4 mmol, 1 eq.) e imidazolio triflato (1,4 g, 5,4 mmol, 2,25 eq.) vengono sciolti in DCM (121 ml, 0,02 M) sotto atmosfera ineste. Dibenzil N,N-diisopropilfosfaramidito (1,83, 5,3, 2,2 eq.) viene aggiunto alla soluzione a 0 ?C. La reazione si monitora tramite TLC (EtPet/acetone 9:1); dopo 30 min, si nota la scomparsa del substrato. Si porta quindi la soluzione a -20 ?C e si gocciola una soluzione di acido metaclororoperbenzoico (1,66 g, 9,7 mmol, 4 eq.) in 17 ml di DCM. Dopo 30 min, si lascia tornare la reazione ad RT e si lascia in agitazione durante la notte.

Dopo analisi TLC, si spegne la reazione con 15 ml di soluzione satura di NaHCO3 e si concentra la soluzione al rotavapor. La miscela viene quindi diluita con AcOEt e lavata 3 volte con NaHCO3 satura e 3 volte con una soluzione 1M di HCl. La fase organica viene recuperata, anidrificata con Na2SO4 ed il solvente rimosso tramite rotavapor. Il grezzo cos? ottenuto si purifica tramite cromatografia in colonna flash (EtPet/acetone 9:1). Si ottengono 2,41 g di composto 18 puro sotto forma di olio giallo con una resa del 91%

1H NMR (400 MHz, CDCl3) ? 7.33 ? 7.18 (m, 21H), 5.66 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 5.51 (d, J = 9.5 Hz, 1H), 5.18 (dd, J = 10.6, 9.2 Hz, 1H), 5.02 (dd, J = 10.8, 3.3 Hz, 4H), 5.00 ? 4.95 (m, 2H), 4.94 ? 4.88 (m, 2H), 4.49 ? 4.43 (m, 1H), 4.42 ? 4.36 (m, 1H), 4.25 (dd, J = 19.8, 9.3 Hz, 1H), 4.16 (ddd, J = 11.8, 7.1, 5.0 Hz, 1H), 3.74 (dd, J = 9.5, 4.2 Hz, 1H), 2.19 (dt, J = 15.9, 7.0 Hz, 5H), 2.07 ? 2.01 (m, 2H), 1.49 (dt, J = 14.0, 7.1 Hz, 4H), 1.45 ? 1.36 (m, 2H), 1.34 ? 1.11 (m, 54H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 10H).

13C NMR (101 MHz, CDCl3) ? 174.22, 172.82, 172.18, 135.79, 135.72, 135.33, 128.62, 128.58, 128.52, 128.05, 128.00, 127.96, 92.44, 74.11, 72.59, 72.39, 69.38, 65.25, 52.68.

Synthesis of 6

Il composto 18 (57 mg, 0,05 mmol, 1 eq.) viene sciolto in una miscela di DCM (2,5 ml) e MeOH (2,5 ml) e posto sotto atmosfera di Ar. Si aggiunge quindi il catalizzatore di Pd/C (10 mg, 20% m/m). Si rimuove quindi il gas dall?ambiente di reazione, che viene successivamente posto sotto atmosfera di H2. Si lascia in agitazione la soluzione per 2 h, poi si rimuove H2 e si monitora la reazione tramite TLC (EtPet/acetone 8:2).

Si ottengono 45 mg di 19 sotto forma di polvere bianca con una resa quantitativa.

1H NMR (400 MHz, cd3od) ? 5.77 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 5.32 ? 5.23 (m, 1H), 4.39 (dd, J = 18.9, 9.5 Hz, 1H), 4.21 (d, J = 9.7 Hz, 3H), 4.10 ? 4.00 (m, 1H), 3.80 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 2.44 ? 2.24 (m, 6H), 2.09 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 1.55 (dd, J = 13.5, 6.9 Hz, 10H), 1.39 ? 1.24 (m, 79H), 0.96 ? 0.82 (m, 33H).

13C NMR (101 MHz, MeOD) ? 174.87, 173.81, 91.22, 72.86, 72.80, 71.25, 68.94, 68.86, 68.80, 64.65, 64.61, 52.10, 48.24, 48.03, 47.82, 47.61, 47.39, 47.18, 46.97, 36.10, 35.63, 33.76, 33.64, 33.55, 33.40, 31.69, 31.63, 29.26, 29.22, 29.18, 29.15, 29.11, 29.06, 29.03, 28.98, 28.84, 28.78, 25.68, 25.62, 24.69, 24.63, 24.38, 22.35, 22.32, 13.06, 13.03, 7.82.

