HUT63204A

HUT63204A - Process for producing monoclonal antibodies against human tumor necrosis alpha-factor

Info

Publication number: HUT63204A
Application number: HU914127A
Authority: HU
Inventors: Elena Barbanti; Martha Ghislieri; Fabrizio Marcucci; Domenico Trizio
Original assignee: Erba Carlo Spa
Priority date: 1990-12-28
Filing date: 1991-12-27
Publication date: 1993-07-28
Also published as: ATE190667T1; EP0492448B1; KR920011519A; FI916059A0; MX9102769A; IL100365A; ES2145735T3; GB9028123D0; DE69132045D1; DE69132045T2; EP0492448A1; PT99887A; CA2058370C; HU914127D0; DK0492448T3; IE914538A1; AU648617B2; ZA9110127B; FI916059A; US5436154A

Description

A találmány tárgya olyan monoklonális ellenanyag, amely nagy semlegesítő aktivitást mutat humán tumor nekrózis alfa faktorral (TNFíX ) szemben és aktív a humán tumor nekrőzis béta faktorral (TNF^j ) szemben is, továbbá egy olyan hibrid sejtvonal, amely ezt az ellenanyagot termeli, valamint e monoklonális ellenanyag használata.

A TNFo( egy 17 5Ό0 moltömegű polipeptid, amelynek primer és tercier szerkezete már tisztázott /Pennica, D. és munkatársai, Natúré, 312: 724 (1984) és Jones, E.Y. és munkatársai, Natúré, 338: 225 (1989)/. A TNFíX trimerként biológiailag aktív. A TNFcK fő forrásai a monocita/makrofág vonalak sejtjei, de megfelelő stimulálás után más sejttipúsokkal ugyanúgy előállíthatok (pl. T-limfocitákkal).

A TNF/δ a TNF/s -hoz nagyon hasonló polipeptid. A két molekula 28 % homológiát mutat az aminosavszintjét tekintve /Pennica, D. és munkatársai, ld. fent és Gray, P.W. és munkatársai, Natúré, 312: 721 (1984)/. A TNF^o fő forrásai a T-limfociták.

A TNFK-t eredetileg olyan molekulaként jellemezték, amely a tumorok vérzéses nekrózisát okozza egérben. De miután a cDNS-ének klónozása révén nagy mennyiségű homogén TNFo( állt rendelkezésre, világossá vált, hogy a TNFX egy sor biológiai aktivitást közvetít, amelyek alapján a TNF(X gyulladásközvetítő tulajdonságot mutat. Ld. általánosságban Beutler, B. és Cerami, A., Natúré, 320: 584 (1986).

A TNF/3 minőségileg hasonló biológiai aktivitásokat közvetít, de mennyiségileg eltérő módon, az egyes biológiai ak- 3 tivitások közvetítéséhez szükséges TNFc< vagy TNlyS adagok különbözőek.

A TNFcK a gyulladásválaszon belül döntő szerepet játszik a gazdaszervezet védelmében a szervezet káros szerekkel való inváziója során. Bizonyos feltételek között azonban, mint pl. a krónikus vagy akut, szisztemikus vagy lokális hipertermelés, a TNF(K más gyulladási válasz közvetítőkkel együtt egy sor patológiás körülményhez vezet. A legismertebb példák a cachexia és a szeptikus sokk /ld. Beutler, B. és Cerami, A., ld. fent és Oliff, A. és munkatársai, Cell 50: 555 ( 1987)/. A TNFcK -ról emellett feltételezik, hogy patogén szerepet játszik az AIDS-ben /Folks, T.M. és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci, USA 86: (1989)/, a befogadó szervezet átültetéskor való megbetegedésekor /Piguet, P.F., és munkatársai, J.Exp. Med. 166: 1280 (1987)/, a cerebrális maláriában (Grau, G.E. és munkatársai, Science, 237: 1210 (1987)/, az arthritis deformans esetében (Brennan, F.M. és munkatársai, Láncét u.ott, 244 (1989)/ és néhány más betegségben.

Jóval kevesebbet tudunk a TNF/3 in vivő hatásáról. Az ismeretes, hogy a TNFK -éhoz hasonló biológiai aktivitásokat közvetít, és bizonyítható, hogy hipertermelés esetén a TNF/3 ugyanúgy hozzájárulhat néhány betegség patogeneziséhez. Mindezek alapján feltételezhető, hogy a TNFcK és valószínűleg a TNF/3 elleni ellenanyagok hasznosak lehetnek olyan betegségek gyógyításában, amelyekben ezek a polipeptidek patogén hatást fejtenek ki.

A gyógyító hatás eléréséhez a TNFr( elleni ellenanyagoknak képeseknek kell lenniük a TNFc< toxikus hatásait semle gesíteni in vivő.

A poliklonális ellenanyagokat könnyű előállítani hiperimmunizált állatok szérumából. Ezek a poliklonális ellenanyag készítmények azonban nem optimálisak az in vivő használatra, mert

- a TNFcK -t nem semlegesítő ellenanyagokat is tartalmazó ellenanyagkeverékek ;

- ugyanahhoz az epitóphoz eltérő affinitást mutató különböző ellenanyagokat tartalmazó ellenanyagkeverékek; és

- nehéz a szabványosításuk a potenciájukat illetően, mert számtalan variációjuk lehet.

Ezeknek a problémáknak a megoldására szolgál a monoklonális ellenanyag technika. Lehetővé teszi az in vitro termelést szabályozott feltételek mellett és korlátlan mennyiségben, reprodukálható specificitásu és affinitásu monoklonális ellenanyagok nyerhetők TNftK és minden immunogén molekula ellen.

Világos, hogy egyetlen antigén ellen több különböző monoklonális ellenanyag állítható elő. Ezek egymástól különbözhetnek

- az ellenanyag osztályt, alosztályt tekintve,

- az epitóp specificitásban;

- a kötőképességben és

- az in vitro és in vivő semlegesítő aktivitásban.

Terápiás célra a TNFíK ellen, mint más antigén ellen is célszerű olyan monoklonális ellenanyagot alkalmazni, amelynek nagy a semlegesítő aktivitása. Ez lehetővé teszi, hogy kisebb monoklonális ellenanyag adagok használatával gyógyászati• β

- 5 lag hatékony szintet érjünk el in vivő, csökkentve a monoklonális ellenanyag lehetséges, nemkívánatos mellékhatásait.

Ilyen vonatkozásban a találmány új monoklonális ellenanyagot, illetve annak a humán TNFcK semlegesítésére alkalmas kötőfragmensét szolgáltatja. A találmány tárgyát képző ellenanyagnak mind in vitro, mind in vivő nagy a TNFX semlegesítő aktivitása. így, a humán TNFc< in vitro fél-maximális biológiai aktivitását kb. 0,15 ng/ml koncentrációnál fejti ki (3,3 x 10 M, figyelembe véve, hogy a TNFíK trimer). 1 /jg/ml (6,25 x 10 M) adott ellenanyag jelenlétében a humán TNFc< kb.

229 ng/ml koncentrációnál fejti ki fél-maximális biológiai aktivitását (4,6 x 10 M, a fél-maximális biológiai aktivitások aránya 1 /jg/ml ellenanyag jelenlétében illetve hiányában kb. 1527). 100 ng/ml (6,25 x 10 M) ellenanyag jelenlétében a humán TNFc\ kb. 26 ng/ml koncentrációnál (5,2 x 10^-^ M) fejti ki fél-maximális biológiai aktivitását. 10 ng/ml (6,25 x 10^-^ M) ellenanyag jelenlétében a humán TNF<x· kb. 1,9 ng/ml koncentrációnál (3,8 x 10~·^ M) fejti ki fél-maximális biológiai aktivitását. így a találmány tárgyát képező monoklonális ellenanyagra jellemző, hogy in vitro semlegesíti a trimer humán TNFc< -t 2:l-nél alacsonyabb, konkrétan 1,3:1 arány mellett, mólokban számolva. Emellett az adott monoklonális ellenanyag semlegesíti és így felismeri a szerkezetileg rokon humán TNF/δ polipetidet is.

Eképpen a humán TNF/3 in vitro fél-maximális biológiai aktivitását kb. 4 ng/ml koncentrációnál fejti ki (8 x ΙΟ^-11

M, figyelembe véve, hogy a TNF/J trimer). 1

- 6 _ Q (6,25 x 10 M) ellenanyag jelenlétében a humán TNF/3 kb.

25,6 ng/ml koncentrációnál fejti ki fél-maximális biológiai aktivitását (5 x 10 M; a fél-maximális biológiai aktivitások aránya 1 yug/ml ellenanyag jelenlétében illetve hiányában kb. 6,3).

Második vonatkozásként a találmány szerint az adott monoklonális ellenanyag képes a humán TNFc< kicsapására, amint azt a kétdimenziós kettős diffúziós módszerrel (Ouchterlony módszer) bebizonyítottuk. Harmadik vonatkozásban a találmány leírja, hogy az adott monoklonális ellenanyag és a humán TNFc< inkubálásával kapott legkisebb antigén - ellenanyag komplex egy nagy molekulatömegű antigén - ellenanyag komplex, amely min. 2 mól monoklonális ellenanyagot és min. 1 humán TNFp< molekulát tartalmaz, rendszerint 3 monoklonális ellenanyag kötődik két molekula humán TNFc< -val.

A nagy molekulatömegű antigén - ellenanyag komplex kifejezés minimum 400 kD-os, rendszerint 570-600 kD-os antigén - ellenanyag komplexet jelent.

Azonkívül az ellenanyag egérben tökéletes védelmet nyújt az egyébként halálos adag humán TNFc< ellen 1 jLig/egér-nél kisebb dózisban, rendszerint 0,4-0,8 yjg/egér adag mellett. Azt tapasztaltuk, hogy 0,4jug/egér kb. 20 jüg/kg testtömegnek felel meg.

A találmány tárgya továbbá egy stabil hibridóma sejtvonal és annak utódjai, amelyek ilyen monoklonális ellenanyagot termelnek.

A találmány tárgyát képezi továbbá az ilyen monoklonális ellenanyag előállítására szolgáló eljárás.

9 • f

- 7 A találmány tárgya ezenkívül az olyan gyógyászati készítmény, amely a humán TNFp< és humán TNF/3 semlegesítésére alkalmas monoklonális ellenanyagot, valamint gyógyászatilag elfogadható hordozóanyagot és/vagy higítószert tartalmaz.

A találmány további vonatkozása egy olyan módszer, amely alkalmas a testfolyadékokban levő humán TNFc< koncentrációjának kimutatására.

A találmány tárgya továbbá egy antiidiotipikus ellenanyag, amely felismeri a humán TNFcK- és humán TNF/o -receptorokat.

A találmány tárgyát képező monoklonális ellenanyagok bármely immunoglobulin osztály tagjai lehetnek, pl. IgM, IgD, IgE, IgA osztály vagy az IgG alosztály tagjai. A monoklonális ellenanyagot használhatjuk teljes egészében, vagy kötőfragmens , pl. F , Fab, F/ab’^ formájában.

A találmány tárgyát képező monoklonális ellenanyagok leggyakrabban az IgG osztályból származnak.

A találmány tárgyát képező monoklonális ellenanyagok közül elsősorban a 78-as hibridóma klón által termelt monoklonális ellenanyagok az elterjedtek, amelyeket itt ismertetünk, és amelyek IgGl k izotipusok.

A találmány tárgyát képező monoklonális ellenanyag kötőfragmensek közül leggyakrabban használatosak a F , Fab, F/ab’/₂ ellenanyag fragmensek.

Amint láttuk, a találmány tárgyát képezi a monoklonális ellenanyag vagy annak kötőfragmense előállítására szolgáló eljárás, amely a hibridóma sejtvonal vagy annak utódai te nyésztéséből, majd a kapott monoklonális ellenanyag kinyeréséből áll.

