HUT76666A

HUT76666A - Pharmaceutical compositions comprising a chimaeric tnf binding protein

Info

Publication number: HUT76666A
Application number: HU9700180A
Authority: HU
Inventors: Robert Frederick Geoffre Booth; Werner Lesslauer
Original assignee: Hoffmann La Roche
Priority date: 1994-07-22
Filing date: 1995-07-15
Publication date: 1997-10-28
Also published as: PL318501A1; FI970247A; NO970264L; CZ19397A3; AU3111995A; EP0772449A1; FI970247A0; CA2195665A1; CZ283219B6; WO1996003141A1; NO970264D0; BR9508419A; JPH09508140A

Description

1994.07.22. (94111455.5) EP

KIVONAT

A találmány tárgya humán p55- vagy p75-TNF-receptor valamely oldható részét és humán immunoglobulin nehéz vagy könnyű láncának konstans tartományait teljesen vagy részben tartalmazó kimer TNF megkötő fehérje vagy gyógyászatilag alkalmas sói felhasználása autoimmun betegségek kezelésére szolgáló gyógyászati készítmény előállítására.

eí_UT\V|' • ·

KÖZZÉTÉTELI

PÉLDÁNY

P9700180

Kimer TNF megkötő fehérjét tartalmazó gyógyászati készítmények

F.HOFFMANN-LA ROCHE AG, Bázel, Svájc

Feltalálók:

BOOTH Róbert Fredrich Geoffrey 1The Willows, Amersham,

LESSLAUER Werner

Buckinghamshire, Nagy-Britannia Aeussere Baselstrasse 288,

4125 Riehen, Svájc

A nemzetközi bejelentés napja: A nemzetközi bejelentés száma:

1995. 07. 15.

PCT/EP95/02788

A nemzetközi közzététel száma:

WO 96/03141

Elsőbbsége:

1994.07.22. (94111455.5) EP

165/1130 • · · • · · · · ·

Találmányunk a humán p55- vagy p75-TNF-receptor valamely oldható részét és humán immunoglobulin nehéz vagy könnyű lánca konstans tartományának egészét vagy annak részeit tartalmazó kimer TNF megkötő fehérje vagy gyógyászatilag alkalmas sói felhasználására vonatkozik, gyakran gyulladásos folyamatokkal társult autoimmun betegségek (pl. reumatoid arthritis, l-tipusú diabetes mellitus fiatalkori formái, szisztémás lupus erythematosus, thyroiditis, különösen sclerosis multiplex) kezelésére. Találmányunk továbbá a fenti betegségek kezelésére szolgáló gyógyászati készítményekre vonatkozik.

A sclerosis multiplex (MS) a központi idegrendszer gyulladásos betegsége, amely feltételezések szerint autoimmun rendellenességekből vezethető le; ennek célpontja a mielin komponensei. Az MS autoimmun eredetét támasztja alá az a tény, hogy emberen kísérleti allergiás encephalomyelitisben a MBP-specifikus encephalitogén T-sejtekhez hasonló mielin alap fehérje (MBP) reaktív T-limfocitákat találtak [Sun, Acta. Neurol. Scand. Suppl. 142, 1-56 (1993); Voskuhl et al., Autoimmunity 15, 137-143 (1993)]. Bizonyíték van arra nézve, hogy MS betegekben a MBP reaktív T-sejt kiónok előfordulásának gyakorisága nagyobb [Allegretta et al., Science 247, 718-721 (1990)]. Ezenkívül a humán MS patofiziológiai aspektusait utánzó különböző kísérleti autoimmun encephalomyelitis állatmodelleket fejlesztettek ki (lásd az alábbiakban). Azonban az MS előfordulását környezeti tényezők is szabályozzák, amit földrajzilag jól meghatározott helyi járványgócok igazolnak.

Az MS-t a gyulladásos sejtek gócszerű felhalmozódása, ödéma és a CNS szövetekben lejátszódó demielineződés jellemzi. Régi felismerés szerint boncolás során több gócszerű fokális sérülést találtak, mint arra a klinikai állapotból következtetni lehetett volna.

A sérülések tipikusan oly módon kezdődnek, hogy mononukleáris sejtek a fehér közegbe perivenilárisan behatolnak, ödémát előidézve. Úgy tűnik, hogy a behatoló sejtek a mielin burok szelektív szétbomlását közvetítik, miközben az axonokat érintetlenül hagyják. A sérülés továbbfejlődése során astrocita burjánzás gliotikus hegesedéshez vezet; ezek ún. MS-foltok 0,1 cm és néhány cm • · · · · • · · · · · • ··· ·· · ··· • ······ · · ······ · · ··· közötti átmérőjűek. Az MS klinikai kifejlődésében átmeneti javulások és visszaesések váltakoznak, miközben váltakozó hosszúságú betegségmentes időszakok is fellépnek vagy a betegség krónikusan fejlődik ki és ez arra utal, hogy a betegséget előidéző patofiziológiai folyamatok heterogén szabályzásúak.