Synthesis of 19

Il composto 17 (100 mg, 0,1 mmol, 1 eq.) ed ossido di argento (I) (140 mg, 0,6 mmol, 6 eq) vengono dissolti in toluene (1 ml, 0,1 M) sotto atmosfera inerte. Si aggiunge allil bromuro (51 ?l, 0,6 mmol, 6 eq.) alla soluzione ad RT. Si lascia la reazione in agitazione durante la notte. Dopo analisi TLC (EtPet/acetone 8:2), si ferma la reazione e si filtra la soluzione su celite. Si recupera la fase organica liquida e si rimuove il solvente tramite rotavapor.

Il grezzo cos? ottenuto viene purificato tramite cromatografia in colonna flash (EtPet/acetone 8:2). Si ottengono 50 mg di composto 18 sotto forma di olio giallo con una resa del 50%.

1H NMR (400 MHz, CDCl3) ? 7.38 ? 7.22 (m, 10H), 5.91 ? 5.77 (m, 1H), 5.64 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 5.25 ? 5.07 (m, 3H), 5.04 ? 4.91 (m, 4H), 4.56 (q, J = 9.3 Hz, 1H), 4.26 (dd, J = 19.8, 9.3 Hz, 1H), 3.99 ? 3.90 (m, 2H), 3.73 (dd, J = 11.0, 1.5 Hz, 1H), 3.69 (dd, J = 9.6, 4.4 Hz, 1H), 3.60 (dd, J = 11.0, 4.4 Hz, 1H), 2.40 ? 2.24 (m, 2H), 2.18 (dd, J = 16.1, 8.4 Hz, 2H), 2.03 (dd, J = 15.1, 7.1 Hz, 2H), 1.62 ? 1.53 (m, 2H), 1.49 (dd, J = 14.2, 7.2 Hz, 2H), 1.41 (dt, J = 13.2, 6.8 Hz, 2H), 1.34 ? 1.10 (m, 51H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 9H).

13C NMR (101 MHz, CDCl3) ? 174.33, 172.77, 172.41, 135.48, 134.43, 128.64, 128.59, 127.92, 117.20, 92.70, 77.32, 77.00, 76.68, 75.29, 75.23, 73.21, 73.15, 72.83, 72.47, 69.67, 69.63, 67.81, 52.83, 36.74, 34.05, 33.93, 31.89, 29.65, 29.62, 29.60, 29.49, 29.44, 29.36, 29.33, 29.31, 29.27, 29.23, 29.10, 29.00, 25.55, 24.57, 24.50, 22.65, 14.07.

Sintesi di 21

Il composto 17 (100 mg, 0,1 mmol, 1 eq.) ed il composto 20 (48 mg, 0,11 mmol, 1,1 eq.) vengono sciolti in DCM (1 ml, 0,1 M) sotto atmosfera inerte. Si aggiungono alla soluzione a 0 ?C 1-etil-3-(3-dimetilamminopropil) carbodiimmide (EDC) (192, mg, 0,12 mmol, 1,2 eq) e N,N-dimetilamminopiridina (DMAP). La reazione viene riportata ad RT e lasciata in agitazione durante la notte.

Dopo il completamento della reazione, la soluzione viene diluita in AcOEt e lavata 3 volte con una soluzione satura di NaHCO3. La fase organica cos? ottenuta viene anidrificata con Na2SO4 e si rimuove il solvente tramite rotavapor.

Il grezzo cos? ottenuto viene purificato tramite cromatografia in colonna flash (EtPet/acetone 85:15).Si ottengono quindi 100 mg di composto 21 puro con una resa del 65%.

Synthesis of 23

Il composto 17 (100 mg, 0,1 mmol, 1 eq.), il composto 22 (57 mg, 0,13 mmol, 1,25 eq.) e 50 mg di setacci molecolari in polvere da 3 a vengono sciolti in toluene (1 ml, 0,1 M) sotto atmosfera inerte e lasciati in agitazione per 1 h. A questo punto, alla soluzione si aggiunge ossido di argento (I) (46 mg, 0,2 mmol, 2 eq.) ad RT, poi la si porta a 0 ?C e si aggiunge acido triflico (4,4 ?l, 0,05 mmol, 0,5 eq.) La reazione si lascia in agitazione durante la notte a temperatura ambiente. Dopo l?analisi TLC (EtPet/acetone 8:2), si ferma la reazione e si filtra la soluzione su celite.si recupera la fase organica liquida, la si diluisce in AcOEt e si lava 3 volte con NaHCO3 satura. La fase organica cos? ottenuta viene anidrificata con Na2SO4 e si rimuove il solvente tramite rotavapor.

