CZ385791A3 - Monoclonal antibodies against human tumorous necrotic factor - Google Patents

Description

Monoklonální protilátky proti lidskému nádorovému nekrotickému faktoru

Oblast techniky

Tento vynález se týká monoklonální protilátky, která má vysokou neutralizační aktivitu na lidský nádorový nekrotický faktor α (TNP a) a také na lidský nádorový nekrotický faktor β (TNP β), hybridní buněčné linie, která produkuje tuto protilátku, a použití této monoklonální protilátky.

Dosavadní stav techniky

TNP a je polypeptid o molekulové hmotě 17 500, jehož primární a terciární struktura je objasněna (PennicaD. a spol·: Nátuře 312. 724 (1984) a Jones E.Y· a spol.: Nátuře 338. 225 (£989)·)· TNP a je biologicky aktivní jako trimer. Hlavním zdroil jem TNP a jsou buňky napojení monocyt/makrofág.Po příslušné stimulaci je však produkován také jinými typy buněk (například T-lymfocyty).

TNP β je polypeptid úzce související s TNP a. Obě molekuly vykazují 28% homologii na úrovni aminokyselin'(viz Pennioa D. a spol.: viz shora a Gray P. W. a spol.: Nature 312. 721 (1984)·)· Hlafním zdrojem TNP β jsou T-lyrafocyty.

TNP a byl původně popsán jako molekula, která indukuje hemoragickou nekrosu nádorů u myší. Avšak po tom, co se klonováním jeho cDNA stala dostupnými velká množství homogenního TNP a, brzy se tak stalo zřejmé, že TNP a zprostředkovává velkou část biologických účinností, které umožňují definovat TNP a jako mediátor zánětu. Obecně viz Beutler B. a Gerami A·: Nátuře 320, 584 (1986)·

TNP β zprostředkovává kvalitativně podobnou řadu biologických aktivit, ale s kvantitativními rozdíly, pokud jde o dávkování TNP a nebo β, jehož je potřeba k vyvolání jednotlivých popsaných biologických aktivit.

TNF α hraje, v rámci protizánětlivé odpovědi, vůdčí roli při obraně hostitele proti invazi organismu škodlivými činid? ly. Za jistých okolností, jako je chronická nebo akutní, systémová nebo lokální hyperprodukce, TNF α vede ve spojení s jinými mediátory zánětlivé odpovědi k četným patologickým stavům. Kachexie a septický šok jsou nejzávažnějšími příklady (viz: Beutler B. a Cerami A.: viz výše a Oliff A. a spol.:

Cell 50, 555 (1987).)· Podobně se o W α předpokládá, že hraje patogenní roli u AIDS (Folks T. M. á spol.j Proč. Nati. Acad. Sci. USA 86, 2365 (1989).), u chorobách typu transplan-’ tát versus hostitel (Piquet P. F. a spol.: J. Exp. Med. 166, 1280 (1987)·), při mozkové malarii (Grau G.E. a spol.í Sci-’ ehce 237» 1210 (1987).), při revmatické artritidě (Brennan F. M. a spol. s Lancét ii-. 244 (1989)·) a při některých dal-⁵ ších chorobných stavech.

účincích TNF β je toho známo mnohem méně. Avšak na záJ kládě té skutečnosti, Že in vitro vyvolává biologické aktivity podobné aktivitám TNF a, lze odvodit, že v případě hyper-? produkce může TNF β také přispívat k patogenesi některých chorobných stavů.

Z těchto výsledků lze odvodit, že protilátky proti TNF α a možná také protilátky proti TNF β by mohly být terapeuticky užitečné při těch chorobných stavech, při nichž tyto polypep3 tidy vykazují patogenní účinek.

Aby protiájítky byly terapeuticky užitečné proti TNF a, měly by být schopny neutralizovat toxické účinky TNF α in vi«5 vo. Polyklonální protilátky jsou snadno získatelné ze sera hyperimunizovaných živočichů. Tyto polyklonálnní protilátkové prostředky však nejsou optimální pro použití in vivo, protože:

- jsou směsí protilátek, která obsahuje protilátky, které neneutralizují TNF a,

- jsou směsí proti^ítek, která obsahuje protilátky, které mají různé afinifty ke stejnému epitopu a

- jsou obtížné standardizovatelné v pojmech potence vzhledem k mnoha rozdílům mezi nimi.

- 3 Technologie monoklonálních protilátek je tím, čím lze obejít tyto problémy. Umožňuje přípravu monoklonálních protilátek o reprodukovatelné specifičnosti a afinitě k TNP a jako proti každé imunogenní molekule in vitro, za kontrolovaných podmínek a v neomezených množstvích. Je zřejmé, že proti jednomu jedinému antigenu lze získat mnoho různých monoklonálních protilátek. Navzájem se odlišují v pojmech:

- tříd a podtříd protilátek,

- specifičnosti na epitop,

- vazebné afinity a

- neutralizační aktivity in vitro a in vivo.

Pro terapeutické použití je žádoucí používat monoklonáld ní protilátku proti TNP a a také proti jakémukoliv jinému antigenu, který má vysokou neutralizační aktivitu. To by umožnilo podávat nižší dávky monoklonální protilátky, který/by se získaly terapeuticky efektivní hladiny in vivo, čímž se zmírňují možné nežádoucí vedlejší efekty, které jsou způsobovány monoklonální protilátkou.

Podstata vynálezu

Z tohoto pohledu tento vynález poskytuje novou monoklonální protilátku nebo její vazebný fragment, který je schopen neutralizovat lidský TNP a. Protilátka podle tohoto vynálezu má vysokou TNP. a neutralizující schopnost jak in vitrotak in vivo. In vitro lidský TNP a vykazuje polovinu maximální bio-3 logické aktivity při asi 0,15 ng/ml (3,3.10^-12 M za předpoklad du, že TNP a je trimer). V přítomnosti 1 mikrogramu na mililitr (6,25.1Ο^-9 M) uvedené protilátky vykazuje lidský TNP a polovinu maximáií biologické účinnosti při asi 229 ng/ml (4,6.10*9 M; poměr poloviny maximální biologické aktivity v přítomnosti versus nepřítomnosti 1 ^ug/ml uvedené protilátJ ky je asi 1527). V přítomnosti 100 ng/ml (6,25.10^-10 M) uved děné protilátky lidský TNP a vykazuje polovinu maximální biologické aktivity při asi 26 ng/jpl (5,2.10^-10 Μ). V přítomnosd ti 10 ng/ml (6,25.10^-11 M)protilátky lidský TNP a vykazuje polovinu maximální biologické aktivity při 1,9 ng/ml (3,8.10^-11 M).

- 4 Monoklonální protilátka získaná podle tohoto vynálezu se vyznačuje tou skutečností, že neutralizuje in vitro trimerní lidský TNF α při poměru menším než 2:1, zvláště při poměru asi 1,3 : 1 (uváděno na molární bázi). Vedle toho uvedená monoklonální protilátka neutralizuje a tedy rozeznává také strukturně podobný polypeptid lidský TNF β.

Lidský TNF β vykazuje polovinu maximální biologické aktivity při asi 4 ng/ml (8.10“¹¹ M za předpokladu, že TNF β je trimer). V přítomnosti 1 ^ug/ml (6,25 .10*^ M) uvedené protilátky TNF β vykazuje polovinu maximální biologické aktivity při asi 25,6 ng/ml (5.10^-10 M) (poměr poloviny maximální biologické aktivity v přítomnosti versus nepřítomnosti 1 yug/ml uvedené protilátky je asi 6,3).

Druhým aspektem tohoto vynálezu je, že tento vynález ukazuje, že uvedená monoklonální protilátka je schopna srážet lidský TNF a, jak to bylo zjištěno dvojitou difusí na dvou rozměrech (Oucbterlonyho metoda). Třetím aspektem tohoto vyhálezu je, že tento vynález ukazuje, že nejmenší kpmplex antitigen - protilátka vytvořený po inkubaci uvedené monoklonálJ ní protilátky e lidským TNF aje komplex antigen - protilátJ ka o vysoké molekulové hmotě, který obsahuje v podstatě alespoň dvě molekuly uvedené monoklonální protilátky a alespoň jednu molekulu lidského TNF a, typicky tři molekuly monoklonální protilátky spojené spolu se dvěma molekulami lidského TNF a.

Pojem «komplex antigen-protilátka o vysoké molekulové hmotě” tak, jak je zde používán,' znamená komplex, antigenů s protilátkou o molekulové hmotě alespoň 400 000, typicky od asi 570 000 do asi 600 000.

Navíc protilátka poskytuje uplnou ochranu myší před jinak smrtelnou dávkou lidského TNF α při dávkách nižších než asi 1 /ug/ml, typicky v dávkách od asi 0,4 do asi 0,8 /Ug/myš

Je třeba poznamenat, že davka 0,4 /ug/myš odpovídá dávce asi

- 5 20 /ug/kg tělesné hmotnosti.

Tento vynález dále poskytuje stabilní hybridomovou buněčnou linii a její progen, která poskytuje takovou monoklonální protilátku.

Tento vynález rovněž poskytuje způsob přípravy také monoklonální protilátky.

Tento vynález také poskytuje farmaceutický prostředek, který obsahuje takovou monoklonální protilátku, která je schop-? na neutralizovat jak lidský TNF a tak lidský TNF β, spolu s farmaceuticky přijatelným nosičem a/nebo ředidlem.

Dalším aspektem tohoto vynálezu je také získání způsobu xdetekce obsahu lidského TNF a v tělesné kapalině.

Předmětem tohoto vynálezu je také získání antiidotypových protilátek, které rozeznávají lidské TNF aX a lidské TNF β-' recept o ry.

Monoklonální protilátky podle tohoto vynálezu mohou být jakoukoliv třídou imunoglobulinů, jako je například XgM, IgD, IgE, IgA nebo po třídou IgG. Monoklonální látky se mohou potu’ vat neporušené nebo jako vazebné fragmenty, jako je například F_y, Fab, F(ab)2·

Výhodnými monoklonálními protilátkami podle tohoto vynálezu jsou monoklonální protilátky třídy IgG. Zvláště výhodnými monoklonálními protilátkami podle tohoto vynálezu jsou ty monoklonální protilátky, které jsou produkovány hybridomovým. klonem 78, jak je zde popsáno, což je IgGýk isotyp.

Výhodnými vazebnými fragmenty monklonálních protiEtek podle tohoto vynálezu jsou F_y, Fab, F(ab')₂ fragmenty uvedených monoklonálních protilátek.

Jak bylo shora uvedeno, podle tohoto vynálezu se získává

- 6 způsob přípravy monoklonální protilátky podle tohoto vynálezu nebo jejích vazebných fragmentů. Tento způsob se vyznačuje tím, že obsahuje kultivaci hybridoraové buněčné linie nebo jejího progenu podle tohoto vynálezu a isolaci takto připravené monoklonální protilátky,

Monoklonální protilátky podle tohoto vynálezu nebo jejich fragmenty se mohou připravovat imortalizací lymfoc^tů B-buněk. Imortalizace lze dosáhnout transformací s ' onkogenním virem nebo napojením s již nesmrtelnou buněčnou linií (např. myelomovou nebo lymfoblastoidní buněčnou linií). Druhý z uvedených postupů, který byl původně popsán Koehlerem a Milsteinem (Koehler G„ a Milstein C.: Nátuře 256. 496 (1975).), poskytuj je nesmrtelné hybridní buněčné linie, které mají schopnost neomezeného růstu a neomezené produkce protilátky. Takto získané nesmrtelné hybridní buněčné linie se mohou klonovat a analyzovat (testovat) tak, aby se v buněčných supernatantech detegovaly protilátky proti žádanému antigenů. V literatuře je popsáno a odborníkům je známo velké množství analytických technik. Tyto techniky jednoznačně umožňují isolaci monoklonálních protilátek proti žádanému antigenů (žádaným antigenům). Jestliže však chce operátor isolovat monoklonální protilátku, která má přesné vlastnosti (tj. má vysokou nebo nízkou afinitu k antigenů, je neutralizující nebo není neutralizující), musí se použít takové analytické techniky, které by umožňovaly isolovat monoklonální protilátky se žádoucími vlastnostmi* Způsob těchto analýz je uspořádán podle toho, která vlastnost se hledá a podle antigenů, proti kterému chce operátor získat protilátky. Způsob analýz je obecně řečeno, nepředpověditelný a musí být. studován případ od případu. Tento stupeň má však rozhodující důležitost, jestliže chce operátor isolovat mo racionální protilátky o vysoké aktivitě.