Klinikai patológiai tanulmányok kimutatták, hogy MS sérülésekben TNF-t termelő sejtek vannak jelen. A TNF pozitív sejtek többsége morfológiailag a reaktív rostszerű astrociták közé sorolható és kettős immunoszinező kísérletek igazolták, hogy a legtöbb reakcióképes sejt astrocita, míg a többi monocita/makrofág [Hofman et al., J. Exp. Med. 170. 607-612 (1989)]. Független kísérletek igazolták a TNF-el szembeni pozitív immunoreaktivitást astrocitákban és monocitákban MS foltokban, valamint a limfotoxin (LT) immunoreaktivitást is vizsgálták. Érdekes módon a várt limfocitákon kívül a mikrogliális sejteket LT-vel szemben pozitívnak találták [Selmaj et al., J. Clin. Invest. 87, 949-954 (1991a)]. Ezenkívül a citokin mRNS kifejezésre MS sérülésekben, in situ hibridizáció által irányuló vizsgálatok azt mutatták, hogy valamennyi gyulladásos perivaszkuláris sérülésben TNF, IL-6 és IFN-gamma (valamint más citokin) mRNS-ek magas szinten vannak jelen. A TNF, IL-6 és IFN-gamma mRNS szint különösen magas az erős demielinizálódást mutató sérülésekben [Woodroofe and Cuzner, Cytokine 5, 583-588 (1993)].

További közlemény arról számol be, hogy a TNF egér gerincvelő szövet mielinezett sejtjeiben levő oligodendrocitákra közvetlen citotoxikus hatást fejt ki, míg az IFN-gamma, IL-2, T-sejt felülúszó vagy antigalaktocerebrozid antiszérum ilyen hatással nem rendelkezik [Selmaj and Raine, Ann. Neurol. 23, 339-346 (1988)]. E sejtek TNF-el történő kezelése oligodendrocita nekrózist okoz; több idegrostban demielineződés fejlődik ki.

MS betegek szérumában és gerincvelő folyadékában (CSF) számos kutató TNF koncentrációt mért. Egyetértés alakult ki abban a tekintetben, hogy az MS betegek jelentős százalékánál a TNF koncentráció a CSF-ben magas, míg a szérumban sokkal alacsonyabb. A TNF koncentráció közvetlenül nem függ össze a CSF sejttartalommal, ami azt sugallja, hogy a CSF TNF-tartalma a TNF terme• · • · · lésre utalhat az MS sérülésekben és ezek körül, különös tekintettel a sérülések gyakori paraventrikuláris elhelyezkedésére.

Encephalomyelitis állatkísérletek (EAE) jelentősen befolyásolták az autoimmun eredetre, valamint a citokinek humán MS-ben betöltött szerepére vonatkozó elképzeléseket. Az EAE-t a mielin antigénekkel történő aktív érzékenyítése vagy specifikus T-sejt kiónoknak szingenetikus érzékeny gazdaállatba történő adoptív átvitele idézi elő. Az MS autoimmun eredetét igazoló fontos érv az a felismerés, hogy egy immunválasznak mielin antigénekben történő kísérleti indukálása a humán MS-hez hasonló betegségekhez vezet. A TNF-nek a betegség kialakulásában és a jellemző patológiáért felelős mechanizmusokban betöltött szerepét anti-TNF monoklonális antitest terápia igazolja [Ruddle et al., J. Exp. Med. 172, 1193-1200 (1990); Selmaj et al., Ann. Neurol. 30, 694-700 (1991b)]. A TNF-t (valamint más citokineket) termelő sejtek kiküszöbölése hasonlóképpen visszaszorítja az EAE-t [Huitinga et al., J. Exp. Med. 172, 1025-1033 (1990)]. A TNF-nek az EAE-ben betöltött fontos szerepét támasztja alá továbbá az a felismerés, hogy a cephalitogenecitás adoptív átvitelben erősen függ az ugyanezen MBP pepiidet felismerő különböző T-sejt kiónok TNF és LT termelő képességétől [Powell et al., Intern. Immunoi. 2, 539-544 (1990)].

Humán p55- és p75-TNF-receptor oldható részeinek kísérleti cephalomyelitisben (EAE) kezelésénél történő felhasználását patkányon az EP 512 528 sz. szabadalmi leírásban már leírták. Mindezideig azonban semmilyen adatot sem közöltek kimer TNF megkötő fehérjék és gyógyászatilag alkalmas sóik védő hatásáról. Ennek megfelelően találmányunk tárgya a humán p55- vagy p75-TNF receptor oldható részeit és humán immunoglobulin nehéz vagy könnyű lánca konstans tartományait teljesen vagy részben tartalmazó TNF-receptor vagy gyógyászatilag alkalmas sói felhasználása autoimmun betegségek (pl. sclerosis multiplex) kezelésére alkalmas gyógyászati készítmények előállítására. Találmányunk különösen olyan kimer TNF megkötő fehérje felhasználására vonatkozik, amely a humán p55-TNF receptor oldható részét tartalmazza. Találmányunk előnyös kiviteli alakja olyan kimer TNF megkötő fehérje felhasználására vonatkozik, • 999 ·

amely az összes tartományt tartalmazza, kivéve a humán immunoglobulin nehéz lánca konstans régiója első tartományát; ez azt jelenti, hogy a humán p55-TNF-receptor oldható része C-végcsoportján az immunoglobulin nehéz lánca saroktartományához van fuzionálva. A fenti immunoglobulin IgG, IgA, IgM vagy IgE, különösen IgG (pl. lgG1 vagy lgG3) lehet. A leírásban használt a humán p55- vagy p75-TNF receptor oldhtó része kifejezés a fenti receptorok egyikének teljes extracelluláris tartományát vagy ezeknek olyan részét jelenti, amely a humán TNF-t még megköti (pl. p55-TNF-receptor esetében az első 12 N-végállású aminosavat nélkülöző extracelluláris tartomány).

