CZ283219B6

CZ283219B6 - Použití chimerního proteinu vázajícího TNF pro výrobu farmaceutického prostředku k ošetřování autoimunních nemocí

Info

Publication number: CZ283219B6
Application number: CZ97193A
Authority: CZ
Inventors: Robert Frederick Geoffrey Booth; Werner Lesslauer
Original assignee: F. Hoffmann-La Roche Ag
Priority date: 1994-07-22
Filing date: 1995-07-15
Publication date: 1998-02-18
Also published as: PL318501A1; JPH09508140A; HUT76666A; AU3111995A; FI970247A0; NO970264D0; CA2195665A1; BR9508419A; FI970247A; EP0772449A1; NO970264L; WO1996003141A1; CZ19397A3

Abstract

Použití chimerního proteinu vázajícího TNF, který obsahuje rozpustný podíl lidského p55-TNF receptoru nebo p75-TNF receptoru a všechny nebo část konstantních domén těžkého nebo lehkého řetězce lidského imunoglobulinu nebo jeho farmaceuticky vhodných solí pro výrobu farmaceutického prostředku k ošetřování autoimunních nemocí zvláště multiple sclerosis.ŕ

Description

Vynález se týká použití chimerního proteinu vázajícího TNF, který obsahuje rozpustnou část lidského p55- nebo p75-TNF receptorů a všechny nebo část konstantních domén těžkého nebo lehkého řetězce lidského imunoglobulinu nebo jeho farmaceuticky vhodných solí pro výrobu farmaceutického prostředku k ošetřování autoimunních nemocí, které jsou často spojeny se zánětlivými procesy, jako jsou například rheumatoidní arthritis, juvenilní nástup diabetes mellitus typ I, systemický lupus erythematosus, thyroiditis, zvláště multiple sclerosis.

Dosavadní stav techniky

Multiple sclerosis (MS) je zánětlivé onemocnění centrálního nervového systému (CNS), při čemž se zdá, že pochází z autoimunních poruch s komponenty myelinu jako štítem. Domněnku o autoimunním původu MS podporuje skutečnost, že myelinové bazické proteinové (MBP) reaktivní T lymfocyty se nacházejí u lidí, a které jsou fenotypicky podobné MBP specifickým encefalitogenickým T buňkám v experimentální alergické encephalomyelitis (Sun. Acta. Neurol. Scand. Suppl. 142, str. 1 až 52, 1993, Voskuhl a kol., Autoimmunity 15, str. 137 až 143, 1993) a je zřejmé, že frekvence MBP reaktivních T buněčných klonů u MS pacientů je zvýšená (Allegretta a kol., Science 247, str. 718 až 721, 1990). Kromě toho byly vyvinuty různé experimentální modely autoimunní encephalomyelitis zvířat, které napodobují patofysiologické aspekty lidské MS (jak bude níže uvedeno). Jsou však faktory životního prostředí kontrolující MS výskyt jakožto doklad existence geograficky dobře definovaných endemických oblastí.

MS je charakterizována ohniskovou akumulací zánětlivých buněk, edemem a demyelinací v CNS tkáni. Je starým poznatkem, že při autopsii se zjišťuje více ohniskových lézí než by se předvídalo z klinického stavu.

Zpravidla léze startují jako perivenulámí infiltrát mononukleámích buněk s následujícím edemem. Infiltrované buňky zprostředkovávají selektivní destrukci myelinových obalů a přitom nechávají asony nedotčené. Při dalším postupu vede astrocytová proliferace ke glyotické jizvě, ktak zvané MS destičce o průměru 0,1 až několik cm. Klinický průběh MS může vykazovat intervaly s odezněním nemoci různého trvání nebo nemoc může chronicky postupovat, což naznačuje že patofysiologické procesy podléhají heterogennímu řízení.

Klinické studie patologie dokládají přítomnost TNF produkujících buněk v MS lézích. Většina TNF positivních buněk je morfologicky klasifikována jako reaktivní vláknité astrocyty a dvojí imunozabarvující pokusy potvrdily, že většina reaktivních buněk jsou astrocyty, přičemž zbytkem jsou monocyt/makrofágy (Hofman a kol., J. Exp. Med. 170, str. 607 až 612, 1989). Nezávislá studie potvrdila pozitivní imunoreaktivitu pro TNF v atrocytech a monocytech v MS destičkách a zkoumala také lymfotoxinovou (LT) imunoreaktivitu. S překvapením kromě očekávaných lymfocytů byly mikrogliální buňky zjištěny jako positivní pro LT (Selmaj a kol., J. Clin. Invest., 87, str 949 až 954, 1991 A). Kromě toho výzkumy cytokinové mRNA exprese v MS lézích při in šitu hybridizaci vykazují, že vysoké hladiny TNF, IL-6 a INF-gama (ajiného cytokinu) mRNA jsou obsaženy ve všech zánětlivých perivaskulárních lézích. Hladiny TNF, ILL a IFN-gama mRNA jsou zvláště vysoké v lézích, které mají trvanlivou demyelinací (Woodroofe a Cuzner. Cytokine 5, str. 583 až 588, 1993).