A találmány tárgyát képező monoklonális ellenanyagok vagy fragmenseik előállíthatok a B-sejt vonal limfociták halhatatlanná tételével. Az immortalizációt onkogén vírussal való átalakítással vagy egy már halhatatlan sejtvonallal (pl. mielóma vagy limfoblasztoid sejtvonal) való fúzióval valósíthatjuk meg. Utóbbi megközelítés, amelyet eredetileg Koehler és Milstein írtak le /Koehler, G. és Milstein, C., Natúré 256: 496 (1975)/, korlátlanul szaporodó és ellenanyagot termelő, halhatatlan hibrid sejtvonalak képződéséhez vezet. Az így kapott halhatatlan sejtvonalak klónozhatok és úgy szelektálhatok, hogy kiválaszthatjuk a kívánt antigén elleni ellenanyagot a sejt felülúszókból. Számos szkrinelési technikát ismertet a szakirodalom, ezek jólismertek a szakember számára. Ezek a módszerek egyértelműen lehetővé teszik a kívánt antigén(ek) elleni monoklonális ellenanyagok izolálását. Ha viszont a szakember adott tulajdonságú monoklonális ellenanyagot kíván izolálni (vagyis olyat, amelynek nagy vagy kicsi az affinitása az antigén irányába, semlegesítő vagy nem-semlegesítő lévén), a szkrinelési technikát úgy kell kiválasztani, hogy lehetővé váljon a kívánt tulajdonságú monoklonális ellenanyag izolálása. A módszer kiválasztása az antigén keresett tulajdonságától függ, amely ellen a szakember az ellenanyagot elő akarja állítani, általában nem jelezhető előre, és minden konkrét esetre külön meg kell vizsgálni. Ez a lépés kulcsfontosságú, ha a szakember nagy aktivitású monoklonális ellenanyagot akar izolálni.

- 9 Ha a találmány tárgyát képező eljárással a humán TNF(\ elleni, kívánt tulajdonságú monoklonális ellenanyagot termelő sejtvonalakat izoláltuk, azok felhasználhatók a monoklonális ellenanyagokat kódoló gének forrásául.

Ezek a gének a hírvivő RNS-ből a cDNS könyvtár készítése útján izolálhatok. Egy egyes cDNS klón, amely az immunoglobulint kódolja, izolálható, és tovább manipulálható. E műveletek végső célja rendszerint, de nem kizárólag, csökkent immunogenicitású ellenanyagok előállítása in vivő beadagolással egy gazdaszervezetbe, amely különbözik attól, amelyből az eredeti ellenanyag származott. Ez az eredeti fajták variábilis régiójú génjeinek megfelelő nukleotidok összekötésével érhető el azon fajták konstans régiójú génjeinek megfelelő nukleotidokkal, amelyekhez az ellenanyagokat hozzá akarjuk adni. Másik vál tozat, mikor a komplementaritást meghatározó eredeti monoklonális ellenanyag régióit kódoló nukleotidokat helyettesíteni lehet azon fajták ellenanyag génjei variábilis régióinak megfelelő nukleotidokkal, amelyekhez az ellenanyagot hozzá akarjuk adni. Végül, az eredeti vagy a módosított cDNS kiónt izolálni lehet, és be lehet helyezni a megfelelő prokarióta vagy eukarióta expressziós vektorba és transzfektálni lehet egy gazdaszervezetbe további tömegtermelés céljából.

Ami az ábrákat illeti, az 1. ábra a monoklonális ellenanyag humán TNFX -ra vonatkozó specificitását mutatja, amelyet ELISA-val határoztunk meg, és amely 100 ng/ml ellenanyag humán TNFo( -hoz való kötődését jellemzi külöböző mennyiségű hu10 mán TNFc<-val vagy különböző mennyiségű egyéb antigénnel való inkubálás után.

_ Q

A 2. ábra 1 jug/ml (6,25 x 10 M) monoklonális ellenanyag semlegesítő aktivitását mutatja különböző menyiségű humán TNFc<-ra vonatkoztatva.

A 3. ábra 1 jug/ml monoklonális ellenanyag semlegesítő aktivitását ábrázolja különböző mennyiségű humán TNF/3 -ra.

A 4. ábra a humán TNFc< és az adott monoklonális ellenanyag kötődésének Scatchard görbéjét mutatja.

Az 5. ábra a humán TNFc< disszociációját illusztrálja a találmányban szereplő monoklonális ellenanyagból.

A 6. ábra egy Ouchterlony féle kettős immundiffúziót mutat be agaron. A középső sávba 20 pg monoklonális ellenanyagot adtunk, a bal felső, jobb felső, bal alsó és jobb alsó sávokba sorrendben 10 jug, 5 pg, 1,25 pg és 2,5 jug humán TNFc<-t.

A 7. ábrán a gyors, nyomás alatti folyadékkromatográfiás (FPLC) nagyság szerinti kiszorítási profilok láthatók x 10 M humán TNFp^-ra egymagában ( - - - A. ábra),

6.25 x ΙΟ”⁶ M monoklonális ellenanyagra önmagában (---- A. ábra), x 10 ⁶ M humán TNF^ és 2 x 10 M monoklonális ellenanyag keverékére (B. ábra) és 10 m jódozott humán TNFc*( és

1.25 x 10 ¹¹ M monoklonális ellenanyag keverékére (C. ábra).

Az 1. táblázat felsorolja a humán TNFo<-nak a találmányban szereplő monoklonális ellenanyaghoz való kötődése paramétereit.

A 2. táblázat mutatja be a fél-maximális biológiai aktivitást adó humán TNFc< koncentrációkat az adott monokloná* * ·

- 11 lis ellenanyag hiánya illetve különböző koncentrációi mellett.

A 3. táblázat különböző adagban egérnek adott humán TNFcK. hatását adja meg a túlélésre.

A 4. táblázat illusztrálja a találmányban szereplő monoklonális ellenanyag védőhatását két letális dózisú TNFóK, -val való kezelés után.

Az 5. táblázat bemutatja a találmányban szereplő monoklonális ellenanyag védőhatását két letális TNF<X. dózissal való kezelést megelőző illetve követő beinjektálás után.

Az adott hibridsejtvonal jellemzését illetően az állandó és stabil kifejezések hosszú, rendszerint min. 6 hónap élettartamot jelentenek. A találmány alapján stabil állandó hibridóma sejtvonal állítható elő, amely legalább 25 generáción (passzázs) át megtartja specifikus monoklonális ellenanyag termelő képességét.

A monoklonális ellenanyag kifejezés lényegében homogén ellenanyag populációból választott ellenanyagot jelöl, vagyis az ellenanyag populáció egyes tagjai azonosak, kivéve a természetesen előforduló mutációkat.

Az ellenanyag kifejezés magában foglalja a teljes molekulákat és azok fragmenseit, mint pl. a F_y-t, F _b~t és F/ab’/₂-t, amelyek képesek az antigén megkötésére. A F_gb és a F/ab’/₂ fragmensekből hiányzik az ellenanyag F_c fragmense, gyorsabban távoznak a keringésből és kisebb a nem-specifikus szövetmegkötő képességük, mint a teljes ellenanyagnak. Látható, hogy a F_y, F_gb, F/ab’/₂ és a találmányban szereplő monoklonális *··« *· «·«<

» · « 4 • * · · • ♦ · · · ellenanyag egyéb fragmensei felhasználhatók ugyanúgy, ahogy a teljes monoklonális ellenanyag, ugyanazokra a célokra, vagyis a TNFcK kimutatására és azoknak a betegségeknek a kezelésére, amelyekben a TNFc< káros szerepet játszott.

A semlegesítés kifejezés az ellenanyag tartalmú oldatok TNFcK és TNF$ in vitro vagy in vivő biológiai aktivitása kifejtésének blokkolási képességét jelenti.

Az in vitro növelt vagy nagy TNFc< semlegesítő aktivitás a monoklonális ellenanyagot tartalmazó oldatnak azt a képességét jelöli, amely szerint tömegbázison számolva 6:1 aránynál és mól bázison számolva 2:1 aránynál kisebb arányban képes semlegesíteni a humán TNFcK. -t 10 ng/ml molekuláris ellenanyag dózis mellett.

Az in vivő növelt vagy nagy TNFtK, semlegesítő aktivitás kifejezéssel a monoklonális ellenanyag tartalmú oldat azon képességét jellemezzük, amely szerint az < 20 yug/kg testtömeg adag mellett blokkolja a TNFcA in vivő káros hatását.

A találmányban szereplő monoklonális ellenanyag teljes védelmet nyújt az egérnek egyébként letális TNF/ dózis esetén 1 pg/égér szint alatt, általában 0,4-0,8 jug/egér szint körül. A 0,4 pg/egér szint kb. 20 jug/kg testtömegnek felel meg.

A találmány egyik ismert megvalósításában monoklonális ellenanyagot válsztottunk ki hibridóma sejtvonallal, amely halhatatlan sejtvonal sejtjeiből és humán rekombináns TNFR,-val immunizált egér sejtekből készült.

A halhatatlan sejtvonal olyan, amely gyakorlati célokra örökösen fenntartható^sejttenyészetben. Más szavakkal *♦·* *♦ • ·

- 13 stabil és állandó, és ha olyan sejtekkel fuzionál, amelyek nem mutatják e tulajdonságokat, képes átvinni ezeket a fúziós termékre .

Bármely halhatatlan sejtvonal használható. Általában emlős eredetű plazmacitóma (mielóma) sejteket használunk. Kedvelt sejttípus a murin hipoxantin-foszforibozil-transzferáz (HPRT) deficiens plazmacitóma. Ezek közül az egyik különösen elterjedt. Ez a NSO sejtvonal, a jólismert HPRT-hiányos BALB/c eredetű plazmacitóma, amely saját maga nem termel és nem választ ki immunoglobulint vagy nehéz illetve könnyű immunoglobulin láncokat /Clark, M.R. és Milstein, C. Somatic Cell Génét. 7: 657 (1981)/.

A halhatatlan sejteket olyan sejtekkel fuzionáljuk, amelyek közül legalább néhány termel olyan ellenanyagokat, amelyek specifikusan kötődnek a humán TNFc<,-hoz.

Az ellenanyagtermelő sejteket rendszerint humán TNFtK-val szemben immunizált egérből nyerik. E célra kereskedelmi forgalomban kapható humán TNF</ -t lehet használni. Fúzió után a fúziós termékekből kiszűrjük azokat, amelyek a kívánt monoklonális ellenanyagot kiválasztják.

Ezeket in vitro ELISA-val teszteljük, hogy kimutassuk a TNFcK elleni ellenanyagokat. Azután teszteljük a humán TNFo< citotoxikus aktivitását semlegesítő képességüket egér LM sejteken.

A kívánt monoklonális ellenanyagokat termelő kiónok utódjait azután in vitro tenyésztjük megfelelő tápközegen, szövettenyésztő üvegekben vagy nagy méretű tenyésztőberendezés14 ·*·: .·*. .*·.

• · · « · · · • · * · * · • 1 · * « * · ben (Acusyst, Endotronics, Coon Rapids, Minnesota) vagy in vivő hasvízkóros tumor formájában laboratóriumi állatokban (pl. egérben, patkányban).

Szükség esetén az ellenanyagot el lehet választani a tenyészközegtől vagy a testfolyadéktól pl. ammónium-szulfátos lecsapással, ioncserélő kromatográfiával, HPLC-val vagy a szakemberek számára ismert más módszerekkel. A találmányban szereplő TNF<á és TNF/2> ellen nagy semlegesítő aktivitást mutató monoklonális ellenanyagokat előállítottuk, és ezek a következő tulajdonságokkal jellemezhetők:

a) populációjuk igen homogén,

b) halhatatlan sejtekkel állítottuk elő ezeket, amelyek maguk halhatatlan sejtvonal és egy ellenanyagtermelő sejt közötti hibridek,

c) növelt TNFix; semlegesítő aktivitást mutatnak in vitro és in vi vo,

d) képesek semlegesíteni, felismerni a humán TNF/J-t,

e) kicsapják a humán TNF^-t,

f) a humán TNFo(-val oldatban komplexeket képeznek, amelyek közül a legkisebb min. 2 monoklonális ellenanyag molekulát tartalmaz és általában magas, minimum 400 kD a molekulatömege .

