HUT71326A - Purification of kringle containing proteins, and especially t-pa - Google Patents

Description

A találmány tárgya eljárás kringle /dán: perec/ tartalmú fehérjék tisztítására kringle-szerkezetü fehérjéket tartalmazó fehérjeoldatokból.

Fehérjék, különösen gyógyászati kezeléshez használandó fehérjék tisztítása kényes eljárás. A tisztítandó kiindulási anyag jellemzően biológiai folyadék, mint plazma vagy szérum, vagy sejtbomlástermék vagy tenyésztő közeg, ha a fehérjét az illető fehérje termelésére képes sejtvonal tenyésztése utján állítják elő. Függetlenül a kiindulási forrástól, az oldatban általában számos nemkívánatos fehérje és egyéb anyag van jelen, amelyektől a kérdéses fehérjét el kell választani. A hagyományos tisztitó műveletek a sejttörmelékek vagy hasonlók szűréssel vagy centrifugálással való elválasztásából, a fehérjeanyag kicsapásából és és a fehérjeanyag szétválasztásából állanak. Ilyen módon a kívánt fehérjét tartalmazó fehérjeoldat jön létre, bár még egyéb fehérjék is szennyezik. A fehérjeoldatot ezután jellemzően alkalmas tisztító oszlopokra viszik fel, igy affinitáskromatográfiát vagy ioncserélő kromatográfiát vagy hasonlót alkalmaznak.

Az affinitáskromatográfia igen alkalmas laboratóriumi méretű tisztításra, például kutatási célokra. Ipari méretű termelésre azonban kevésbé vonzó, főként az az oszlop anyag magas ára, de nem kielégítő kémiai stabilitása miatt is. Az oszlop anyaga bizonyos használati idő után szennyezetté válik, és mivel nem regenerálható, gyakran kell uj anyaggal kicserélni, ami növeli az előállítás költségeit.

így az affinitáskromatográfia oszlopai a kezdeti tisztítási művelethez, amikor sok szennyezés van jelen, nem különösebben alkalmasak.

Fehérjék üzemi méreti tisztításakor a kezdeti műveletben előnyös nem költséges és jó kémiai és fizikai stabilitással rendelkező töltetet alkalmazni. Az anyag ellenálló kell legyen a nagy átfolyási sebességgel szemben is, ami például 10 - 20 oszloptérfogat/óra. Ilyen kivánalmaknak jellemzően az ioncserélő oszlop tesz eleget.

A fehérjék az ioncserélő oszlopról általában a pH és/vagy az ionerősség változtatása utján oldhatók le. A kérdéses fehérje és a szennyezések ekkor különböző eluátumokban jelennek meg, függően például izoelemtromos pontjuktól /pi/. Ha a kérdéses fehérje és az elválasztandó fehérjék pi-je azonos tartományba esik, az ilyen elució túlságosan aspecifikus, minthogy az azonos pi-értékü fehérjék bizonyos mértékig együtt oldódnak le az oszlopról. Ezért további időrabló és költségnövelő tisztitó műveletek szükségesek, amelyek a kívánt fehérje fokozott bomlásának és elvesztésének a kockázatával járnak.

Az EP Ο256836Β számú szabadalmi bejelentésben eljárást írnak le t-PA tisztítására, melynek során különböző molekulatömegű t-PA fajtákat úgy választanak szét, hogy a • ··· · ··· • · · ···· · * · · ♦ · •··♦ · · · ·«·« keveréket hidroxiapatittal hozzák érintkezésbe és a különböző frakciókat egymás után különböző pH-nál és/vagy sókoncentrációknál eluálják. így e módszer a fentebb említett hátrányokkal jár. Ugyanez vonatkozik az EP O261941A számú szabadalmi bejelentésben leirt eljárásra, ahol a t-PA-t kationcserélő oszloppal tisztítják és sógradiens eluciós módszerrel eluálják. A 63-091080 számú japán szabadalmi bejelentésben leirt eljárás szerint a t-PA-t t-iaztitás céljából adszorpciós hordozón, igy ellenőrzött pórusu üvegen /0 PG/, szilikagélen vagy diatómaföldön adszorbeáltatják és tU-aminosavat tartalmazó oldattal eluálják. Az adszorpciós mátrixok lényegesen eltérnek az ioncserélő anyagtól. Adszorpciós kromatográfiánál az elválasztandó anyagokat főként a felületi energia és Van dér Waals erők kötik a mátrixhoz és az elválasztás poláros és térbeli tényezőktől függ. Ioncserélő kromatográfiánál a visszatartó erők túlnyomórészt elektrosztatikusak és az elválasztás a komponensek ionos természetétől függ.