Il grezzo cos? ottenuto si purifica tramite cromatografia in colonna flash (toluene/acetone 85:15). Si ottengono 50 mg di una miscela di diastereoisomeri del composto 21 sotto forma di olio giallo con una resa del 40%

1H NMR (400 MHz, CDCl3) ? 7.40 ? 7.20 (m, 38H), 5.65 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 5.61 (s, 1H), 5.40 (s, 1H), 5.24 ? 5.18 (m, 1H), 5.14 (s, 1H), 4.91 (d, J = 11.6 Hz, 9H), 4.69 (s, 2H), 4.62 (d, J = 2.2 Hz, 4H), 4.57 ? 4.37 (m, 2H), 4.23 (s, 1H), 2.40 ? 2.26 (m, 3H), 2.13 (ddd, J = 13.7, 7.6, 4.4 Hz, 3H), 2.05 (s, 3H), 1.57 (s, 6H), 1.47 ? 1.36 (m, 3H), 1.29 (s, 79H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 14H).

13C NMR (101 MHz, CDCl3) ? 174.23, 172.81, 172.43, 138.66, 138.63, 135.24, 128.75, 128.69, 128.67, 128.62, 128.50, 128.40, 128.31, 128.27, 128.20, 128.06, 127.92, 127.88, 127.71, 127.64, 127.56, 127.41, 127.39, 98.55, 92.54, 80.36, 79.72, 77.32, 77.00, 76.68, 75.36, 74.99, 72.76, 72.51, 71.93, 69.72, 69.66, 69.63, 69.58, 68.09, 64.99, 52.74, 36.77, 34.03, 33.89, 31.89, 30.90, 29.66, 29.60, 29.49, 29.46, 29.36, 29.34, 29.22, 29.09, 29.02, 25.59, 24.58, 24.46, 22.66, 17.97, 14.09.

Synthesis of 24

Il composto 18 (70 mg, 0,05 mmol, 1 eq.) viene sciolto in una miscela di DCM (2,5 ml) e MeOH (2,5 ml) e posto sotto atmosfera di Ar. Si aggiunge quindi il catalizzatore di Pd/C (10 mg, 20% m/m). Si rimuove quindi il gas dall?ambiente di reazione, che viene successivamente posto sotto atmosfera di H2. Si lascia in agitazione la soluzione per 2 h, poi si rimuove H2 e si monitora la reazione tramite TLC (EtPet/acetone 8:2).

Si ottengono 50 mg di 19 sotto forma di polvere bianca con una resa quantitativa.

1H NMR (400 MHz, MeOD) ? 5.76 (dd, J = 8.8, 4.7 Hz, 1H), 5.29 (dd, J = 10.5, 9.1 Hz, 1H), 4.76 (d, J = 1.2 Hz, 1H), 4.36 (dd, J = 18.8, 9.4 Hz, 1H), 4.08 (ddt, J = 19.6, 14.2, 5.9 Hz, 4H), 3.91 (dd, J = 3.4, 1.6 Hz, 2H), 3.83 ? 3.75 (m, 2H), 3.75 ? 3.62 (m, 5H), 3.44 ? 3.34 (m, 3H), 2.48 ? 2.27 (m, 7H), 2.14 ? 2.08 (m, 2H), 1.60 (s, 11H), 1.40 ? 1.21 (m, 96H), 0.92 (t, J = 6.8 Hz, 17H).

13C NMR (101 MHz, MeOD) ? 174.68, 173.39, 171.99, 101.03, 92.10, 75.14, 72.96, 72.66, 72.32, 70.90, 70.57, 68.47, 65.71, 52.71, 48.23, 48.02, 47.81, 47.59, 47.38, 47.17, 46.96, 36.06, 33.66, 33.57, 31.69, 29.39, 29.30, 29.09, 28.95, 28.76, 28.44, 25.59, 24.42, 22.33, 16.62, 13.03.

Biologia

La capacit? dei composti FP20, FP21, FP22, FP23 e FP24 di attivare selettivamente il TLR4 ? stata inizialmente investigata su specifiche linee cellulari HEK reporter. HEK-BlueTM hTLR4 e HEK-BlueTM hTLR2 (InvivoGen) sono linee cellulari progettate per studiare l?attivazione dei recettori umani TLR4 e TLR2, rispettivamente, monitorando l?attivazione dei fattori trascrizionali NF-?B e AP-1. La stimolazione con ligandi del TLR4 (nel caso delle HEK-Blue hTLR4) o con ligandi del TLR2 (nel caso delle HEK-Blue hTLR2) attiva NF-?B e AP-1, inducendo la produzione ed il rilascio del gene reporter SEAP (fosfatasi alcalina embrionale secreta) nell?ambiente extracellulare. L?analisi del gene reporter ? stata eseguita mediante il saggio colorimetrico QUANTI-Blue? (InvivoGen), substrato della SEAP, che genera un prodotto cromogenico la cui assorbanza viene letta a 630 nm. L?attivit? agonista delle molecole ? stata saggiata trattando le cellule HEK-Blue hTLR4 per 18 ore con concentrazioni crescenti dei composti (0.1-1-10-25?M) e utilizzando MPLA (0.1-1-10 ?M) e S-LPS (100 ng/mL) come riferimento e controllo positivo di attivazione del recettore, rispettivamente. I risultati ottenuti mostrano che le molecole FP20, FP21, FP22, FP23 e FP24 sono in grado di indurre l?attivazione del TLR4 in modo dose-dipendente (Figura 1a). Le molecole sono state successivamente testate sulla linea cellulare HEK-Blue hTLR2 con l?obiettivo di escludere l?attivazione di questo recettore. A tale proposito, le cellule HEK-Blue hTLR2 sono state trattate con gli stessi composti e alle stesse concentrazione dei test condotti precedentemente e il composto PAM2CSK4 ? stato utilizzato come controllo positivo di attivazione del TLR2. Come d?atteso la stimolazione con PAM2CSK4 ha indotto una forte attivazione del TLR2, mentre il trattamento con i composti FP20, FP21, FP22, FP23 e FP24 non ha prodotto alcuna attivazione (Figura 1b).

