HUT64582A

HUT64582A - Method for producing recombinant human interleukin-1 inhibitor

Info

Publication number: HUT64582A
Application number: HU9201777A
Authority: HU
Inventors: Robert Hageman; Stephen P Eisenberg; David Dripps; Ronald Evans; Henryk Cudny; Robert C Thompson
Original assignee: Synergen Inc
Priority date: 1989-11-29
Filing date: 1990-11-29
Publication date: 1994-01-28
Also published as: CA2068320C; CA2068320A1; FI104733B; KR0182819B1; GR3024031T3; NO922138L; US5453490A; NO922138D0; ATE152172T1; FI922434A; ES2103305T3; JP3014007B2; DE69030582D1; JPH05503007A; HU9201777D0; DK0502956T3; DE69030582T2; EP0502956A1; EP0502956A4; BR9007883A

Description

A rekombináns DNS technika területén sokféle fehérjét állítottak elő laboratóriumokban a kutatási célokra alkalmas mennyiségekben. Annak ellenére azonban, hogy a kutatási mennyiségek előállításának technológiáját optimalizálták, ezek a laboratóriumi szintézis és tisztítási módszerek gyakran nem alkalmasak arra, hogy a kívánt fehérjét kereskedelmi mennyiségben, és ezzel egyidejűleg a humán gyógyszerészetben történő felhasználáshoz szükséges minőségben előállítsák.

Egy adott fehérje kereskedelmi mennyiségben és megfelelő minőségben történő előállításához különleges fermentációs, elválasztási és tisztítási eljárásokra van szükség. A feltárt fehérje mennyiségét és a végtermék tisztaságát gyakran befolyásolja továbbá az alkalmazott technológiák kombinációja és alkalmazási sorrendje is.

A 199 915, 238 713, 248 521 és 266 531 alapszámu USA-beli szabadalmi bejelentések egy különleges fehérje, a humán interleukin-1 inhibitort ismertetik. Ezek az irodalmak ismertetik továbbá a rekombináns humán interleukin-1 inhibitor, a továbbiakban IL-li laboratóriumi méretekben transzformált mikroorganizmussal történő előállítását. Ezek az eljárások azonban nem eredményeznek kereskedelmi mennyiségű és humán célokra alkalmazható minőségű IL-li-t.

A jelen találmány keretein belül olymódon kombináljuk a fermentációs, elválasztási és tisztítási technikákat, amely lehetővé teszi kereskedelmi mennyiségű és magas tisztaságú

IL-li előállítását. Ebben az értelemben a kereskedelmi menynyiségü kifejezés legalább néhányszor 10 vagy néhányszor

100 g magas tisztaságú terméket jelent 100 1 fermentációs elegyre számolva. A magas tisztaságú kifejezés humán célokra alkalmas tisztaságot jelent. Közelebbről, a magas tisztaságú termék legfeljebb 5 E.U./dózis endotoxint, és legfeljebb 0,0025 tömeg% E. coli fehérjét tartalmaz.

A találmány feladata uj eljárás kidolgozása kereskedelmi mennyiségű rekombináns humán interleukin-1 inhibitor előállítására.

A feladat megoldásához az IL-li termelésére alkalmas javított mikroorganizmus törzset dolgoztuk ki, amelynek jele SGE90, és amely a találmány szerinti eljárás során legalább 50 g magas tisztaságú IL-li termelésére alkalmas 100 1 fermentációs elegyre számolva.

A találmány értelmében a kereskedelmi mennyiségű és nagy tisztaságú IL-li előállítása során előnyösen úgy járunk el, hogy

1) IL-li-t kódoló DNS-t tartalmazó plazmidot hordozó E. coli-t fermentálunk,

2) a sejtet feldolgozzuk, ennek során

a) a sejtet feltárjuk,

b) roncsoljuk és

c) a lizátumot tisztítjuk,

3) egy első ioncserés lépést végzünk,

4) egy második ioncserés lépést végzünk,

5) a kapott anyagot, előnyösen bekoncentrálással és diaszüréssel, feldolgozzuk.

A termék tisztaságának fokozása érdekében kívánt esetben egy harmadik ioncserés lépést is végzünk.

A találmány szerinti eljárás egyik előnyös megvalósítási módja szerint a fermentációs lépést egy mikroorganizmusban, előnyösen E. coli-ban végezzük, mig az első ioncserés lépést kationos S-Sepharose ioncserélő gyantával töltött oszlopon végezzük. Egy másik előnyös megvalósítási mód szerint a második ioncserés lépés anionos Q-Sepharose ioncserélő gyantával töltött oszlopon végezzük. Az adott esetben alkalmazott harmadik ioncserés lépést előnyösen kationos S-Sepharose ioncserélő gyantával töltött oszlopon végezzük.

Megjegyezzük, hogy a kövektező általános leírás és példaszerű kitanitás a megoldás bemutatására és példaszerű alátámasztására szolgál, és nem jelenti az oltalmi kör korlátjait. A mellékelt rajz a leírás részét képezi, és a találmány szerinti megoldás különleges esetét mutatja be, és a leírással együtt a megoldás bemutatására szolgál.

A találmány értelmében tehát előnyösen úgy járunk el, hogy

1) egy, IL-li-t kódoló DNS-t tartalmazó plazmidot hordozó E. coli törzset fermentálunk,

2) a sejteket feldolgozzuk, amelynek során

a) a fejtet feltárjuk,

b) roncsoljuk, és

c) a lizátumot tisztítjuk,

3) egy első ioncserés lépést végzünk,

4) egy második ioncserés lépést végzünk, ♦ · · . ₉ • · ♦ · · φ ♦ ····· · , • ··«····· ······ « φ

5) a kapott terméket, előnyösen bekoncentrálássál és diaszüréssel feldolgozzuk.

Kívánt esetben egy harmadik ioncserés lépést is végzünk. Ezt az adott esetben alkalmazott lépést közvetlenül a második ioncserés lépés után hajtjuk végre.

Az E. coli fermentálását és a sejtek feldolgozását a területen jártas szakember számára ismert módon végezzük. A fenti lépések előnyös megvalósítási módját az alábbiakban ismertetjük, de ezek helyett bármely más ismert megvalósítási mód alkalmazható.

A találmány értelmében a kereskedelmi mennyiségű IL-li előállításához egy első ioncserélő oszlopot alkalmazunk. Mint említettük, az oszlopot előnyösen kationos S-Sepharose gyantával (lásd 2. példa) töltjük. Ioncserélő gyantaként alkalmazható továbbá SP-C25 Sephadex, CM Sephadex, CM Sepharose vagy CM cellulóz gyanta. Az IL-li további tisztításához egy második ioncserélő oszlopot alkalmazunk. Mint említettük, anionos ioncserélő gyantaként előnyösen Q-Sepharose gyantát alkalmazunk. Anionos ioncserélő gyantaként alkalmazható továbbá DEAE-Sepharose, Q-Sephadex vagy DEAE cellulóz gyanta is.