Az ismert módszerekkel járó problémák akkor oldhatók meg, ha a kérdéses fehérje az ioncserélő oszlopról olyan eluenssel oldható le, amely a kívánt fehérje szelektív eluálására képes, anélkül, hogy az eluciós müvelett alatt a pH és az ionerősség lényeges mértékben változna. Ha ez lehetséges lenne, csak a kérdéses fehérje eluálódna, míg a szenynyezések az oszlopon maradnának vissza.

Találmányunk alapját az a meglepő észlelés ké• « · • ··· · pezi, hogy bizonyos tipusu aminosavak, az un. -aminosavak ezzel a kívánatos tulajdonsággal rendelkeznek. Közelebbről meghatározva kitűnt, hogy a lys-plazminogén, a plazminogén egy származéka, S-Sepharose oszlopról £-amino-kapronsavval /6-AHA/ magas kitermeléssel szelektíven eluálható.

.Legtágabb vonatkozásában a találmány kringletartalmu fehérjék tisztítási eljárására vonatkozik, amelyek az őket tartalmazó fehérjeoldatból ω-aminosavakhoz képesek kötődni. Az eljárás a következő műveletekből áll:

a/ a fehérjeoldatot ioncserélő oszlopra visszük fel olyan körülmények között, amikor a kringle-tartalmu fehérje az oszlop anyagához kötődik;

b/ a kringle-szerkezetü fehérjét egyώ-aminosavval szelektíven eluáljuk a pH és az ionerősség lényeges megváltoztatása nélkül; és c/ a kringle-tartalmu fehérjét a b/ művelet eluátumából további alkalmas tisztitó műveletekkel izoláljuk.

Szükebb vonatkozását tekintve a találmány plazminogén vagy valamely plazminogén-származék, mint lys-plazminogén tisztítására vonatkozik.

A rajzok rövid leírása

A találmány közelebbről ismertethető a rajzokra hivatkozva. Ezek közül • ·· ·«»* ♦··· »44 • »·4 4· 4 ·

4 4 4 4 4 4 4··4··

4··· 4 » 4·*·4 ♦4 444 · · 444 az 1. ábra lys-plazminogén eluciós profilját mutatja, S-Sepharose-ról 0,5 M NaCl-oldattal eluálva;

a 2. ábra lys-plazminogén eluciós profilját mutatja S-Sepharose-ról 3 mM 6AHA-val eluálva;

a 3» ábra a 0,5 M NaCl-oldattal és 3 mM 6-AHA-oldattal eluált lys-plazminogén frakció nem redukált SDS-PAGE /nátrium-dodecil-szulfát—pliakrilamid gél elektroforézis/ képét mutatja;

a 4. ábra 0,5 M NaCl-oldattal affinitásoszlopról /lizin-Sepharóz/ eluált, majd dializált lys-plazminogén frakció eluciós profilját mutatja;

az 5. ábra a 3 mM 6-AHA-oldattal affinitásoszlopról /lizin-Sepharose/ eluált, majd dializált lys-plazminogén eluciós profilját mutatja;

a 6. ábra a 4. illetve 5. ábrán látható lys-Sepharose oszlop eluciós profilok különböző eluált frakcióinak nem redukált SDS-PAGE elektroforetogramját mutatja; és a 7» ábra a lys-Sepharose oszloppal tovább tisztított lysplazminogén plazmin-elemzésének eredményeit mutatja.