Jakmile jsou jednou isolovány buněčné linie, které produkuji monoklonální protilátky se žádoucími vlastnostmi proti lidskému TNP a, pak se mohou, jestliže je to žádoucí, používat jako zdroj, genů kódujících monoklonální protilátky.

- 7 Tyto geny se mohou isolovat tak, že se připraví první banky cDNA z mRNA. Potom se isoluje jednotlivý klon cDNA, který kóduje imunoglobulin, a s ním se dále pracuje,, Konečným cílem těchto manipulací je obvykle (ale nikoliv pouze) generace protilátek o snížené imunogenicitě při podávání in vivo hostiteli, který je jiný než ten, od něhož byly původní protilátky odvozeny. Toho lze dosáhnout ligací nukleotidů odpovídajících různých oblastí genů původních druhů s nukleotidy odpovídajícími stálé oblasti genů těch druhů, jímž se protilátky podávají. Nukleotidy kódující oblasti původní monoklonální protilátky determinující komplementaritu mohou být substituovány nukleotidy různých oblastí genů protilátky těch druhů, jímž se protilátky podávají. A konečně, původní nebo modifikovaný cDNA klon se může isolovat a umístit do vhodného prokaryotického nebo eukaryotického expresního vektoru a následně transů fektovat do hostitele, v němž probíhá konečná produkce ve velkém měřítku.

Na připojených obrázcích je uvedeno následující:

Obrázek 1 ukazuje specifičnost monoklonální protilátky na lidský TNE a podle stanovení testem ELISA, kdy se měří residuální navázání na TNE a 100 ný/ml protilátky po inká/baci, s různými dávkami lidského TNE a nebo s různými dávkami ne-’ příbuzných antigenů.

Obrázek 2 ukazuje neutralizační aktivitu 1 (6,25.

« 10“9 M) monoklonální protilátky na různé dávky lidského TNE o.

Obrázek 3 ukazuje neutralizační aktivitu 1 yug/ml (6,25.

• 1O~⁹ M) monoklonální protilátky na různé dávky lidského TNE β.

Obrázek 4 ukazuje Sclftchardovu křivku vazby lidského TNF a na uvedenou mo racionální protilátku.

Obrázek 5 ukazuje disociaci lidského TNE a z mor^clonální protilátky podle tohoto vynálezu.

Obrázek 6 ukazuje Ouchterlonyho dvojnásobnou imunodifusi v agaru. Ve středním žlábku bylo přidáno 20 /Ug morSclonální protilátky. V horním levém, horním pravém, dolním levém a dolním pr^aém žlábku bylo přidáno 10 ^ug, 5 yUg, 1,25/Ug a 2,5 y-ug lidského TNE a.

- 8 Obrázek 7 ukazuje dělení podle velikostí rychlotlakou kapalinovou chromatografii (FPLC) 2.1Ο”⁶ M lidského TNP α samotného (______graf A), 6,25.1O“⁶ M uvedené monoklonální protilátky samotné (- graf A), směsi 2.10^-θ M lidského

TNF α s 2.10”7 M monoklonální protilátky (graf S) a směsi 10“^1θ M jodovaného lidského TNE α s 1,25.10^-11 M monoklonální protig$tky (graf C).

V připojených tabulkách jsou v tabulce I uvedeny parametry vazby lidského TNE α na monoklonální protilátku podle to-¹ hoto vynálezu. V tabulce II jsou uvedeny koncentrace lidského TNE a, které poskytují polovinu maximální biologické aktivity v nepřítomnosti nebo v přítomnosti různých koncentrací uvede-⁵ né monoklonální protilátky. V tabulce III je uveden vliv podávání různých dávek TNE α na přežití myší. V tabulce IV je uveden ochranný účinek monoklonální protilátky podle tohoto vynálezu u myší, jímž byly podány dvě smrt^ené dávky TNE a.

V tabulce V je uveden ochranný účinek monoklonální protilátky podle' tohoto vynálezu u myší, jímž byly v různých dobách před a po léčení podány dvě smrtelné dávky TNE a.

Pokud jde o charakterizaci hybridní buněčné linie uvedené v patentových nárocích, pojmy “permanentní (stálý)” a stabilní” znamenají životaschopnost po prodlouženou dobu, ty. picky alespoň po dobu asi 6 měsíců. Tento vynález rovněž umožňuje získání stabilní stálé hybridomové buněčné linie, která si zachovává schopnost produkce specifické mo racionální protilátky během alespoň 25 pasážování.

Pojem monoklonální protilátky” zde znamená protilátky, které jsou vybrány z protilátek, jejichž populace je v podstatě homogenní, tj. jednotlivci populace protilátek jsou i-¹ dentičtí až na přirozeně se vyskytující mutace.

Pojem protilátka” znamená, že zahrnuje j$k neporušené me lekuly tak také jejich fragmenty, jako je nap^&lad Ε , Eab a P(ab )₂, které jsou schopny vázat antigen. Fragmentům Fab a F(ab*)₂ chybí fragment Fc protilátky a mohou mít méně vazebné

- 9 ecifické tkán© než neporušená protilátka. Bude zřejmé, že je výhodné, že Ε_γ, Bab, P(ab')₂ a další fragmenty monoklonálni protilátky podle tohoto vynálezu se mohou používat stejně nesp jako neporušená monoklonálni protilátka pro stejné účely, např. pro detekci TNE α a pro léčení těch chorobných stavů, při nichž TNE α hraje škodlivou roli.

Pojem neutralizací je zde používán k označení schopnosti roztoků obsahujících protilátky blokovat biologické aktivity TNE α a TNE β in vitro a/nebo in vivo.

Pojem zvýšená nebo vysoká TNE α neutralizační aktivita, in vitro je zde používán pro označení schopnosti roztoku ob-’ sáhujícího monoklonálni protilátku neutralizovat lidský TNE α v poměru menším než 6 ! 1 (vztaženo na hmotnosti) a v poměru menším než 2:1 (vztaženo na moly) při dávkách monoklonálni protilátky menších než 10 ng/ml nebo 10 ng/ml. Pojem zvýšená nebo vysoká TNE α neutralizační aktivita in vivo je zde pou-2 žíván pro označení schopnosti roztoku, který obsahuje monoklonální protilátku, blokovat in vivo v dávkách menších nebo rovných 20 /Ug/kg tělesné hmotnosti schopnost TNE hrát škodlivou roli.

Monoklonálni prertilátka podle tohoto vynálezu je skutečně schopna poskytovat úplnou.ochranu myší před jinak smrtelnou dá^ou TNE α v dávkách nižších než 1 ^ug/myš, typicky od asi 0,4 do asi 0,8 /ug na myš. Je třeba poznamenat, že 0,4 ^ug na myš odpovídá asi 20 mikrogramům na kg tělesné hmotnosti.

Ve výhodném uspořádání podle tohoto vynálezu je taková monoklonálni protilátka utajena hybridomovou buněčnou linií, která se připraví využitím buněk nesmrtelné buněčné linie a buněk odvozených od myší, které byly imunizovány lidským rekombinantním TNE a.

Nesmrtelná buněčná linie je taková linie, která se pro praktické účely může uchovávat nepřetržitě v buněčné kultuře.

Jinak řečeno, tato linie je stabilní a permanentní a po spojení

- IQ s buňkami, které nevykazují tyto vlastnosti, je schopna udělit tyto vlastnosti napojenému produktu.

Může se použít jakákoliv nesmrt^/ená buněčná linie. Typicky se používá plasmocystom (myelom) savčího původu. Výhodným typem buněčné linie je myší plasmocytom deficitní na hypoxanthin-fosforibosyl-transferasu (HPRT).Jedna taková buněčná linie je zvláště výhodná. Touto buněčnou linií je buněčná liJ nie NSO, dobře známý plasmacytom deficitní na HPRT původu BALB/c, který neprodukuje ani nesekretuje ani imunoglobulin ani těžké nebo lehké řetězce imunoglobulinu (Clark M.R. a Milstein C.: Somatic Cell Genet. 2» 657 (1981).).

Nesmrtcené buňky jsou spojeny s buňkami, z nichž alespoň některé produkují protilátky, které se vážou specificky na lidský TNP a.

Buňky, které produkují protilátky, se obvykle získávají z myší imunizovaných na lidský TNP a. Pro tento účel se může, používat komerčně dostupný lidský TUP a. Po napojeni.se napojené produkty testují na sekreci žádaných monoklonálních protilátek. In vitro ®e nejdříve testují v ELISA testu, kde se detegují protilátky na TNP a. Potom se testují na svoji schopnost neutralizovat cytostatickou aktivitu lidského TNP a na myších buňkách LM. Progeny klonů, které produkují žádoucí monoklonální protilátky, se pak mohou nechat růst in vitro ve vhodném kultivačním mediu v baňkách s tkáňovou kulturou nebo se kultivují v kultivačních zařízeních pro kultivaci ve velkém měřítku (např. Acusyst Endotronics, Coon Rapids, Minesota, USA) nebo in vivo jako sscitický nádor v laboratorních zvířatech (např. v myších nebo v krysách).

Jestliže je to žádoucí, může se protilátka oddělit z kultivačního prostředí nebo z tělové kapaliny, případ od případu, takovými způsoby, jako je například srážení síranem amonným, ohromatografií na iontoměniči, vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií nebo jinými způsoby známými odborníkům. Podle tohoto vynálezu se tedy získávají monoklonální protilátky s vysokou neutralizační aktivitou na TNE cc a s neutralizační aktivitou také na TNF β, vyznačující se tím, že:

a) jejich populace je v podstatě homogenní,

b) jsou produkovány nesmrtelnými buňkami, které samy jsou hybridy nesmrtelné buněčné linie a buněk, které produkují protilátky,

c) vitro i

d) vykazují zvýšenou neutralizační aktivitu na TNE α in in vivo, jsou schopny neutralizovat a tedy rozeznávat lidský

TNF β,

e) srážejí lidský TNF α a

f.) s lidským TNF α vytvářejí v roztoku komplexy, při čemž nejmenší z těchto komplexů obsahují v podstatě alespoň dvě molekuly monoklonální protilátky a mají molekulovou hmotu typicky alespoň 400 000.

