HUT76841A - Transgenic cereal plants - Google Patents

Transgenic cereal plants Download PDF

Info

Publication number
HUT76841A
HUT76841A HU9700247V HUP9700247V HUT76841A HU T76841 A HUT76841 A HU T76841A HU 9700247 V HU9700247 V HU 9700247V HU P9700247 V HUP9700247 V HU P9700247V HU T76841 A HUT76841 A HU T76841A
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
shoot
meristem
cells
plant
transgenic
Prior art date
Application number
HU9700247V
Other languages
English (en)
Inventor
Benjamin A Bowen
William J Gordon-Kamm
Keith Lowe
Margot C Ross
Gary A Sandahl
David D Songstad
Dwight T Tomes
Original Assignee
Pioneer Hi Bred Int
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US08/483,091 external-priority patent/US5736369A/en
Application filed by Pioneer Hi Bred Int filed Critical Pioneer Hi Bred Int
Publication of HUT76841A publication Critical patent/HUT76841A/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8206—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by physical or chemical, i.e. non-biological, means, e.g. electroporation, PEG mediated
    • C12N15/8207—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by physical or chemical, i.e. non-biological, means, e.g. electroporation, PEG mediated by mechanical means, e.g. microinjection, particle bombardment, silicon whiskers

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Cereal-Derived Products (AREA)
  • Noodles (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)