A találmány ismertetése előtt, annak jobb megértése céljából hasznos lehet az alább használt egyes meghatározások értelmezése.

Plazminogén; plazminogén alatt általában humán glu-plazminogént értünk.

• ♦ • · ·· ·

Plazminogén-származékok; e meghatározás a plazminogén lebomlott vagy mutáns formáira vonatkozik, beleértve lys-plazminogént, amely az 5 kringle-domén legalább egyikét megtartotta, előnyösen 3-nál többet és legelőnyösebben mind az 5 kringle domént. A mutációkba beletartozik a nativ molekula egy vagy több aminosavcsoportjának helyettesítése, vagy aminosavcsoportok kiiktatása vagy hozzáadása, ami a melekula tulajdonságait a kívánt módon módosítja..

<0-aminosavak; e meghatározás körébe tartozó aminosavak szabad aminocsoportja a karboxilcsoporthoz képest a legtávolabbi szénatomhoz kötődik.

Kringle-tartalmu fehérjék; kringle-tartalmu fehérjék alatt egy vagy több un. kringle-szerkezetü fehérjét, például t-PA.-t és plazminogént értünk.

Szelektív elució; e meghatározás kimutatható mennyiségű szennyező fehérjétől mentes, kívánt fehérjére vonatkozik. Pehérjeoldat: e meghatározás körébe olyan biológiai oldat vagy vizes oldat tartozik, amely számos fehérjét tartalmaz, beleértve a kívánt fehérjét.

Biológiai oldatok; e kifejezés plazmára, szérumra vagy frakcióikra, vagy emberi vagy állati eredetű szervek extrakciójával kapott oldatokra vonatkozik.

Az alapvetően állandó pH + 1 pH-egység, előnyösen +0,5 pH-egység változására vonatkozik, összehasonlítva a • ··« 4 • « * * · ♦ • · · Λ · · · · · · • · 4 4 ·♦ ·« ··· · · · · · puffer pH-értékével az 6*-aminosav hozzáadása előtt.

Az alapvetően állandó ionerősség azt jelenti, hogy az ionerősség + 20%, előnyösen + 10% tartományos belül változik, összehasonlítva a puffer ionerősségével az ω-aminosav hozzáadása előtt.

Noha a találmány szerinti tisztitó eljárást biológiai oldatokból, mint plazmából és szérumból származó, kringle-tartalmu fehérjék tisztítására használjuk, az eljárás előnyösen használható tenyésztő közegből vagy sejtfeltárás utján kapott, intracellulárisan képződő fehérje tisztítására is. A kringle-tartalmu fehérjét képező sejtek természetes sejtek vagy transzformált vagy transzfektált sejtvonalak lehetnek, amelyek expresszálni tudják a kringleszerkezetü fehérjét kódoló, beékelt DNS-szakaszt.

Ioncserélő oszlopok jól ismertek az irodalomból. Alkalmas ioncserélő oszlop az S-Sepharose és Fractogel SO^.

Az íd-aminosavak előnysen legalább 4 szénatomot tartalmaznak a karboxilcsoport és az á)-aminocsoport közötti szénláncban. Alkalmas lineáris L>-aminosavakra példaként szolgálhat a 4-amino-vajsav, 5-amino-pentánsav, 6-amino-hexánsav / £-amino-kapronsav, 6-AHA/, 7-amino-heptánsav, 8-amino-oktánsav, lizin és arginin. Ciklikus tí-aminosavakra példa a transz-4-amino-metil-ciklohexán-karbonsav /tranexámsav/ és p-amino-metil-benzoesav.

