JPH0596A - ヒト腫瘍致死因子αに対するモノクローナル抗体 - Google Patents
ヒト腫瘍致死因子αに対するモノクローナル抗体Info
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- JPH0596A JPH0596A JP3345474A JP34547491A JPH0596A JP H0596 A JPH0596 A JP H0596A JP 3345474 A JP3345474 A JP 3345474A JP 34547491 A JP34547491 A JP 34547491A JP H0596 A JPH0596 A JP H0596A
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【構成】ヒト腫瘍致死因子α（ＴＮＦα）に対する高い
中和活性とヒト腫瘍致死因子β（ＴＮＦβ）に対する中
和活性とを有するモノクローナル抗体、抗体を産生する
ハイブリッド細胞系、及び該モノクローナル抗体の使用
法。 【効果】このモノクローナル抗体は、ＴＮＦα及びＴＮ
Ｆβが病源効果を発揮しているとされる疾患状態、特に
悪液質、敗血症性ショック、移植片対受容者疾患、慢性
関節リウマチ、慢性及び急性炎症性疾患、心筋虚血等の
予防及び／又は治療用として人体で使用できる。又ヒト
体液サンプル中のヒトＴＮＦ濃度を検出するために使用
され得る。
中和活性とヒト腫瘍致死因子β（ＴＮＦβ）に対する中
和活性とを有するモノクローナル抗体、抗体を産生する
ハイブリッド細胞系、及び該モノクローナル抗体の使用
法。 【効果】このモノクローナル抗体は、ＴＮＦα及びＴＮ
Ｆβが病源効果を発揮しているとされる疾患状態、特に
悪液質、敗血症性ショック、移植片対受容者疾患、慢性
関節リウマチ、慢性及び急性炎症性疾患、心筋虚血等の
予防及び／又は治療用として人体で使用できる。又ヒト
体液サンプル中のヒトＴＮＦ濃度を検出するために使用
され得る。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ヒト腫瘍致死因子α
（ＴＮＦα）に対する高い中和活性とヒト腫瘍致死因子
β（ＴＮＦβ）に対する中和活性とを有するモノクロー
ナル抗体、抗体を産生するハイブリッド細胞系、及びモ
ノクローナル抗体の使用に係る。
（ＴＮＦα）に対する高い中和活性とヒト腫瘍致死因子
β（ＴＮＦβ）に対する中和活性とを有するモノクロー
ナル抗体、抗体を産生するハイブリッド細胞系、及びモ
ノクローナル抗体の使用に係る。
【０００２】
【従来技術及び発明が解決しようとする課題】ＴＮＦα
は分子量１７５００のポリペプチドであり、その一次及
び三次構造は解明されている（Ｐｅｎｎｉｃａ， Ｄ．
ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ ３１２： ７２４ （１
９８４）及びＪｏｎｅｓ， Ｅ．Ｙ． ｅｔ ａｌ．Ｎ
ａｔｕｒｅ ３３８： ２２５ （１９８９））。ＴＮ
Ｆαは三量体として生物学的に活性である。ＴＮＦαの
主要源主なソースは単球／マクロファージ由来の細胞で
あるが、適切な刺激後、他の細胞型（例えばＴリンパ
球）によっても産生される。
は分子量１７５００のポリペプチドであり、その一次及
び三次構造は解明されている（Ｐｅｎｎｉｃａ， Ｄ．
ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ ３１２： ７２４ （１
９８４）及びＪｏｎｅｓ， Ｅ．Ｙ． ｅｔ ａｌ．Ｎ
ａｔｕｒｅ ３３８： ２２５ （１９８９））。ＴＮ
Ｆαは三量体として生物学的に活性である。ＴＮＦαの
主要源主なソースは単球／マクロファージ由来の細胞で
あるが、適切な刺激後、他の細胞型（例えばＴリンパ
球）によっても産生される。
【０００３】ＴＮＦβはＴＮＦαに密接に関連するポリ
ペプチドである。両方の分子はアミノ酸レベルで２８％
の相同度を示す（Ｐｅｎｎｉｃａ， Ｄ． ｅｔａｌ．
上掲及びＧｒａｙ， Ｐ．Ｗ． ｅｔ ａｌ． Ｎａｔ
ｕｒｅ ３１２： ７２１（１９８４）参照）。ＴＮＦ
βの主要源はＴリンパ球である。
ペプチドである。両方の分子はアミノ酸レベルで２８％
の相同度を示す（Ｐｅｎｎｉｃａ， Ｄ． ｅｔａｌ．
上掲及びＧｒａｙ， Ｐ．Ｗ． ｅｔ ａｌ． Ｎａｔ
ｕｒｅ ３１２： ７２１（１９８４）参照）。ＴＮＦ
βの主要源はＴリンパ球である。
【０００４】ＴＮＦαは最初はマウスに腫瘍の出血性壊
死を誘発する分子として記載された。しかしながら、そ
のｃＤＮＡのクローニングにより大量の均質ＴＮＦαが
入手可能になるや、ＴＮＦαは炎症メディエーターとし
てＴＮＦαを定義し得る多数の生物活性を媒介すること
が明らかになった。一般に、Ｂｅｕｔｌｅｒ， Ｂ．ａ
ｎｄ Ｃｅｒａｍｉ， Ａ．， Ｎａｔｕｒ ｅ ３２
０： ５８４ （１９８６）を参照されたい。
死を誘発する分子として記載された。しかしながら、そ
のｃＤＮＡのクローニングにより大量の均質ＴＮＦαが
入手可能になるや、ＴＮＦαは炎症メディエーターとし
てＴＮＦαを定義し得る多数の生物活性を媒介すること
が明らかになった。一般に、Ｂｅｕｔｌｅｒ， Ｂ．ａ
ｎｄ Ｃｅｒａｍｉ， Ａ．， Ｎａｔｕｒ ｅ ３２
０： ５８４ （１９８６）を参照されたい。
【０００５】ＴＮＦβは定性的に類似の生物活性を媒介
するが、単一の生物活性を媒介するために必要なＴＮＦ
α又はβの用量は定量的に異なることが記載されてい
る。
するが、単一の生物活性を媒介するために必要なＴＮＦ
α又はβの用量は定量的に異なることが記載されてい
る。
【０００６】ＴＮＦαは炎症性応答の範囲で、有害物質
による生物の侵入から受容者を防御する上で重要な役割
を果たす。しかしながら、慢性又は急性、全身性又は局
所過形成のような所定の状況下では、ＴＮＦαは炎症性
応答の他のメディエーターと共に多数の病理状態を引き
起こす。悪液質及び敗血症性ショックは最もよく知られ
ている例である（Ｂｅｕｔｌｅｒ， Ｂ． ａｎｄ Ｃ
ｅｒａｍｉ， Ａ．，上掲及びＯｌｉｆｆ， Ａ．，
ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ ５０： ５５５（１９８
７）参照）。同様に、ＴＮＦαはＡＩＤＳ（Ｆｏｌｋ
ｓ， Ｔ．Ｍ．， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏ ｃ． Ｎａ
ｔｌ． Ａｃａ ｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ８６： ２３６
５ （１９８９））、移植片対受容者疾患（Ｐｉｇｕｅ
ｔ，Ｐ．Ｆ．， ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅ
ｄ． １６６： １２８０（１９８７））、脳性マラリ
ア（Ｇｒａｕ， Ｇ．Ｅ．， ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ ２３７： １２１０ （１９８７））、慢性関
節リウマチ（Ｂｒｅｎｎａｎ， Ｆ．Ｍ．， ｅｔ ａ
ｌ．， Ｌａｎｃｅｔ ｉｉ： ２４４（１９８９））
及び数種の他の状態において病原役割を果たすと予想さ
れる。
による生物の侵入から受容者を防御する上で重要な役割
を果たす。しかしながら、慢性又は急性、全身性又は局
所過形成のような所定の状況下では、ＴＮＦαは炎症性
応答の他のメディエーターと共に多数の病理状態を引き
起こす。悪液質及び敗血症性ショックは最もよく知られ
ている例である（Ｂｅｕｔｌｅｒ， Ｂ． ａｎｄ Ｃ
ｅｒａｍｉ， Ａ．，上掲及びＯｌｉｆｆ， Ａ．，
ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ ５０： ５５５（１９８
７）参照）。同様に、ＴＮＦαはＡＩＤＳ（Ｆｏｌｋ
ｓ， Ｔ．Ｍ．， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏ ｃ． Ｎａ
ｔｌ． Ａｃａ ｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ８６： ２３６
５ （１９８９））、移植片対受容者疾患（Ｐｉｇｕｅ
ｔ，Ｐ．Ｆ．， ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅ
ｄ． １６６： １２８０（１９８７））、脳性マラリ
ア（Ｇｒａｕ， Ｇ．Ｅ．， ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ ２３７： １２１０ （１９８７））、慢性関
節リウマチ（Ｂｒｅｎｎａｎ， Ｆ．Ｍ．， ｅｔ ａ
ｌ．， Ｌａｎｃｅｔ ｉｉ： ２４４（１９８９））
及び数種の他の状態において病原役割を果たすと予想さ
れる。
【０００７】ＴＮＦβのｉｎ ｖｉｖｏ効果については
あまり知られていない。しかしながら、ＴＮＦβはＴＮ
Ｆαに類似の生物活性をｉｎ ｖｉｔｒｏで媒介するの
で、過形成の場合にＴＮＦβも同様に何らかの疾患状態
の病因に関与し得るということができる。
あまり知られていない。しかしながら、ＴＮＦβはＴＮ
Ｆαに類似の生物活性をｉｎ ｖｉｔｒｏで媒介するの
で、過形成の場合にＴＮＦβも同様に何らかの疾患状態
の病因に関与し得るということができる。
【０００８】これらの結果から、ＴＮＦαに対する抗
体、及び場合によりＴＮＦβに対する抗体はこれらのポ
リペプチドが病原効果を発揮する疾患状態で治療薬とし
て有用であり得ると予想された。
体、及び場合によりＴＮＦβに対する抗体はこれらのポ
リペプチドが病原効果を発揮する疾患状態で治療薬とし
て有用であり得ると予想された。
【０００９】治療薬として有用であるためには、ＴＮＦ
αに対する抗体はＴＮＦαの毒性効果をｉｎ ｖｉｖｏ
で中和することができなければならない。ポリクローナ
ル抗体は高度免疫した動物の血清から容易に取得可能で
ある。しかしながら、これらのポリクローナル抗体調製
物は、 −ＴＮＦαを中和しない抗体を含有する抗体混合物であ
る、 −同一エピトープに対して種々の親和性を有する種々の
抗体を含有する抗体混合物である、 −ロット毎に異なるため、力価に関して標準化が難しい といった理由からｉｎ ｖｉｖｏで使用するのに最適で
はない。
αに対する抗体はＴＮＦαの毒性効果をｉｎ ｖｉｖｏ
で中和することができなければならない。ポリクローナ
ル抗体は高度免疫した動物の血清から容易に取得可能で
ある。しかしながら、これらのポリクローナル抗体調製
物は、 −ＴＮＦαを中和しない抗体を含有する抗体混合物であ
る、 −同一エピトープに対して種々の親和性を有する種々の
抗体を含有する抗体混合物である、 −ロット毎に異なるため、力価に関して標準化が難しい といった理由からｉｎ ｖｉｖｏで使用するのに最適で
はない。
【００１０】
【課題を解決するための手段】モノクローナル抗体技術
はこれらの問題を回避するための選択手段である。この
技術は全免疫原分子に対すると同様にＴＮＦαに対して
再現可能な特異性及び親和性を有するモノクローナル抗
体を制御条件下で且つ無制限量にｉｎ ｖｉｔｒｏで製
造することができる。当然のことながら、単一の抗原に
対して多くの異なるモノクローナル抗体が得られる。こ
れらのモノクローナル抗体は、 −抗体クラス及びサブクラス、 −エピトープ特異性、 −結合親和性、並びに −ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ中和活性 の点で相互に異なり得る。
はこれらの問題を回避するための選択手段である。この
技術は全免疫原分子に対すると同様にＴＮＦαに対して
再現可能な特異性及び親和性を有するモノクローナル抗
体を制御条件下で且つ無制限量にｉｎ ｖｉｔｒｏで製
造することができる。当然のことながら、単一の抗原に
対して多くの異なるモノクローナル抗体が得られる。こ
れらのモノクローナル抗体は、 −抗体クラス及びサブクラス、 −エピトープ特異性、 −結合親和性、並びに −ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ中和活性 の点で相互に異なり得る。
【００１１】治療薬として使用するためには、他の全抗
原に対すると同様にＴＮＦαに対して特異的であり且つ
高い中和活性を有するモノクローナル抗体を使用するこ
とが望ましい。こうすると、ｉｎ ｖｉｖｏで治療薬と
して有効なレベルに達するためにモノクローナル抗体投
与量を低減することができ、こうしてモノクローナル抗
体により場合により生じる望ましくない副作用を緩和す
ることができる。
原に対すると同様にＴＮＦαに対して特異的であり且つ
高い中和活性を有するモノクローナル抗体を使用するこ
とが望ましい。こうすると、ｉｎ ｖｉｖｏで治療薬と
して有効なレベルに達するためにモノクローナル抗体投
与量を低減することができ、こうしてモノクローナル抗
体により場合により生じる望ましくない副作用を緩和す
ることができる。
【００１２】この点で、本発明はヒトＴＮＦαを中和す
ることが可能な新規モノクローナル抗体又はその結合フ
ラグメントを提供する。本発明の抗体は、ｉ ｎ ｖｉｔ
ｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏの両方で高いＴＮＦα中和活性
を有する。即ち、ｉｎ ｖｉｔｒｏでヒトＴＮＦαは約
０．１５ｎｇ／ｍｌ（ＴＮＦαが三量体であると仮定す
るなら、３．３×１０-12Ｍ）の半最大生物活性を発揮
する。１μｇ／ｍｌ（６．２５×１０-9Ｍ）の該抗体の
存在下で、ヒトＴＮＦαは約２２９ｎｇ／ｍｌ（４．６
×１０-9Ｍ、１μｇ／ｍｌの該抗体の存在下対不在下の
半最大生物活性の比は約１５２７である）の半最大生物
活性を発揮する。１００ｎｇ／ｍｌ（６．２５×１０
-10Ｍ）の該抗体の存在下で、ヒトＴＮＦαは約２６ｎ
ｇ／ｍｌ（５．２×１０-10Ｍ）の半最大生物活性を発
揮する。１０ｎｇ／ｍｌ（６．２５×１０-11Ｍ）の該
抗体の存在下で、ヒトＴＮＦαは約１．９ｎｇ／ｍｌ
（３．８×１０-11Ｍ）の半最大生物活性を発揮する。
従って、本発明により提供されるモノクローナル抗体
は、約２：１未満のモル比、特に約１．３：１のモル比
で三量体ヒトＴＮＦαをｉｎ ｖｉｔｒｏで中和するこ
とを特徴とする。更に、該モノクローナル抗体は構造的
に関連するポリペプチドヒトＴＮＦβを同様に中和し、
従って認識する。
ることが可能な新規モノクローナル抗体又はその結合フ
ラグメントを提供する。本発明の抗体は、ｉ ｎ ｖｉｔ
ｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏの両方で高いＴＮＦα中和活性
を有する。即ち、ｉｎ ｖｉｔｒｏでヒトＴＮＦαは約
０．１５ｎｇ／ｍｌ（ＴＮＦαが三量体であると仮定す
るなら、３．３×１０-12Ｍ）の半最大生物活性を発揮
する。１μｇ／ｍｌ（６．２５×１０-9Ｍ）の該抗体の
存在下で、ヒトＴＮＦαは約２２９ｎｇ／ｍｌ（４．６
×１０-9Ｍ、１μｇ／ｍｌの該抗体の存在下対不在下の
半最大生物活性の比は約１５２７である）の半最大生物
活性を発揮する。１００ｎｇ／ｍｌ（６．２５×１０
-10Ｍ）の該抗体の存在下で、ヒトＴＮＦαは約２６ｎ
ｇ／ｍｌ（５．２×１０-10Ｍ）の半最大生物活性を発
揮する。１０ｎｇ／ｍｌ（６．２５×１０-11Ｍ）の該
抗体の存在下で、ヒトＴＮＦαは約１．９ｎｇ／ｍｌ
（３．８×１０-11Ｍ）の半最大生物活性を発揮する。
従って、本発明により提供されるモノクローナル抗体
は、約２：１未満のモル比、特に約１．３：１のモル比
で三量体ヒトＴＮＦαをｉｎ ｖｉｔｒｏで中和するこ
とを特徴とする。更に、該モノクローナル抗体は構造的
に関連するポリペプチドヒトＴＮＦβを同様に中和し、
従って認識する。
【００１３】従って、ｉｎ ｖｉｔｒｏでヒトＴＮＦβ
は約４ｎｇ／ｍｌ（ＴＮＦβが三量体であると仮定する
なら、８×１０-11Ｍ）の半最大生物活性を発揮する。
１μｇ／ｍｌ（６．２５×１０-9Ｍ）の該抗体の存在下
で、ヒトＴＮＦβは約２５．６ｎｇ／ｍｌ（５×１０
-10Ｍ、１μｇ／ｍｌの該抗体の存在下対不在下の半最
大生物活性の比は約６．３である）の半最大生物活性を
発揮する。
は約４ｎｇ／ｍｌ（ＴＮＦβが三量体であると仮定する
なら、８×１０-11Ｍ）の半最大生物活性を発揮する。
１μｇ／ｍｌ（６．２５×１０-9Ｍ）の該抗体の存在下
で、ヒトＴＮＦβは約２５．６ｎｇ／ｍｌ（５×１０
-10Ｍ、１μｇ／ｍｌの該抗体の存在下対不在下の半最
大生物活性の比は約６．３である）の半最大生物活性を
発揮する。
【００１４】第２の側面として、本発明は該モノクロー
ナル抗体が二次元で二重拡散により決定した場合（オク
テルロニー法）にヒトＴＮＦαを沈殿し得ることを示
す。第３の側面として、本発明は該モノクローナル抗体
をヒトＴＮＦαと共にインキュベーション後に形成され
る最小の抗原−抗体複合物が、実質的に少なくとも２個
の該モノクローナル抗体分子と少なくとも１個のヒトＴ
ＮＦα分子、典型的には３個のモノクローナル抗体分子
と２個のヒトＴＮＦα分子とを含む高分子量抗原−抗体
複合体であることを示す。
ナル抗体が二次元で二重拡散により決定した場合（オク
テルロニー法）にヒトＴＮＦαを沈殿し得ることを示
す。第３の側面として、本発明は該モノクローナル抗体
をヒトＴＮＦαと共にインキュベーション後に形成され
る最小の抗原−抗体複合物が、実質的に少なくとも２個
の該モノクローナル抗体分子と少なくとも１個のヒトＴ
ＮＦα分子、典型的には３個のモノクローナル抗体分子
と２個のヒトＴＮＦα分子とを含む高分子量抗原−抗体
複合体であることを示す。
【００１５】「高分子量抗原−抗体複合体」なる用語
は、少なくとも４００ｋＤ、典型的には約５７０ｋＤ〜
約６００ｋＤの抗原−抗体複合体を表すために使用され
る。
は、少なくとも４００ｋＤ、典型的には約５７０ｋＤ〜
約６００ｋＤの抗原−抗体複合体を表すために使用され
る。
【００１６】更に、該抗体は約１μｇ／匹未満、典型的
には約０．４〜約０．８μｇ／匹の用量で、抗体非投与
時には致死量のヒトＴＮＦαからマウスに完全な保護を
実現する。０．４μｇ／匹は約２０μｇ／ｋｇ体重に対
応することを指摘すべきである。
には約０．４〜約０．８μｇ／匹の用量で、抗体非投与
時には致死量のヒトＴＮＦαからマウスに完全な保護を
実現する。０．４μｇ／匹は約２０μｇ／ｋｇ体重に対
応することを指摘すべきである。
【００１７】本発明は更に、このようなモノクローナル
抗体を産生する安定なハイブリドーマ細胞系及び子孫を
提供する。