A seguito dei risultati ottenuti dai test di screening sulle cellule HEK, l?attivit? biologica dei composti FP20, FP21, FP22, FP23 e FP24 ? stata investigata in linee cellulari di macrofagi umani e murini. Sono state utilizzate le linee cellulari THP-1-X BlueTM, monociti differenziati in macrofagi in seguito al trattamento con PMA 100 ng/mL, e RAW-BlueTM. Analogamente alle cellule HEK-Blue, le THP-1 X-Blue e le RAW-Bue esprimono stabilmente il gene reporter SEAP, sotto il controllo dei fattori trascrizionali NF-?B e AP-1. Le cellule sono state trattate come descritto precedentemente. I risultati mostrano che tutti i composti inducono l?attivazione di NF-?B, sia su macrofagi umani Figura (2a) che murini Figura (2b); il composto FP23 risulta l?unico statisticamente non significativo sulla linea di macrofagi umani. Inoltre, sulla linea RAW-blue i composti risultano attivi alla pi? bassa concentrazione testata (0,1 ?M), mentre sulle THP-1-X-Blue i composti attivano in modo significativo a partire da una concentrazione 100 volte superiore (10 ?M). Per valutare la citotossicit? dei composti FP20, FP21, FP22, FP23 e FP24, le cellule THP-1-X-Blue differenziate in macrofagi e RAW-Blue sono state trattate con concentrazioni crescenti dei composti in esame (0,1, 1, 10, 25, 50 ?M). La tossicit? dei composti ? stata valutata mediante saggio di vitalit? MTT (bromuro di 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio). I risultati ottenuti mostrano che i composti risultano non tossici sulla linea cellulare THP-1-X-Blue, tuttavia alla pi? alta concentrazione testata (50 ?M) si ha una diminuzione della vitalit? cellulare in seguito al trattamento con FP20 e FP23 (Figura 3). I risultati sulla linea di macrofagi murini mostrano un aumento della tossicit? dei composti alla concentrazione di 50 ?M, mentre il composto FP23 ? l?unico a mostrare tossicit? alla concentrazione di 25 ?M (Figura 4).

L'attivit? di FP200 ? stata quindi verificata sulla linea cellulare di monociti umani THP-1-X-Blue, precedentemente descritta. Le cellule sono state trattate coi composti FP11, FP112, FP20, FP200 ed FP21 in concentrazioni crescenti (0.1, 1, 10, 20 ?M) ed usando MPLA (0.1-1-10 ?M) e S-LPS (100 ng/ml) come riferimento e controllo positivo dell?attivazione del recettore, rispettivamente. Il risultato mostra che tutti I composti inducono l?attivazione di NF-?B in maniera dose dipendente.

I dati In vitro and vivo che riguardano I composti presentati WO2019/092572 sono riportati di seguito.

Attivazione del TLR4 da parte di agonisti sintetici.

La capacit? di attivare il TLR4 umano da parte dei composti FP ? stata verificata usando cellule HEK-Blue hTLR4. Esse sono una linea cellulare derivata dalle HEK293 stabilmente transfettata coi recettori dell?LPS CD14, TLR4 e MD-2 e un gene reporter, la fosfatasi alcalina embrionale secreta (secreted embryonic alkaline phosphatase, SEAP), messa sotto il controllo di fattori di trascrizione dipendenti dal TLR4 (NF-?B e AP-1). Le cellule HEK-Blue hTLR4 sono state trattate con concentrazioni crescenti (0.1-25 ?M) di Fp11, FP112 ed FP111 per 18 ore. La stimolazione tramite il chemotipo smoorh dell?LPS (S-LPS) ? stata usata come controllo positivo per l?attivazione del meccanismo mediato dal TLR4.