A találmány szerinti eljárás egyik megvalósítási módja szerint közvetlenül a második ioncserés után egy harmadik ioncserés lépést is végzünk. Ebben az adott esetben alkalmazott harmadik lépésben kationos ioncserélő gyantával töltött oszlopot alkalmazunk. Ennek során kationos ioncserélőként előnyösen alkalmazható az S-Sepharose gyanta, • 4 • · · · 4 « * ··· · · ♦ ♦ · ’ ····<···· · ·····» · « _β

- 6 valamint bármely más ismert változtatható gyanta. Ezekre példaként említhető az SP25-Sephadex, CM-Sephadex, CM-Sepharose, CM cellulóz, vagy CM Toyopearl gyanta.

A fenti lépések után a kapott terméket feldolgozzuk. Ennek során a terméket kívánt esetben bekoncentráljuk, és az IL-li-t diaszüréssel izoláljuk. Ezeket a lépéseket a területen jártas szakember számára ismert módon hajtjuk végre.

Az eljárás megvalósítása során fontos szerepet játszanak az olyan kvantitatív analitikai módszerek, amelyek lehetővé teszik a kitermelés és a tisztaság meghatározását.

Mint ezt a 4. példában közelebbről bemutatjuk, a fenti célból egy olyan módszert dolgoztunk ki, amely egy reverz fázisú HPLC (RP-HPLC) vizsgálatból, egy ioncserés HPLC (IE-HPLC) vizsgálatból, egy SDS-PAGE vizsgálatból, egy méretkizárás vizsgálatból, egy tripszin-peptides térképezésből, és egy biológiai aktivitás vizsgálatból áll. Az első négy említett vizsgálat szerint a találmány szerinti eljárással előállított magas tisztaságú IL-li tisztasága nagyobb, mint 90 %. Közhelebbről, az IE-HPLC vizsgálat szerint a magas tisztaságú IL-li tisztasága legalább 98 %, mint a mono-Q, mint a mono-S oszlopban. Az SDS-PAGE vizsgálat szerint a magas tisztaságú IL-li tisztasága legalább 99,5 %, mig a méretkizárás vizsgálat szerint legalább 98 %. A magas tisztaságú IL-li tripszinpeptides térképezése során az elméletileg várt mintát kapjuk. A magas tisztaságú IL-li a biológiai vizsgálatok szerint gátolja az IL-1 fehérjét.

A találmány szerinti eljárást közelebbről az alábbi példákkal világítjuk meg anélkül, hogy az oltalmi kör a példákra korlátozódna.

1. példa

1) Az IL-li cDNS átvitele egy lambda fágból egy Bluescript plazmid klónozó vektorba

A GT10-IL-li-2a lambda fágot (ATCC 40488) EcoRI enzimmel hasítjuk, és az IL-li cDNS-t tartalmazó 1,7 kb fragmenst gélelektroforézis segítségével tisztítjuk. A kapott fragmenst EcoRI enzimmel hasított Bluescript SKM13 plazmáddal (Stratagene) ligáljuk, amelynek során BS-IL-li-2 plazmidot kapunk.

2) IL-li kifejező vektor kifejlesztése a T7 rendszer segítségével

A. A pT5T átírása

Az IL-li előállításához alkalmazott T7 kifejező vektor a pT5T nevet viseli. Ez lényegébenazonos a pJU1003 plazmiddal (Squires és munkatársai: J. Bioi. Chem. 31, 16297-16302 (1988)), azzal az eltéréssel, hogy a T7 promoter 5' végének egyetlen Bgl2 helye és a tetraciklin rezisztenciáért felelős gén Clal helye közötti DNS röviden meg van feszítve.

Ez a DNS az alábbi szekvenciát mutatja:

ATCGATGATA AGCTGTCAAA CATGAGAATT GAGCTCCCCG GAGATCCTTA Clal

GCGAAAGCTA AGGATTTTTT TTAGATCT

Bgl2

A vektort BamHI és Smal restrikciós enzimekkel linearizáljuk. A BS-IL-li-2 plazmidot PflMl és Scal enzimekkel hasítjuk, és az érett IL-li gén 4-152 aminosavját kódoló szekvenciát, a terminációs kodont és a 3' le nem fordított szakasz 3 bp részét hordozó 453 bp fragmenst poliakrilamid gélelektroforézissel tisztítjuk. Szintetizáljuk az alábbi szekvenciával rendelkező oligonukleotidot, az 5' végeket foszforilezzük, és kapcsoljuk.

' GATCCATTGGAGGATGATTAAATGCCGCCCT 3 '

3' GTAACCTCCTACTAATTTACGGC 5·

Ezek az oligonukleotidok a T7 Φ10 génnek az IL-li génhez történő transzlációs kapcsolásához szükséges szekvenciákat tartalmazzák. A kapcsolt oligonukleotidokat, a linearizált vektorfragmenst, és a 453 bp IL-li génfragmenst tartalmazó elegyet T4 DNS ligázzal kezeljük, majd E. coli JM109 törzsbe transzformáljuk (lásd az 1. ábrát).

B. Az IL-li mutációja

Az izolált és megfelelő szekvenciával rendelkező plazmid ·♦ · » β • · · * · · • «··«· > · • ········ • ·· · ·· · ·

- 9 a pRJl jelet kapta. A pRJl plazmid különböző IL-li fehérjéket kódoló szekvenciákat tartalmaz. Az egyes fehérjeváltozatok aminoterminális szekvenciája Met-Pro-Pro-Ser, mig a természetes humán fehérje aminoterminális szekvenciája Arg-Pro-Ser. Az volt a célunk, hogy a természetes fehérjéhez a lehető legközelebb álló fehérjéket fejezzünk ki. Ebből a célból az IL-li fehérjét kódoló DNS-t megváltoztattuk úgy, hogy a Met-Arg-Pro-Ser szekvenciát kódolja. A pRJl plazmidban lévő IL-li gént BamHI és PstI enzimekkel végzett hasítással eltávolítjuk. Az 1375 bp fragmenst az M13 mp 19 BamHI és PstI helyei közé klónozzuk, és a kapott plazmid az M13-IL-1Í1 jelet kapta.

Az Mll-IL-lil izolált egyszálu DNS-én helyspecifikus mutációt hajtunk végre a BioRad Mutagene mutációs készlet előírásai szerint. A megváltoztatott oligonukleotid szekvenciát a mutált IL-li aminoterminális aminosav szekvenciájával együtt az alábbiakbn adjuk meg:

5’ TGATTAAATGCGTCCGTCTGGGAG 3'

M R P S G R

Ezzel a mutációval olyan M13 IL-1Í2 plazmidot kapunk, amely annyiban tér el az M13-IL-1Í1 plazmidtól, hogy a kódolt IL-li fehérje a kívánt aminoterminális szekvenciával rendelkezik, és az Arg és Pro aminosavakra az E. coli által preferált kodonokat tartalmazza.