Találmányunk tárgya továbbá eljárás emlősök autoimmun betegségeinek kezelésére oly módon, hogy az ilyen kezelésre rászoruló emlősnek az autoimmun betegség hatásait javító kimer TNF megkötő fehérje vagy sója gyógyászatilag hatékony mennyiségét adjuk be. Találmányunk különösen sclerosis multiplex fenti kezelésére vonatkozik.

A találmányunk szerinti felhasználásnál alkalmazható kimer TNF megkötő fehérjék előállítása az EP 417 563 sz. közrebocsájtási iratban és az alábbi irodalmi helyen kerül ismertetésre: Loetscher et al., J. Bioi. Chem. 266 18324-18329 (1991). A fenti kimer TNF megkötő fehérjék előállításához továbbá az alábbi szabadalmi leírásokban és közrebocsájtási iratokban leírt TNF megkötő fehérjék vagy részeik alkalmazhatók: EP 308 378, EP 422 339, GB 2 218 101, EP 393 438, WO 90/13575, EP 398 327, EP 412 486, WO 91/03553, EP 418 014, JP 127,800/1991, EP 433 900, U.S. 5,136,021, GB 2 246 569, EP 464 533, WO 92/01002, WO 92/13095, WO 92/16221, EP 512 528, EP 526 905, WO 93/07863, EP 568 928, WO 93/21946, WO 93/19777, EP 417 563 és WO 94/06476.

A jelen szabadalmi leírásban használt kimer TNF megkötő fehérje kifejezés olyan fehérjéket is magában foglal, amelyekben az immunoglobulin rész vagy a TNF megkötő rész bármely aminosavát törölték, vagy egy vagy több aminosavval helyettesítették, vagy egy vagy több aminosavat hozzáadtak mindaddig, amíg a TNF megkötő részek a TNF-t még megkötik és az immunoglobulin részek • · · · · · • ··· ·· · ··« • ······ · · ······ « · ·· · egy vagy több jellegzetes tulajdonságot mutatnak. Amennyiben az immunoglobulin rész a saroktartományt beleértve az összes tartományból áll - kivéve a konstans régió első tartományát - a saroktartományból az első öt N-terminális aminosav hiányozhat. A fenti kimer TNF megkötő fehérje muteinek az irodalomból jól ismert módszerekkel állíthatók elő [lásd pl. Sambrook és tsai Molecular Cloning, 2. kiadás (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York] vagy a korábbiakban felsorolt egy vagy több szabadalmi leírás és közrebocsájtási irat.

Ezenkívül a találmányunk szerinti kimer TNF megkötő fehérjék módosított formában is alkalmazhatók, pl. kémiai egységekkel összekapcsolva az alapvető biológiai aktivitás megváltoztatása nélkül. Előnyösek azon jólismert módosítások, amelyek során a kimer TNF megkötő fehérjét vízoldható polimerekhez kapcsoljuk. E célra pl. széles molekulatömeg tartományú (pl. 500-20000 dalton) polietilénglikolok vagy polipropilénglikolok alkalmazhatók. Ez a módosítás lényegében nem-immunogén védett fehérjéket eredményez. Az irodalomban számos módszert ismertettek polimernek a fehérjéhez különböző linkereken keresztül történő kapcsolására, lásd pl. Perspectives in Bioconjugate Chemistry, kiadó C.F. Meares, American Chemical Society, Washington (1993); és különösen a 4 179 337 sz. USA szabadalmi leírás.

A találmányunk szerint felhasznált kimer TNF megkötő fehérjék továbbá gyógyászatilag alkalmas sóik alakjában is felhasználhatók. A karboxilesöpört önmagában ismert módon alakítható sóvá. A sók közül a szervetlen sókat (pl. nátrium-, kalcium-, ammónium-, vas/lll/- vagy cinksókat stb.) és szerves bázisokkal (pl. aminokkal, mint pl. trietanolamin, arginin, lizin, piperidin, prokain stb.) képezett sókat említjük meg. A sók továbbá ásványi savakkal (pl. sósav vagy kénsav) vagy szerves savakkal (pl. ecetsav vagy oxálsav) képezett addiciós sók lehetnek.

A kimer TNF megkötő fehérjét találmányunk céljaira előnyösen befecskendezhető parenterális készítmények alakjában alkalmazhatjuk, azonban más hatékony adagolási módok is tekintetbe jöhetnek, pl. intraartikuláris injekció vagy transzdermális iontoforézis. Hordozóanyagként előnyösen fiziológiás kony• · · · · hasó-oldat alkalmazható, azonban más gyógyászatilag alkalmas hordozóanyagok is felhasználhatók. Vizes vagy nemvizes oldószerek jöhetnek tekintetbe. A hordozóanyag további gyógyászatilag alkalmas excipienseket is tartalmazhat, mint pl. a pH-t, ozmolaritást, viszkozitást, áttetszőséget, szint, sterilitást, stabilitást, a kioldódás mértékét vagy az illatot módosító vagy biztosító excipienseket. A hordozóanyag további gyógyászatilag alkalmas excipienseket is tartalmazhat, különösen a kimer TNF megkötő fehérje stabilitását, a kioldódás mértékét, a fehérje felszabadulását vagy abszorpcióját módosító vagy biztosító excipienseket. Az e célra felhasználható excipiensek a parenterális gyógyászati készítmények előállításánál szokásos anyagok lehetnek; a készítmények egyetlen dózisegység vagy többszörös adagolásra alkalmas dózisegység formájában állíthatók elő.