• ·· «4·· «««ο 44* • *44 Λ' · · • 4 · · 444 ···4·· »··»· · * » t V* *4 4 · « «44·4

- 9 A találmány szerinti eljárás elvileg íJ-aminosavhoz kötődő és az ioncserélő oszlopról a pH és/vagy ionerősség alapvető változása nélkül eluálódó, kringle-tartalmu fehérjék tisztítására használható. Ennek nagy előnye, hogy az oszlophoz a kérdéses fehérjével együtt kötődő egyéb fehérjeszennyezések az oszlopon maradnak, mivel a pH vagy az ionerősség nem változik lényegesen. Az tí-aminosavak szelektív eluciója annak köszönhető, hogy kötődésük a kringle-tartalmu fehérjéhez olyan erős,, hogy megváltoztathatja a fehérje izoelektromos pontját, vagy a molekulában bizonyos konformációs változásokat okozhat, ami az oszlopról való leoldodáshoz vezet.

A találmány szerinti eljárással tisztítható fehérjék fontos csoportját képezik az un. kringle-tartalmu fehérjék /lásd például Patthy L., Blood Goagulation and Fibrinolysis 1, 153-166 /1990//. E fehérjék egy vagy több kringle-szerkezetet tartalmaznak, melyek ismert módon lizinhez vagy lizin-analógokhoz, mint transz-4-amino-metil-ciklohexán-karbonsavhoz és £-amino-kapronsavhoz kötődnek. Az ilyen kringle-tartalmu fehérjék közé tartozik a t-PA és t-PA-analógok az ujj” növekedési faktor és kringle-domének különféle módosulásával, és az aktivációs hely körüli különböző változásokkal, a 191,843; 201,153; 207,589; 241,209; 233,013; 240,334; 293,936; 293,934 és 292,009 számú európai szabadalmi leírásban megadottak szerint. További példa a plazminögén, lys-plazminogén, apolipoprotein a, hepatocita növekedési faktor, FXII, protrombin, * »· • 4 « · 4 ·4 4 44444 • 44*4 · ··4«4 • *4 · »4 4 4 ·44

- 10 és a feltételezett tumorgátló tulajdonságokkal rendelkező uj fehérje, az uPA /Degen S.J.F. /1991/ 20th Lindenström Láng Conference, Vingsted, Dánia, Abstract 164-166. oldal//.

Bár a találmány szerinti eljárás elsődleges célja a kezdeti tisztitó lépésben való felhasználás, ahol nagy menynyiségü a szennyezés, későbbi vagy végső tisztitó műveletben is alkalmazható, ahol a szennyezés nagy részét a kezdeti ioncserélő vagy affinitáskromatográfiával vagy más alkalmas eljárással már eltávolították.

Az ioncserélő oszlop eluátumát előnyösen további alkalmas tisztitó műveletekkel, mint dialízissel, gélszüréssel és affinitáskromatográfiával tovább tisztítjuk.

A találmány az alábbiakban részletesebben ismertetjük a. plazminogén tisztításának példáján.

Az emberi plazminogén egyláncu glikoprotein, melynek molekulatömege mintegy 90 ezer. A plazmában körülbelül 2 uM koncentrációban kering és a humán plazmából affinitáskromatográf iával, lizinmolekulához kötött Sepharose oszlopon tisztítható. A plazminogén natív formája NH^-terminális glutaminsavat tartalmaz és glu-plazminogén”-nek nevezik. A plazminogén molekula 791 aminosavat tartalmaz 24 diszulfidhiddal, 5 hármas-hurku kringle-szerkezettel és egy szerinproteáz doménnel.

A natív molekula proteolitikus emésztése utján számos kisebb molekulatömegü humán plazminogén forma nyerhető.

• ···* ·♦♦· 0* * • « · 9 9··· • · 9 · 0«· ·0*«·» •909 *0 9 · 00·

- 11 E molekulákhoz használt nomenklatúra az N-terminális aminosav szekvencia-helyzetén alapul. Ha glu-plazminogént nagyon rövid időre plazmin hatásnak tesszük ki, a glu-plazminogénről Nterminálisan 77 aminocsoport hasad le, és egy molekula plazminogén, mintegy 83 ezer molekulatömegű lys-plazminogén keletkezik, amely fontos szerepet játszik a fibrinolitikus rendszer számos tulajdonságában.