«« * · · ·

C. Az IL-li fehérje kifejezése

A megváltoztatott IL-li gént visszatranszformáljuk a pT5T plazmidba a fent leirt módon. A kapott második kifejező plazmid a pRJ2 jelet kapta. A pRJ2 plazmidot E. coli BL21 (DE3) törzsbe transzforrnáÍjuk. Ez a törzs (lásd Studier és Moffat: J. Mól. Bioi. 189. 113-130 (1986)) T7 RNS polimerázt tartalmaz az IPTG által indukálható lac promoter szabályozása alatt, és egy ki nem hasítható lizogén lambda bakteriofágon belül. Az rIL-li kifejezésének fokozásához a sejteket [BL21(DE3)pRJ2] 15 Mg/ml tetraciklinnel kiegészített Luria táptalajon tenyésztjük Αβθθ = 0,8 sejtsürüség eléréséig. Ezután 1,0 mmól/1 végkoncentrációig IPTG-t adagolunk, és a sejteket 4 órán keresztül növesztjük. A sejteket ezután centrifugálással begyüjtjük, és az rIL-li-t az oldható sejtlizátumból a fehérjekémia szokásos módszereivel tisztítjuk.

3) IL-li kifejező vektor kifejlesztése a tac promoter rendszer segítségével

A. pDDl előállítása

A pJU1003 plazmidot (Squires és munkatársai idézett müve) Hindin és BamHI enzimekkel hasítjuk, és egy szintetikus humán hasnyálmirigy kiválasztásu tripszin inhibitor (HPSTI) génnel fuzionáljuk, amelynek szekvenciája:

*··· ♦ ··· Λ·

- 11 EcoRl

GAATTCGATA

CTTAAGCTAT

AGGCGCAAAA

TCCGCGTTTT

GGTTTCGCTA

CCAAAGCGAT

CTACAACGAA GATGTTGCTT

CCGACGGTGA

GGCTGCCACT

AAACGTCAGA TTTGCAGTCT

TCTCGTTGGA

AGAGCAACCT

GATATTCATG

CTATAAGTAC

GATGATAACG

CTACTATTGC

AATGAAAAAG

TTACTTTTTC

CCGTAGCGCA

GGCATCGCGT

CTGAACGGTT GACTTGCCAA

CACCTACCCG

GTGGATGGGC

CCTCCATCCT GGAGGTAGGA

ACAGCTATCG TGTCGATAGC

GGCTGACTCT

CCGACTGAGA

GCACTAAAAT CGTGATTTTA

AACGAATGCG TTGCTTACGC

GATCCAGAAA

CTAGGTCTTT

TGCTGTGCTT ACGACACGAA

TCTGGTCCGT AGACCAGGCA

ACGTATTTTG TGCATAAAAC . PW-l CGATCGCAGT GCTAGCGTCA

CTGGGTCGTG

GACCCAGCAC

CTACAACCCG

GATGTTGGGC

GGCACTGGCT

CCGTGACCGA

AAGCTAAGTG TTCGATTCAC

GTATGTGGTA CATACACCAT

CGAAAACCGT

GCTTTTGGCA

GCTAAGTCGAC CGATTCAGCTG

Hind 3

CCTGCAGAAG CTT...

GGACGTCTTC GAA...

Ehhez a HPSTI gént Pvul és Hind3 enzimekkel hasítjuk, és a Pvul/Hind3 fragmenst a BamHI és Hind3 enzimekkel hasított plazmidhoz ligáljuk egy alábbi szekvenciáju kettősszálu oligonukleotid adapter felhasználásával:

5’

GAT CCG ATC TTG GAG GAT GAT

TAA ATG AAA

AAG AAC GCT

ATC

GC TAG AAC CTC CTA CTA

ATT TAC TTT

TTC TGG CGA

TAG

GCC

AT

CGG

5’

Ez szintetikus HPSTI gén az érett HPSTI fehérjével fuzionálva olyan fehérjét kódol, amely tartalmazza az E.

coli ompA fehérje szignálpeptidjét. Ezzel a művelettel tehát a pJU1003 plazmidba az ompA szignálpeptidet kódoló szekven ciát vittünk be. A kapott plazmid pDDl jelet kapta. A pDDl plazmidot BstXl és Hind3 enzimekkel emésztjük.

B. pDD3 plazmid előállítása és E. coli transzlációs szignál összekapcsolása az IL-li cDNS-sel

A pT5T plazmidot (lásd fent) BamHI és Smal enzimekkel hasítjuk. A BS-IL-li-2 plazmidot PflMl és Scal enzimekkel hasítjuk, amelynek során olyan 453 bp fragmenst szabadítunk fel, amely az IL-li fehérje egy szakaszát kódolja (lásd • V *

n«i

fent) . A BamHl és Smal enzimekkel hasított pT5T, a 453 bp

Il-li fragmens és az alábbi szekvenciáju oligonukleotid adapter összekapcsolásával pDD2 plazmidot kapunk:

BstXl

5'

GA

TCC

ATC

GCA

GTG

GCA

CTG

GCT

GGT

TTC

GCT

ACC

GTA

GCG

3 '

G

TAG

CGT

CAC

CGT

GAC

CGA

CCA

AAG

CGA

TGG

CAT

CGC

CAG

GCC

CGT

CCC

T

3'

GTC

CGG

GCA

G

5’

A pDD2 plazmidot BstXl és Hind3 enzimekkel hasítjuk, és igy olyan 499 bp fragmenst szabadítunk fel, amely a teljes IL-li fehérjét és az ompA szignálszekvencia egy részét kódolja. Ezt a 499 bp fragmenst a BstXl és Hind3 enzimekkel hasított pDDl plazmiddal összekapcsolva pDD3 plazmidot kapunk.

C. PT3XI-2 plazmid előállítása, és a PKK223-3 plazmid módosítása

A pKK223-3 plazmid (Pharmacia) tetraciklin rezisztenciáért felelős parciális gént hordoz. Ezt a nem funkcionális gént a pBR322 plazmidban lévő teljes tetraciklin rezisztenciáért felelős génnel helyettesítjük. A pKK223-3 plazmidot Sphl enzimmel teljesen, és BamHl enzimmel részlegesen emésztjük. Egy 4,4 kb fragmenst gélelektroforézissei tisztítunk, és egy alábbi szekvenciáju szintetikus adapterrel, valamint a pBR322 plazmid (PL Biochemicals, 27-4891-01) tetraciklin rezisztenciáért felelős génjének a

Clal és Sphl enzimekkel végzett emésztésével kapott 539 bp

DNS fragmenssel kapcsoljuk:

5' GATCTAGAATTGTCATGTTTGACAGCTTATCAT 3'

3' ATCTTAACAGTACAAACTGTCGAATAGTAGC 5'

A kapott plazmid a pCJl jelet kapta.

A pCJl plazmid PvuII helyére egy Xhol linkért (New England Biolabs) beépítve pCJX-1 plazmidot kapunk. Ez a beépítés szétroncsolja az rop gént, amely szabályozza a plazmid másolatainak számát. A pMC9 plazmidból (Calos és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80. 3015-3019 (1983)) egy lacl gént hordozó EcoRI fragmenst izolálunk, majd az Xhol helyen Xhol segítségével az alábbi szekvenciáju EcoRI adapterbe építjük:

5' TCGAGTCTAGA 3'

3’ CAGATCTTTAA 5'

A pKK223-3 plazmid EcoRI és PstI helyei között elhelyezkedő polilinker szekvenciát az alábbi szekvenciáju polilinkerrel helyettesítjük:

5* AATTCCCGGG TACCAGATCT GAGCTCACTA GTCTGCA 3' · GGGCCC ATGGTCTAGA CTCGAGTGAT CAG 5'

A kapott plazmid vektor a pCJXI-1 jelet kapta.