Přímé cytotoxické působení TNF nikoliv však IFN-gama. IL-2, T-buněčných supematantů nebo antigalaktocerebrosidního antisera na oligodendrocyty v myelinovaných kulturách myší míšní

- 1 CZ 283219 B6 tkáně byly popsány (Selmaj aRaine. Ann. Neurol. 23, str. 339 až 346, 1988). Ošetření TNF těchto kultur způsobuje oligodendrocytovou nekrosu, některá nervová vlákna vykazují postupující demyelinaci.

Koncentrace TNF v seru a v mozkomíšní kapalině (CSF) MS pacientů byla změřena četnými výzkumníky. Existuje souhlas v tom, že významný procentový podíl MS pacientů vykazuje zvýšený obsah TNF v CSF a mnohem méně v seru. Koncentrace TNF nejsou v přímém vztahu k CSF buněčnému obsahu, což naznačuje, že obsah CSFTNF může odrážet TNF produkci v MS lézích a kolem nich, zvláště se zřetelem na časté paraventrikulámí umístění lézí.

Studie na zvířatech v experimentální encefalomyelitis (EAE) významně objasnily názor na autoimunní původ a na úlohu cytokinů v lidské MS. EAE je navozena buď aktivní senzitizací myelinovými antigeny, nebo adoptivním transferem specifických T buněčných klonů do syngeneického citlivého hostitelského zvířete. Zjištění, že experimentální navození imunní odezvy na myelinové antigeny vede k onemocnění s podobností s lidskou MS je důležitý důkaz pro autoimunní původ MS. Úloha TNF ve vytvoření vyvolávacích mechanismů, zodpovědných za charakteristickou patologii nemoci, je doložena protektivním působením anti-TFN monoklonální pritilátkové terapie (Ruddle a kol. , J. Exp. Med, , 172, str. 1193 až 1200, 1990, Selmaj a kol. , Ann. Neurol., 30, str. 694 až 700, 1991b). Eliminace buněk, produkujících TNF (a jiné cytokiny), podobně potlačuje EAE (Huitinga a kol., J. Exp. Med., 172, str. 1025 až 1033, 1990). Další podporou pro významnou úlohu TNF v EAE je nález, že encepalitogenicita v adoptivním transferu silně závisí na TNF a LT produkční schopnosti různých T buněčných klonů, což vše je pozorováno na stejném MBPM peptidu (Powell a kol., Intem. Immunol., 2, str. 539 až 544, 1990).

Podstata vynálezu

Podstatou vynálezu je použití chimemího TNF vazebného proteinu, který obsahuje rozpustný podíl lidského p55-TNF receptoru nebo p75-TNF receptoru a všechny nebo část konstantních domén těžkého nebo lehkého řetězce lidského imunoglobulinu nebo jeho farmaceuticky vhodných solí pro výrobu farmaceutického prostředku k ošetřování autoimunních nemocí.

Použití rozpustných podílů lidského p55-TNF-receptoru ap75- TNF-receptoru pro ošetřování experimentální encefalomyelitis (EAE) krys je již popsáno v evropském patentovém spise číslo 512528. Neexistují však dosud žádné údaje o ochranném působení chimemích proteinů vázajících TNF a jejich farmaceuticky vhodných solí. Proto použití chimemího proteinu vázajícího TNF, který zahrnuje rozpustný podíl lidského p55-TNF-receptoru a p75TNFreceptoru a všech nebo části konstantních domén těžkého nebo lehkého řetězce lidského imunoglobulinu nebo jeho farmaceuticky vhodné soli pro přípravu farmaceutického prostředku pro ošetřování autoimunních nemocí, například multiple sclerosis, zvláště kdy chimemí protein vázající TNF obsahuje rozpustný podílů lidského p55-TNF-receptoru je tedy podstatou tohoto vynálezu. Výhodné provedení vynálezu je takové, kdy se používá chimemího proteinu vázajícího TNF obsahujícího všechny domény s výjimkou první domény konstantní oblasti těžkého řetězce lidského imunoglobulinu, což znamená, že rozpustný podíl lidského p55-TNF-receptoru je fúzován na C zakončení k závěsné oblasti imunoglobulinového těžkého řetězce. Takovým mimunoglobulinem může být IgG, IgA, IgM nebo IgE, zvláště IgG podobně jako IgGl nebo lgG3. Výrazem rozpustný podíl lidského p55-TNF-receptoru a p75-TNF-receptoru se zde vždy míní buď kompletní extracelulámí doména jednoho z těchto receptorů, nebo jejich část, která stále ještě váže lidský TNF, například v případě p55-TNF-receptorové extracelulámí domény postrádající prvních 12 N-koncových aminokyselin.