Description

A találmány tárgya eljárás transzgénikus növények előállítására, melynek során a merisztémaszövetet - nagyon korai fejlődési stádiumban - biolisztikus (biolistic) bombázásnak vetjük alá, és a csíravonal átörökítésében szerepet játszó sejtrétegekben szelektíven gyarapítjuk a transzgénikus szektorokat (a genetikai homogenitás felé).
A transzgénikus növények előállítása elsőként az Agrobacterium alkalmazása révén vált szokványossá, és e vektor totipotens szövetekkel együttes alkalmazása sok kétszikű növényfaj esetében kiváló transzformációs eljárást biztosított. Bár ezen eljárás genotípus- és faj tartományának kiterjesztése érdekében állandó kutatások folynak, az Agrobacterium-közvetítette transzformáció az egyszikű növényfajok (köztük a gabonafajok) esetében nem alkalmazható széles körűen, és valószínűleg csak specifikus genotípusokra korlátozódik. A protoplaszt-alapú eljárások az egyszikűek esetében szintén nem alkalmazhatók általánosan.
A fertilis, transzgénikus kukoricanövény biolisztikumközvetítette előállítását leíró első beszámolók egy specifikus hibridre (A188 x B73) korlátozódtak [ld. Gordon-Kamm és mtsai.: Plánt Cell 2, 603 (1990); és Fromm és mtsai.: Bio/Technology 8, 833, (1990)]. Azóta ezt az eljárást sok más fontos egyszikű terménynövényre (köztük az árpára, búzára, rizsre és zabra), és egyre több kukorica-genotípusra (mint pl. az általánosan alkalmazott A188xB73, H99, FR16 és Pa91) is kiterjesztették. A találmány leírásában
85101-6198-GI • · · · · ·
ismertetett munkánk célja az volt, hogy az embrió scutellumából regenerálható kalluszt hozzunk létre. Az e témában megjelent publikációkban rávilágítottak arra a szükségszerűségre, hogy a regenerálható kalluszt az éretlen embrió scutellumából kell kialakítani, függetlenül attól, hogy a mikrolövedékekkel (a) a scutellumot bombázzuk, közvetlenül az embrió izolálása után, és a scutellumsejtekből fejlődő kalluszt szelektáljuk; (b) a scutellum rövid ideig tartó, előzetes tenyésztése után a frissen kialakított kalluszt bombázzuk; vagy (c) hosszabb ideig nevelt kalluszt vagy sejtszuszpenzió-tenyészetet bombázunk.
A kalluszon alapuló megoldások új genotípusokra vagy fajokra történő kiterjesztését eredményező fejlesztések az alapmódszer - éretlen, embrióból származó kallusz különböző alakjaira (pl. laza kallusz és kompakt kallusz, melyeket I., illetve II. típusú kallusznak is nevezünk) tipikusan jellemző morfológiai és növekedési különbségekhez történő adaptálása következtében voltak eredményesek. Ennek ellenére, a genotípus korlátozottsága megmaradt, mivel bizonyos csíraplazmák nem adnak megfelelő kalluszreakciót.
A biolisztikum-közvetítette transzformáció megjelenésével számos kutatócsoport felismerte a mikrolövedékes beviteli eljárások merisztémaszövetekkel kapcsolatos alkalmazásának lehetőségét. Nyitott kérdés maradt azonban, hogy egyszikű fajok hajtásának apikális merisztémasejtjeinek integráló hatású transzformálása lehetséges-e [Bilang és mtsai.: Plánt J. £, 735 (1993)].
Az idevonatkozó szakirodalomra a merisztéma-célsejtek transzformálásának korlátáit érintő elméleti vizsgálódások jellemzők, ami magyarázatot adhat arra, hogy e területen miért nem jelentkeznek sikerek. Például, megfigyelték, hogy gabonanövényekben a hajtás-merisztémák nagyon kicsik (kb. 100 μπι-esek), és ... a biolisztikus részecskék véletlenszerűen nagy célterülete csapódnak be és a merisztémasejtekben olyan molekuláris mechanizmusok létezhetnek, amely megakadályozhatja (sic) az idegen DNS integrálódását [Potrykus: Natúré 355, 568 (1992)]. Általánosabban: az a tény, hogy az egyszikű növényfajok kisebb mértékű fejlődési képlékenységet (plaszticitást) mutatnak, mint a kétszikűek, arra utal, hogy az egyszikűek kevésbé fogékonyak a biolisztikus vagy egyéb technikákkal végzett transzformációra.
Mivel a gabonanövényekből hiányzik a fejlődési plaszticitás, e terménynövények esetében a transzformációs kísérletek a néhány - I. vagy II. típusú embriogén kalluszt fejlesztő - genotípus egyikéből származó kalluszra összpontosultak. Ezek a transzformációs célpontok könnyen alkalmazhatók voltak, mivel nagy mennyiségű meghatározatlan, proembriogén sejtet lehetett szelektálni. Ilyenformán, sok kutatócsoport e megoldás előnyeit használta ki, és nem próbáltak más célszöveteket keresni. Mostanáig senki nem számolt be a kukorica (amely kulcsfontosságú gabonanövény) merisztémabombázással végzett csíravonal-transzformálásáról. E vonatkozásban a sikerek hiánya a merisztémát alkotó sejtek szigorú fejlődési rendjének tulajdonítható .
A találmány szerinti megoldás kidolgozása során célul • · tűztük ki egy eljárás kifejlesztését stabilan transzformált gabonanövények reprodukálható előállítására.
A találmány fenti és egyéb céljainak megvalósítása érdekében - a találmány tárgyának megfelelően - kifejlesztettünk egy eljárást transzgénikus gabonanövények (például kukorica-, cirok-, búza-, árpa-, zab- vagy rizsnövények) előállítására, mely növények a bevitt DNS-t átörökítik utódaikra; az eljárás során (A) idegen DNS-t (i) szárat beburkoló levelek által be nem borított merisztéma sejtjeibe vagy (ii) ilyen merisztémában közreműködésre kijelölt sejtekbe juttatunk be; majd (B) a merisztémában a transzgénikus szektor méretének növelése érdekében újraszerveződést indukálunk, miáltal a fokozzuk annak valószínűségét, hogy egy transzgénikus szektor hozzájáruljon a csíravonal átörökítéséhez; és (C) a merisztémát olyan körülmények hatásának tesszük ki, melyek között csíranövénnyé differenciálódik, mely csíranövény tartalmazza a transzgénikus szektort vagy az idegen DNS-sel homogén módon van transzformálva, miáltal a csíranövény olyan transzformált gabonanövénnyé nevelhető, amely az idegen DNS-t átörökíti utódaira.
Az idegen DNS merisztémák sokaságába vihető be, melyek közül legalább néhány a (C) lépésben csíranövények sokaságát létrehozva differenciálódik. Az idegen DNS-t olyan merisztémába visszük be, amelyet nem burkolnak takarólevelek; az ilyen merisztémák közé tartoznak a korai proembrió, közepes proembrió, kései proembrió, valamint az átmeneti és korai csírahüvely (coleoptyl) stádiumban lévő • · embriókból származó merisztémák.
A találmány egyik előnyös megvalósítási módja értelmében az újraszerveződést az alábbi manipulációk legalább egyikének alkalmazásával indukáljuk: (i) a merisztémákra nem letális, szelektív nyomást fejtünk ki; (ii) a merisztéma újraszerveződését mechanikailag indukáljuk; és (iii) a hajtás sejtjeinek sokszorozódását hormonálisán indukáljuk. A találmány egy másik előnyös megvalósítási módja szerint a (C) lépésben említett körülményeket úgy választjuk meg, hogy a merisztémák hajtáscsúcsokat létrehozva érjenek és differenciálódjanak növénnyé, és a hajtáscsúcsokban úgy indukáljuk a merisztémaszövet újraszerveződését, hogy megnövekedjenek a transzformált szektorok vagy periklinális L2-kimérák alakuljanak ki. Az ilyen újraszerveződés, például, úgy indukálható, hogy a hajtáscsúcsokat nem letális szelekciós nyomásnak vetjük alá, hogy a hajtáscsúcsban a transzformált sejtek kompetitív növekedési előnyben legyenek a nem transzformált sejtekkel szemben, és a hajtáscsúcsban fokozódjon a transzformált sejtek aránya. Egy további előnyös megvalósítási mód értelmében az eljárás során, a (B) lépés előtt - például, az (A) lépés előtt újabb lépésként, a hajtáscsúcs fedelét szelektíven megsebezzük. A találmány szerinti eljárás magában foglalhatja a következő, újabb lépéseket is: (i) amennyiben a csíranövény levelének jelentős részén kimérikus szektort fedezünk fel, a levél alapja feletti részről kivágunk egy hónaljrügyet; majd (ii) a hónaljrügyet csíráztatva teljes növényt hozunk létre vagy a hónaljrügyet hajtásszaporí6 • · · · · · • · · · · · · • · tásnak vetjük alá.
A találmány egy másik előnyös megvalósítási módja szerint a csíranövény transzgénikus szektorát tőhajtások indukálásával stabilizáljuk. A transzgénikus csíranövény csúcsát eltávolítjuk, és a megsebzett csíranövényt sok tőhajtás kialakítása érdekében növesztjük, majd a kialakult tőhajtások közül kiválasztjuk a transzgénikus tőhajtásokat.
Szintén a találmány tárgyát képezi egy transzgénikus gabonanövény, amely (A) a fentebb leírt eljárás terméke; (B) a bevitt DNS-t átörökíti utódaira; és (C) a kalluszon alapuló transzformációval szemben ellenálló gabonavonalba tartozik. A találmány egyik előnyös megvalósítási módja szerint a transzgénikus gabonanövény olyan kukoricanövény, amely az A188, A188xB73, H99, Pa91 vagy FR16 genotípusok (vagy e genotípusokat érintő keresztezéssel kapott genotípusok) transzformálásával nem állítható elő.
Szintén a találmány tárgyát képezi egy olyan kukoricanövény, amely a bevitt DNS-t átörökíti utódaira, és amelynek pedigréje visszavezethető a PHT47, PHP02, PHV78, PHK05,
PHW20, PHR62, PHN37, PHM10, PHV37, PHJ65, PHBW8, PHK29,
PHJ33, PHP60, PHN73 vagy PHHV4 vonalra.
A találmány egyéb tárgyait, jellemzőit és előnyeit az alábbi, részletes leírásban ismertetjük. Nyilvánvaló, hogy a részletes leírást és a példákat - bár a találmány előnyös megvalósítási módjain keresztül mutatjuk be - csupán a találmány szerinti megoldás bemutatása céljából ismertetjük. A leírás alapján szakember számára nyilvánvaló, hogy a találmány szerinti megoldásban különböző változtatások és
Ί
módosítások hajthatók végre, melyek nem térnek el a találmányi gondolat lényegétől, és az igényelt oltalmi körön belül maradnak.
Az alábbiakban az ábrák rövid ismertetését írjuk le.
Az 1. ábrán egy tipikus gabonaembrió szerkezetét mutatjuk be. Az 1/a ábrán látható embrió csírahüvely stádiumban van, amely kukoricánál a beporzás után kb. 8-14 nappal jelentkezik. Az 1/b ábrán látható embrió a későbbi, harmadik stádiumban van (kukorica esetében kb. a beporzás utáni 22-28. nap). Az 1/c ábrán a zárvatermők (köztük a gabonanövények) hajtáscsúcsának modelljét mutatjuk be, hosszanti metszetben. Az 1/d ábrán a gabonanövényekre általánosan jellemző hajtás- és gyökérstruktúrákat mutatjuk be (a hajtás egy részletének kiemelésével). Rövidítések: c = csírahüvely (coleoptyl); cn = csírahüvely-nódusz; cp = csírahüvely-pórus; cr = gyökérhüvely (coleorhiza); m = mesocotyl (szikközépi szár); r = primer gyökér-primordium; s = szuszpenzor; sa = hajtáscsúcs; se = scutellum; sr = szeminális gyökér-primordium.
A 2. ábrán a találmány szerinti transzformációs eljárás vázlatát mutatjuk be.
Felismertük, hogy a gabonanövények merisztéma-alapú transzformációs eljárásának alkalmazásával kapcsolatban korábban tapasztalt nehézségek kiküszöbölhetők, oly módon, hogy (A) a gyökércsúcsi merisztéma sejtjeit biolisztikusan (biolistically) megcélozzuk, olyan körülmények között, amelyek lehetővé teszik, hogy a csúcsmerisztéma apikális fedelét ne zárják körül a szárat beburkoló levelek (ld. 1.
ábra); és (B) a transzformált sejtek gyarapodása érdekében nem letális szelekciót végzünk, például úgy, hogy a transzformáit sejtek számára a nem transzformált sejtekkel szemben kompetitív előnyt biztosítunk, és ezáltal elősegítjük a szektor szélességének növekedését. A nem letális szelekció elősegítheti a rövid élettartamú, meriklinális L2-esemény stabil, periklinális eseménnyé történő átalakulását, amelynek során a csíravonalhoz tartozó legtöbb (vagy valamennyi) sejt (vagyis az L2-réteg) transzformálódik. Ezenkívül, azt találtuk, hogy a szelekciós nyomás elősegítheti az L1 —> L2 átalakulási eseményeket, növelve ezáltal a csíravonal átörökítés valószínűségét.
Gabonanövényekben a hajtáscsúcs-merisztéma az egyes fajok között igen változékony. A legtöbb fajban azonban réteges merisztéma van, amely két vagy három látható rétegből áll, és ezek alkotják a teljes hajtást. E rétegek a felszíni Ll-réteg, a felszín alatti L2-réteg, és - bizonyos esetekben - a mélyebben fekvő L3-réteg. A külső réteg (ek) tartalmazza (tartalmazzák) a tunikát (a merisztéma felületi részét), amelyre antiklinális sejtosztódás jellemző. Ezzel szemben, a legbelső rétegben - a korpuszban - a sejtosztódások véletlenszerűen (antiklinálisan és periklinálisan egyaránt) történnek. Úgy tartják, hogy kukorica esetében a merisztéma csak két rétegből (L1 és L2), és esetleg egy harmadik rétegből (L3) áll [ld. Poethig: Contemporary Problems in Plánt Anatomy, 235-239. old., (1984) ] . A hajtás fő szöveteit kijelölő sejtdifferenciálódás inkább pozíció-függő, és nem sejtvonal-függő.
Például, a legtöbb fajban az epidermiszt csaknem kizárólag az Ll-réteg hozza létre, míg az L2-réteg a csíravonalban közreműködik. Egy idegen gén apikális merisztémasejt-csoportokba történő bevitelével olyan növényt hozunk létre, amely szükségszerűen kimérikus, vagyis, amelyben bizonyos részek genetikai összetételét megváltoztattuk. A kiméranövényeknek - a genetikai különbségek jellemző mintázata alapján - három fő csoportja létezik: (1) szektoros kimérák, melyekben a növény egy része - például, mutáns szomatikus fenotípus, kromoszómaszám-változás vagy transzformált sejtek jelenléte alapján - valamennyi sejtrétegben genetikailag elkülöníthető; (2) periklinális kimérák, amelyekben egy teljes sejtréteg - például, csak az L1 vagy csak az L2 - különbözik a növény többi részétől; és (3) meriklinális kimérák, amelyek az előző két típus közötti átmenetet képviselik, vagyis a genetikai különbség csak az egyik réteg egy részére jellemző.
A találmány leírásában a biolisztikum és biolisztikus kifejezések a genetikai transzformáció egyik eljárására vonatkoznak (ld. pl. 4 945 050 és 5 141 131 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás; melyek idevonatkozó részét teljes terjedelmükben a kitanítás részének kell tekinteni).
A biolisztikus megoldás értelmében DNS-t hordozó (pl. szemcsés felületükön DNS-sel bevont vagy abszorbeált DNS-t tartalmazó) kisméretű részecskékkel erőt közlünk, oly módon, hogy a kifejtett nyomás a részecskéket a megcélzott sejtbe vagy szövetbe (biológiai mintába) juttassa. Az ilyen részecskéket mikrolövedékeknek (microprojectiles) vagy mikrohordozóknak (microcarriers) nevezzük. Más szavakkal; a mikrolövedékeket a biológiai mintában mozgatjuk, olyan sebességre gyorsítva, amellyel az összeütközéskor áthatolnak a sejtek felületén, és a sejt vagy a mintában lévő sejtek belsejébe épülnek.
A mikrolövedékek átlagos átmérőjének eléggé kicsinek kell lenni ahhoz, hogy lehetővé tegye a mikrolövedék minta sejtjeibe történő - behatolását és a sejtekben való megmaradását, anélkül, hogy a sejtek pusztulását okozná. Az exogén (idegen) nukleinsavak gazdasejtbe történő bevitelére alkalmas mikrolövedékek jellemző példái az arany és a volfrám, melyek mérettartománya körülbelül 0,1-4 jxm. A biolisztikus hordozók egyéb példáinak leírását ld. pl.: 5 120 657 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás (a hordozót elektromos kisülés hajtja a cél felé); 5 240 842 számú amerikai egyesült államokbeli sazbadalmi leírás (nukleinsav bevitele aeroszolos cseppekkel); és a WO 92/01802 számú közrebocsátott PCT szabadalmi bejelentés leírása (melyben hordozóként jégrészecskéket alkalmaztak).
A találmány szerinti megoldás értelmében az apikális merisztémasejtek biolisztikus részecskebombázását a sejtek korai fejlődési stádiumában végezzük. A találmány egyik előnyös megvalósítási módja szerint a merisztémasejteket legkésőbb a hajtáshüvely stádiumban vetjük alá a részecskebombázásnak, amikor a hajtáscsúcs fedele teljesen szabad (nem védi a levél-primordium), és a merisztéma kevesebb sejtből áll, mint a későbbi stádiumokban. A kukorica embriogenezis stádiumainak részletes leírását ld. Poethig és mtsai.: Developmental Biology 117, 392 (1986) (mely hivatkozást teljes terjedelmében a kitanítás részének kell tekinteni).
A találmány szerinti transzformációs eljárást a hajtáshüvely- és a későbbi stádiumokban lévő embriók (nevezetesen a korai proembrió, a közepes fejlettségű proembrió, a kései proembrió, valamint az átmeneti fázisokban lévő embriók) esetében alkalmazzuk. A fejlődés legkorábbi stádiumaiban a merisztéma még nem fejlődött ki. E stádiumokban nagy citoplazma-denzitású sejtek gyors osztódásokon esnek át, és végül ezek hozzák létre a csúcsi merisztémát.
A különböző stádiumba tartozó embriók megcélzása érdekében a DNS-t (i) a megfelelő stádiumú (vagyis a csírahüvely-stádiumban lévő) merisztémát alkotó sejtekbe vagy (ii) korábbi fejlődési stádiumokban, helyzetük vagy betöltött szerepük alapján a merisztémában közreműködő sejtekbe visszük be. A találmány szerinti biolisztikus bombázás elvégzéséhez az embriót úgy helyezzük el, hogy a merisztémán belüli vagy a merisztémában közreműködő sejtek közvetlenül találkozzanak a biolisztikus mikrolövedékekkel.