TNF*> és TNF/3 semlegesítő képességüknek köszönhetően a találmányban szereplő monoklonális ellenanyagok felhasználhatók emlősökben, ezen belül emberekben is megelőző és/vagy gyógyítási célból bármely betegség esetén, amelyben a TNF<X • · « * ·«· » · · · · * •· ·· · ··

- 15 és/vagy TNF/3 patogén hatást fejt ki. Tipikusan ilyen betegségek a cachexia, szeptikus sokk, gazdaszervezetbe való átültetéskor fellépő betegség, AIDS, cerebrális malária, arthritis deformans, krónikus és akut gyulladásos betegségek, miokardiális ischemia stb., amelyekben már most tudjuk, vagy a közeljövőben várhatóan megtudjuk, hogy a TNFc< és/vagy TNF/ó káros szerepet játszik. A találmányban szereplő felnőtt ember helyi vagy szisztemikus kezelésére megfelelő, monoklonális ellenanyagok, pl. a 78-as hibridóma által termeltek adagolási szintje a 20 pg - 1 mg ellenanyag/testtömeg tartományban van. A készítmény egyszeri vagy ismételt adagolása a kezelőorvos által megállapított menynyiségben és módon történhet. A gyógyszerkészítményeknek minden esetben elegendő ellenanyag mennyiséget kell biztosítaniuk a beteg profilaktikus vagy gyógyító kezeléséhez.

A találmányban szereplő monoklonális ellenanyagot vagy magában formulázzák, vagy más, gyógyászatilag aktív anyaggal gyógyszerkészítmény formájában, amely pl. megfelelő mennyiségű monoklonális ellenanyagot, gyógyászatilag elfogadható hordozóanyagot és/vagy higítószert tartalmaz.

Egy másik megoldásban a monoklonális ellenanyagot kombinált kezelési módszer során különböző gyógyászati hatóanyaggal is be lehet adni. A monoklonális ellenanyagok formulázására használható, vagy a kombinált kezelés során beadagolható gyógyászati hatóanyagok lehetnek pl. más antigének elleni ellenanyagok, ezen belül monoklonális ellenanyagok, amelyek így koktélt képeznek a találmányban szereplő monoklonális ellenanyaggal és egy vagy több, a megfelelő betegség patogenezisében résztvevő, más antigének elleni (monoklonális) ellenanyaggal.

···· ⁴· ··<·> ·’ • V « · · · • V · · ··* • · · · · A

További aktív ágensek, amelyeket a találmányban szereplő monoklonális ellenanyagokkal formulázni, vagy kombinált kezelési módszerben alkalmazni lehet, elsősorban a megfelelő gyógyítóhatás elérése céljából, a gyógyítandó betegségtől függenek, és a következők lehetnek: a kereskedelmi forgalomban kapható gamma-globulin és immunoglobulin termékek, antibiotikumok, mikroba elleni termékek, antibakteriális és tumor elleni szerek, két vagy több szerből készült keverékek.

A találmányban szereplő monoklonális ellenanyagok ezen túlmenően felhasználhatók magukban vagy kombinált kezelési módszerrel antibakteriális és, ezen belül antineopláziás szerekkel együtt a célból, hogy az általuk okozott mellékhatás megszűnjön vagy mérséklődjön. Tipikus kezelhető mellékhatások a cachexia, émelygés, hányás, étvágytalanság, hajhullás, hasmenés és neutropénia.

Az antimikrobiális szer rendszerint penicillint tartalmaz aminoglükoziddal összekötve (pl. gentamycin, tobramycin). Természetesen több jólismert további szer, pl. kefalosporinok is alkalmazhatók.

Az antineuropláziás szer kifejezés magában foglalja mind az egyszerű tumorellenes gyógyszert, mind a koktélokat, vagyis a klinikai gyakorlatban használatos ilyen gyógyszerek keverékét.

A találmányban szereplő vegyülettel formulázott, vagy a kombinált kezelési módszerrel beadagolható tumorellenes szerek pl. a doxorubicin, daunomycin, epirubicin, idarubicin, etoposide, fluorouracil, mephalan, ciklofoszfamid, bleomycin, vinblastin és mitomycin, vagy ezek közül kettő illetve több keveréke.

A kombinált kezelési módszer kifejezés magában foglalja a találmányban szereplő monoklonális ellenanyag tartalmú gyógyszerkészítmény és egy másik, gyógyászatilag aktív szert tartalmazó gyógyszerkészítmény mind önálló, mind egyidejű adagolását .

A találmány egyik gyakori célja a rák kombinált kezelési módszere emlősökben, az embert is beleértve, az ilyen kezelés szükségessége esetén az adott módszer magában foglalja

1) a találmányban szereplő monoklonális ellenanyag vagy annak kötőfragmense és

2) egy tumorellenes szer adagolását, utóbbit olyan mennyiségben és időben elég gyorsan ahhoz, hogy a kívánt gyógyító hatást elérjük.

A találmány tárgyát képezi ezen túlmenően a találmányban szereplő monoklonális ellenanyagból vagy annak kötőfragmenséből és tumorellenes szerből álló, párhuzamos, különálló vagy egymást követő adagolásra szánt, rák elleni terápiás készítmény előállítása.

A találmányban szereplő monoklonális ellenanyag és annak kötőfragmense tehát használható a rák gyógyítására. Ezek beadhatók a tumorellenes szerrel pl. antraciklin glükoziddal, köztük a fentebb említett doxorubicinnel, daunomycinnel, epirubicinnel vagy idarubicinnel kezelendő rákos betegnek. A találmányban szereplő ellenanyag és egy tumorellenes szer, pl. az antraciklin glükozid adagolható a leukémiás (pl. mieloblasztikus leukémia, limfóma, szarkóma, euroblasztóma, Wilm tumor vagy a hólyag, mell, tüdő vagy a pajzsmirigy rosszindulatú neoplazmája) beteg állapotának javítása céljából.

A találmányban szereplő ellenanyag nagy semlegesítő aktivitása alapján, amint az a 2. ábrán látható, felismer egy epitópot a humán TNFv\ receptorkötő helyén belül vagy annak közelében. Két TNFcC receptort jellemeztek /Schall, T.J. és munkatársai, Cell 61: 361 (1990) és Smith, C.A. és munkatársai, Science, 248: 1019 (1990)/.

A két receptor közel azonos affinitással köti a humán TNFc<-t és humán TNF/3 -t egész sejtekben való kifejeződéskor. A két receptor oldható formái ugyanakkor jóval kisebb affinitással kötik a humán TNF/ó-t, mint a humán T N F cK. -1 /Seckinger, P. és munkatársai, O.Biol.Chem. 264: 11966 (1989) és Engelmann, H. és munkatársai, J.Biol. Chem. 265: 1531 (1990)/. Ennek alapján feltételezhető, hogy a receptorok extracelluláris doménje oldásakor változás következik be a humán TNFc< és humán TNF/3 relatív affinitásában. Ha a találmányban szereplő monoklonális ellenanyag felismer egy epitópot a humán TNFc< receptorkötő helyén, akkor funkcionálisan úgy kell viselkednie, mint egy TNF«< -receptornak, vagyis fel kell ismernie mind a humán

TNFc< -t, mind a humán TNF/3 -t. Mivel az adott monoklonális ellenanyag oldható molekula, funkcionálisan oldható TNFc< -receptorként kell viselkednie, vagyis jóval nagyobb affinitással kell megkötnie a humán TNFc<-t, mint a humán TNF/J -t.

A 3. ábra igazolja, hogy valóban ez megy végbe. A humán TNF/5 fél-maximális biológiai aktivitásának aránya 1 jug/ml adott ellenanyag jelenlétében illetve hiányában 6,3. Ez azt jelenti, hogy az adott monoklonális ellenanyag oldható TNF<X -receptorként köti meg a humán TNFcK -t és a humán TNF/3-t. Ezért kiválóan megfelel immunogénként a szakemberek számára jólismert technikák alkalmazása segítségével (ld. általánosságban, Anti-idiotípusok, receptorok és a molekuláris utánzás, Linthicum, D.S. és Farid, N.R. szerk., Springer-Verlag Heidelberg, 1988) antiidiotípusos ellenanyagok előállítására, amelyek úgy kötődnek a találmányban szereplő monoklonális ellenanyaghoz, mint a humán TNF(^ . Következésképpen ezek a monoklonális antiidiotipusos ellenanyagok, amelyek úgy kötik meg a TNFcK -receptorokat, mint a TNFc< , vagyis utánozzák a TNFo< biológiai aktivitását, használhatók terápiás célra olyan betegségeknél, amelyekben a TNFí< adagolása valószínűleg kedvező hatású. Ilyen betegség pl. a rák, amelynél a találmányban szereplő antiidiotipusos ellenanyagok a TNFc< -hoz hasonlóan magukban vagy kombinált kezelés részeként adhatók /Műié, 3.J. és munkatársai, J. Exp. Med. 171: 629 (1990)/ és néhány autoimmun betegség /Jacob O.J., és

McDevitt, H.O., Natúré 331: 356 (1988)/.

A találmányban szereplő monoklonális ellenanyagokat és gyógyszerkészítményeket parenterálisan lehet adagolni szubkután, intramuszkulár is, intraarteriális vagy intravénás bejuttatással.

A találmányban szereplő monoklonális ellenanyagokat tartalmazó gyógyszerkészítményeket rendszerint hagyományos mód20 szerekkel készítik.

A találmányban szereplő gyógyszerkészítmények hordozó és/vagy hígító szerei általában alkoholos/vizes oldatok, emulziók vagy szuszpenziók, ezen belül sólék vagy pufferoldatok. A parenterális vivőanyag nátrium-klorid oldat, Ringer féle dextróz, dextróz és NaCl, laktált Ringer féle vagy kötött olajok. Az intravénás hordozóanyagok folyadék vagy tápanyag töltőanyagok, elektrolit töltőanyagok, pl. Ringer féle dextróz alapú vagy hasonló anyagok. Tartósító szerek és más adalékanyagok szintén jelen lehetnek, pl. antimikrobiális szerek, antioxidánsok, kelátképzők, iners gázok, stb . Ld. általánosságban, Remington’s Pharmaceutical Sciences, 16. kiadás, Mack, szerk., 1980.

Az olyan betegségeknél, amelyekben a TNFíK patogén hatást fejt ki, a testfolyadékok TNFcK szintje magasabb az egészséges egyénekéhez viszonyítva. Ezért a TNFc< színt meghatározása ezekben a testfolyadékokban diagnosztikai és prognosztikai értékű lehet.

A találmány további tárgyát képezi ily módon immunvizsgálatok kidolgozása, amelyekben a találmányban szereplő monoklonális ellenanyagok biológiai tulajdonságai különösen előnyösek. A találmány céljaira a találmányban leírt monoklonális ellenanyaggal kimutatott humán TNFcK jelen lehet a biológiai folyadékokban vagy szövetben. Bármely minta használható, amely valamely egyéntől származik és amely ismeretlen mennyiségű humán TNFcK.-t tartalmaz. A minta rendszerint folyadék, pl. vér, szérum , plazma, stb.

A találmányban szereplő monoklonális ellenanyagok különösen megfelelőek az immunvizsgálatokhoz, mivel felhasználhatók folyadék fázisban vagy szilárd hordozó anyaghoz köthetők. Emellett ezekben az immunvizsgálatokban a monoklonális ellenanyag különböző módokon megjelölhető.

Számos hordozóanyag létezik, amelyekhez a találmányban szereplő monoklonális ellenanyag hozzáköthető és amely felhasználható humán TNF<^ jelenlétének kimutatására. A jólismert hordozóanyagok az üveg, polisztirol, polipropilén, polietilén, dextrán, nejlon, amilázok, természetes és modifikált cellulózok, poliakrilamidok, agarózok és magnetit. A találmány céljaira szolgáló hordozóanyag lehet bizonyos mértékig oldható vagy oldhatatlan. A szakemberek számos más hordozóanyagot ismernek a monoklonális ellenanyag megkötésére vagy rutin kísérletekkel kereshetnek ilyeneket.