A találmányunk szerinti gyógyászati készítmények steril ampullákban (oldat, szuszpenzió, gél, emulzió, szilárd anyag) vagy vízmentesített formában (liofilizált por) tárolhatók. Az ilyen készítmények felhasználásra kész formában tárolhatók vagy közvetlenül beadagolás előtt hozhatók a felhasználásra kész formára. A készítményeket előnyösen 4 °C-nál alacsonyabb hőmérsékleten - előnyösen -70 °C-on - tárolhatjuk. Előnyösen járhatunk oly módon, hogy a készítményeket fiziológiás pH értéken vagy annak közelében tároljuk és adagoljuk.

A találmányunk szerint felhasznált hatóanyagok dózisa sclerosis multiplex kezelése esetén általában kb. 0,001-5,0 mg/kg, előnyösen 0,1-5,0 mg/kg, különösen előnyösen 0,1-2,0 mg/kg testtömeg. A készítményt 1-4 héten át egyetlen dózisban, különösen előnyösen 1-4 héten át kb. 0,1-2,0 mg/kg testtömeg dózisban adagolhatjuk. A gyógyászati készítmény előnyösen egyetlen dózisban a humán p55-TNF-receptor oldható részét és humán immunoglobulin nehéz vagy könnyű lánca konstans tartományait teljesen vagy részben tartalmazó kimer TNF megkötő fehérjét vagy gyógyászatilag alkalmas sóját tartalmaz. Előnyösen alkalmazhatunk hatóanyagként olyan kimer TNF megkötő fehérjét, amely az összes tartományt tartalmazza, kivéve a humán immunoglobulin nehéz lánca konstans régiója első tartományát; a humán immonuglobulin pl. IgG, IgA, IgM vagy IgE, előnyösen IgG, különösen előnyösen lgG1 vagy lgG3 lehet. Az adagolás gyakori8 sága és az optimális dózis a kimer TNF megkötő fehérje farmakokinetikai párámé tereitől és a felhasznált készítménytipustól függ.

A specifikus dózist az adagolás módjától függetlenül a beteg hozzá vetőleges testtömege alapján számítjuk ki. Az optimális dózis, valamint az adago lás módjának megválasztása a szakember kötelező tudásához tartozik.

Találmányunk további részleteit az alábbi példákban ismertetjük anélkül, hogy találmányunkat a példákra korlátoznánk.

·· ·· ·

Példák

I. példa

Akut EAE modell (AHH/R patkányok)

Nőstény AHH/R patkányok [Bloxham et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 252, 1331-1340 (1990)] mindkét hátsó mancsának talpi felületébe tengerimalac gerincagyat és Mycobacterium tuberculosist (Difco Laboratories, Detroit, Ml, USA) (10 mg/ml) magábanfoglaló Freund-féle teljes adjuvánst (1:1) tartalmazó emulziót (0,05 ml) oltunk. Az állatokat lemérjük, és a neurológiai jeleket naponta az alábbi skála segítségével értékeljük (4-pontos klinikai skála) : 0=normális; 1=ernyedt farok; 2=hátsó végtag részleges bénulása; 3=hátsó végtag teljes bénulása; 4=tetraplegia. Az állatokat humán IgGyl nehéz lánca saroktartományához fuzionált és CHO-sejtekben kifejezett humán p55-TNF receptor (a receptor első 182 N-terminális aminosava) extracelluláris tartománnyal (fúziós fehérje) i.p. beoltjuk, vagy az állatokba csak foszfáttal pufferolt konyhasó-oldatot (PBS) fecskendezünk. Az encephalytogén szuszpenzió patkányokba történő fecskendezésének eredményeként neurológiai tünetek lépnek fel (10. nap), amelyek csúcspontjukat a 14. napon érik el. A neurológiai tüneteket jelentős súlyveszteség kíséri. A fúziós fehérjével történő kezelés (1, 5 és 10 mg/kg i.p., naponta adagolva, EAE posztindukálása a 8-14. napon) hatására az EAE tünetei szignifikánsan csökkennek és a testsúlyváltozás is dózistól függő mértékben csökken [az 1. ábrán 10 állatból álló csoport átlagos klinikai pontszámait mutatjuk be, a 10-21. napon. A 2. ábrán a megfelelő testsúly-alakulást tüntetjük fel, a 8-20. napon; a p-értékeket Mann-Whitney-U-teszttel határozzuk meg (statistical Methods in Biology, Bailey

N.T.J., Hodder és Staughton, London], Egy második kiérletsorozatban a fúziós fehérjét (10 mg/kg i.p.) poszt-indukcióval egy betegség-ablakon (8-20 nap) adagolva azt találtuk, hogy a kezelés hatására az EAE tünetek és a testtömegváltozás a 14. napig szignifikánsan csökken. [A 3. ábrán 10 állatból álló • · csoport átlagos klinikai pontértékeit tüntetjük fel a 10-20 naptól; a p értékeket a fenti Mann-Whitney-U-teszt segítségével határozzuk meg. A 4. ábrán a megfelelő átlagos testsúly változás értékeket tüntetjük fel, a p értékeket páratlan P-teszttel határozzuk meg (Statistical Methods in Biology, s.a.]