A kései proembriók esetében az embrió tengely felé eső oldala kissé lapított, ami lehetővé teszi, hogy az embriót - a mikrolövedékes bombázáshoz - lapos oldalával felfelé helyezzük az agar táptalajra. Az átmeneti és hajtáshüvely stádiumban lévő embriókat hasonló orientációban helyezzük el, míg a közepes és korai proembriók esetében, az izolálás után (vagyis a csírázás előtt) nincs ilyen lehetőség, ehelyett, ha a proembriókat véletlenszerűen helyezzük el az agar táptalajon, a merisztéma szemmel láthatóan az embrió felső (táptalajtól távolabbi) oldalán fejlődik ki.· A táptalajon történő elhelyezés arra serkentheti az embriót, hogy hajtástengelyét - például az alkalmazott in vitro körülmények (vagyis az embrióban kialakított új hormonális gradiens) eredményeként - új irányba állítsa.
A találmány szerinti megoldás gyakorlati megvalósítására alkalmas - és így előnyös - merisztéma-forrást a hajtáshüvely stádiumban lévő embrió képezi. A gabonaembrió fejlődésének hajtáshüvely stádiumában a hajtáshüvely (coleoptyl) a merisztémát körülvevő levél-primordium gyűrűként figyelhető meg. Kukoricában a korai hajtáshüvely stádiumra általában a beporzás után 10-12 nappal kerül sor. (A beporzás utáni napok száma kritériumot az embrionális környezet és a genotípus befolyásolja, ilyenformán, a fejlődési stádium - ami a találmány szerinti transzformáció időzítése szempontjából fontos kritérium - morfológiai alapú meghatározásának csupán kiegészítőjeként szolgál.) A korai hajtáshüvely stádiumban a merisztéma határa jól elkülönül, látható tunika és korpusz (Ll, ill. L2) rétegekkel.
A találmány szerinti megoldás gyakorlati megvalósításában előnyösen alkalmazható célsejtek közé az embriófejlődés korai proembrió, közepes proembrió, kései proembrió, és átmeneti stádiumaiba tartozó embriók tartoznak. Kukorica esetében a korai proembrió, közepes proembrió, kései proembrió, és átmeneti stádiumba tartozó embriók általában 13 sorrendben - a 2., 4., 7-8., illetve 8-10. napon izolálhatok [ld. Poethig és mtsai.: Developmental Biology 117, 392 (1986)]. Még egyszer: a fejlődési stádium a lényeges kritérium; a fejlődés sebessége - és ezáltal a beporzás után eltelt napok száma (amikor az embriókat izolálhatjuk) - a fejlődési környezettől és a genotípustól függően változhat.
A közepes proembrió stádiumban az LI és L2 rétegek nem különböztethetők meg. Az LI és L2 közötti különbség akkora válik szembetűnővé, amikor az embrió az átmeneti stádiumba jut.
Más módon, a találmány szerinti transzformációhoz az éretlen, hímivarú virágzatok (bugavirágzat, címer) és nőivarú virágzatok (torzsavirágzat, kukoricacső) is szolgálhatnak merisztéma-forrásként. Az éretlen kifejezés itt olyan fejlődési stádiumot jelent, amikor a virág-merisztéma fejlődési szempontból még képlékeny, azaz hajtásdifferenciációra képes. Az ilyen fejlődési képlékenység - a találmány szerinti megoldás értelmében - számos pázsitfű-faj transzformálása esetében felhasználható, mivel a pázsitfüvek virágzatának fejlődésében sok hasonlóság található.
Gyakorlott szakember naponta 200-600 - közepes proembrió, kései proembrió, illetve átmentei vagy hajtáshüvely stádiumban lévő - embriót izolálhat (az izolálás egyszerűsége és az izolált embriók száma az embrió méretével egyenes arányban nő). Az éretlen hím- és/vagy nőivarú virágzatokból tízszeres nagyságrendű merisztéma-explantátum izolálható, és ezek nagy hányada úgy indukálható, hogy vegetatív fejlődést kövessenek. A merisztéma-forrásként virágos explantátumok alkalmazásának másik lényeges előnye, hogy sok genotípus jobb merisztémanövekedést és hajtásszaporodást mutat, ha kiindulási anyagként virágos explantátumot alkalmazunk. Ez az előny, például, egy olyan beltenyésztett kukoricavonal esetében kifejezett, amely a PHV78 vonalból származik. Ezzel szemben, bizonyos genotípusok - mint pl. a PHBW8 vonalból származó beltenyésztett kukoricavonalak - esetében merisztémaként az éretlen embriók alkalmazhatók előnyösen. Mindkét lehetőség hozzáférhetősége jelentősen fokozza a találmány szerinti merisztéma-transzformációban alkalmazható genotípusok számát.
Függetlenül attól, hogy explantátumot vagy szövetet alkalmazunk-e a találmány szerinti biolisztikus kezeléshez, a csíranövények előállítása során a mikrolövedékekkel bombázott sejteket egy első, nem letális szelekciós lépésnek [ld. 2. ábra, (I.) út] vagy más módon, egy második, nem letális szelekció előtt - mechanikailag vagy hormonálisán idnukált - merisztéma-újraszervezésnek vetjük alá [2. ábra, (II.) út]. A nem letális szelekció és az indukált merisztéma-újraszerveződés részletes leírását a későbbiekben ismertetjük.
A merisztémán belüli sejtek fejlődési útja szigorúan meghatározott. Ilyenformán, a merisztémában lévő egy adott sejt transzformálása rendszerint egy kisméretű, transzgénikus szektort eredményez, amely kizárólag az adott sejt leszármazottaiból áll. A normális fejlődés során az ilyen szövetek - további manipuláció nélkül - ritkán (vagy egyáltalán nem) kerülnek átfedésbe a gametofiton-szövettel.
Ha azonban a sejteket korábbi fejlődési stádiumokban (ld. fentebb) kezeljük, és a találmány szerinti megoldás értelmében enyhe szelekciós körülményeket alkalmazunk (melyek a transzformált sejtek számára növekedési előnyt biztosítanak, de nem elég súlyosak ahhoz, hogy a merisztéma teljes fejlődését visszatartsák), a transzformált sejtek gyorsabb osztódási sebessége azt eredményezi, hogy ezek utódsejtjei teszik ki a merisztéma nagyobb részét. Ennek megfelelően, a transzgénikus szektor az érett növény nagyobb részét alkotja, és nagyobb a valószínűsége annak, hogy a szektor hozzájárul a csíravonal átörökítéséhez.
A találmány egyik előnyös megvalósítási módja szerint a transzformált sejteknek - tobramicinnel, kanamicinnel és rokon vegyületeikkel szembeni, NPTII-kódolt rezisztencia formájában - szelektív növekedési előnyt biztosítunk. Elfogadható azonban az is, ha egy másik színtelenítő antibiotikummal szemben (például sztreptomicin-rezisztencia gén alkalmazásával) vagy herbiciddel szemben (például, a norflurazonnal szemben rezisztenciát biztosító crtl-génnel végzett transzformációval) biztosítunk rezisztenciát. A találmány leírásában feltárunk egyéb hasonló, nem letális stratégiákat is, melyek során - megfelelő, rezisztenciát biztosító génnel együtt - más szelektív anyagokat (pl. bialaphost vagy higromicint) alkalmazunk, miáltal a szelekciós nyomás a nem transzformált sejtek növekedését - a transzgénikus szektorban lévő sejtek növekedéséhez képest visszatartja.
A szelekció modellkísérlete során izolált merisztéma16 szövet mintáit megfelelő tápközegben, a szelekciós ágens sorozathígításaival kezeljük, majd meghatározzuk azt a koncentrációküszöböt, amely alatt a transzformált sejteknek kedvező szelekciós nyomás nem annyira szigorú, hogy károsítsa az általános merisztémafejlődést. Míg ez a megoldás a szelekció során rendszerint folyamatos merisztémanövekedést eredményez, alkalmazhatunk olyan feltételeket is, amelyek csak kismértékben (vagy egyáltalán nem) biztosítanak merisztémanövekedést (statikus feltételek), és a tenyésztést időnként, rövid ideig, nagyobb koncentrációjú szelekciós ágens adagolásával megszakítjuk (impulzus-szelekció), mely nagyobb koncentráció egyébként károsan befolyásolná a teljes merisztémafejlődést.
Ahogy fentebb említettük, a találmány szerinti gabonatranszformáció - adott esetben - magában foglalja a merisztéma újraszervezését (reorganizációját), amit például, a merisztéma apikális fedelének megsebzésével végzünk. Bár a megsebzés egyéb módszerei szintén újraszerveződést eredményeznek, előnyösen az apikális fedél mikromanipulációs tűvel történő átszúrását alkalmazzuk. Az így kiváltott újraszerveződés megváltoztatja az apikális fedél növekedését, és több merisztéma proliferációját váltja ki, ami végül fokozza a transzformációs gyakoriságot és a szektorméretet. Például, a mechanikailag indukált merisztémaproliferáció - a szelekciós nyomással együtt - a kialakuló levelekben fokozza a transzgénikus szektorok gyakoriságát és méretét.
A merisztéma újraszervezése előtt biolisztikus kezelést végezhetünk, amit a csíráztatás és a szelekció követ, melyek transzformált, kimérikus növényeket eredményeznek (2. ábra, I. út). Más módon, a mechanikai megsebzést a merisztémák mikrolövedékes bombázása után végezzük, hogy elősegítsük a merisztémák proliferációját. Ha a kimérikus merisztémákat ilyen módon kezeljük, a szektorok mérete megnőhet, mivel az újraszervezett merisztémák kisebb számú sejtből származnak, és így a merisztémában lévő transzformált sejtek aránya megnő.
A II. út értelmében (ld. 2. ábra) az újraszerveződést transzformált szektor jelenléte alapján kiválasztott csíranövény fejlődő hajtásmerisztémájának - hormonálisán indukált hajtásszaporításával idézzük elő. A hormonálisán indukált újraszerveződés nem zárja ki szükségszerűen a fentebb említett, adott esetben végzett, mechanikusan indukált újraszerveződést, és a merisztéma proliferációját a hajtás sokszorozódásával idézi elő.
A hormonálisán indukált újraszerveződés megvalósítása érdekében először lokalizáljuk a fejlődő hajtásmerisztémát rendszerint a csíranövény szikközépi (mesocotyl) és sziklevél feletti (epicotyl) szárának kapcsolódásánál lévő duzzanatban (ld. 2. ábra). Ezután a duzzadt részből kivágunk egy 2-3 mm-es darabot, amely a merisztémát tartalmazza, és ezt - például, Lowe és mtsai. [Plánt Science 41, 125 (1985)], illetve Zhong és mtsai. [Planta 187, 483 (1992)] által leírt - hajtásszaporító táptalajon tenyészthetjük. A merisztémákat jellemzően - 2 mg/1 BAP-ot (6benzil-amino-purint) , 3 % szacharózt és 9 mg/1 agart tar18 ·· ·”. .··. .·· • · · · ·· • · · · · ·*····· ,. φ talmazó - MS-táptalajon tenyésztjük. Általánosabban, a hajtásszaporító táptalajban - 0,5 mg/1 és 10 mg/1 között koncentrációban - citokint (pl. kinetint, BAP-ot, thidiazuront vagy zeatint) alkalmazunk. Néhány genotípus esetében kevés auxin alkalmazása is kívánatos lehet. A Murashige and Skooge (MS) sók megfelelőek, de valószínűleg nem optimálisak, mivel az MS-táptalajban lévőnél nagyobb mennyiségű ammóniumsót tartalmazó táptalajokkal végzett előzetes kísérletekben jobb tenyésztési eredményeket kaptunk. Egyéb adalékanyagok, mint például a TIBA elnevezésű auxintranszport-inhibitor, és az etilén-inhibitorok (ezüst-nitrát és cefotaxim) szintén előnyösek lehetnek.
A hajtásszaporító tápközeg - hormonális összetételének köszönhetően - minden egyes kivágott hajtásmerisztémából százas nagyságrendig terjedő mennyiségű hajtás képződését segíti elő, növelve annak valószínűségét, hogy olyan hajtás-szubpopulációt kapjunk, melyben a hajtások némelyike transzformált szektorból származik. A meriklinális és szektoros kimérákkal ellentétben (melyek kisebb valószínűséggel eredményeznek csíravonal öröklődést), a kialakult hajtások jelentős - és reprodukálható - hányada periklinális kiméra, és így stabilizált, abban az értelemben, hogy a genetikai homogenitás egy sejtrétegen (pl. az L2 rétegen) belül megvalósult, ami végül elősegíti a csíravonal öröklődést.
A fentebb említett hajtás-szubpopuláció azonosítása érdekében az indukált hajtások nagy populációját a nem szektoros, periklinális kimérák azonosítására szkríneljük.
• ·
- 19 Ezt nem letális módszerrel végezzük, ami a transzformált sejtek gyarapítását eredményezi, olyan szelektív ágensek alkalmazásával, melyek (i) a normálisan zöld szövetet olyan mértékben színtelenítik el, ami nem gátolja a növekedést vagy (ii) amelyek a nem transzformált merisztémaszektorok növekedését anélkül gátolják, hogy jelentősen csökkentenék a merisztémák életképességét.
A megfelelő szelekciós ágens nem letális szintű alkalmazása lehetővé teszi azt is, hogy a transzformált merisztémarétegben vizuálisan értékeljük a homogenitás mértékét. A találmány szerinti megoldás értelmében a megnövelt időtartamú szelekciós tenyésztés fokozza a meriklinális -> periklinális átalakulások és a szektoros transzformáció homogén transzformációvá történő átalakulásának esélyét, továbbá az L1 —» L2 átalakulásokra is szelektál, ami pozícióeltolódás révén - végül hozzájárul a csíravonalhoz.
Az eddigi leírásból nyilvánvaló, hogy a találmány szerinti megoldás egyik megvalósítási módja a merisztéma újraszerveződésének - bombázás előtti, bombázás utáni vagy bombázás előtti és utáni - serkentését foglalja magában, melynek során a hajtáscsúcs apikális fedelének szelektív megsebzésével gátoljuk a sejtnövekedést (ami több merisztéma kialakulását indukálja) vagy a kimetszett merisztémákat hormonális kezelésnek vetjük alá (ami szintén több bár proliferálódott hajtások alakjában lévő - merisztéma kialakulását eredményezi). A találmány egy másik előnyös megvalósítási módja értelmében, egy transzformált csíranövény hónalj rügyét - közvetlenül a levélalap alatt • · ' - · · · · · • ί ;····. ··· ·... .. · .· ····
- 20 kivágjuk, ha a levél jelentős részén kimérikus szektort találunk. Az izolált hónalj rügy egy újabb merisztémát reprezentál, amelyből teljes növény nevelhető, vagy amelyből - rövid ciklusú hajtásszaporítás után - homogénebb, transzformált növény nyerhető.
E megvalósítási mód célja - hasonlóan a fentebb leírtakhoz -, hogy fokozzuk a csíravonal átörökítésének gyakoriságát. Ennek megfelelően, ha a transzformált szektor egynél több levélen húzódik keresztül, a transzformációs eseményt sikerülhet a hónaljrügyben elfogni, vagyis, egy transzformált merikrinális vagy szektoros kimérát periklinálisan vagy homogén módon transzformált hajtássá alakíthatunk.
A transzgénikus szektorok stabilizálásának egy másik eljárása szerint a transzformált növényben tőhajtásokat alakítunk ki. Olyan esetekben, amikor a transzgénikus szektorok a kukoricanövények legalsó leveleire vagy területeire korlátozódnak, a tőhajtásokat e transzgénikus szektorok stabilizálása érdekében indukáljuk.
A találmány szerinti eljárások alkalmazásával elsőként válik lehetővé számos különböző gabonanövény-változat genotípustól független módon történő - transzformálása. Például, kukorica esetében ez azt jelenti, hogy - a kívánt jellemző(k) utódmagvakra történő átörökítésével jellemezhető - transzformációra korábban nem fogékony, kiváló vonalak génsebészeti módszerekkel úgy manipulálhatók, hogy különböző, mezőgazdasági szempontból értékes fenotípusokat expresszáljanak. Az e vonatkozásban felhasználható gének közé tartoznak - nem kizárólagosan - az alábbiak.
I. Rovarkártevőkkel vagy betegségekkel szemben rezisztenciát biztosító gének, illetve az általuk kódolt proteinek (A) Bacillus thuringiensis protein, annak származéka vagy annak alapján előállított, szintetikus polipeptid [ld. pl. Geiser és mtsai.: Gene 48, 109 (1986), amelyben leírják a Bt δ-endotoxin gén klónozását és nukleotid-szekvenciáját]. A δ-endotoxin gént alkotó DNS-molekulák az American Type Culture Collection-től (Rockville, MD) , ATCC No. 40098, 67136, 31995 és 31998 deponálási számokon szerezhetők be.
(B) Lektin [ld. pl. Van Damme és mtsai.: Plánt Molec.
Bioi. 24, 825 (1994); amelyben számos, Clivia miniata mannózkötő-lektingén nukleotid-szekvenciáját írják le].
(C) Vitaminkötő-protein, például avidin (ld. 07/911 864 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejenetést - melyet teljes terjedelmében a kitanítás részének kell tekinteni -, amelyben az avidin és avidin-homlógok rovarkártevők elleni lárvaölő szerként történő alkalmazását írják le).
(D) Enzim-inhibitor, például proteáz-inhibitor vagy amiláz-inhibitor [ld. pl. Abe és mtsai.: J. Bioi. Chem. 262, 16793 (1987) (ahol a rizs cisztein-proteináz-inhibitorának nukleotid-szekvenciáját írják le); Huub és mtsai.: Plánt Molec. Bioi. 21, 985 (1993) (ahol a dohány proteináz-inhibitor-I-et kódoló cDNS-szekvenciáját írják le); Sumitani és mtsai.: Biosci. Biotech. Biochem. 57, 1243 (1993) (ahol a Streptomyces nitrosporeus a-amiláz-inhibitor nukleotid-szekvenciáját írják le) ] .
(E) Rovarspecifikus hormon vagy feromon, például ekdiszteroid vagy juvenilis hormon, ezek változata, utánzata, antagonistája vagy agonistája [ld. pl. Hammock és mtsai.: Natúré 344, 458 (1990) (ahol klónozott juvenilis hormonészteráz - amely a juvenilis hormon inaktivátora - baculovírus által történő expresszióját írják le].