A szakemberek számára sok különböző jelölés és jelölési módszer ismeretes. A találmányban felhasználható jelölésekre nem kizárólagos például szolgálhatnak az enzimek, radioizotópok, fluoreszcens vegyületek, kemilumineszcens vegyületek, biolumineszcens vegyületek és fémkelátok. A szakemberek ezenkívül számos jelölést ismernek, amelyeket mind hozzá lehet kötni a monoklonális ellenanyaghoz, vagy rutin kísérletekkel kereshetnek ilyeneket. E jelölések hozzákötése a monoklonális ellenanyaghoz a szakemberek által ismert szabványos technikákkal megvalósítható.

Egyik módszer, amellyel a találmányban szereplő monoklonális ellenanyag kimutathatóan jelölhető, egy enzimhez való kötés. Mikor ez az enzim később találkozik a szubsztrátjával, azzal reagál, így olyan kémiai anyag képződik, amely spektrofotometriásán vagy fluorometriásan kimutatható. A találmányban szereplő monoklonális ellenanyagok jelölésére alkalmas enzimek pl. a malát dehidrogenáz, a staphylococcus-os nukleáz, delta-V-szteroid izomeráz, élesztő alkohol dehidrogenáz, alfa-glicerofoszfát dehidrogenáz, trióz foszfát izomeráz, torma peroxidáz, alkalikus foszfatáz, aszparagináz, glükóz oxidáz, béta-galaktozidáz, ribonukleáz, ureáz, kataláz, glükóz-VI-foszfát dehidrogenáz, glükoamiláz és acetilkolin észteráz.

A találmányban szereplő monoklonális ellenanyag jelölhető radioaktív izotóppal is, amely aztán gammaszámlálóval vagy szcintillációs számlálóval meghatározható. A találmány céljaira különösen alkalmas izotópok: ^H,

A monoklonális ellenanyag megjelölhető fluoreszcens vegyülettel is. Mikor a fluoreszcensen jelölt monoklonális ellenanyagot megfelelő hullámhosszú fény éri, jelenléte a színezék fluoreszcenciájának köszönhetően kimutatható. A legelterjedtebb fluoreszcens jelölővegyületek a fluoreszcein izotiocianát, rodamin, fikoeritrin, fikocianin, allofikocianin, oftaldehid és fluoreszcamin.

A találmányban szereplő monoklonális ellenanyag je152 lölhető fluoreszcencia-kibocsátó fémekkel is, pl. Eu, vagy a lantanidák sorozatának más tagjaival. Ezek a fémek hozzáköthetőek az ellenanyag molekulához olyan kelátképző csoportokkal, mint a dietiléntriamin-pentaecetsav (DTPA) vagy az etiléndiamin-tetraecetsav (EDTA).

A találmányban szereplő monoklonális ellenanyag jelölhető kemilumineszcens vegyülethez való kötéssel is. A kemilumineszcens vegyülethez erősített monoklonális ellenanyag jelenlétét azután a kémiai reakció során fellépő lumineszcencia alapján ki lehet mutatni. Különösen jól használható kemilumineszcens jelölővegyületek a luminol, izoluminol, theromás akridiniumészter, imidazol, akridiniumsó és oxalátészter.

Ugyanígy, biolumineszcens vegyület is használható a találmányban szereplő monoklonális ellenanyag jelölésére. A biomolekula a kemilumineszcencia egyik fajtája, amely olyan biológiai rendszerekben fordul elő, amelyekben a katalitikus fehérje növeli a kemilumineszcens reakció hatékonyságát. A biolumineszcens monoklonális ellenanyag jelenlétét a lumineszcencia kimutatásával határozzuk meg. Fontos biolumineszcens jelölő vegyületek a luciferin, luciferáz és aequorin.

A találmány megvalósítása során való alkalmazása esetén nagy érzékenységet biztosító másik technika a találmányban szereplő monoklonális ellenanyag hozzákapcsolása kis molekulatömegű hapténekhez. A haptének azután egy második reakcióval specifikusan kimutathatók. Igen elterjedt pl. az avidinnel reagáló biotin, vagy.a dinitrofenil, piridoxál és az anti-haptén ellenanyagokkal specifikusan reagáló fluoreszcamin haptének alkalmazása.

A találmányban szereplő monoklonális ellenanyagok nagyon megfelelnek egy készlet Összeállítására. Az ilyen kit tar24 talmazhat egy hordozó dobozt, amelynek tartóiba ampullák, csövek, stb. helyezhetők, szorosan lezárva, mindegyik tartóelem az alkalmazandó immunvizsgálat egyes komponenseit tartalmazza. Hasonló készletet lehet összeállítani egymástól elszigetelt hordozóelemekkel, amelyeknek egy vagy több tartóeleme a találmányban szereplő terápiás célú komponenseket tartalmazza.

Sokféle, készlet formájában használható immunvizsgálat-típus létezik. Tipikus immunvizsgálat, amelyhez a találmányban szereplő monoklonális ellenanyagok használhatók, a kompetitív és az immunmetriás vagy szendvics vizsgálatok.

Az immunmetriás vagy szendvics immunvizsgálat kifejezés a szimultán szendvics, egyenes szendvics és fordított szendvics immunvizsgálatot jelenti. Ezek a kifejezések ismertek a szakember számára. A szakember számára világos, hogy a találmányban szereplő monoklonális ellenanyagok használhatók más immunvizsgálat változatokban is, amelyek már most ismeretesek, vagy a jövőben fedezik fel őket. Szándékunkban áll ezek befoglalása a találmány tárgykörébe.

Az egyenes szendvics immunvizsgálatban a mintát először humán TNF(/ elleni monoklonális ellenanyagot tartalmazó szilárd fázisú immunabszorbenssel inkubáljuk. Az inkubálást addig folytatjuk, hogy a mintában levő antigénnek elegendő ideje legyen a szilárd fázisban levő immobilizált ellenanyaghoz kötődni. Az első inkubálás után a szilárd fázisú immunabszorbenst elválasztjuk az inkubációs keveréktől és kimossuk belőle az antigénfelesleget és az egyéb zavaró anyagokat, mint pl. a nem-specifikus kötőfehérjéket, amelyek szintén jelen lehetnek a mintában. Az immobilizált ellenanyagokhoz kötött humán TNFp< -t tartalmazó szilárd fázisú immunabszorbenset másodszor is inkubáljuk, oldható jelölt ellenanyaggal vagy ellenanyagokkal. A második inkubálás után másik mosással eltávolítjuk a meg nem kötött, jelölt ellenanyago(ka)t és a nem-specifikusan kötött, jelölt ellenanyago(ka)t a szilárd fázisú immunabszorbensről. A szilárd fázisú immunabszorbenshez kötött jelölt ellenanyago(ka)t azután kimutatjuk az eredeti mintában levő antigén közvetlen mérése alapján. Egy másik változatban az immunabszorbenshez nem kötődő jelölt ellenanyag is kimutatható, és ebben az esetben a mennyiség fordítottan arányos a mintában jelenlevő antigén mennyiségével. Az egyenes szendvics vizsgálatot pl. a 3,867,517; 4,012,294 és 4,376,110 számú USA szabadalmak írják le.

Az egyenes immunmetriás vizsgálat részletesebben a következőkkel jellemezhető:

(a) a mintából a szilárd fázishoz kötött ellenanyagból keverék készítése és a keverék inkubálása olyan feltételek között és annyi ideig, amely elegendő, hogy a mintában levő antigén a szilárd fázishoz kötött ellenanyaghoz kötődjön.

(b) az (a) inkubálási lépés után a keverékhez a jelölt ellenanyag(ok) hozzáadása és a kapott új keverék inkubálása olyan feltételek között és annyi ideig, hogy a jelölt ellenanyag a szilárd fázisú immunabszorbenshez kötődjön;

(c) a szilárd fázisú, immunabszorbens elválasztása a keveréktől a (b) inkubálási lépés után; és (d) a szilárd fázisú immunabszorbenshez kötött, jelölt ellenanyag vagy ellenanyagok, vagy a hozzá nem kötődött ellenanyag kimutatása.

A fordított szendvics vizsgálatban a mintát először a jelölt ellenanyaggal inkubáljuk, azután az immobilizált ellenanyagokat tartalmazó szilárd fázisú immunabszorbenst hozzáadjuk, majd egy második inkubálást végzünk. Az egyenes szendvics módszer első mosási lépésére itt nincs szükség, bár a második inkubálás után végzünk egy mosást. A fordított szendvics vizsgálatot írják le pl. a 4,098,876 és a 4,376,110 számú USA szabadalmak .

A fordított immunmetriás vizsgálatok során az eljárás a következő részletekkel jellemezhető:

(a) keverék előállítása az oldható jelölt ellenanyagból és a mintából, majd a keverék inkubálása annyi ideig és olyan feltételek között, hogy a mintában levő antigén a jelölt ellenanyaghoz tudjon kötődni;

(b) az (a) inkubálási lépés után a keverékhez a szilárd fázishoz kötött ellenanyagok hozzáadása, és a kapott új keverék inkubálása annyi ideig és olyan feltételek mellett, hogy a jelölt ellenanyaghoz kötött antigén hozzákötődjön a szilárd fázisú ellenanyagokhoz;

Λ * (c) a szilárd fázisú immunabszorbens elválasztása az inkubációs keveréktől a (b) inkubációs lépés után; és (d) vagy a szilárd fázishoz kötött jelölt ellenanyag vagy a hozzá nem kötődő jelölt ellenanyag kimutatása.

A szimultán szendvics vizsgálat során a mintát a több immobolizált ellenanyagot tartalmazó immunabszorbenset és a jelölt ellenanyago(ka)t párhuzamosan egy lépésben inkubáljuk. A szimultán vizsgálathoz csak egy inkubálási lépés szükséges, mosási lépésekre nincs szükség. A szimultán szendvics vizsgálat használata messze a legkedveltebb módszer. Ez a módszer könnyű kezelést, homogenitást, reprodukálhatóságot, linearitást és nagy pontosságot nyújt. Az antigént tartalmazó mintát, az immobolizált ellenanyagokat tartalmazó szilárd fázisú immunabszorbenst és a jelölt, oldható ellenanyago(ka)t inkubáljuk olyan feltételek között és annyi ideig, amely elegendő ahhoz, hogy az antigén az immobilizált ellenanyag(ok)hoz és az oldható ellenanyaghoz kötődjön. Általában olyan inkubálási feltételeket célszerű biztosítani, hogy a lehető legtöbb antigén kötődjön meg, mivel ez maximálisan növeli az ellenanyag kötődését a szilárd fázishoz, ezáltal növelve a jelet. Tipikus idő és hőmérséklet - két óra kb. 45 °C-on vagy 20 óra kb. 37 °C-on.

Az antigén rendszerint gyorsabba kötődik a jelölt ellenanyaghoz, mint az immobilizált ellenanyaghoz, mivel előbbi oldatban van, míg utóbbi a szilárd fázisú hordozóhoz van kötve.

Emiatt a jelölt ellenanyag kisebb koncentrációban használható, mint az immobilizált ellenanyag, és célszerű a jelölt ellenanyagra nézve nagy fajlagos aktivitású anyagot venni. Pl. a találmányban szereplő jelölt ellenanyag kb. 1-50 ng/vizsgálat koncentrációban alkalmazható, míg az immobilizált ellenanyag koncentrációja 10-500 ng/vizsgálat is lehet. Radioaktív jelölés esetén az ellenanyag fajlagos aktivitása pl. egy radioaktív jód/molekula vagy esetleg 1-2 radioaktív jód lehet ellenanyag molekulánként.

Több antigént tartalmazó minta szimultán immunmetriás vizsgálata során a folyamat a következő részletekkel jellemezhető:

(a) keverék szimultán előállítása a mintából, a szilárd fázishoz kötött ellenanyagból és az oldható, jelölt ellenanyag(ok)ból;

(b) az (a) lépésben kapott keverék inkubálása annyi ideig és olyan feltételek között, hogy a mintában levő antigén az immobilizált és jelölt ellenanyagokhoz kötődjön;

(c) a szilárd fázisú immunabszorbens szeparálása az inkubációs keveréktől az inkubálás után; és (d) vagy a szilárd fázisú, immunabszorbenshez kötött, vagy a nem kötött ellenanyag kimutatása.