Působením jejich neutralizační aktivity na TNF α a TNF β se mohou monoklonální protilátky podle tohoto vynálezu použíJ vat u savců, včetně lidí pro profylaktická a/nebo terapeuticJ ké účely v jakémkoliv stavu onemocnění, o němž je známo, že TNF α a/nebo TNF β v takovém případě mají patogenní účinek. , Takovými chorobánými stavy jsou kachexie, septický šok, choroby pocházející od vztahu transplantát versus hostitel, AIDS, mozková malarie, reumatická artritida, chronická a akutní zánětlivá onemocnění, myokardiální ischemie, respektive další choroby, o nichž je známo nebo o nichž bude v budoucnu známo, že TNF α a/nebo TNF β hrajtí v těchto případech škodlivou úlolohu. Hladiny dávkování (které jsou vhodné pro lokální nebo systémová podávání dospělým lidem) monoklonální p^tilátky podle tohoto vynálezu, například těch monoklonálních protilátek, které jsou produkovány hybridomovým klonem 78, se mohou pohybovat v rozmění od asi 20 ^ug do asi 1 mg protilátky na kg tělesné hmotnosti. V rámci těchto dávek lze prostředky podávat bučí jako jedinou dávku .nebo rozděleně jako více dávek, což závisí na rozhodnutí ošetřujícího lékaře. V každém případ dě by však farmaceutický prostředky měly pacientovi dodávat tolik protilátky, aby toto množství bylo efektivní pro léče12 ní pacienta nebo aby bylo pro pacienta efektivní z hlediska pro fylak t ického.

Monoklonální protilátka podle tohoto vynálezu se může formulovat buá. samotná nebo spolu s jinými farmaceuticky účinnými činidly ve farmaceutických prostředcích tak, že tyto prostředky obsahují příslušná množství monoklonální protilátky společně s farmaceuticky přijatelným nosičem a/nebo ředidlem.

Monoklonální přtilátka podle tohoto vynálezu se může podávat kombinovaným způsobem léčení společně s jiným farmaceuticky účinným činidlem. Farmaceuticky účinnými Činidly , která mohou být formulována společně s monoklonálními protilátkami podle tohoto vynálezu nebo se mohou podávat také kombinoval ným způsobem léčení, mohou být například protilátky, zvláště monoklonální protilátky, proti jiným antigenům. Získá se tak kokteil” obsahující monoklonální protilátku a jednu nebo více (monoklonálních) protilátek proti jiným antigenům, které jsou zahrnuty v patogenesi stavu příslušné choroby.

Další aktivní činidla, která se mohou formulovat s monoklonálními protilátkami podle tohoto vynálezu nebo se také mohou podávat kombinovaným způsobem léčení, zvláště proto, aby se dosáhlo terapeuticky užitečného“efektu,’závisí na stavu cho----------roby, která má být léčena. Těmito činidly jsou například, ko-¹ merčně dostupné gamaglobulinové a imunoglobulinové produkty, antibiotika, protimikrobiální produkty, protibakteriální a protinádorová činidla nebo směsi dvou nebo více těchto činidel.

*

Monoklonální protilátky podle tohoto vynálezu se dále mohou používat buú samotné nebo při kombinovaném způsobu podávaní spolu s protibakteriálními a zvláště protinádorovými činidly, čímž se zabrání nebo zlepší jejich vedlejší účinky. Typickými vedlejšími účinky, které mohou takto léčeny, jsou například kachexie, nauzea, zvracení, anorexie (nechutenství), alcpecie, průjem a neutropenie. Mezi typická protimikrobiální činidla lze zahrnout penicilín ve spojení s aminoglykosidem

- 13 V . V / I v 3 ak Ό o u 2 i t sporiny.

(například gentamycin, tobramycin). Mohou se některá další známá činidla, například cefalo

Pojem ”protinádorová činidla” v s%e obsahuje jak jednotlivé protinádorové léky tak kokteily”, tj. směs takových leků, podle toho, co vyžaduje klinická praxe. Protinádorovými činidly, která se formulují ze sloučenin podle tohoto vynálezu nebo se mohou podávat také kombinovaným způsobem léčení, jsou například doxorubici^ daunomycin, epirubicin, idarubicin, etoposid, flurouracil, raefalan (mephalan), cyklofosfamid, bleomycin. vinblastin a mitomycin nebo směsi dvou nebo více těchto láteko

Pojem ”kombinovaný způsob” léčení znamená to, že tento způsob zahrnuje jak oddělené tak v podstatě současné podává-’ ní farmaceutického prostředku obsahujícího monoklonální protilátku podle tohoto vynálezu a farmaceutický prostředek obsahující jiné farmaceuticky aktivní činidla.

Výhodným způsobem podle tohoto vynálezu je kombinovaný způsob léčení rakoviny savců, včetně lidí, u nkhž existuje potřeba takového léčení, při čemž uvedený způsob zahrnuje podávání: 1)monoklonální protilátky podle tohoto vynálezu nebo jejího fragmentu a

2)protinádorového činidla v takových množstvích a v čase dostatečně blízkém podávání monoklonální protilátky podle ad 1), aby se získal terapeuticky užitečný efekt. ·

Předmětem tohoto vynálezu je také získání produktů, kte^ ré obsahují monoklonální protilátky podle tohoto vynálezu nebo jejich vazebný fragment a protinádorové činidlo jako kombinovaný prostředek pro současné, oddělené nebo postupné použití při protirakovínové terapii. Monoklonální protilátky podle tohoto vynálezu a jejich vazebné fragmenty se tedy mohou pou-’ žívat při léčení ke zlepšení rakovinových chorob. Mohou se podávat pacientovi, který trpí rakovinou léčitelnou protinádorovým činidlem, jako je například antracyklinový glykosid, napři- 14 klad doxorubicin, daunomycin, epirubicin nebo idarubicin jak shora uvedeno. Protilátka podle tohoto vynálezu a protinádorové činidlo, jako je například antracyklinový glykosid, se mohou podávat pro zlepšení stavu pacienta s leukémií, jako je například myťjéblastická leukemie, lymfomem, sarkomem, neuroblastonem, Wilmovým nádorem nebo maligním nádorem žlučníku, prsu, plic nebo štítné žlázy.

Navíc, vysoká neutralizační aktivita protilátky podle tohoto vynálezu, jak je to ukázáno na obrázku 2, předpokládá, že uvedená protilátka rozeznává epitop blízko místa nebo přímo v místě vazby receptoru lidského TNF a. Byly charakter! z o-í vány dva TNF α receptory (Schali T. J. a spol.: Cell 61, 361 (1990) a Smith C. A. a-spol.: Spcience 248. 1019 (1990).)· Oba receptdry vážou lidský TNF α a lidský TNF β s téměř stejnou afinitou pokud jde o celé buňky. Rozpustné formy těchto dvou receptorů však vážou lidský TNF β s mnohem nižší afinitou než lidský TNF α (Seckinger P. a spol.: J. Biol. Chem. 264, 11966 (1989) a EnVgelmann H. a spol.: J. Biol. Chem. 265. 1531 (1990)·). Tento výsledek ukazuje, že rozpustnost extracelu-* lární domény receptorů indukuje změnu v relativních afinitách pro lidský TNF α a lidský TNF β. Jestliže monoklonální proti-¹ látka podle tohoto vynálezu rozeznává epitop v místě vazby receptoru lidského TNF a, potom by se měl funkčně chovat jako receptor TNF a, tj. měl by rozeznávat jak lidský TNF α tak i lidsky TNF β. Jelikož uvedena monoklonální protilátka je rozpustná molekula, měla se funkčně chovat jako rozpustný TNF α receptor, tj. měla by vázat lidský TNF α s mnohem vyšší afinitou než lidský TNF β. Obrázek 3 ukazuje, že. tomu tak skutečně je.

Poměr poloviční maximální biologické, aktivity pro lidský TNF β v přítomnosti versus nepřítomnosti 1 ^ug / ml uvedené ^potilátky je 6,3. Z toho lze předpokládat, že uvedená monoklonální protilátka se váže na lidský TNF α a na lidslj TNF β podobně jako rozpustný TNF α receptor. Je tedy ideálně vhodná pro použití jako imunogen pro získání (podle standardních způsobů dobré známých odborníkům, viz například ”Anti—idiotypes, recep— tors and molecular mimicry, Linthicum D.S. a Farid N.R., red., Springer-Verlag, Heidelberg, 1988. ) antiidiotypových proti15 protiá/Ltek, které se vážou na monoklonální protilátku podle tohoto vynálezu podobné jako lidský TNF a. Tyto monoklonální antiiáiotypové protilátky, které jsou schopny vázaťna TNF a-receptory podobně jako TNF a a následné mimikovat (napodobovat) biologické aktivity TNF a, mohou být terapeuticky užitečné u těch chorob, při nichž podávání TNF a pravděpodobně hraje příznivou roli. Těmito chorobenými stavy je například rakovina, při níž antiidiotypové protilátky podle tohoto vynálezu se, podobně jako TNF a, mohou podávat buď samotné nebo, a to s výhodou, jako část kombinovaného způsobu léčení (Mule J. J. a spol.: J. Exp. Med. 171, 629 (1990).), a některé autoimunní choroby (Jacob 0. J. a McDevitt H.O.: Nátuře 331, 356 (1988).).

Monoklonální protilátky a farmaceutické prostředky podle tohoto vynálezu se mohou parenterálně podávat subkutánne, intramuskulárně, intraarteriálně. nebo intravenosně. FanmaceuticA ké prostředky, které obsahují monoklonální protilátky podle tohoto vynálezu, se obvykle připravují podle následujícíh konvenčních způsobů.

Mezi nosiče a/nebo ředidla pro farmaceutické prostředky podle tohoto vynálezu patří alkoholické/vodné roztoky, emulse nebo suspense včetně solných nebo pufrovaných systémů. Mezi parenterální ředidla (vehikula) patří roztok chloridu sodného, Ringerova dextrosa, dextrosa s chloridem sodným a Ringerovy nebo nemísitelné oleje. Mezi intravenosní ředidla patří kapalné a živné doplňující roztoky, elektrolytové doplňující roztoky, jako jsou například ty, které jsou odvozeny od Ringerovy dextrosy apod. Mohou být přítomna také ochranná činidla a další přísady, jako jsou například protimikrobiální činidla, antioxidanty, chelatační činidla, inertní plyny apod. Obecně viz Remingtonů Pharmaceutical Sciences, 16. vydání, Mack (red. ), 1980.

U chorobných stavů, při nichž TNF a vykazuje patogenní efekt, stoupají hladiny TNF a v tělových kapalinách ve srovnání s hladinami TNF a ve stejných kapalinách zdravých jedinců.

- 16 Stanovení hladin TNF tedy diagnostickou a α v těchto tělových kapalinách může mít prognostickou cenu.

Dalším aspektem tohoto vynálezu je získání imunoanalýz, pro něž jsou zvláště výhodné biologické vlastnosti monoklonálních protilátek podle tohoto vynálezu. Pro účely podle tohoto vynálezu může být v biologických kapalinách nebo tkáních přítomen lidský TNF a, který se deteguje monoklonálními protilátkami podle tohoto vynálezu. Lze použít jakýkoliv vzorek získaný z jedince, který obsahuje neznámé množství TNF a. Normálně je tímto vzorkem kapalina, jako je například krev, sérum, plasma a podobné kapaliny.

Monoklonální protilátky podle tohoto vynálezu jsou zvlá-⁽ ště vhodné pro použití v imunoanalýzách, při nichž se mohou používat v kapalné fázi nebo mohou být vázány na nosič v pevné fázi. Monoklonální protilátka pro tyto imunoanalýzy může být také různými způsoby detegovatelně označena.

Existuje mnoho nosičů, na něž se monoklonální protilátka podle tohoto vynálezu může navázat a které se mohou používat pro detegování přítomnosti lidského TNF a. Mezi dobře známé nosiče patří sklo, polystyren, polypropylen, polyethylen, dex-’ tran, nylon, amylasy, přírodní a modifikované celulosy, polyakrylamidy, agarosy a magnetit. Nosič může být svojí povahou pro účely tohoto vynálezu buď do jistého stupně rozpustný nebo může být nerozpustný. Odborníci znají mnoho jiných vhod-¹ ných nosičů pro navázání monoklonální protilátky nebo si je mohou zjistit a nalézt běžným experimentováním.