(F) Rovarspecifikus peptid vagy neuropeptid, amely expresszálódva - elpusztítja az érintett kártevőt [ld. pl. Regan: J. Bioi. Chem. 269, 9 (1994) (ahol leírja, hogy az expressziós klónozás rovar diuretikus hormon-receptort kódoló DNS-t eredményez); Pratt és mtsai.: Biochem. Biophys. Rés. Comm. 163, 1243 (1989) (amelyben leírják, hogy a Diploptera puntata-ban egy allosztatint azonosítottak) ; és az 5 226 317 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás (Tomalski és mtsai., akik rovarspecifikus, paralitikus neurotoxinokat kódoló géneket írtak le) ] .
(G) A természetben kígyó, darázs stb. által termelt rovarspecifikus méreg [ld. pl. Pang és mtsai.: Gene 116, 165 (1992), ahol skorpió által termelt, rovarokra toxikus peptidet kódoló gén növényekben végrehajtott heterológ expresszióját írták le].
(H) Monterpén, szeszkviterpén, szteroid, hidroxaminsav, fenil-propanoid-származék vagy más, inszekticid aktivitású (nem protein) molekula rendkívüli szintű fel23 halmozódásáért felelős enzim.
(I) Biológiailag aktiv molekula módosításában (beleértve a poszt-transzlációs módosítást) szerepet játszó enzim, például glikolízises enzim, proteolízises enzim, lipolízises enzim, nukleáz, cikláz, transzamináz, észteráz, hidroláz, foszfatáz, kináz, foszforiláz, polimeráz, elasztáz, kitináz vagy glukanáz (melyek mindegyike lehet természetes vagy szintetikus); ld. WO 93/02197 számú PCT irat (Scott és mtsai.), melyben egy kalláz-gén nukleotid-szekvenciáját írják le. A kitinázt kódoló szekvenciákat tartalmazó DNS-molekulák az American Type Culture Collection-től 39637 és 67152 deponálási számon szerezhetők be. Lásd még Kramer és mtsai.: Insect Biochem. Molec. Bioi. 23, 691 (1993) (ahol dohány horogféreg-kitinázt kódoló cDNS nukleotid-szekvenciáját írják le); és Kawalleck és mtsai.: Plánt Molec. Bioi. 21, 673 (1993) (ahol a petrezselyem ubi4-2 poliubikitin-génjének nukleotid-szekvenciáját írják le) .
(J) Szignál-transzdukciót stimuláló molekula [ld. pl. Botella és mtsai.: Plánt Molec. Bioi. 24, 757 (1994) (mung bean kalmodulin cDNS-klónok nukleotid-szekvenciája); és Griess és mtsai.: Plánt Physiol. 104, 1467 (1994) (kukorica kalmodulin cDNS-klón nukleotid-szekvenciája)].
(K) Hidrofób moment peptid [ld. 08/168 809 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés (a növénypatogén gombákat gátló Tachyplesin peptidszármazékai); 08/179 632 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés (betegséggel szembeni rezisztenciát biztosító, szintetikus, antimikrobiális peptidek). A leírások idevonatkozó részét a kitanítás részének kell tekinteni.
(L) Membrán-permeáz, csatornaképző vagy csatorna-blokkoló [ld. pl. Jaynes és mtsai.: Plánt Sci. 89, 43 (1993) (a cerkopin-β litikus peptidanalóg heterológ expresszáltatása transzgénikus dohánynövények -Pseudomonas solanacearum-nal szembeni - rezisztenciájának kialakítása céljából).
(M) Vírust megtámadó protein vagy abból származó komplex toxin. Például, transzformált növényi sejtekben a vírusok burokproteinjeinek felhalmozódása rezisztenciát biztosít a vírusfertőzéssel és/vagy a vírus (amelyből a burokprotein-gén származik, valamint rokon vírusok) hatására kialakuló betegséggel szemben [ld. Beachy és mtsai.: Ann. Rév. Phytopathol. 28, 451 (1990)]. Transzformáit növényekben alfalfa mozaikvírus, uborka mozaikvírus, dohány streak vírus, burgonya X-vírus, burgonya Yvírus, dohány etch vírus, dohány rattle vírus és dohány mozaikvírus elleni - burokproteinek által közvetített - rezisztencia alakítható ki.
(N) Rovarspecifikus antitest vagy abból származó immunotoxin. A rovar bélrendszerében egy kulcsfontosságú anyagcserefunkció ellen irányuló antitest inaktiválja az érintett enzimet, elpusztítva ezáltal a rovart [Taylor és mtsai.: Seventh Int'l Symposium on Molecular Plant-Microbe Interactions, 497. kivonat (1994) (amelyben a transzgénikus dohánynövényben egyláncú antitest-fragmensek termelésével kiváltott enzimatikus inaktiválást írják le)].
(O) Vírusspecifikus antitest [ld. pl. Tavladoraki és mtsai.: Natúré 366, 469 (1993), ahol kimutatták, hogy a rekombináns antitest-géneket expresszáló transzgénikus növények védettek a vírusok támadásával szemben].
(P) Fejlődést gátló protein, amelyet a természetben patogén vagy parazita termel. A gomba endo-α-Ι,4-D-poligalakto-uronázok - a növényi sejtek falában a homo-a-1,4-D-galakto-uronázok szolubilizálása révén - serkentik a gombák telepképzését és a növényi tápanyagok felszabadítását [Lamb és mtsai.: Bio/Technology 10 305 (1992)]. Egy bab endo-poligalakto-uronázt gátló proteint kódoló gén klónozását és karakterizálását Toubart és mtsai. [Plánt J. g, 367 (1992)] írták le.
(Q) A természetben növények által termelt, fejlődést gátló protein. Például, Logemann és mtsai. [Bio/Technology
10, 305 (1992)] kimutatták, hogy az árpa riboszómainaktiváló génjét expresszáló transzgénikus növények a gombabetegségekkel szemben fokozott rezisztenciát mutatnak.
11. Herbiciddel szemben rezisztenciát biztosító gének (A) A növekedési zónát vagy a merisztémát gátló herbicid, pl. imidazalinon vagy szulfonil-karbamid. Az e csoportba tartozó, példaként szolgáló gének mutáns ALS- és AHA-enzimet kódolnak [ld. Lee és mtsai.: EMBO J. j_, 1241 (1988); illetve Miki és mtsai.: Theor. Appl. Génét. 80, 449 (1990)].
(B) Glifozát (mutáns EPSP-szintetáz-, illetve aroAgén által biztosított rezisztencia) és egyéb foszfon26 vegyületek, mint például a glufozinát (PAT- és bar-gén), a piridin-oxi- vagy fenil-oxi-propionsav és a ciklohexonok (ACC-áz inhibitort kódoló gének) [ld. pl. 4 940 835 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás (Shah és mtsai.), amelyben az EPSP glifozát-rezisztenciát biztosító alakjának nukleotid-szekvenciáját írják le]. A mutáns aroAgént tartalmazó DNS-molekula az American Type Culture Collection-től 39256-os deponálási számon szerezhető be; a mutáns gén nukleotid-szekvenciájának leírását ld. 4 769 061 számú ameriaki egyesült államokbeli szabadalmi leírás (Comai). A 0 333 033 számú európai szabadalmi leírásban (Kumada és mtsai.) és a 4 975 374 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban (Goodman és mtsai.) herbicidekkel - mint például az L-foszfinotricinnel szemben rezisztenciát biztosító glutamin-szintetáz gének nukleotidszekvenciáit írják le. A foszfinotricin-acetil-transzferáz gén nukleotid-szekvenciája leírását ld. 0 242 246 számú európai szabadalmi leírás (Leemans és mtsai.). De Greef és mtsai. [Bio/Technology Ί_, 61 (1989)] - foszfinotricin-acetil-transzferáz-aktivitást kódoló - kimérikus bar-géneket expresszáló, transzgénikus növények előállítását írják le. A fenil-oxi-propionsavval és ciklohexonokkal (pl. sethoxydim és haloxyfop) szemben rezisztenciát biztosító gének példái közé tartozik az Accl-Sl-, Accl-S2- és Accl-S3-gén [Marshall és mtsai.: Theor. Appl. Génét. 83, 435 (1992)].
(C) Fotoszintézist gátló herbicid, például triazin (psbA- és gs+-gén) és benzonitril (nitriláz-gén) [Przibilla és mtsai.: Plánt Cell 3, 169 (1991), ahol
Chlamydomonas - mutáns psbA-géneket hordozó plazmidokkal végzett transzformálását írják le] . A nitriláz-gének nukleotid-szekvenciáját a 4 810 648 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban (Stalker) írják le. Az ilyen géneket tartalmazó DNS-molekulák az American Type Culture Collection-nél 53435, 67441 és 67442 deponálási számon férhető hozzá. A glutation-S-transzferázt kódoló DNS klónozását és expresszálását Hayes és mtsai. [Biochem. J. 285, 173 (1992)] írják le.
III. Értékjavító jellemvonást biztosító vagy ahhoz hozzájáruló gének (A) Tápanyagtartalmat fokozó gének (1) Nagyobb lizintartalom: a gabonanövények (pl. kukorica) olyan génnel transzformálható, amely fokozza a lizintartalmat, teljesebbé téve ezáltal a gabona tápanyagtartalmát, és kiküszöbölve a lizin pótlásának szükségességét (pl. baromfi- és sertéstápok esetében).
(2) Nagyobb metionintartalom: a gabonanövények olyan génnel transzformálhatok, amely fokozza a metiontartalmat, például egy baromfitáp (amely kisebb és nagyobb metionintartalmú komponensekből - pl. szójababból és kukoricából - áll) alacsony metionintartalmának kiegyenlítése érdekében.
(B) Csökkentett fitáttartalom (1) Fitázt kódoló gén bevitelével fokozhatjuk a fitát lebomlását, ami a transzformált gabonában nagyobb szabad foszfátszintet eredményez. [ld. pl. Van
Hartingsveldt és mtsai.: Gene 127, 87 (1993), ahol egy
Aspergillus niger fitáz-gén nukleotid-szekvenciáját írják le].
(2) Gabonanövényekbe fitáttartalmat csökkentő gént vihetünk be. Ennek megvalósítása érdekében - a kukoricamutánsok alacsony fitinsav-szintjéért felelős alléllal kapcsolatos - DNS-t klónozunk, melyet visszajuttattunk a növénybe [ld. Raboy és mtsai. Maydica 35, 383 (1990)].
(C) A szénhidrát-tartalmat például úgy módosíthatjuk, hogy a kukoricát - a keményítő elágazási mintázatát módosító enzimet kódoló - génnel transzformáljuk [ld. Shiroza és mtsai. J. Bacteriol. 170, 810 (1988) (Streptococcus mutáns fruktozil-transzferáz-gén nukleotid-szekvenciája); Steinmetz és mtsai.: Mól. Gén. Génét. 200, 220 (1985) (Bacillus subtilis leván-szacharáz-gén nukleotid-szekvenciája); Pen és mtsai.: Bio/Technology 10, 292 (1992) (Bacillus licheniformás α-amilázt expresszáló transzgénikus növények előállítása); Elliot és mtsai.: Plánt. Molec. Bioi. 21, 515 (1993) (paradicsom invertáz-gének nukleotid-szekvenciái); Sogaard és mtsai.: J. Bioi. Chem. 268, 22480 (1993) (árpa amiláz-gén helyspecifikus mutagenezise); és Fisher és mtsai.: Plánt Physiol. 102, 1045 (1993) (kukorica endospermium keményítő-elágazódási [branching] enzim-II) .
A találmány szerinti megoldás gyakorlati megvalósítása során eredményesen alkalmazható gének szintézise kölcsönösen láncindító, hosszú oligonukleotidok alkalmazásával hajtható végre [ld. pl. Ausubel és mtsai. (szerkesztők):
Current Protocols in Molecular Biology 8.2.8.-8.2.13. (Wiley Interscience, 1990)]. A polimeráz láncreakciót alkalmazó, jelenlegi technikák 1,8 kb-os gének szintézisét is lehetővé teszik [ld. Adang és mtsai.: Plánt Molec. Bioi.
21, 1131 (1993); Bambot és mtsai.: PCR Methods and
Applications 2, 266 (1993)].
A találmány szerinti eljárásokkal transzformálható kukoricavonalak közé tartoznak - többek között - a kereskedelmi hibridek előállítására alkalmazott beltenyésztett vonalak, amely (szabadalmazott vagy szakirodalmi forrásokból ismert) vonalak sok heterotikus családot fednek át. A heterotikus csoportok előnyös képviselői és a teljes heterotikus minták relatív használhatósága az adott piacnak megfelelően változik. Például, különböző csíraplazmák előnyösek az Ameriaki Egyesült Államok különböző területein (például a keleti, nyugati, északi és középső kukorica övben) , Európában vagy Dél-Amerikában, illetve egyéb nemzetközi piacokon történő felhasználáshoz végzett nemesítések esetében.
A kallusz-közvetítette eljárások sok beltenyésztett vonal esetében alkalmatlanok, melyek nem adnak megfelelő kallusz-reakciót vagy olyan kalluszt fejlesztenek, amely úgy növekszik, hogy az ilyen eljárásokat hatástalanná teszi (nehezen kezelhető beltenyésztett vonalak). Ennek megfelelően, az ilyen eljárások csupán néhány genotípus például a kukorica A188, A188xB73, H99, Pa91, FR16 genotípusok, valamint ezek valamelyikének keresztezésével kapott genotípusok - transzformálására alkalmasak. Ezzel szemben, a találmány szerinti merisztéma-transzformáció bármely vonal esetében alkalmazható, függetlenül attól, hogy az adott vonal reagál-e a kallusz-közvetítette transzformációra. A találmány szerinti eljárással olyan gabonavonalak is stabilan transzformálhatok, amelyek korábban nehezen kezelhetőknek bizonyultak. Az érintett beltenyésztett kukoricavonalak jellemző példái a PHT47, PHP02, PHV78, PHK05, PHW20, PHR62, PHN37, PHM10, PHV37,
PHJ65, PHBW8, PHK29, PHJ33, PHP60, PHN73 és PHHV4. Ezenfelül, a találmány szerinti megoldás újonnan kifejlesztett, beltenyésztett vonalak és új heterotikus csoportok esetében is alkalmazható.
A találmány egyik előnyös megvalósítási módja értelmében feltárunk egy olyan transzgénikus növényt, amely a kalluszalapú transzformációs eljárásra nem fogékony gabonavonalba tartozik. A találmány egy másik előnyös megvalósítási módja értelmében olyan transzgénikus kukoricanövényeket tárunk fel, amelyek az A188, A188xB73, H99, Pa91 vagy FR16 genotípusok transzformálásával nem állíthatók elő. A gabonavonal’’ kifejezés a Poaoideae alcsaládba tartozó pázsitfüvek olyan csoportját jelenti, amelynek tagjai általában (de nem kizárólag) a több generáción keresztül végzett önbeporzásnak köszönhetően - egynél több jellegzetes tulajdonság tekintetében viszonylag kevéssé különböznek egymástól. (A vonal kifejezést a leírásban elég tág értelemben használjuk ahhoz, hogy magában foglalja az egyetlen szülői növényből szövettenyésztési eljárásokkal vegetatív úton szaporított növények csoportját is). Egy növényről akkor mondjuk, hogy egy bizonyos vonalba tartozik, ha (A) az adott növény a szóban forgó vonal anyagából regenerált elsődleges transzformáns (To) növény; vagy (B) a szóban forgó vonal To növényét magában foglaló pedigrével rendelkezik. Ebben az összefüggésben a pedigré kifejezés egy növény származási vonalát jelenti, például az ivaros keresztezések értelmében, melyek során egy gén vagy gének kombinációi (heterozigóta vagy homozigóta állapotban) egy kívánt jellemzőt biztosítanak a növény számára.
A továbbiakban a találmány szerinti megoldást a példákon keresztül fogjuk ismertetni, melyeket csupán bemutatási célból írunk le.
A példákban a biolisztikus transzformáció általános eljárását mutatjuk be, amely során 60 mg - 1,0-1,8 μιη-es volfrám mikrolövedékeket (General Electric) 2 ml 0,1 M salétromsavban szuszpendáltunk, és jégen 20 percig ultrahanggal kezeltünk. A salétromsavat 10000-es percenkénti fordulatszámmal végzett centrifugálással eltávolítottuk, a maradékhoz 1 ml steril ioncserélt vizet adtunk, majd rövid ultrahang-kezelést és újabb centrifugálást végeztünk. Ezt a vizes öblítést kétszer megismételtük, majd a vizet eltávolítottuk, és visszamaradt anyaghoz 1 ml 100 %-os etanolt adtunk. A részecskéket ultahangozással újraszuszpendáltuk, és az etanolos öblítést megismételtük. 1 ml steril, ioncserélt víz hozzáadása és újabb ultrahangkezelés után a kapott szuszpenzió négy, egyenként 250 μΐ térfogatú alikvotját 2 ml-es kémcsövekbe pipettáztuk, és mindegyik kémcsőhöz steril, ioncserélt vizet (750 μΐ) adtunk, és a csöveket -20 °C-on tároltuk. A DNS-készítmények előállítása céljából az ultrahanggal kezelt volfrámmikrolövedék szuszpenzió 50 μΐ-ét 1,5 ml-es kémcsőbe pipettáztuk, amelybe 1-10 μg idegen DNS-t tettünk. A kémcsőbe tartalmának összekeverése után - 50 μΐ 2,5 M CaCl2-oldatot, majd újabb keverést követően 20 μΐ 0,1 M spermidint adtunk. A kapott készítményt összekevertük, ultrahangoztuk, majd kb, 10 másodpercig centrifugáltuk. A felülúszó eltávolítása és 250 μΐ 100 %-os etanol hozzáadása után a készítményt ultrahanggal kezeltük és centrifugáltuk, és a felülúszót újra eltávolítottuk. A készítményhez végül 30 μΐ 100 %-os etanolt adtunk, és ezt - bombázásonként 5 μΐ mennyiségben 200-1100 psi (1,38xl04-7, 57xl04 kPa) nyomású törőtárcsákkal alkalmaztuk.
1. példa
Nem letális szelekció alkalmazásával végzett transzformálás (A) Az NPTII-génhez kapcsolt kukoricahiszton-promóter értékelése
Szabadalmazott kukorica-genotípusainkba (melyet a leírás céljaira N10000-nek nevezünk) tartozó kukoricanövény csöveit a beporzás után hét nappal - az embriók korai hajtáshüvely stádiumában - betakarítottuk, és a kukoricacsöveket Tween-20-at tartalmazó 50 %-os Chloroxoldatban 20 percig sterilizáltuk, majd steril, ioncserélt vízzel háromszor leöblítettük. A kukoricaszemek tetejét szikével levágtuk, és az embriókat kimetszettük az endo33 speriumból. Csészénként 10, összesen 60-70 embriót tengelyük felé eső oldalukkal felfelé - érlelő táptalajra (MS-sók, 0,1 g/1 mioinozitol, MS-vitaminok, 0,5 mg/1 zeatin, 150 g/1 szacharóz és 6 g/1 Sea-Kem agaróz;
autoklávozás előtt pH=5,6) helyeztünk. Az embriókat a bombázás előtt egy éjszakán át, 28 °C-on, sötétben inkubáltuk.
Ezekben a kísérletekben az embriókat a DP6212- és