Természetesen a jelölt és immobilizált ellenanyagok fajlagos koncentrációja, az inkubációs hőmérséklet és idő, valamint a vizsgálat többi feltétele a különböző tényezőktől füg29 gően változik, beleértve a mintában levő antigén koncentrációját és a minta természetét stb. A szakemberek meg tudják határozni az operatív és optimális vizsgálati feltételeket az egyes esetekre rutin kísérletek segítségével.

Az inkubálás után a szilárd fázisú immunabszorbenset eltávolítjuk az inkubációs keverékből. Ez bármely ismert elválasztási technikával kivitelezhető, pl. ülepítéssel és centrifugálásal. A kimutatás történhet szcintillációs számlálással, pl. ha a jelölőanyag radioaktív gammasugárzó, vagy pl. fluorométerrel, ha a jelölőanyag fluoreszcens anyag. Enzimjelölés esetén a kimutatás kolorimetriás módszerrel történhet, amelyhez az enzim egyik szubsztrátját alkalmazzuk.

Egyéb lépésekkel, pl. mosás, keverés, rázás, szűrés, stb. kiegészíthető a módszer, az adott helyzetből fakadó szokás vagy szükség szerint.

Számos szilárd fázisú immunabszorbens használható, és használtunk ilyeneket eddig is a találmány céljaira. Jólismert immunabszorbensek az üveg, polisztirol, polipropilén, dextrán, nejlon és egyéb anyagok és olyan csövek, amelyek ezekből készültek vagy velük vannak bevonva. Az immobilizált ellenanyagok vagy kovalensen vagy fizikailag kötöttek a szilárd fázisú immunabszorbenshez, pl. kovalens kötési technikával amid vagy észter kötés kialakításával, vagy abszorpcióval. A szakemberek számos további szilárd fázisú immunabszorbenst és ellenanyag-immobilizálási módszert ismernek, vagy rutin eljárásokkal ki tudnak dolgozni.

A találmány további vonatkozásait a következő példákon keresztül ismertetjük. Ez a példa semmilyen módon nem szándékozik behatárolni a találmányt.

Példa

1. Egér immunizálása humán TNFcK,-val

Humán TNFc^ -t (Esquire Chemie Ag, Zürich, Svájc) foszfátpufferes sóoldatban (PBS) hígítva, komplett Freund hatásjavító szerrel kiegészítve (CFA, Difco, Detroit, Michigan, 500 JLil - 500 pl PBS) 5 BALB/c egér első talpába adtunk be 30 pg/egér mennyiségben.

Az első immunizálás után 14 nappal a fentiek szerint PBS-sel hígított, CFA-val kiegészített humán TNFo^-t adtunk be szubkután módon ugyanazoknak az egereknek 30 /ig/egér adagban.

A második immunizálás után 14 nappal PBS-sel hígított humán TNFo<; -t adtunk be ugyanazoknak az egereknek, intraperitoneálisan, 30 pg/egér mennyiségben.

A harmadik immunizálás után 14 nappal humán TNFcX, -t adtunk be ugyanazoknak az egereknek ugyanolyan adagolásban, a

3. immunizálással megegyező feltételek között.

nap múlva a szérumban az ELISA vizsgálat alapján a legnagyobb anti-TNFc< ellenanyag titerrel rendelkező egeret leöltük.

2. Az anti-TNFcK, ellenanyagokat termelő egér lépsejtek halhatatlanná tétele

Aszeptikus feltételek között kivettük a lépet, homogenizáltuk, és a kapott sejtszuszpenziót centrifugáltuk. Eközben NSO mielómasejteket ( > 99 % életképes sejt) is centrifugáltunk. Aztán a szemcséket komplett RPMI tápközegbe újra szuszpendáltuk. Az RPMI tápközeg RPMI 1640 (Flow, Opera, Olaszország), amelyet 1 mM nátrium-piruvát (Gibco, Paisley, Skócia), nem esszenciális aminosavak (Gibco), 100 pg/ml sztreptomicin, 1,5 jjg/ml amfotericin B és glutamin (2 mM) egészít ki. Mindkét sejtszuszpenziót 10:1 arányú lépsejt:mielómasejt arányban kombináltuk. A kapott sejtkeveréket 10 percig 400 g-vel centrifugáltuk. A közeget eldobtuk és 1 ml polietilénglikolt (PEG 1500, Serva, Heidelberg, NSZK, 40 % m/v komplett RPMI tápközegben)adtunk be cseppenként 1 perc alatt, hogy lehetővé váljon a fúzió. Ezután 5 ml komplett RPMI közeget adagoltunk be 5 perc alatt, majd 10 ml-t 5 perc alatt és végül 15 ml-t 5 perc alatt. A kapott végső szuszpenziót 10 percig 400 g-vel centrifugáltuk és a szemcséket 20 % borjú magzat szérummal (FCS, Flow, 56 °C-on 30 percig hőaktivált) kiegészített RPMl-ben újraszuszpendáltuk, hogy 5 x 10^ sejt/ml végső sejtsűrűséget (lépsejtek + NSO sejtek) kapjunk. Ebből a szuszpenzióból 200 jul-t egy 96 lyuku szövettenyésztő lemez lyukaiba ültettünk (Falcon N° 3072, Becton Dickinson, Milánó, Olaszország), amelyekbe előzőleg besugárzott egér peritoneális sejteket (3000 Rád; 2,5 x 10^A sejt/lyuk) helyeztünk el. A fúziós terméket tartalmazó lemezeket azután 24 órán át 37 °C-on, 5 % CO2 mellett inkubáltuk. Ezután 20 % FCS-sel kiegészített • ·

- 32 50 pl komplett RPMI tápközeget, hipoxantint, aminopterint és timidint (HAT, sorrendben 10^-4 M, 4 x ΙΟ^-7 M és 1,6 x 10^-5 M végkoncentráció a lemezen), adtunk hozzá. Ebben a tápközegben csak a hibrodómák tudnak túlélni, mivel az NSO sejtek az aminopterin hatására elpusztulnak, a nem-fuzionált lépsejtek élettartama pedig korlátozott.

A lemezeket azután 37 °C-on, 5 % CO2 mellett tovább inkubáltuk. A tenyészethez 2 naponként friss tápközeget adtunk. A szaporodó hibridek a 4. naptól láthatók. 3 hét után az aminopterint eltávolítottuk, és 20 % FCS-sel kiegészített komplett RPMI tápközeget kezdtünk alkalmazni az 5. héttől kezdve.

10-14 nap múlva a tenyészeteket enzimkötéses immunszorbens vizsgálattal (ELISA) teszteljük humán TNF^-hoz kötött ellenanyag termelésre és a humán TNFc< biológiai hatásainak egyikét semlegesítő ellenanyagokra. Egyszerűsége miatt rendszerint a humán TNFc< citotoxin aktivitását semlegesítő képességet vizsgáljuk az egér LM sejteken (a vizsgálat részletes leírását ld. lejjebb). A legerősebb semlegesítő aktivitású ellenanyagot termelő hibrid sejteket klónozzuk, a hígítást 0,5 sejt/lyuk bemeneti koncentrációra korlátozva a 96 lyuku lemezeken (Falcon), amelyekbe előzőleg besugárzott egér peritoneális sejteket (3000 Rád; 2,5 x 10⁴ sejt/lyuk) helyeztünk el. Két hét múlva a szaporodás-pozitív lyukakat teszteljük TNFcA-specifikus ellenanyagokra a fentemlített két vizsgálattal.

A legnagyobb semlegesítő aktivitással rendelkező kiónt kiválasztjuk és tovább expandáljuk. E klón felülúszóját • *

...J «

- 33 teszteljük in vitro és in vivő semlegesítő aktivitásának pontos meghatározása céljából. E célból a felülúszó immonoglobulin koncentrációját kvantitatív ELISA vizsgálattal (a vizsgálat részletes leírását ld. lejjebb) meghatározzuk. Az in vitro semlegesítő aktivitás mennyiségi meghatározására 1 jug/ml, 100 ng/ml vagy 10 ng/ml (6,25 x 10 M, 6,25 x 10 M vagy 6,25 x 10~^M) monoklonális ellenanyagot együtt inkubálunk növekvő mennyiségű humán TNFcÁ-val. Két óra múlva meghatározzuk a humán maradék citotoxikus aktivitását egér LM sejteken.

Annak eldöntésére, vajon a monoklonális ellenanyag kersztreagál-e a hozzá igen hasonló TNF/ó polipeptiddel, 1 ^ug/ml monoklonális ellenanyagot együtt inkubálunk növekvő mennyiségű humán TNF/3 dózisokkal és 2 óra múlva meghatározzuk a humán TNF/2» eredő citotoxikus aktivitását LM sejteken.

Az in vivő semlegesítő aktivitás pontos mennyiségi meghatározása céljából különböző mennyiségű monoklonális ellenanyagot vizsgálunk az egérvédő képességére TNFp< -val és D-galaktóz-aminnal kiváltott halálos sokk szindrómával szemben (a vizsgálat részletes leírását ld. lejjebb).

A hibridóma klón sejteket a fent leírt módon ismét klónozzuk, hogy biztosítsuk a sejtpopuláció stabilitását és homogenitását. Egyik kiónt (78-as klón) kiválasztjuk, és további jellemzés céljából expandáljuk. Az adott klón által termelt monoklonális ellenanyagnak IgGI alosztályu nehézláncai és k osztályú könnyűláncai vannak.

• ·<-* · * ···· ·« • · t ♦ · · w « « * ·· · « · · · · ♦ • · · · * * ·

3. A humán TNFc^ -specifikus monoklonális ellenanyag specificitásának bizonyítása

Az 1. ábra bemutatja, hogy a 78-as hibridóma által termelt monoklonális ellenanyag humán TNFpC -hoz kötődése csak humán TNFo< -val való előinkubálás után szorítható ki, más antigén sorozatokkal nem.

A vizsgált egyéb antigének pl. az epidermális növekedési faktor (EGF), szomatosztatin, interleukin 6 (IL6), transzferrin, timusz hormon faktor (THF), inzulin és patkány immonoglobulin G voltak.

4. Növelt TNF<x( semlegesítő aktivitású és TNF/3 semlegesítő aktivitású monoklonális ellenanyag in vitro semlegesítő aktivitása

A 2. ábra bemutatja a 78-as hibridóma klón által termelt, 1 ^ig/ml monoklonális ellenanyag (6,25 x 10 M) semlegesítő aktivitását növekvő humán TNFc< adagok hatására. Amint látható, a humán TNFcKJ egymagában 50 % citotoxicitást fejt ki, 0,15 ng/ml-nél (3,3 x 10 Μ). 1 jug/ml adott monoklonális ellenanyag jelenlétében a humán TNFo^ 50 % citotoxicitást mutat 229 ng/ml-nél 84,6 x 10”^ M). Ez azt jelenti, hogy 1 jug/ml adott monoklonális ellenanyag teljesen semlegesít kb. 228 ng/ml humán TNF<j^ -t. A fél-maximális biológiai aktivitás aránya 1 jug/ml adott ellenanyag jelenlétében vagy hiányában tehát 1527.

Figyelembe véve, hogy a humán TNFc£ az oldatban trimer formájában van jelen, arra következtethetünk, hogy a mono35 klonális ellenanyag kb. 1,3:1 aránynál (moláris alapon) semlegesíti a humán TNF^-t.

A 3. ábra azt illusztrálja, hogy a humán TNF$,-ra a fél-maximális biológiai aktivitás aránya 1 jug/ml találmány szerinti ellenanyag jelenlétében vagy hiányában kb. 6,3. A 2. táblázat bemutatja az 5 0 % citotoxikus aktivitást adó humán TNF/) -9 _ 1 n adagokat LM sejtekre 6,25 x 10 , 6,25 x 10 M vagy

6,25 x 10¹¹ M adott ellenanyag hiányában vagy jelenlétében. Amint látható, az adott ellenanyag az összes vizsgált adag esetén semlegesíti a humán TNFo< -1 s; 2 arány mellett, moláris alapon számolva.