II. példa

Krónikus EAE modell (Biozzi egér)

Beltenyésztésű Biozzi szelekciós I AB/H egereket [Baker et al., J. Neuroimmunol., 28. 261-270 (1990)] standard pelletírozott tápon és vizen ad libitum tartunk. A hím egerek hasába két helyen szubkutáns úton 0,3-0,3 ml (összesen 0,6 ml) emulziót fecskendezünk, amely 6,6 mg/ml fagyasztvaszárított Biozzi gerincagyat foszfáttal pufferezett konyhasó-oldatban (PBS) és 60 mg hővel elpusztított micobaktériumot [Mycobacterium tuberculosis H37Ra és M. butyricum (8:1); Difco, s.a.] 0,15 ml Freund-féle nemteljes adjuvánsban (Baker és tsai, lásd fenn) tartalmaz. Az injekció beadását 7 nap múlva megismételjük. Az állatokat lemérjük és a neurológiai tüneteket az alábbi 5 pontos skála alapján naponta értékeljük: 0=normális; 1=ernyedt farok; 2=gyengített kiegyenesedő reflex (IRR); 3=a hátsó végtag részleges bénulása; 4=a hátsó végtag teljes bénulása; 5=elhullás). Egér csoportok állataiba fúziós fehérjét (lásd I. példa) vagy hordozóként foszfáttal pufferolt konyhasó-oldatot (PBS) fecskendezünk, i.p. A krónikus EAE modellben (Biozzi egér) a hordozóval kezelt csoportban az akut betegség előfordulása 90 %-os, és a neurológiai tünetek az EAE előidézése utáni 14. napon jelentkeznek. Fúziós fehérjével történő előkezelés hatására (7 mg/kg i.p., a kísérleti jegyzőkönyv szerint 3 naponként adagoljuk) a bénulást mutató állatok száma (az 5-pontos skála szerint 1-4 pontérték) a betegség akut fázisában [3/9] és visszaeső fázisában [1/7] a kontrolihoz [9/10, illetve 6/8] viszonyítva egyaránt csökken [lásd az 1. táblázatot és az 5. ábrát; az 5a. ábrán kontroll kísérletben tiszta konyhasó-oldattal (hordozó) végzett kezelést és az 5b. ábrán a fúziós fehérjével végzett kezelést mutatjuk be; az oszlopok a klinikai pontértéket jelzik és a görbe a testsúlyváltozást (g) mutatja]. Utólag elvégzett dózis-reakció teszt során a fúziós fehérjét (1-14 mg/kg, i.p.) a betegség előidézése után (10-30 nap) adagoltuk és kedvező eredményeket tapasztaltunk; a minimális hatékony dózis 7 mg/kg.

Ili, példa

Általános módszerek

Állatok, reagensek és seitvonalak

Belsőtenyésztésű Lewis patkányokat (testtömeg 120-150 mg) Charles RIVER WIGA (Sulzfeld, Németország) cégtől szereztünk be. Teljes agyból [Eylar et al., J. Methods Enzymol 32B, 323 (1979)] tengerimalac mielin alapfehérjét (MBP) izoláltunk. Az MBP encephalitogén pepiidet (Cl, 68-88 aminosav) a Peptide Products cégtől (Porton Down, Egyesült Királyság) szereztük be. Szarvasmarha S100p fehérjét a Sigma Chemical Co. cégtől (St. Louis, MO, USA), szereztük be. M.tuberculosis tisztított fehérje származékát (PPD) a Statens Seruminstitut Intézettől (Koppenhága, Dánia) szereztük be. Mielin oligodendrocita glikoproteinnel szembeni monoklonális antitestet [anti-MOG Mab 8-18C5, Schlüsener et al., J. Immunoi. 139, 4016 (1987)] hibridoma felülúszóból termeltünk és fehérje A-sepharozén (Sigma) tisztítottunk.

Immunizálás

Lewis patkányok hátsó talpába MBP-t (100 pg/patkány), Cl-t (50 pg/patkány) vagy S100p fehérjét (50 pg/patkány) immunizálunk. Az emulziókat 4 mg/ml M-tuberculosissal (H37Ra, Difco, Detroit, USA) kiegészített Freund-féle adjuvánsban (Gibco BRL/AG, Bázis, Svájc) készítjük el.

