HUT71603A - Pharmaceutical composition for treating osteoporosis - Google Patents

Description

A találmány tárgyát oszteoporózis kezelésére alkalmas gyógyászati készítmények képezik.

A japán társadalomban az előrehaladott korúak rétege az elmúlt időkhöz képest nagymértékben növekszik, ez az oszteoporózisban szenvedő betegek számának növekedésével jár együtt, ami komoly problémát jelent. A csonttörés miatt ágyhoz kötött személyek nagy száma a betegellátási költségek rendkívül magas növekedését okozza.

Az oszteoporózis kezelésére Japánban D-vitamin készítményeket, kalcitonin készítményeket, ipriflavon készítményeket és hasonlókat alkalmaznak. Mindeddig azonban csak a szimptómák kezelésére került sor, magának az oszteoporózisnak gyökeres kezelésére még nem sikerült megoldást találni. Oszteoporózis alakul ki az esetben, ha a csontképződés és a csont reszorpciója (felszívódása) közötti egyensúly felborul, ebből arra következtethetünk, hogy az oszteoporózis kialakulását megelőzhetjük, ha elősegítjük a csont képződését, vagy pedig inhibitáljuk a csont reszorpcióját.

A találmány tárgya oszteoporózis kezelésére alkalmas új gyógyászati készítmény. Kutatásaink eredményeként azt találtuk, hogy a komló extraktumban található xanthohumol a csontok reszorpcióját erősen inhibitálja.

A komlót (Humulus lupulus L.) eredetileg gyógynövényként ismerik. A komlót régóta sör főzéshez használják. Ebből arra következtethetünk, hogy a xanthohumol toxicitása megfelelően alacsony értéken van.

A találmány szerinti, oszteoporózis kezelésére alkalmas gyógyászati készítmények hatóanyagként az (1) képletú xanthohumolt tartalmazzák. A találmányunk célja volt, hogy az oszteoporózis kezelésére alkalmas gyógyászati készítményt állítsunk elő, ennek érdekében a csont reszorpcióját inhibitáló anyagok kiválasztására törekedtünk.

Mint ismeretes, csont reszorpciót inhibitáló faktorként Európában és Észak-Amerikában az oszteoporózis terápiás kezelésére ösztrogént alkalmaztak; az ösztrogén egy női nemi hormon [IGAKU NO AYUMI, Journal of Clinical and Experimental Medicine, 165. kötet, 533. oldal (1993)]. Azonban az ösztrogénnel végzett kezelés különféle mellékhatásokat idéz elő, ezek közül említjük meg a méh nyálkahártya túlfejlődését, genitális vérzést, emlőfájdalmat, az elhízást, a méh nyálkahártya elrákosodásának megindulását és hasonlókat, szükségessé vált egy olyan vegyület alkalmazása, amely rendelkezik az ösztrogén hatásával annak mellékhatásai nélkül. A feltalálók figyelmét felkeltette az az ismertetés, amelyben arról írtak, hogy a komló kivonat egy ösztrogén jellegű anyagot tartalmaz; azonban ezen anyag hatóanyag részét ezideig nem derítették még fel [Food Cosmet. Toxicol., 11. kötet, 597-603. oldal (1973)]; munkánk során ezen ösztrogén jellegű anyag tisztításával foglalkoztunk, ezenkívül a csont reszorpcióját inhibitáló hatás vizsgálatát végeztük el üregképződési módszer segítségével. A vizsgálatok eredményéből kitűnt, hogy a xanthohumol inhibitálja a csontok reszorpcióját már 10’⁶ mól koncentráció értéknél is. Az a körülmény, hogy a xanthohumol üregképződést inhibitáló hatással rendelkezik, ezideig nem volt ismeretes, e körülményt a feltalálók ismertették először.

A komló kivonatban lévő ösztrogén jellegű anyag azonosításához foszfor-molibdénsavat használunk, ami egy színképző reagens, amely ösztrogénnel specifikus reakcióban lép [J. Chromatog., 34. kötet, 269. oldal (1968)], ezen reagenst eredményesen alkalmaztuk az ösztrogén jellegű anyag azonosításához; a foszfor-molibdénsav az ösztrogén jellegű anyaggal zöldes színt képez.

A xanthohumol kinyerhető a természetes eredetű komló tisztítása révén, de előállítható szintetikus úton is hagyományos módszerek segítségével.