Vynález se také týká způsobu ošetřování autoimunních onemocnění savců, při kterém se savcům podává farmaceuticky účinné množství chimemího proteinu vázajícího TNF nebo jeho soli,

-2CZ 283219 B6 shora definovaného, čímž se zmírňuje působení takových autoimunních onemocnění, zvláště v případech, kdy je autoimunním onemocněním multiple sclerosis.

Způsob přípravy chimemích proteinů vázajících TNF používaných podle vynálezu je podrobně popsána v evropské zveřejněné přihlášce vynálezu číslo EP 417563 a také ji popsal Loetscher a kol. (J. Biol. Chem. 266, str. 18324 až 18329, 1991). Kromě toho proteiny vázající TNF nebo jejich části podle následující patentové literatury se mohou použít pro přípravu takových chimemích proteinů vázajících TNF: EP 308378, EP 422339, GB 2 218101, EP 393438, WO 90/13575, EP 398327, EP 412486, WO91/03553, EP 418014, JP 127, 800/1991, EP 433900, USP 5 136021, GB 2 246569, EP 464533, WO 92/01002, WO 92/13095, WO 92/16221, EP 512528, EP 526905, WO 93/07863, EP 568928, WO 93/21946, WO 93/19777, EP 417563 a WO 94/06476.

Zde používaný výraz chimemí protein vázající TNF zahrnuje také proteiny, ve kterých kterákoliv aminokyselina imunoglobulinového podílu nebo podíl vázající TNF se může vypustit nebo nahradit jednou nebo několika aminokyselinami nebo jedna nebo několik aminokyselin se přidá pokud část vázající TNF stále váže TNF a imunoglobulinové podíly vykazují jednu nebo několik svých charakteristických vlastností. V případě, že imunoglobulinový podíl obsahuje všechny domény včetně závěsné oblasti s výjimkou první domény konstantní oblasti těžkého řetězce, taková závěsná oblast nemusí mít prvních pět N-koncových aminokyselin. Takové muteiny chimemího proteinu vázajícího TNF se mohou připravovat o sobě známými způsoby v oboru, jakoje popsal například Sambrook a kol. (Molecular Cloning, druhé vydání, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York) nebo jako jsou popsány v alespoň jednom ze shora uvedených patentových spisů.

Kromě toho se chimemí protein vázající TNF podle vynálezu také může používat ve své modifikované formě, například kopulovaný na chemickou jednotku bez změny své základní biologické aktivity. Výhodnou a dobře známou modifikací je kopulace na polymery rozpustné ve vodě, jako jsou například polyethylenglykoly nebo polypropylenglykoly o širokém oboru molekulových hmotností například 5000 až 20 000 daltonů. Tak se získají chráněné proteiny, které mohou být v podstatě neimunogenní. Některé modely kopulace polymerů na proteiny prostřednictvím různých spojovníků jsou ze stavu techniky známy a jsou popsány v literatuře (například Perspectives in Bioconjugate Chemistry, C. F. Meares. Američan Chemical Society. Washington 1993 a zvláště americký patentový spis číslo 4 179 337).

Kromě toho chimemí proteiny vázající TNF podle vynálezu mohou být ve formě farmaceutických vhodných solí. Soli karboxylové skupiny se mohou vytvářet o sobě známými způsoby a v úvahu přicházejí soli anorganické, například sodné, vápenaté, amoniové, železité nebo zinečnaté, avšak také soli s organickými zásadami, jako například s aminy jako s triethanolaminem, s argininem nebo s lysinem, s piperidinem a s prokainem. Adiční soli s kyselinami zahrnují například soli s minerálními kyselinami, například s kyselinou chlorovodíkovou nebo sírovou a soli s organickými kyselinami například s kyselinou octovou nebo šťavelovou.

Chimemí protein vázající TNF pro účely vynálezu se s výhodou podává parenterálně vstřikováním, jakkoliv jiné účinné formy podání, například intraartikulámí vstřikování nebo transdermální iontoforéza jsou rovněž možné. Výhodným nosičem je fysiologický slaný roztok, mohou se však použít rovněž jiné farmaceuticky vhodné nosiče. Primární rozpouštědlo v takovém nosiči může být buď vodné, nebo nevodné povahy. Kromě toho může nosič obsahovat jiné farmaceuticky vhodné excipienty pro modifikaci nebo udržování hodnoty pH, osmolarity, viskozity, čirosti, barvy, sterility, stability, míry rozpuštění nebo vůně formulace. Podobně nosič mů že obsahovat ještě jiné farmaceuticky vhodné excipienty pro modifikaci nebo udržení stability, míry rozpouštění, uvolňování, nebo absorpce chimemího proteinu vázajícího TNF. Takovými excipietny jsou látky běžně používané pro formulaci dávek pro parenterální

- j CZ 283219 B6 podávání buď v jednotkové, nebo v několikajednotkové formě. Hotový terapeutický prostředek se může uchovávat ve sterilní fiole jako roztok, suspenze, gel, emulze, pevná látka nebo v dehydratované formě, například ve formě lyofilizovaného prášku. Takové prostředky se mohou uchovávat ve formě přímo k použití nebo ve formě vyžadující rekonstituci bezprostředně před podáním. Farmaceutické prostředky se uchovávají při nízké teplotě alespoň 4 °C, s výhodou při teplotě -70 °C. Je také výhodné uchovávat takové farmaceutické prostředky a podávat je při hodnotě blízké fysiologické hodnotě pH.