A plazminogén aktív proteinázzá, azaz plazminná való átalakulását az un. plazminogén aktivátorok /PAs/ katalizálják. A plazmint magasabbrendü gerinceseknél a keringés elsődleges fibrinolitikus enzimjének tartják, de fontos szerepe lehet más éren kívüli proteolitikus történésekben is.

A plazminogén és lys-plazminogén trombolitikus szerként használható /lásd Anderle K. és munkatársai, Hemostasis 18, 165-175 /1988//.

A humán plazminogén a plazmából számos utón tisztítható. A humán plazmából való tisztítás uj módszerei mind affinitáskromatográfián alapulnak. Affinitás-mátrixot /lizinSepharose/ úgy állítanak elő, hogy az L-lizin c(-aminocsoportját kovalens kötéssel Sepharose-hoz kapcsolják. Foszfát pufferrel /pH 7,4/ szobahőmérsékleten egyensúlyba hozott lizinSepharose oszlopon vízzel hígított plazmát bocsátanak át, majd az oszlopot foszfát pufferrel mossák. Ezután a plazminogént 0,2 M íö-amino-karronsavval /pH 7,4/ eluálják. Az í4-amino-kapronsavat hidegben foszfát pufferrel kiegyensúlyozott

- 12 Sephadexen gélszüréssel távolitják el a plazminogénből.

A plazmából tisztított humán fehérjék alkalmazása a vírusfertőzés bizonyos kockázatával jár. Plazma-eredetű humán proteinekkel foglalkozva fó gond a HÍV és májgyulladás fertőzés.

A kockázat elkerülése céljából előnyös lenne plazminogént rekombináns DNS-technikával előállítani. A plazminogén transzfektált sejtekben való előállítására irányuló kísérletekből azonban kitűnt, hogy az intracelluláris plazminogén aktiválás és az azt követő degradáció megakadályozza az ép rekombináns plazminogén ésszerű hozammal történő előállítását. Ξ problémát plazminogén és plazminogén aktiválást gátló proteázinhibitor együttes expressziója - koexpresziója utján oldották meg /319,944 számú európai szabadalmi leírás/.

így lys-plazminogén vagy glu-plazminogén BHKsejtekben lys- vagy glu-plazminogén és c<-2-plazmin inhibitor, C^g-Pi együttes kifejeződése /koexpressziója/ utján állítható elő. Glu-plazminogén vagy lys-plazminogén ζλ-1-antitripszinnel /AAT/ is koexpresszálható BHK sejtekben vagy származékaikban. Az AAT-vel történő koexpresszió biztosítja, hogy a BHK sejtek által termelt urokinázt az AAT gátolja. A plazminogén urokináz általi aktiválása és a plazmin-közvetetette proteolitikus hasítás így csökken és magas koncentrációban képződik intakt plazminogén. A plazminogén tenyésztő közegből kétlépcsős eljárással tisztítható, amely ioncserélő kromatográfiából és • ·· ···· ···· «· * • · V * · ··« • · * · ··· ··· ··· ···· · · » « · ·· • ·· ··· ··· ··

- 13 lizin-Sepharose-on végzett affinitáskromatográfiából áll. Közelebbről az ioncserélő oszlopot /S-Sepharose/ mossuk, majd 0,5 M NaCl-oldattal eluáljuk. Az aluátumot affinitáskromatográfiás oszlopon /Lys-Sepharose/ bocsátjuk át és a plazminogént

6-AHA elucióval izoláljuk.

Mint említettük, a transzfektált BHK sejtek plazminogénen kivül urokinázt is kifejeznek. A plazminogén és urokináz izoelektromos pontja 6,7 - 8,1, illetve 8,5. Ezért mind a plazminogén, mind az urokináz az ioncserélő oszlophoz kötődik, mig a koexpresszált plazminogén aktivátor inhibitor az üres térfogatban jelenik meg.