Végül, a tetraciklin rezisztenciáért felelős gént olyan hasonló génnel helyettesítjük, amely tartalmazza a biszulfit mutációval elroncsolt Hind3, BamHl és Sáli restrikciós felismerő helyeket. A pBR322 plazmid tetraciklin részintencióért felelős génjének mutációjához a következő eljárást alkalmaztuk. A pBR322 plazmidot Hind3 enzimmel hasítjuk, majd nátrium-biszulfittál mutáljuk (Shortle és Nathans: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 5, 2170-2174 (1978)). A mutált DNS-t ligáivá köralaku DNS-t állítunk elő, ezt Hind3 enzimmel hasítva linearizáljuk a mutációt túlélt plazmidot. E. coli JM109 törzset (Yanish-Perron és munkatársai: Gene 33. 103-119 (1985)) a plazmiddal transzforrnálünk, majd szelektáló közegre visszük. A plazmidokat izoláljuk a tetraciklin rezisztens telepekből, és ellenőrizzük a Hind3 hasítási hely kiiktatását a tetraciklin rezisztenciáért felelős génből. A megfelelően mutált plazmid a pTl jelet kapta. A pTl plazmid BamHl helyét hasonló módon megváltoztatva pT2 plazmidot kapunk. A pT2 plazmid Sáli helyét megváltoztatva viszont pT3 plazmidot kapunk. Izoláljuk a pT3 plazmidnak a megváltoztatott tetraciklin rezisztenciáért felelős gént hordozó Call-BsmHl fragmensét, és a pCJXI-1 homológ fragmensét ezzel helyettesítve pT3XI-2 plazmidot kapunk. A megváltoztatott tetraciklin rezisztenciáért felelős gén továbbra is kódolja a funkcionális fehérjét.

D. pT3XI-2-$10TC3FGFsvn előállítása, valamint IL-li promoter vektor előállítása

Először egy fibroblaszt növekedési faktor (FGF) fehérjére vonatkozó gént” szintetizálunk. Ez a gén·· ugyanazt a szekvenciát kódolja, mint az FGF Sommer és munkatársai által kimutatott szekvenciája, de az E. coli által preferált kodonokat tartalmazza. Ebben a szerkezetben a kódoló szakaszt egy transzlációs kapcsoló szekvencia (Squires és munkatársai idézett müve) előzi meg, amely biztosítja a transzláció hatékony megindítását.

Az FGF szintetikus gént először az M13mpl8 EcoRI és Hind3 hasítási helyei közé építjük be, és szekvenáljuk. A gén szerkezete a következő:

- 17 AATTCAGGA TCCGATCGTG GAGGATGATT AAATGGGTAC CATGGCTGCT GGCTCCATCA

GTCCT AGGCTAGCAC CTCCTACTAA TTTACCCATG GTACCGACGA CCGAGGTAGT EcoRI BamHI________RBS____________FGFatart transzlációs kapcsoló ³

CTACCCTGCC GGCACTGCCG GAAGACGGTG GCTCCGGTGC TTTCCCGCCG GGCCACTTCA GATGGGACGG CCGTGACGGC CTTCTGCCAC CGAGGCCACG AAAGGGCGGC CCGGTGAAGT

AAGACCCGAA ACGTCTGTAC TGTAAAAACG GTGGCTTCTT CCTGCGTATC CACCCGGATG TTCTGGGCTT TGCAGACATG ACATTTTTGC CACCGAAGAA GGACGCATAG GTGGGCCTAC

GTCGTGTCGA CGGCGTACGT GAAAAAAGCG ACCCGCACA TCAAACTGCA GCTGCAGGCTG CAGCACAGCT TGCCGCATGC ACTTTTTTCC TGGGCGTGT AGTTTGACGT CGACGTCCGAC

AAGAACGTG GTGTTGTATC TATCAAAGGC GTTTGCGCAA ACCGTTACCT GGCTATGAAAG TTCTTGCAC CACAACATAG ATAGTTTCCG CAAACGCGTT TGGCAATGGA CCGATACTTTC

AAGACGGTC GTCTGCTGGC TAGCAAATGT GTAACTGACG AATGTTTCTT CTTCGAACGTC TTCTGCCAG CAGACGACCG ATCGTTTACA CATTGACTGC TTACAAAGAA GAAGCTTGCAG

TGGAAAGCA ACAACTACAA CACCTACCGT TCTCGTAAAT ACACTTCTTG GTACGTTGCTC ACCTTTCGT TGTTGATGTT GTGGATGGCA AGAGCATTTA TGTGAAGAAC CATGCAACGAG

TGAAACGTA CCGGCCAGTA CAAACTGGGT TCCAAAACTG GCCCGGGTCA GAAAGCAATCC ACTTTGCAT GGCCGGTCAT GTTTGACCCA AGGTTTTGAC CGGGCCCAGT CTTTCGTTAGG

TGTTCCTGC CGATGAGCGC TAAATCTTAA ACTAGTA ACAAGGACG GCTACTCGCG ATTTAGAATT TGATCATTCGA

FGFstop HinDIII

Az ábrán aláhúzás jelöli a gén különleges tulajdonságait.

Ezután BamHI és Hind2 enzimekkel végzett emésztéssel, és a BamHI/Hind3 enzimekkel hasított pJU1003 plazmidba (Squires és munkatársai idézett müve) történő beépítéssel pJU1003-synFGF plazmidot kapunk. Ezt a plazmidot Xbal és Hind3 enzimekkel hasítjuk, és izoláljuk az FGF gént hordozó Xbal/Hind3 fragmenst. Ezt a fragmenst EcoRI és Hind3 enzimekkel hasított pT3XI-2 plazmidba ligáljuk az alábbi EcoRI-Xbal linker segítségével:

5' pAAT TCC ACA ACG GTT TCC CT 3'

3' GG TGT TGC CAA AGG GAG ATCp 5'

A kapott plazmid a pT3XI-2-*10TC3FGFsyn jelet kapta.

E. pDD4 plazmid előállítása és az IL-li bevitele egy tac promoter vektorba

A pTC3XI-2-$10TC3FGFsyn plazmidot BamHI és Hind3 enzimekkel hasítjuk, amellyel linearizáljuk a 7,4 kb kifejező vektort, és felszabadítjuk a beépített DNS-t. A DNS-t ezután Ncol és Smal enzimekkel hasítjuk, amely a beépített DNS-t fragmentáija. A pDD3 plazmidot BamHI és Hind3 enzimekkel hasítjuk, és az 546 bp IL-li fragmenst gélelektroforézissel tisztítjuk, majd a pT3XI-2-$10TC3FGFsyn plazmid BamHI/Hind3 enzimekkel hasított 7,4 kb vektor DNS fragmensével egyesit- 19 jük, amikor pDD4 plazmidot kapunk.