Le molecole FP11 ed FP112 inducono il rilascio della proteina reporte SEAP nel mezzo intercellulare in maniera dipendente dalla concentrazione, il che indica che entrambi i composti attivano NF-?B e AP-1, mentre FP111 ? inattivo (Fig. 5A). I tre composti non inibiscono la produzione della SEAP indotta da LPS, suggerendo che manchino di un?attiva antagonistica del TLR4 (Fig.5B). La mancanza di attivit? sulle cellule HEK-Blue Null, che portano lo stesso gene reporter della SEAP ma mancano dei recettori dell?LPS, conferma che sia FP11 sia FP112 agiscono attraverso il TLR4 (Fig.5C). Per confermare la selettivit? per il TLR4 rispetto al TLR2, le molecole sono anche state testate sulle cellule HEK-Blue esprimenti il Toll-Like receptor 2 umano (hTLR2), motrando nessuna attivit? agonistica di sorta (Fig.5D). Questi dati concordano coi risultati dei test di legame in vitro e suggeriscono che FP11 ed FP112 siano agonisti specifici del TLR4 che interagiscono direttamente col corecettore MD-2.

Attivit? come adiuvanti di FP11 ed FP112 e tossicit? in vivo: esperimenti di immunizazione con OVA

L'abilit? di indurre risposte immunitarie in vivo di FP11 ed FP112 ? stata paragonata a quella di MPLA valutando la produzione di anticorpi in topi C57BI/6 immunizzati con ovalbumina (OVA) di pollo come antigene modello. Per prima cosa, ? stata valutata la tossicit? degli FP in un esperimento pilota in cui i topi sono stati iniettati per via sottocutanea con 10 ?g di FP11 ed FP112. I risultati mostrano che i due adiuvanti provati non hanno alcun effetto collaterale visibile sui topi, come verificato dalla risposta locale al sito dell?iniezione e determinando il peso e lo stato di allerta dell?animale durante 7 giorni (Fig. 6A). In seguito, i topi sono stati immunizzati con i due adiuvanti provati miscelati con ovalbumina (OVA). L?induzione degli anticorpi ? stata valutata 21 giorni dopo l?immunizazione. I risultati mostrano che i topi immunizati cogli adiuvanti provati esibiscono livelli totali di IgG anti-OVA marginalmente superiori dopo la prima immunizzazione rispetto al gruppo di controllo immunizzato con OVA e livelli significativamente inferiori rispetto agli animali immunizzati con MPLA-OVA (Fig. 6B, Prime Immunization). Al contrario, dopo la seconda immunizzazione data il giorno 22 ed esaminata per il titolo di anticorpi OVA-specifici 14 giorni dopo, i livelli di IgG nel gruppo immunizzato con FP112 sono pi? alti di quelli nel gruppo immunizzato con FP11 (Fig. 6B), Booster Immunization). Questi dati indicano che, in accordo coi risultati in vitro e sulle cellule, FP112 ? un adiuvante migliore in vivo di FP11 ed ha una potenza paragonabile od addirittura maggiore di quella di MPLA.

Impurezza 1 della reazione 6 nella sintesi di FP11, riferimento Figura 7

<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) ? 6.04 (d, J = 9.7 Hz, 1H), 5.63 (dd, J = 9.7, 7.3 Hz, 1H), 3.87 (dt, J = 7.5, 3.9 Hz, 1H), 3.77 ? 3.70 (m, 3H), 3.68 (dd, J = 10.5, 4.3 Hz, 1H), 2.36 (dd, J = 14.7, 6.9 Hz, 2H), 2.32 ? 2.26 (m, 3H), 1.67 (dt, J = 15.3, 7.7 Hz, 2H), 1.59 (dt, J = 20.5, 7.1 Hz, 4H), 1.27 (d, J = 16.5 Hz, 62H), 0.91 ? 0.84 (m, 20H), 0.05 (d, J = 8.4 Hz, 7H).

Impurezza 2 della reazione 6 nella sintesi di FP11, riferimento Figura 8

(<1>H NMR ) e 9 (<13>C NMR)

<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) ? 6.01 (d, J = 9.1 Hz, 1H), 5.40 ? 5.30 (m, 1H), 5.21 (t, J = 6.7 Hz, 1H), 5.10 ? 4.99 (m, 2H), 4.22 (td, J = 10.7, 3.4 Hz, 1H), 4.04 (ddd, J = 10.2, 4.3, 2.0 Hz, 1H), 3.68 (d, J = 11.7 Hz, 1H), 3.61 ? 3.53 (m, 1H), 2.32 ? 2.19 (m, 5H), 2.18 ? 2.06 (m, 3H), 1.62 ? 1.46 (m, 8H), 1.34 ? 1.18 (m, 62H), 0.87 (t, J = 6.8 Hz, 11H).

<13>C NMR (101 MHz, CDCl3) ? 174.14, 173.65, 173.12, 91.40, 77.32, 77.01, 76.69, 70.37, 69.67, 68.54, 61.19, 52.49, 36.68, 34.19, 34.13, 31.90, 29.66, 29.63, 29.60, 29.54, 29.52, 29.46, 29.39, 29.34, 29.33, 29.29, 29.27, 29.19, 29.15, 25.60, 24.92, 23.82, 22.66, 14.08.