Bár e módszerrel magas hozammal nyerhető plazminogén, azt találtuk, hogy a plazminogén aktiválása bizonyos mértékig az affinitáskromatográfia folyamán következhet be. Ez feltehetően arra vezethető vissza, hogy a plazminogén aktivátor inhibitor a megelőző ioncserés tisztitó műveletben eliminálódik. Ha a plazminogént és plazminogén aktivátort együtt eluáljuk az ioncserélő oszlopról /S-Sepharose/, az eluátumban még kis mennyiségű plazminogén aktivátor /urokináz/ is képes a plazminogént plazminná aktiválni és ezért kis menynyiségü plazmint tartalmazó plazminogén termék képződik.

Meglepő módon kitűnt, hogy az első ioncserélő tisztitó műveletben használa 6-AHA biztosítani tudja a lysplazminogén szelektív elucióját, az urokináz egyidejű eluciója nélkül. így az eluátumban a plazminogén plazminná történő,

- 14 urokináz által nem szándékolt aktiválása elkerülhető és a sógradiens eljárással összehasonlítva tisztább termék nyerhető.

Kísérleti rész

1. példa

Lys-plazminogén tisztítása

Lys-plazminogént a 319,944 számú európai szabadalmi bejelentésben leirt eljárással állítunk elő.

A BHK sejtek urokináz /uk/ szekrécióját 1-antitripszinnel gátoljuk, amely plazminogénnel együtt fejeződik ki. Az aktivátor jelenlététa plazmin kromogén próbájában exponenciális termékképződés támasztja alá. Az uk jelenlétét fibrin overlay technikával /Granelli-Piperno és Reich, J. Exp. Med. I48, 223-234 /1978// mutatjuk ki.

A tenyésztő közeg egy mintáját két azonos frakcióra választjuk szét.

Az S-Sepharose ioncserélő oszlopot az első lépésben 6-AHA-pufferrel vagy 0,5 M NaCl-oldattal eluáljuk. Mindkét eluátumot dializáljuk és lizin-Sepharose oszlopon tisztítjuk.

• · · ι

1. kísérlet

S-Sepharose, elució NaCl-dal /910723 sz. próba/ Kiegyensúlyozó puffer: 0,02 M NaHgPO^, 0,04 M NaCl, 0,02% Tween-80, 3 mg/liter aprotinin; pH 5,0.

1. mosópuffer = kiegyensúlyozó puffer.

2. mosópuffer = 0,15 M NaCl-ot tartalmazó kiegyensúlyozó puffer; pH = 5,5.

3. eluciós puffer = 0,50 M NaCl-ot tartalmazó, aprotinin nél- küli kiegyensúlyozó puffer; pH = 5,5.

Aprotinint akkor adunk a frakciókhoz, miután plazmin meghatározáshoz már mintát vettünk ki.

Az oszlop térfogata 5 ml, 7 ml tenyésztő nédiumot viszünk fel és az átfolyási sebesség 125 ml/h.

Az eluciós profilt az 1. ábra mutatja.

Az eluciós profil eléggé meredek. Lys-plazminogént a 2. csúcs tartalmaz.

Az 1. ábrán az alapvonal alatti számok /1, 2 és 3/ a különböző pufferek hozzáadásának idejét jelzik /1. kiegyensúlyozó puffer, 2. mosópuffer /0,15 & NaCl, pH 5,5/ és 3. eluciós puffer /0,5 M NaCl, pH 5,5//. Az alapvonal feletti számok Az SDS-PAGE-ban /3. ábra/ használt frakciók számára vonatkozik.

2. kísérlet

S-Sepharose, elució NaCl-dal /910723 sz, próba/

Megismételjük az 1. kísérletet, azzal a különbséggel, hogy az oszlopot két lépésben eluáljuk: az első eluciót 0,02 M NaHgPO^-et, 0,18 M NaCl-ot, 0,02% Tween-80-at és 3 mM

6-AHA-t tartalmazó eluciós pufferrel /pH 5,5/ hajtjuk végre.

A második elució az 1. kísérletben leírtak szerint történik.

Az eluciós profilt a 2. ábra mutatja. A lysplazminogént a 2. csúcs tartalmazza. A 3. csúcs különböző szennyezéseknek felel meg.