DP3953-plazmiddal transzformáltuk. A DP6212-plazmid a 2xhiszton-143 promótert, a kukorica ADHl-gén első intronját, a neomicin-foszfotranszferázt (NPTII) kódoló nptllgént, és a burgonya proteináz-inhibitor-II (Pinll) génjének 3'-végi transzkriptum-processing régióját tartalmazza. A DP3953-plazmid az ubikitin-promótert, az ubi-gén első intronját, a β-glükuronidázt (GUS) kódoló gént, és a Pinllgénjének 3'-végi transzkriptum-processing régióját tartalmazza. Az embriókat az DP6212- és DP3953-plazmiddal bombáztuk, melyeket 1:1 arányban - a savval mosott volfrámrészecskéket tartalmazó kémcsőben 1 pg össz-DNS koncentrációban - alkalmaztunk. Ez a koncentráció - amely tizede a standard koncentrációnak - optimális volt az egységesebb GUS-festődési mintázatú transzformánsok kinyeréséhez, és nem okozott - a szelektálható marker funkcióját vagy a transzformációs gyakoriságot érintő - káros hatásokat.
A fenti biolisztikus eljárás során a részecskéket 1100 psi (7,57xl04 kPa) nyomású törőtárcsákkal, PDS-1000 Hélium részecskebombázó készülék alkalmazásával - egy volfrám csőre vonatkoztatva öt, egyenként 5 μΐ térfogatú lövedékként alkalmaztuk. Valamennyi embriót csészénként egy bombázással kezeltünk.
A bombázás után az embriókat érlelő táptalajon hét napig, 28 eC-on, sötétben tartottuk. Ezután az embriókat szelekciós ágensként 150 mg/1 tobramicin-szulfátot tartalmazó - 272K hajtásnövelő táptalajra (MS-sók, 0,1 g/1 mioinozitol, MS-vitaminok, 30 g/1 szacharóz és 4 g/1 gelrit) helyeztük át. Az embriókat fényben, 28 ’C-on inkubáltuk. Az áthelyezéskor az embriók megnyúlt szikleveleket tartalmaztak.
A bombázás után két, három és négy héttel a regenerált csíranövényekből mintákat vettünk, melyeket McCabe és mtsai. által leírt eljárással [BioTechnology 87, 923 (1988)] GUS-expresszióra vizsgáltunk. A levélcsúcsokat kb. 200 μΐ hisztokémiai festékbe helyeztük, amelyben - a GUSexpresszió maximalizálása érdekében - egy éjszakán keresztül, 37 ’C-on, sötétben inkubáltuk. Az első és második levelekkel kapott adatokat az 1.
ismertetjük.
táblázatban
1. táblázat
A transzformált N10000 kukorica szöveteiben mért GUSaktivitás
Csésze Vizsgált növények száma GUS-pozitív növények száma GUS-szektor típusa
1. 9 6 fél levelek
2. 8 5 fél levelek vagy foltok
3. 9 4 lineáris szektorok
4. 9 6 fél levelek vagy foltok
5. 7 3 lineáris szektorok
6. 11 2 teljes festődés
A pozitív festődésű szektorokat tartalmazó csíranövényeket - tobramicin nélküli - hajtásnövelő tápközeget tartalmazó tenyésztő csövekbe tettük, és mindegyik új levelet GUS-expresszióra vizsgáltuk. A következetesen GUSpozitív csíranövényeket - a gyökerek látható fejlődésének megjelenése után - melegházba ültettük át. A GUS-t többé nem expresszáló növényekben vizsgáltuk a fenotípusos változásokat, például a szövetelhalást, elszíntelenedést vagy a növekedés általános hiányát, melyek a szelekció alóli kibújást jelezték. A normális fenotípusú növényeket - NPTII ELISA reagenskészlet (5 * —>3 *, Inc., 5603 Arapahoe Road, Boulder, CO 80303; katalógusszám: 5307-661-514) alkalmazá36 sával - NPTII-protein jelenlétére vizsgáltuk. Az NPTIIpozitiv növényeket melegházba ültettük.
A melegházban nevelt transzgénikus növények minden egyes új leveléből, buga- és torzsavirágzatából mintákat vettünk, és ezeket - az egyes növények expressziós mintázatának karakterizálása érdekében - GUS-aktivitásra, illetve NPTII-proteinre vizsgáltuk. A megtermékenyítést önbeporzással vagy rokonbeporzással végeztük. A beporzás után 8-10 nappal a csöveket betakarítottuk, felületükön sterilizáltuk, majd kivágtuk az embriókat, és a csíráztatáshoz hajtásnövelő táptalajra tettük (erre nem volt feltétlenül szükség, de a vizsgálati eljárás gyorsítása érdekében elvégeztük). A TI levélszöveteket - a transzgének öröklődésének igazolása érdekében - 2 % kanamicin-szulfátot tartalmazó 0,2 %-os SDS-pufferben festve GUS hisztokémiai vizsgálatnak vetettük alá. A T0 transzformáns érett leveleiből vett mintákat - a transzformáció további karakterizálása érdekében - Southern-analízisnek vetettük alá.
Egy N10000 növény (jelzése 2-4,) hisztokémiai analízise azt mutatta, hogy a GUS a levelekben, bibeszálakban (primer cső), a primer cső takaróleveleiben és a csutkában , valamint a bugavirágzat centrális és elágazó részeiben expresszálódik. Ezenfelül, az érett Ro növényből származó levélszövetben Southern-analízissel igazoltuk az NPTII strukturális gén jelenlétét. E hibridizáló sáv szegregációja ebben a növényben összhangban volt az NPTIIpozitív ELISA eredményekkel. A szár analízisével a járu37 lékos gyökerek epidermális rétegében és a szállítónyalábokban is mutattunk ki GUS-expressziót.
(B) Kukoricavonalak transzformálása nem letális szelekció alkalmazásával
Különböző kukorica genotípusokban a nem letális szelekció hatékonyságának meghatározása érdekében kísérleteket végeztünk. Az N10000 genotípust és más, szabadalmazott genotípusokat (melyeket a leírás céljaira P10000-nak, W20000-nek, E10000”-nek, PHP02-nek és R20000-nek nevezünk), a fentebb leírtak szerint, DP6212- és DP3953plazmiddal transzformáltunk. A 2. táblázatban bemutatott együttes transzformációs kísérletben kapott - adatok alapján látható, hogy a nem letális szelekciós eljárás alkalmazható a különböző kukoricavonalak esetében. Az együttes transzformációs kísérletben a stabil szektorgyakoriság és méret értékeléséhez a második, nem szelektált gén expreszszióját használtuk fel.
2. táblázat
Nem letális szelektáló táptalajon végzett csíráztatás után
GUS-aktivitást expresszáló cslranövények százalékos aránya
Kísérlet N10000 P10000 W20000 E10000 PHP02 R20000
A 65, 6 - - - - -
B 23,1 - - - - -
c - - - 16, 7 - -
D - - - 71,1 - -
E o o - 38, 5 - - -
F 16, 4 - - - 7,3 -
G 12,3 - - - - 20, 0
H 39,1 - - - - -
I - - - 20, 0 - 15, 5
J - - - 7,2 - -
K - - - 4,3 - -
L - 5, 0 - - - -
M - - - 5, 0 - 1,3
Átlagok: 26, 1 5, 0 38,5 20, 7 7,3 12,3
(C) A transzformációs gyakoriság értékelése olyan esetben, amikor a merisztéma újraszerveződését a hajtáscsúcs fedelének - mikrolövedékes bombázás előtti - mechanikai rongálásával indukáljuk
Az E10000 és W20000 genotípusú kukoricanövények csöveit az embriófejlődés korai hajtáshüvely stádiumában, illetve a beporzás utáni 9-11. napon takarítottuk be. 160 embriót izoláltunk, melyeket a fentebb leírtak szerint, érlelő táptalajon inkubáltunk.
A mikrolövedékes bombázás előtt több embrió apikális hajtásfedelét megrongáltuk, hogy a merisztémát újraszerveődésre és új merisztémás területek kialakítására serkentsük. A mechanikai rongálást - World Precision Instruments M3301 mikromanipulátorhoz csatlakoztatott - 0,5-5 μπι átmérőjű mikromanipulációs tűkkel végeztük. Az embriók hajtáscsúcsának fedelét középen, néhány μιη-től néhány 100 μιη-ig terjedő mélységben szúrtuk át (az embrió morfológiájától függően). A nagyobb scutellummal rendelkező embriók mélyebb behatolást viselnek el; a behatolási mélység előnyösen 50 μπι és 100 μπι közé esik. Az embriókat a kezelés után - a fentebb leírtak szerint - NPTII- és GUSkonstrukciókkal bombáztuk.
Az embriókat 28 °C-on, sötétben hét napig érlelő táptalajon tartottuk, majd 150 mg/1 tobramicin-szulfátot tartalmazó 272K táptalajra vittük át őket. Az áthelyezéskor az embriók megnyúlt sziklevelekkel és összetett merisztémaképződménnyel rendelkeztek. Az embriókat 28 °C-on, fényben inkubáltuk.
A mikrolövedékes bombázás után két, három és négy héttel a regenerált növények első és második levelét hisztokémiai módszerrel - GUS-expresszióra vizsgáltuk. A 3. táblázatban a GUS-vizsgálat eredményeit, valamint a merisztéma kialakulásával kapcsolatos megfigyeléseket foglaljuk össze.
3. táblázat
A mechanikai rongálás hatása a transzformációs gyakoriságra és a merisztémaképződésre
Manipuláció Embriók száma Új merisztémák száma GUS-pozitív növények (%)
150 gm-es 80 89 45,9 % (37 vizsgált
tűvel növény közül 17)
Rongálás 60 0 37,5 % (8 vizsgált
nélkül növény közül 3)
Ezek az adatok azt bizonyítják, hogy a hajtáscsúcs fedelének megrongálása új merisztémaképződést és nagyobb transzformációs gyakoriságot eredményezett. Ezenfelül, a mechanikai rongálás - a nem manipulált növényekhez képest (amelyek szőkébb, inkább foltokban jelentkező GUS-expressziós mintázatot mutattak) - folytonosabb GUS-expreszsziós mintázatot eredményezett. A nem rongált merisztémák gyakran csupán levélcsúcsi GUS-expressziót mutattak, míg a legtöbb, megrongált merisztéma a leveleken széles, folytonos GUS-expressziós mintázatot eredményezett.
2. példa
Hajtásszaporítás alkalmazásával végzett transzformáció (A) Az eljárás általános menete
Hajtáshüvely stádiumban lévő embriókat izoláltunk, és az izolált embriókat - scutellum felé eső oldalukkal lefelé
- embrióérlelő táptalajon tenyésztettük (csészénként 10-20 embrió). Mivel az embrió ontogenezisét jelentés mértékű szezonális és genotípusos változékonyság befolyásolhatja, a beporzás után eltelt napok száma és az embrió mérete helyett inkább az embrió fejlődési stádiumát ellenőriztük.
Az embriókat jellemzően MS-alapú táptalajon érleltük, amely 0,5 mg/1 zeatint, 1 mg/1 indol-ecetsavat és fokozott mennyiségű cukrot tartalmazott, mely utóbbi ozmotikumként szolgált. Az embriókat az izolálás után 0-48 óra hosszat, előnyösen 12-24 óra hosszat inkubáltuk. A merisztémákat ezután - más, nem szelektált génekkel (pl. mezőgazdasági vagy vizuális markergénekkel) együtt kanamicin-, illetve sztreptomicin-rezisztenciát biztosító génekkel bombáztuk.
A bombázás után az embriókat - a csírázás elősegítése érdekében - sötétben inkubáltuk. Egy-két hét elteltével az embriókat csíráztató táptalajra, például, hormonmentes vagy alacsony hormontartalmú MS-táptalajra vittük át. A kicsírázott csíranövényeken - a mesocotyl és epicotyl közötti kapcsolódásnál - általában duzzanat figyelhető meg. Ez a duzzanat a fejlődő hajtásmerisztémát tartalmazó régióban jelent meg.
A duzzadt részből - a merisztémát tartalmazó - 2-3 mmes darabokat vágtunk ki, melyeket - megfelelő hormonokat és szelektáló ágenseket tartalmazó - hajtásszaporító táptalajra helyezve tenyésztettünk. A szárdarabokról szabályos időközönként levágtuk a megnyúlt leveleket, és 10-14 naponként friss táptalajra helyeztük át. A tenyésztett merisztémákat 28 °C-on, sötétben inkubáltuk. 3-9 hét elteltével a proliierálódó merisztémákat megvilágított szobába vittük át.
A transzformált szektorokat a fényben végzett tenyésztést követően egy-két héttel, zöld színük alapján azonosítottuk (a nem transzformálódott szövet a szelekció hatására színtelen maradt) . A növényeket általában a hormonkoncentráció csökkentésével regeneráltuk, de néhány genotípus esetében - a regeneráció elősegítése érdekében növeltük a citokinin koncentrációját. Mivel a regenerált növények gyökereztetése néha nehézségekbe ütközik, a gyökérfejlődés elősegítése érdekében a növényeket 1 mg/1 NAA-t tartalmazó SH-táptalajon tenyésztettük, vagy a szár alapját bemetszettük, és a gyökereket 1 mg/ml koncentrációjú NAAoldatba merítettük.
(B) A Honey and Pearl változat transzformálása NPTIIgénnel
Honey and Pearl változatba tartozó kukoricanövényekből - a beporzás után 9 nappal - 180, hajtáshüvely stádiumba tartozó embriót izoláltunk. Az izolált embriók scutellumainak átlagos hosszúsága 0,48 mm volt. Az embriókat embrióérlelő táptalajra (csészénként 10 embrió) helyeztük, és 28 eC-on, egy éjszakán át sötétben tenyésztettük.
A fentebb leírt eljárás szerint 16 csészét -1,8 μιη-es volfrámrészecskék alkalmazásával, 10 pg DNS/volfrámtartalmú kémcső DNS-koncentráció mellett - DP551-plazmiddal bombáztunk. A DP551-plazmid ADH-intron-l-et, GUS-gént és nosterminátort, valamint ADH-intron-l-et, NPTII-gént és Pinll43 terminátort tartalmaz. A GUS- és NPTII-gént egyaránt a 35SCaMV-szekvenciák irányítják. Az embriókat tartalmazó csészéket 28 ’C-on, sötétben tenyésztettük és érleltük. Nyolc nappal később néhány embriót X-Gluc hisztokémiai festékbe helyeztünk, melyek közül valamennyi intenzív kék festődést mutatott, ami a GUS-aktivitásra utal.
Az embriók többsége a részecskebombázás után 19 nappal kicsírázott. Ekkor a merisztémát és a levél-primordiumokat tartalmazó régiót - a fentebb leírtak szerint - kimetszettük, és agarral szilárdított, 2 mg/1 BAP-ot és 50 mg/1 kanamicint tartalmazó MS-táptalajon tenyésztettük. A levélszöveteket megfestettük, és a 16 csésze közül nyolc esetében kék festődésű, kimérikus szektorokat találtunk. A merisztémát tartalmazó régióról levágtuk a megnyúlt leveleket, és 10-14 naponként friss táptalajra helyeztük át. A részecskebombázás után 26 nappal a kanamicin koncentrációját 100 mg/l-re növeltük. A proliierálódó merisztémákat egy héttel később fényre vittük. Ezek a kísérletek három független transzformációs eseményt eredményeztek. A transzformánsok közül kettőt polimerázláncreakcióval, GUS-festéssel, NPTII ELISA-vizsgálattal és Southern-analízissel karakterizáltunk. Az egyik transzformáns nagy GUS-aktivitást és magas NPTII-protein-szintet mutatott. A későbbi vizsgálatokhoz az e transzformánsból származó TI és T2 generációkat alkalmaztuk. Az utódok kikeresztezés után - 1:1 arányú együttes szegregációt mutattak (a GUS-aktivitás és az NPTII ELISA-vizsgálat eredményei alapján; ld. 4. táblázat), ami összhangban van ·* · ···· az integrált gének mendeli öröklődésével. Az NPTII-gén integrációját és szegregációját - ami összhangban van a pozitív NPTII ELISA eredményekkel - a Ti növények Southernanalízisével bizonyítottuk.
(C) A Honey and Pearl változat transzformálása aadAgénnel
Hajtáshüvely stádiumban lévő Honey and Pearl embriókat izoláltunk, és az izolált embriókat 288B táptalajon (0,5 mg/1 zeatint, 1 mg/1 IAA-t, 0,25 M szorbitolt és 4 % szacharózt tartalmazó, 3 g/1 gerlittel szilárdított MS-táptalaj) tenyésztettük. A fentebb leírtak szerint nyolc, egyenként 10 embriót tartalmazó csészét vetettünk alá részecskebombázásnak. Valamennyi (hat bombázáshoz elegendő) részecskekészítmény összesen 10 gg DNS-t tartalmazott (5 gg DP4790-plazmid + 5 gg DP460- vagy DP3536-plazmid) . Az 1-4. csészéket a - 35S CaMV promótert, ómega'-t, aadA-t és ocs-terminátort tartalmazó - DP4790-plazmiddal [melyet Dr.
Jonathan Jones (John Innes Institute) bocsáttott rendelkezésünkre] és a - 35S CaMV promótert ADH-intront, GUS-gént és nos-terminátort tartalmazó - DP460-plazmiddal, míg az 58. csészéket a DP4790- és DP3536-plazmiddal bombáztuk (a DP3536-plazmid cab-promótert, ADH-intron-6-ot, GUS-gént és ocs-terminátort tartalmaz) . Valamennyi embriót a fenti (B) részben leírtak szerint növesztettük és csíráztattuk. Csírázás után a merisztémákat tartalmazó régiókat - 2 mg/1 BAP-ot és 100 mg/1 sztreptomicin-szulfátot tartalmazó agarral szilárdított MS táptalajon tenyésztettük.
Miután a tenyésztett merisztémákat megvilágított szobába helyeztük át, a 6. csészén lévő, proliferálódó merisztémán zöld szektort figyeltünk meg. Az összes többi tenyésztett merisztéma fehér volt (a sztreptomicin színtelenítő hatása miatt). Ekkor a GUS-festés szektoros és nem szektoros, kék festődésű leveleket eredményezett. A bombázás után körülbelül 7 héttel a 6. csészén lévő transzformációs eseményből származó levelek megjelenésében eltérést tapasztaltunk: néhány levél nem szektoros GUS-pozitív volt, míg a többi még továbbra is meriklinális maradt. A transzformációt polimeráz-láncreakció (PCR), GUS-festés és
Southern-analízis alkalmazásával ellenőriztük.
(D) Kiváló beltenyésztett vonal transzformálása
Nyolc nappal a beporzás után egy kiváló beltenyésztett vonalból (melyet a leírás céljaira B30000 elnevezéssel jelölünk) hajtáshüvely stádiumú embriókat izoláltunk, melyeket 288L táptalajon, 15 csészében (csészénként 20 embriót) tenyésztettünk. 12 csészét standard eljárás alkalmazásával bombáztunk. Röviden, a részecskebombázást hat lövedékkel, 650 psi (4,47xl04 kPa) nyomású törőtárcsák és DP5397-plazmiddal (szabadalmazott, mezőgazdasági jelentőségű gén) és DP5606-plazmiddal (cab-promóter/ADH-intron6/GUS-gén/ocs-terminátor kazettához kapcsolt Ubipromóter/Ubi-intron/NPTII-gén/pin-II-terminátor) [mindkét plazmidból 5 μg/(részecskekészítményt tartalmazó) cső] bevont - 1 μπι-es volfrámrészecskék alkalmazásával végeztük.
A DP5397-plazmid saját, szabadalmazott mezőgazdasági jelentőségű plazmidunk, amely Bt-gént tartalmaz, míg a DP5606-plazmid Ubi-promótert, Ubi-intront, NPTII-gént és Pinll-terminátort tartalmaz, amely cab-promóterhez, ADHintron-6-hoz, GUS-génhez és ocs-terminátorhoz kapcsolódik.