抗体を産生する安定なハイブリドーマ細胞系及び子孫を
提供する。
【００１８】本発明は更に、このようなモノクローナル
抗体の製造方法を提供する。
抗体の製造方法を提供する。
【００１９】本発明は更に、ヒトＴＮＦα及びヒトＴＮ
Ｆβの両方を中和することが可能なこのようなモノクロ
ーナル抗体と、医薬上許容可能なキャリヤー及び／又は
希釈剤とを含有する医薬組成物を提供する。
Ｆβの両方を中和することが可能なこのようなモノクロ
ーナル抗体と、医薬上許容可能なキャリヤー及び／又は
希釈剤とを含有する医薬組成物を提供する。
【００２０】本発明の更に別の側面は、体液中のヒトＴ
ＮＦαの濃度を検出する方法を提供することである。
ＮＦαの濃度を検出する方法を提供することである。
【００２１】本発明の１つの目的は更に、ヒトＴＮＦα
及びヒトＴＮＦβレセプターを認識する抗イディオタイ
プ抗体を提供することである。
及びヒトＴＮＦβレセプターを認識する抗イディオタイ
プ抗体を提供することである。
【００２２】本発明のモノクローナル抗体はＩｇＭ、Ｉ
ｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＡのような免疫グロブリンのクラス
又はＩｇＧのサブクラスの任意のものであり得る。モノ
クローナル抗体は完全なまま使用してもよいし、Ｆｖ、
Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）2のような結合フラグメントとし
て使用してもよい。
ｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＡのような免疫グロブリンのクラス
又はＩｇＧのサブクラスの任意のものであり得る。モノ
クローナル抗体は完全なまま使用してもよいし、Ｆｖ、
Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）2のような結合フラグメントとし
て使用してもよい。
【００２３】好ましくは、本発明のモノクローナル抗体
はＩｇＧクラスである。
はＩｇＧクラスである。
【００２４】本発明の特に好適なモノクローナル抗体
は、本明細書に記載するようにＩｇＧ１ ｋイソタイプ
のハイブリドーマクローン７８により産生される類であ
る。
は、本明細書に記載するようにＩｇＧ１ ｋイソタイプ
のハイブリドーマクローン７８により産生される類であ
る。
【００２５】本発明のモノクローナル抗体の好適結合フ
ラグメントは、該抗体のＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）2
フラグメントである。
ラグメントは、該抗体のＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）2
フラグメントである。
【００２６】上述のように、本発明は本発明のモノクロ
ーナル抗体又はその結合フラグメントの製造方法を提供
するものであり、該方法は、本発明のハイブリドーマ細
胞系又はその子孫を培養する段階と、こうして産生され
たモノクローナル抗体を回収する段階とを含む。
ーナル抗体又はその結合フラグメントの製造方法を提供
するものであり、該方法は、本発明のハイブリドーマ細
胞系又はその子孫を培養する段階と、こうして産生され
たモノクローナル抗体を回収する段階とを含む。
【００２７】本発明のモノクローナル抗体又はそのフラ
グメントは、Ｂ細胞由来のリンパ球を不滅化（無限増殖
化）することにより製造され得る。不滅化は腫瘍ウイル
スで形質転換することにより、又は既に不滅状態の細胞
系（例えばミエローマ又はリンパ芽球細胞系）と融合す
ることにより実施され得る。後者のアプローチはＫｏｅ
ｈｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（Ｋｏｅｈｅｒ，
Ｇ． ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ， Ｃ．， Ｎａｔｕ
ｒｅ ２５６： ４９６ （１９７５））により最初に
記載され、無制限増殖及び抗体産生の可能な不滅ハイブ
リッド細胞系をもたらす。こうして得られた不滅細胞系
をクローニング及びスクリーニングし、細胞上清中で所
望の抗原に対する抗体を検出する。多数のスクリーニン
グ技術が文献中に記載されており、当業者に周知であ
る。これらの技術は、所望の抗原に対するモノクローナ
ル抗体を単離できることが明白である。もっとも、オペ
レータが特別の特性（即ち抗原に対する高い又は低い親
和性、中和又は非中和活性）を有するモノクローナル抗
体を単離したい場合、スクリーニング技術は所望の特性
を有するモノクローナル抗体を単離できるように実施す
べきである。これらのアッセイを実施する方法は、求め
られる特性、オペレータが得たいと望む抗体に対する抗
原に依存し、一般に予想不可能であり、ケースバイケー
スで調べなければならない。しかしながら、オペレータ
が高い活性を有するモノクローナル抗体を単離したいと
望む場合、このステップは極めて重要である。
グメントは、Ｂ細胞由来のリンパ球を不滅化（無限増殖
化）することにより製造され得る。不滅化は腫瘍ウイル
スで形質転換することにより、又は既に不滅状態の細胞
系（例えばミエローマ又はリンパ芽球細胞系）と融合す
ることにより実施され得る。後者のアプローチはＫｏｅ
ｈｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（Ｋｏｅｈｅｒ，
Ｇ． ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ， Ｃ．， Ｎａｔｕ
ｒｅ ２５６： ４９６ （１９７５））により最初に
記載され、無制限増殖及び抗体産生の可能な不滅ハイブ
リッド細胞系をもたらす。こうして得られた不滅細胞系
をクローニング及びスクリーニングし、細胞上清中で所
望の抗原に対する抗体を検出する。多数のスクリーニン
グ技術が文献中に記載されており、当業者に周知であ
る。これらの技術は、所望の抗原に対するモノクローナ
ル抗体を単離できることが明白である。もっとも、オペ
レータが特別の特性（即ち抗原に対する高い又は低い親
和性、中和又は非中和活性）を有するモノクローナル抗
体を単離したい場合、スクリーニング技術は所望の特性
を有するモノクローナル抗体を単離できるように実施す
べきである。これらのアッセイを実施する方法は、求め
られる特性、オペレータが得たいと望む抗体に対する抗
原に依存し、一般に予想不可能であり、ケースバイケー
スで調べなければならない。しかしながら、オペレータ
が高い活性を有するモノクローナル抗体を単離したいと
望む場合、このステップは極めて重要である。
【００２８】ヒトＴＮＦαに対する所望の特性を有する
モノクローナル抗体を産生する細胞系を本発明に従って
単離したら、必要に応じてモノクローナル抗体をコード
する遺伝子源としてこれらの細胞系を使用することがで
きる。
モノクローナル抗体を産生する細胞系を本発明に従って
単離したら、必要に応じてモノクローナル抗体をコード
する遺伝子源としてこれらの細胞系を使用することがで
きる。
【００２９】これらの遺伝子は、まず最初にメッセンジ
ャーＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを作成することに
より単離され得る。次に免疫グロブリンをコードする単
一ｃＤＮＡクローンを単離し、更に加工する。これらの
加工の最終目的は、必ずしもそうではないが通常、元の
抗体を得た宿主と別の宿主にｉｎ ｖｉｖｏ投与後に低
い免疫原性の抗体を生成することである。これは、元の
種の可変領域遺伝子に対応するヌクレオチドを、抗体を
投与すべき種の不変領域遺伝子に対応するヌクレオチド
に連結することにより達せられる。あるいは、抗体を投
与すべき種の抗体遺伝子の可変領域の対応するヌクレオ
チドの代わりに、相補性を決定する元のモノクローナル
抗体の領域をコードするヌクレオチドを使用してもよ
い。最後に、元の又は修飾したｃＤＮＡクローンを単離
し、適切な原核又は真核発現ベクターに担持させ、その
後、最終的大量生産のために宿主にトランスフェクトす
る。
ャーＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを作成することに
より単離され得る。次に免疫グロブリンをコードする単
一ｃＤＮＡクローンを単離し、更に加工する。これらの
加工の最終目的は、必ずしもそうではないが通常、元の
抗体を得た宿主と別の宿主にｉｎ ｖｉｖｏ投与後に低
い免疫原性の抗体を生成することである。これは、元の
種の可変領域遺伝子に対応するヌクレオチドを、抗体を
投与すべき種の不変領域遺伝子に対応するヌクレオチド
に連結することにより達せられる。あるいは、抗体を投
与すべき種の抗体遺伝子の可変領域の対応するヌクレオ
チドの代わりに、相補性を決定する元のモノクローナル
抗体の領域をコードするヌクレオチドを使用してもよ
い。最後に、元の又は修飾したｃＤＮＡクローンを単離
し、適切な原核又は真核発現ベクターに担持させ、その
後、最終的大量生産のために宿主にトランスフェクトす
る。
【００３０】以下、添付図面及び表に関して本発明を説
明する。
明する。
【００３１】尚、表１は本発明のモノクローナル抗体に
対するヒトＴＮＦαの結合のパラメーターを示す。
対するヒトＴＮＦαの結合のパラメーターを示す。
【００３２】表２は、種々の濃度の該モノクローナル抗
体の不在下又は存在下で半最大生物活性を与えるヒトＴ
ＮＦαの濃度を示す。
体の不在下又は存在下で半最大生物活性を与えるヒトＴ
ＮＦαの濃度を示す。
【００３３】表３は、種々の用量のヒトＴＮＦαをマウ
スに投与した場合の生存効果を示す。
スに投与した場合の生存効果を示す。
【００３４】表４は、２種の致死量のＴＮＦαで処理し
たマウスにおける本発明のモノクローナル抗体の保護効
果を示す。
たマウスにおける本発明のモノクローナル抗体の保護効
果を示す。
【００３５】表５は、２種の致死量のＴＮＦαで処理前
後種々の時点でマウスに注入した本発明のモノクローナ
ル抗体の保護効果を示す。
後種々の時点でマウスに注入した本発明のモノクローナ
ル抗体の保護効果を示す。
【００３６】本発明のハイブリッド細胞系の特徴付けに
関して、「永続的」及び「安定的」なる用語は、長期
間、典型的には少なくとも約６カ月にわたって生存可能
であることを意味する。本発明は、本発明のモノクロー
ナル抗体を少なくとも２５継代産生する能力を維持する
安定的で永続的なハイブリドーマ細胞系を提供すること
ができる。
関して、「永続的」及び「安定的」なる用語は、長期
間、典型的には少なくとも約６カ月にわたって生存可能
であることを意味する。本発明は、本発明のモノクロー
ナル抗体を少なくとも２５継代産生する能力を維持する
安定的で永続的なハイブリドーマ細胞系を提供すること
ができる。
【００３７】「モノクローナル抗体」なる用語は、実質
的に均質な集団を有する抗体から選択された抗体を意味
し、即ち抗体集団の個体は天然に発生する突然変異を除
いて同一であることを意味する。
的に均質な集団を有する抗体から選択された抗体を意味
し、即ち抗体集団の個体は天然に発生する突然変異を除
いて同一であることを意味する。
【００３８】「抗体」なる用語は更に、完全な分子及び
抗原に結合することが可能なＦｖ、Ｆａｂ及びＦ（ａ
ｂ’）2のようなそのフラグメントを意味する。Ｆａｂ
及びＦ（ａｂ’）2フラグメントは抗体のＦｃフラグメ
ントを欠失し、循環からより迅速に除去され、完全抗体
よりも非特異的組織結合が少ない。本発明のモノクロー
ナル抗体のＦｖ、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）2並びに他の
フラグメントは。同一目的（例えばＴＮＦαの検出及び
ＴＮＦαが有害な役割を果たすことが示された疾患状態
の治療）のために完全抗体と同様に使用できることが理
解されよう。
抗原に結合することが可能なＦｖ、Ｆａｂ及びＦ（ａ
ｂ’）2のようなそのフラグメントを意味する。Ｆａｂ
及びＦ（ａｂ’）2フラグメントは抗体のＦｃフラグメ
ントを欠失し、循環からより迅速に除去され、完全抗体
よりも非特異的組織結合が少ない。本発明のモノクロー
ナル抗体のＦｖ、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）2並びに他の
フラグメントは。同一目的（例えばＴＮＦαの検出及び
ＴＮＦαが有害な役割を果たすことが示された疾患状態
の治療）のために完全抗体と同様に使用できることが理
解されよう。
【００３９】「中和」なる用語は、ＴＮＦα及びＴＮＦ
βがｉｎ ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ ｖｉｖｏで生物
活性を発揮する能力を阻止する抗体含有溶液の能力を表
すために使用される。
βがｉｎ ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ ｖｉｖｏで生物
活性を発揮する能力を阻止する抗体含有溶液の能力を表
すために使用される。
【００４０】「高いｉｎ ｖｉｔｒｏＴＮＦα中和活
性」なる用語は、モノクローナル抗体を含有する溶液が
≦１０ｎｇ／ｍｌのモノクローナル抗体用量で、＜６：
１の重量比及び＜２：１のモル比でヒトＴＮＦαを中和
する能力を表すために使用される。
性」なる用語は、モノクローナル抗体を含有する溶液が
≦１０ｎｇ／ｍｌのモノクローナル抗体用量で、＜６：
１の重量比及び＜２：１のモル比でヒトＴＮＦαを中和
する能力を表すために使用される。
【００４１】「高いｉｎ ｖｉｖｏＴＮＦα中和活性」
なる用語は、モノクローナル抗体を含有する溶液が≦２
０μｇ／ｋｇ体重の用量で、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＴ
ＮＦαの有害な役割を果たす可能性を阻止する能力を表
すために使用される。
なる用語は、モノクローナル抗体を含有する溶液が≦２
０μｇ／ｋｇ体重の用量で、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＴ
ＮＦαの有害な役割を果たす可能性を阻止する能力を表
すために使用される。
【００４２】本発明のモノクローナル抗体は実際に、１
μｇ／匹未満、典型的には約０．４〜約０．８μｇ／匹
の用量で、抗体非投与時の致死量のＴＮＦαからマウス
に完全な保護を与えることが可能である。０．４μｇ／
匹は約２０μｇ／ｋｇ体重に対応することに留意すべき
である。
μｇ／匹未満、典型的には約０．４〜約０．８μｇ／匹
の用量で、抗体非投与時の致死量のＴＮＦαからマウス
に完全な保護を与えることが可能である。０．４μｇ／
匹は約２０μｇ／ｋｇ体重に対応することに留意すべき
である。
【００４３】本発明の好適態様によると、このようなモ
ノクローナル抗体は不滅化細胞系及びヒト組換ＴＮＦα
で免疫したマウスに由来する細胞を使用して作成された
ハイブリドーマ細胞系により分泌される。
ノクローナル抗体は不滅化細胞系及びヒト組換ＴＮＦα
で免疫したマウスに由来する細胞を使用して作成された
ハイブリドーマ細胞系により分泌される。
【００４４】不滅化細胞系は実際上、細胞培養で永久に
維持され得る細胞系である。換言するなら、該細胞系は
安定且つ永続的であり、これらの特性を示さない細胞と
融合すると、融合産物に特性を与えることが可能であ
る。
維持され得る細胞系である。換言するなら、該細胞系は
安定且つ永続的であり、これらの特性を示さない細胞と
融合すると、融合産物に特性を与えることが可能であ
る。
【００４５】任意の適切な不滅化細胞系を使用すること
ができる。典型的には、哺乳動物起源の形質細胞腫（ミ
エローマ）を使用することができる。好適型の細胞系は
マウスヒポキサンチン−ホスホリボシル−トランスフェ
ラーゼ（ＨＰＲＴ）欠失形質細胞腫である。このような
細胞系の１種が特に好適である。これは免疫グロブリン
又は免疫グロブリンＨ鎖もしくはＬ鎖を産生又は分泌し
ないＢＡＬＢ／ｃ起源の周知のＨＰＲＴ欠失形質細胞腫
であるＮＳＯ細胞系である（Ｃｌａｒｋ， Ｍ．Ｒ．
ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ， Ｃ． Ｓｏｍａｔｉｃ
Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔ． ７： ６５７ （１９８
１））。
ができる。典型的には、哺乳動物起源の形質細胞腫（ミ
エローマ）を使用することができる。好適型の細胞系は
マウスヒポキサンチン−ホスホリボシル−トランスフェ
ラーゼ（ＨＰＲＴ）欠失形質細胞腫である。このような
細胞系の１種が特に好適である。これは免疫グロブリン
又は免疫グロブリンＨ鎖もしくはＬ鎖を産生又は分泌し
ないＢＡＬＢ／ｃ起源の周知のＨＰＲＴ欠失形質細胞腫
であるＮＳＯ細胞系である（Ｃｌａｒｋ， Ｍ．Ｒ．
ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ， Ｃ． Ｓｏｍａｔｉｃ
Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔ． ７： ６５７ （１９８
１））。
【００４６】少なくとも一部がヒトＴＮＦαに特異的に
結合する抗体を産生する細胞に、不滅化細胞を融合す
る。
結合する抗体を産生する細胞に、不滅化細胞を融合す
る。
【００４７】抗体産生細胞は一般に、ヒトＴＮＦαに対
して免疫されたマウスから得られる。この目的で市販の
ヒトＴＮＦαを使用してもよい。融合後、融合産物から
所望のモノクローナル抗体を分泌する産物をスクリーニ
ングする。
して免疫されたマウスから得られる。この目的で市販の
ヒトＴＮＦαを使用してもよい。融合後、融合産物から
所望のモノクローナル抗体を分泌する産物をスクリーニ
ングする。
【００４８】まず最初にｉｎ ｖｉｔｒｏでＥＬＩＳＡ
試験し、ＴＮＦαに対する抗体を検出する。次に、マウ
スＬＭ細胞でヒトＴＮＦαの細胞毒性活性を中和する能
力を試験する。
試験し、ＴＮＦαに対する抗体を検出する。次に、マウ
スＬＭ細胞でヒトＴＮＦαの細胞毒性活性を中和する能
力を試験する。
【００４９】次に、ｉｎ ｖｉｔｒｏでは組織培養フラ
スコ又は大規模培養装置（例えばＡｃｕｓｙｓｔ， Ｅ
ｎｄｏｔｒｏｎｉｃｓ， Ｃｏｏｎ Ｒａｐｉｄｓ，
Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ）で適切な培養培地で、又はｉｎ
ｖｉｖｏでは実験動物（例えばマウス又はラット）にお