5. A növelt TNFcC semlegesítő aktivitású monoklonális ellenanyag affinitása

A találmányban szereplő monoklonális ellenanyag affinitását Sctachard elemzéssel határoztuk meg. E célból 1 ng/ml (6,25 x 10 M) adott monoklonális ellenanyagot különböző menynyiségű jódozott humán TNFcx -val inkubáltunk, majd meghatároztuk az ellenanyaghoz kötött humán TNF< mennyiségét.

Amint a 4. ábrán látható, a kötési adatokból felrajzolt Scatchard görbe egyenes vonalat ad. Az 1. táblázat bemutatja az adott monoklonális ellenanyaghoz kötött humán TNF</ kötődési paramétereit. Amint látható, az affinitási állandó (K₀b_s) 3,16 x 10^ M-l és a 6,25 x 10 M adott monoklonális ellenanyaghoz köthető jódozott humán TNFc< legnagyobb mennyisége 4,34 x 10~12 m.

*·»« ···« ·· • · Λ · ·· r · ( »· · * ♦ »Λ * ·* ♦ f Μ ·· ·

6. A humán TNF£ disszociációja növelt TNF<£ semlegesítő aktivitású monoklonális ellenanyagból

A humán TNFo<: disszociációját az adott ellenanyagból jódozott humán TNFdj (2,5 ng/ml, 5 x 10 M) és a monoklonális ellenanyag (2 ng/ml, 1,25 x 10^-^¹ M) előinkubálásával, majd a disszociáció mérésével határozzuk meg, a jódozott humán TNFc^ újradisszociáciálódását megakadályozandó, feleslegben levő nem-jelölt humán TNFcC hozzáadása mellett. Az 5. ábra illusztrálja e kísérlet eredményeit. Amint látható, a jódozott humán TNFoQ disszociációja elsőrendű reakciókinetikát követ, egyenesvonalú görbét adva. A k_^ értéket (disszociációs sebességi állandó) e görbéből meghatározva 1,37 x 10 $ sec”l-t (T 1/2 = 14h) kapunk.

7. Ouchterlony féle kettős immundiffúzió agaron

A 6. ábra azt mutatja, hogy a találmányban szereplő monoklonális ellenanyag képes a humán TNFoQ. immunlecsapására. Precipitin sávok képződnek, ha 20 pg adott monoklonális ellenanyagot (középső sáv) reagáltatunk 10 /jg (bal felső sáv), 5 yug (jobb felső sáv) és 2,5 pg (jobb alsó sáv) humán TNFoC -val.

1,25 pg humán TNF<K -nál (bal alsó sáv) a precipitin sáv többé nem látható. Ismeretes, hogy a találmányban szereplő monospecifikus ellenanyaghoz hasonló antigén lecsapásához annak többértékűnek kell lennie, és minimum 3 azonos epitópot kell kifejeznie ugyanazon a molekulán /Sachs, D.H. és munkatársai, J. Immunoi 109: 1300 (1972)/. A humán TNFoC -t trimerként írták le oldatban (Jones, E.Y. és munkatársai ld. fentebb), de néhányan » * *«»· <· ···· • · · · * · • · · * * · · « » * < · * • r ·* ♦ · <

azt állítják, hogy oldatban a humán TNFoq dimerként van jelen /Petersen, C.M. és munkatársai, Europ.3.Immunoi. 19: 1887 (1989)/. A 6. ábra eredménye szerint a találmányban szereplő monoklonális ellenanyag segítségével egyértelműen megállapítható, hogy a humán TNFot trimer.

8. Humán TNFc£ és növelt TNFoó. semlegesítő aktivitású monoklonális ellenanyag keverékek gyors, nagynyomású folyadékkromatográfiás (FPLC) nagyság szerinti kiszorításos profiljai

A 7. ábra ábrázolja a 100 jug/ml (2 x 10^-^ M) humán TNFcC nagyság szerinti kiszorításos FPLC profilját önmagában (- - - A ábra), a 100 yug/ml (6,25 x 10 ⁶ M) adott monoklonális ellenanyagét egyedül (---- A ábra), a 100 jjg/ml (2 x 10^-^ M) humán TNFoC és 30 |jg/ml (2 x 10 M) monoklonális ellenanyag keverékét (B ábra) és 5 ng/ml (10^-^^BM) jódozott humán TNF<< és 2 ng/ml (1,3 x 10 M) monoklonális ellenanyag keverékét (C ábra). Amint látható, a humán TNFoQ egyedül 40 kD-nak megfelelő volumennél eluál. A humán TNFcC ezen kromatográfiás viselkedése egyezik azokkal a vizsgálatokkal, amelyekben az oligomer TNFoC 34-40 kD-os látszólagos molekulatömeget mutatott a gélszűrés során /Kumitani, M.G. és munkatársai, 3.Chromatogr. 443: 205 (1988)/. Másrészt a humán TNFo< és a monoklonális ellenanyag keverék nagy feleslegben levő vagy a számított K_Q^_s-hoz közeli reagenskoncentráció mellett olyan komplexeket ad, amelyek min. 400 kD, rendszerint 570-600 kD (B és C ábra) molekulatömegnek megfelelő volumennél eluálnak.

*♦·· «··· ** itt ♦ ·· « 4 · ·>··· » · * 4 ·*

4« t» ·«»

9. A növelt TNF<*; semlegesítő aktivitású monoklonális ellenanyaggal végzett in vitro kísérletekből levonható következtetések

A humán TNFu<-ból és az adott monoklonális ellenanyagból képződött komplexek molekulatömegét figyelembe véve (570-600 kD) és szem előtt tartva, hogy a monoklonális ellenanyag által megköthető és semlegesíthető legnagyobb humán TNF/ζ mennyiség 0,7 mól TNFcC/mól ellenanyag, arra a következtetésre jutunk, hogy az adott komplexek mindegyike nagy molekulatömegű komplex, amelyek lényegében min. 2 molekula adott monoklonális ellenanyagot és 1 humán TNF</; molekulát tartalmaznak, rendszerint 3 molekula adott monoklonális ellenanyag (6 kötődő kar) kötődik össze 2 molekula humán TNFt£-val (6 epitóp).

Az ilyen komplexeknek gélszűrés során elvileg az 560-580 kD-nak megfelelő volumennél kell eluálniuk, és az az érték nagyon közel áll a kísérleti értékhez. Mivel a kötődési sztöchiometria eredményét antigénfelesleg mellett kaptuk, kizártuk, hogy a humán TNFσζ/monoklonális ellenanyag komplexek változó, nyitott lánc konfigurációjú mAb78-huTNFc< molekulából állnak. Ehelyett feltételeztük, hogy a humán TNFcC /monoklonális ellenanyag molekulák gyűrűszerű szerkezetet hoznak létre. A gyűrűs antigén - ellenanyag komplexek energetikai előnyét és az ebből következő extrém stabilitást gondosan megvizsgálták és megtárgyalták /Archer, B.G. és Krakaur, H., Biochemistry 16: 618 (1977); Erickson, 3. W. és munkatársai Biochemistry 30: 2357 (1991); Posner R.G. és munkatársai, Biochemistry 30: 2348 (1991); Dembo, M. és Goldstein, B., Immunochemistry 15: 307 *·«· ·· «·»· • · « 9 4» • · · » *·· • · * » < · ·· ·· · ·· (1978)/. A disszociációs vizsgálatok (5. ábra) azt mutatják, hogy a humán TNF c</monoklonális ellenanyag komplexek valóban igen stabilak (k_j = 1,37 x 10 sec ^). Ezek az értékek ugyanolyan nagyságrendűek, mint amelyeket a sejtfelületi antigénekhez kötődő monoklonális ellenanyagokra leírtak monogám, kétértékű kötési mód mellett, /Mason,D.W. és Williams A.F. Biochem. 0. 187: 1 (1989)/, amely egy, hasonlóan stabil komplexek képződéséhez vezető másik antigén - ellenanyag kölcsönhatás. Egyébf ként, ha az ilyen ciklikus komplexek képződése rév^o a humán TNF<x; és az adott monoklonális ellenanyag eléri a legnagyobb stabilitási állapotot, az megmagyarázza azt a látszólag^paradoxont, hogy antigénfelesleg esetén a legkisebb antigén - ellenanyag komplex ellenanyag-felesleget tartalmaz.

E modellt szem előtt tartva felmerül a kérdés, hogy a humán TNFo; és az adott monoklonális ellenanyag hogyan csapódnak ki. Mivel ezekben a komplexekben nincs szabad humán TNFc£ epitóp, amely reagálna az adott monoklonális ellenanyagokkal, az kizárható, hogy a kicsapódás a komplexek térhálós kötéseioek következménye lenne. Inkább azt gondoljuk, hogy a gyűrűs komplexek képződése és a kicsapódás két alapvetően különböző, egymással versenyben levő jelenségek. Antigén felesleg esetén és alacsony (a K_o^_s-hoz közeli) reagenskoncentráció mellett a gyűrűs komplexek képződése a jellemző, míg egyensúly illetve ellenanyag felesleg és nagy reagenskoncentráció mellett a változó ellenanyag - antigén molekulákból felépülő komplexek dominálnak a klasszikus rácselméletnek megfelelően.

•t ·· •β

Végül a monoklonális ellenanyagok kötődése a humán

TNFcx; -hoz a találmányban leírtak szerint előnyös lehet a humán TNFo< -val kapcsolatos betegségek gyógyításában való alkalmazás szempontjából is.

A min. kettő, rendszerint három monoklonális ellenanyagból álló komplexek lényegében mikroaggregátumoknak tekinthetők. A monocita - makrofág vonal sejtjeinek el kellene ezeket távolítani a keringésből, megakadályozva ezzel lerakódásukat a kritikus szervekben (pl. a vesében) és így elkerülve az immunkomplex-közvetítette gyulladási reakciókat ezeken a területeken

10. A növelt TNFp< semlegesítő aktivitású monoklonális ellenanyag in vivő semlegesítő aktivitása

Az in vivő semlegesítő aktivitás értékelésére modellrendszert alkalmazunk, amelyben az egereknek intraperitoneálisan 36 mg D-galaktóz-amint (Fluka AG, Buchs, Svájc) és humán TNFo< -t adunk be. A D-galaktóz-amin az állatokat; rendkívül érzékennyé teszi a humán TNFo< halálos hatására. Amint a 2., 3. és 4. táblázatokból látható, 0,1 yug/egér mennyiségű humán TNFc< az egerek többségénél pusztulást okoz. Az ilyen mennyiségű TNF^< beadása az egérnek a vér TNFc£ szintjét olyan mértékűre növeli, amilyet az emberekben olyan betegségeknél mértek, amelyekben a TNF<£ káros szerepet játszott /ld. Cannon, 3.G. és munkatársai, The Oournal of Infectious Diseases 161: 79 (1990)/. Ez a modellrendszer ezért alkalmas azon anti-TNF<£ monoklonális ellenanyag adagok meghatározására, amelyek elvégzik a semlegesítést az emberekben olyan betegségeknél, amelyekben a TNFo< pa41 fogén hatást fejt ki.

A 3. és 4. táblázatok a 78-as hibridóma klón által termelt, a találmányban szereplő monoklonális ellenanyaggal végzett in vivő védelmi vizsgálatok eredményeit illusztrálják.

A 3. táblázat ezen belül azt mutatja, hogy 0,4 ^ug/egér monoklonális ellenanyag képes az egér teljes védelmére 36 mg D-galaktóz-aminnal együtt beadott 0,1 jug/egér humán TNF</; halálos hatásával szemben. 1 jug/egér szuperletális adag humán TNF<£ almazásakor 4 ^ug/egér monoklonális ellenanyag teljesen megvédi az egeret.