F. dDD5 plazmid előállítása, és az E. coli által preferált kodonok alkalmazása

A pDD4 plazmid tartalmazza az ompA szignálszekvenciát, és a teljes hosszúságú IL-li fehérjét kódoló DNS-t, mivel ez utóbbi az eredeti cDNS-ből származik. A pDD4 plazmidot BamHI és Spel enzimekkel hasítjuk, és igy egy kisméretű fragmenst (170 bp) szabadítunk fel, amely tartalmazza az ompA szignálpeptidet kódoló szekvenciát, és az IL-li fehérje első 29 aminosav maradékának kodonját. Emellett egy nagyméretű (7,8 kb) vektor fragmenst kapunk. A nagyméretű BamHI/Spel vektor fragmenst négy szintetikus oligonukleotidból összeállított két kisméretű DNS fragmenssel kapcsoljuk. A fenti fragmensek szekvenciája a következő:

5' GAT CCG ATC TTG GAG GAT GAT TAA ATG CGT CCG AGC GGC CGC 3* GC TAG AAC CTC CTA CTA ATT TAC GCA GGC TCG CCG GCG

SacI

AAG AGC TCC AAA AT 3'

TTC TCG AGG TTT TAC GTC CG 5'

5* G CAG GCT TTC CGT ATC TGG GAC GTT AAC CAG AAA ACC TTC

TAC

3' A AAG GCA TAG ACC CTG CAA TTG GTC TTT TGG AAG

ATG

CTG CGC AAC AAC CAA 3'

GAC GCG TTG TTG GTT GAT C 5' • · * ···· ··· · · · · ·

Ezek a fragmensek az IL-li fehérje első 29 aminosav maradékát kódoló szekvenciát tartalmazzák, és az E. coli által preferált kodonokat hordozzák (deBoer és Kastelein: Gene to Protein: Steps Dictating the Maximai Level fór Gene Expresssion, Davis and Reznikoff, pp. 225-283, Butterworths, New York, USA (1986)), emellett egy egyetlen SacI hasítási helyet tartalmaz az IL-li hatodik kodonja után. A kapott plazmid a pDD5 jelet kapta.

G. dDD6 plazmid előállítása, az mRNS szekunder szerkezetének eltávolítása

A pDD5 plazmidot BamHI és SacI enzimekkel hasítjuk, a nagyméretű (7,8 kb) vektor fragmenst egy alábbi szekvenciáju szintetikus DNS fragmenssel ligáljuk:

5' GAT CCG ATC TTG GAG GAT GAT TAA ATG CGA CCG TCC GGC CGT 3' GC TAG AAC CTC CTA CTA ATT TAC GCT GGC AGG CCG GCA

AAG AGC T 3'

TTC 5'

Ez a DNS fragmens az IL-li fehérje első hat maradékát kódolja, de olyan kodonokat hordoz, amelyek megelőzik, hogy az mRNS 5’ végéhez közel hajtühurok képződjön, amely magában foglalja a Shine-Dalgarno szekvenciát vagy az IL-li fehérje inditókodonját. így pDD6 plazmidot kapunk, amely az IL-li

- 21 előállításához alkalmazható kifejező vektor. A pDD6 plazmidot JM107 törzsbe transzformálva SGE90 törzset kapunk.

2. példa

1) IL-li előállítása E. coli SGE90 törzsből

Az E. coli SGE90 törzs tenyészetét oltóanyag céljából ampullázzuk. A szélesztett tenyészetet 15 mg/1 tetraciklin HCl-lel kiegészített Luria agar tápközegen növesztjük 37 °C hőmérsékleten. Egyetlen telepet kiválasztunk, és 15 mg/1 tetraciklin HCl-lel kiegészített Luria tápközegen 37 °C hőmérsékleten tovább növesztjük. A növekedést 660 nm hullámhosszon ellenőrizzük (és OD értékben fejezzük ki). Amikor a tenyészet eléri a mintegy OD = 1 értéket, aszeptikus körülmények között centrifugáljuk, és 20 tömeg% glicerol/Luria tápközeg 1:1 elegyében újra szuszpendáljuk. Ezután 1,5 ml-es részletekben ampullákba töltjük, és -70 °C hőmérsékleten tároljuk. A törzsoldatot ebből a sejtbankból készítjük, amelyhez 1 ampulla tartalmát 15 mg/1 tetraciklin HCl-lel kiegészített Luria tápközegen mintegy OD = 1 értékig növesztjük, majd a fent leirt módon ampullákba töltjük.

A fermentor előkészítéséhez az ampullákat 40 °C hőmérsékletű vezetéki vízben megolvasztjuk, és az ampulla készítmény 1 ml-es részletét oltjuk két 2 literes üvegedénybe töltött 0,5 liter oltóközegre (1. sorszámú összetétel) . Az üvegeket 37 °C hőmérsékleten 350 fordulat/perc értéken rázva mintegy 6 órán keresztül inkubáljuk. Az ol22 tóanyag OD értéke ez idő alatt mintegy 3-4.

500 ml oltóközeget alkalmazunk 10 liter fermentáció közeg (2. számú összetétel inokulálására). A tenyészetet 37 °C hőmérsékleten pH = 7,0 értéken 5-6 órán keresztül növesztjük, miközben mintegy OD = értéket ér el. A kapott oltótenyészetet használjuk a fermentor inokulálásához.

2) Fermentálás

A fermentálást 1600 liter fermentáció közegben (2. számú összetétel) végezzük. A hőmérsékletet 37 °C értékre szabályozzuk. Az oldott oxigén szintjét 30 % értéken tartjuk (21 kPa nyomású levegő bevezetésével) a pH értéket 7,0 szinten szabályozzuk sósav és nátrium-hidroxid adagolásával.

A növekedést az OD érték mérésével ellenőrizzük. Mintegy OD = 10 érték elérése után az IL-li termelését izopropil-B-D-tiogalaktozid (IPTG) 150 pmól/l végső koncentrációig történő adagolásával indítjuk be. A fermentálást mintegy OD = 40 érték elérésig folytatjuk. A kapott sejtkitermelés mintegy 150 kg szilárd anyag 1600 liter fermentációs közegre számolva.

3) Sejtfeltárás és mosás

A sejteket iszapmentesitő centrifugával (például Alfa Laval BTUX 510) tárjuk fel, és 150 mmól/1 koncentrációjú nátrium-klorid oldattal mossuk. A sejteket mintegy 16 tömeg% • ··· · · «· · .:.. ..· ·*:· ··;· :

- 23 szilárdanyag koncentrációban 150 mmól/1 koncentrációjú nátrium-klorid oldatban ismét szuszpendáljuk, megfagyasztjuk, és -20 °C hőmérsékleten tároljuk.

4) Seitroncsolás és a törmelék eltávolítása g újra szuszpendált sejtet (mintegy 2,2 kg szilárd anyag) felolvasztunk. 5 mmól/1 koncentrációban EDTA-t adunk a sejt szuszpenzióhoz, majd a sejteket nagy nyomású homogenizátorban kétszer áthajtva roncsoljuk. A pH-t 1 mól/1 ecetsav segítségével 5,5 értékre állítjuk, a lizátumot ± 2 literre hígítjuk vízzel, és 14 000 G értéken 20 percen keresztül centrifugálva tisztítjuk.

5) Első ioncserélés (a) Oszlop: A művelethez Amicon G300x250 oszlopot alkalmazunk, amit 7,5 liter S-Sepharose gyantával (Pharmacia) töltünk. Az oldatokat 500 ml/perc áramlási sebességgel szivattyúzzuk az oszlopra.