ける腹水腫瘍として、所望のモノクローナル抗体を産生
するクローンの子孫を増殖することができる。
スコ又は大規模培養装置（例えばＡｃｕｓｙｓｔ， Ｅ
ｎｄｏｔｒｏｎｉｃｓ， Ｃｏｏｎ Ｒａｐｉｄｓ，
Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ）で適切な培養培地で、又はｉｎ
ｖｉｖｏでは実験動物（例えばマウス又はラット）にお
ける腹水腫瘍として、所望のモノクローナル抗体を産生
するクローンの子孫を増殖することができる。
【００５０】場合に応じて硫安沈殿、イオン交換クロマ
トグラフィー、高性能液体クロマトグラフィー又は当業
者に周知の他の技術を用いることにより、必要に応じて
抗体を培養培地又は体液から分離することができる。従
って本発明は、ＴＮＦαに対する高い中和活性とＴＮＦ
βに対する中和活性を有するモノクローナル抗体を提供
するものであり、該抗体は、 ａ）その集団が実質的に均質であり、 ｂ）それ自体不滅性細胞系と抗体産生細胞との間のハイ
ブリッドである不滅化細胞により産生され、 ｃ）ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏで高いＴＮＦ
α中和活性を示し、 ｄ）ヒトＴＮＦβを中和し、従って認識することが可能
であり、 ｅ）ヒトＴＮＦαを沈殿させ、 ｆ）最小で実質的に少なくとも２つのモノクローナル抗
体分子を含み且つ典型的には少なくとも４００ｋＤの高
分子量を有する複合体を、ヒトＴＮＦαと共に溶液中で
形成することを特徴とする。
トグラフィー、高性能液体クロマトグラフィー又は当業
者に周知の他の技術を用いることにより、必要に応じて
抗体を培養培地又は体液から分離することができる。従
って本発明は、ＴＮＦαに対する高い中和活性とＴＮＦ
βに対する中和活性を有するモノクローナル抗体を提供
するものであり、該抗体は、 ａ）その集団が実質的に均質であり、 ｂ）それ自体不滅性細胞系と抗体産生細胞との間のハイ
ブリッドである不滅化細胞により産生され、 ｃ）ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏで高いＴＮＦ
α中和活性を示し、 ｄ）ヒトＴＮＦβを中和し、従って認識することが可能
であり、 ｅ）ヒトＴＮＦαを沈殿させ、 ｆ）最小で実質的に少なくとも２つのモノクローナル抗
体分子を含み且つ典型的には少なくとも４００ｋＤの高
分子量を有する複合体を、ヒトＴＮＦαと共に溶液中で
形成することを特徴とする。
【００５１】ＴＮＦα及びＴＮＦβ中和活性により、本
発明のモノクローナル抗体は哺乳動物で使用することが
でき、例えばＴＮＦα及び／又はＴＮＦβが病原効果を
発揮するとして知られている任意の疾患状態において予
防及び／又は治療用として人体で使用することができ
る。典型的には、このような疾患状態は悪液質、敗血症
性ショック、移植片対受容者疾患、ＡＩＤＳ、脳性マラ
リア、慢性関節リウマチ、慢性及び急性炎症性疾患、心
筋虚血及び、ＴＮＦα及び／又はＴＮＦβが有害な役割
を果たすことが既に知られているか又は将来知られるよ
うな他の疾患である。本発明のモノクローナル抗体（例
えばハイブリドーマクローン７８により産生されるモノ
クローナル抗体）を成人に局所又は全身投与するのに適
切な投与量は、体重ｋｇ当たり抗体約２０μｇ〜約１ｍ
ｇであり得る。組成物を１回又は複数回投与することが
でき、投与量及び施用法は治療医により選択される。い
ずれにせよ、医薬調合物は患者を有効に治療又は予防的
に治療するために十分な抗体量を提供すべきである。
発明のモノクローナル抗体は哺乳動物で使用することが
でき、例えばＴＮＦα及び／又はＴＮＦβが病原効果を
発揮するとして知られている任意の疾患状態において予
防及び／又は治療用として人体で使用することができ
る。典型的には、このような疾患状態は悪液質、敗血症
性ショック、移植片対受容者疾患、ＡＩＤＳ、脳性マラ
リア、慢性関節リウマチ、慢性及び急性炎症性疾患、心
筋虚血及び、ＴＮＦα及び／又はＴＮＦβが有害な役割
を果たすことが既に知られているか又は将来知られるよ
うな他の疾患である。本発明のモノクローナル抗体（例
えばハイブリドーマクローン７８により産生されるモノ
クローナル抗体）を成人に局所又は全身投与するのに適
切な投与量は、体重ｋｇ当たり抗体約２０μｇ〜約１ｍ
ｇであり得る。組成物を１回又は複数回投与することが
でき、投与量及び施用法は治療医により選択される。い
ずれにせよ、医薬調合物は患者を有効に治療又は予防的
に治療するために十分な抗体量を提供すべきである。
【００５２】本発明のモノクローナル抗体は単独で調合
してもよいし、又は医薬上許容可能なキャリヤー及び／
又は希釈剤と共に適切な量のモノクローナルを配合する
ことにより他の医薬上活性な物質と共に医薬組成物で調
合してもよい。
してもよいし、又は医薬上許容可能なキャリヤー及び／
又は希釈剤と共に適切な量のモノクローナルを配合する
ことにより他の医薬上活性な物質と共に医薬組成物で調
合してもよい。
【００５３】あるいは、別の医薬上活性な物質による治
療方法と組み合わせて本発明のモノクローナル抗体を投
与することもできる。本発明のモノクローナル抗体と調
合可能、又は組み合わせ治療方法で投与することが可能
な医薬上活性な物質は、例えば他の抗原に対する抗体、
特にモノクローナル抗体であり得、従って、本発明のモ
ノクローナル抗体と、関連疾患状態の病因に関与する他
の抗原に対する１種以上の（モノクローナル）抗体とを
含有する「カクテル」を提供する。
療方法と組み合わせて本発明のモノクローナル抗体を投
与することもできる。本発明のモノクローナル抗体と調
合可能、又は組み合わせ治療方法で投与することが可能
な医薬上活性な物質は、例えば他の抗原に対する抗体、
特にモノクローナル抗体であり得、従って、本発明のモ
ノクローナル抗体と、関連疾患状態の病因に関与する他
の抗原に対する１種以上の（モノクローナル）抗体とを
含有する「カクテル」を提供する。
【００５４】特に治療薬として有用な効果を生じるため
に、本発明のモノクローナル抗体と調合可能、又は組み
合わせ治療方法で投与可能な別の活性物質は、治療すべ
き疾患状態に依存し、例えば市販のγグロブリン及び免
疫グロブリン製品、抗生物質、抗微生物製品、抗細菌及
び抗腫瘍剤又はそれらの２種以上の混合物である。
に、本発明のモノクローナル抗体と調合可能、又は組み
合わせ治療方法で投与可能な別の活性物質は、治療すべ
き疾患状態に依存し、例えば市販のγグロブリン及び免
疫グロブリン製品、抗生物質、抗微生物製品、抗細菌及
び抗腫瘍剤又はそれらの２種以上の混合物である。
【００５５】更に、本発明のモノクローナル抗体は単独
で使用してもよいし、又は抗細菌剤、特に抗新生物剤か
ら生じる副作用を阻止又は改良するために、これらの物
質による組み合わせ治療方法で使用してもよい。治療さ
れ得る典型的な副作用は例えば、悪液質、悪心、嘔吐、
食欲不振、脱毛症、下痢及び好中球減少症である。
で使用してもよいし、又は抗細菌剤、特に抗新生物剤か
ら生じる副作用を阻止又は改良するために、これらの物
質による組み合わせ治療方法で使用してもよい。治療さ
れ得る典型的な副作用は例えば、悪液質、悪心、嘔吐、
食欲不振、脱毛症、下痢及び好中球減少症である。
【００５６】典型的には、抗微生物剤はアミノグリコシ
ド（例えばゲンタマイシン、トブラマイシン）と共にペ
ニシリンを含み得る。もっとも、数種の周知の添加剤
（例えばセファロスポリン）を使用することもできる。
ド（例えばゲンタマイシン、トブラマイシン）と共にペ
ニシリンを含み得る。もっとも、数種の周知の添加剤
（例えばセファロスポリン）を使用することもできる。
【００５７】「抗新生物剤」なる用語は、臨床実地に応
じて単一の抗腫瘍薬及び「カクテル」（即ちこのような
薬剤の混合物）の両方を意味する。
じて単一の抗腫瘍薬及び「カクテル」（即ちこのような
薬剤の混合物）の両方を意味する。
【００５８】本発明の化合物と調合可能、又は組み合わ
せ治療方法で投与可能な抗腫瘍剤は例えば、ドキソルビ
シン、ダウノマイシン、エピルビシン、イダルビシン、
エトポサイド、フルオロウラシル、メファラン、シクロ
ホスファミド、ブレオマイシン、ビンブラスチン及びマ
イトマイシン又はそれらの２種以上の混合物である。
せ治療方法で投与可能な抗腫瘍剤は例えば、ドキソルビ
シン、ダウノマイシン、エピルビシン、イダルビシン、
エトポサイド、フルオロウラシル、メファラン、シクロ
ホスファミド、ブレオマイシン、ビンブラスチン及びマ
イトマイシン又はそれらの２種以上の混合物である。
【００５９】「組み合わせ」治療方法なる用語は、本発
明のモノクローナル抗体を含有する医薬組成物と、別の
医薬上活性な物質を含有する医薬組成物とを別々及び実
質的に同時に投与することを意味する。
明のモノクローナル抗体を含有する医薬組成物と、別の
医薬上活性な物質を含有する医薬組成物とを別々及び実
質的に同時に投与することを意味する。
【００６０】従って、本発明の好適目的は治療を必要と
するヒトを含む哺乳動物の癌の組み合わせ治療方法を提
供することであり、該方法は、 １）本発明のモノクローナル抗体又はその結合フラグメ
ント、及び ２）治療上有用な効果を発揮するのに十分な量及び時間
施用される抗腫瘍剤を投与することからなる。
するヒトを含む哺乳動物の癌の組み合わせ治療方法を提
供することであり、該方法は、 １）本発明のモノクローナル抗体又はその結合フラグメ
ント、及び ２）治療上有用な効果を発揮するのに十分な量及び時間
施用される抗腫瘍剤を投与することからなる。
【００６１】本発明の目的は更に、本発明のモノクロー
ナル抗体又はその結合フラグメントと抗腫瘍剤とを含有
し、抗癌療法で同時、別々又は順次使用するための組み
合わせ調製物としての製品を提供することである。
ナル抗体又はその結合フラグメントと抗腫瘍剤とを含有
し、抗癌療法で同時、別々又は順次使用するための組み
合わせ調製物としての製品を提供することである。
【００６２】従って、本発明のモノクローナル抗体及び
その結合フラグメントは癌を改善するための治療で使用
され得る。本発明のモノクローナル抗体及びその結合フ
ラグメントは、抗腫瘍剤例えばアントラサイクリングリ
コシド（例えば上記のようにドキソルビシン、ダウノマ
イシン、エピルビシン又はイダルビシン）で治療可能な
癌患者に投与され得る。本発明の抗体及びアントラサイ
クリングリコシドのような抗腫瘍剤は、骨髄芽球性白血
病のような白血病、リンパ腫、肉腫、神経芽腫、ウィル
ムス腫、悪性膀胱腫瘍、悪性乳房腫瘍、悪性肺腫瘍又は
悪性甲状腺腫瘍患者の状態を改善するために投与され得
る。
その結合フラグメントは癌を改善するための治療で使用
され得る。本発明のモノクローナル抗体及びその結合フ
ラグメントは、抗腫瘍剤例えばアントラサイクリングリ
コシド（例えば上記のようにドキソルビシン、ダウノマ
イシン、エピルビシン又はイダルビシン）で治療可能な
癌患者に投与され得る。本発明の抗体及びアントラサイ
クリングリコシドのような抗腫瘍剤は、骨髄芽球性白血
病のような白血病、リンパ腫、肉腫、神経芽腫、ウィル
ムス腫、悪性膀胱腫瘍、悪性乳房腫瘍、悪性肺腫瘍又は
悪性甲状腺腫瘍患者の状態を改善するために投与され得
る。
【００６３】更に、例えば図２に示すように本発明の抗
体の高中和活性は、該抗体がヒトＴＮＦαのレセプター
結合部位に近接するか又は該部位内でエピトープを認識
することを示唆する。２種のＴＮＦαレセプターが特徴
付けられている（Ｓｃｈａｌｌ， Ｔ．Ｊ． ｅｔ ａ
ｌ． Ｃｅｌｌ ６１： ３６１ （１９９０）及びＳ
ｍｉｔｈ， Ｃ．Ａ． ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉｅｎｃｅ
２４８：１０１９（１９９０））。
体の高中和活性は、該抗体がヒトＴＮＦαのレセプター
結合部位に近接するか又は該部位内でエピトープを認識
することを示唆する。２種のＴＮＦαレセプターが特徴
付けられている（Ｓｃｈａｌｌ， Ｔ．Ｊ． ｅｔ ａ
ｌ． Ｃｅｌｌ ６１： ３６１ （１９９０）及びＳ
ｍｉｔｈ， Ｃ．Ａ． ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉｅｎｃｅ
２４８：１０１９（１９９０））。
【００６４】両方のレセプターは完全細胞で発現される
とほぼ等しい親和性を有するヒトＴＮＦα及びヒトＴＮ
Ｆβに結合する。しかしながら、２つのレセプターの可
溶性形態はヒトＴＮＦαよりも著しく低い親和性でヒト
ＴＮＦβに結合する（Ｓｅｃｋｉｎｇｅｒ， Ｐ． ｅ
ｔ ａｌ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６４：
１１９６６ （１９８９）及びＥｎｇｅｌｍａｎｎ，
Ｈ． ｅｔ ａｌ．Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．
２６５： １５３１ （１９９０））。この結果、レセ
プターの細胞外領域の可溶化はヒトＴＮＦα及びヒトＴ
ＮＦβに対する相対親和性に変化をもたらすと予想され
る。本発明のモノクローナル抗体がヒトＴＮＦαのレセ
プター結合部位内でエピトープを認識するならば、該抗
体はＴＮＦαレセプターと同様に機能的に挙動し、即ち
ヒトＴＮＦα及びヒトＴＮＦβの両方を認識する。該モ
ノクローナル抗体は可溶性分子であるので、可溶性ＴＮ
Ｆαレセプターと同様に機能的に挙動し、即ちヒトＴＮ
Ｆβよりも著しく高い親和性でヒトＴＮＦαに結合す
る。図３はこれを実証する。ヒトＴＮＦβの場合、１μ
ｇ／ｍｌの該抗体の存在下対不在下の半最大生物活性の
比は６．３である。従って、該モノクローナル抗体は可
溶性ＴＮＦαレセプターと同様にヒトＴＮＦα及びヒト
ＴＮＦβに結合すると予想される。従って、当業者に周
知の標準技術（一般に、Ａｎｔｉ−ｉｄｉｏｔｙｐｅ
ｓ， ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ ｍｉｍｉｃｒｙ， Ｌｉｎｔｈｉｃｕｍ， Ｄ．
Ｓ． ａｎｄ Ｆａｒｉｄ， Ｎ．Ｒ．， Ｅｄｓ．，
Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−ＶｅｒｌａｇＨｅｉｄｅｌｂｅｒ
ｇ， １９８８参照）に従ってヒトＴＮＦαと同様に本
発明のモノクローナル抗体に結合する抗イディオタイプ
抗体を得るために、該抗体は免疫原として使用するのに
最適である。従って、ＴＮＦαと同様にＴＮＦαレセプ
ターに結合することが可能であり、従ってＴＮＦαの生
物活性に類似するこれらのモノクローナル抗イディオタ
イプ抗体は、ＴＮＦαの投与が有益な役割を果たし得る
疾患で治療薬として有用であり得る。これらの疾患状態
は例えば、本発明の抗イディオタイプ抗体をＴＮＦαと
同様に単独又は、好ましくは組み合わせ治療方法の一部
として投与することが可能な癌（ＭＵＬＥ， Ｊ．Ｊ．
ｅｔａｌ． Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅ ｄ． １７１： ６
２９（１９９０））及び所定の自己免疫疾患（Ｊａｃｏ
ｂ Ｏ．Ｊ． ａｎｄ ＭｃＤｅｖｉｔｔ， Ｈ．
Ｏ．， Ｎａｔｕｒｅ ３３１： ３５６（１９８
８））である。
とほぼ等しい親和性を有するヒトＴＮＦα及びヒトＴＮ
Ｆβに結合する。しかしながら、２つのレセプターの可
溶性形態はヒトＴＮＦαよりも著しく低い親和性でヒト
ＴＮＦβに結合する（Ｓｅｃｋｉｎｇｅｒ， Ｐ． ｅ
ｔ ａｌ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６４：
１１９６６ （１９８９）及びＥｎｇｅｌｍａｎｎ，
Ｈ． ｅｔ ａｌ．Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．
２６５： １５３１ （１９９０））。この結果、レセ
プターの細胞外領域の可溶化はヒトＴＮＦα及びヒトＴ
ＮＦβに対する相対親和性に変化をもたらすと予想され
る。本発明のモノクローナル抗体がヒトＴＮＦαのレセ
プター結合部位内でエピトープを認識するならば、該抗
体はＴＮＦαレセプターと同様に機能的に挙動し、即ち
ヒトＴＮＦα及びヒトＴＮＦβの両方を認識する。該モ
ノクローナル抗体は可溶性分子であるので、可溶性ＴＮ
Ｆαレセプターと同様に機能的に挙動し、即ちヒトＴＮ
Ｆβよりも著しく高い親和性でヒトＴＮＦαに結合す
る。図３はこれを実証する。ヒトＴＮＦβの場合、１μ
ｇ／ｍｌの該抗体の存在下対不在下の半最大生物活性の
比は６．３である。従って、該モノクローナル抗体は可
溶性ＴＮＦαレセプターと同様にヒトＴＮＦα及びヒト
ＴＮＦβに結合すると予想される。従って、当業者に周
知の標準技術（一般に、Ａｎｔｉ−ｉｄｉｏｔｙｐｅ
ｓ， ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ ｍｉｍｉｃｒｙ， Ｌｉｎｔｈｉｃｕｍ， Ｄ．
Ｓ． ａｎｄ Ｆａｒｉｄ， Ｎ．Ｒ．， Ｅｄｓ．，
Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−ＶｅｒｌａｇＨｅｉｄｅｌｂｅｒ
ｇ， １９８８参照）に従ってヒトＴＮＦαと同様に本
発明のモノクローナル抗体に結合する抗イディオタイプ
抗体を得るために、該抗体は免疫原として使用するのに
最適である。従って、ＴＮＦαと同様にＴＮＦαレセプ
ターに結合することが可能であり、従ってＴＮＦαの生
物活性に類似するこれらのモノクローナル抗イディオタ
イプ抗体は、ＴＮＦαの投与が有益な役割を果たし得る
疾患で治療薬として有用であり得る。これらの疾患状態
は例えば、本発明の抗イディオタイプ抗体をＴＮＦαと
同様に単独又は、好ましくは組み合わせ治療方法の一部
として投与することが可能な癌（ＭＵＬＥ， Ｊ．Ｊ．
ｅｔａｌ． Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅ ｄ． １７１： ６
２９（１９９０））及び所定の自己免疫疾患（Ｊａｃｏ
ｂ Ｏ．Ｊ． ａｎｄ ＭｃＤｅｖｉｔｔ， Ｈ．
Ｏ．， Ｎａｔｕｒｅ ３３１： ３５６（１９８
８））である。
【００６５】本発明のモノクローナル抗体及び医薬組成
物は皮下、筋肉内、動脈内又は静脈内投与により非経口
投与され得る。
物は皮下、筋肉内、動脈内又は静脈内投与により非経口
投与され得る。
【００６６】本発明のモノクローナル抗体を含有する医
薬組成物は通常、従来方法に従って製造される。
薬組成物は通常、従来方法に従って製造される。
【００６７】一般に、本発明の医薬組成物によるキャリ
ヤー及び／又は希釈剤は、アルコール／水溶液、エマル