• · · · ·

Antigén-specifikus T-seitek

A jelen teszt során felhasznált T-sejtvonalak tengerimalac MBP-vel és/vagy Cl-el (F8, C1-C9, C1, LMBP) vagy szarvasmarha S1OOP fehérjével - nem-mielin kalciumkötő fehérje (LS1) - szemben specifikusak. Az antigén-specifikus T-sejtvonalak kialakításához két különböző jegyzőkönyvet alkalmazunk. Az immunizálás után 10 nappal popliteális, inguinális és para-aorta nyirokcsomókból egyetlen sejtszuszpenziót készítünk. A sejteket 10⁷ sejt/ml (5 ml, Petri-csésze) és antigén (10 pg/ml) koncentráció mellett tenyésztve T-sejtvonalakat (LS1, C1, LMBP) hozunk létre, vagy alternatív módon sorozathigitással nagyszámú pauciklonális T-sejtvonalat készítünk (F8, C1-C9). Utóbbi esetben nyirokcsomó sejtszuszpenziókat 96-mélyedéses kerekfenekű mikrotiter lemezeken tenyésztünk; a sejtszám 2x10⁵ - 100 sejt/mélyedés. A sejteket antigénnel kiegészítjük és antigén sejtforrásként (APC) syngeneikus csecsemőmirigysejteket besugározzuk (4000 rád). A végső sejtszám 2 x 10⁵ sejtmélyedés, L-aszparaginnal (36 mg/ml), L-glutaminnal (2 mM), nátrium-piruváttal (1 mM) nem-esszenciális aminosavakkal (1 térfogat/térfogat %), penicilinnel (100 E/ml), streptomicinnel (100 mg/ml; Gibco) és autolog patkányszérummal (1 %) dúsított Eagle-táptalajban (EA). A táptalajt 72 óra múlva eltávolítjuk és a visszamaradó T-sejteket IL-2-el kiegészített táptalajban további 7-10 napon át szétterítjük. A T-sejteket ezután 2 x 10⁵ besugárzott APC jelenlétében antigénnel újra ingereljük. A tenyészetek vizuális megfigyelése után a pozitív növekedésű tenyészeteket IL-2 jelenlétében szétterítjük. Limfoprep-gradiens érintkezési felületéről (sűrűség 1,077 g/ml, Nycomed Pharma AS, Oslo, Norvégia) törzstenyészetekben kitenyésztett aktivált blasztoid limfocitákat gyűjtünk össze. A pihenő T-sejteket ezután besugárzott APC jelenlétében újra ingereljük (T-sejt: csecsemőmirigysejt arány = 1:30). A szaporítási ciklust az IL-2-tartalmú táptalajban, valamint az antigénnel + APC-vel végzett újraingerlést ezután addig ismételjük, amíg stabil T-sejtvonalakat nyerünk.

• · · ·

Specifikusság teszt

A T-sejt specifikusság értékelésére standard T-sejt burjánzásos tesztet alkalmazunk. T-sejteket (2 x 10⁴/ml) laposfenekű mikrotiter lemezekben (200 pg/mélyedés), APC (6 x 10⁵/ml) és MBP, C1 vagy S100p (20 pg/ml) releváns antigén, PPD (10 pg/ml) nem-releváns antigén és ConA (2,5 pg/ml) jelenlétében újraingereljük. A sejttenyészeteket 72 óra múlva összegyűjtjük, majd 1 pCi/mélyedés triciált timidinnel (³H-dT; 2 Ci/mmól; Amesham-Buchler,

Braunschweig, BRD) 16 órán át pulzáljuk. A radiojelzett sejteket üvegszálas szűrőn összegyűjtjük, majd a mosott és szárított szűrőkön levő radioaktivitást Mátrix 96 számlálóval mennyiségileg meghatározzuk (Canberra-Packard, Frankfurt, BRD).

Aktív EAE

Aktív EAE-t patkányon MBP-vel vagy Cl-el végzett immunizálás után indukáljuk. A testsúlyt és a klinikai pontértéket naponta klinikai megfigyeléssel nyomonkövetjük. A klinikai betegséget az alábbi skála segítségével értékeljük: 0=normális; 1=farok ernyedtség; 2=paraparézis esetlen járásmóddal; 3=hátsó végtag bénulása; 4=hátsó és elülső végtag bénulása; 5=elhullás. A tesztet vakpróbával végezzük el, azaz a megfigyelő a jegyzőkönyvet nem ismerte.

Passzív EAE

Passzív EAE-t syngeneikus patkányokon indukálunk, frissen antigén-aktivált T-sejtblasztok (5-7 x 10⁶/patkány) i.p. befecskendezése után. Ha a EAE indukálásához S100p specifikus T-sejteket használunk, a patkányok 10⁷sejtet, majd a sejtátvitel utáni 5. napon egyetlen dózisban Mab 8-18 C5-t (3-5 mg/patkány) kapnak. A testsúlyt és a klinikai pontszámot a fentiek szerint naponta ellenőrizzük. Az állatokat megfelelő időpontokban leöljük, majd a szokásos központi és perifériás ideghisztológiai vizsgálathoz felhasználjuk.

EaE kezelése

Aktívan vagy passzívan indukált EAE-t 10 mg/kg fúziós fehérje (lásd

I. példa) többszöri vagy egyszeri intraperitoniális befecskendezésével kezelünk.

FACS analízis

Egér anti-patkány T-sejt-specifikus monoklonális antitesteket (MAb) pan-T (W 3,13), CD4 (W 3,25), CD8 (OX-8), ap-TcR [R73, Hünig et al., J. Exp. Med. 169 73 (1989)] hibridoma felülúszókból fehérje G-sepharozon (Sigma, Taufkirchen, Németország) tisztítunk vagy a Camon cégtől (Wiesbaden, Németország) szerzünk be. TcR Vp isotipusspecifikus MAbs B73 (V 8,5) esetében G101 (Vp 10), és R78 (Vp 8,2), lásd Torres-Nagel, Immunogenetics 37, 305 (1993). A specifikus MAb-k jelzésének detektálásához DTAF-jelzett F (ab') 2 kecske anti-egér IgG-t (H+L lánc) fragmenseket alkalmazunk. Az életképes sejtek immunofluoreszcenciáját - propidium-jodátot kizárva (10 pg/ml) Sigma) - FACScan (Becton, Dickinson, Heidelber, Németország) segítségével mérjük.