Možné dávkování při ošetřování multiple sclerosis může být přibližně 0,001 až 5,0, s výhodou 0,1 až 5,0 a ještě výhodněji 0,1 až 2,0 mg na kg tělesné hmotnosti pacienta na 1 až 4 týdny podávané v jedné dávce a výhodněji v dávce přibližně 0,1 až 2,0 mg/kg tělesné hmotnosti pacienta na 1 až 4 týdny a podávat v jedné dávce chimemí protein vázající TNF, který zahrnuje rozpustný podíl lidského p55-TNF receptoru a všechny konstantní domény nebo jejich část těžkého nebo lehkého řetězce lidského imunoglobulinu nebo jeho farmaceuticky vhodné soli, přičemž s výhodou takový chimemí protein vázající TNF obsahuje všechny domény s výjimkou první domény konstantní oblasti těžkého řetězce lidského imunoglobulinu jako je například IgG, IgA, IgM nebo IgE, přičemž nejvýhodněji je lidským imunoglobulinem IgG, zvláště IgGl nebo IgG3. Frekvence dávky a optimální dávka závsí na farmakologických parametrech chimemího proteinu vázajícího TNF v použitém farmaceutickém prostředku.

Bez zřetele na způsob podání se specifická dávka vypočítává podle přibližné hmotnosti pacienta. Přesnosti výpočtu ke stanovení ke stanovení vhodné dávky pro ošetření každým shora uvedeným farmaceutickým prostředkem jsou pro pracovníky v oboru obvyklé.

Vynález objasňují, nijak však neomezují následující příklady a připojené obrázky.

Seznam obrázků

Na obr. 1 je střední klinická známková hodnota při 10 zvířatech v každé skupině ode dne 10 do dne 21. Na ose x jsou dny, na ose y klinická stupnice. Jednotlivé čáry mají tento význam:

—— kontroly —·— fuzní konstrukt 10 mg/kg IP —A— fuzní konstrukt 5 mg/kg IP —x— fuzní konstrukt 1 mg/kg IP (*) P<.05 (xx)P<.01

Na obr. 2 je odpovídající střední tělesná hmotnost ode dne 8 do dne 21. Na ose x jsou dny, na ose y tělesná hmotnost. Jednotlivé čáry mají tento význam:

—— kontroly —·— fuzní konstrukt 10 mg/kg IP —Á— fuzní konstrukt 5 mg/kg IP —x— fuzní konstrukt 1 mg/kg IP

-4 CZ 283219 B6

Na obr. 3 je střední klinická hodnotící známka 10 zvířat ode dne 10 po den 20 s p-hodnotami stanovenými U-testem Mann

Whitney,

Na ose x jsou dny, na ose y klinická stupnice. Jednotlivé čáry mají tento význam:

—— kontroly —·— fuzní konstrukt *P<.05

Na obr. 4 je odpovídající střední tělesná hmotnost s p-hodnotami stanovenými nepárovým Τ'testem.

Na ose x jsou dny, na ose y tělesná hmotnost. Jednotlivé čáry mají tento význam:

——kontroly —·—fuzní konstrukt xP<05 mmxP<.001

Na obr. 5 výkres 5a se týká kontrolního pokusu pouze s čistým solankovým roztokem (nosič) a výkres 5b situace s fuzovým konstruktem, přičemž sloupky udávají klinické hodnoty stupnice a křivka je indikátorem pro změnu tělesné hmotnosti (v g]). Na ose xjsou dny.

Studentův t-test: *p<0,05, Taank suma = p<0, 1

Na obr. 6 je vliv fuzového konstruktu na aktivní experimentální autoimunní encefalomyelitis (EAE), vývoj hmotnosti krys.

Imunizace: 50 gg Cl s, c. (#1-6)

Fuzní konstrukt: 10 mg/kg den 2, 7, 8, 9, 10 i. p.(#4-6)

Na obr. 7 je vliv fuzového konstruktu na T buňkou zprostředkovaný tranfer EAE (tEAE). přenos buněk: 6 x 10⁶ i. p., krysa 1 - 6

Fuzní konstrukt: 10 mg/kg i. p. ,den 0, 2, 3, krysa #4-6

Na obr. 8 je vliv fuzového konstruktu na přenos experimentální autoimunní panencephalomyelitis (tEAP) krysy pasivně ošetřené βΙΟΟβ proteinovými specifickými T buňkami (obr. 8 #1-3), krysy po podání anti-MOG monoklonální protilátky (obr. 8 # 4-6), krysy, kterým byl vedle Mab-8-I8C5 fúzí podán také fuzový konstrukt (obr. 8, # 7 až 9).