ジョン、又は懸濁液を含み、食塩水又は緩衝媒質を含
む。非経口賦形剤は塩化ナトリウム溶液、リンゲルぶど
う糖、ぶどう糖及び塩化ナトリウム、乳酸化リンゲル又
は脂肪油を含む。静脈内賦形剤は、リンゲルぶどう糖等
をベースとするような流体及び栄養補充物、電解質補充
物を含む。例えば抗微生物剤、酸化防止剤、キレート化
剤、不活性ガス等のような保存剤及び他の添加剤も配合
することができる。一般に、Ｒｅｍｉｎ ｇｔｏｎ’ｓ
Ｐｈａｒｍ ａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃ ｉｅｎｃｅｓ，
１６ｔｈ Ｅｄ．， Ｍａｃｋ， ｅｄｓ．， １９８
０を参照されたい。
ヤー及び／又は希釈剤は、アルコール／水溶液、エマル
ジョン、又は懸濁液を含み、食塩水又は緩衝媒質を含
む。非経口賦形剤は塩化ナトリウム溶液、リンゲルぶど
う糖、ぶどう糖及び塩化ナトリウム、乳酸化リンゲル又
は脂肪油を含む。静脈内賦形剤は、リンゲルぶどう糖等
をベースとするような流体及び栄養補充物、電解質補充
物を含む。例えば抗微生物剤、酸化防止剤、キレート化
剤、不活性ガス等のような保存剤及び他の添加剤も配合
することができる。一般に、Ｒｅｍｉｎ ｇｔｏｎ’ｓ
Ｐｈａｒｍ ａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃ ｉｅｎｃｅｓ，
１６ｔｈ Ｅｄ．， Ｍａｃｋ， ｅｄｓ．， １９８
０を参照されたい。
【００６８】通常、ＴＮＦαが病原効果を発揮する疾患
状態において、体液中のＴＮＦα濃度は健康な個体の同
一体液中で検出可能な濃度に比較して増加する。従っ
て、これらの体液中のＴＮＦα濃度の決定は診断及び予
後値であり得る。
状態において、体液中のＴＮＦα濃度は健康な個体の同
一体液中で検出可能な濃度に比較して増加する。従っ
て、これらの体液中のＴＮＦα濃度の決定は診断及び予
後値であり得る。
【００６９】従って本発明の別の側面は、本発明のモノ
クローナル抗体の生物特性が特に有利であるようなイム
ノアッセイを提供することである。本発明の目的のため
に、本発明のモノクローナル抗体により検出されるヒト
ＴＮＦαは生物流体又は組織中に存在し得る。未知量の
ヒトＴＮＦαを含有する個体から得た任意のサンプルを
使用することができる。一般に、サンプルは例えば血
液、血清、血漿等のような液体である。
クローナル抗体の生物特性が特に有利であるようなイム
ノアッセイを提供することである。本発明の目的のため
に、本発明のモノクローナル抗体により検出されるヒト
ＴＮＦαは生物流体又は組織中に存在し得る。未知量の
ヒトＴＮＦαを含有する個体から得た任意のサンプルを
使用することができる。一般に、サンプルは例えば血
液、血清、血漿等のような液体である。
【００７０】本発明のモノクローナル抗体はイムノアッ
セイで使用するのに特に適しており、液相で使用しても
よいし、固相支持体に結合してもよい。更に、これらの
イムノアッセイにおけるモノクローナル抗体は種々の方
法で検出可能に標識され得る。
セイで使用するのに特に適しており、液相で使用しても
よいし、固相支持体に結合してもよい。更に、これらの
イムノアッセイにおけるモノクローナル抗体は種々の方
法で検出可能に標識され得る。
【００７１】本発明のモノクローナル抗体を結合するこ
とができ且つヒトＴＮＦαの存在を検出するのに使用可
能な多数の支持体が存在する。周知の支持体は、ガラ
ス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デ
キストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然又は改質セル
ロース、ポリアクリルアミド、アガロース及び磁鉄鉱を
含む。支持体の性質は、本発明の目的のためにある程度
まで可溶性であるか又は不溶性であり得る。当業者はモ
ノクローナル抗体を結合するための多くの他の適切な支
持体キャリヤーに着目し、又は慣用実験を使用すること
によりこれを確認することができよう。
とができ且つヒトＴＮＦαの存在を検出するのに使用可
能な多数の支持体が存在する。周知の支持体は、ガラ
ス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デ
キストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然又は改質セル
ロース、ポリアクリルアミド、アガロース及び磁鉄鉱を
含む。支持体の性質は、本発明の目的のためにある程度
まで可溶性であるか又は不溶性であり得る。当業者はモ
ノクローナル抗体を結合するための多くの他の適切な支
持体キャリヤーに着目し、又は慣用実験を使用すること
によりこれを確認することができよう。
【００７２】当業者に周知の多種のラベル及び標識方法
が存在する。本発明で使用可能なラベルの型の非限定的
な例は、酵素、放射性同位体、蛍光化合物、化学発光化
合物、生物発光化合物及び金属キレートを含む。当業者
はモノクローナル抗体に結合するための他の適切なラベ
ルを知っており、又は慣用実験を使用することによりこ
れを確認することができよう。更に、これらのラベルを
モノクローナル抗体に結合するには、当業者に周知の標
準技術を使用することができる。
が存在する。本発明で使用可能なラベルの型の非限定的
な例は、酵素、放射性同位体、蛍光化合物、化学発光化
合物、生物発光化合物及び金属キレートを含む。当業者
はモノクローナル抗体に結合するための他の適切なラベ
ルを知っており、又は慣用実験を使用することによりこ
れを確認することができよう。更に、これらのラベルを
モノクローナル抗体に結合するには、当業者に周知の標
準技術を使用することができる。
【００７３】本発明のモノクローナル抗体を検出可能に
標識することが可能な方法の１つは、該抗体を酵素に結
合することである。この酵素はその後、基質に暴露され
ると、基質と反応し、例えば分光光度法又は蛍光光度法
により検出され得る化学的成分を生成する。本発明のモ
ノクローナル抗体を検出可能に標識するために使用可能
な酵素の例は、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌
ヌクレアーゼ、Δ−Ｖ−ステロイドイソメラーゼ、酵母
アルコールデヒドロゲナーゼ、α−ａ−グリセロリン酸
デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、西
洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、
アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラ
クトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラ
ーゼ、グルコース−VI−リン酸デヒドロゲナーゼ、グル
コアミラーゼ及びアセチルコリンエステラーゼを含む。
標識することが可能な方法の１つは、該抗体を酵素に結
合することである。この酵素はその後、基質に暴露され
ると、基質と反応し、例えば分光光度法又は蛍光光度法
により検出され得る化学的成分を生成する。本発明のモ
ノクローナル抗体を検出可能に標識するために使用可能
な酵素の例は、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌
ヌクレアーゼ、Δ−Ｖ−ステロイドイソメラーゼ、酵母
アルコールデヒドロゲナーゼ、α−ａ−グリセロリン酸
デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、西
洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、
アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラ
クトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラ
ーゼ、グルコース−VI−リン酸デヒドロゲナーゼ、グル
コアミラーゼ及びアセチルコリンエステラーゼを含む。
【００７４】本発明のモノクローナル抗体は更に、その
後、γカウンター又はシンチレーションカウンターを使
用するような手段により決定され得る放射性同位体で標
識され得る。本発明の目的に特に有用な同位体は、
3Ｈ、125Ｉ、131Ｉ、32Ｐ、35Ｓ、14Ｃ、51Ｃｒ、36Ｃ
ｌ、57Ｃｏ、58Ｃｏ、59Ｆｅ及び75Ｓｅである。
後、γカウンター又はシンチレーションカウンターを使
用するような手段により決定され得る放射性同位体で標
識され得る。本発明の目的に特に有用な同位体は、
3Ｈ、125Ｉ、131Ｉ、32Ｐ、35Ｓ、14Ｃ、51Ｃｒ、36Ｃ
ｌ、57Ｃｏ、58Ｃｏ、59Ｆｅ及び75Ｓｅである。
【００７５】モノクローナル抗体を蛍光化合物で標識す
ることも可能である。蛍光標識したモノクローナル抗体
を適正な波長の光に暴露すると、その存在は染料の蛍光
により検出され得る。最も一般的に使用される蛍光標識
化合物としては、フルオレセインイソチオシアネート、
ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロ
フィコシアニン、オフタルデヒド及びフルオレサミンを
挙げることができる。
ることも可能である。蛍光標識したモノクローナル抗体
を適正な波長の光に暴露すると、その存在は染料の蛍光
により検出され得る。最も一般的に使用される蛍光標識
化合物としては、フルオレセインイソチオシアネート、
ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロ
フィコシアニン、オフタルデヒド及びフルオレサミンを
挙げることができる。
【００７６】本発明のモノクローナル抗体は、152Ｅｕ
又はランタン系列の他の金属のような蛍光発光金属を使
用して検出可能に標識され得る。これらの金属はジエチ
レントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）又はエチレンジ
アミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）のような金属キレート化
基を使用して抗体分子に結合され得る。
又はランタン系列の他の金属のような蛍光発光金属を使
用して検出可能に標識され得る。これらの金属はジエチ
レントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）又はエチレンジ
アミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）のような金属キレート化
基を使用して抗体分子に結合され得る。
【００７７】本発明のモノクローナル抗体は更に、化学
発光化合物に結合することにより検出可能に標識され得
る。化学発光化合物で標識したモノクローナル抗体の存
在はその後、化学反応の過程で生じる発光の存在を検出
することにより決定される。特に有用な化学発光標識化
合物の例は、ルミノール、イソルミノール、セロマティ
ックアクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジ
ニウム塩及びシュウ酸エステルである。
発光化合物に結合することにより検出可能に標識され得
る。化学発光化合物で標識したモノクローナル抗体の存
在はその後、化学反応の過程で生じる発光の存在を検出
することにより決定される。特に有用な化学発光標識化
合物の例は、ルミノール、イソルミノール、セロマティ
ックアクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジ
ニウム塩及びシュウ酸エステルである。
【００７８】同様に、本発明のモノクローナル抗体を標
識するために生物発光化合物を使用してもよい。生物発
光は、触媒タンパク質が化学発光反応の効率を増加する
ような生物系で見いだされる化学発光の型である。生物
発光モノクローナル抗体の存在は、発光の存在を検出す
ることにより決定される。標識の目的に重要な生物発光
化合物はルシフェリン、ルシフェラーゼ及びエクオリン
である。
識するために生物発光化合物を使用してもよい。生物発
光は、触媒タンパク質が化学発光反応の効率を増加する
ような生物系で見いだされる化学発光の型である。生物
発光モノクローナル抗体の存在は、発光の存在を検出す
ることにより決定される。標識の目的に重要な生物発光
化合物はルシフェリン、ルシフェラーゼ及びエクオリン
である。
【００７９】本発明に関連して使用した場合により高い
感度をもたらし得る別の技術は、本発明のモノクローナ
ル抗体を低分子量ハプテンに結合する方法である。ハプ
テンはその後、第２の反応により特異的に検出され得
る。例えば、（アビジンと反応する）ビオチン又は（特
異的抗ハプテン抗体と反応する）ジニトロフェノール、
ピリドキサール及びフルオレサミンのようなハプテンを
使用するのが一般的である。
感度をもたらし得る別の技術は、本発明のモノクローナ
ル抗体を低分子量ハプテンに結合する方法である。ハプ
テンはその後、第２の反応により特異的に検出され得
る。例えば、（アビジンと反応する）ビオチン又は（特
異的抗ハプテン抗体と反応する）ジニトロフェノール、
ピリドキサール及びフルオレサミンのようなハプテンを
使用するのが一般的である。
【００８０】本発明のモノクローナル抗体はキットの製
造に最適である。このようなキットは、バイアル、チュ
ーブ等のような１個以上の容器手段を密封状態に受容す
るように区分される支持手段から構成され得、該容器の
各々は使用すべきイムノアッセイの個々の成分を含む。
本発明の治療用途に適切な個々の成分を含む１個以上の
容器手段を有する区分付き支持手段から構成される類似
のキットを製造してもよい。
造に最適である。このようなキットは、バイアル、チュ
ーブ等のような１個以上の容器手段を密封状態に受容す
るように区分される支持手段から構成され得、該容器の
各々は使用すべきイムノアッセイの個々の成分を含む。
本発明の治療用途に適切な個々の成分を含む１個以上の
容器手段を有する区分付き支持手段から構成される類似
のキットを製造してもよい。
【００８１】キットで使用又はキットに組み込み可能な
イムノアッセイの型は多数である。本発明の抗体を使用
することができるイムノアッセイのいくつかの典型的な
例は、コンペティティブアッセイ及び免疫定量又はサン
ドイッチイムノアッセイである。
イムノアッセイの型は多数である。本発明の抗体を使用
することができるイムノアッセイのいくつかの典型的な
例は、コンペティティブアッセイ及び免疫定量又はサン
ドイッチイムノアッセイである。
【００８２】「免疫定量アッセイ」又は「サンドイッチ
イムノアッセイ」なる用語は、同時サンドイッチ、正方
向サンドイッチ及び逆方向サンドイッチイムノアッセイ
を包含する。これらの用語は当業者に十分理解されてい
る。当業者は更に、本発明のモノクローナル抗体が現在
知られているか又は将来開発され得る他の種々の型のイ
ムノアッセイで有用であり得ることを理解できよう。こ
れらのイムノアッセイは本発明の範囲に含まれるものと
意図される。
イムノアッセイ」なる用語は、同時サンドイッチ、正方
向サンドイッチ及び逆方向サンドイッチイムノアッセイ
を包含する。これらの用語は当業者に十分理解されてい
る。当業者は更に、本発明のモノクローナル抗体が現在
知られているか又は将来開発され得る他の種々の型のイ
ムノアッセイで有用であり得ることを理解できよう。こ
れらのイムノアッセイは本発明の範囲に含まれるものと
意図される。
【００８３】正方向サンドイッチイムノアッセイによる
と、サンプルをまず最初にヒトＴＮＦαに対するモノク
ローナル抗体を含有する固相免疫吸着剤と共にインキュ
ベートする。インキュベーションは、サンプル中の抗原
を固相中の固定抗体に結合させるために十分な時間続け
られる。第１のインキュベーション後、固相免疫吸着剤
をインキュベーション混合物から分離し、洗浄し、過剰
の抗原及びサンプル中に同様に存在し得る他の有害物質
（例えば非特異的結合タンパク質）を除去する。次いで
固定抗体に結合したヒトＴＮＦαを含む固相免疫吸着剤
を、可溶性標識抗体と共に第２の時間インキュベートす
る。第２のインキュベーション後、再び洗浄し、固相免
疫吸着剤から未結合標識抗体を除去し、非特異的に結合
した標識抗体を除去する。次に、固相免疫吸着剤に結合
した標識抗体を検出し、検出した標識抗体の量を元のサ
ンプル中に存在する抗原量の直接規準として使用する。
あるいは、免疫吸着剤複合体に会合しない標識抗体も検
出することができ、その場合、規準はサンプル中に存在
する抗原量に反比例する。正方向サンドイッチアッセイ
は例えば米国特許第３８６７５１７号、４０１２２９４
号及び４３７６１１０号に記載されている。
と、サンプルをまず最初にヒトＴＮＦαに対するモノク
ローナル抗体を含有する固相免疫吸着剤と共にインキュ
ベートする。インキュベーションは、サンプル中の抗原
を固相中の固定抗体に結合させるために十分な時間続け
られる。第１のインキュベーション後、固相免疫吸着剤
をインキュベーション混合物から分離し、洗浄し、過剰
の抗原及びサンプル中に同様に存在し得る他の有害物質
（例えば非特異的結合タンパク質）を除去する。次いで
固定抗体に結合したヒトＴＮＦαを含む固相免疫吸着剤
を、可溶性標識抗体と共に第２の時間インキュベートす
る。第２のインキュベーション後、再び洗浄し、固相免
疫吸着剤から未結合標識抗体を除去し、非特異的に結合
した標識抗体を除去する。次に、固相免疫吸着剤に結合
した標識抗体を検出し、検出した標識抗体の量を元のサ
ンプル中に存在する抗原量の直接規準として使用する。
あるいは、免疫吸着剤複合体に会合しない標識抗体も検
出することができ、その場合、規準はサンプル中に存在
する抗原量に反比例する。正方向サンドイッチアッセイ
は例えば米国特許第３８６７５１７号、４０１２２９４
号及び４３７６１１０号に記載されている。
【００８４】正方向免疫定量アッセイを実施する場合、
方法はより詳細には、（ａ）まず最初にサンプルと固相
結合抗体との混合物を形成し、サンプル中の抗原を固相
結合抗体に結合させるために十分な時間及び条件で混合
物をインキュベートする段階と、（ｂ）段階（ａ）の該
インキュベーション後、検出可能に標識した抗体を混合
物に加え、標識抗体を固相免疫吸着剤に結合させるため
に十分な時間及び条件下で新しく形成された混合物をイ
ンキュベートする段階と、（ｃ）段階（ｂ）のインキュ