111.1. példa

A fúziós fehérje hatása aktív kísérleti autoimmun encephalomyelitisre (EAE)

Ez a kísérleti modell a patogenézis viszonylag széles spektrumát felöleli, beleértve az autoagresszív T-sejtek in vivő aktiválását és a betegség különböző gyulladásos szakaszait, a központi idegrendszeren belül. A betegség azonban általában csak perivaszkuláris beszűrődésekre korlátozódik és nem jár együtt a primer nagymértékű demielineződéssel.

··· · a

« · · »· · · • *·

Lewis patkányokból álló csoportokat (n=3) C1 pepiiddel immunizálunk, amely a tengerimalac MBP encephalitogén tartományát Lewis-patkányok számára a 68-88 aminosavtól összeköti. A következő 8 napon valamennyi patkány súlygyarapodást mutat (6. ábra), majd a testsúlygörbe a 9. naptól kezdődően ellaposodik. A 9. naptól kezdődően a nem-fuziós fehérjével kezelt kontrollcsoport gyors súlyveszteséget mutat, előbb a farok elernyed, majd a hátsó végtag kifejezetten elgyengül és a szőrzet felborzolódik. Az egyensúlyozási reflex részleges elvesztését és inkontinenciát is megfigyeltünk. A betegség ezen klinikai jelei a 16. napig tartanak, ezután a patkányok állapotának helyreállása megkezdődik és az állatok súlyukat visszanyerik. A fúziós fehérje i.p. befecskendezésével kezelt patkányok esetében a testsúly görbe a 9. naptól kezdődően ellaposodik, azonban a kezelés hatására a klinikai tünetek súlyossága drámai módon csökken. Az állatok összességében normális klinikai viselkedést mutatnak. Mindössze a faroktonicitás enyhe részleges elvesztését figyeltük meg, amely a 13. napon kezdődött és további növekedés nélkül 2-3 napon át tartott.

III.2. példa

Fúziós fehérje hatása T-sejt által közvetített átvitt EAE-re (tEAE)

Ezen állatmodell alapjául MBP-peptid immunizált patkányokból nyert T-limfociták szolgálnak. A sejteket kinyerjük és in vitro antigén specifikus vonalként tároljuk. Jelölésük CD4⁺, CD8‘, TcR νβ8.2⁺, MHC-II osztályú korlátozott T-sejtek, amelyek in vivő normál naiv recipiensekbe átvive előre megjósolható és reprodukálható módon EAE indukciójára képesek. Az aktív modellhez hasonlóan a tEAE-t demielineződéssel nem jellemezzük, hanem az EAE recirkulációs és gyulladásos effektor fázisára összpontosítunk, beleértve a T-sejtek és véragygát között lejátszódó patogén közrehatásokat.

Lewis patkányokból álló csoportokat (n=3) C1-specifikus T-sejtekkel (C1-C9) passzívan kezelünk. A kontrollcsoportot nem kezeljük fúziós fehérjével (7. ábra). A kontrollcsoport állatain a tEAE tipikus súlyos jelei fejlődnek ki, amelyeket a sejtátvitel utáni 2. nappal kezdődően súlyos testsúly-csökkenés kisér. A klinikai

9 jelek kialakulása a 2. nap után gyorsan megkezdődik és az aktív EAE kezeléshez hasonlít. Az állatok állapota a 6. nap körül áll helyre. A három különböző időpontban fúziós fehérjével kezelt patkányok a 3. nappal kezdődően csak csekély súlyveszteséget mutatnak. A klinikai jelek azonban nagymértékben csökkennek és csupán a 3-6. napon részleges faroktonicitáselvesztést figyeltünk meg.

III.3. példa

A fúziós fehérje hatása transzfer kísérleti autoimmun panencephalomyelitisre (tEAP)

Ezen modell szerint immunizált patkányokból leszármaztatott δ100β specifikus T-sejtek gyulladásos sérüléseket közvetítenek a teljes központi idegrendszeren, gerincagyon, szemidegen, retinán és uvean keresztül. Ezenkívül, a humán sclerosis multiplexhez (MS) hasonlóan, a szemek általában retinális periphelebitist mutatnak. A celluláris beszűrődéseket perivaszkulárisan figyeljük meg, azonban a környező parenchynben általában kevesebb ED1⁺ makrofág van jelen, mint az MBP által előidézett EAE esetében. Csupán enyhe klinikai jeleket (pl. testsúlycsökkenés) figyeltünk meg. Mab 8-18C5 befecskendezése után súlyosabb klinikai állapot alakul ki [Linington et al., J. Immunoi. 23. 1364 (1993)]. A beszűrődések körül hisztológiailag nagy összefüggő demielineződési gócok vannak jelen, amelyek összekapcsolják a jelen modellt a humán MS bizonyos eseteivel.

Lewis patkányokból álló csoportokat (n=3) S1OO0 fehérje specifikus T-sejtekkel (LS1) passzívan transzferálunk. Ezek a sejtek az idegrendszerben súlyos gyulladásos választ indukálnak, amely azonban naiv syngeneikus recipiensekben csupán minimális neurológiai diszfunkciót mutat (8. ábra, # 1-3.). A klinikai jelek azonban felerősödnek, mihelyt a patkányok a sejttranszfer utáni 5. napon anti-MOG monoklonális antitesteket kapnak (8. ábra, # 4-6.). Az összes patkányon a faroktonicitás 48 órán át teljesen megszűnik. Ezzel szemben a Mab 8-18C5 mellett fúziós fehérjével kezelt patkányok klinikai tüneteket egyáltalán nem mutatnak és teljesen normálisan viselkednek (8. ábra, # 7-9.).