Existuje mnoho různých .značení a způsobů označování známých odborníkům. Mezi příklady značeni, které se mohou používat podle tohoto vynálezu, patří, ale nejsou na ně omezeny, enzymy, radioisotopy, fluorescenční činidla, chemiluminiscenČní činidla, bioluminiscenční sloučeniny a cheláty kovů. Odborníci znají jiná vhodná značení pro navázání na monoklonální protilátky podle tohoto vynálezu nebo si je mohou nalézt běžným experimentováním. Navázání tohoto značení (markéru) na monoklo17 nální orotilátku se prová horníkům.

standardními způsoby známými od.

Jedním ze způsobů, jimiž lze monoklonálni protilátku podle tohoto vynálezu detegovatelně označit, je navázání této monoklonálni protilátky na enzym. Takový enzym, když je později vystaven působení substrátu, reaguje se substrátem tak, že vznikne chemické seskupení, které je možno detegovat například spektrofotometričky nebo fluorometričky. Mezi příkla-¹ dy enzymů, které se mohou používat pro detegovatelně označení monoklonálních protilátek podle tohoto vynálezu patří malát-dehydrogenasa, stafylokoková nukleasa, delta-5-steroilní isomerasa, kvasinková alkohol-dehydrogenasa, alfa-glycerolfosfát-dehydrogenasa, triosofosfát-isomerasa, křenová peroxidasa, alkalická fosfatasa, asparaginasa, glukoso-oxidasa, beta-galaktosidasa, ribonukleasa, ureasa, kaíasa, glukoso-VI-fosfát-’ -dehydrogenasa, glukoamylasa a acetylcholinesterasa.

Monoklonálni protilátka podle tohoto vynálezu se může označit také radioaktivním isotopem, který se pak může detegovat takovými prostředky, jako je například gamapočítač nebo scintilační počítač. Zvláště užitečnými isotopy pro účely podle tohoto vynálezu jsou: ^H, ^²P, 35_s 14_c> ⁵¹Cr, ³⁶C1, ⁵⁷Co, ⁵⁸Co,⁵⁹Pe, respektive ⁷⁵Se. Monoklonálni protilátku je možné označovat také fluorescenční sloučeninou. Jestliže se fluorescenčně označená monoklonálni protilátka vystaví působení světla, příslušné vlnové délky, je možno stanovit její přítomnost, a to na základě fluorescence. Mezi nej častěji používané fluorescenční značkovací sloučeniny patří isothiokyanát fluoresceinu, rodamin, fykoerythrin, fykokyanin, allofykokyanin, oftalaldehyd a fluoreskamin.

Monoklonálni protilátku podle tohoto vynálezu je možné detegovatelně značit také kovy, které emitují fluorescenci, jako je například _ne^₀ kovy serie lanthanidů. Tyto kovy mohou být napojeny na molekulu protilátky pomocí takových chelatačnich skupin, jako je například diethylentriaminopentaoctová kyselina (DTPA) nebo ethylendiaminotetraoctová kyselina (EDTA).

- 18 Monoklonální protilátka podle tohoto vynálezu se může detegovatelně označit také její kondenzaci s chemiluminscen— ční sloučeninou. Přítomnost chemiluminiscenčně značené monoklonální protilátky se pak stanoví tak, že se deteguje přítomnost luminiscence ke které během chemické reakce dochází. Mezi oříklady zvláště užitečných chemiluminiscenčních značkovacích (markerových) činidel patří luminol, isoluminol, akridinový ester, imidazol, akridinová sůl a ester kyseliny síave lové.

Podobně se k označování monoklonální protilátky podle tohoto vynálezu mohou používat bioluminiscenční činidla. Bioluminiscence je jedním z typů chemiluminiscence nalézající se v biologických systémech, ve kterých katalytický protein zvyšuje účinnost chemiluminiscenční reakce. Přítomnost biolumini scenční monoklonální protilátky se stanovuje čLetegováním přítomnosti luminiscence. Důležitými bioluminscenčními sloučeni-¹ námi pro označování monoklonách protilátek jsou luciferin, luciferasa a akvorin.

Jiná technika, která také může vést k větší citlivosti, jestliže se používá v souvislosti s tímto vynálezem, spočívá v kondenzaci monoklonální protilátky podle tohoto vynálezu s hapteny o nízké molekulové hmotě. Tyto hapteny lze pak specificky detegovat prostřednictvím druhé reakcej obvykle lze například používat takové hapteny jako jsou biotin (reaguje s avidinem) nebo dinitrofenyl, pyridoxal a fluoreskamin (reagující se specifickými anti-haptenovými protilátkami).

Monoklonální protilátky podle tohoto vynálezu jsou ideálně vhodné pro přípravu sestav (kitů). Taková sestava může obsahovat nosné prostředky, které jsou sestaveny tak, že obsahuji jeden nebo více kontejnerových prostředků, jako jsou například baničky, zkumavky a podobné, každý kontejnerový pro· středek obsahuje oddělené prvky imunoanalýzy. Podobná sestava se může připravit tak, že obsahuje nosné prostředky obsahující oddělené prvky, které jsou vhodné pro terapeutické použití podle tohoto vynálezu.

- 19 Existuje mnoho zahrnovat do sestav ene lze používat nebo některých imunoanalýz typů imunoanalýz, kt Typickými příklady které mohou používat protilátky podle tohoto vynálezu, jsou kompetitivní analýzy a imunometrické nebo sendvičové imunoanalýzy. Pod pojmem imunometrická analýza” nebo sendvičová imunoanalýza” jsou zde míněny simultánní sendvičové, postupné sendvičové a reversní sendvičové imunoanalýzy. Tyto pojmy jsou dobře srozumitelné odborníkům,. Odborníci rovněž ocení to, že monoklonální protilátka podle tohoto vynálezu se může používat v jiných variacích a formách imunoanalýz než v těch, které jsou dnes známy, nebo těch, které mohou být vyvinuty v budoucnu. Tomu je třeba rozumět tak, že všechny tyto variace a formy jsou zahrnuty v rozsahu tohoto vynálezu.

V postupné (forward)sendvičové imunoanalýze se vzorek nej dříve inkubuje s imunoabsorbentem v pevné fázi, který obsahuje monoklonální protilátku proti lidskému TNF a. Inkubace se nechá probíhat po dobu, která je dostatečně dlouhá pro to, aby umožnila antigenů ve vzorku navázat se na imobilizovanou proJ tilátku v pevné fázi. Po první inkubaci se imunoabsorbent v pevné fázi oddělí z inkubační směsi. Promyje se tak, aby se od stranil nadbytek antigenů a další interferující látky, jako jsou například nespecifické vazebné proteiny, které mohou být ve vzorku přítomny. Imunoabsorbent v pevné fázi obsahující . lidský TNF a na imobilizované protilátce se potom inkubuje po druhé rozpustnou označenou protilátkou (rozpustnými označenými protilátkami)₀ Po druhé inkubaci se dalším promýváním odstraní nenavázaná označená protilátka (nenavázané označené proti2 látky). Označená protilátka (označené protilátky) navázaná (navázané) na imunoabsorbent v pevné fázi se potom deteguje (ietegují). Detegované množství navázané protilátky slouží jako jako přímá míra množství antigenů přítomného v původním vzorku. Nebo se také může detegovat označená protilátka, která není asociována s komplexem imunoabsorbentu. V tomto případě změřená hodnota je nepřímo úměrná množství antigenů přítomného ve vzorku. Postupná sendvičová analýza je popsána: například v USA patentech č. 3 867/4 4 012 294 a 4 376 110.

- 20 Podrobnější postup provádění imunometrických analýz obsahuje následující stupen:

a) nejdříve se vytvoří směs vzorku s protilátkou navázanou na pevnou fázi, tato směs se inkubuje po takovou dobu a za takových podmínek, které postačují k tomu, aby se antigen ve vzor, ku mohl navázat na protilátku navázanou na pevnou fázi,

b) po uvedeném inkubačním stupni ad a) se k této směsi při dá detegovatelně označená protilátka nebo protilátky, tato nová směs se inkubuje po takovou dobu a za takových podmínek, které postačují k tomu, aby se označená protilátka navázala na imunoabsorbent v pevné fázi,

c) po inkubaci podle stupně ad b) se oddělí imunoabsorbent v pevné fázi od směsi a

d) deteguje se bud označená protilátka nebo označené protilátky navázaná (navázané) na imunoabsorbent v pevné fázi nebo se deteguje označená protilátka nenavázaná na imunoabsorbent v pevné fázi.

Při reversní sendvičové analýze se vzorek nejdříve inkubuje s označenou protilátkou, potom se přidá imunoabsorbent v pevné fázi obsahující více imobilizovaných protilátek a provede se druhá inkubace_o Počáteční stupen promývání při rever sní sendvičové analýze není potřeba, i když promývání se po druhé inkubaci provádí.'Reversní sendvičová analýza byla popsá-¹ na například v USA patentech č„ 4 098 876 a 4 378 110.

Podrobnější postup provádění reversních imunometrických analýz obsahuje následující stupně!

a) nejdříve se vytvoří směs vzorku s rozpustnou detegovatelně označenou protilátkou po takovou dobu a za takových podmínek, ktere postačují k tomu, aby se antigen ve vzorku mohl navázat na protilátku, která je označena,

b) po uvedeném inkubačním stupni ad a) se k této směsi při. dají protilátky navazane na pevnou fázi, nová výsledná směs se inkubuje po takovou dobu a za takových podmínek, které postasuji k tomu, aby se antigen navazaný na označenou protilátku navázal na protilátky v pevné fázi,

c) po inkubaci podle stupně ad b) se od inkubační směsi oddělí imunoabsorbent v pevné fázi a

- 21 d) dsteguje se buá označená protilátka navázaná na imunoabsorbent v pevné fázi nebo se deleguje protilátka nenavázaná na imunoabsorbent v pevné fázi.

Při simultánní sendvičové analýze se vzorek, imunoabsorbent nesoucí více imobilizovaných protilátek a označená rozpustná protilátka nebo označené rozpustné protilátky inkubují současně v jednom inkubačním stupni. Simultánní analýza vyv zaduje pouze jedinou inkubaci a chybí ji promývací stupen. Používání simultánní analýzy je zdaleka nejvýhodnějším způsobem. Tento typ analýzy s sebou nese snadnost zacházení, homogeni čnost, reprodukovatelnost a linearitu analýz a vysokou preciznost. Vzorek, který obsahuje antigen, imunoabsorbent v pevné fázi s imobilizovánými protilátkami a označenou rozpustnou protilátku nebo označené rozpustné protilátky, se inkubuje (inkubují) po takovou dobu a ta takových podmínek, které postačují k tomu,aby se antigen navázal na imobilizované protilátky a na rozpustnou protilátku. Obecně je žádoucí, aby iriku-í bační podmínky byly takové, aby se navázalo co nejvíce antiJ genu, nebol se tím maximalizuje navázaní protilátky na pevnou fázi a tím se zvyšuje signál. Typickými podmínkami, pokud .jde o dobu a teplotu, jsou dvě hodiny při asi 45 °C nebo dvanáct hodin při teplotě asi 37 °C.