ベーション後に混合物から固相免疫吸着剤を分離する段
階と、（ｄ）固相免疫吸着剤に結合した標識抗体を検出
するか、又は固相免疫吸着剤に会合しない抗体を検出す
る段階とを含む。
方法はより詳細には、（ａ）まず最初にサンプルと固相
結合抗体との混合物を形成し、サンプル中の抗原を固相
結合抗体に結合させるために十分な時間及び条件で混合
物をインキュベートする段階と、（ｂ）段階（ａ）の該
インキュベーション後、検出可能に標識した抗体を混合
物に加え、標識抗体を固相免疫吸着剤に結合させるため
に十分な時間及び条件下で新しく形成された混合物をイ
ンキュベートする段階と、（ｃ）段階（ｂ）のインキュ
ベーション後に混合物から固相免疫吸着剤を分離する段
階と、（ｄ）固相免疫吸着剤に結合した標識抗体を検出
するか、又は固相免疫吸着剤に会合しない抗体を検出す
る段階とを含む。
【００８５】逆方向サンドイッチアッセイによると、サ
ンプルをまず最初に標識抗体と共にインキュベートし、
その後、複数の固定抗体を含有する固相免疫吸着剤を加
え、第２のインキュベーションを行う。第２のインキュ
ベーション後に洗浄を行うが、正方向サンドイッチアッ
セイの最初の洗浄段階は不要である。逆方向サンドイッ
チアッセイは例えば米国特許第４０９８８７６号及び４
３７６１１０号に記載されている。
ンプルをまず最初に標識抗体と共にインキュベートし、
その後、複数の固定抗体を含有する固相免疫吸着剤を加
え、第２のインキュベーションを行う。第２のインキュ
ベーション後に洗浄を行うが、正方向サンドイッチアッ
セイの最初の洗浄段階は不要である。逆方向サンドイッ
チアッセイは例えば米国特許第４０９８８７６号及び４
３７６１１０号に記載されている。
【００８６】逆方向免疫定量アッセイを実施する場合、
方法はより詳細には、（ａ）まず最初にサンプル中の抗
原を標識抗体に結合させるために十分な時間及び条件下
で検出可能に標識した可溶性抗体とサンプルとの混合物
を形成する段階と、（ｂ）段階（ａ）のインキュベーシ
ョン後、固相結合抗体を混合物に加え、標識抗体に結合
した抗原を固相抗体に結合させるために十分な時間及び
条件下で新しく形成された混合物をインキュベートする
段階と、（ｃ）段階（ｂ）のインキュベーション後にイ
ンキュベート混合物から固相免疫吸着剤を分離する段階
と、（ｄ）固相免疫吸着剤に結合した標識抗体を検出す
るか、又は固相免疫吸着剤に会合しない標識抗体を検出
する段階とを含む。
方法はより詳細には、（ａ）まず最初にサンプル中の抗
原を標識抗体に結合させるために十分な時間及び条件下
で検出可能に標識した可溶性抗体とサンプルとの混合物
を形成する段階と、（ｂ）段階（ａ）のインキュベーシ
ョン後、固相結合抗体を混合物に加え、標識抗体に結合
した抗原を固相抗体に結合させるために十分な時間及び
条件下で新しく形成された混合物をインキュベートする
段階と、（ｃ）段階（ｂ）のインキュベーション後にイ
ンキュベート混合物から固相免疫吸着剤を分離する段階
と、（ｄ）固相免疫吸着剤に結合した標識抗体を検出す
るか、又は固相免疫吸着剤に会合しない標識抗体を検出
する段階とを含む。
【００８７】同時サンドイッチアッセイによると、サン
プルと、複数の抗体を固定され且つ標識可溶性抗体を有
する免疫吸着剤とを１つのインキュベーション段階で同
時にインキュベートする。同時アッセイは単一のインキ
ュベーションしか必要とせず、洗浄段階を欠く。同時ア
ッセイの使用は断然好適方法である。この型のアッセイ
は取り扱いが容易であり、均質性、再現性、アッセイの
線形性及び高精度が得られる。抗原、抗体を固定した固
相免疫吸着剤及び標識可溶性抗体を含むサンプルを、抗
原を固定抗体及び可溶性抗体に結合させるに十分な条件
及び時間インキュベートする。一般に、可能な限り多量
の抗原を結合するために十分なインキュベーション条件
を提供することが望ましく、その結果、固相への標識抗
体の結合を最大にし、信号を増加することができる。典
型的な時間及び温度条件は約４５℃で２時間、又は約３
７℃で１２時間である。
プルと、複数の抗体を固定され且つ標識可溶性抗体を有
する免疫吸着剤とを１つのインキュベーション段階で同
時にインキュベートする。同時アッセイは単一のインキ
ュベーションしか必要とせず、洗浄段階を欠く。同時ア
ッセイの使用は断然好適方法である。この型のアッセイ
は取り扱いが容易であり、均質性、再現性、アッセイの
線形性及び高精度が得られる。抗原、抗体を固定した固
相免疫吸着剤及び標識可溶性抗体を含むサンプルを、抗
原を固定抗体及び可溶性抗体に結合させるに十分な条件
及び時間インキュベートする。一般に、可能な限り多量
の抗原を結合するために十分なインキュベーション条件
を提供することが望ましく、その結果、固相への標識抗
体の結合を最大にし、信号を増加することができる。典
型的な時間及び温度条件は約４５℃で２時間、又は約３
７℃で１２時間である。
【００８８】標識抗体は不溶性であり、固定抗体は固相
支持体に結合されているので、抗原は典型的には固定抗
体よりも標識抗体により迅速に結合する。このため、標
識抗体は固定抗体よりも低濃度で使用することができ、
更に、標識抗体に高比活性を使用することが好ましい。
例えば、本発明の標識抗体は約１〜５０ｎｇ／アッセイ
の濃度で使用することができ、固定抗体は１０〜５００
ｎｇ／アッセイ／抗体の濃度を有し得る。放射性標識す
る場合、抗体は例えば放射性ヨウ素１／抗体分子、又は
放射性ヨウ素２以上／抗体分子の比活性をもち得る。
支持体に結合されているので、抗原は典型的には固定抗
体よりも標識抗体により迅速に結合する。このため、標
識抗体は固定抗体よりも低濃度で使用することができ、
更に、標識抗体に高比活性を使用することが好ましい。
例えば、本発明の標識抗体は約１〜５０ｎｇ／アッセイ
の濃度で使用することができ、固定抗体は１０〜５００
ｎｇ／アッセイ／抗体の濃度を有し得る。放射性標識す
る場合、抗体は例えば放射性ヨウ素１／抗体分子、又は
放射性ヨウ素２以上／抗体分子の比活性をもち得る。
【００８９】多価抗原を含有するサンプルで同時免疫定
量アッセイを実施する場合、方法はより詳細には、
（ａ）サンプル、固相結合抗体及び可溶性標識抗体を含
む混合物を同時に形成する段階と、（ｂ）サンプル中の
抗原を固定及び標識抗体の両方に結合させるために十分
な時間及び条件下で段階（ａ）で形成された混合物をイ
ンキュベートする段階と、（ｃ）インキュベーション後
にインキュベーション混合物から固相免疫吸着剤を分離
する段階と、（ｄ）固相免疫吸着剤に結合した標識抗体
を検出するか、又は会合しなかった標識抗体を検出する
段階とを含む。
量アッセイを実施する場合、方法はより詳細には、
（ａ）サンプル、固相結合抗体及び可溶性標識抗体を含
む混合物を同時に形成する段階と、（ｂ）サンプル中の
抗原を固定及び標識抗体の両方に結合させるために十分
な時間及び条件下で段階（ａ）で形成された混合物をイ
ンキュベートする段階と、（ｃ）インキュベーション後
にインキュベーション混合物から固相免疫吸着剤を分離
する段階と、（ｄ）固相免疫吸着剤に結合した標識抗体
を検出するか、又は会合しなかった標識抗体を検出する
段階とを含む。
【００９０】当然のことながら、標識及び固定抗体の比
濃度、インキュベーション温度及び時間、並びに他のア
ッセイ条件は、サンプル中の抗原濃度、サンプルの種類
等を含む種々の因子に依存して変化し得る。当業者は、
慣用実験を使用することにより各決定の操作及び最適ア
ッセイ条件を決定することができよう。
濃度、インキュベーション温度及び時間、並びに他のア
ッセイ条件は、サンプル中の抗原濃度、サンプルの種類
等を含む種々の因子に依存して変化し得る。当業者は、
慣用実験を使用することにより各決定の操作及び最適ア
ッセイ条件を決定することができよう。
【００９１】インキュベーション後、固相免疫吸着剤を
インキュベーション混合物から除去する。これは、沈降
及び遠心分離のような既知の分離技術の任意のものによ
り実施することができる。検出は、例えばラベルがγ放
射体である場合はシンチレーションカウンター、ラベル
が蛍光材料である場合は蛍光光度計により実施すること
ができる。酵素ラベルの場合、検出は酵素の基質を使用
する比色分析法により実施され得る。
インキュベーション混合物から除去する。これは、沈降
及び遠心分離のような既知の分離技術の任意のものによ
り実施することができる。検出は、例えばラベルがγ放
射体である場合はシンチレーションカウンター、ラベル
が蛍光材料である場合は蛍光光度計により実施すること
ができる。酵素ラベルの場合、検出は酵素の基質を使用
する比色分析法により実施され得る。
【００９２】洗浄、撹拌、振盪、濾過等のような他の段
階は当然、常法通り又は任意の特定の状況の必要に応じ
てアッセイに加えられる。
階は当然、常法通り又は任意の特定の状況の必要に応じ
てアッセイに加えられる。
【００９３】従来使用されており且つ本発明で使用可能
な多数の固相免疫吸着剤が存在する。周知の免疫吸着剤
は、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、デキスト
ラン、ナイロン及び他の材料から形成されるビーズ、こ
のような材料等から形成されるか又はこのような材料等
で被覆されたチューブを含む。固定抗体はアミドもしく
はエステル結合を介する共有結合のような技術、又は吸
着により固相免疫吸着剤に共有的又は物理的に結合され
得る。多くの他の適切な固相免疫吸着剤及び該吸着剤に
抗体を固定するための方法は当業者に知られており、又
はもはや慣用実験を使用しなくてもこれを確認すること
ができよう。
な多数の固相免疫吸着剤が存在する。周知の免疫吸着剤
は、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、デキスト
ラン、ナイロン及び他の材料から形成されるビーズ、こ
のような材料等から形成されるか又はこのような材料等
で被覆されたチューブを含む。固定抗体はアミドもしく
はエステル結合を介する共有結合のような技術、又は吸
着により固相免疫吸着剤に共有的又は物理的に結合され
得る。多くの他の適切な固相免疫吸着剤及び該吸着剤に
抗体を固定するための方法は当業者に知られており、又
はもはや慣用実験を使用しなくてもこれを確認すること
ができよう。
【００９４】以下、実施例により本発明の種々の側面を
更に説明する。この実施例はいずれにせよ本発明を限定
するものではない。
更に説明する。この実施例はいずれにせよ本発明を限定
するものではない。
【００９５】
１．ヒトＴＮＦαによるマウスの免疫感作。
【００９６】完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ，
Ｄｉｆｃｏ， Ｄｅｔｒｏｉｔ，Ｍｉｃｈｉｇａｎ，
ＰＢＳ５００μｌに対して５００μｌ）を補充したリン
酸緩衝食塩溶液（ＰＢＳ）で希釈したヒトＴＮＦα（Ｅ
ｓｑｕｉｒｅ Ｃｈｅｍｉｅ ＡＧ， Ｚｕｅｒｉｃ
ｈ， Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を５匹のＢＡＬＢ／ｃ
マウスの後脚に３０μｇ／匹の用量で投与した。
Ｄｉｆｃｏ， Ｄｅｔｒｏｉｔ，Ｍｉｃｈｉｇａｎ，
ＰＢＳ５００μｌに対して５００μｌ）を補充したリン
酸緩衝食塩溶液（ＰＢＳ）で希釈したヒトＴＮＦα（Ｅ
ｓｑｕｉｒｅ Ｃｈｅｍｉｅ ＡＧ， Ｚｕｅｒｉｃ
ｈ， Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を５匹のＢＡＬＢ／ｃ
マウスの後脚に３０μｇ／匹の用量で投与した。
【００９７】第１の免疫感作から１４日後、上記のよう
にＣＦＡを補充したＰＢＳで希釈したヒトＴＮＦαを同
一マウスに３０μｇ／匹の用量で皮下投与した。
にＣＦＡを補充したＰＢＳで希釈したヒトＴＮＦαを同
一マウスに３０μｇ／匹の用量で皮下投与した。
【００９８】第２の免疫感作から１４日後、ＰＢＳで希
釈したヒトＴＮＦαを同一マウスに３０μｇ／匹の用量
で腹腔内投与した。
釈したヒトＴＮＦαを同一マウスに３０μｇ／匹の用量
で腹腔内投与した。
【００９９】第３の免疫感作から１４日後、ヒトＴＮＦ
αを第３の免疫感作と同一用量及び同一条件で同一マウ
スに投与した。
αを第３の免疫感作と同一用量及び同一条件で同一マウ
スに投与した。
【０１００】３日後、ＥＬＩＳＡで決定される血清中抗
ＴＮＦα抗体の最高力価を有するマウスを殺した。
ＴＮＦα抗体の最高力価を有するマウスを殺した。
【０１０１】２．抗ＴＮＦα抗体を産生するマウス脾細
胞の不滅化。
胞の不滅化。
【０１０２】脾臓を無菌下に取り出し、均質化し、得ら
れた細胞懸濁液を遠心分離した。同時にＮＳＯミエロー
マ細胞（＞９９％生存可能細胞）を同様に遠心分離し
た。次に両方のペレットを完全ＲＰＭＩ培地に再懸濁し
た。完全ＲＰＭＩ培地は、１ｍＭピルビン酸ナトリウム
（Ｇｉｂｃｏ， Ｐａｉｓｌｅｙ， Ｓｃｏｔｌａｎ
ｄ）、非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、ストレプトマイ
シン１００μｇ／ｍｌ、アンホテリシンＢ １．５μｇ
／ｍｌ及び付加的グルタミン（２ｍＭ）を補充したＲＰ
ＭＩ １６４０（Ｆｌｏｗ Ｏｐｅｒａ， Ｉｔａｌ
ｙ）とした。両方の細胞懸濁液を１０：１の脾細胞：ミ
エローマ細胞比で結合した。得られた細胞混合物を１０
分間４００ｇで遠心分離した。培地を廃棄し、融合を生
じるように、１ｍｌのポリエチレングリコール（ＰＥＧ
１５００， Ｓｅｒｖａ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，
Ｗｅｓｔ Ｇｅｒｍａｎｙ， 完全ＲＰＭＩ培地中４０
％ｗ／ｖ）を１分間かけて注意深く滴下した。その後、
完全ＲＰＭＩ培地５ｍｌを５分間かけて加え、その後１
０ｍｌを５分間、最後に１５ｍｌを５分間かけて加え
た。最終懸濁液を１０分間４００ｇで遠心分離し、細胞
５×１０5個／ｍｌ（脾細胞＋ＮＳＯ細胞）の最終細胞
密度を有するように、２０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ，
Ｆｌｏｗ， ５６℃で３０分間熱不活化）を補充した完
全ＲＰＭＩ培地にペレットを再懸濁した。放射線照射し
たマウス腹膜細胞（３０００Ｒａｄ； ２．５×１０4
細胞／ウェル）を予め接種しておいた９６穴組織培養プ
レート（Ｆａｌｃｏｎ Ｎｏ． ３０７２， Ｂｅｃｔ
ｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ， Ｍｉｌａｎ， Ｉｔａｌ
ｙ）の各ウェルに、この懸濁液２００μｌを接種した。
その後、融合産物を含むプレートを２４時間３７℃、５
％ＣＯ2でインキュベートした。その後、２０％ＦＣ
Ｓ、ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジン（Ｈ
ＡＴ、プレート中最終濃度夫々１０-4Ｍ、４×１０-7Ｍ
及び１．６×１０-5Ｍ）を補充した完全ＲＰＭＩ培地５
０μｌを加えた。ＮＳＯ細胞はアミノプテリンの存在下
で死滅し、非融合脾細胞は寿命が短いので、この培養培
地ではハイブリドーマのみが生存可能である。
れた細胞懸濁液を遠心分離した。同時にＮＳＯミエロー
マ細胞（＞９９％生存可能細胞）を同様に遠心分離し
た。次に両方のペレットを完全ＲＰＭＩ培地に再懸濁し
た。完全ＲＰＭＩ培地は、１ｍＭピルビン酸ナトリウム
（Ｇｉｂｃｏ， Ｐａｉｓｌｅｙ， Ｓｃｏｔｌａｎ
ｄ）、非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、ストレプトマイ
シン１００μｇ／ｍｌ、アンホテリシンＢ １．５μｇ
／ｍｌ及び付加的グルタミン（２ｍＭ）を補充したＲＰ
ＭＩ １６４０（Ｆｌｏｗ Ｏｐｅｒａ， Ｉｔａｌ
ｙ）とした。両方の細胞懸濁液を１０：１の脾細胞：ミ
エローマ細胞比で結合した。得られた細胞混合物を１０
分間４００ｇで遠心分離した。培地を廃棄し、融合を生
じるように、１ｍｌのポリエチレングリコール（ＰＥＧ
１５００， Ｓｅｒｖａ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，
Ｗｅｓｔ Ｇｅｒｍａｎｙ， 完全ＲＰＭＩ培地中４０
％ｗ／ｖ）を１分間かけて注意深く滴下した。その後、
完全ＲＰＭＩ培地５ｍｌを５分間かけて加え、その後１
０ｍｌを５分間、最後に１５ｍｌを５分間かけて加え
た。最終懸濁液を１０分間４００ｇで遠心分離し、細胞
５×１０5個／ｍｌ（脾細胞＋ＮＳＯ細胞）の最終細胞
密度を有するように、２０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ，
Ｆｌｏｗ， ５６℃で３０分間熱不活化）を補充した完
全ＲＰＭＩ培地にペレットを再懸濁した。放射線照射し
たマウス腹膜細胞（３０００Ｒａｄ； ２．５×１０4
細胞／ウェル）を予め接種しておいた９６穴組織培養プ
レート（Ｆａｌｃｏｎ Ｎｏ． ３０７２， Ｂｅｃｔ
ｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ， Ｍｉｌａｎ， Ｉｔａｌ
ｙ）の各ウェルに、この懸濁液２００μｌを接種した。
その後、融合産物を含むプレートを２４時間３７℃、５
％ＣＯ2でインキュベートした。その後、２０％ＦＣ
Ｓ、ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジン（Ｈ
ＡＴ、プレート中最終濃度夫々１０-4Ｍ、４×１０-7Ｍ
及び１．６×１０-5Ｍ）を補充した完全ＲＰＭＩ培地５
０μｌを加えた。ＮＳＯ細胞はアミノプテリンの存在下
で死滅し、非融合脾細胞は寿命が短いので、この培養培
地ではハイブリドーマのみが生存可能である。
【０１０３】その後、プレートを３７℃、５％ＣＯ2で
更にインキュベートした。培養物に２日おきに新鮮な培
地を供給した。増殖ハイブリッドは４日目まで目に見え
た。３週間後にアミノプテリンを培地から除去し、５週
目から２０％ＦＣＳを補充した完全ＲＰＭＩ培地を使用
した。
更にインキュベートした。培養物に２日おきに新鮮な培
地を供給した。増殖ハイブリッドは４日目まで目に見え
た。３週間後にアミノプテリンを培地から除去し、５週
目から２０％ＦＣＳを補充した完全ＲＰＭＩ培地を使用
した。
【０１０４】１０〜１４日後、培養物が酵素結合イムノ
ソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）でヒトＴＮＦαに結
合する抗体及びヒトＴＮＦαの数種の生物活性の１つを
中和する抗体を産生する能力を試験した。典型的には、
容易であるという理由から、マウスＬＭ細胞でヒトＴＮ