* · · · · · «« · φ • ··· · · « ...

.:. ···· · · ·

Szabadalmi igénypontok

Claims

1. Humán p55- vagy p75-TNF-receptor valamely oldható részét és humán immunoglobulin nehéz vagy könnyű láncának konstans tartományait teljesen vagy részben tartalmazó kimer TNF megkötő fehérje vagy gyógyászatilag alkalmas sói felhasználása autoimmun betegségek kezelésére szolgáló gyógyászati készítmény előállítására.

2. Az 1. igénypont szerinti felhasználás, amelynél az autoimmun betegség sclerosis multiplex.

3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti felhasználás, amelynél a kimer TNF megkötő fehérje a humán p55-TNF-receptor oldható részét tartalmazza.

4. Az 1.-3. igénypontok bármelyike szerinti felhasználás, amelynél a kimer TNF megkötő fehérje humán immunoglobulin - pl. IgG, IgA, IgM vagy IgE valamennyi tartományát tartalmazza, kivéve a nehéz lánc konstans régiója első tartományát.

5. A 4. igénypont szerinti felhasználás, amelynél a humán immunoglobulin IgG, előnyösen lgG1 vagy lgG3.

A bejelentő helyett a meghatalmazott:

wr. iot. -akasztó

Ügyved

1093 Koyaktáru. 24.1. 1l/_a.

, ^0TP számlasrám; 11705008-2OT 45419

KÖZZÉTÉTELI

PÉLDÁNY

1. ábra

9/1

Klinikai pontszám

Idő (napok)

Kontroll

-·- Fúziós szerkezet 10 rng/kg IP

-A— Fúziós szerkezet 5 mg/kg IP _ Fúziós szerkezet 1 mg/kg IP (*) P< . 0:

(##) P< . 0 1 ür. Tóth-lJrbán László ___Jigyvéd

1093 Budait Közraktár u^/24.1. 11/a. OTP számlásaim- 11705008-20145410 • · · · • · · ·

Ifcp't- KÖZZÉTÉTELI

PÉLDÁNY

2. ábra

Testtömeg (g)

Kontroll —·— Fűz i ó s —A— Fúziós __ Fűz i ós szerkezet 10 mg/kg IP szerkezet 5 mg/kg IP szerkezet 1 mg/kg IP lútft-üJrbán László ügyvéd

1093 Budatí^pCöi:raktár u. 24.1. 11/a. °TP számlaszáirr 117O5008-20145419 • · · ·

KÖZZÉTÉTELI

PÉLDÁNY • · · ·

9/3

3. ábra

Klinikai 2.0— pontszára j í

2.5-j0.0-Γ

-0.5-t

Θ 3 10 11 12 13 14 :5 16 17 IS 19 20

Mő (napok') * Kontnoll · Fúziós szerkezet * P<.05 ügyvéd

1093 „24. I. 1! ,».

. íaoszám: 4146205(/2-43 OTP számlaszám: 11705008-20,145419

KÖZZÉTÉTELI

PÉLDÁNY «ογ » · · · »·· ·· · ··· ······ · « ······ · · ···

9/4

4. ábra

Testtömeg (g)

1S5-T

140 —

Idő (napok)

-— Kontroll

Kuziós szerkezet x P<.05 *** P<.00l

Líí. m «j-íjji-í ϊ,/!

-y—ügyvéd

1093 BudaX.24.1. Il/a. OTP száminsrónv 11705008-^0145419

KÖZZÉTÉTELI

PÉLDÁNY • · íjiií.1«í«4i, Oz^aktánuz J4.1.,) 1/a. OTP száWaatóm: 1.1705008-20 ,U< * ’'

KÖZZÉTÉTELI

PÉLDÁNY • · ♦ · ·

9/6

5a. ábra

Stuaents i-test: o<0.05 Hanksum: ~ p< 0 1

Student t-teszt Rangsor összeg

Dr. Tóth-Urbán László 1093 Buda^/Közraktár u. 24.1. 11/a. OTP számlaszám: 1170500S-20.l4«4in

KÖZZÉTÉTELI

PÉLDÁNY

6. áfera

a) t—J :o

EH

180

160

140

1S0

160

140

Klinikai pont mnunizálás utáni napok τ crauniz álás Fúziós szerkezet : 50 pg C1 s.c, (#1-6) : 10 mg/kg day 2,7,8,9.10 i.p.(# 4-6) ür. Tóth-Vrbán ügyvéd

1093 Bud^est, ^.özraktáru. 24.1. 11/a,

OTP «zámlasróm •11705008-20.14541

KÖZZÉTÉTELI

PÉLDÁNY

7. ábra

Testtömeg (gj

Sejt transzfer utáni napok ε

N ffi

-P

Ö o

PU •H

VÓ

Ö •H

Sejt

Fúziós transzfer szerkezet

6 x 10 ⁶ I.D.. Rat 1 - 6 10 mg/kg l.p.. day 0. 2,

3; Rat >t 4 iíf. í'óíL-tlihá/1 jigyvéd

1093 BudSfcstji^özraktár u. 2_Ζ4· I- 11 iOTP sJ&mlaszánr 11705008-00’ i - · ’ «OM