Antigen se typicky vážena označenou protilátku rychleji než na imobiúzovanou protilátku, protože první z nich je v roztoku, zatímco druhá je navázána na nosič v pevné fázi. Díky tomu se značená protilátka může používat v nižší koncentraci než imobilizovaná protilátka. Je tedy také výhodné používat pro označenou protilátku vysokou specifickou aktivitu. Například označená protilátka podle tohoto vynálezu se může používat v koncentraci asi 1 až 50 ng/na analýzu, zatímco imobilizovaná protilátka může mít koncentraci 10 až 500 ng/na analýzu na protilátku. Jestliže jde o radiooznačenou protilátku, pak nrotilátka muže mít specifickou aktivitu například jeden radioaktivní atom jodu na molekulu nebo dva nebo více radioaktivních atomů jodu na molekulu protilátky.

Podrobněji je provádění simultánní imunometrieké analýzy ukázáno na vzorku obsahujícím vícevazný antigen na postupu, který sestává z následujících stupňů:

a) současně se vytvoří směs, která obsahuje vzorek spolu s protilátkou navázanou na pevnou fázi a rozpustnou označenou protilátku nebo protilátky,

b) směs, která se vytvoří ve stupni ad a) se inkubuje po takovou dobu a za takových podmínek, které postačují k tomu, aby se antigen ve vzorku navázal jak na imobilizované tak i na značené protilátky,

c) z inkubační směsi se po inkubaci odstraní imunoabsorJ bent v pevné fázi a

d) deteguje se buň označená protilátka navázaná na imunoabsorbent v pevné fázi nebo se deteguje označená protilátka ne-¹ asociovaná s imůnoabsorbentem v pevné fázi.

Specifická koncentrace značených a imobilizovaných protilátek, teplota a doba inkubace a také další podmínky analýzy se mohou měnit v závislosti na různých faktorech, včetně koncentrace antigenu vzorku, povahy vzorku a podobných vlastností. Odborníci budou schopni uřčit operativní a optimáti podmínky analýzy pro každé stanovení na základě běžných experimentů. Po inkubaci se imunoabsorbent v pevné fázi odstraní z inkubačn£ směsi. To se provádí známými separačními technikami, jako jsou například sedimentace a odstřelování. Detekce se provádí scintilačním počítačem. Například, jestliže je markér radioaktivvím gama-zářičera. Nebo se detekce provádí fluorometrem, jestliže je markér fluorescenčním materiálem. V případě značení enzymem se detekce může provádět kolorimetrickými způsoby, které používají substrát pro enzym.

Další stupně, jako je například promývání, míchání, třepaní, filtrováni a podobné operace mohou být ovšem k analý— zám přidány, pokud je to zvykem nebo nutností pro tu kterou situaci.

Existuje mnoho imunoabsorbenťů v pevné fázi, které se mohou používat a které byly použity v tomto vynálezu. Mezi dobře známé imunoabsorbenty patří perličky tvořené sklem, póly23 styrenem, polypropylenem, dextranem, nylonem a dalšími materiály a trubičky tvořené takovými materiály, jako jsou popsány výše nebo těmito materiály potažené a pod. Imobilizované protilátky mohou být na imunoabsorbent v pevné fázi vázány buď kovalentní nebo fyzikální vazbou způsoby, jako je například kovalentní vazba a to amidovou nebo esterovou vazbou nebo absorpcí. Odborníci znají mnoho jiných vhodných imunoabsorbentů v pevné fázi a způsobů iraobilizace protilátek na těchto imunoabsorbentech v pevné fázi nebo budou schopni pouhým rutinním exp-eř* imentováním tyto materiály vybrat.

Různé aspekty totoho vynálezu jsou dále popsány následujícími příklady. Tyto příklady nezamýšlejí žádným způsobem omezovat tento vynález.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Imunizace myší lidským TRP α

Lidský TRP α (Esquire Chemie AG, Zurich, Švýcarsko) zředěJ ný ve fosforečnanem pufrovaném solném roztoku (PBS)doplneném úplným ^reundovým adjuvantem (CPA, Difco, Detroit, Michigan,

500 yul na 500 /Ul PBS) se podá do zadní tlaky pěti myší BALB/c, v dávce 30 /ug/mys. Po 14 dnech od první imunizace se subkutánně stejným myším v dávce 30 /Ug/myš podá lidský TRP α zředěný PBS doplněným o CPA jak shora uvedeno. Po 14 dnech od druhé imunizace se intraperitoneálně stejným myším v dávce 30 yug/myš podá lidsky TRP α zredený PBS_O Po 14 dnech od třetí imunizace se intraperitoneálně stejným myším v dávce 30 /ug/myš podá lidský TRP α zředěný PBS jako při třetí imunizaci. Po třech dnech byly usmrceny ty myši, které měly v seru nejvyšší titr anti TRP α protilátek podle stanovení testem ELISA.

Příklad 2

Imortalizace myších slezinových buněk produkujících anti-TRP α protilátky

Slezina se asepticky odstraní, zhomogenizuje se a výsledná susoense buněk se odstredujeo V© stejne dob© s© odstreďuji také myelomové buňky NSO (více než 99 % živých buněk). Oboje pelety se potom resuspendují v úplném RPMI mediu. Úplným RPMI. mediem je RPMI 1640 (Plow, Opera, Itálie) doplněné ImM pyrohroznanem sodným (Gibco, Paisley, Skotsko), neesenciálními aminokyselinami (Gibco), 100 yUg/ml střeptomycinu, 1,5 /Ug/ral amfotericinu B a dalším glutaminem (2 mM). Obě suspense buněk se spojí v poměru 10 : 1 (buňky sleziny : myelomové buňky).. Výsledná směs- buněk se odstřeďuje 10 minut při 400 x g. Me-. dium se odstraní. Opatrně se během minuty přikape 1 ml polyethylenglykolu (PEG 1500, Serva, Heidelberg, NSR, 40 % (hmotnostní díly k objemovým dílům) v úplném RPMI mediu), aby se umožnilo napojení. Během pěti minut se pak přidá 5 ml úplného RPMI media, potom dalších 10 ml opět během 5 minut a nakonec ještě 15 ml během opět pěti minut. Konečná suspense se odstřeďuje deset minut při 400 x g. Peleta se resuspenduje v úplném RPMI mediu doplněném 20 % plodového telecího sera (PCS, Plow, inaktivované teplem při 56 °C po dobu třiceti minut), takže konečná hustota buněk byla 5*10^ buněk/ml (buJÍky sleziny + + buňky kjQ), Do každé jamky desek pro tkáňové kultury o 96 jamkách se dá 200 /ul této suspense (Palcon č. 3072, Becton Dickinson, Milano, Itálie), při čemž však už v těchto jamkách předem byly ozářené myší peritoneální buňky (3000 Rad, 2,5.

.10 buněk na jamku). Desky, které obsahují napojené produkty, se pak inkubují 24 hodin při 37 °C v atmosféře s 5 $ oxidu uhličitého. Potom se přidá 50 ,ul úplného RPMI media doplněného 20 % PCS a hypoxanthinem, amimpterinem a thymidinem (HAT, konečné koncentrace na desce: 10 ^M, 4.10“?M a 1,6.10^-¾). V tomto kultivačním mediu mohou přežít pouze hybridomy, nebo? buňky NSO jsou zabíjeny v přítomnosti aminppterinu a nenapojené slezinné buňky mají omezenou dobu života.

Desky se pak dále inkubují při 37 °C s 5 % oxidu uhličitého. Kultury dostaly každý druhý den čerstvé medium. Rostoucí hybridy jsou viditelné čtvrtý den. Aminppterin se z media odstraní po třech týdnech. Od počátku pátého týdne se používá úplné RPMI medium doplněné o 20 % PCS.

o deseti kultury testují analýzou rodukci protilátek vážících se ns lidsky TNP α a na produkci protilátek neutralizjících některé biologické aktivity lidského TNP a. Supernatanty se typicky, z důvodu snadnosti, testují na svoji schopnost neutralizovat cytotoxickou aktivitu lidského TNP α na myších LM buňkách (pro detailní popis analýz - viz níže). Hybridní buňky, které produkují protilátky s nej silnější neutralizační aktivitou, se klonují limitujícím zředěním na 0,5 buňku na jamku na deskách s 96 jamkami (Palcon), na nichž byly předem vysety ozářené myší peritoneální buňky (3000 Rad$ 2,5.10^ buněk/jamku). Po dvou týdnech se, jamky s positivním růstem testují na produkci protilátek spe-’ cifických na TNP α dvěma shora uvedenými analýzami.

Vybere se jeden klon, který produkuje protilátky s nejJ silnější neutralizující aktivitou a ten se dále množí. Supernatant tohoto klonu se testuje, aby se kvantitativně vyhodnotila jeho neutralizační aktivita in vitro a in vivo. Pro tentu ucel se nejdříve kvantitativní ELISou (podrobný popis této . analýzy viz níže) stanoví obsah imunoglobulinu. Aby se přesně kvantitativně stanovila jeho nautralizační aktivita in vitro, koinkubuje se 1 /ug/ml, 100 ng/ml nebo 10 ng/ml (6,2531Ο“θ M, β,25.1Ο^-1θ M nebo 6,25olO^-11 M) monoklonální protilátky se zvyšujícími se dávkami lidského TNP a. Po dvou hodinách se' stanoví zbývající cytotoxická aktivita lidského TNP α na myších LM buňkách. Aby bylo vidět, jestli monoklonální protilátka zkříženě reaguje s blízce příbuzným polypeptidem TNP β, koinkubuje se 1 /Ug/1 ml monoklonální protilátky se zvyšujícími se dávkami lidského TNP β. Po dvou hodinách se stanoví zbývající cytotoxická aktivita lidského TNP β na myších LM buňkách.

Pro přesné kvantitativní stanovení neutralizační aktivity in vivo se testuje schopnost různých dávek moi$clonální protilátky ochránit myši před lethálním, šokovým synd ,omem indukovaným TNP a, který byl podán současně s D-galaktosaminem (podrobný popiš analýzy - viz níže). Buňky hybridomového klonu se klonují opět jak shora popsáno, aby se zajistila stabilita

- 26 a homogenita buněčné populace. Vybere se jeden klon (klon 78) a namnoží se pro další charakterizaci. Bylo zjištěno, že monoklonální protilátka produkovaná tímto klonem má těžké řetězce podtřídy IgGl a lehké řetzece třídy k.

Příklad 3

Ověření specifičnosti monoklonální protilátky specifické na lidský TNP a

Obrázek 1 ukazuje, že k navázání monoklonální protilátky produkované hybridomem 78 na lidský TNP a dochází pouze po předinkubaci s lidským TNP a, ale nikoliv se sérií nepříbuzných antigenů. Nepříbuzné antigeny jsou protilátky epidermáJLního růstového faktoru (EGP), somastatinu, interlejakinu 6 (IL 6), transferinu, hormonálního faktoru štítné žlázy (THP), insulinu a krysího imunoglobulinu G.