(b) Műveleti előírás: Az oszlop minden ciklusában a következő puffer sorrendet alkalmazzuk, a pufferek összetételét a 4. példa tartalmazza.

oldat Összetétel sorszáma	Térfoaat 20 liter
Kiegyenlítő	3
Tisztított sejtlizátum		15-25 liter
Kiegyenlítő	3	20 liter
Sógradiens oldat*	3/4	40 liter
Nátrium-hidroxid mosóoldat	5	10 liter
Ecetsav mosóoldat	6	5 liter

Tárolóoldat liter

Megjegyzés: * = A sógradiens értéke 150-400 mmól/1 nátrium-klorid

Az eluátumot 280 nm hullámhosszon vizsgálva összegyűjtjük, és a sógradiens közben eluálódó csúcsot egyesítjük. A feltárással mintegy 55 g IL-li-t kapunk mintegy 10 liter egyesített frakcióban 20 liter tisztított sejtlizátumból.

6) Második ioncserélés (a) Diaszürés: Az egyesített eluátumot kívánt esetben YM10 membránon (Amicon) bekoncentráljuk, majd a sót diaszüréssel 4 térfogatrész második ioncserélő kiegyenlítő puffer (8. számú összetétel) segítségével eltávolítjuk. A kapott csapadékot 3 /xm-es és 0,22 μιη-es szűrőn kiszűrjük.

(b) Oszlop; A művelethez Amicon G180x250 oszlopot al4 4

7) Végső feldolgozás (a) Dekoncentrálás és díaszürés: A második ioncserélő oszlop egyesített eluátumot YM10 membránon (Amicon) mintegy 6 liter térfogatra bekoncentráljuk. Az anyagot ezután 5 térfogatrész diazsürő pufferrel (10. számú összetétel) szemben diaszürjük. A végső koncentráció mintegy 1-2 liter térfogatban 10-30 g/1 kívánt anyag. A csapadékot 3 gm-es és 0,22 gm-es szűrőn szűrve eltávolítjuk. A végső koncentrátumot ezután 0,22 gm-es szűrőn steril, pirogénmentes csövekbe szűrjük, és -70 °C hőmérsékleten tároljuk. A feltárás a második ioncserés lépés egyesitett frakciójából mintegy 80 %.

3. példa

1) Az N-terminális metionin eltávolítása az E, coli által termelt IL-li fehérjéből

Az E. coli által termelt IL-li szekvenciája azonos a humán monocitákból származó IL-li-x szekvenciájával azzal az eltéréssel, hogy N-terminálisan egy további metionin maradékot tartalmaz. Ez a maradék S. cerevisiae-ből származó exoproteáz aminopeptidáz segítségével inkubálással eltávolítható.

mg rekombináns IL-li fehérjét (az első S-Sepharose gyantából vagy a tisztítási lépés Q-Sepharose gyantájából) 1 mg élesztő aminopeptidáz 1 segítségével inkubálunk, amit ·· ·»Ι « · <* Β

- 27 Change és Smith: J. Bioi. Chem. 264. 6979 (1989) szerint tisztítottuk. Az inkubálást 50 mmől/1 ammónium-karbonátban pH = 8,0 értéken 6 órán keresztül végezzük. A dezmetionil IL-li fehérjét a reakcióelegyből további S-Sepharose gyantán végzett kromatografálással tisztítjuk.

Kívánt esetben a dezmetionilezés lépése eltávolítható, ha az IL-li fehérjét valamely megfelelő kifejező vektorban az élesztő aminopeptidáz 1 cDNS-ét hordozó E. coliban fejezzük ki. További feltétel, hogy ez az E. coli ne fejezze ki az aminopeptidáz P génjét (Yoshimoto és munkatársai: J. Biochem. (Tokyo) 104 93 (1988)), mivel az N-terminális metionin eltávolítása egyébként az N-terminális arginin lehasadásához vezetne.

Szakember számára nyilvánvaló, hogy a fent ismertetett leírás mellett a találmány szerinti megoldás különböző változatokban és módosításokkal megvalósítható, amelyek a találmány oltalmi körén belül esnek.

- 28 A. Közegek és egyéb reagensek összetétele ····

4. példa

Sorsz. Lépés

Reagens neve Összetétel

Mennyiség

1.

fermentálás oltóközeg

élesztő extraktum	5 g/i
tripton	10 g/1
NaCl	io g/1
habosodásgátló*	0,2 ml/1
tetraciklin	15 mg/1
ionmentesi-	tetszés
tett víz	szerint

kivételével

A komponenseket a tetraciklin elkeverjük, és nátrium-hidroxiddal pH = =7,5 értékre állítjuk. A tetraciklint sterilen szűrjük és külön adagoljuk.

2. fermentálás

fermentációs	NZ amin HD	40 g/1
közeg	kh₂po₄	2 g/1
	MgSO₄.7H₂O	1 g/1
	NaSO₄	6 g/1
	nátrium-citrát	0,3 g/1
	glicerol	50 g/1
	habosodásgátló*	kb. 3 ml/1
	nyomelemek**	4 ml/1
	tiamin HC1	10 ml/1
	tetraciklin HC1	15 ml/1
	ionmentesi-	tetszés

tett víz szerint

- 29 (folytatás)

Sorsz. Lépés_____Reagens neve Összetétel_______Mennyiség ·«··

A habosodásgátlóig felsorolt komponenseket együtt sterilizáljuk. A nyomelemeket, a tiamint és a tetraciklint sterilen szűr jük és külön adagoljuk.
* fermentálás	habosodásgátló Macol 19	750 ml/1
	GE60 habosodás-
	gátló	250 ml/1
** fermentálás	nyomelemek FeCl₃.6H₂O	27 g/1
	ZnCl₂	1,3 g/1
	CoCl₂.6H₂O	2 g/1
	NaMo0₄.6H₂O	2 g/1
	CaCl₂.2H₂O	2,5 g/1
	CuCl₂.2H₂O	1,27 g/1
	MnCl₂.4H₂O	3,3 g/1
	H₃BO₃	0,5 g/1
	cc. HC1	160 ml/1
	ionmentesi-	tetszés
	tett víz	szerint

3. első ionkiegyenlítő nátrium-acetát 25 mmól/1 cserélés oldat

EDTA 1 mmól/1

NaCl 150 mmól/1 ionmentesi tett és ultra- tetszés szűrt víz szerint • 1

- 30 (folytatás)

Sorsz. Lépés_____Reagens neve összetétel_______Mennyiség ···♦ • · · · 4 Λ • ··· · · 9 « _· · »··« »<»«· * ··«· «· « · *

5 mól/1 ecetsavval pH - 5,5 értékre állítjuk.
4. első ion-	eluciós elegy nátrium-acetát 25 mmól/l
cserélés	magas sótarta- EDTA 1 mmól/l
	lommal NaCl 400 mmól/l

ionmentesitett és ultra- tetszés szűrt víz szerint mól/1 ecetsavval pH = 5,5 értékre állít

iuk.
5.	első/második	nátrium-hid-	NaOH	0,2 mól/1
	ioncserélés	roxid mosó-	NaCl	1,0 mól/1
		oldat	ionmentesi-
			tett és ultra-	tetszés
		9	szűrt víz	szerint
6.	első/második	ecetsavas	ecetsav	10 mmól/l
	ioncserélés	mosóoldat	ionmentesi-
			tett és ultra-	tetszés
			szűrt víz	szerint
7.	első/második	tárolóoldat	NaCl	1 mól/1
	ioncserélés		ionmentesi-
			tett és ultra-	tetszés
			szűrt víz	szerint

• · · (folytatás)

Sorsz. Lépés_____Reagens neve összetétel_______Mennyiség

8. második kiegyenlítő hisztidin 20 mmól/1 ioncserélés oldat EDTA 1 mmól/1 ionmentesitett és ultra tetszés szűrt víz szerint mól/1 sósavval pH = 6,0 értékre állítjuk.