A 4. táblázat összegezi a kinetikai vizsgálatok eredményeit. Amint látható, 10 jjg/egér monoklonális ellenanyag képes az egér teljes védelmére 1 pg/egér TNF<£ halálos hatásával szemben, ha azt 1,5 órával előbb vagy a TNFcK-val egyidejűleg adjuk be. Ha a beadás 20 perccel a TNFc^ bevitele után történik, részleges védelem figyelhető meg. Másrészt 1 yjg/egér monoklonális ellenanyag teljes védelmet nyújt az egérnek, ha ezt a 0,1 ^ig/egér TNFcK beadása után 40 perccel visszük be. Ha a TNF</ után 2 órával történik a beadagolás, a védelem részleges. A 78-as hibridóma klón sejteket ideiglenes 90110707 ECACC katalógusszámmal 1990. november 7-én elhelyeztük.

Módszerek

1. Humán TNF</(-specifikus ellenanyagok kimutatása

ELISA-val

Síkfenekű mikrotitráló lemezeket (Falcon N° 3912)

100 μΐ/lyuk koncentrációban 100 mM bikarbónát pufferben oldott

Λ jjg/ml humán TNF(£ -val vonunk be 9,6-os pH mellett. Egy éjszakán át 4 °C-on való inkubálás után a nem abszorbeálódott TNFcA.-t eldobjuk és 1 % marha szérumalbuminnal (BSA, Armour, Kankakee, Illinois) kiegészített PBS-t adunk minden egyes lyukba, hogy telítsük az el nem foglalt helyet.

A lemezeket 3 órán át szobahőmérsékleten tovább inkubáljuk. Ezután 0,1 % Tween 20-szal (Merek, Schuchardt, Hohenbrunn, NSZK) és 0,01 % merthioláttal (BDH, Pool, Nagy- Britannia) kiegészített PBS-sel mint mosópufferrel (W B) háromszor mossuk. 1 % BSA-val kiegészített, 1:5 arányban PBS-sel hígított 50 μΐ hibridóma felülúszót adunk minden egyes lyukba, a lemezeket 60 percig 37 °C-on inkubáljuk és a fentiek szerint mossuk. Ezután 100 jul peroxidáz-konjugált kecske-antiegér immunoglobulin G-t (HRPalgG, Bio-Rad, Richmond, California) l:3000-es WB-s hígítás mellett beadagolunk minden lyukba, a lemezeket 45 percig 37 °C-on inkubáljuk, majd a fentiek szerint mossuk. Azután 100 yul peroxidáz szubsztrátot (PD2, Chemicon, SCI, Róma, Olaszország, 1 tablettát 5 ml citrátpufferben oldva, 0PD4, Chemicon) adunk minden lyukba. A reakció 2 percen át szobahőmérsékleten végbemegy, ezután a színfejlődést 100 jul/lyuk 4M kénsav beadagolásával leállítjuk. A színfejlődés mértékét lemezes ELISA leolvasón 492 nm-nél leolvassuk. A 0,5-nél nagyobb optikai sűrűséget (0D) adó felülűszókat anti-TNF<K ellenanyag jelenlét szempontjából pozitívnak vesszük.

9

2. A humán TNFcK.-spécii ikus ellenanyagok specificitásának bizonyítása kompetitiv ELISA-val

100 ng/ml hibridóma felülúszót együtt inkubálunk különböző koncentrációjú humán TNFc< -val vagy különböző koncentrációjú egyéb antigénnel vagy higítószerrel (1 % BSA-val kiegészített PBS-sel) 2 órán át 37 °C-on. Az inkubációs idő letelte után megmérjük a humán TNFc4 -kötődést a korábban leírt ELISA módszerrel, amely lehetővé teszi a humán TNFc<-specifikus ellenanyagok kimutatását.

3. Egér IgG ellenanyagok mennyiségi meghatározása ELISA-val

Síkfenekű mikrotitráló lemezeket 100 jul/lyuk mennyiségű, 40 mm foszfátpufferrel hígított kecske-antiegér Ig-vel (Organon Teknika, Turnhout, Belgium, 1 jug/lyuk végkoncentráció) vonunk be. Egy éjszakán át 4 °C-on való inkubálás után a nem abszorbeálódott ellenanyagot eldobjuk és 1 % BSA-val kiegészített PBS-t adunk minden lyukba az üres műanyag helyek betöltésére .

A lemezeket szobahőmérsékleten 3 órán át tovább inkubáljuk, majd WB-vel háromszor mossuk. Ezalatt az inkubációs időszak alatt a referencia egér IgG készítményekből (Pel-Freez, Rogers, Arkansas) kétszeres higítási sorozatot készítünk, általában 5-0,25 yúg IgG/ml koncentrációban. Párhuzamosan az ismeretlen mennyiségű IgG-t tartalmazó felülúszókból kétszeres higításu sorozatot állítunk elő, rendszerint 1:100-tól 1:12800-as koncentrációban. Az összes hígítást 1 % BSA-val kiegészített

PBS-sel végezzük. Mindegyik hígításból 50 pl-t adunk a lyukba, a lemezeket 60 percen át inkubáljuk 37 °C-on, majd a fentiek szerint mossuk.

A peroxidáz szubsztrát beadagolása és a színfejlődés az 1. pontban leírtak szerint történik.

Az ismeretlen mennyiségű IgG-t tartalmazó felülúszók IgG koncentrációit ELISA-SOFT PC programmal (Perkin-Elmer, Norwalk, Connecticut) való adatfeldolgozással számítjuk ki.

4. A monoklonális ellenanyagok nehéz és könnyű láncainak besorolása ELISA-val

E célra HYBRIDOMA SUB ISOTYPING KIT (Calbiochem, La üolla, California) készletet használunk az előállító javaslatai szerint. A tipizálást 1 % BSA-val kiegészített PBS-sel 1:5 arányban hígított hibridóma felülúszóból végezzük. A 0,4-nél nagyobb OD értéket adó lyukakat tartjuk pozitívnak az adott lg osztály, alosztály monoklonális ellenanyaga és könnyű lánc jelenléte szempontjából.

5. Anti-TNFc< monoklonális ellenanyag in vitro semlegesítő aktivitásának meghatározása

A 0. napon a logaritmikusán szaporodó egér LM sejteket /Rubin, B.Y. és munkatársai, J.Exp. Med. 162: 1099 (1985)/ tripszinizáljuk, centrifugáljuk és 3 x 10⁵ sejt/ml végkoncentrációig újra szuszpendáljuk 5 % FCS-sel és 1 % glutaminnal kiegészített Eagle féle minimál esszenciális táptalajban (komplett MÉM) .

Ebből a szuszpenzióból 100 pl-t síkfenekű mikrotitráló lemezek lyukaiba adagolunk (Falcon 3072). Ezután humán TNFcK vagy humán TNF/3 (Omnia Rés. Cinisello Balsamo, Olaszország) higításckat készítünk komplett MEM-ben oly módon, hogy a lyukakba adagolás után a végkoncentrációk 1 pg/ml és 25 pg/ml között legyenek.

Az ellenanyag-tartalmú felülúszókat és oldatokat komplett MEM-ben hígítjuk, hogy a lyukakba adagolás után a végső koncentráció 1 pg/ml, 100 ng/ml vagy 10 ng/ml monoklonális ellenanyag legyen.

pl hígított TNFok -t vagy TNF/3 -t együtt inkubálunk 50 pl monoklonális ellenanyaggal vagy 50 pl komplett MEM-mel 2 órán át 37 °C-on. Ezalatt az inkubációs időszak alatt actinomycin D-t (Fluka) tartalmazó oldatot készítünk komplett MEM-ben. Az actinomycin D végső koncentrációja a lyukakba adagolás után 1 pg/ml. Az inkubációs időszak végén ellenanyag - TNFo< vagy -TNF/3 keveréket és 50 pl actinomycin D-t adagolunk a mikrotitráló lemezek lyukaiba. Néhány lyukba 100 pl g hígított TNFc<-t vagy TNF/3-t önmagában adunk. Néhány kontroll lyukba csak actinomycin D-t plusz komplett MEM-et adunk. Ezután a lemezeket 24 órán át 37 °C-on inkubáljuk.

Az inkubálási periódus végén 20 pl thiazolil kék oldatot (MTT, Calbiochem, 5 mg/ml, PBS-ben) adunk minden lyukba. A lemezeket ezután tovább inkubáljuk 4 órán át 37 °C-on. Ezután a felülúszókat eldobjuk, 200 pl dimetil-szulfoxidot (DMSO, Farmitalia Carlo Erba) adunk minden lyukba és a színkifejlődés mértékét lemezes ELISA leolvasón leolvassuk 570 nm-nél.

Az ellenanyag -TNF<\ vagy -TNF/3 keverékekre talált 00 értékeket összehasonlítjuk az egyedül levő TNFc<-ra vagy TNF/3 -ra találttal. Monoklonális ellenanyag jelenlétében vagy hiányában meghatározzuk azokat a TNFcZ. vagy TNF/3 adagokat, amelyek a kontroll lyukakra kapott 0D értékek 50 %-ának felelnek meg (50 % citotoxicitás). A legnagyobb semlegesítő aktivitású monoklonális ellenanyagok azok, amelyek a legnagyobb növekedést okozzák az 50 % citotoxicitás eléréséhez szükséges TNFcK dózisban.

6. Az anti-TNFcK. monoklonális ellenanyagok affinitásának meghatározása

Az anti-TNFc<( monoklonális ellenanyagok affinitásának meghatározására a következő kísérlet szolgál. 1 ng/ml (6,25 x 10 M) adott monoklonális ellenanyagot illetve csak hígító szert (0,5 % BSA-val kiegészített PBS-t) különböző koncentrációjú jódozott humán TNF«<.-val (NEN, Wilmington, DE, a koncentrációk rendszerint 0,5 x 10 M és 4 x 10 M között vannak) inkubálunk Eppendorff csöveken 4 órán át szobahőmérsékleten. Az inkubálási idő eltelte után minden egyes csőbe 1:5 higítású Immunobeads-t (170-5104, Bio-Rad, Segrate, Olaszország) adunk, és a csöveket tovább inkubáljuk 1 órán át. Azután a keverékeket ftalát-dibutil-ftalát olaj keveréken át centrifugáljuk (1:1,5 v/v, Fluka, AG). Az Immunobeacfésszociált radioaktivitást gammaszámlálóban mérjük. Az így nyert adatok'egyensúlyi kötődési adat elemző programmal dolgozzuk fel (EBDA, ΐχΊ

Elsevir Science Publisher, Amsterdam, Hollandia).

7. Anti-TNFc\ monoklonális ellenanyaghoz kötött humán TNFK disszociációs sebességi állandójának (k_j) meghatározása ng/ml (1,25 x 10~H M) 78-as hibridóma által termelt monoklonális ellenanyagot illetve csak puffért (PBS + 0,5 % BSA) inkubálunk 2,5 ng/ml (5 x 10”^^ M) jódozott humán TNFcX-val órán át szobahőmérsékleten. Ezután 1:5 higítású Immunobeads-et adunk hozzá 1 óra alatt, majd a keveréket kétszer centrifugáljuk. A kapott szemcséket 250 ng/ml (5 x 10 M) hideg humán TNFc< -bán újra szuszpendáljuk, hogy a disszociálódó Összes jódozott humán TNFc<-t újra kössük. Különböző időtartamú, szobahőmérsékleten végzett inkubálás után (ld. 5. ábra) a szemcséket olajkeveréken át centrifugáljuk az előzőekben leírtak szerint.

A kapott monoklonális ellenanyaghoz specifikusan kötődő jódozott humán TNFcX. mennyiségét meghatározzuk, és az eredményeket kötött radioaktivitás % - lóg idő görbére visszük fel. Az 50 %-os disszociáció ideje (T 1/2) a görbéről leolvasható és a k_! kiszámítására használható:

0,693 ^k-i ⁼ ------- ¹ T 1/2

8. Ouchterlony féle kettős immundiffúzió agaron

Annak vizsgálatára, hogy a 78-as hibridóma által termelt monoklonális ellenanyag kicsapja-e a humán TNFc^-t, kettős diffúziós elemzést végzünk. E célból 1 % agarózgélt használunk 0,9 % NaCl-ban. A mintákat (humán TNFiX. és monoklonális ellenanyag) kör alakú lyukakba helyezzük. Legalább 24 órán át 4 °C-on hagyjuk kifejlődni a mintákat fotografálás előtt.