Claims

RIVENDICAZIONI 1. Un composto di formula 1

In cui R1 ? una catena alchilica satura C5-C15 opzionalmente sostituita, in cui R2 ? una catena alchilica satura C5-C15 opzionalmente sostituita, in cui R3 ? una catena alchilica satura C5-C15 opzionalmente sostituita, in cui R4 ? un qualsiasi sostituente conosciuto dalla persona esperta nel settore che pu? essere legato per mezzo di un legame tra C6 e un atomo adatto e/o qualsiasi sostituente che possiede un atomo di ossigeno o di azoto che pu? legarsi a C6.
2. Il composto secondo la rivendicazione 1, in cui la catena R4 ? un gruppo idrossile (OH), un gruppo fosfato (PO4<2->), un gruppo azide (N3), un gruppo amminico (NH2), un gruppo acile (O(C=O)R) o un gruppo alchilico (OR) o un gruppo glicosilico.
3. Il composto secondo le rivendicazioni 1 o 2, in cui R1, R2, R3, diversi tra loro.
4. Il composto secondo le rivendicazioni 1 o 2, in cui almeno due di R1, R2, e R3, sono identici.
5. Il composto secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 4, in cui almeno uno di R1, R2, e R3, ? sostituito.
6. Il composto secondo una delle rivendicazioni da 1 a 5, in cui almeno uno di R1, R2, e R3, ? privo di sostituenti -OH in posizione 2.
7. Il composto secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 4, in cui almeno uno di R1, R2 o R3, ? non sostituito.
8. Il composto secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 7, in cui R1 = R2 = R3 = C11H23 e R4 = OH, o R1 = R3 = C13H27 ; R2 = C11H23 e R4 = OH, o R1 = R2 = R3 = C9H19 e R4 = OH, o R1 = R2 = R3 = C13H27 e R4 = OH, o R1 = R3 = C9H19 ; R2 = C11H23 e R4 = OH, o R1 = R2 = R3 = C11H23 e R4 = PO4<2>,-o R1 = R2 = R3 = C9H19 e R4 = PO4<2>,-o R1 = R2 = R3 = C13H27 e R4 = PO4<2>, o R1 = R2 = R3 = C11H23 e R4 =OC3H7, o R1 = R2 = R3 = C11H23 e R4 = O(C=O)C6H8(OH)3, o R1 = R2 = R3 = C11H23 e R4 =NH2.
9. Il composto di una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 8 in cui detto composto ? un anomero ? del composto della formula 1.
10. Il composto di una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 8 in cui detto composto ? un anomero ? del composto della formula 1.
11. Il composto secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 10 per l'uso come principio attivo o come adiuvante nel trattamento di malattie che richiedono o beneficiano di una immunostimolazione attivando il recettore TLR4.
12. Il composto per l'uso secondo la rivendicazione 11 in cui dette malattie sono cancro, allergie, malattie infettive, malattie cardiovascolari, malattie metaboliche dipendenti dall'obesit?, degenerazione neuronale, apoptosi, disturbi autoimmuni, infezioni virali, infezioni batteriche, malattie autoimmuni.
13. Un adiuvante vaccinale costituito dal composto come definito in una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 10.
14. Una composizione vaccinale comprendente il composto come definito in una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 13, almeno un veicolante farmaceuticamente accettabile e almeno un antigene immunogenico farmaceuticamente accettabile.
15. La composizione vaccinale secondo la rivendicazione 14, in cui detto composto ? l'unico adiuvante presente in detta composizione.
16. Una composizione farmaceutica comprendente il composto come definito in una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 12 e almeno un eccipiente e/o un veicolante farmaceuticamente accettabile.
17. La composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 16, ulteriormente comprendente almeno un principio attivo addizionale.
18. La composizione farmaceutica secondo le rivendicazioni 16 o 17, in una forma per la somministrazione orale, parenterale, nasale, aerosol, sublinguale, rettale, vaginale, topica o sistemica.
19. La composizione farmaceutica secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 16 a 18 sotto forma di sospensione, emulsione, unguento, crema, spray, granulato, polvere, soluzione, capsula, pillola, compressa, prodotto liofilizzato, losanga, aerosol, nebulizzazione o iniezione.
20. La composizione farmaceutica secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 16 a 19, per l'uso come ingrediente attivo o come adiuvante, nel trattamento di malattie che richiedono o beneficiano di una immunostimolazione attivando il recettore TLR4.
21. La composizione farmaceutica per l'uso secondo la rivendicazione 20, in cui dette malattie sono cancro, allergie, malattie infettive, malattie cardiovascolari, malattie metaboliche dipendenti dall'obesit?, degenerazione neuronale, apoptosi, disturbi autoimmuni, infezioni virali, infezioni batteriche, malattie autoimmuni.
22. Un intermedio di formula 1i