A 2. ábrán az alapvonal alatt számok /1, 2, 3 és 4/ a különböző pufferek hozzáadását mutatják /1. kiegyensúlyozó puffer, 2. mosó puffer /0,5 M NaCl, pH 5,5/, 3. eluciós puffer I /0,18 M NaCl, 3 mM 6-AHA, pH 5,5/ és 4. eluciós puffer II /0,5 M NaCl, pH 5,5//. Az alapvonal feletti számok /16 - 42/ az SDS-PAGE elemzésben használt frakciók számára vonatkozik /3» ábra/.

A 3. ábra a két kísérlet eluciójának frakcióiból készült, nem redukált SDS-PAGE képét mutatja. Némi aprotininnel együtt nagyon sok nagy molekulájú komplex eluálódik. Az elektroforetogrammon a sávok számozásának jelentése az alábbi:

1. Molekulatömeg meghatározás standardja

2. Plazma-eredetű lys-plazminogén /kontroll/

3. A 910723 próbában használt tenyésztő közeg « ·'

4. Az 1.

5. Az 1.

6· Az 1·

7. Az 1.

ábra 23. ábra 24.

ábra 25.

ábra 26.

frakciója frakciója frakciója frakciója /1, kísérlet/

8. A 910724 próbában használt tenyésztő közeg

9. A 2. ábra 16. frakciója

10. A 2. ábra

11. A 2. ábra

12. A 2. ábra

13. A 2. ábra

14. A 2. ábra

15.

22. frakciója

23. frakciója

26. frakciója

30. frakciója

42. frakciója

Molekulatömeg-standard /2. kísérlet/

Látható, hogy a 3 ml 6-AHA-val történő elució /10 - 13· sáv/ nagy molekulatömegü komplexektől mentes tiszta terméket /lys-plazminogén/ eredményez, míg NaCl-os elucióval /4-7. sáv/ némi nagy molekulatömegü szennyezést tartalmazó termékhez jutunk.

Annak megvizsgálása céljából, hogy az izolált lys-plazminogén tartalmaz-e kisebb mennyiségű plazmint /az ioncserélő oszlopról lejövő eluátumban az urokináz-aktiválás következtében/, további tisztítást végeztünk lizin-Sepharose

segítségével. E tisztitő művelet egyebek mellett eltávolítja az aprotinint.

Mindkét eluátumot az alább megadott kiegyensúlyozó pufferrel szemben dializáltuk és lizin-Sepharose-on affinitáskromatográfiával tisztítottuk.

Oszlopméret: 5 ml, átfolyási sebesség: 50 ml/h

Kiegyensúlyozó puffer: 0,1 M NagHPO^, 0,02% Tween-80, 80,3 mg/liter parotinin, pH 7,4

1. mosópuffer = kiegyensúlyozó puffer

2. mosópuffer = 0,15 M NaCl-ot tartalmazó, aprotinin nélküli kiegyensúlyozó puffer.

Az eluciót 0,02% Tween-80-at és 0 - 5 mM 6-AHA-t tartalmazó 0,1 M Na2HP0^ gradiensével /50 - 50 ml/ hajtjuk végre.

A 4. ábrán az 1. kísérletből származó dializált eluátum /NaCl/ eluciós profilja látható.

Az alapvonal alatti számok /1, 2, 3 és 4/ a következő műveletekre vonatkoznak:

1. Minta felvitele

2. 1. mosópuffer

3. 2. mosópuffer és

4. az eluciós gradiens elindítása.

Az alapvonal feletti számok /8, 10, 12/ az SDSPAGE eljárásban használt frakciók számát mutatja /6. ábra/.

Az 5« ábra a 2. kísérletből származó dializált eluátum eluciós profilját mutatja /6-AHA/.

Az alapvonal alatti számok a következő műveletekre conatkoznakí

1. mintafelvitel

2. 1. mosópuffer

3. 2. mosópuffer

4. gradiens elució kezdete.