Příklad 4

In vitro neutralizační účinnost monoklonální protilátky se zvýšenou neutralizační aktivitou na TNP a a s neutralizační aktivitou na TNP β b

Obrázek 2 ukazuje neutralizační aktivitu 1 /Ug/ml (6,25. •10 M) monoklonální protilátky produkované hybridomovým klonem 78 na zvyšující se dávky TNP a. Jak lze vidět, lidský TNP a samotný vykazuje 50% cytotoxicitu při 0,15 ng/ml (3,3,. 10“¹² Μ). V přítomnosti 1 /Ug/ml uvedené monoklonální protiJ látky vykazuje lidský TNP a 50% cytotoxicitu při asi 229 ng/ml (4,6.10 θ M). To ukazuje, že 1 /Ug/ml uvedené monoklonální protilátky úplně zneutralizuje asi 228 ng/ml lidského TNP a. Poměr poloviny maximální biologické aktivity v přítomnosti 1 /ug/ml uvedené monoklonální protilátky k polovině maximální biologické aktivity v nepřítomnosti monoklonální protilátky je tedy asi 1527. Jestliže se předpokládá, že lidský TNP a je v roztoku přítomen jako trimer, lze z toho odvodit, že monoklonalm protilátka neutralizuje lidský TNP a v poměru asi

1,3 í 1 (na molárním základě). Obrázek 3 ukazuje, že u lidského TNP β poměr poloviny maximální biologické aktivity v přítomnosti 1 yUg/ml uvedené monoklonální protilátky podle tohoto vynálezu k polovině maximální biologické aktivity v nepřítomnosti monoklonální protilátky podle tohoto vynálezu je asi 6,3. Tabulka II ukazuje dávky lidského TNF a, které vykazují 50% cyto toxickou aktivitu na LM buňky v nepřítomnosti uvedené monoklonální protilátky podle tohoto vynálezu k polovině maximální biologické aktivity v přítomnosti 6,25.10“ ' M, 6.25· „10“¹⁰ M nebo 6,25.1ο“¹¹ ffi uvedené monoklonální protilátky podle tohoto vynálezu. Jak lze vidět, uvedená protilátka neutralizuje ve všech testovaných dávkách lidský TNF α v poměru menším než 2 (na molárním základu).

Tabulka I

Vazebné parametry huTNFa na mAb78
změřená afinitní konstanta (ao-10 r?)a	maximální vazebná kapacita (olO12 M)	poměr ]WnAb78
3,16 + 0,7+	. 4,34 + 0,46	0,71+0,11

⁺ Výsledky byly získány ze tří nezávislých pokusů.

Tabulka II

Koncentrace lidského TNF α poskytující 50% cytotoxicitu na buňky LM v přítomnosti a v nepřítomnosti různých koncentrací mAb78

koncentrace	koncentrace huTNF α poskytu-	neutralizační
mAb78	jící 50% cytotoxicitu+	poměr++
-	3,3 + 0,4.10“12M .
6,25»10“9 M	4,6 + O,2.1O“9M	1,36
6,25.10“10 M	5,2 + 0,5.10“10M	1,21
6,25.1ο“11 M.	3,8+1 . 10“ηΜ	1,8

⁺ Výslelyáy byly získány alespoň ze tří nezávislých pokusů.

+4- v y

Neutralizační poměr = poměr mezi koncentrací mAb78 a koncentrací neutralizovaného lidského TNF a.

Příklad 5

Afinita monoklonální protilátky se zvýšenou neutralizační aktivitou na TNF α

Afinita monoklonální protilátky podle tohoto vynálezu se stanovuje Scatchardovou analýzou. Pro tento účel se inkubuje 1 ng/ml (6,25.10”^1,2 M) uvedené monoklonální protilátky s různými dávkami jodovaného lidského TNF a. Potom se stanoví množství lidského TNF α navázaného na protilátku. Jak je vidět z obrázku 4 Scatchardova křivka vazebných dat je přímá čára. Tabulka I ukazuje parametry lidského TNF α navázaného na uvedenou monoklonální protilátku. Jak je vidět, afinitní konstanta (Κ_ο1;)13) je 3,16.10¹⁰ M^-1 a nejvyšší množství jodovaného lidského TNF α návázatelného množstvím6,25« 10^-12 U uvedené monoklonální protilátky je 4,34.10^-12 M.

Příklad 6

Disociace lidského TNF α z monoklonální protilátky se zvýše-’ nou neutralizační aktivitou na TNF α

Disociace lidského TNF α z uvedené monoklonální protilátky se stanoví tak, že se jodovaný lidský TNF α (2,5 ng/ml,

5.10^{- 11} M) preinkubuje s monoklonální protilátkou (2 ng/ml, 1,25.10 ¹¹ M), načež se měří disociace přidáním nadbytku neznačeného lidského TNF a, aby se zabránilo reasociaci jodovaného lidského TNF a. Obrázek 5 ukazuje výsledek takového pokusu. Jak lze vidět, disociace jodovaného lidského TNF α se řídí kinetikou reakce prvního řádu, neboí se získá přímka. Odtud stanovená hodnota kj^ (disociační konstanta) má hodnotu

1.37.10^{- 5} sec^-1 (Τ^₂ = 14 hodin).

Příklad 7

Ouchterlonyho dvojnásobná imunodifuse v agaru

Obrázek 6 ukazuje, že monoklonální protilátka podle tohoto vynálezu je schopna imunosrážet lidský TNF a. Vysrážené pásy se vytvoří, jestliže se nechá zreagovat 20 yug uvedené monoklonální protilátky (střední žlábek) s 10 y-ug (levý horní žlábek), 5 /Ug (pravý horní žlábek) a 2,5 y^ug (pravý dolní žlábek)

- 29 lidského TNP α_ο Při 1,25 ^ug (levý spodní žlábek) lidského TNP cí již není žádný vysrážený pás viditelný. Je známo, že pro to, aby se antigen vysrážel monospecifickou, protilátkou podobné té, která je popsána v tomto vynálezu, musí být vícevazný a musí mít minimálně 3 stejné epitopy v téže molekule (Sachs Do H. a spol.: J. Immunol. 109, 1300 (1972).). Lidský TNP a byl v roztoku popsán jako trimer (Jones Ε. Y. a spol.: viz výše.), ale existuje také práce, v níž se tvrdí, že lidský TNP a existuje v roztoku jako dimer (Petersen C. M. a spol.: . Eur. J. Immunol. 19, 1887 (1989).). Výsledek na obrázku 6 ukazuje, že pomocí monoklonální látky podle tohoto vynálezu je možné lidský TNP a jednoznačně definovat jako trimer.

Příklad 8

Profily směsí lidského TNP a a monoklonální protilátky se zvýšenou neutralizační aktivitou na TNP a podle velikostí rychlotlakou kapalinovou chromatografií

Obrázek 7 ukazuje FPLC profily p.odle velikostí ,100 (2.10~6 M) lidského TNP a samotného (—----graf A), 100 jag/xcH.

(6,25.10“^ M) uvedené monoklonální protilátky samotné (—— -.

graf A), směsi 100 ^ug/ml (2.10^-^ M) lidského TNP a a 30 /Ug/ml (2.10^6 M) monoklonální protilátky (graf B)a směsi 5' ng/ml (10“ⁱ⁰ M)jodovaného lidského TNP a a 2 ng/ml (1,3.10^-11 M) monoklonální protilátky (graf C). Jak je vidět, lidský TNP a samotný se eluuje při objemu odpovídajícího molekulové hmotě 40 000. Toto chromatografické chování lidského TNP a je v souladu s jinými studiemi, v nichž bylo popsáno, že oligomerní TNP a vykazuje při gelové filtraci zdánlivou molekulovou hmotu 34 000 až 40 000 (Kumitani M. G. a spol.: J. Chromatogr. 443, 205 (1988).). Na druhé straně však směsi lidského TNP a a monoklonální protilátky, připravené tak, aby bul činidlo bylo ve velkém nadbytku nebo blízko vypočtené hodnotě K _b , poskytují komplexy, které se euluují při objemu, který odpovídá molekulové hmotě alespoň 400 000, typicky 570 000 aš 600 000 (grafy BaO).

Příklad 9

Závěry odvozené z in vitro pokusů prováděných s monklonální protilátkou se zvýšenou neutralizační aktivitou na TNF a

Jestliže se vezme v úvahu molekulová hmota komplexů (570 000 až 600 000) vytvořených interakcí lidského TNF a s uvedenou monoklonální protilátkou a to, že nejvyšší množství lidského TNF a navázatelného a neutralizovatelného mor^clonál-* ní protilátkou je přibližně 0,7 molů TNF a na mol protilátky, lze z toho vyvodit, že každý z uvedených komplexů je komplex s vysokou molekulovou hmotou, který sestává v podstatě z alespoň dvou molekul uvedené monoklonální protilátky a jedné molekuly lidského TNF a, typicky ze tří molekul uvedené mono», klonální protilátky (6 vazebných ramének) spojených se dvěma molekulami lidského TNF a (6 epitopů).

takových komp4xech lze očekávat, že se při gelové filtraci budou chovat ták, že se budou eluovat při objemu odpovídajícímu molekulovým hmotám 560 000 aš 580 000, hodnotě velice blízké pozorované hodnotě. Jelikož stechiometrické výsledky . byly získány z pokusů prováděných s nadbytkem antigenu, vylučujeme možnost, že by komplexy lidského TNF a s monoklonální protilátkou sestávaly ze střídajících se molekul mAb78-huTNFtt v konfiguraci otevřeného řetězce. Místo toho navrhujeme, že molekuly lidský TNF a /monoklonální protilátka se spojují za vzniku struktur podobných kruhu. Energetická výhodnost a v důsledku toho extremní stabilita kruhu podobných komplexů antigen-protilátka byla diskutována a důkladné studovaná v divalentním hapten—protilátka systému (Archer B. G. a Krakaur H.: Biochemistry 16, 618 (1977), Erickson J. W. a spol.: Biochemistry JO, 2357 (1991), Fosner R. G. a spol.: Biochemistry.20, 2348 (1991) a Dembo M. a Goldstein B.: ImuJ nochemistry 15, 307 (1978). ). Ve skutečnosti disociaČní studie (obrázek 5) ukazuje, še komplexy lidský TNF a /monoklonální protilátka jsou skutečně velmi stabilní (K _a 1,37. .lO-^sec“¹). Tyto hodnoty jsou hodnotami stejného řádu jako hodnoty popsané pro monoklonální protilátky vázané na buněčné povrchové antigeny monogamním bivalentním způsobem vazby /Mason D. W. a Williams A. F.: Biochem. J, 187, 1 (1989)«,), ji- 31 ným druhem interakce antigen-protilátka vedoucím k tvorbě podobně stabilních komplexů. Navíc, jestliže se při tvorbě takových cyklických komplexů lidský TNF α a uvedená monoklonáL ní protilátka nechají relaxovat do stavu nejvyšši stability, potom toto vysvětluje zdánlivě paradoxní výsledek, že při nadbytku antigenů se tvoří nejmenší komplex antigenů s protilátkou.

Z pohledu takového modelu se však objevuje otázka, jak se mohou lidský TNF α a uvedená protilátka srážet. Na základě toho, že v pozorovaných komplexech žádné epitopy lidského TNF α nezůstávají volné při interakci s uvedenými molekulami monoklonální protilátka, vylučujeme, že by ke srážení docházelo jako důsledku zesilováni takových komplexů. Spíše dáváme přednost možnosti, že tvorba sraženiny a cyklických komplexů jsou dva zásadně rozdílné jevy při vzájemné kompetici. Při nadbytku antigenů a při nízkých koncentracích (blízkých K_obg) reakčního činidla by převládla tvorba cyklických komplexů, při ekvi-’ valenci/nadbytku protilátky a vysokých koncentracích reakčního činidla převládne tvorba komplexů vystavěných ze střídajících se molekul protilátka - antigen podle klasické mřížkové teorie.

A konečně, monoklonální protilátky navázané na lidský TNF α podobně jako ta , která je popsána v tomto vynálezu^ mohou ,být výhodné z hlediska možných terapeutických aplikací u chorobných stavů, které mají souvislost s lidským TNF a.

Na komplexy, sestávající z alespoň dvou typicky monoklonálních pnMlátek, lze pohlížet jako na mikroagregáty. Buňky spojení monocyt-makrofág by je měly preferenčně odstranit z oběhu. Tím by ss zabránilo jejich ukládání v kritických orgánech (například v ledvině) a tím by bylo možné vyhnout se zánětlivým reakcím vyvolaných imunitním systémem.