Přenos buněk: 1x10⁷ LS1 (8100β-5ρεοΐΑ^^), den 0, krysa #1-9

Krysa # 1-3: jen LS1

Krysa # 4-6: a-MOG-Ab, den 5 (3 mg/krysa)

Krysa # 7-9: a-MOG-Ab, den 5, fuzní konstrukt 10 mg/kg, den 1, 3, 5

- 5 CZ 283219 B6

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Akutní EAE model (AHH/R krysy)

Samičky krysy AHH/R (Bloxham a kol., J. Pharmacol. Exp. Ter. 252, str. 1331 až 1340, 1990) se naočkují emulzí (0,05 ml) obsahující djuvant míchy morčete aFreundův kompletní adjuvant (1:1) obsahující Mycobacterium tuberculosis (Difco Laboratories. Detroit. MI, USA) (10 mg/ml) do plantemího povrchu obou zadních pacek. Zvířata se zváží a hodnotí se denně se zřetelem na neurologické příznaky podle čtyrbodové hodnotící stupnice (klinická stupnice) : 0 = normální, 1 = ochablý ocas, 2 = částečná paralyza zadní tlapky, 3 = plná paralyza zadní tlapky, 4 = tetraplegia. Skupinám krys se dávkuje konstrukt extracelulámí domény lidského p-55-TNFreceptoru (prvních 182 N-koncových aminokyselin receptoru) fúzovaných na závěsnou oblast lidského IgGgama 1 těžkého ře těžce a expresovaného do CHO-buněk (fuzový konstrukt) (i. p.) nebo jen fosfátem pufrovaný solankový nosič (PBS). Podání encefalitogenní suspenze u krys vede k nástupu neurologických symptomů (den 10) který následně vrcholí v den 14. Neurologické symptomy jsou provázeny výraznou ztrátou hmotnosti. Ošetření fuzovým konstruktem (1,5 a 10 mg/kg, i. p. , podáváno denně, postindukce EAE, dny 8 až 14) výrazně snižují symptomy EAE a změny tělesné hmotnosti způsobem závislým na dávce (obr. 1 ukazuje střední klinickou známkovou hodnotu při 10 zvířatech v každé skupině ode dne 10 do dne 21 a obr. 2 ukazuje odpovídající střední tělesnou hmotnost ode dne 8 do dne 21, p-hodnoty se stanovují U-testem Mann-Whitney [Statistical Methods in Biology. Bailey N. T.J. , Hodder a Staughton. London]). Ve druhé řadě zkoušek fuzový konstrukt 10 mg/kg, i. p.) podávaný po indukci v průběhu okna nemoci (den 8 až 20) opět výrazně snižuje symptomy EAE a změny tělesné hmotnosti až do dne 14 (obr. 3 ukazuje střední klinickou hodnotící známku 10 zvířat ode dne 10 po den 20 s p-hodnotami stanovenými U-testem Mann-Whitney [Statistical Methods in Biology. Bailey N. T.J. , Hodder a Staughton. London] a obr. 4 ukazuje odpovídající střední tělesnou hmotnost s p-hodnotami stanovenými nepárovým T-testem [Statistical Methods in Biology. Bailey N. T.J., Hodder a Staughton. London]).

Příklad 2

Chronický EAE model (myši Biozzi)

Inbrední Biozzi selekce 1 AB/H myši (Baker a kol., J. Neuroimmunol. , 28, str. 261 až 270, 1990) se udržují na standardní peletované dietě a vodě ad libitum. Samečci myši se naočkují subkutanně na břiše ve dvou místech 0,3 ml (celkem 0,6 ml) emulze obsahující 6,6 mg/ml vymražovaně sušené Biozzi míchy ve fosfátem pufrované solance (PBS) a 60 mg teplem usmrceného mycobacteria (Mycobacterium tuberculosis H 37Ra aM. butyricum [8:1], Difco Laboratories. Detroit. MI, Sp. St. a.) v 0,15 ml Freundova nekompletního adjuvantu (Baker a kol., J. Neuroimmunol., 28, str. 261 až 270, 1990). Injekce se opakuje po 7 dnech. Zvířata se zváží a hodnotí se denně se zřetelem na neurologické příznaky podle pětibodové hodnotící stupnice (klinická stupnice) : 0 = normální , 1 = zplihlý ocas, 2 = zhoršený napřimovací reflex (IRR) , 3 = částečná paralyza zadní tlapky, 4 = úplná paralyza zadní tlapky. 5 = smrt. Skupinám myší se dávkuje fuzový konstrukt (podle příkladu 1) (i. p.) nebo fosfátem pufrovaný solankový nosič. V případě chronického EAE modelu myš Biozzi vykazuje výskyt akutního onemocnění u skupiny ošetřené nosičem v 90 % s neurologickými symptomy projevujícími se 14. den po navození EAE. Předběžné ošetření fuzovým konstruktem (7 mg/kg,

i. p. dávkováno každé 3 dny v průběhu experimentálního protokolu) snižuje počet zvířat