A klinikai kezelés során a xanthohumol dózisa függ a beadás módjától, a dózis értéke általában 0,1 g - 2 g érték között van felnőtt személyeknél naponta (mintegy 1,5 mg - 30 mg/kg/nap). Ezen hatóanyagot adhatjuk intravénásán, intramuszkulárisan, orálisan vagy rektálisan. Az intravénás kezelés esetében adhatunk szokásos intravénás injekciót vagy pedig intravénás csepp-infúziót.

A xanthohumol tartalmú készítmények előállítását szokásos módon végezzük, ezen készítmények előállításához ismert segéd- és vivőanyagokat használunk.

Az injekciós célra szánt készítményeket előállíthatjuk például injekciós célra alkalmas porok formájában is. Ezen esetben a porokat oly módon állítjuk elő, hogy a hatóanyaghoz egy vagy több, vízben oldódó vivőanyagot adunk, ezek közül említjük meg a mannitot, szacharózt, laktózt, maltózt, glükózt, fruktózt és így tovább, az elegyet vízben feloldjuk, üvegcsékbe vagy ampullákba letöltjük, majd liofilizáljuk és lezárjuk.

Orális felhasználás céljára előállíthatunk szokásos tablettákat, kapszulákat, granulátumot, finom granulátumot vagy porokat, továbbá készíthetünk enterális készítményeket.

Az enterális készítményeket oly módon állítjuk elő, hogy a hatóanyaghoz valamely vivőanyagot adunk, így például mannitot, szacharózt, laktózt, maltózt, keményítőt, szilícium-dioxidot, kalcium-foszfátot, és így tovább, ezen készítmények előállításához használhatunk lubrikánsokat (csúsztatószerek), mint például talkumot, magnézium-sztearátot és hasonló anyagokat, megkötőszereket, mint például karboxi-metil-cellulózt, metil-cellulózt, zselatint, gumiarábikumot és így tovább, szétesést elősegítő szereket, mint például kalcium-karboxi-metil-cellulózt, és így tovább; ezen kívül a tabletták, granulátumok, finom granulátumok és hasonló készítmények esetében jelen lehet egy vagy több enterális hordozóanyag, használhatunk például cellulóz-acetát-ftalátót, hidroxi-propil-metil-cellulóz-ftalátót, hidroxi-propil-metil-cellulóz-acetil-szukcinátot, poli(vinil-alkohol-ftalát)-ot, sztirol-maleinsavanhidrid kopolimert, sztirol-maleinsav-kopolimert, (metil-metakrilát)-metakrilsav- kopolimert, (metil-akrilát)-metakrilsav-kopolimert, továbbá kívánt esetben alkalmazhatunk valamilyen színezőanyagot, mint például titán-oxidot a bevonattal ellátott készítmények előállításához. Az enterális célra szánt granulátumot vagy finom granulátumot kapszulákba töltve kapszulákat állíthatunk elő.

Ezen túlmenően a szokásos módon előállított kapszulákat bevonattal láthatjuk el, erre a célra a fent említett enterális bevonóanyagokat használhatjuk, ily módon enterális kapszulákat állíthatunk elő. Másik megoldásként az enterális kapszulákat oly módon állítjuk elő, hogy magát a kapszulát a fent említett enterális jellegű anyagok egyikéből állítjuk elő, vagy pedig a kapszulát az enterális jellegű anyagoknak zselatinnal készült elegyéből készítjük el.

A kúpok előállításánál úgy járunk el, hogy a hatóanyaghoz lipofil komponenst adunk, erre a célra használhatunk félig szintetikus anyagokat, így kakaóvajat vagy zsírsav-trigliceridet, amit különböző arányban zsírsav monogliceriddel vagy zsírsav-digliceriddel keverünk, vagy használhatunk hidrofil vivőanyagot, mint például poli(etilén-glikol)-t vagy glicerin-zselatint, és hasonló anyagokat; az elegyet hőkezeléssel megolvasztjuk és homogén elegyet képezünk, majd a megolvadt elegyet kiöntő formákba öntve kúpokat állítunk elő.

A találmány szerinti megoldást az alábbi példák szemléltetik.