A részecskebombázás után a merisztémákat - 2 mg/1 BAPot, 0,25 mg/1 2,4-diklór-fenoxi-ecetsavat és 3 % szacharózt tartalmazó - agarral szilárdított MS táptalajon tenyésztettük. A részecskebombázás után öt héttel a merisztémákat kanamicinnel (100 mg/1) szelektáltuk. A merisztémák irreverzibilis kifehéredésének elkerülése érdekében a szöveteket a szelektív és nem szelektív tápközegen felváltva tenyésztettük.
A részecskebombázás után öt hónappal az egyik kifehéredett hajtástenyészetről eltávolítottunk egy nagy zöld szektort, és ezt X-Gluc alkalmazásával megfestettük. Megállapítottuk, hogy a levelek - a nem epidermális sejtekben - GUS-aktivitást expresszálnak.
E kísérletsorozatból egyetlen növényt regeneráltunk, amely nagy mennyiségű pollent és több csövet termelt. Azt találtuk, hogy a pollenek a GUS-expresszió tekintetében szegregációt mutattak, ami meglepő volt, mivel ez a gén a cab-promóter irányítása alatt állt. E növény valamennyi levele magas szintű, nem szektoros GUS-aktivitást mutatott. A bugavirágzat (címer) pelyvái szintén pozitívak voltak a GUS-aktivitásra. E To növény levélszövetének mintái NPTII és Bt proteint tartalmaztak (amit ELISA vizsgálatokkal igazoltunk), és magas szintű GUS-aktivitást mutattak (amit fluorometriás analízissel ellenőriztünk). A hisztokémiai
- 47 GUS-vizsgálattal kimutattuk, hogy 106 csíranövény közül 42 örökölte a GUS-gént, ami megfelel a mendeli öröklődésnek.
3. példa
Éretlen kukoricacső és címer merisztémák alkalmazásával végzett transzformáció (A) Az éretlen kukoricaszemek levágása
A palántázás után 7-9 héttel betakarított növényekről a leveleket egyenként, fertőzésmentesen eltávolítottuk, és a csöveket szabaddá tettük. A csöveket boncolómikroszkóp alatt kivágtuk a héjból. A csövek hosszanti kettémetszése fokozza a reakciót, és a merisztémát jobban szabaddá teszi a részecskebombázáshoz.
(B) A reagáló explantátumok fejlődési stádiumának meghatározása és szelektálása
Azt találtuk, hogy a kivágott teljes kukoricacső mérete és a merisztémák fejlődési stádiuma a betakarítás pontos időzítésének megbízható indikátorai. A kisebb csövek fejlődésileg kevésbé determináltak, és érzékenyebbek a hormonális ingerekre, de a kevesebb életben maradt merisztéma kevesebb transzformációs célt eredményez. Bár kisebb virágzatokat használtunk, a transzformációs kísérletekhez alsó mérethatárként a két millimétert alkalmaztuk. Az érzékeny célok szelektálásához a felső határt a merisztéma fejlődési stádiuma határozta meg; a fejlődési képlékenység rohamosan csökkent, amikor a pelyvák egyértelműen láthatók48 ká váltak, és elérték a merisztémafedél oldalát.
(C) Kiindulási táptalaj
Különféle táptalajokat alkalmaztunk, és a beltenyésztett vonalak különböző módon reagáltak a változásokra. A virágzati merisztéma tenyésztésének kezdeti stádiumában (különböző genotípusokhoz) előnyösen alkalmazott táptalaj Murashige és Skoog (MS) sókat, MS vitaminokat, 0,1 mg/1 2,4-D-t, 0,5 mg/1 6-BAP-ot, 12,2 μΜ L-prolint, 8 % szacharózt és 30 mg/1 ezüst-nitrátot tartalmazott. Szilárdító anyagként előnyösen GELRITE-ot (Merck and Co., Inc./Kelco Division, Rathway, NJ) alkalmaztunk (3,5 g/1 koncentrációban).
(D) Részecskebombázás
Az éretlen kukoricacső-explantátumok részecske-bombázását 650 psi (4,47x10 kPa) nyomású törőtárcsák és - a szövet felett kb. 0,5-1,0 cm távolságban felfüggesztett rozsdamentes acélernyő (100 μιη-es szemnagyság) alkalmazásával végeztük. A DNS-precipitáció és a részecskebombázás egyéb paraméterei azonosak voltak az 1. példában leírtakkal .
(E) A kukoricacsövek feldarabolása, tenyésztése és szelektálása
A merisztémák gyors növekedésének fenntartása és életben tartásuk érdekében a csöveket - az izolálás után 46 nappal - feldaraboltuk (az egyes darabok 4-8 merisztémát tartalmaztak) . Ezeket a darabokat hajtásszaporító táptalajon tenyésztettük, melynek alapösszetétele megegyezett a kiindulási táptalajjal (ld. fentebb), azzal a különbséggel, hogy 1 mg/1 BAP-ot és 3 % szacharózt tartalmazott. A merisztémaszöveteket kéthetenként friss hajtásszaporító táptalajra tettük át.
A részecskebombázással kezelt kukoricacső-merisztémák X-Gluc-oldatban végzett inkubálása - a részecskebombázás után két nappal - következetesen nagy gyakoriságú átmeneti GUS-expressziót eredményezett. A számos sarjhajtás által képzett levelekben lévő stabil szektorokról megállapítottuk, hogy a GUS-t a részecskebombázás után egy hónappal is expresszálják. Ebben a stádiumban a levelek 1-2 cm hosszúak voltak, és azt találtuk, hogy a transzformált szektorok a levelek hosszúságának több, mint a felét teszik ki. Ráadásul, az e stádiumban feláldozott egyik merisztéma hisztokémiai vizsgálat szerint - magas szintű GUSexpressziót mutatott.
Az egy hónapos hajtásszaporítás után 100 mg/1 koncentrációjú sztreptomicinnel egy hónapos szelekciót végeztünk. A szelekció után valamennyi kezelt anyagot szelektálószer nélküli táptalajra vittük át, és fényben inkubáltuk. A nem szelektált tenyészetekben a levelek és hajtások gyorsan megzöldültek, míg a szelektált tenyészetekben a levelek színtelenek (fehérek) maradtak.
(F) A növények regenerálása
A feltételezhetően transzformált sárjhajtásokat nővé50 nyi növekedésszabályozóktól mentes táptalajra helyeztük. 1 mg/1 BAP jelenlétében a levelek különböző mértékben fejlődtek, és a hajtások rövidesen kialakultak és megnyúltak (hormon hiányában).
(G) Gyökereztetés
A gyökereztetést 1-5 mg/1 NAA-t tartalmazó MS- vagy SH-alapú táptalaj alkalmazásával segítettük elő.
4. példa
A korai proembrió, közepes proembrió, kései proembrió, valamint átmeneti és korai haj táshüvely stádiumba tartozó embriók transzformálása
A közepes fejlettségű proembrió, kései proembrió, valamint átmeneti és korai hajtáshüvely stádiumba tartozó éretlen embriókat összegyűjtöttük, és - nagy koncentrációban citokinint és ozmotikumot tartalmazó - 610A táptalajon tenyésztettük. A 610A táptalaj MS-sókat, MS-vitaminokat, 100 mg/1 mioinozitolt, 0,4 mg/1 tiamin-HCl-ot, 1 mg/1 zeatin-ribozidot, 0,1 mg/1 BAP-ot, 60 g/1 szacharózt, 400 mg/1 aszparagint és 7 g/1 Hazelton TC agart tartalmazott. Egy napos regenerálás után az embriókat - a fentebb leírtak szerint - DNS-sel bombáztuk, és annak a területnek a közepén, ahol a csúcsmerisztéma kifejlődik, 0,5 pm-es mikromanipulációs tűvel sebet ejtettünk.
Az embriókat a sötétben 7 napig érleltük, majd - 1 mg/1 bialaphost tartalmazó - hormonmentes táptalajra helyeztük. A hormonmentes táptalajon, sötétben végzett újabb 7 napos inkubálás után az embriókat csíráztató tápközegre tettük, és a folyamatos csírázás érdekében fényben tenyésztettük. Amikor a levelek kifejlődtek, megfigyeltük a növény fenotípusát, és a szektorok kialakulásának - fentebb leírt hisztokémiai vizsgálattal (GUS) végzett - ellenőrzése érdekében mintákat vettünk.
A normális fenotípusú és/vagy riportergén-aktivitású, egészséges növényeket melegházba ültettük át. A 4. táblázatban látható adatok (melyeket a fentebb leírt eljárás során nyertünk) az N10000-es beltenyésztett vonal több, hasonló (közepes proembrió, kései proembrió, átmeneti és korai hajtáshüvely stádiumba tartozó embriók alkalmazásával végzett) kísérletben kapott - szektorgyakoriságát mutatják.
4. táblázat
Közepes proembrió, kései proembrió, átmeneti és korai hajtáshüvely stádiumba tartozó embriók alkalmazásával megállapított szektorgyakoriság
Embrió- Embriók Transz- GUS- GUS- Szektor
stádium száma gének gyakoriság expresszió elhelyez
mintázata -kedése
Korai 320 BAR/GUS 14,2 % Levélcsúcs 1. és 2 .
hajtáshüvely és 1-3 levél
sejtsor
Átmeneti 250 BAR/GUS 22,5 % Nyereg 1., 5.
(saddle) vagy 11.
és lineáris levél*
Kései 200 BAR/GUS 34 % Nyereg és 1. vagy
proembrió lineáris 5.
levél*
Közepes 110 BAR/GUS 3 % Lineáris és 1.
proembrió teljes levél levél*
* A szektorok a megadott sorszámú leveleknél kezdődnek
A közepes proembriók esetében megfigyelt GUS-gyakoriság - az adatok gyűjtésekor - viszonylag alacsony (részecskebombázás és szelektálás utáni) túlélési arányt mutatott. Ha azonban a 610A táptalajhoz 1 mg/1 koncentrációban zeatint adunk, az agar koncentrációját 12 g/l-re növeljük, és a részecskebombázás során a törőtárcsanyomást
200 psi-re (l,38xl04 kPa) emeljük, a közepes proembriók életbenmaradása (az izolálás és DNS-bevitel után) javul.
5. példa
Merisztéma-transzformáció - közvetlen csíráztatási módszer
Az N10000 genotípusú növényeket beporoztuk, és nyolc nappal később - a kései proembrió stádiumban lévő - embriókat tenyészetbe vittük.
Az embriókat (hajtástengelyükkel felfelé) a 0. napon 150 g/1 szacharózt, 1 mg/1 zeatint és 12 g/1 agart tartalmazó - módosított 610A táptalajra tettük, és sötétben egy éjszakán keresztül, 28 ’C-on inkubáltuk. Az 1. napon (az egy éjszakás inkubálás után) 0,5 μιη-es Femotip mikromanipulációs tűvel valamennyi embrió csúcsmerisztémáját (az apikális fedél közepén) megrongáltuk, és az embriókat 28 ’C-on, sötétben további egy éjszakán át inkubáltuk. A 2. napon PDS-1000 Hélium részecskebombázó készülékkel, 650 psi (4,47xl04 kPa) törőtárcsanyomás alkalmazásával, csészénként egy lövedékkel részecskebombázást végeztünk. Ehhez DNS-ként - 1 μιη-es volf rámrészecskéket tartalmazó csőre számítva - 1 pg DP3528+DP3953 plazmidot [2x35S::BAR+UBI::GUS] alkalmaztunk. A 2. naptól a merisztéma érésének elősegítése érdekében - valamennyi embriót 610A táptalajon 7 napig, sötétben, 28 ’C-on tartottuk. A 7. napon (a 610A táptalajon végzett hét napos inkubálás után) az embriókat - csíráztatás és szelektálás céljából - 612 táptalajra vittük át. Ez a táptalaj MSsókat és -vitaminokat, 0,001 mg/1 kinetint, 0,1 mg/1 adenin-szulfátot, 20 g/1 szacharózt, 6 g/1 agart és 0,5 mg/1 bialaphost tartalmaz. A 14. naptól az embriókat 7 napig, sötétben, 28 eC-on tartottuk, majd további csíráztatás érdekében fényre helyeztük őket. A 21. és 49. nap között a fejlődő levelekkel hisztokémiai GUS-analízist végeztünk, és a 35. napon a növekvő csíranövényeket - 5 mg/1 bialaphost tartalmazó - hormonmentes MS-tápközeget tartalmazó kémcsövekbe helyeztük. Az 56. napon a 6-1 (SÍD 180741) és 2-7 növényt (SÍD 180742) melegházba ültettük át.
összesen 48 embriót tenyésztettünk és részecskebombáztunk, és ezek közül 37 fejlődött normálisan. Az 1. levélen túlnőtt embriók száma 17 volt, melyek közül négy mutatott GUS-expressziót. Az 5 mg/1 koncentrációjú bialaphos alkalmazásával végzett szelekciót (normális gyökérfejlődéssel) két növény élte túl,, melyeket melegházba ültettünk.
A SÍD 180741-es és SÍD 180742-es jelzésű növény - a melegházba történő áthelyezéskor - GUS-expressziót mutatott, és leveleik, illetve gyökerük normális fejlettségű volt. Ezzel szemben, az összes többi növény elpusztult. Az SÍD 180742-es növény csak az 1-8. levelekben mutatott GUSexpressziót .
5. táblázat
A SID180742-es növényben hisztokémiai GUS-analízissel megállapított szektor-elhelyezkedés
Struktúra GUS fenotípus
1. levél Negatív
2. levél Levélcsúcs
3. levél Levélcsúcs
4. levél Nyeregszektor: levélszél és középső ér
5. levél Középér szektor
6. levél Nyeregszektor: levélszél és középső ér
7. levél Középér szektor
8. levél Nyeregszektor: levélszél és középső ér
9. levél Középér szektor
10. levél Nyeregszektor: levélszél és középső ér
11. levél Középér szektor
12. levél Nyeregszektor: levélszél és középső ér
13. levél Középér szektor
14. levél Fél levél
15. levél Fél levél
16. levél Fél levél
17. levél Fél levél
18. levél Fél levél
19. levél Fél levél
20. levél Teljes levél
21. levél Teljes levél
Címer A centrális kocsány pollenfestődést mutat;
öt címerelágazás szintén pozitív
Portokok Az endotécium és epidermisz pozitív
Portok-pelyvák Epidermisz pozitív
A leveleket - a V6-V8 fejlődési stádiumban - lanolin kenőcsben 1 % Ignite alkalmazásával megfestettük. Az SID180741-es növény csak a szektoros (GUS-expresszáló) területeken volt rezisztens az Ignite-ra, míg az SID180742-es egyáltalán nem mutatott rezisztenciát. A levelekből vett mintákkal PCR-analízist végeztünk, és az SID180471-es növényben GUS- és BAR-gén, míg az SID180742-es növényben csak GUS-gén jelenlétét igazoltuk.
Korábbi fejlődési stádiumok felé haladva (vagyis kései proembriókat megcélozva) az egyik megfigyelt, fő különbség a nyeregszektorok kialakulása volt [ld. Poethig és mtsai.: Developmental Biology 117, 392 (1986)]. A merisztéma szerveződésére vonatkozó információk alapján arra a következtetésre jutottunk, hogy ez a kukoricacímeren keresztül történő csíravonal átörökítéshez vezethet. A nyeregszektorok a levél-primordiumtól felfelé - az apikális fedél középső részén keresztül - a levél-primordium egy másik részéig húzódnak. A transzgénikus szektoroknak a merisztéma középső részébe történő kiterjesztése nagymértékben fokozza annak valószínűségét, hogy a szektor hozzájáruljon a címer - és végül a pollen - kialakításához.
A kukorica anatómiájával foglalkozó korábbi kutatások és a klonális analízisek eredményeként kimutatták, hogy a kukorica szervezett, rétegekből álló apikális (csúcs) merisztémát tartalmaz, amely a fejlődés átmeneti stádiumában kezd kialakulni [Randolph: J. Agric. Rés. 53, 881 (1936); Poethig és mtsai.: Developmental Biology 117, 392 (1986)]. Dawe és Freeling a kukorica porzós virágzatában lévő sejtek származására vonatkozó cikkükben [Develpomental Bioi. 142, 233 (1990)] leírták, hogy az apikális merisztéma LI és L2 rétege alakítja ki a portok falának két rétegét. Csak a belső réteg származása egyezik meg a hímivarsejtekével (L2) . A fejlődés átmeneti stádiuma után bekövetkező események csak az egyik sejtvonalra korlátozódtak, amely csak akkor öröklődik, ha az L2 rétegben szektorok találhatók.
A 180741-es transzformánst kései proembrió stádiumban a merisztémaréteg szerveződése előtt - részecskebombáztuk. Ez a transzformáns olyan nyeregszektort tartalmazott, amely - definíció szerint - keresztezi az apikális merisztémafedelet, és kettéosztja a merisztémát (a merisztéma egy olyan régiójában, amely később a hímivarú virágzattá fejlődik [Poethig és mtsai.: Developmental Biology 117, 392 (1986)]. A merisztéma újraszerveződésének elősegítése érdekében mikromanipulációs tűvel ezt is megsebeztük, és bialaphost és szelektálószert tartalmazó táptalajon inkubáltuk. A hisztokémiai GUS-analízis adatai a levelek mindkét rétegében, a portok falában, és a centrális kocsányról származó pollen kb. 50 %-ában GUS-expresszióról tanúskodtak.
6. példa
A transzgénikus szektorok stabilizálása tőhajtások kialakí fásával
Ahogy fentebb említettük, transzformált növényekben a tőhajtások kialakítása a - transzgénikus szektorok stabilizálását célzó - hajtásszaporítás alternatív módját képezi. Ennek megfelelően, a kiváló kukoricavonalakban - a találmány szerinti megoldás értelmében - tőhajtások indukálhatok, melyekkel stabilizálhatok a transzgénikus szektorok.
Ebben a példában a tőhajtások kialakulását kontroll növényekben De Wolff leírása szerint indukáltuk [Euphytica 20, 524 (1971)]. Kéthetes csíranövényeken - hozzávetőleg a hajtáscsúcs magasságában vagy valamivel fölötte - 11-es szikével háromszögletű bemetszést ejtettünk. A bemetszést a levelek síkjára merőlegesen készítettük, hogy ne károsítsuk a középereket. A P10000-es, PHP02-es, G30000-es és E10000es csíranövények hajtáscsúcsát eltávolítottuk. Ezek a genotípusok olyan beltenyésztett vonalak, amelyek jelentős mértékben különböző, heterotikus családokból származnak. Kontrollként azonos genotípusú, kezeletlen növényeket alkalmaztunk. Ha a bemetszés túl messze esett a hajtáscsúcstól, közvetlenül az első bemetszés alatt újabbat készítettünk.
A megsebzett és a kezeletlen kontroll növényeket két hétig, 24 órás folyamatos megvilágítás mellett tartottuk (nappal melegházban, éjjel nevelőkamrában). A kísérletet fény/sötét ciklusok alkalmazásával is elvégeztük.
Azon növények esetében figyeltünk meg jelentős mértékű tőhajtásképződést, amelyek hajtáscsúcsait eltávolítottuk. A folyamatos megvilágítás tőhajtásképződésre gyakorolt hatása - a fény/sötét ciklusok váltakozásával végzett • · · · · kísérlethez viszonyítva - változó és genotípus-függő volt. A kezelés nélküli kontroll növények nem hoztak tőhaj fásokat.
A tőhajtások gyakoriságának növelése érdekében a növényeken a bemetszéssel létrehozott lyukak lanolin és fitohormonok - például TIBA (1 mg/1) vagy BAP (10 mg/1) keverékével betömhetők. Más lehetőség szerint - a transzgénikus szektorok azonosítása és szelektálása érdekében - a bemetszések helyén a fitohormonok mellett szelekciós ágensek (pl. kanamicin) is alkalmazhatók.