in cui R1 ? una catena alchilica satura C5-C15 opzionalmente sostituita.
23. Un metodo per la preparazione di un intermedio di formula 1i

comprendente i seguenti passaggi 1) Acilazione selettiva del gruppo amminico in posizione C2 della glucosamina cloridrato per reazione con cloruro di acile in presenza di bicarbonato di sodio. 2) Protezione mediante sililazione selettiva dell'idrossile in posizione C6 per reazione con terz-butildimetilsilil cloruro (TBDMSCl) in presenza di imidazolo.
24. Un metodo per la preparazione di un composto di formula 1,

in cui R1 ? una catena alchilica satura C5-C15 opzionalmente sostituita, in cui R2 ? una catena alchilica satura C5-C15 opzionalmente sostituita, in cui R3 ? una catena alchilica satura C5-C15 opzionalmente sostituita, in cui R4 ? un qualsiasi sostituente conosciuto dalla persona esperta nel settore che pu? essere legato per mezzo di un legame tra C6 e un atomo adatto e/o qualsiasi sostituente che possiede un atomo di ossigeno o di azoto che pu? legarsi a C6, comprendente i seguenti passaggi: 1) Acilazione selettiva del gruppo amminico in posizione C2 della glucosamina cloridrato per reazione con cloruro di acile in presenza di bicarbonato di sodio; 2) Protezione mediante sililazione selettiva dell'idrossile in posizione C6 per reazione con terz-butildimetilsilil cloruro (TBDMSCl) in presenza di imidazolo, ottenendo cos? l'intermedio definito nella rivendicazione 20; 3) Acilazione selettiva degli idrossili nelle posizioni C1 e C3 per reazione con cloruro di acile in presenza di trietilammina e N, N-dimetil aminopiridina (DMAP); 4) Fosforilazione degli idrossili in posizione C4 per reazione con dibenzil N, N-diisopropilfosfaramidite in presenza di triflato imidazolio, seguita da ossidazione del fosfito a fosfato tramite acido metacloroperbenzoico; 5) Deprotezione dell'idrossile dal silano in posizione C6 attraverso la presenza di acido solforico in quantit? catalitica; e 6) Deprotezione del fosfato da benzili in posizione C4 e opzionalmente deprotezione di benzili su qualsiasi sostituente in posizione C6 attraverso idrogenazione catalizzata da Palladio su carbonio (Pd/C).
25. Il metodo della rivendicazione 24, ulteriormente comprendente un passaggio 5i) dopo il passaggio 5) e prima del passaggio 6): 5i) Fosforilazione dell?idrossile in posizione C6 per reazione con dibenzil N, N-diisopropilfosfaramidite in presenza di triflato imidazolio, seguita da ossidazione di fosfito a fosfato tramite acido metacloroperbenzoico in cui detto passaggio di deprotezione 6) viene effettuato in posizione C4 e C6, e in cui l'R4 risultante ? un gruppo fosfato (PO4<2->).
26. Il metodo della rivendicazione 24 in cui il composto di formula 1 ? uno tra R1 = R2 = R3 = C11H23 e R4 = PO4<2>, o R1 = R2 = R3 = C9H19 e R4 = PO4<2>, o R1 = R2 = R3 = C13H27 e R4 = PO4<2>.
27. Il metodo della rivendicazione 24, ulteriormente comprendente un passaggio 5ii) dopo il passaggio 5) e prima del passaggio 6): 5ii) Acilazione dell?idrossile in posizione C6 per reazione con un acido carbossilico in presenza di un agente condensante e di un catalizzatore adatti, o con cloruro di acile in presenza di un catalizzatore adatto, in cui detta fase di deprotezione 6) ? effettuata in posizione C4 e in cui l'R4 risultante ? un gruppo acilico.
28. Il metodo secondo la rivendicazione 27 in cui in detta fase di acilazione 5ii) detti agente condensante e catalizzatore adatti sono 1-etil-3- (3-dimetilaminopropil) carbodiimide (EDC) e N, N-dimetil aminopiridina (DMAP).
29. Il metodo della rivendicazione 24, ulteriormente comprendente un passaggio) 5iii) dopo il passaggio 5) e prima del passaggio 6): 5iii) glicosilazione dell'idrossile in posizione C6 per reazione di un donatore di cloruro di glicosile in presenza di un attivatore adatto, un catalizzatore e un setaccio molecolare in cui l'R4 risultante ? un gruppo glicosilico.
30. Il metodo della rivendicazione 24, ulteriormente comprendente un passaggio 5iv) dopo il passaggio 5) e prima del passaggio 6): 5iv) alchilazione dell?idrossile in C6 per reazione di un cloruro alchilico stabilizzato in presenza di un attivatore, un catalizzatore e un setaccio molecolare adatti in cui l'R4 risultante ? un gruppo n alchilico.
31. Il metodo delle rivendicazioni 29 e 30, in cui in detto passaggio di glicosilazione 5iii) e di alchilazione 5iv) detto attivatore adatto ? ossido d'argento (I), detto catalizzatore adatto ? acido trifilico e detto setaccio molecolare adatto ? uno scavenger dell'acqua.
32. Il metodo della rivendicazione 24, ulteriormente comprendente un passaggio 5v) e un passaggio 5vi) dopo il passaggio 5) e prima del passaggio 6): 5v) tosilazione della posizione C6 per reazione del cloruro di tosile in presenza di trietilammina come base e di un catalizzatore adatto; 5vi) Inserimento di azide in posizione C6 per reazione con azide di sodio in presenza di ioduro di tetrabutilammonio.
33. Il metodo della rivendicazione 32, in cui in detto passaggio di tosilazione 5v) detto catalizzatore adatto ? N, N-dimetil aminopiridina (DMAP).
34. Il metodo di una qualsiasi delle rivendicazioni da 24 a 33, in cui detto passaggio di acilazione 3) viene eseguito a una temperatura compresa tra -78 ?C e 0 ?C e una quantit? di catalizzatore compresa tra 0,05 e 0,2 equivalenti, ottenendo cos? un ?anomero di detto composto di formula 1, preferibilmente una temperatura di -20 ?C e una quantit? di catalizzatore di 0,1 equivalenti.
35. Il metodo di una qualsiasi delle rivendicazioni da 24 a 33, in cui detto passaggio di acilazione 3) ? effettuato a una temperatura compresa tra 20 ?C e 50 ?C e una quantit? di catalizzatore compresa tra 2 e 2,5 equivalenti, ottenendo cos? un ?-anomero di detto composto di formula 1, preferibilmente una temperatura di 30 ?C e una quantit? di catalizzatore di 2,02 equivalenti.
36. Uso di un composto intermedio come definito nella rivendicazione 22 per la sintesi dei composti di formula 1,