9. második	magas sótar-	hisztidin	20 mmól/1
ioncserélés	i talmu eluciós	EDTA	1 mmól/1
	oldat	NaCl	100 mmól/1
		ionmentesi-
		tett és ultra-	tetszés
		szűrt víz	szerint
	5 mól/1 sósavval pH = 6,0 értékre
	állítjuk.
10. diaszürés	diaszürő oldat	NaH₂PO₄	10 mmól/1
		EDTA	0,1 mmól/1
		ionmentesi-
		tett és ultra-	tetszés
		szűrt víz	szerint
	5 mól/1 nátrium-hidroxiddal pH =	7,0 értékre
	állítjuk.

» · · ·

- 32 B. Reverz fázisú HPLC nem-redukáló körülmények között

HPLC rendszer:

Beckman 114 oldat adagoló modul

Beckman 165 változtatható hullámhosszúságú detektor

Beckman System Gold Analóg Interface Modulé 406

Beckman System Gold személyi számitógépes kromatografáló program

Oszlop:

Brownlee RP-300 (C8) (220 mm x 4,6 mm, 7 gm)

Detektor:

A csatorna: 215 nm

B csatorna: 280 nm

Intervallum: 0-0,05 AUFS

Mozgó fázis:

A: 0,1 tömeg% TFA vízben

B: 0,1 tömeg% TFA acetonitrilben

Gradiens:

Idő (perc)	B fázis (%)	Időtartam
0	0	5
5	30	30 (Induló gradiens
35	50	40
75	100	5 (befejező gradiens)
85	0	5
95	0	vége

- 33 Áramlási sebesség:

1,0 ml/perc

Minta készítmény:

A mintát vízzel 0,1-0,5 mg/ml koncentrációra hígítjuk.

Injekciós térfogat:

100 μΐ

Vegyszerek:

TFA (Sigma) katalógusszám: T-6508 acetonitril (HPLC tisztaság) (Baker) katalógusszám: 9017-03

C. Mono O HPLC

HPLC rendszer:

Beckman System Gold programozható oldat adagoló modul 126 pásztázó detektor modul 167 távoli interface modul

HP Series 1050 automata mintaadagoló

System Gold személyi számitógépes kromatografáló program

Oszlop:

Pharmacia mono Q HR 5/5

Detektor:

280 nm

- 34 • ·· · * • · « ··

Mozgófázis:

A: 20 mmól/1 trisz, pH = 7,5

B: 20 mmól/1 trisz, pH = 7,5 + 250 mmól/1 NaCl

Gradiens:

0-100 % B 60 perc alatt

Áramlási sebesség:

0,5 ml/perc

Minta előkészítés:

nincs

Beinjektált mennyiség:

μg

D. Mono S HPLC

HPLC rendszer:

HP Series 1050 automata mintaadagoló

System Gold személyi számitógépes kromatografáló program

Oszlop:

Pharmacia mono S HR 5/5

Detektor:

280 nm

Mozgófázis:

A: 25 mmól/1 nátrium-acetát, pH = 5,5 + 1 mmól/1 EDTA

B: 25 mmól/1 nátrium-acetát, pH = 5,5 + 1 mmól/1

EDTA + 500 mmól/1 nátrium-klorid

Gradiens:

0-60 % B 36 perc alatt

Áramlási sebesség:

0,5 ml/perc

Minta előkészítés:

nincs

Beinjektált mennyiség:

yg

E. Méretkizárásos HPLC

HPLC rendszer:

HP Series 1050 automata mintaadagoló

System Gold személyi számitógépes kromatografáló program

Oszlop:

Bio-Sil TSK 250 (7,5 mm x 30 cm) • · • ·· *

Detektor:

280 nm

Intervallum: 0-0,2 AU

Mozgó fázis:

mmól/1 nátrium-acetát és 0,5 mól/1 nátrium-klorid, pH = 5,5

Áramlási sebesség:

0,5 ml/perc

Minta előkészítés:

Az IL-li oldatot a mozgó fázissal mintegy 2 mg/ml koncentrációra hígítjuk.

Beinjektálási térfogat:

μΐ

F. Redukáló SDS PAGE vizsgálat

Gél előkészítés:

Laemmli: J. Mól. Bioi. 80, 575-599 (1973) szerint.

Elválasztó gél:

akrilamid	15 tömeg%
Trisz, pH = 8,8	375 mmól/1
SDS	0,1 tömeg%
Felhalmozó gél:
akrilamid, pH =	6,8 5 tömeg%

SDS

0,1 tömeg% ·· ···· ·· • · ··· Λ

Mintaelőkész ités:

A mintát mintapufferrel 1:1 arányban hígítjuk.

A mintát ezután 15 percen keresztül 65 °C hőcentrifugáljuk, és a gélre

250 mmól/1

2,5 tömeg% tömeg%

12,5 tömeg% az elválasztó gélt, kék fut a gélen.

45,5 tömeg%

9,0 tömeg%

45,5 tömeg%

2,5 tömeg% mérsékleten melegítjük, visszük.

Mintapuffér:

Trisz, pH = 6,8

SDS

2-merkapto-etanol glicerol Elektroforézis paraméterei:

V, amig a minta eléri

100 V, amig a bróm-fenol Festés:

etanol ecetsav víz

Coomassie Brilliant Blue

A megfestést egy éjszakán keresztül szobahőmérsékleten enyhe rázás közben végezzük.

A festés eltávolítása:

metanol 30,0 tömeg% ecetsav 12,5 tömeg% víz 57,5 tömeg%

A festés eltávolítását egy éjszakán keresztül vagy a háttér elszíntelenedéséig szobahőmérsékleten végezzük.

Móltömeg standard alacsony móltömeg tartományban (BRL):

Fehérje:

Igazolt móltömeq:

inzulin (A és B)

2300 és 3400 borjutripszin inhibitor

5200 lizozim

14300 β-laktoglobulin

18400 alfa-kimotripszin

257 00 ovalbxmín

43000

A μg fehérje elegyet az SDS-PAGE gélre viszünk.