Claims (22)

  1. Szabadalmi igénypontok
    1. Eljárás transzgénikus gabonanövények előállítására, melyek a bevitt DNS-t átörökítik utódaikra, azzal jellemezve, hogy (A) idegen DNS-t (i) szárat beburkoló levelek által be nem borított merisztéma sejtjeibe vagy (ii) ilyen merisztémában közreműködésre kijelölt sejtekbe juttatunk be; majd (B) a merisztémában a transzgénikus szektor méretének növelése érdekében újraszerveződést indukálunk, miáltal a fokozzuk annak valószínűségét, hogy egy transzgénikus szektor hozzájáruljon a csíravonal átörökítéséhez; és (C) a merisztémát olyan körülmények hatásénak tesszük ki, melyek között csíranövénnyé differenciálódik, mely csíranövény tartalmazza a transzgénikus szektort vagy az idegen DNS-sel homogén módon van transzformálva, miáltal a csíranövény olyan transzformált gabonanövénnyé nevelhető, amely az idegen DNS-t átörökíti utódaira.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az (A) lépést korai proembrió, közepes proembrió, kései proembrió, átmeneti vagy korai hajtáshüvely stádiumban hajtjuk végre.
  3. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az idegen DNS-t merisztémák sokaságába visszük be, melyek legalább egyike a (C) lépésben csíranövények sokaságát kialakítva differenciálódik.
  4. 4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az újraszerveződést a következő manipulációk legalább egyikének alkalmazásával indukáljuk: (i) a merisztémákra nem letális, szelektív nyomást fejtünk ki; (ii) a merisztéma újraszerveződését mechanikailag indukáljuk; és (iii) a hajtás sejtjeinek sokszorozódását hormonálisán indukáljuk.
  5. 5. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a (C) lépésben olyan körülményeket alkalmazunk, amelyek biztosítják, hogy a merisztémák hajtáscsúcsokat létrehozva érjenek és differenciálódjanak növénnyé, továbbá a hajtáscsúcsokban úgy indukáljuk a merisztémaszövet újraszerveződését, hogy a transzformált szektorok megnövekedjenek vagy periklinális L2-kimérák alakuljanak ki.
  6. 6. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az újraszerveződés indukálása során a hajtáscsúcsokat nem letális szelekciós nyomásnak vetjük alá, hogy a hajtáscsúcsban a transzformált sejtek kompetitív növekedési előnyben legyenek a nem transzformált sejtekkel szemben, és a hajtáscsúcsban fokozódjon a transzformált sejtek aránya.
  7. 7. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az (A) lépésben az idegen DNS-t legfeljebb hajtáshüvely stádiumban lévő embrió biolisztikus bombázásával visszük be.
  8. 8. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az újraszerveződés indukálása során a hajtáscsúcsokat olyan körülmények között tenyésztjük, hogy azokból - organogenezis révén - proliferációval sok hajtás alakuljon ki.
  9. 9. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a (C) lépés elvégzése előtt a hajtáscsúcs fedelét szelektíven megsebezzük.
  10. 10. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a megsebzést az (A) lépés elvégzése előtt hajtjuk végre.
  11. 11. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az (A) lépésben éretlen torzsa vagy címer explantátumot vetünk alá biolisztikus bombázásnak.
  12. 12. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy célsejtként kukorica-, cirok-, búza-, árpa-, zabvagy rizssejteket alkalmazunk.
  13. 13. A 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy célsejtként kukoricasejteket alkalmazunk.
  14. 14. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy (i) amennyiben a csíranövény levelének jelentős részén kimérikus szektor figyelhető meg, a levél alapja feletti részről kivágunk egy hónalj rügyet; majd (ii) a hónalj rügyet csíráztatva teljes növényt hozunk létre vagy a hónaljrügyet hajtásszaporításnak vetjük alá.
  15. 15. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy újabb lépésekként a csíranövény hajtásából eltávolítjuk a hajtáscsúcsot, miáltal sebet ejtünk; majd (ii) a csíranövényeket tőhajtások sokaságának kialakítása érdekében növesztjük; és (ii) a tőhajtások sokaságából kiszelektáljuk a transzgénikus tőhajtást.
  16. 16. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az (i) lépés elvégzése után a sebbe tőhajtásképződést fokozó fitohormonokat teszünk.
  17. 17. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az (i) lépés elvégzése után a sebbe - a transz63 génikus szektorok azonosítása és szelektálása érdekében szelekciós ágenst teszünk.
  18. 18. Transzgénikus gabonanövény, amely az 1. igénypont szerinti eljárás terméke, és a bevitt DNS-t átörökíti utódaira, továbbá olyan gabonavonalba tartozik, amely kalluszon alapuló transzformációra nem fogékony.
  19. 19. A 18. igénypont szerinti transzgénikus gabonanövény, amely egy olyan kukoricanövény, amely az A188, A188xB73, H99, Pa91 vagy FR16 genotípus, valamint ezek bármelyikével végzett keresztezéssel kapott genotípusok transzformálásával nem állítható elő.
  20. 20. Transzgénikus gabonanövény, amely a 15. igénypont szerinti eljárás terméke, és a bevitt DNS-t átörökíti utódaira, továbbá olyan gabonavonalba tartozik, amely kalluszon alapuló transzformációra nem fogékony.
  21. 21. A 20. igénypont szerinti transzgénikus gabonanövény, amely egy olyan kukoricanövény, amely az A188, A188xB73, H99, Pa91 vagy FR16 genotípus, valamint ezek bármelyikével végzett keresztezéssel kapott genotípusok transzformálásával nem állítható elő.
  22. 22. Kukoricanövény, amely a bevitt DNS-t átörökíti utódaira, és pedigréje visszavezethető a PHT47, PHP02, PHV78, PHK05, PHW20, PHR62, PHN37, PHM10, PHV37, PHJ65, PHBW8, PHK29, PHJ33, PHP60, PHN73 vagy PHHV4 vonalra.
HU9700247V 1994-07-29 1995-07-26 Transgenic cereal plants HUT76841A (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US28227094A 1994-07-29 1994-07-29
US08/483,091 US5736369A (en) 1994-07-29 1995-06-07 Method for producing transgenic cereal plants