-6CZ 283219 B6 vykazujících paralýzu (číslo 1 až 4 v pětibodové hodnotící stupnici) v průběhu jak akutní fáze (3/9) a návratu nemoci (1/7) ve srovnání s kontrolou (9/10 a 6/8) (Tabulka 1 a obr. 5, kde výkres 5a se týká kontrolního pokusu pouze s čistým solankovým roztokem (nosič) a výkres 5b situace s fuzovým konstruktem, přičemž sloupky udávají klinické hodnoty stupnice a křivka je 5 indikátorem pro změnu tělesné hmotnosti [v g]). V následné studii odezvy na dávku se fuzový konstrukt (1 až 14 mg/kg, i. p.) podává po navození nemoci (den 10 až 30), přičemž se rovněž pozoruje příznivé působení a minimální účinná dávka je 7 mg/kg.

io Příklad 3

Obecné způsoby

Živočichové, reagencie a buněčné linie

Inbrední krysy Lewis o hmotnosti 120 až 150 g se získají od organizace Charles River Wiga (Sulzfeld. Německo). Myelinový bázický protein (MBP) morčat se izoluje z celých mozků (Eylar a kol., J. Methods Enzymol. 328, str. 323, 1979). Cl, encefalitogenní peptid MBP (aminokyseliny 68 až 88) jsou obchodním produktem Peptide Products (Porton Down. Spojené 20 království). Hovězí SlOOp protein se získá od společnosti Sigma Chemical Co. (St. Louis. M0,

USA). Proteinový čistý derivát M. tuberculosis (PPD) se získá od organizace Statens Seruminstitut (Kopenhagen. Dánsko). Monoklonální protilátka proti myelin oligodentrocytovému glykoproteinu (anti-MOG Mab 8-18C5, Schlůsener a kol., J. Immunol. 139, str. 4016, 1987) se vyrábí z hydridomových supematantů a čistí se na proteinu kuliček A-sepharose 25 (Sigma).

Imunizace

Krysy Lewis se imunizují do zadních pacek buď MBP (100 pg/krysa), Cl (50 pg/krysa), nebo 30 S1003 (50 pg/krysa), proteinem emulgovaným v Freundově adjuvantu (Gibco BRL AG, Basilej.

Švýcarsko) kompletovaném 4 mg/ml M. tuberculosis (H37Ra. Difco. Detroit. Sp, st, a.).

Anrigenově specifické T buňky

T buněčné linie, použité při této studii, jsou specifické pro morčatový MBP a/nebo Cl (F8, ClC9, Cl, LMBP) nebo hovězí SlOOp protein, nemyelin, kalcium vázající protein (LS1). Použije se dvou různých protokolů pro stanovení antigenově specifických T buněčných linií. Deset dní po imunizaci se připraví suspenze jediné buňky z vyčerpaných podkoleních, tříselných a paraaortových lymfových nodů. Primárně imunizované buňky se buď kultivují za koncentrace 40 10⁷ buněk/ml (5 ml, petri misky) aantigenu (10 pg/ml) ke stanovení hmoty T buněčné linie (LS1, Cl, LMBP), nebo sériově zředěné k vytvoření velkého počtu pauciklonálních T liniových buněk (F8, C1-C9), V tomto případě suspenze lymfových nodových buněk se kultivují v 96 důlkových mikrotitrových destičkách s okrouhlým dnem za počtu buněk 2 x 10⁵ až 100 buněk/důlek. Buňky se doplňují antigenem aozářují se (4000 rad) syngeneické thymové 45 buňky jako zdroj buněk představujících antigen (APC) k dosažení konečného počtu buněk žxlO^/důlek v prostředí Eagle (EA) obohaceném L-asparaginem (36 mg/ml), L-glutaminem (2 mM), pyruvátem sodným (1 mM), neesenciálními aminokyselinami (1% objem/objem), penicilinem (100 J/ml), treptomycinem (100 mg/ml. Gibco) a autologovým krysím sérem (1 %), Po 72 hodinách se prostředí odstraní a zbylé T buňky se expandují po dalších 7 až 10 dní 50 v prostředí doplněném IL-2. T buňky se pak restimulují antigenem v přítomnosti 2 x 10’ ozářených APC. Po vizuálním hodnocení kultur se kultury pozitivní pro růst expandují v přítomnosti IL-2. Aktivované blastoidní lymfocyty, generované v kulturách, se oddělí od rozhraní Lmphoprepových gradientů (hustota 1,077 g/ml. Nycomed Pharma AS, Oslo. Norsko).

-7CZ 283219 B6

Zbylé T buňky se pak restimulují v přítomnosti ozářených APC (T buňky v poměru k buňkám thymu 1:30). Cyklus propagace v IL-2 obsahujícím prostředí arestimulace santigenem plus APC se pak opakuje, dokud se nevytvoří stabilní T buněčná linie.