Příklad 10

In vivo neutralizační aktivita monoklonální protilátky se zvýšenou neutralizační aktivitou na TNF α

Pro vyhodnocení in vivo neutralizační aktivity se používá modelový systém, ve kterém se myším intraperitoneální injekcí

- 32 podá 36 mg D-galaktosaminu (Fluka AG, Buchs, Švýcarsko) a lidský TNF a. D-Galaktosamin způsobuje, že zvířata jsou mimořádně vnímavá na lethální účinky lidského TNF a. Jak lze vidět z tabulek II, III a IV, tak nízká dávka lidského TNF a, jako je , 0,1 /Ug/myš, zabijí většinu myší. Ve skutečnosti podání takového množství TNF a myším vede ke zvýšení hladin TNF a v krevním oběhu na hladiny, které byly detegovány u lidí při chorobných stavech, o nichž se předpokládá, že v nich TNF a hraje škodlivou roli (viz Cannon J. G« a spol.: The Journal of Infectious Diseases 161, 79 (1990)»). Tento modelový systém je tedy vhodným systémem pro stanovení takových dávek anti-TNF a monoklonální protilátky, která budou mít u lidí neutralizační' aktivitu při chorobných stavech, při nichž TNF a vykazuje patogenní účinek.

Tabulka III

Úmrtnost myší, jimž byl podán lidský rekombinantní TNF a a D^galaktosamin

dávka D-galaktosaminu+	dávka TNF a+	úmrtnost
36 mg/myš	-	0/4
36 mg/myš	0,01 /Ug/myš	2/4
36 mg/myš	0,1 /Ug/myš	4/4
36 mg/myš	1 /Ug/myš	4/4

⁺ D-Galaktosamin a TNF a byly podávány současně intraperitoneálně.

Tabulka IV

Účinek monoklonální protilátky 78 (mAb 78) na myši, jimž byl podán lidský rekombinantní TNF a a D-galaktosamin dávka D-galakto saminu*_ mg/myš mg/myš mg/myš 36 mg/myš 36 mg/myš 36 mg/myš dávka TNF a⁺

0,1 /Ug/myš O»¹ /ug/myš 0,1 ^ug/myš 0,1 /Ug/myš 0,1 /Ug/myš 0,1 ^ug/myš dávka mAb78⁺⁺

0»5 /ug/myš 0,4 /Ug/myš 0,3 /Ug/myš 0,2 /Ug/myš 0,1 /ug/myš úmrtnost

19/21

0/5

0/5

4/13

4/13

3/5

Tabulka IV (pokračování) dávka D— galaktos- dávka TNE a + dávka mAb78++ úmrtnost amnu^T mg/myš 36 mg/myš 36 mg/myš 36 mg/myš 36 mg/myš 36 mg/myš /Ug/myš - 12/12 /Ug/myš 5yug/myš 0/12 /Ug/myŠ 4 ^ug/myš 0/8 /Ug/myŠ 3 yUg/myš 1/8 yUg/myš 2 ^ug/myš 4/8 ^ug/myš 1 /Ug/myš 6/8 viz tabulka I ++ mAb byl podáván intravenosně 1 hodinu 30 minut před podáním TNE a a D-galaktosaminu.

Tabulka III a IV ukazují výsledky ochranných studií in vivo, které byly prováděny monoklonální protilátkou podle to-T hoto vynálezu produkovanou hybridomovým klonem 78.

Tabulka III zvláště ukazuje, že 0,4 yUg monoklonální protilátky na myš je schopno plně chránit myš před lethálními účinky 0,1 /ug lidského TNE α/myš podaného společně s 36 jng D-galaktosaminu. Při použití superlethální dávky 1 ^ug lidského TNE a na myš, množství 4 /Ug monoklonální protilátky na myš plně myši chrání.

Tabulka V ukazuje výsledky časových kinetických studií.

Jak je z tabulky vidět, 10 /Ug monoklonální protilátky/myš je schopno plně ochránit myši před lethálními účinky 1 ^ug TNF a na myš podané 1 1/2 hodiny před podáním TNE a nebo současně^ TNE a. Jestliže se monoklonální protilátka podá dvacet minut po TNE a, stále ag/etě lze pozorovat, částečnou ochranu. Na druhé straně 1 ^ug/myš plně chrání myši, jestliže se podá čtyřicet minut po podání 0,1 ^ug TNE a na mys. Jestliže se toto množství podá az dve hodiny po podání TNE a, stále .ještě lze pozorovat částečnou ochranu myší. Buňky hybridomového klonu 78 byly uloženy pod SCAOC číslo 9oll0707 7o listopadu 1990.

- 34 Tabulka V

Účinek monoklonální protilátky 78 (mAb78) podávané v různou dobu myším, jimž byl podán TNP a a D-galaktosamin

Z Λ + doba nodánx raAb78 a'nebo TN? a	úmrt- nost
-1 h 30' 0	+20 '	+40 ' +1 h	+ 2 h + 3 h
1 /Ug	TNP			31/33
10 /Ug78 IzUg	TNP			1/24
1/Ug	TNP			0/19
+
10/Ug	78			5/15
1 /UgTNP 10/Ug	78		13/15
1/Ug	TNP	10/Ug 78		15/19
1/ug	TNP	10 yUg78		11/14
1/Ug	TNP		10/Ug 78	8/9
0,1/Ug	TNP			15/15
1/Ug 78 0,1/ug	TNP			0/5
1/Ug	78			0/10
0,1/ug	TNP 1/Ug	78		0/5
0,l^ug	TNP	1/Ug 78		0/5
0,1/Ug	TNP	1/Ug 78		3/15
0,1/Ug	TNP		1/Ug 78	2/10
O.lyUg	TNP		l/-ug 78	5/5

⁺ TNP byl podáván intraperitoneálne společně s 36 mg D-galaktosaminu na myš, mAb 78 byla podávána intravenosně.

Příklad 11

Způsoby biologického vyhodnocování (1) ELISA pro detekci protilátek specfických na lidský

TNP a: Mikrotitrovací desky s plochým dnem (Palcon Č. 3912) (100 ^ul směsi na jamku) se potáhnou 1 ^ug/ml lidského TNP & zředěného lOOmM hydrogenuhličitanovým pufrem, pH 9,6. Po inkubaci přes noc při 4 °C se neabsorbovaný TNP a odstraní. Do každé jamky se přidá PBS doplněný 1 % hovězího serumalbuminu (BSA, Armour, Kankakee, Illinosi, USA), aby se nasytila neobsazená místa.

Desky se pak dále inkubují tři hodiny za teploty místnosti. Potem se desky promyjí 3 x promývacím pufrem (WB), což je PBS doplněný 0,1 % Tweenu 20 (Merck, Schuchardt, Hohenbrunn, NSR) a 0,01 % merthiolátu (3DH, Pool, Velká Británie). Do každé jamky se přidá 50 yul supernatantů hydridomu zředěných 1 : 5 PBS doplněným 1 % BSA. Desky se inkubují 60 minut při teplotě 37 °C a promyjí se jak shora uvedeno. Do každé jamky se přidá 100 /ul s peroxidasou konjugovanéhe kozího protimyšího imunoglobulinu G (HRPalgG, Bio Rad, Richmond, Kalifornie, USA) zředěného 1 : 3 000 promývacím pufrem. Desky se inkubují 45 minut při 37 °C a promyjí se jak shora uvedeno. Do každé jamky se pak přidá 100 /ul peroxidasového substrátu (0PD2, Chemicon, SCI, Řím, Itálie; 1 tableta rozpuštěná v 5 ml citranového pufru 0PĎ4, Chemicon)..Reakce se nech^, probíhat dvě minuty za teploty místnosti. Přidáním 100 /Ul 4M kyseliny sírové na jamku se zaslaví další vyvíjení barvy. Intensita zabarvení se , zjistí čtecím zařízením na deskách ELISA při 492 nm. Supernatanty s hodnotami optické hustoty (OD) větší než 0,5 byly považovány za positivní při vyhodnocování přítomnosti anti-TNP α protilátek.

(2) Kompetitivní ELISA pro ověření specifičnosti protilátek specifických na lidský TNP a: 100 ng/ml hybridomového supernantantu se inkubuje s různými koncentracemi lidského TNP α nebo s různými koncentracemi nepřibuzných antigenů a nebo samotných pouze s ředidlem (PBS doplněné o 1 % BSA) dvě hodiny při 37 °C_O Na konci inkubační doby se změří zbývající navázaný TNP α podle shora popsané. analýzy ELISA. Stanoví se tak protilátky specifické na lidský TNP a. <

(3) ELISA pro ]?antitativní stanovení myších IgG protilátek: Mikrotitrovací desky s rovným dnem se potáhnou 100 /Ul na jamku kozího antimyšího Ig (Organon Teknika, Turnhout, Bel-, gie, konečná koncentrace: 1 ^ug/jamku) zředěného 40mM fosforečnanovým pufrem (pH 7,4). Po inkubaci přes noc při 4 °c se neabsorbovaná protilátka odstraní. Do každé jamky se přidá PBS doplněné o 1 % BSA, aby se nasytila neobsazená místa. Desky ,se pak dále inkubují tři hodiny při teplotě místnosti. Potom se trikrát promyjí WB. Během inkubační doby se připraví seri- 36 álová dvojnásobná zředění referenčního myšího IgG přípravku (Pel-Freeze, Rogers, Arkansas), typicky v rozmezí od 5 do 0,25 mikrogramů IgG/ml. Paralelně se připraví seriálová dvojnásobná ředění supernatantů obsahujících neznámé množství IgG, typicky od 1 : 100 do 1 í 12 800. Všechny ředění se provedou v PBS doplněném 1 % BSA. Do jamky se přidá 50_Q/Ul každého ředění. Desky se inkubují šedesát minut při 37 C, načež se promyjí jak shora uvedeno.

Přidání peroxidasového substrátu a vývoj zabarvení je stejný jako v odstavci (1). Koncentrace IgG v supernatantech, které obsahují neznámé množství IgG, se vypočte na počítači pomocí programu ELISA-SOFT-PG (Perkin-Elmer, Norwald, Koněktikat).

· 7 (4) ELISA pro stanoveni? typů těžkých a lehkých imuno globulinových řetězců monoklonálních protilátek: Pro tento účel se používá sestava “Hybridoma Sub Intyping Kit” (Calbiochem,

La jolla, Kalifornie, USA) podle způsobu postupu popsaného výrobcem. Stanovení typů se provádí u hybridomových super na— tantů zředěných v poměru 1 : 5 PBS doplněným 1 % BSA. Jamky, které mají hodnoty OD větší než 0,4, se považují za positivní na přítomnost monoklonální př^ilátky dané IgG třídy, podtřídy a lehkého řetězce.