Ｆαの細胞毒性活性を中和する能力について上清を試験
した（アッセイの詳細については以下の記載を参照）。
放射線照射したマウス腹腔細胞（３０００Ｒａｄ；
２．５×１０4細胞／ウェル）を予め接種した９６穴プ
レート（Ｆａｌｃｏｎ）に０．５細胞／ウェルの割合で
希釈液を制限することにより、最大の中和活性を有する
抗体を産生するハイブリッド細胞をクローニングした。
２週間後、ＴＮＦα特異的抗体を産生する能力について
増殖陽性ウェルを上記２種のアッセイにより試験した。
ソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）でヒトＴＮＦαに結
合する抗体及びヒトＴＮＦαの数種の生物活性の１つを
中和する抗体を産生する能力を試験した。典型的には、
容易であるという理由から、マウスＬＭ細胞でヒトＴＮ
Ｆαの細胞毒性活性を中和する能力について上清を試験
した（アッセイの詳細については以下の記載を参照）。
放射線照射したマウス腹腔細胞（３０００Ｒａｄ；
２．５×１０4細胞／ウェル）を予め接種した９６穴プ
レート（Ｆａｌｃｏｎ）に０．５細胞／ウェルの割合で
希釈液を制限することにより、最大の中和活性を有する
抗体を産生するハイブリッド細胞をクローニングした。
２週間後、ＴＮＦα特異的抗体を産生する能力について
増殖陽性ウェルを上記２種のアッセイにより試験した。
【０１０５】最大の中和活性を有する抗体を産生する１
つのクローンを選択し、更に拡張した。ｉｎ ｖｉｔｒ
ｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ中和活性を正確に定量するため
に、このクローンの上清を試験した。この目的にため
に、まず最初に上清の免疫グロブリン濃度を定量的ＥＬ
ＩＳＡで試験した（アッセイの詳細については以下の説
明を参照のこと）。ｉｎ ｖｉｔｒｏ中和活性を正確に
定量するために、ヒトＴＮＦαの用量を増加しながらモ
ノクローナル抗体１μｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ又は
１０ｎｇ／ｍｌ（６．２５×１０-9Ｍ、６．２５×１０
-10Ｍ又は６．２５×１０-11Ｍ）をコインキュベートし
た。２時間後、マウスＬＭ細胞に残留するヒトＴＮＦα
の細胞毒性活性を決定した。
つのクローンを選択し、更に拡張した。ｉｎ ｖｉｔｒ
ｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ中和活性を正確に定量するため
に、このクローンの上清を試験した。この目的にため
に、まず最初に上清の免疫グロブリン濃度を定量的ＥＬ
ＩＳＡで試験した（アッセイの詳細については以下の説
明を参照のこと）。ｉｎ ｖｉｔｒｏ中和活性を正確に
定量するために、ヒトＴＮＦαの用量を増加しながらモ
ノクローナル抗体１μｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ又は
１０ｎｇ／ｍｌ（６．２５×１０-9Ｍ、６．２５×１０
-10Ｍ又は６．２５×１０-11Ｍ）をコインキュベートし
た。２時間後、マウスＬＭ細胞に残留するヒトＴＮＦα
の細胞毒性活性を決定した。
【０１０６】モノクローナル抗体が密接に関連するポリ
ペプチドＴＮＦβと交差反応するか否かを調べるため
に、ヒトＴＮＦβの用量を増加しながらモノクローナル
抗体１μｇ／ｍｌをコインキュベートし、２時間後、Ｌ
Ｍ細胞に残留するヒトＴＮＦαの細胞毒性活性を決定し
た。
ペプチドＴＮＦβと交差反応するか否かを調べるため
に、ヒトＴＮＦβの用量を増加しながらモノクローナル
抗体１μｇ／ｍｌをコインキュベートし、２時間後、Ｌ
Ｍ細胞に残留するヒトＴＮＦαの細胞毒性活性を決定し
た。
【０１０７】次にｉｎ ｖｉｖｏ中和活性を正確に定量
するために、Ｄ−ガラクトサミンと同時投与したＴＮＦ
αにより誘発される致死性ショック症候群からマウスを
保護する能力について種々の量のモノクローナル抗体を
試験した（アッセイの詳細な説明は以下に示す）。
するために、Ｄ−ガラクトサミンと同時投与したＴＮＦ
αにより誘発される致死性ショック症候群からマウスを
保護する能力について種々の量のモノクローナル抗体を
試験した（アッセイの詳細な説明は以下に示す）。
【０１０８】細胞集団の安定性及び均質性を確保するた
めに、ハイブリドーマクローンの細胞を再び上記のよう
にクローニングした。１つのクローン（クローン７８）
を選択し、更に特徴付けするために拡張した。このクロ
ーンにより産生されるモノクローナル抗体は、ＩｇＧ１
サブクラスのＨ鎖とｋクラスのＬ鎖とを有することが判
明した。
めに、ハイブリドーマクローンの細胞を再び上記のよう
にクローニングした。１つのクローン（クローン７８）
を選択し、更に特徴付けするために拡張した。このクロ
ーンにより産生されるモノクローナル抗体は、ＩｇＧ１
サブクラスのＨ鎖とｋクラスのＬ鎖とを有することが判
明した。
【０１０９】３．ヒトＴＮＦα特異的モノクローナル抗
体の特異性の立証。
体の特異性の立証。
【０１１０】図１は、ハイブリドーマ７８により産生さ
れるモノクローナル抗体のヒトＴＮＦαへの結合が、ヒ
トＴＮＦαと共にプレインキュベーション後のみに変化
し、一連の無関係抗原と共にプレインキュベーション後
では変化しないことを示す。無関係抗原は表皮成長因子
（ＥＧＦ）、ソマトスタチン、インターロイキン６（Ｉ
Ｌ６）、トランスフェリン、胸腺ホルモン因子（ＴＨ
Ｆ）、インシュリン、ラット免疫グロブリンＧ抗体であ
る。
れるモノクローナル抗体のヒトＴＮＦαへの結合が、ヒ
トＴＮＦαと共にプレインキュベーション後のみに変化
し、一連の無関係抗原と共にプレインキュベーション後
では変化しないことを示す。無関係抗原は表皮成長因子
（ＥＧＦ）、ソマトスタチン、インターロイキン６（Ｉ
Ｌ６）、トランスフェリン、胸腺ホルモン因子（ＴＨ
Ｆ）、インシュリン、ラット免疫グロブリンＧ抗体であ
る。
【０１１１】４．高いＴＮＦα中和活性とＴＮＦβ中和
活性を有するモノクローナル抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏ中
和活性。
活性を有するモノクローナル抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏ中
和活性。
【０１１２】図２は、ヒトＴＮＦαの用量の増加に伴う
ハイブリドーマクローン７８により産生されるモノクロ
ーナル抗体１μｇ／ｍｌ（６．２５×１０-9Ｍ）の中和
活性を示す。図面から明らかなように、ヒトＴＮＦα単
独では０．１５ｎｇ／ｍｌ（３．３×１０-12Ｍ）で５
０％細胞毒性を発揮する。１μｇ／ｍｌの該モノクロー
ナル抗体の存在下で、ヒトＴＮＦαは約２２９ｎｇ／ｍ
ｌ（４．６×１０-9Ｍ）で５０％の細胞毒性を発揮す
る。このことから明らかなように、１μｇ／ｍｌの該モ
ノクローナル抗体が約２２８ｎｇ／ｍｌのヒトＴＮＦα
を完全に中和する。したがって、１μｇ／ｍｌの該抗体
の存在下対不在下の半最大生物活性の比は約１５２７で
ある。
ハイブリドーマクローン７８により産生されるモノクロ
ーナル抗体１μｇ／ｍｌ（６．２５×１０-9Ｍ）の中和
活性を示す。図面から明らかなように、ヒトＴＮＦα単
独では０．１５ｎｇ／ｍｌ（３．３×１０-12Ｍ）で５
０％細胞毒性を発揮する。１μｇ／ｍｌの該モノクロー
ナル抗体の存在下で、ヒトＴＮＦαは約２２９ｎｇ／ｍ
ｌ（４．６×１０-9Ｍ）で５０％の細胞毒性を発揮す
る。このことから明らかなように、１μｇ／ｍｌの該モ
ノクローナル抗体が約２２８ｎｇ／ｍｌのヒトＴＮＦα
を完全に中和する。したがって、１μｇ／ｍｌの該抗体
の存在下対不在下の半最大生物活性の比は約１５２７で
ある。
【０１１３】ヒトＴＮＦαが三量体として溶液中に存在
すると仮定するなら、モノクローナル抗体は約１．３：
１のモル比でヒトＴＮＦαを中和すると予想することが
できる。
すると仮定するなら、モノクローナル抗体は約１．３：
１のモル比でヒトＴＮＦαを中和すると予想することが
できる。
【０１１４】図３は、ヒトＴＮＦβでは１μｇ／ｍｌの
本発明の該抗体の存在下対不在下の半最大生物活性の比
が約６．３であることを示す。
本発明の該抗体の存在下対不在下の半最大生物活性の比
が約６．３であることを示す。
【０１１５】表２は、６．２５×１０-9Ｍ、６．２５×
１０-10Ｍ及び６．２５×１０-11Ｍの該抗体の不在下又
は存在下でＬＭ細胞に対して５０％の細胞毒性活性を与
えるヒトＴＮＦの用量を示す。表から明らかなように、
該抗体は試験した全用量でヒトＴＮＦαを＜２のモル比
で中和する。
１０-10Ｍ及び６．２５×１０-11Ｍの該抗体の不在下又
は存在下でＬＭ細胞に対して５０％の細胞毒性活性を与
えるヒトＴＮＦの用量を示す。表から明らかなように、
該抗体は試験した全用量でヒトＴＮＦαを＜２のモル比
で中和する。
【０１１６】５．高いＴＮＦα中和活性を有するモノク
ローナル抗体の親和性。
ローナル抗体の親和性。
【０１１７】本発明のモノクローナル抗体の親和性をス
キャッチャード分析により決定した。このために、該モ
ノクローナル抗体１ｎｇ／ｍｌ（６．２５×１０
-12Ｍ）を種々の用量のヨウ素化ヒトＴＮＦαと共にイ
ンキュベートし、その後、抗体結合ヒトＴＮＦαの量を
決定した。
キャッチャード分析により決定した。このために、該モ
ノクローナル抗体１ｎｇ／ｍｌ（６．２５×１０
-12Ｍ）を種々の用量のヨウ素化ヒトＴＮＦαと共にイ
ンキュベートし、その後、抗体結合ヒトＴＮＦαの量を
決定した。
【０１１８】図４から明らかなように、結合データのス
キャッチャードプロットは直線を与えた。表１は該モノ
クローナル抗体へのヒトＴＮＦα結合のパラメーターを
示す。表から明らかなように、親和性定数（Ｋobs）は
３．１６×１０10Ｍ-1であり、該モノクローナル抗体
６．２５×１０-12Ｍにより結合可能なヨウ素化ヒトＴ
ＮＦαの最大量は４．３４×１０-12Ｍである。
キャッチャードプロットは直線を与えた。表１は該モノ
クローナル抗体へのヒトＴＮＦα結合のパラメーターを
示す。表から明らかなように、親和性定数（Ｋobs）は
３．１６×１０10Ｍ-1であり、該モノクローナル抗体
６．２５×１０-12Ｍにより結合可能なヨウ素化ヒトＴ
ＮＦαの最大量は４．３４×１０-12Ｍである。
【０１１９】６．高いＴＮＦα中和活性を有するモノク
ローナル抗体からのヒトＴＮＦαの解離。
ローナル抗体からのヒトＴＮＦαの解離。
【０１２０】ヨウ素化ヒトＴＮＦα（２．５ｎｇ／ｍ
ｌ、５×１０-11Ｍ）をモノクローナル抗体（２ｎｇ／
ｍｌ、１．２５×１０-11Ｍ）と共にプレインキュベー
トし、その後、ヨウ素化ヒトＴＮＦαの再会合を阻止す
るように過剰の非標識ヒトＴＮＦαを加えることにより
解離を測定することにより、該抗体からのヒトＴＮＦα
の解離を決定した。図５は、このような実験の結果を示
す。図から明らかなように、ヨウ素化ヒトＴＮＦαの解
離は直線プロットを与えることにより一次反応曲線に従
う。このプロットから決定したｋ-1値（解離速度定数）
は１．３７×１０-5ｓｅｃ-1（Ｔ1/2＝１４ｈ）であ
る。
ｌ、５×１０-11Ｍ）をモノクローナル抗体（２ｎｇ／
ｍｌ、１．２５×１０-11Ｍ）と共にプレインキュベー
トし、その後、ヨウ素化ヒトＴＮＦαの再会合を阻止す
るように過剰の非標識ヒトＴＮＦαを加えることにより
解離を測定することにより、該抗体からのヒトＴＮＦα
の解離を決定した。図５は、このような実験の結果を示
す。図から明らかなように、ヨウ素化ヒトＴＮＦαの解
離は直線プロットを与えることにより一次反応曲線に従
う。このプロットから決定したｋ-1値（解離速度定数）
は１．３７×１０-5ｓｅｃ-1（Ｔ1/2＝１４ｈ）であ
る。
【０１２１】７．オクテルロニー寒天二重免疫拡散。
【０１２２】図６は、本発明のモノクローナル抗体がヒ
トＴＮＦαを免疫沈降できることを示す。該モノクロー
ナル抗体２０μｇ（中央のトラフ）をヒトＴＮＦα１０
μｇ（左上トラフ）、５μｇ（右上）及び２．５μｇ
（右下）と反応させると、沈降素バンドが形成された。
トＴＮＦαを免疫沈降できることを示す。該モノクロー
ナル抗体２０μｇ（中央のトラフ）をヒトＴＮＦα１０
μｇ（左上トラフ）、５μｇ（右上）及び２．５μｇ
（右下）と反応させると、沈降素バンドが形成された。
【０１２３】ヒトＴＮＦα１．２５μｇ（左下のトラ
フ）では沈降素バンドはもはや見えない。本発明で開示
されるような単一特異的抗体により抗原を沈殿させるた
めには、抗体は多価でなければならず、同一分子で最小
３つの同一エピトープを発現しなければならないことが
知られている（Ｓａｃｈｓ， Ｄ．Ｈ．， ｅｔ ａ
ｌ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １０９： １３００，
１９７２）。ヒトＴＮＦαは溶液中で三量体であると
記載されている（Ｊｏｎｅｓ， Ｅ．Ｙ． ｅｔａｌ．
上掲）が、ヒトＴＮＦαは溶液中で二量体として存在
すると主張する報告もある（Ｐｅｔｅｒｓｅｎ， Ｃ．
Ｍ．， ｅｔ ａｌ． Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ． １９： １８８７， １９８９）。図６の結果
は、本発明のモノクローナル抗体により、ヒトＴＮＦα
を明白に三量体として規定できることを示す。
フ）では沈降素バンドはもはや見えない。本発明で開示
されるような単一特異的抗体により抗原を沈殿させるた
めには、抗体は多価でなければならず、同一分子で最小
３つの同一エピトープを発現しなければならないことが
知られている（Ｓａｃｈｓ， Ｄ．Ｈ．， ｅｔ ａ
ｌ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １０９： １３００，
１９７２）。ヒトＴＮＦαは溶液中で三量体であると
記載されている（Ｊｏｎｅｓ， Ｅ．Ｙ． ｅｔａｌ．
上掲）が、ヒトＴＮＦαは溶液中で二量体として存在
すると主張する報告もある（Ｐｅｔｅｒｓｅｎ， Ｃ．
Ｍ．， ｅｔ ａｌ． Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ． １９： １８８７， １９８９）。図６の結果
は、本発明のモノクローナル抗体により、ヒトＴＮＦα
を明白に三量体として規定できることを示す。
【０１２４】８．ヒトＴＮＦαと高いＴＮＦα中和活性
を有するモノクローナル抗体との混合物の高速高圧液体
クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）サイズ排除プロフィ
ル。
を有するモノクローナル抗体との混合物の高速高圧液体
クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）サイズ排除プロフィ
ル。
【０１２５】図７は、ヒトＴＮＦα単独１００μｇ／ｍ
ｌ（２×１０-6Ｍ）（−−−−パネルＡ）、該モノクロ
ーナル抗体単独１００μｇ／ｍｌ（６．２５×１０
-6Ｍ）（−パネルＡ）、ヒトＴＮＦα１００μｇ／ｍｌ
（２×１０-6Ｍ）とモノクローナル抗体３０μｇ／ｍｌ
（２×１０-6Ｍ）との混合物（パネルＢ）、及びヨウ素
化ヒトＴＮＦα５ｎｇ／ｍｌ（１０-10Ｍ）とモノクロ
ーナル抗体２ｎｇ／ｍｌ（１．３×１０-11Ｍ）との混
合物（パネルＣ）のＦＰＬＣサイズ排除プロフィルを示
す。図面から明らかなように、ヒトＴＮＦα単独は４０
ｋＤに対応する容量で溶離する。ヒトＴＮＦαのこのク
ロマトグラフィー特徴は、オリゴマーＴＮＦαがゲル濾
過で３４〜４０ｋＤの見かけの分子量を示すことが報告
されている他の文献（Ｋｕｍｉｔａｎｉ， Ｍ．Ｇ．，
ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ． ４４
３： ２０５ （１９８８））に一致する。他方、Ｋ
obs計算値より著しく高いか又はこれに近似する試薬濃
度で調製したヒトＴＮＦαとモノクローナル抗体との混
合物は、少なくとも４００ｋＤ、典型的には５７０〜６
００ｋＤの分子量に対応する容量で溶離する複合体を形
成した（パネルＢ及びＣ）。
ｌ（２×１０-6Ｍ）（−−−−パネルＡ）、該モノクロ
ーナル抗体単独１００μｇ／ｍｌ（６．２５×１０
-6Ｍ）（−パネルＡ）、ヒトＴＮＦα１００μｇ／ｍｌ
（２×１０-6Ｍ）とモノクローナル抗体３０μｇ／ｍｌ
（２×１０-6Ｍ）との混合物（パネルＢ）、及びヨウ素
化ヒトＴＮＦα５ｎｇ／ｍｌ（１０-10Ｍ）とモノクロ
ーナル抗体２ｎｇ／ｍｌ（１．３×１０-11Ｍ）との混
合物（パネルＣ）のＦＰＬＣサイズ排除プロフィルを示
す。図面から明らかなように、ヒトＴＮＦα単独は４０
ｋＤに対応する容量で溶離する。ヒトＴＮＦαのこのク
ロマトグラフィー特徴は、オリゴマーＴＮＦαがゲル濾
過で３４〜４０ｋＤの見かけの分子量を示すことが報告
されている他の文献（Ｋｕｍｉｔａｎｉ， Ｍ．Ｇ．，
ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ． ４４
３： ２０５ （１９８８））に一致する。他方、Ｋ
obs計算値より著しく高いか又はこれに近似する試薬濃
度で調製したヒトＴＮＦαとモノクローナル抗体との混
合物は、少なくとも４００ｋＤ、典型的には５７０〜６
００ｋＤの分子量に対応する容量で溶離する複合体を形
成した（パネルＢ及びＣ）。
【０１２６】９．高いＴＮＦα中和活性を有するモノク
ローナル抗体で実施したｉｎ ｖｉｔｒｏ実験の結論。
ローナル抗体で実施したｉｎ ｖｉｔｒｏ実験の結論。
【０１２７】モノクローナル抗体により結合可能且つ中
和可能な最大量のヒトＴＮＦαは約０．７モルＴＮＦα
／モル抗体であるという事実に鑑みてヒトＴＮＦαと該
モノクローナル抗体との反応後に形成される複合体の分
子量（５７０〜６００ｋＤ）を考慮すると、該複合体の
各々は少なくとも２個の該モノクローナル抗体分子と１
個のヒトＴＮＦα分子、典型的にはヒトＴＮＦα２分子
（６エピトープ）を相互に連結する該モノクローナル抗
体３分子（６結合手）から構成される高分子量複合体で
あると結論することができる。
和可能な最大量のヒトＴＮＦαは約０．７モルＴＮＦα
／モル抗体であるという事実に鑑みてヒトＴＮＦαと該
モノクローナル抗体との反応後に形成される複合体の分
子量（５７０〜６００ｋＤ）を考慮すると、該複合体の
各々は少なくとも２個の該モノクローナル抗体分子と１
個のヒトＴＮＦα分子、典型的にはヒトＴＮＦα２分子
（６エピトープ）を相互に連結する該モノクローナル抗
体３分子（６結合手）から構成される高分子量複合体で
あると結論することができる。