Zkouška specificity

K hodnocení specificity T buněk se použije standardní zkoušky proliferace T buněk. T buňky (2x 10⁴/ml) se restimulují v mikrotitrových destičkách s plochým dnem (200 pg/důlek) v přítomnosti APC (6 x 10⁵/ml) a relevantních antigenů MBP, Cl nebo SlOOP (20 pg/ml) a nerelevantního antigenů PPG (10 pg/ml) aConA (2,5 pg/ml). Po 72 hodinách kultivace se buňky shromáždí, následuje 16 hodin pulsu s 1 pCi/důlek tritiovaného thymidinu (³H-dT, 2 Ci/mmol. Amesham-Buchler. Braunschweig. Německo). Radioaktivně značené buňky se shromáždí na filtrech ze skleněných vláken a radioaktivita na promytých a usušených filtrech se kvantitativně hodnotí čítačem matrix 96 (Canberra-Packard. Frankfurt. Německo).

Aktivní EAE

Aktivní EAE se navozuje v krysách po imunizaci MBP nebo Cl. Hmotnost a klinické hodnocení se monitoruje na denní bázi klinickou inspekcí. Klinická nemoc se hodnotí následovně stupnicí : 0 = normál, 1 = ochablost ocasu, 2 = paraparesis s nemotornou chůzí , 3 = paralyza zadních končetin, 4 = paralyza zadních a předních končetin, 5 = smrt. Studie se provádí slepou zkouškou. To znamená že pozorovatel nezná protokol.

Pasivní EAE

Pasivní EAE se navozuje v syngenních krysách po intraperitoneálním vstřiknutí čerstvých antigenem aktivovaných T buněčných blastů (5 až 7 x 10⁶/krysa). Jestliže se použijí SlOOp specifické T buňky k navození EAE podává se krysám 10⁷ buněk s následnou jednou dávkou Mab-8-18C5 (3 až 5 mg/krysa) pátý den po přenosu buněk. Hmotnost a klinické příznaky se monitorují denně, jak shora popsáno. Ve vhodné chvíli se krysy usmrtí a použijí se pro běžnou histologii centrálních a periferních nervů.

Ošetření EAE

Aktivně nebo pasivně navozená EAE se ošetřuje opakovaným nebo jedním intraperitoneálním vstřiknutím 10 mg/kg fuzového konstruktu (podle příkladu 1).

FACS analýza

Myší anti-krysové pro T buňky specifické monoklonální protilátky (MAb) pan-T (W 3.13), CD4 (W 3.25), CD8 (OX-8), a[3-TcR (R73, Hůnig a kol., J. Exp. Med. 169, str. 73, 1989) se oddělí od hybridomních supematantů na proteinových kuličkách G-sepharose (Sigma. Taufkirchen. Německo) nebo společnosti Camon (Wiesbaden. Německo), Pro TcR νβ isotypově specifické MAb 873 (V 8.5), G101 (VplO) a R78 (νβ 8.2) viz Torres-Nagel. Immunogenetics 37, str. 305 (1993). Značení specifických MAb se zjišťuje za použití DTAF-značených F (ab')2 fragmentů kozího protimyšího IgG (H+L řetězec). Imunofluorescence živých buněk s výjimkou propidiumjodátu (10 pg/ml. Sigma) se měří FACScan (Becton Dickinson. Heidelberg. Německo).

-8CZ 283219 B6

Příklad 3.1

Vliv fuzového konstruktu na aktivní experimentální autoimunní encefalomyelitis (EAE)

Tento model pokrývá poměrně široké spektrum pathogenese včetně aktivace autoagresivních buněk T in vivo a různé zánětlivé stavy onemocnění v centrálním nervovém systému. Avšak onemocnění se normálně omezuje pouze na perivaskulámí infiltrace a nesouvisí s primární demyelinací ve velkém měřítku.

Skupiny krys Lewis (n=3) se imunizují Cl peptidem, který má rozpětí encefalitogenní domény morčatového MBP pro krysy Lewis z aminokyseliny 68-88. U všech krys vzrůstá hmotnost pro následujících 8 dní (obr. 6) s následným vyrovnáním křivky hmotnosti od 9. dne. Počátkem devátého dne kontrolní skupina, neošetřená fuzovým konstruktem, vykazuje rychlou ztrátu hmotnosti s ochablostí ocasu následovanou výrazným oslabením zadních tlapek a zdrsnutím kožíšku. Pozoruje se také částečná ztráta napřimovacího reflexu a inkontinence. Tyto klinické znaky onemocnění jsou až do šestnáctého dne, kdy se krysy začínají zotavovat a začíná se obnovovat hmotnost. Krysy, které dostaly intraperitoneální injekce fuzového konstruktu, vykazují vyrovnání hmotnostní křivky od devátého dne, avšak ošetření vede ke dramatickému snížení závažnosti klinických symptomů. Celkem se klinicky chovají normálně. Pozoruje se pouze mírná částečná ztráta tonicity ocasu, ke které dochází třináctý den a trvá 2 až 3 dny, přičemž nevykazuje další vzrůst.