1. Példa (1) Komlóból nyert xanthohumol tisztítása

250 g, kereskedelmi forgalomban beszerezhető komlóhoz (Rupofresh Co. Inc. cégtől beszerezve) 500 ml acetont adunk, 1 óra hosszat perkolálást és extrakciót végzünk, majd a műveletet összesen háromszor megismételjük. Az ily módon kapott aceton extraktumot csökkentett nyomáson betöményítjük, így 50 g sötét színű szirupot nyerünk. Az így kapott szirupból egy részt (17,5 g) 500 ml, 0,5 %-os ecetsav/80 % metanol elegyben feloldjuk, majd az oldatot anioncserélő gyantán (Dowex-I, keresztkötés mértéke x 4, részecskeméret 0,04-0,075 l(200-400 mesh), ecetsav típusú; előállító: Dow Chemical Co.) a művelethez 5 cm átmérőjű, 27,5 cm hosszúságú oszlopot használunk, az átfolyás sebessége 3 ml/perc.

Az abszorbeáltatott komló extraktumot gradiens eluálásnak vetjük alá, ehhez az irodalomból ismert ecetsav és metanol elegyet használjuk [Agric. Bioi. Chem., 49. kötet, 399-403. oldal (1985)], az eluátumot a folyadék tömegére számítva 10 g-os részekre frakcionáljuk, ehhez a művelethez frakció-gyűjtő berendezést használunk. Az oszlopra először 1 liter 0,5 % ecetsav/80 % metanol elegyet viszünk, ezt követően 2 liter 5 % ecetsav/80 % metanolt adagolunk, ily módon az oldhatatlan anyagot eluáljuk, majd ezután 1 liter 20 % ecetsav/80 % metanol eleggyel a xanthohumolt extraháljuk.

Az 1-420 számú frakciókból 10-10 μΙ mintát veszünk ki. A mintákat szilikagéllel bevont vékonyrétegkromatográfiás lemezeken futtatjuk (5715 számú szilikagél lemez, előállító: Merek AG), a kifejlesztéshez szerves oldószer elegyet használunk (etil-acetát és metanol 30:1 arányú elegye). A szilikagél lemezre 4 %-os, metanolos foszfor molibdénsav oldatot (előállító: Merek AG) permetezünk, ez a fenolos hidroxilcsoporttal színes reakcióba lép, a szín előhívásához gáz halmazállapotú ammóniát használunk. A xanthohumol a fenti kezelés hatására zöld elszíneződést mutat. A szilikagél bevonatú lemezeken a xanthohumol azonosításához e szín reakciót használjuk.

A vizsgálati eredmények alapján a 320-400-as számú frakciókból xanthohumolt eluálunk (a frakciót a Dowex-1 oszlop eluálása során kaptuk). A frakciókat csökkentett nyomáson betöményítjük, így 80 mg por alakú anyagot kapunk. Az eredményekből kitűnik, hogy 100 g komlóból 90,7 g xanthohumolt sikerült kinyerni.

(2) Xanthohumol szerkezetének meghatározása

Az ily módon frakcionált és tisztított xanthohumol szerkezetét színreakció segítségével, proton és ¹³C mágneses mag rezonancia spektrum felvétellel, tömegspektrum és infravörös abszorpciós spektrum vizsgálat segítségével határozzuk meg.

(3) Xanthohumol szín reakciója vasklorid (FeCI₃) segítségével %-os, etanollal készült FeCI₃ oldatot permetezünk szilikagél lemezen lévő xanthohumolra, ily módon az irodalomból ismert sárga elszíneződést kapjuk [Bull. Soc. Chim. Béig., 66. kötet, 452-457. oldal (1957)]. A xanthohumol által előidézett elszíneződés az irodalomban leírtakkal megegyezik.

(4) ¹H-NMR spektrum (belső standard: TMS) ¹H-NMR spektrum δ (CD₃OD): 1,648 (3H, s), 1,755 (3H, s), 3,223 (2H, d), 3,896 (3H, s), 5,196 (1H, t), 6,004 (1H, s), 6,819 (2H, d), 7,493 (2H, d), 7,646 (1H, d), 7,799 (1H, d).

A fentiekben kapott értékek az irodalmi adatokkal megegyeznek [Arch. Pharm. Weinheim, 321. kötet, 37-40. oldal (1988)].

(5) ^1ÍC-NMR spektrum ¹³C-NMR δ (CDsOD): 18,018, 22,465, 26,078, 56,299, 92,289, 106,466, 109,730, 117,107, 124,560, 126,047,

128,582, 131,345, 132,529, 143,291, 161,399, 162,644,

164,981, 166,332, 193,928.