【０１２８】このような複合体は、ゲル濾過で検出値に
非常に近い値である５６０〜５８０ｋＤに対応する容量
で溶離すると予想される。結合化学量論に関する結果は
抗原過剰で実施される実験から得たので、ヒトＴＮＦα
／モノクローナル抗体複合体が開鎖構造中の交互ｍＡｂ
７８−ｈｕＴＮＦα分子から構成される場合は除外す
る。その代わりに、ヒトＴＮＦα／モノクローナル抗体
分子が相互に結合して環状構造を形成すると想定する。
環状抗原−抗体複合体のエネルギー利点、したがって優
れた安定性は、二価ハプテン−抗体系で検討され、十分
に研究されている（Ａｒｃｈｅｒ， Ｂ．Ｇ．， ａｎ
ｄ Ｋｒａｋａｕｒ， Ｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ １６： ６１８ （１９７７）； Ｅｒｉｃｋｓｏ
ｎ， Ｊ．Ｗ． ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ ｔ
ｒｙ ３０： ２３５７ （１９９１）； Ｐｏｓｎｅ
ｒ， Ｒ．Ｇ． ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ３０： ２３４８ （１９９１）及びＤｅｍｂｏ，
Ｍ． ａｎｄ Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ， Ｂ．， Ｉ ｍ
ｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔ ｒｙ １５： ３０７ （１９
７８））。実際に解離調査（図５）によると、ヒトＴＮ
Ｆα／モノクローナル抗体複合体は確かに非常に安定
（Ｋ-1＝１．３７×１０-5 ｓｅｃ-1）である。このよ
うな値は、一雌一雄二値結合モード（Ｍａｓｏｎ，Ｄ．
Ｗ． ａｎｄＷｉｌｌｉａｍｓ， Ａ．Ｆ．， Ｂｉｏ
ｃｈｅ ｍ． Ｊ． １８７： １（１９８９）にしたが
って細胞抗原表面に結合するモノクローナル抗体につい
て報告されている値と同程度の大きさであり、別の種の
抗原−抗体相互作用も同様に安定な複合体の形成をもた
らす。さらに、このような環状複合体の形成を介してヒ
トＴＮＦα及び該モノクローナル抗体を最大の安定性の
状態にできるならば、これは、抗原過剰では形成される
最小抗原−抗体複合体が抗体過剰であるという明白に逆
説的な結果を説明する。
非常に近い値である５６０〜５８０ｋＤに対応する容量
で溶離すると予想される。結合化学量論に関する結果は
抗原過剰で実施される実験から得たので、ヒトＴＮＦα
／モノクローナル抗体複合体が開鎖構造中の交互ｍＡｂ
７８−ｈｕＴＮＦα分子から構成される場合は除外す
る。その代わりに、ヒトＴＮＦα／モノクローナル抗体
分子が相互に結合して環状構造を形成すると想定する。
環状抗原−抗体複合体のエネルギー利点、したがって優
れた安定性は、二価ハプテン−抗体系で検討され、十分
に研究されている（Ａｒｃｈｅｒ， Ｂ．Ｇ．， ａｎ
ｄ Ｋｒａｋａｕｒ， Ｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ １６： ６１８ （１９７７）； Ｅｒｉｃｋｓｏ
ｎ， Ｊ．Ｗ． ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ ｔ
ｒｙ ３０： ２３５７ （１９９１）； Ｐｏｓｎｅ
ｒ， Ｒ．Ｇ． ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ３０： ２３４８ （１９９１）及びＤｅｍｂｏ，
Ｍ． ａｎｄ Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ， Ｂ．， Ｉ ｍ
ｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔ ｒｙ １５： ３０７ （１９
７８））。実際に解離調査（図５）によると、ヒトＴＮ
Ｆα／モノクローナル抗体複合体は確かに非常に安定
（Ｋ-1＝１．３７×１０-5 ｓｅｃ-1）である。このよ
うな値は、一雌一雄二値結合モード（Ｍａｓｏｎ，Ｄ．
Ｗ． ａｎｄＷｉｌｌｉａｍｓ， Ａ．Ｆ．， Ｂｉｏ
ｃｈｅ ｍ． Ｊ． １８７： １（１９８９）にしたが
って細胞抗原表面に結合するモノクローナル抗体につい
て報告されている値と同程度の大きさであり、別の種の
抗原−抗体相互作用も同様に安定な複合体の形成をもた
らす。さらに、このような環状複合体の形成を介してヒ
トＴＮＦα及び該モノクローナル抗体を最大の安定性の
状態にできるならば、これは、抗原過剰では形成される
最小抗原−抗体複合体が抗体過剰であるという明白に逆
説的な結果を説明する。
【０１２９】しかしながら、このようなモデルでは、ヒ
トＴＮＦα及び該モデル抗体が如何にして沈殿し得るか
という問題が生じる。記載の複合体では依然として該モ
ノクローナル抗体分子と自由に反応し得るヒトＴＮＦα
エピトープはないので、沈殿がこのような複合体の架橋
に起因する場合は除外する。むしろ、沈殿及び環状複合
体の形成が相互に競合する２つの基本的に異なる現象で
あるという可能性を支持する。抗原過剰及び低（Ｋobs
に近似）試薬濃度では、環状複合体の形成が優勢であ
り、等量／抗体過剰及び高試薬濃度では複合体の形成は
従来の格子理論にしたがって交互抗体−抗原分子から形
成される。
トＴＮＦα及び該モデル抗体が如何にして沈殿し得るか
という問題が生じる。記載の複合体では依然として該モ
ノクローナル抗体分子と自由に反応し得るヒトＴＮＦα
エピトープはないので、沈殿がこのような複合体の架橋
に起因する場合は除外する。むしろ、沈殿及び環状複合
体の形成が相互に競合する２つの基本的に異なる現象で
あるという可能性を支持する。抗原過剰及び低（Ｋobs
に近似）試薬濃度では、環状複合体の形成が優勢であ
り、等量／抗体過剰及び高試薬濃度では複合体の形成は
従来の格子理論にしたがって交互抗体−抗原分子から形
成される。
【０１３０】最後に、本発明に記載されるようなヒトＴ
ＮＦαに結合するモノクローナル抗体は、ヒトＴＮＦα
関連疾患状態における可能な治療用途に関して有利であ
り得る。
ＮＦαに結合するモノクローナル抗体は、ヒトＴＮＦα
関連疾患状態における可能な治療用途に関して有利であ
り得る。
【０１３１】実際に、少なくとも２個の典型的にはモノ
クローナルの抗体分子から構成される複合体は巨大凝集
体とみなされ得る。単球−マクロファージ由来細胞は複
合体を循環から優先的に除去し、こうして危機器官（例
えば腎臓）に沈積するのを阻止し、こうしてこれらの場
所における免疫複合体により媒介される炎症反応を避け
ることができる。
クローナルの抗体分子から構成される複合体は巨大凝集
体とみなされ得る。単球−マクロファージ由来細胞は複
合体を循環から優先的に除去し、こうして危機器官（例
えば腎臓）に沈積するのを阻止し、こうしてこれらの場
所における免疫複合体により媒介される炎症反応を避け
ることができる。
【０１３２】１０．高いＴＮＦα中和活性を有するモノ
クローナル抗体のｉｎ ｖｉｖｏ中和活性。
クローナル抗体のｉｎ ｖｉｖｏ中和活性。
【０１３３】ｉｎ ｖｉｖｏ中和活性を調べるために、
マウスに３６ｍｇのＤ−ガラクトサミン（Ｆｌｕｋａ
Ａｇ， Ｂｕｃｈｓ， Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）及び
ヒトＴＮＦαを腹腔内注入したモデルシステムを使用し
た。Ｄ−ガラクトサミンはヒトＴＮＦαの致死効果に対
して動物を非常に感受性にする。表２、表３及び表４か
ら明らかなように、０．１μｇ／匹程度の低用量のヒト
ＴＮＦαでマウスのほとんどが死滅した。実際に、この
ような量のＴＮＦαをマウスに投与すると、ＴＮＦαの
血中濃度は、ＴＮＦαが有害な役割を果たすことが示さ
れている疾患状態でヒトに検出された濃度に近づく（Ｃ
ａｎｎｏｎ， Ｊ．Ｇ． ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ Ｊｏｕ
ｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓ
ｅｓ１６１： ７９ （１９９０）参照）。従って、こ
のモデルシステムは、ＴＮＦαが病原効果を発揮するよ
うな疾患状態でヒトで中和する抗ＴＮＦαモノクローナ
ル抗体の用量を決定するために適切である。
マウスに３６ｍｇのＤ−ガラクトサミン（Ｆｌｕｋａ
Ａｇ， Ｂｕｃｈｓ， Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）及び
ヒトＴＮＦαを腹腔内注入したモデルシステムを使用し
た。Ｄ−ガラクトサミンはヒトＴＮＦαの致死効果に対
して動物を非常に感受性にする。表２、表３及び表４か
ら明らかなように、０．１μｇ／匹程度の低用量のヒト
ＴＮＦαでマウスのほとんどが死滅した。実際に、この
ような量のＴＮＦαをマウスに投与すると、ＴＮＦαの
血中濃度は、ＴＮＦαが有害な役割を果たすことが示さ
れている疾患状態でヒトに検出された濃度に近づく（Ｃ
ａｎｎｏｎ， Ｊ．Ｇ． ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ Ｊｏｕ
ｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓ
ｅｓ１６１： ７９ （１９９０）参照）。従って、こ
のモデルシステムは、ＴＮＦαが病原効果を発揮するよ
うな疾患状態でヒトで中和する抗ＴＮＦαモノクローナ
ル抗体の用量を決定するために適切である。
【０１３４】表３及び表４は、ハイブリドーマ７８によ
り産生される本発明のモノクローナル抗体で実施したｉ
ｎ ｖｉｖｏ保護調査の結果を示す。
り産生される本発明のモノクローナル抗体で実施したｉ
ｎ ｖｉｖｏ保護調査の結果を示す。
【０１３５】表３は特に、０．４μｇ／匹のモノクロー
ナル抗体が０．１μｇ／匹のヒトＴＮＦαと３６ｍｇの
Ｄ−ガラクトサミンとを同時投与した場合の致死効果か
らマウスを完全に保護できることを示す。致死量を越え
る１μｇ／匹のヒトＴＮＦαを使用した場合、４μｇ／
匹のモノクローナル抗体でマウスを完全に保護すること
ができた。
ナル抗体が０．１μｇ／匹のヒトＴＮＦαと３６ｍｇの
Ｄ−ガラクトサミンとを同時投与した場合の致死効果か
らマウスを完全に保護できることを示す。致死量を越え
る１μｇ／匹のヒトＴＮＦαを使用した場合、４μｇ／
匹のモノクローナル抗体でマウスを完全に保護すること
ができた。
【０１３６】表４は経時的調査の結果を示す。表から明
らかなように、１０μｇ／マウスのモノクローナル抗体
はＴＮＦαよりも１時間３０分前／又はＴＮＦαと同時
に投与した場合、１μｇ／匹のＴＮＦαの致死効果から
マウスを完全に保護することができる。ＴＮＦαから２
０分後に投与した場合、依然として部分的な保護が観察
された。他方、０．１μｇ／匹のＴＮＦαから４０分後
までに投与した場合、１μｇ／匹のモノクローナル抗体
はマウスを完全に保護した。ＴＮＦαから２時間後に投
与した場合、部分的保護がまだ観察された。ハイブリド
ーマクローン７８の細胞は１９９０年１１月７日付けで
ＥＣＡＣＣ仮受託番号９０１１０７０７で寄託されてい
る。
らかなように、１０μｇ／マウスのモノクローナル抗体
はＴＮＦαよりも１時間３０分前／又はＴＮＦαと同時
に投与した場合、１μｇ／匹のＴＮＦαの致死効果から
マウスを完全に保護することができる。ＴＮＦαから２
０分後に投与した場合、依然として部分的な保護が観察
された。他方、０．１μｇ／匹のＴＮＦαから４０分後
までに投与した場合、１μｇ／匹のモノクローナル抗体
はマウスを完全に保護した。ＴＮＦαから２時間後に投
与した場合、部分的保護がまだ観察された。ハイブリド
ーマクローン７８の細胞は１９９０年１１月７日付けで
ＥＣＡＣＣ仮受託番号９０１１０７０７で寄託されてい
る。
【０１３７】方法
１．ヒトＴＮＦα特異的抗体の検出のためのＥＬＩＳ
Ａ。
Ａ。
【０１３８】平底微量滴定プレート（Ｆａｌｃｏｎ Ｎ
ｏ． ３９１２）を１００ｍＭ重炭酸緩衝液、ｐＨ９．
６で希釈したヒトＴＮＦα１μｇ／ｍｌで１００μｌ／
ウェルの割合で被覆した。４℃で一晩インキュベーショ
ン後、未吸着ＴＮＦαを廃棄し、１％ウシ血清アルブミ
ン（ＢＳＡ， Ａｒｍｏｕｒ， Ｋａｎｋａｋｅｅ，Ｉ
ｌｌｉｎｏｉｓ）を補充したＰＢＳを各ウェルに加え、
空いているプラスチック部位を飽和させた。
ｏ． ３９１２）を１００ｍＭ重炭酸緩衝液、ｐＨ９．
６で希釈したヒトＴＮＦα１μｇ／ｍｌで１００μｌ／
ウェルの割合で被覆した。４℃で一晩インキュベーショ
ン後、未吸着ＴＮＦαを廃棄し、１％ウシ血清アルブミ
ン（ＢＳＡ， Ａｒｍｏｕｒ， Ｋａｎｋａｋｅｅ，Ｉ
ｌｌｉｎｏｉｓ）を補充したＰＢＳを各ウェルに加え、
空いているプラスチック部位を飽和させた。
【０１３９】プレートを更に室温で３時間インキュベー
トした。その後、プレートを洗浄用緩衝液（ＷＢ）、即
ち０．１％Ｔｗｅｅｎ ２０（Ｍｅｒｃｋ， Ｓｃｈｕ
ｃｈａｒｄｔ， Ｈｏｈｅｎｂｒｕｎｎ， ＦＲＧ）及
び０．０１％メルチオレート（ＢＤＨ， Ｐｏｏｌ，
ＧＢ）を補充したＰＢＳで３回洗った。１％ＢＳＡを補
充したＰＢＳでハイブリドーマ上清５０μｌを１：５に
希釈して各ウェルに加え、プレートを６０分間３７℃で
インキュベートし、上記のように洗浄した。次に、ＷＢ
で１：３０００に希釈したペルオキシダーゼ結合ヤギ抗
マウス免疫グロブリンＧ（ＨＲＰａＩｇＧ， ＢｉｏＲ
ａｄ， Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）１
００μｌを各ウェルに加え、プレートを４５分間３７℃
でインキュベートし、上記のように洗った。その後、ペ
ルオキシダーゼ基質（ＯＰＤ２， Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，
ＳＣＩ， Ｒｏｍｅ， Ｉｔａｌｙ， クエン酸緩衝
液５ｍｌに１タブレットを溶解、ＯＰＤ４， Ｃｈｅｍ
ｉｃｏｎ）１００μｌを各ウェルに加えた。室温で２分
間反応させた後、１００μｌ／ウェルの４Ｍ Ｈ2ＳＯ4
を加えることにより顕色を停止した。顕色の程度をプレ
ートＥＬＩＳＡリーダーで４９２ｎｍで読み取った。光
学密度（ＯＤ）値＞０．５を与える上清を抗ＴＮＦα抗
体の存在に関して陽性であるとみなした。
トした。その後、プレートを洗浄用緩衝液（ＷＢ）、即
ち０．１％Ｔｗｅｅｎ ２０（Ｍｅｒｃｋ， Ｓｃｈｕ
ｃｈａｒｄｔ， Ｈｏｈｅｎｂｒｕｎｎ， ＦＲＧ）及
び０．０１％メルチオレート（ＢＤＨ， Ｐｏｏｌ，
ＧＢ）を補充したＰＢＳで３回洗った。１％ＢＳＡを補
充したＰＢＳでハイブリドーマ上清５０μｌを１：５に
希釈して各ウェルに加え、プレートを６０分間３７℃で
インキュベートし、上記のように洗浄した。次に、ＷＢ
で１：３０００に希釈したペルオキシダーゼ結合ヤギ抗
マウス免疫グロブリンＧ（ＨＲＰａＩｇＧ， ＢｉｏＲ
ａｄ， Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）１
００μｌを各ウェルに加え、プレートを４５分間３７℃
でインキュベートし、上記のように洗った。その後、ペ
ルオキシダーゼ基質（ＯＰＤ２， Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，
ＳＣＩ， Ｒｏｍｅ， Ｉｔａｌｙ， クエン酸緩衝
液５ｍｌに１タブレットを溶解、ＯＰＤ４， Ｃｈｅｍ
ｉｃｏｎ）１００μｌを各ウェルに加えた。室温で２分
間反応させた後、１００μｌ／ウェルの４Ｍ Ｈ2ＳＯ4
を加えることにより顕色を停止した。顕色の程度をプレ
ートＥＬＩＳＡリーダーで４９２ｎｍで読み取った。光
学密度（ＯＤ）値＞０．５を与える上清を抗ＴＮＦα抗
体の存在に関して陽性であるとみなした。
【０１４０】２．ヒトＴＮＦα特異的抗体の特異性の立
証のためのコンペティティブＥＬＩＳＡ。
証のためのコンペティティブＥＬＩＳＡ。
【０１４１】ハイブリドーマ上清１００ｎｇ／ｍｌを種
々の濃度のヒトＴＮＦα又は種々の濃度の無関係抗原又
は希釈剤単独（１％ＢＳＡを補充したＰＢＳ）と共に２
時間３７℃でコインキュベートした。インキュベーショ
ン後、ヒトＴＮＦα特異抗体を検出することが可能な従
来記載されているＥＬＩＳＡで残留ＴＮＦα結合を測定
した。
々の濃度のヒトＴＮＦα又は種々の濃度の無関係抗原又
は希釈剤単独（１％ＢＳＡを補充したＰＢＳ）と共に２
時間３７℃でコインキュベートした。インキュベーショ
ン後、ヒトＴＮＦα特異抗体を検出することが可能な従
来記載されているＥＬＩＳＡで残留ＴＮＦα結合を測定
した。
【０１４２】３．マウスＩｇＧ抗体の定量用ＥＬＩＳ
Ａ。
Ａ。
【０１４３】平底微量滴定プレートを４０ｍＭリン酸緩
衝液（ｐＨ７．４）で希釈したヤギ−抗マウスＩｇ（Ｏ
ｒｇａｎｏｎ Ｔｅｋｎｉｋａ， Ｔｕｒｎｈｏｕｔ，
Ｂｅｌｇｉｕｍ， 終濃度１μｇ／ウェル）で１００
μｌ／ウェルの割合で被覆した。４℃で一晩インキュベ
ーション後、未吸着の抗体を廃棄し、１％ＢＳＡを補充
したＰＢＳを各ウェルに加え、空いているプラスチック
部位を飽和させた。
衝液（ｐＨ７．４）で希釈したヤギ−抗マウスＩｇ（Ｏ
ｒｇａｎｏｎ Ｔｅｋｎｉｋａ， Ｔｕｒｎｈｏｕｔ，
Ｂｅｌｇｉｕｍ， 終濃度１μｇ／ウェル）で１００
μｌ／ウェルの割合で被覆した。４℃で一晩インキュベ
ーション後、未吸着の抗体を廃棄し、１％ＢＳＡを補充
したＰＢＳを各ウェルに加え、空いているプラスチック
部位を飽和させた。
【０１４４】プレートを更に３時間室温でインキュベー
トし、その後、ＷＢで３回洗った。このインキュベーシ
ョンの間に、基準マウスＩｇＧ調製物（Ｐｅｌ−Ｆｒｅ
ｅｚ， Ｒｏｇｅｒｓ， Ａｒｋａｎｓａｓ）の典型的
には５〜０．２５μｇ ＩｇＧ／ｍｌの連続２倍希釈液
を調製した。これと平行して未知量のＩｇＧを含有する
上清の典型的には１：１００〜１：１２８００の連続２
倍希釈液を調製した。全希釈液は１％ＢＳＡを補充した
ＰＢＳ中で調製した。各希釈液５０μｌをウェルに加
え、プレートを６０分間３７℃でインキュベートし、そ
の後、上記のように洗った。
トし、その後、ＷＢで３回洗った。このインキュベーシ
ョンの間に、基準マウスＩｇＧ調製物（Ｐｅｌ−Ｆｒｅ
ｅｚ， Ｒｏｇｅｒｓ， Ａｒｋａｎｓａｓ）の典型的
には５〜０．２５μｇ ＩｇＧ／ｍｌの連続２倍希釈液
を調製した。これと平行して未知量のＩｇＧを含有する
上清の典型的には１：１００〜１：１２８００の連続２
倍希釈液を調製した。全希釈液は１％ＢＳＡを補充した
ＰＢＳ中で調製した。各希釈液５０μｌをウェルに加
え、プレートを６０分間３７℃でインキュベートし、そ