Publications (1)

Publication Number Publication Date
HUT76841A true HUT76841A (en) 1997-11-28

Family

ID=26961344

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9700247V HUT76841A (en) 1994-07-29 1995-07-26 Transgenic cereal plants

Country Status (9)

Country Link
EP (1) EP0772687A2 (hu)
JP (1) JPH10503374A (hu)
AU (1) AU697373B2 (hu)
BR (1) BR9508341A (hu)
CA (1) CA2195206A1 (hu)
HU (1) HUT76841A (hu)
MX (1) MX199137B (hu)
NZ (1) NZ293737A (hu)
WO (1) WO1996004392A2 (hu)

Families Citing this family (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7102056B1 (en) 1997-04-29 2006-09-05 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for plant transformation and regeneration
US6235529B1 (en) 1997-04-29 2001-05-22 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for plant transformation and regeneration
WO1999015003A1 (en) 1997-09-24 1999-04-01 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for transformation of cereals using cultured shoot meristematic tissue
WO1999016890A2 (en) 1997-09-30 1999-04-08 The Regents Of The University Of California Production of proteins in plant seeds
US6153811A (en) * 1997-12-22 2000-11-28 Dekalb Genetics Corporation Method for reduction of transgene copy number
US6096546A (en) * 1998-01-30 2000-08-01 Board Of Trustees, Rutgers, The State University Of New Jersey Methods for recovering polypeptides from plants and portions thereof
US6100092A (en) 1998-06-15 2000-08-08 Board Of Trustees, Rutgers The State University Of New Jersey Materials and methods for amplifying polynucleotides in plants
AU2001255050B2 (en) * 2000-02-25 2005-07-14 Avestha Gengraine Technologies Pvt. Ltd. A process for generating genetically modified pearl millet through agrobacteriumand biolistic transformation
EP1261729A2 (en) * 2000-02-25 2002-12-04 Villoo Morawala Patell A process for generating genetically modified pearl millet through agrobacterium and biolistic transformation
US6544789B1 (en) 2000-03-13 2003-04-08 Board Of Trustees, Rutgers, The State University Of New Jersey Phosphorus-controllable recombinant expression of polypeptides in plants
IT1317038B1 (it) * 2000-06-05 2003-05-26 Vitroplant Vivai Di Zuccherell Metodo per la rigenerazione di piante e suoi usi per lamoltiplicazione e/o la trasformazione di piante.
WO2003007698A2 (en) 2001-07-19 2003-01-30 Monsanto Technology Llc A novel method for the production of transgenic plants
KR20030010234A (ko) * 2001-07-26 2003-02-05 권오경 차동 신호 검출회로
DE10201637A1 (de) * 2002-01-17 2003-08-07 Univ Albert Ludwigs Freiburg Verfahren zur Herstellung einer Mais-Kalluskultur
WO2004022707A2 (en) 2002-09-03 2004-03-18 The Regents Of The University Of California Method and compositions for transformation and regeneration of maize
EP1578193A4 (en) 2002-12-23 2011-06-15 Vical Inc FREEZING PROCESS FOR NUCLEIC ACID / BLOCK COPOLYMER / CATION SIDE COMPLEXES
WO2004060363A1 (en) 2002-12-23 2004-07-22 Vical Incorporated Method for producing sterile polynucleotide based medicaments
AU2008233555B2 (en) 2007-03-29 2013-10-17 Suntory Holdings Limited Method for producing transgenic surface chimeric plant
EP3051940A4 (en) * 2013-10-04 2017-03-29 Dow AgroSciences LLC Soybean transformation method
US10526612B2 (en) 2014-03-06 2020-01-07 Riken Plant transformation method
EP3456825A4 (en) * 2016-05-13 2020-03-18 Kaneka Corporation METHOD FOR PLANT GENE EDITING
WO2017195905A1 (ja) * 2016-05-13 2017-11-16 株式会社カネカ 形質転換植物の作製方法
US11499158B2 (en) 2016-05-13 2022-11-15 Kaneka Corporation Method for modifying plant

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5177010A (en) * 1986-06-30 1993-01-05 University Of Toledo Process for transforming corn and the products thereof
CA1328236C (en) * 1987-05-05 1994-04-05 Novartis Ag Plant tissue transformation
EP0331083A3 (de) * 1988-03-02 1990-11-28 Schweizerische Eidgenossenschaft Eidgenössische Technische Hochschule (Eth) Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzen
FI902635A0 (fi) * 1989-05-29 1990-05-25 Eidgenoess Tech Hochschule Foerfarande foer framstaellning av transgena vaexter.
DE4013099A1 (de) * 1990-04-25 1991-10-31 Hoechst Ag Verfahren zur transformation somatischer embryonen von nutzpflanzen
EP0539563B2 (en) * 1991-05-15 2008-01-23 Monsanto Technology LLC Method of creating a transformed rice plant
US5304719A (en) * 1992-02-03 1994-04-19 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Inbred corn line PHT47
FI933682A0 (fi) * 1993-08-20 1993-08-20 Valtion Teknillinen Metod foer att producera transgena saedesvaexter

Also Published As

Publication number Publication date
MX9700688A (es) 1998-01-31
MX199137B (es) 2000-10-18
WO1996004392A2 (en) 1996-02-15
AU697373B2 (en) 1998-10-01
JPH10503374A (ja) 1998-03-31
AU3624795A (en) 1996-03-04
NZ293737A (en) 1998-07-28
EP0772687A2 (en) 1997-05-14
WO1996004392A3 (en) 1996-03-28
BR9508341A (pt) 1997-08-12
CA2195206A1 (en) 1996-02-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US5736369A (en) Method for producing transgenic cereal plants
HUT76841A (en) Transgenic cereal plants
US5405765A (en) Method for the production of transgenic wheat plants
US8323974B2 (en) Method for excision of plant embryos for transformation
MXPA97000688A (en) Transgenic plants of cer
US5986181A (en) Transformation and regeneration of fertile cotton plants
HU218465B (hu) Eljárások és kompozíciók stabilan transzformált, termő egyszikű növények és sejtjeik előállítására
US6495741B1 (en) Method of selecting transformed Brassica tissue
US20230057290A1 (en) Methods for plastid transformation
WO2002014520A2 (en) Process for inducing direct somatic embryogenesis and secondary embryogenesis in monocotyledonous plant cells, and rapidly regenerating fertile plants
EP2456893A1 (en) Sugarcane centromere sequences and minichromosomes
BRPI0809836A2 (pt) Manipulação do envelhecimento de plantas usando promotores modificados
MX2007002083A (es) Metodos para regeneracion, transformacion y produccion de plantas de abelmoschus esculentus transgenica resistente a insectos.
JP7250524B2 (ja) ソルガムの遺伝子形質転換を改善する方法
CN115605600A (zh) 未成熟花序分生组织编辑
Magdalita et al. Progress in the development of transgenic papaya: transformation of Solo papaya using ACC synthase antisense construct
Mangena A simplified in-planta genetic transformation in soybean
US20040210959A1 (en) A Novel Method for Production of Transformed Dihaploid Corn Plants
US20040045056A1 (en) Transformation of Brassica
Magdalita et al. Towards transformation, regeneration and screening of papaya containing antisense ACC synthase gene
US7129393B1 (en) Transgenic plants and method for transforming carnations
US20060260005A1 (en) Transformation of Brassica
Liu Transformation of microspores for generating doubled haploid transgenic wheat (Triticum aestivum L.)
WO2024215568A1 (en) Methods for rapid agrobacterium-mediated sunflower stable transformation
CN114760836A (zh) 使用腋生分生组织的植物原位转化方法

Legal Events

Date Code Title Description
DFD9 Temporary prot. cancelled due to non-payment of fee