Příklad 3.2

Vliv fuzového konstruktu na T buňkou zprostředkovaný tranfer EAE (tEAE)

Základem tohoto modelu jsou T lymfocyty získané z MBP nebo MBP-peptidem imunizovaných krys. Buňky se ustaví a udržují se in vitro jakožto antigenové specifické linie. Jsou charakterizované jakožto CD4⁺, CD8‘, TcR νβ8.2⁺ , MHC třída II restriktované T buňky, které jsou schopné předvídatelně a reprodukovatelně navozovat EAE po transferu in vivo do normálních primitivních recipientů. Podobně jako v aktivním modelu tEAE není charakterizován demyelinací avšak zaměřuje se na recirkulaci a zánětlivé efektorové fáze EAE včetně patogenních interakcí mezi T buňkami a krevní mozkovou barierou.

Skupina devíti krys Lewis (n = 3) se pasivně ošetří Cl-specifickými T buňkami (Cl až C9) introperitoneálně. Kontrolní skupina, která se neošetří fuzovým konstruktem (obr. 7), vyvíjí typické závažné znaky tEAE provázené závažnou ztrátou hmotnosti, počínající druhý den po přenosu buněk. Nástup klinických příznaků začíná výrazně druhý den aje podobný jako u aktivní EAE. Krysy se zotaví přibližně šestý den. Krysy, které jsou ošetřeny fuzovým konstruktem, ve třech různých časových bodech vykazují pouze mírnou ztrátu hmotnosti od třetího dne. Avšak klinické příznaky jsou značně sníženy na toliko částečnou ztrátu tonicity ocasu třetí až šestý den.

Příklad 3.3

Vliv fuzového konstruktu na přenos experimentální autoimunní panencephalomyelitis (tEAP)

V tomto modelu S100β-specifické T buňky, odvozené od imunizovaných krys, zprostředkovávají zánětlivou lézi v celém centrálním nervovém systému, v míše, v očním nervu, v sítnici a v prostřední vrstvě oční koule. Nadto podobně při lidské multiple sclerosis (MS) jsou oči obvykle napadeny a vykazují retinální periphlebitis. Buněčné infiltráty se pozorují perivaskulámě avšak také v obklopujícím parenchymu, obecně je přítomno méně ED1⁺

-9CZ 283219 B6 makrofágů ve srovnání s MBP navozeným EAE. Pozorují se pouze mírné klinické příznaky jako ztráta hmotnosti. Klinicky závažnější stav se jeví po vstřiknutí Mab 8-IBC5 (Linington a kol., J. Immunol. 23, str. 1364, 1993). Histologicky se pozorují velké slité foci demyelinace uspořádané okolo infiltrátu přemosťující tento model na určité případy lidské MS.

Skupiny krys Lewis (n = 3) se pasivně ošetří SlOOP proteinovými specifickými T buňkami (LS1). Tyto buňky navozují silnou zánětlivou odezvu v nervovém systému, avšak pouze minimální neurologickou dysfunkci u primitivního syngenického recipientu (obr. 8 #1-3). Avšak klinické příznaky nastoupí, jestliže se krysám podají (obr. 8 # 4-6) anti-MOG monoklonální protilátky pátý den po přenosu buněk. Všechny krysy vykazují naprostou ztrátu tonicity ocasu trvající 48 hodin. Na rozdíl od toho krysy, kterým byl vedle Mab-8-18C5 fúzí podán také fuzový konstrukt, nevykazují žádné klinické symptomy a chovají se zcela normálně (obr. 8, # 7 až 9)

Průmyslová využitelnost

Použití chimemího proteinu vázajícího TNF, který obsahuje rozpustný podíl lidského p55-TNF receptoru nebo p75-TNF receptoru a všechny nebo část konstantních domén těžkého nebo lehkého řetězce lidského imunoglobulinu nebo jeho farmaceuticky vhodných solí pro výrobu farmaceutického prostředku k ošetřování autoimunních nemocí zvláště multiple sclerosis.

Claims

1. Použití chimemího proteinu vázajícího TNF, který obsahuje rozpustný podíl lidského p55TNF receptoru nebo p75-TNF receptoru a všechny nebo část konstantních domén těžkého nebo lehkého řetězce lidského imunoglobulinu nebo jeho farmaceuticky vhodných solí pro výrobu farmaceutického prostředku k ošetřování autoimunních nemocí.

2. Použití podle nároku 1, přičemž autoimunním onemocněním je multiple sclerosis.

3. Použití podle nároků 1 a 2, přičemž chimemím proteinem vázajícím TNF je rozpustný podíl lidského p55-TNF receptoru.

4. Použití podle nároků 1 až 3, přičemž chimemí protein vázající TNF obsahuje všechny domény s výjimkou první domény konstantní oblasti těžkého řetězce lidského imunoglobulinu, jako jsou IgG, IgA, IgM nebo IgE.

5. Použití podle nároku 4, přičemž lidským imunoglobulinem je IgG, zvláště IgGl nebo IgG3.