(6) Infravörös spektrum (KBr módszer)

-: 3280, 1705, 1606, 1541, 1512, 1470, 1439, 1346, 1292, 1227, 1171, 1144, 1103 cm'¹.

(7) Tömegspektrum

MS (El) m/z: 354 (M⁺), 339, 311, 299, 234, 219, 205, 191, 179, 177, 153, 147, 120.

A fenti 4-7. pont alatt bemutatott vizsgálati eredmények igazolják azt, hogy xanthohumolos szerkezete az (1) képlet szerint megadottal azonos.

2. Példa

A xanthohumol csont reszorpciót inhibitáló hatásának vizsgálata (1) Sejttenyészet készítése

10-11 napos ICR egerektől (szállító Charles River Inc.) combcsontot és lábszárcsontot metszünk ki, ezeket ollóval MÉM táptalajba aprítjuk (szállító: Flow Laboratories Inc.), a táptalaj 5 % FBS-t (szállító: Irving Scientific Inc.), 100 U/ml penicillint és 100 gg/ml sztreptomicint tartalmaz. A kapott felülúszót pipettával leszívatjuk, táptalajjal mossuk, majd 5 %-os FBS-ben szuszpendáljuk; ez utóbbi egy MÉM táptalaj, amelyben csontlebontó sejtek képződnek. A táptalaj sejt színvonalát 1 x 10⁷/ml-re állítjuk be, a hígításhoz olyan táptalajt használunk, amely patkány paratiroid hormonoktól mentes.

(2) Lyuk képződési vizsgálati módszer

Egy elefántcsont darabot 150 gm vastagságú darabokra vágunk, ehhez precíziós, kis sebességű vágóeszközt használunk (szállító: Buehler GmbH), majd ezekből 6 mm átmérőjű kerek darabokat vágunk le lyukasztó segítségével. Az elefántcsont metszeteket 70 % etanolba mártjuk, 2x5 percig ultrahanggal kezeljük, majd steril PBS-sel háromszor mossuk, végül táptalajjal kétszer átöblítjük. Az ily módon előkezelt elefántcsont metszeteket 96-nyílású tenyésztő lemezre viszszük (szállító: Falcon Inc.), majd a nyílásokba 100 μΙ, a vizsgálati vegyületet különféle koncentrációban tartalmazó táptalajt (amely 2 x 10'⁸ mól patkány paratiroid hormont tartalmaz) adunk. Ezt követően minden egyes nyílásba 100 μΙ, fentiek szerint előkészített 1 x 10⁶ csontsejtet tartalmazó táptalajt viszünk. 37 ’C hőmérsékleten 10 % CO₂-t tartalmazó inkubátorban 3 napig inkubálást végzünk. Az inkubálás befejezése után az elefántcsont metszetek felett lévő sejteket eltávolítjuk, a képződött üregeket Coomassie Brilliant kékkel megfestjük, majd a képződött abszorpciós üregeket mikroszkóp alatt megszámláljuk. Az eredményeket az 1. táblázat tünteti fel.

- 11 1. Táblázat

Vizsgálati vegyület koncentrációja	Az abszorpciós üvegek száma (Átlag + SD)	Az inhibitor hatás mértéke (%)
0	248,3 ± 35,7	-
10’4	0	100
10'5	15,8±6,0	93,6
10’6	162,7±41,2	34,5

A táblázat adataiból kitűnik, hogy a xanthohumol által biztosított inhibitor hatás eléri a 100 %-os értéket 1 x 10'⁴ mól koncentrációnál; az inhibitor hatás 93,6 %-os 1 x 10'⁵ mól-nál és 34,5 %-os 1 x 10'⁶ mól koncentrációnál.

Fenti eredményekből megállapítható, hogy a xanthohumol inhibitálja a csont reszorpciót már 10'⁶ koncentráció értéknél is.

Claims (2)

1. Gyógyászati készítmények, azzal jellemezve, hogy ezek hatóanyagként hatásos mennyiségben (1) képletű xanthohumolt, valamint a gyógyászatban általában alkalmazott segéd- és vivőanyagokat tartalmaznak.

2. Az 1. igénypont szerinti gyógyászati készítmények oszteoporózis kezelésére, azzal jellemezve, hogy ezek hatóanyagként hatásos mennyiségben (1) képletű xanthohumolt, valamint a gyógyászatban általában alkalmazott segéd- és vivőanyagokat tartalmaznak.