G. Tripszin peptid térképezés rekombináns humán IL-li-n

1. Reagensek:

1.1 tripszin szekvenáló minőségben,

Boehringer Mannheim GmbH

1.2 karbamid, ultratiszta, BRL

1.3 milli-Q víz

1.4 trifluor-ecetsav, Pierce

1.5 HPLC minőségű acetonitril, J.T. Baker

1.6 trisz

1.7 CaCl₂

2. Felszerelés:

2.1 HPLC rendszer

Beckman 114 oldat adagoló modul

Beckman 165 változtatható hullámhosszúságú detektor

Beckman System Gold Analóg Interface Modulé

406

Beckamn System Gold, személy számitógépes kromatografáló program

2.2 Oszlop

BrownLee RP-300 (C8) (220 mm x 4,6 mm, 7 μ)

2.3 Fütő és hütő vízfürdő

3. Oldat:

3.1 tripszin: 0,1 mg-ot 0,1 ml 0,1 mmól/1 koncentrációjú sósavban oldunk, az oldatot -20 °C hőmérsékleten tároljuk, amelyen hónapokon keresztül az aktivitás csökkenése nélkül stabil marad.

3.2 karbamid: 8 mól/1 karbamid milli-Q vízben, naponta frissen készítjük.

3.3 2 mól/1 trisz HC1, pH = 8,0 és 0,1 mól/1 trisz HC1, pH = 8,0

3.4 3 mmól/1 CaC12

4. Módszer:

4.1 Az IL-li fehérjét 6 mól/1 karbamidban és

0,1 mól/1 trisz HCl-ben (pH =8,0) mintegy mg/ml végkoncentrációban 10 percen keresztül 37 ’C hőmérsékleten denaturáljuk.

4.2 Az oldatot 0,3 mmól/1 CaC12“t tartalmazó

0,1 mól/1 trisz HCl-ben (pH =8,0) 2 mól/1 karbamid végkoncentrációig hígítjuk (1:2 térfogatarány).

4.3 Hozzáadjuk a tripszin oldatot (az oldat sorszáma 3.1), és a fehérje koncentrációját tömeg%-ra állítjuk be. Az elegyet jól elkeverjük.

4.4 Az oldatot 37 °C hőmérsékleten 1 órán keresztül inkubáljuk, majd további 1 tömeg% tripszint adunk hozzá.

4.5 További 3 óra elteltével az emésztést -20 ’C hőmérsékletre történő fagyasztással vagy tömeg%-os trifluor-ecetsawal történő savanyítással megállítjuk, végső koncentráció 0,1 tömeg%.

4.6 Az oldatot a HPLC oszlopra adagoljuk.

5. A tripszines emésztéssel kapott peptid fragmensek reverz fázisú vizsgálata:

5.1 A HPLC rendszer és oszlop azonos a 2. pontban ismertetett rendszerrel.

• ♦

5.2 Detektor beállítás:

A csatorna: 215 nm

B csatorna: 200 nm

Intervallum: 0-0,5 AU

5.3 Mozgó fázis:

A: 0,1 tömeg% TFA vízben B: 0,1 tömeg% TFA acetonitrilben Gradiens beállítás:
Idő (perc)	B oldat (%)	Időtartam
0	0	0
5	40	80
85	100	5
95	0	5
120	0	vége

5.5 Áramlási sebesség

1,0 ml/perc

5.6 Minta előkészítése nincs

5.7 Adagolási térfogat

50-100 μΐ.

H. Az IL-li fehérje biológiai vizsgálata

Az IL-1 inhibitor vizsgálatát az IL-1 fehérje vizsgálatára S. Nakai, K. Mizuno, M. Kaneta és Y. Hirai által kifejlesztett módszert alkalmazzuk (Biochem. Biophys. Rés. Conun. 154, 1189-1196 (1988)). A vizsgálat alapja, hogy az ·· e * · «

- 42 IL-1 folyamatos adagolás esetén citotoxikus az A375 humán melanoma sejtvonalra. A citotoxikus hatást az IL-1 receptor közvetíti. Az IL-li antagonizálja ezt a citotoxikus hatást, amelynek mértéke a dózistól függ. Ehhez az IL-li verseng az IL-1 fehérjével a megfelelő receptorhoz történő kötődésben. A toxikusság mértéke mérhető, ha az élő sejteket kristályibolyával megfestjük, a festéket a sejtekből egy éjszakán keresztül 100 %-os etanolban végzett inkubálással extraháljuk, és spektrofotometriásán mérjük az extrahált festék optikai sűrűségét. Az A375 melanoma sejt vizsgálatának előnye, hogy a módszer egyszerű, és közvetlen lehetőséget nyújt mind az IL-1, mind az IL-li aktivitásának meghatározásához. Az irodalomban egy sor más vizsgálati módszer ismert, amelyek az IL-l-nek más termékek aktivizálásában kifejtett hatását mérik. Ezekre a termékekre példaként említhető a prosztaglandin E2 és a laktonsav fibroblasztokban, valamint az interleukin-2 a T-sejtekben. A másodlagos termékek mennyiségének meghatározásával mérhetjük az IL-1 szintet. Bár valamennyi IL-1 aktivitást receptorok közvetítenek, a több fokozatú rendszer alkalmazása a módszert nehézkessé teszi, és növeli a tévedések számát.

Claims

Szabadalmi igénypontok

1. Eljárás kereskedelmi mennyiségi! és magas tisztaságú interleukin-1 inhibitor (IL-li) előállítására, azzal jellemezve, hogy

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy pDD6 plazmidot hordozó E. coli-t fermentálunk.

2) a sejtet feldolgozzuk, ennek során

a) a sejtet feltárjuk,

b) roncsoljuk és

c) a lizátumot tisztítjuk,

3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az első ioncserés lépést kationos gyantával töltött oszlopon végezzük.

3) egy első ioncserés lépést végzünk,

4. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy kationos gyantaként S-Sepharose, SP-C25 Sephadex, CM Sephadex, CM Sepharose, CM cellulóz vagy CM Toyopearl gyantát alkalmazunk.

4) egy második ioncserés lépést végzünk,

5. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy kationos gyantaként S-Sepharose gyantát alkalmazunk.

6. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a második ioncserés lépést anionos gyantával töltött oszlopon végezzük.

7. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy anionos gyantaként Q-Sepharose, DEAE-Sepharose, Q-Sephadex vagy DEAE cellulóz gyantát alkalmazunk.

8. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy anionos gyantaként Q-Sepharose gyantát alkalmazunk.

9»·9 ··««

- 45 ti

9. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy további lépésként egy harmadik ioncserés lépést végzünk közvetlenül a végső feldolgozás előtt.

10. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a harmadik ioncserés lépést kationos gyantával töltött oszlopon végezzük.

11. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy kationos gyantaként S-Sepharose, SP-C25 Sephadex, CM Sephadex, CM Sepharose, CM cellulóz vagy CM Toyopearl gyantát alkalmazunk.

12. A 11. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy kationos gyantaként S-Sepharose gyantát alkalmazunk.

13. Transzformált E. coli gazdatörzs, azzal jellemezve, hogy legalább egy, IL-li-t kódoló DNS szekvenciát tartalmazó plazmidot hordoz, ami lehetővé teszi kereskedelmi mennyiségű és nagy tisztaságú IL-li előállítását.

14. pDD6 jelű plazmid.

15. Interleukin-1 inhibitor, azzal jellemezve, hogy anionos gyantához van kötve.

Ο « * ··«· • ti • · # ·«· · · • *··4 *· 9 • «

16. Interleukin-1 inhibitor, azzal jellemezve, hogy kationos gyantához van kötve.