In cui R1 ? una catena alchilica satura C5-C15 opzionalmente sostituita, in cui R2 ? una catena alchilica satura C5-C15 opzionalmente sostituita, in cui R3 ? una catena alchilica satura C5-C15 opzionalmente sostituita, in cui R4 ? un qualsiasi sostituente conosciuto dalla persona esperta nel settore che pu? essere legato per mezzo di un legame tra C6 e un atomo adatto e/o qualsiasi sostituente che possiede un atomo di ossigeno o di azoto che pu? legarsi a C6.
37. Un metodo per la preparazione di un composto di formula X

in cui R1 ? una catena alchilica satura C5-C15 opzionalmente sostituita, in cui R2 ? una catena alchilica satura C5-C15 opzionalmente sostituita, in cui R3 ? una catena alchilica satura C5-C15 opzionalmente sostituita, in cui R4 ? OH e in cui ciascuno di R1, R2 e R3 ? privo di sostituenti -OH in posizione C2 comprendente i seguenti passaggi: 1) Acilazione selettiva del gruppo amminico in posizione C2 della glucosamina cloridrato per reazione con cloruro di acile in presenza di bicarbonato di sodio. 2) Protezione per sililazione selettiva dell'idrossile in posizione C6 per reazione con terzbutildimetilsilil cloruro (TBDMSCl) in presenza di imidazolo ottenendo l'intermedio di formula 1i come definito nelle forme di realizzazione di realizzazione precedentemente descritte. 3) Acilazione completa degli idrossili nelle posizioni C1, C3 e C4 per reazione con cloruro di acile in presenza di trietilammina e N, N-dimetil aminopiridina (DMAP). 4) diacilazione selettiva della posizione C1 per reazione con etilendiammina in presenza di acido acetico 5) Fosforilazione dell'idrossile in posizione C1 per reazione con dibenzil N, N-diisopropilfosfaramidite in presenza di triflato imidazolio, seguita da ossidazione del fosfito a fosfato tramite acido metacloroperbenzoico 6) Deprotezione dell'idrossile dal silano in posizione C6 attraverso la presenza di acido solforico in quantit? catalitica. 7) Deprotezione del fosfato da benzile in posizione C4 e opzionalmente deprotezione di benzile su qualsiasi sostituente in posizione C6 attraverso idrogenazione catalizzata da Palladio su carbonio (Pd/C).
38. Uso di un composto intermedio come definito nella rivendicazione 22 per la sintesi di composti di formula X,

In cui R1 ? una catena alchilica satura C5-C15 opzionalmente sostituita, in cui R2 ? una catena alchilica satura C5-C15 opzionalmente sostituita, in cui R3 ? una catena alchilica satura C5-C15 opzionalmente sostituita, in cui R4 ? OH e in cui ciascuno di R1, R2 e R3 ? privo di sostituenti -OH in posizione C2.