(5) Stanovení neutralizační aktivity in vitro anti-TNF a monoklonálních protilátek: v den nula se logaritmicky rostoucí myší LM buňky (Rubin Β. Y. a spol.: J. Exp. Med. 162, 1099 (1985).) trypsinizují, odstřeňují a resuspendují na konečnou koncentraci 3.10 buněk na ml Eaglyho minimálního esenciálního media doplněného o 5 % FCS a 1 % glutaminu (úplné MEM). Do jamek mik' rotitrovacich desek (Palcon, 3072) s plochým dnem se dá po 100 mikrolitrech teto suspense. Potom se připraví taková zředění lidského TNE a nebo lidského TNF β (Omnia Res., Cinisello, Balsamo, Itálie) v úplném MEM, aby konečná končentrace po přidáni do jamek byly 1 ^ug/ml až 20 pg/ml. Supernatanty nebo roztoky obsahující protilátku se zředí úplným MEM tak, aby konečná koncentrace po přidání do jamky byla 1 ^ng i

klonální protilátky nard

100 ng monoklonální protilátky ir.c no na ml nebo 10 ng monoklonální protilátky na ml. 50 ^ul každého zředění TNF a nebo TNF β se inkubujě s 50 yul monoklonální protilátky nebo s 50 y-ul úplného MEM dvě hodiny při 37 °C. Během této inkubační doby se připraví roztok obsahující aktinomycin D (Fluka) v úplném MEM. Konečná koncentrace aktinomycinu D po přidání do jamek je 1 ^ug/ml. Na konci inkubační doby se do jamek mikrotitrovacích desek přidá směs protilátky -TNF a nebo protilátky-TNF β a 50 yul aktinomycinu D. Do. některých jamek se přidá 100 ^ul každého zředění obsahují- , čího samotné TNF a nebo TNF β. Do některých kontrolních jamek se přidá pouze aktinomycin D a úplné MEM. Potom se desky inkubují 24 hodin při 37 °C.

Na konci této inkubační doby se do každé jamky přidá 20 /ul roztoku thiazolylové modře (MTT, Calbiochem, 5 mg/ml , v PBS). Desky se dále inkubují čtyři hodiny při 37 °0. Supernatant se potom odstraní, do každé jamky se přidá po 200 ^ul dimethylsulfoxidu (DMSO, Farmitalia, Oarlo Erba) a rozsah zabarvení se odečte na Stečce desek (plate ELISA reader) při 570 nm. Hodnoty OD získané pro každou směs protilátka-TNF a , nebo protilátka-TNF β se srovná s hodnotami získanými pro samotné TNF a nebo TNF β. Stanoví se dávky TNF a nebo TNF β udávající (v přítomnosti nebo nepřítomnosti monoklonální protilátky) OD hodnoty, které jsou 50 % z hodnot získaných pro kontrolní jamky (50% cytotoxicita). Definují se monoklonální protilátky s nejvyšší neutralizační aktivitou, což jsou takové monoklonální pr^ilátky, u nichž bylo pro dosažení 50% cytotoxicity potřeba nejvyšší dávky TNF a.

(6)Stanovení afinity anti-TNF a monoklonálních protilátek: Pro stanovení afinity anti-TNF a monaklonálních- protilátek byl proveden následující pokus. 1 ng/ml (6-,25.10^-12 M) shora uvedené monoklonální protilátky nebo samotného ředidla (PBS doplněný o 0,5 % BSA) se inkubují s různými koncentracemi jodovaného lidského TNF α (NEN, Wilmington, DE, koncentrační rozmezí typicky od 0,5.10^-11 M do 4.10^-10M) v Eppendorfo. vých zkumavkách čtyři hodiny za teploty místnosti. Na konci této doby se do každé zkumavky přidá zředěný Immunobeads

- 38 (170-5104, Bio-Rad, Segrate, Itálie''. Zkumavky se inkubují další jednu hodinu. Směs se pak odstřeluje olejovou směsí ftalát-dibutylftalát (1 : 1,5 (objemové díly))(Pluka, AG). Radioaktivita Imunobeads” se zjistí gamapočítačem. Takto získaná data se zpracují analytickým programem pro rovnovážná vazebná data (EBDA, Elsevier Science Publishers, Amsterodam, Nizozemí).

(7) Stanovení disociační konsanty (k_^) lidského TNP a navázaného na anti-TNP a monoklonální protilátku: 2 ng (1,25. .10“^θ M)monoklonální pi^ilátky produkované hybridomem 78 ne-* bo samotného pufru (PBS + 0,5 % BSA) se inkubuje s 2,5 ng/ml (5.10^-^) jodovaného lidského TNP a čtyři hodiny za teploty místnosti. Potom se přidají “Imunobeads” zředěné 1 s 5 a po jedné hodině se směsi dvakrát odstřelují. Výsledné pelety se resuspendují ve 250 ng/ml (5β10~θ M)”studeného lidského TNP a, který soutěží o vazby s jodovaným lidským TNP a, který tak disociuje. Po různých dobách inkubace (viz obrázek 5) za teploty místnosti se pelety odstřelují olejovou směsí jak shora popsáno v předcházejícím odstavci. Stanoví se výsledný jodovaný lidský TNP a specificky navázaný na monoklonální protilátku. Výsledky se vynesou do grafu jako procento radioak-2 tivity proti log času. Z grafu se odečte čas odpovídající 50% disociaci ^a ^^{en se} použije pro výpočet k k . _0x6g<L ^Tl/2 (8) Ouchterlonyho dvojitá imunodifuse v agaru: Analýza dvojnásobnou difusí se provádí proto, yba se zjistilo, jestli monoklonální protilátka produkovaná hybridomem 78 sráží lidský TNP a. Pro tento účel se používá 1% agarosový gel v 0,9% chloridu sodném. Vzorky (lidský TNP a a monoklonální protilátka) se umístí do kruhových jamek. Před fotografováním se vzorky nechají vyvíjet alespoň dvacet čtyři hodiny při 4 °C.

(9) Stanovení profilů směsí lidského TNP a a anti-TNP a monoklonální protilátky podle velikostí pomocí PPLC: Pro tenJ to účel se připraví směsi lidského TNP a nebo jodovaného lidJ ského TNP cc a vyčištěné anti-TNP a monoklonální protilátky

- 39 v nadbytku lidského THE α (např. 100 ^ug/ml lidského TNE α a 30 /ug/ml monoklonálni protilátky nebo 5 ng/ml jodovaného lidského TNE α a 2 ng/ml monoklonálni protilátky) v PBS (pro směsi 100 /ug/ml lidského TNE α a 30 yUg/ml monoklonálni protilátky) nebo v PBS + 0,5 % BSA (pro směsi 5 ng/ml jodovaného lidského TNE α a 2 ng/ml monoklonálni protilátky).

Tyto směsi se nechají inkubovat Čtyři hodiny za teploty místnosti. Potom se směsi, TNE α samotný nebo monoklonálni protilátka samotná chromatografují na FPLC koloně (10 x 300 mm) se Superosou 6 (Pharmacia LKB Biotechnology, Upsala, Švédsko). Získají se tak AggQ absorbanční profily. Kolona se předem stabilizuje a ekvilibruje a eluuje se 50mM fosforečnanem sodným, 150mM chloridem sodným, pH 7,2. Standardy molekulových hmot jsou: modrý dextran (2.10^), lidský IgM (900 000), hovězí Thyroglobulin (670 000), hovězí IgG (158 000), kuřecí ovalbumin (44 000), koňský myoglobin (17 000) a vitamin B·, ₉ (1 350).

(10) Stanovení neutralizační aktivity in vivo anti-TNE α monoklonálních protilátek: Pro vyhodnocení neutralizační aktivity in vivo anti-TNE α monoklonálních protilátek se připraví modelový systém pro lethální Šok na myši vyvolaný lidským TNE a. Myším se injekčně intraperitoneálně podají různé dávky lidského TNF α (typicky 0,1 /.ug nebo 1 ^ug/myš zředěno v 0,25 ml PBS) a D-galaktosaminu (typicky 36 mg/myš zředěno v 0,25 ml PBS). Myši, jimž byly injekčně podány smrtelné dávky lidského TNE a, zahynuly během 24 až 48 hodin. Neutralizační, aktivity in vivo anti—TNE α monoklonálních protilátek se vyhodnocuji tak, že se myším injekčně intravenosně podají různé dávky monoklonálni protilátky (zředěné 0,25 ml PBS). Po 90 minutách se těmto myším intraperitoneálně podá smrtelná dávka lid ského TNE a. 7 jiné řadě pokusů se vyhodnocuje neutralizační aktivita in vivo anti—TNE α monoklonálních protilátek v závislosti na čase. V tomto případě se monoklonálni protilátka podává v různých dobách před a po podání smrtelné dávky lidského TNE a.

ύΜ v - 77 tyty ,

patent/

Claims (15)

1. Monoklonální protilátka nebo její vazebný fragment, která je schopna neutralizovat lidský nádorový nekrotický faktor a, vyznačující se tím , že uvedená protilátka je schopna srážet lidský TNP α za tvorby komplexů antigen-protilátka o vysoké molekulové hmotě.

2. Monoklonální protilátka nebo její vazebný fragment podle bodul, vyznačující se tím , že nejmenší komplexy antigen-protilátka tvořené lidským TNP α obsahují v podstatě alespoň dvě molekuly uvedené protilátky a alespoň jednu molekulu lidského TNP α a mají molekulovou hmotu alespoň 400 000.

3. Monoklonální protilátka nebo její vazebný fragment podle bodu 2, vyznačující se tím , že je schopna neutralizovat in vitro lidský TNP α v poměru menším než 2 : 1 vztaženo na moly.

4. Monoklonální protilátka nebo její vazebný fragment podle bodu 1, vyznačující se tím ,žeje schopna poskytnou úplnou ochranu myším před jinak smrtelnou dávkou lidského TNP α v dávkách menších než 1 ^ug/myš.

5. Monoklonální protilátka nebo její vazebný fragment podle bodu 1, vyznačující se tím , že je schop- na rozeznávat také lidský nádorový nekrotický faktor β.

6. Monoklonální protilátka podle bodu 1, kterou je fragment Ρ , Pab nebo P(ab*)_o ·

7. Stabilní hybridomová buněčná linie a její progen, vyznačující se tím , že sekretuje monoklonální protilátku podle bodů 1 až 5·

8. Hybridomová buněčná linie 78 (ECAOC čísle 90110707) a její progen

41

9c

Zcůsob přípravy stabilní hybridomové buněčné linie podle bodu?, vyznačující se tím , že obsahuje napojení nesmrtelných buněk na buňky odvozené od myši, která byla imunizována lidským TNF a.

10. Monoklonální protilátka nebo její vazebný fragment podle bodů 1 až 5, vyznačující se tím , že se získává z hybridomu buněčné linie 78«,

11. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že jako účinnou složku obsahuje monoklonální protilátku nebo její vazebný fragment podle bodu 1 až 6 a 10 a farmaceuticky přijatelný nosič a/nebo ředidlo.

12. Monoklonální protilátka nebo její vazebný fragment podle bo-3 du 1 až 6 a 10, vyznačující se tím , že se používá jako profylaktická a/nebo terapeutické činidlo u chorobných stavů, při nichž lidský TNF α a/nebo lidský TNF β vykazuje pathogenní účinek.

í

13· Monoklonální protilátka nebo její vazebný fragment podle bo-¹ du 1 až 6 a 10, vyznačující se tím, že se používá při prevenci nebo léčení vedlejších účinků, které pocházejí od protibakteriální nebo protinádorové léčby.

14. Produkty obsahující monoklonální protilátku nebo její fragment podle bodu 1 až 6 a 10 a antibiotické, protimikrobiální nebo protibakteriální činidlo nebo směs dvou Či více těchto látek, vyznačující se tím , že se používají jako spojené prostředky pro současné, oddělené nebo postupné použití při protimikrobiální nebo protibakteriJ ální léčbě.

15. Produkty obsahující monoklonální protilátku nebo její vazebný fragment podle bodů 1 až 6 a 10 a protinádorové činidlo, vyznačující se tím , že se používají jako spojený prostředek pro současné, oddělené nebo postupné použití při protirakovinové léčbě.

42 16.

Způsob detekce obsahu lidského TNF α ve vzorku tělesné kapaliny, vyznačující se tím , že se vzorek uvádí do kontaktu s monoklonální protilátkou nebo jejím fragmentem podle bodů 1 až 6 a 10.