Egyes esetekben '’váll-képződés figyelhető meg, mint a 4. ábrán. Az irodalomból ismeretes, hogy a plazminogén két glikolizációs formájának különböző az affinitása lizinSepharose iránt.

A 6. ábra, amely a lizin-Sepharose pszlopról eluált frakciók SDS-PAGE képe, azt mutatja, hogy a lys-plazminogén eléggé tiszta, tekintetbe véve, hogy csak két tisztító műveleten esett át.

A sávok számainak jelentése:

1. molekulatömeg standard

2. plazma-eredetű lys-plazminogén

3. a 4. ábrán látható elució mintája /a 910723 sz. próbából

6-AHA nélkül /1. ábra/

4. = 3

5. a 4. ábra 7. sz. frakciója

6. a 4. ábra 9. sz. frakciója

7. a 4. ábra 11. sz. frakciója

8. az 5. ábrán látható elució mintája /a 910724 sz. próbából • · ·

- 20 6-AHA-val, 2. ábra/

9. = 8

10.	az	5. ábra	7.	sz.	frakciója
11.	az	5. ábra	8.	sz.	frakciója
12.	az	5. ábra	9.	sz.	frakciója
13.	az	5. ábra	10.	sz	. frakciója

14. molekulatömeg standard.

A 7. ábra a találmány szerint tisztított, azaz az S-Sepharose tisztitó műveletben 6-AHA-val eluált /A/, és NaCl-dal eluált /B/ tisztított lys-plazminogén plazminelemzésének eredményeit mutatja. Az elemzést S 2251 kromogén szubsztrát segítségével hajtottuk végre. A próba standard eljárás, ahol a plazmin enzimatikus hatására p-NA hasad le az S 2251-ről /H-D-Val-Leu-Lys-pNA/, és a kialakult sárga szint 405 nm-en fotometriás utón értékeljük. A próba előtt minden mintát azonos fehérjekoncentrációra hígítunk. Világosan látható, hogy plazmin nem mutatható ki abban a termékben, amelyet az S-Sepharose-ról 6-AHA-val eluáltunk /nincs szinképződés/. Ha az eluciót NaCl-dal jaktjuk végre, a termék plazmint tartalmaz, ami arra utal, hogy az eluátumban a lysplazminogén bizonyos aktiválása következett be.

Claims (7)

1. Szabadalmi igénypontok

   1. Eljárás kringle-tartalmú fehérjék tisztítására, amelyek az őket tartalmazó fehérjeoldatból £J-aminosavakhoz képesek kötődni,., azzal jellemezve, hogy az eljárás a következő műveletekből áll:

   a/ a kringle-tartalmu fehérjeoldatot ioncserélő oszlopra visszük fel olyan körülmények, hogy a kringle-szerkezetü fehérje az oszlop anyagához kötődik;

   b/ a kringle-tartalmu fehérjét C-aminosavval eluáljuk a pH és ionerősség lényeges megváltozása nélkül; és c/ a b/ műveletben kapott eluátumból a kringletartalmu fehérjét további alkalmas tisztitó műveletekkel izoláljuk.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal j ellemezve , hogy ú>-amino savként 4-amino-vajsavat, 5-amino-pentánsavat, 6-amino-hexánsavat, 7-amino-heptánsavat,

   8-amino-oktánsavat, lizint, arginint vagy terc-amino-metil-ciklohexán-1-karbonsavat alkalmazunk.
3. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kringle-tartalmu fehérje t-PA vagy egy t-PA-analóg.
4. 4. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal j ellemezve , hogy a fehérje plazminogén vagy • · « plazminogén-származék.
5. 5. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jel

   1 e m e z v e , hogy a plazminogén-származék lys-plazminogén.
6. 6. Az előző igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy -aminosavként 6-amino-hexánsavat /6-AHA/ alkalmazunk.
7. 7. Az előző igénypontok bármelyike szerinti el- járás, azzal jellemezve, hogy a b/ műveletben kapott eluátumon affinitáskromatográfiát végzünk.