9. Humán TNFcK és anti-TNFcK monoklonális ellenanyag keverékek FPLC nagyság szerinti kiszorításos profiljainak meghatározása

E célból a humán TNF<K vagy jódozott humán TNFc<

és tisztított anti-TNFc< monoklonális ellenanyagot tartalmazó keverékeket készítünk humán TNFck, felesleggel (pl. 100 ^ig/ml humán TNF< és 30 pg/ml monoklonális ellenanyag vagy 5 ng/ml jódozott TNFc< és 2 ng/ml monoklonális ellenanyag) vagy PBS-sel (100 pg/ml humán TNFcX és 30 jug/ml monoklonális ellenanyag keverékhez) vagy PBS + 0,5 % BSA-val (5 ng/ml jódozott humán TNFcZ és 2 ng/ml monoklonális ellenanyaghoz). A keverékeket 4 órán át szobahőmérsékleten inkubáljuk. Ezután a keverékeket, a TNFcX.-t önmagában, vagy a monoklonális ellenanyagot önmagában 10 x 300 ífim-es Superose 6 FPLC oszlopon (Pharmacia LKB Biotechnology- Uppsala, Svédország) kromatografáljuk, hogy Α£θβ abszorbancia profilokat kapjunk. Az oszlopot előzetesen kiegyenlítjük és eluáljuk 50 mM nátriumfoszfáttal, 150 mM NaCl-dal, pH = 7,2 puffer mellett. A molekulatömeg standardok rendszerint kék dextrán (mt 2 x 10^é), humán IgM (mt 900 000), marha triglobulin (mt 670 000), marha IgG (mt 158 000), csirke ovalbumin (mt 44000), ló mioglobin (mt 17 000), B^ vitamin (mt 1 350).

10. Anti-TNFo<: monoklonális ellenanyagok in vivő semlegesítő aktivitásának meghatározása

Az anti-TNFo^ monoklonális ellenanyag in vivő semlegesítő aktivitásának értékelésére egérben humán TNFcK -indukált letális sokkot létrehozó modellrendszert állítunk össze. E célból az egerekbe intraperitoneálisan különböző mennyiségű humán TNFcC-t injektálunk be (rendszerint 0,1 ug vagy 1 ^ig/egér,

0,25 ml PBS-sel hígítva) D-galaktóz-aminnal együtt (rendszerint 36 mg/egér 0,25 ml PBS-sel hígítva). A halálos humán TNFo^ adagot kapott egerek 24-48 óra múlva elpusztulnak.

Az anti-TNFc^, monoklonális ellenanyag in vivő semlegesítő aktivitását úgy értékeljük, hogy az egerekbe intravénásán különböző mennyiségű monoklonális ellenanyagot adunk be (0,25 ml PBS-ben hígítva) és 90 perc múlva halálos adag humán TNFc< -t adunk intraperitoneálisan.

Egy másik kísérletsorozatban az anti-TNFc< monoklonális ellenanyag in vivő semlegesítő aktivitását értékeltük az idővel. E célból a monoklonális ellenanyagot különböző időpontokban adtuk be a halálos mennyiségű humán TNFc*; bevitele előtt és után.

	1. Táblázat
A h u T N Fc<	mAb78-hoz kötődésének paraméterei

Mért affinitási	Maximális kötőké-	Arány
állandó	pesség
K k obs	B max	B /mAb78
		max
(xlO^-10M^_1)	(x10¹²M)
3,16 + 0,7*	4,34 + 0,46	0,71 + 0,11
* Az eredményeket	(+ standard eltérés) három	független kísérlet

alapján határoztuk meg.

2. Táblázat

LM sejteken 50 % citotoxicitást adó huTNFc< koncentrációk különböző koncentrációjú mAb78 jelenlétében illetve távollétében

mAB78 koncentráció	50 % citotoxicitást adó	Semlegesítési arány⁺
huTNFcK	koncentráció
-	3,3 +	0,4 x 10^_12M	-
6,25 x 10⁹M	4,6 +	0,2 x 10^-9M	1,36
6,25 x 10^-1°M	5,2 +	0,5 x 10¹⁰M	1,21
6,25 x 10^_11M	3,8 +	1 x 10^_11M	1,8

Az eredményeket (+ standard hiba) minimum 3 önálló kísérlet alapján határoztuk meg ⁺ Semlegesítési arány = a mAb78 koncentráció és a semlegesített huTNFcK koncentráció aránya • · ·

3. Táblázat humán TNFe< -val és D-galaktóz-aminnal kezelt egerek halálozási aránya

D-galaktóz-amin adag³	TNF	adag³	Halálozási arány
36 mg/egér		-	0/4
36 mg/egér	0,01	pg/egér	2/4
36 mg/egér	0,1	pg/egér	4/4
36 mg/egér	1	pg/egér	4/4

- a D-galaktóz-amint és a TNFcK,-t együtt, intraperitoneálisan adtuk be.

4. Táblázat

A 78-as monoklonális ellenanyag (mAb78) hatása humán rekombináns TNFcK, -val és D-galaktóz-aminnal kezelt egerekre

D-galaktóz-amin	TNF<K	mAb78	Halálozási
adag³	adag³	adag'³	arány
36 mg/egér	0,1 pg/egér	-	19/21
36 mg/egér	0,1 pg/egér	0,5 pg/egér	0/5
36 mg/egér	0,1 jjg/egér	0,4 pg/egér	0/5
36 mg/egér	0,1 pg/egér	0,3 pg/egér	4/13
'36 mg/egér	0,1 pg/egér	0,2 pg/egér	4/13
36 mg/egér	0,1 pg/egér	0,1 pg/egér	3/5
36 mg/egér	1 pg/egér	-	12/12
36 mg/egér	1 pg/egér	5 pg/egér	0/12
36 mg/egér	1 pg/egér	4 pg/egér	0/8
36 mg/egér	1 pg/egér	3 pg/egér	1/8
36 mg/egér	1 pg/egér	2 pg/egér	4/8
36 mg/egér	1 pg/egér	1 pg/egér	6/8

a - Ld. 1. táblázat b - a mAb-ot intravénásán 1,5 órával a TNFe<. és D-galaktóz-amin előtt adagoltuk be.

Különböző időpontokban beadott 78-as monoklonális ellenanyag (mab78) hatása humán TNFcK -val és D-galaktóz-aminnal kezelt egerekre

Q)
•n	CD
ω
Ό
•r-i	+
•i—í
in
'Cü

Cü	·>
ω	CD
	CSí
	+
CÜ
X
Ll.
Z
l·—
>>	O
CD
ro
>
in
'03
co
r-
_□	J=
<
E	LA

<	t—1

jug 78 0/10

• 4 ·

- 55 Különböző időpontokban beadott 78-as monoklonális ellenanyag (mab78) hatása humán TNFcX, -val és D-galaktóz-aminnal kezelt egerekre

CD 'tü

N □ >. r-l C -ra 'ro r-l H ra ro x

X

CXI +

£2 !—I +

ω ~ •rro o

QJ •r4 + •r-i cn 'ro

Ό ro

O XD 04 ro

L1_ >. CT ro >

cn 'CD co r~jo _c <

E DX

C r-l

Lf\ i-4 ro o

OJ co o·

CD

LO

4-5 ro co r* JO < E r*

CD

CO r~~

CT

co r·*

CD ro

4^ -P :□ >> CD (D

CD

I

N 'CD

CD

CD \

C • H

E Cü

I

N Ό 4-5 ro rH ro

CD i Q

CD

Γ~

CT =L.

CT

3^

CT

5.

·<·· «4 ···«• V 4 4 ·*

44» ··«« • » · · · ·

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Monoklonális ellenanyag vagy annak kötőiragmense, amely képes a humán nekrózis alfa faktor semlegesítésére, azzal jellemezve, hogy az adott ellenanyag ki tudja csapni a humán TNFX -t nagy molekulatömegű antigén-ellenanyag komplexek képzésével.
2. Az 1. igénypont szerinti monoklonális ellenanyag vagy annak kötőfragmense, azzal jellemezve, hogy a humán TNFc^-val képzett legkisebb antigén-ellenanyag komplexek lényegében minimum két molekula adott monoklonális ellenanyagot és minimum egy molekula humán TNFc< -t tartalmaznak, és molekulatömegük min 400 kD.
3. A 2. igénypont szerinti monoklonális ellenanyag vagy annak kötőfragmense, amely in vitro semlegesíteni képes a humán TNFc<-t 2:l-nél kisebb arány mellett moláris alapon számolva.
4. Az 1. igénypont szerinti monoklonális ellenanyag vagy annak kötőfragmense, amely teljes védelmet tud biztosítani az egérnek az egyébként halálos adag humán TNFc^-val szemben 1 pg/egér-nél kisebb adag mellet.
5. Az 1. igénypont szerinti monoklonális ellenanyag vagy annak kötőfragmense, amely képes a humán tumor nekrózis béta faktor felismerésére is.

«·«· ·· «··« «» • · · « * · • · · · ··· • · « · · · »* ·» · ««
6. Az 1. igénypont szerinti monoklonális ellenanyag, amely F , Fab vagy F/ab’^ fragmenset képvisel.
7. Stabil hibridóma sejtvonal és annak utódjai, amelyek az 1-5. igénypontok szerinti monoklonális ellenanyagot kiválasztják.
8. 78-as hibridóma sejtvonal (ECACC ideiglenes katalógus száma 90110707) és annak utódai.
9. A 7. igénypont szerinti stabil hibridóma sejtvonal előállítására szolgáló eljárás, amely a halhatatlan sejtek és a humán TNFcK-val immunizált egérből származó sejtek fúzióját foglalja magában.
10. Az 1-5. igénypontok szerinti monoklonális ellenanyag vagy annak kötőfragmense, amely a 78-as hibridóma sejtvonalból nyerhető.
11. Gyógyszerkészítmény, amely hatóanyagként az 1-6. igénypontok szerinti monoklonális ellenanyagot vagy annak fragmensét tartalmazza, és egy gyógyászatilag elfogadható hordozó és/vagy hígító szert.
12. Az 1-6. és 10. igénypont szerinti monoklonális ellenanyagnak vagy ezen anyag kötőfragmensének használata profilaktikus és/vagy gyógyászati szerként olyan betegségek esetében, amelyekben a humán TNF<X és/vagy humán TNF/3 patogén hatást fejt ki.
13. Az 1-6. és 10. igénypont szerinti monoklonális ellenanyagnak vagy ezen anyag kötőfragmensének használata az antibakteriális vagy antineopláziás terápia mellékhatása megelőzésére vagy kezelésére.

9 <4 «··· ·· 4····· • · ·* ν · • · · · «·· • · · · · · ·· ·· Φ··
14. Az 1-6. és 10. igénypontok szerinti monoklonális ellenanyagból vagy annak kötőfragmenséből, és egy antibiotikus, antimikrobiális vagy antibakteriális szerből kettőt vagy többet tartalmazó keverékből álló termékek mint kombinált készítmények, egyidejű, különálló vagy egymást követő használatra az antimikrobiális és antibakteriális terápiában.
15. Az 1-6. és 10. igénypont szerinti monoklonális ellenanyagot vagy annak kötőfragmensét és egy tumorellenes szert tartalmazó termékek mint kombinált készítmények, egyidejű, különálló vagy egymást követő használatra a rákellenes terápiában.
16. Módszer humán TNFcK, tartalom kimutatására testfolyadék mintában, azzal jellemezve, hogy a mintát az 1-6. és

10. igénypont szerinti monoklonális ellenanyaggal vagy annak fragmensével reagáltatjuk.
17. Monoklonális antiidiotipikus ellenanyag, azzal jellemezve, hogy humán TNFX - és humán TNF/3-receptorokhoz kötődik.