の後、上記のように洗った。
【０１４５】ペルオキシダーゼ基質添加及び顕色は１項
を参照されたい。
を参照されたい。
【０１４６】ＥＬＩＳＡ−ＳＯＦＴ−ＰＣプログラム
（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ， Ｎｏｒｗａｌｋ， Ｃ
ｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ）でデータを処理することによ
り、未知量のＩｇｇを含有する上清中のＩｇＧ濃度を計
算した。
（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ， Ｎｏｒｗａｌｋ， Ｃ
ｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ）でデータを処理することによ
り、未知量のＩｇｇを含有する上清中のＩｇＧ濃度を計
算した。
【０１４７】４．モノクローナル抗体のＨ鎖及びＬ鎖の
型別のためのＥＬＩＳＡ。
型別のためのＥＬＩＳＡ。
【０１４８】この目的のために、ＨＹＢＲＩＤＯＭＡ
ＳＵＢ ＩＳＯＴＹＰＩＮＧ ＫＩＴ（Ｃａｌｂｉｏｃ
ｈｅｍ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉ
ａ）を製造業者の指示に従って使用した。型別は１％Ｂ
ＳＡを補充したＰＢＳで１：５に希釈したハイブリドー
マ上清で行った。ＯＤ値＞０．４を与えるウェルを所与
のＩｇＧクラス、サブクラス及びＬ鎖のモノクローナル
抗体の存在に関して陽性であるとみなした。
ＳＵＢ ＩＳＯＴＹＰＩＮＧ ＫＩＴ（Ｃａｌｂｉｏｃ
ｈｅｍ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉ
ａ）を製造業者の指示に従って使用した。型別は１％Ｂ
ＳＡを補充したＰＢＳで１：５に希釈したハイブリドー
マ上清で行った。ＯＤ値＞０．４を与えるウェルを所与
のＩｇＧクラス、サブクラス及びＬ鎖のモノクローナル
抗体の存在に関して陽性であるとみなした。
【０１４９】５．抗ＴＮＦαモノクローナル抗体のｉｎ
ｖｉｔｒｏ中和活性の決定。
ｖｉｔｒｏ中和活性の決定。
【０１５０】０日目に対数的に増殖するマウスＬＭ細胞
（Ｒｕｂｉｎ， Ｂ．Ｙ． ｅｔａｌ， Ｊ． Ｅｘ
ｐ． Ｍｅｄ． １６２： １０９９ （１９８５））
をトリプシン処理し、遠心分離し、５％ＦＣＳ及び１％
グルタミンを補充したイーグルの最小必須培地（完全Ｍ
ＥＭ）ｍｌ当たり細胞３×１０5個の終濃度で再懸濁し
た。
（Ｒｕｂｉｎ， Ｂ．Ｙ． ｅｔａｌ， Ｊ． Ｅｘ
ｐ． Ｍｅｄ． １６２： １０９９ （１９８５））
をトリプシン処理し、遠心分離し、５％ＦＣＳ及び１％
グルタミンを補充したイーグルの最小必須培地（完全Ｍ
ＥＭ）ｍｌ当たり細胞３×１０5個の終濃度で再懸濁し
た。
【０１５１】この懸濁液１００μｌを平底微量滴定プレ
ート（Ｆａｌｃｏｎ ３０７２）のウェルに加えた。次
に、ウェルへの添加後に１μｇ／ｍｌ〜２５ｐｇ／ｍｌ
の終濃度を得るように、完全ＭＥＭでヒトＴＮＦα又は
ヒトＴＮＦβ（ＯｍｎｉａＲｅｓ， Ｃｉｎｉｓｅｌｌ
ｏ Ｂａｌｓａｍｏ， Ｉｔａｌｙ）の懸濁液を調製し
た。
ート（Ｆａｌｃｏｎ ３０７２）のウェルに加えた。次
に、ウェルへの添加後に１μｇ／ｍｌ〜２５ｐｇ／ｍｌ
の終濃度を得るように、完全ＭＥＭでヒトＴＮＦα又は
ヒトＴＮＦβ（ＯｍｎｉａＲｅｓ， Ｃｉｎｉｓｅｌｌ
ｏ Ｂａｌｓａｍｏ， Ｉｔａｌｙ）の懸濁液を調製し
た。
【０１５２】ウェルへの添加後にモノクローナル抗体ｍ
ｌ当たり１μｇ、１００ｎｇ又は１０ｎｇの終濃度を有
するように、完全ＭＥＭで抗体含有上清又は溶液を希釈
した。
ｌ当たり１μｇ、１００ｎｇ又は１０ｎｇの終濃度を有
するように、完全ＭＥＭで抗体含有上清又は溶液を希釈
した。
【０１５３】各ＴＮＦα又はＴＮＦβ希釈液５０μｌを
モノクローナル抗体５０μｌ又は完全ＭＥＭ５０μｌと
共に２時間３７℃でコインキュベートした。このインキ
ュベーションの間に、完全ＭＥＭ中のアクチノマイシン
Ｄ（Ｆｌｕｋａ）を含有する溶液を調製した。ウェルへ
の添加後のアクチノマイシンＤの終濃度は１μｇ／ｍｌ
とした。インキュベーション後、各抗体−ＴＮＦα又は
ＴＮＦβ混合物及びアクチノマイシンＤ ５０μｌを微
量滴定プレートのウェルに加えた。いくつかのウェルに
ＴＮＦα又はＴＮＦβを含有する各希釈液１００μｌを
加えた。いくつかの対照ウェルにはアクチノマイシンＤ
単独＋完全ＭＥＭのみを加えた。その後、プレートを２
４時間３７℃でインキュベートした。
モノクローナル抗体５０μｌ又は完全ＭＥＭ５０μｌと
共に２時間３７℃でコインキュベートした。このインキ
ュベーションの間に、完全ＭＥＭ中のアクチノマイシン
Ｄ（Ｆｌｕｋａ）を含有する溶液を調製した。ウェルへ
の添加後のアクチノマイシンＤの終濃度は１μｇ／ｍｌ
とした。インキュベーション後、各抗体−ＴＮＦα又は
ＴＮＦβ混合物及びアクチノマイシンＤ ５０μｌを微
量滴定プレートのウェルに加えた。いくつかのウェルに
ＴＮＦα又はＴＮＦβを含有する各希釈液１００μｌを
加えた。いくつかの対照ウェルにはアクチノマイシンＤ
単独＋完全ＭＥＭのみを加えた。その後、プレートを２
４時間３７℃でインキュベートした。
【０１５４】インキュベーション後、チアゾリルブルー
溶液（ＭＴＴ， Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ， ＰＢＳ中５
ｍｇ／ｍｌ）２０μｌを各ウェルに加えた。プレートを
更に４時間３７℃でインキュベートした。次に、上清を
捨て、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ， Ｆａｒｍｉ
ｔａｌｉａ Ｃａｒｌｏ Ｅｒｂａ）２００μｌを各ウ
ェルに加え、顕色の程度をプレートＥＬＩＳＡリーダー
で５７０ｎｍで読み取った。
溶液（ＭＴＴ， Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ， ＰＢＳ中５
ｍｇ／ｍｌ）２０μｌを各ウェルに加えた。プレートを
更に４時間３７℃でインキュベートした。次に、上清を
捨て、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ， Ｆａｒｍｉ
ｔａｌｉａ Ｃａｒｌｏ Ｅｒｂａ）２００μｌを各ウ
ェルに加え、顕色の程度をプレートＥＬＩＳＡリーダー
で５７０ｎｍで読み取った。
【０１５５】各抗体−ＴＮＦα又はＴＮＦβ混合物に得
られたＯＤ値をＴＮＦα又はＴＮＦβ単独に得られたＯ
Ｄ値に比較した。モノクローナル抗体の不在下又は存在
下で対照ウェルに得られた値の５０％のＯＤ値（５０％
細胞毒性）を与えるＴＮＦα又はＴＮＦβの量を決定し
た。最高の中和活性を有するモノクローナル抗体を、５
０％の細胞毒性を与えるために必要なＴＮＦαの最高増
加を決定する活性として定義する。
られたＯＤ値をＴＮＦα又はＴＮＦβ単独に得られたＯ
Ｄ値に比較した。モノクローナル抗体の不在下又は存在
下で対照ウェルに得られた値の５０％のＯＤ値（５０％
細胞毒性）を与えるＴＮＦα又はＴＮＦβの量を決定し
た。最高の中和活性を有するモノクローナル抗体を、５
０％の細胞毒性を与えるために必要なＴＮＦαの最高増
加を決定する活性として定義する。
【０１５６】６．抗ＴＮＦαモノクローナル抗体の親和
性の決定。
性の決定。
【０１５７】抗ＴＮＦαモノクローナル抗体の親和性を
決定するために、次の実験を実施した。該モノクローナ
ル抗体又は希釈剤単独（０．５％ＢＳＡを補充したＰＢ
Ｓ）１ｎｇ／ｍｌ（６．２５×１０-12Ｍ）を、種々の
濃度のヨウ素化ヒトＴＮＦα（ＮＥＮ， Ｗｉｌｍｉｎ
ｇｔｏｎ， ＤＥ，典型的には０．５×１０-11Ｍ〜４
×１０-10Ｍの濃度）と共にエッペンドルフチューブで
４時間室温でインキュベートした。インキュベーション
後、１：５希釈Ｉｍｍｕｎｏｂｅａｄｓ（１７０−５１
０４， Ｂｉｏ−Ｒａｄ， Ｓｅｇｒａｔｅ， Ｉｔａ
ｌｙ）を各チューブに加え、チューブを更に１時間イン
キュベートした。次に、混合物をフタル酸−フタル酸ジ
ブチル油状混合物（１：１．５ｖｏｌ／ｖｏｌ， Ｆｌ
ｕｋａ，ＡＧ）を通して遠心分離した。Ｉｍｍｕｎｏｂ
ｅａｄに会合した放射活性をγカウンターで計数した。
こうして得られたデータを平衡結合データ分析プログラ
ム（ＥＢＤＡ， Ｅｌｓｅｖｉｒ．Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐ
ｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ， Ｎｅｔｈ
ｅｒｌａｎｄｓ）により処理した。
決定するために、次の実験を実施した。該モノクローナ
ル抗体又は希釈剤単独（０．５％ＢＳＡを補充したＰＢ
Ｓ）１ｎｇ／ｍｌ（６．２５×１０-12Ｍ）を、種々の
濃度のヨウ素化ヒトＴＮＦα（ＮＥＮ， Ｗｉｌｍｉｎ
ｇｔｏｎ， ＤＥ，典型的には０．５×１０-11Ｍ〜４
×１０-10Ｍの濃度）と共にエッペンドルフチューブで
４時間室温でインキュベートした。インキュベーション
後、１：５希釈Ｉｍｍｕｎｏｂｅａｄｓ（１７０−５１
０４， Ｂｉｏ−Ｒａｄ， Ｓｅｇｒａｔｅ， Ｉｔａ
ｌｙ）を各チューブに加え、チューブを更に１時間イン
キュベートした。次に、混合物をフタル酸−フタル酸ジ
ブチル油状混合物（１：１．５ｖｏｌ／ｖｏｌ， Ｆｌ
ｕｋａ，ＡＧ）を通して遠心分離した。Ｉｍｍｕｎｏｂ
ｅａｄに会合した放射活性をγカウンターで計数した。
こうして得られたデータを平衡結合データ分析プログラ
ム（ＥＢＤＡ， Ｅｌｓｅｖｉｒ．Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐ
ｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ， Ｎｅｔｈ
ｅｒｌａｎｄｓ）により処理した。
【０１５８】７．抗ＴＮＦαモノクローナル抗体に結合
したヒトＴＮＦαの解離速度定数（ｋ-1）の決定。
したヒトＴＮＦαの解離速度定数（ｋ-1）の決定。
【０１５９】ハイブリドーマ７８又は緩衝液（ＰＢＳ＋
０．５％ＢＳＡ）単独により産生されたモノクローナル
抗体２ｎｇ／ｍｌ（１．２５×１０-11Ｍ）をヨウ素化
ヒトＴＮＦα ２．５ｎｇ／ｍｌ（５×１０-11Ｍ）と
共に４時間室温でインキュベートした。その後、１：５
希釈Ｉｍｍｕｎｏｂｅａｄを１時間加え、その後、混合
物を２回遠心分離した。得られたペレットを２５０ｎｇ
／ｍｌ（５×１０-9Ｍ）「寒冷」ヒトＴＮＦαに再懸濁
し、解離する全ヨウ素化ヒトＴＮＦαとの再結合に関し
て競合させた。室温で種々の時間インキュベーション
（表５参照）後、ペレットを前項に記載したように油状
混合物を通して遠心分離した。次に、モノクローナル抗
体に特異的に結合した残留ヨウ素化ヒトＴＮＦαを決定
し、結果をｌｏｇ時間に対する結合放射性百分率として
プロットした。５０％解離時間（Ｔ1/2）をこのグラフ
から読み取り、ｋ-1＝０．６９３／Ｔ1/2を計算するた
めに使用した。
０．５％ＢＳＡ）単独により産生されたモノクローナル
抗体２ｎｇ／ｍｌ（１．２５×１０-11Ｍ）をヨウ素化
ヒトＴＮＦα ２．５ｎｇ／ｍｌ（５×１０-11Ｍ）と
共に４時間室温でインキュベートした。その後、１：５
希釈Ｉｍｍｕｎｏｂｅａｄを１時間加え、その後、混合
物を２回遠心分離した。得られたペレットを２５０ｎｇ
／ｍｌ（５×１０-9Ｍ）「寒冷」ヒトＴＮＦαに再懸濁
し、解離する全ヨウ素化ヒトＴＮＦαとの再結合に関し
て競合させた。室温で種々の時間インキュベーション
（表５参照）後、ペレットを前項に記載したように油状
混合物を通して遠心分離した。次に、モノクローナル抗
体に特異的に結合した残留ヨウ素化ヒトＴＮＦαを決定
し、結果をｌｏｇ時間に対する結合放射性百分率として
プロットした。５０％解離時間（Ｔ1/2）をこのグラフ
から読み取り、ｋ-1＝０．６９３／Ｔ1/2を計算するた
めに使用した。
【０１６０】８．オクテルロニー寒天二重免疫拡散。
【０１６１】ハイブリドーマ７８により産生されたモノ
クローナル抗体がヒトＴＭＦαを沈殿させるか否かを調
べるために、二重拡散アッセイを実施した。このため
に、０．９％ＮａＣｌ中の１％アガロースゲルを使用し
た。サンプル（ヒトＴＮＦα及びモノクローナル抗体）
を円形ウェルに入れた。少なくとも２４時間４℃でパタ
ーンを展開させ、写真撮影した。
クローナル抗体がヒトＴＭＦαを沈殿させるか否かを調
べるために、二重拡散アッセイを実施した。このため
に、０．９％ＮａＣｌ中の１％アガロースゲルを使用し
た。サンプル（ヒトＴＮＦα及びモノクローナル抗体）
を円形ウェルに入れた。少なくとも２４時間４℃でパタ
ーンを展開させ、写真撮影した。
【０１６２】９．ヒトＴＮＦα及び抗ＴＮＦαモノクロ
ーナル抗体の混合物のＦＰＬＣサイズ排除プロフィルの
決定。
ーナル抗体の混合物のＦＰＬＣサイズ排除プロフィルの
決定。
【０１６３】この目的のために、ヒトＴＮＦα又はヨウ
素化ヒトＴＮＦαと精製抗ＴＮＦαモノクローナル抗体
との混合物（例えばヒトＴＮＦα１００μｇ／ｍｌとモ
ノクローナル抗体３０μｇ／ｍｌ又はヨウ素化ヒトＴＮ
Ｆα５ｎｇ／ｍｌとモノクローナル抗体２ｎｇ／ｍｌ）
をヒトＴＮＦα過剰となるようにＰＢＳ（ヒトＴＮＦα
１００μｇ／ｍｌとモノクローナル抗体３０μｇ／ｍｌ
との混合物の場合）又はＰＢＳ＋０．５％ＢＳＡ（ヨウ
素化ヒトＴＮＦα５ｎｇ／ｍｌとモノクローナル抗体２
ｎｇ／ｍｌとの混合物の場合）中で調製した。混合物を
４時間室温でインキュベートさせた。その後、混合物、
ＴＮＦα単独又はモノクローナル抗体単独を１０×３０
０ｍｍ Ｓｕｐｅｒｏｓｅ ６ ＦＰＬＣカラム（Ｐｈ
ａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｙ， Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）でクロマトグラ
フィーにかけ、Ａ280吸着プロフィルを得た。カラムを
予備平衡させ、５０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ
ＮａＣｌ， ｐＨ７．２緩衝液で溶離させた。分子量
標準は典型的にはブルーデキストラン（ｍｗ２×１
０6）、ヒトＩｇＭ（ｍｗ ９０００００）、ウシチロ
グロブリン（ｍｗ ６７００００）、ウシＩｇＧ（ｍｗ
１５８０００）、ニワトリオボアルブミン（ｍｗ ４
４０００）、ウマミオグロブリン（ｍｗ １７００
０）、ビタミン（ｍｗ１３５０）とした。
素化ヒトＴＮＦαと精製抗ＴＮＦαモノクローナル抗体
との混合物（例えばヒトＴＮＦα１００μｇ／ｍｌとモ
ノクローナル抗体３０μｇ／ｍｌ又はヨウ素化ヒトＴＮ
Ｆα５ｎｇ／ｍｌとモノクローナル抗体２ｎｇ／ｍｌ）
をヒトＴＮＦα過剰となるようにＰＢＳ（ヒトＴＮＦα
１００μｇ／ｍｌとモノクローナル抗体３０μｇ／ｍｌ
との混合物の場合）又はＰＢＳ＋０．５％ＢＳＡ（ヨウ
素化ヒトＴＮＦα５ｎｇ／ｍｌとモノクローナル抗体２
ｎｇ／ｍｌとの混合物の場合）中で調製した。混合物を
４時間室温でインキュベートさせた。その後、混合物、
ＴＮＦα単独又はモノクローナル抗体単独を１０×３０
０ｍｍ Ｓｕｐｅｒｏｓｅ ６ ＦＰＬＣカラム（Ｐｈ
ａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｙ， Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）でクロマトグラ
フィーにかけ、Ａ280吸着プロフィルを得た。カラムを
予備平衡させ、５０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ
ＮａＣｌ， ｐＨ７．２緩衝液で溶離させた。分子量
標準は典型的にはブルーデキストラン（ｍｗ２×１
０6）、ヒトＩｇＭ（ｍｗ ９０００００）、ウシチロ
グロブリン（ｍｗ ６７００００）、ウシＩｇＧ（ｍｗ
１５８０００）、ニワトリオボアルブミン（ｍｗ ４
４０００）、ウマミオグロブリン（ｍｗ １７００
０）、ビタミン（ｍｗ１３５０）とした。
【０１６４】１０．抗ＴＮＦαモノクローナル抗体のｉ
ｎ ｖｉｖｏ中和活性の決定。
ｎ ｖｉｖｏ中和活性の決定。
【０１６５】抗ＴＮＦαモノクローナル抗体のｉｎ ｖ
ｉｖｏ中和活性を調べるために、ヒトＴＮＦαによりマ
ウスに誘発した致死性ショックのモデルシステムを作成
した。この目的のために、マウスに種々の用量のヒトＴ
ＮＦα（典型的にはＰＢＳ０．２５ｍｌに希釈して０．
１μｇ又は１μｇ／匹）及びＤ−ガラクトサミン（典型
的にはＰＢＳ ０．２５ｍｌに希釈して３６ｍｇ／匹）
を腹腔内注入した。致死量のヒトＴＮＦαを注入したマ
ウスは２４〜４８時間以内に死亡した。
ｉｖｏ中和活性を調べるために、ヒトＴＮＦαによりマ
ウスに誘発した致死性ショックのモデルシステムを作成
した。この目的のために、マウスに種々の用量のヒトＴ
ＮＦα（典型的にはＰＢＳ０．２５ｍｌに希釈して０．
１μｇ又は１μｇ／匹）及びＤ−ガラクトサミン（典型
的にはＰＢＳ ０．２５ｍｌに希釈して３６ｍｇ／匹）
を腹腔内注入した。致死量のヒトＴＮＦαを注入したマ
ウスは２４〜４８時間以内に死亡した。
【０１６６】マウスに種々の用量のモノクローナル抗体
（ＰＢＳ ０．２５ｍｌに希釈）を静脈内注入し、９０
分後に致死量のヒトＴＮＦαを腹腔内注入することによ
り、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体のｉｎ ｖｉｖｏ中
和活性を調べた。
（ＰＢＳ ０．２５ｍｌに希釈）を静脈内注入し、９０
分後に致死量のヒトＴＮＦαを腹腔内注入することによ
り、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体のｉｎ ｖｉｖｏ中
和活性を調べた。
【０１６７】別の実験系列では、抗ＴＮＦαモノクロー
ナル抗体の経時的ｉｎ ｖｉｖｏ中和活性を調べた。こ
の目的のために、モノクローナル抗体を致死量のヒトＴ
ＮＦαの投与前後種々の時刻に投与した。
ナル抗体の経時的ｉｎ ｖｉｖｏ中和活性を調べた。こ
の目的のために、モノクローナル抗体を致死量のヒトＴ
ＮＦαの投与前後種々の時刻に投与した。
【０１６８】
【表１】
【０１６９】
【表２】
【０１７０】
【表３】
【０１７１】
【表４】
【０１７２】
【表５】
【図１】種々の用量のヒトＴＮＦα又は種々の用量の無
関係抗原と共にインキュベーション後に抗体１００ｎｇ
／ｍｌがＴＮＦαに結合し続ける残留結合能を測定する
ＥＬＩＳＡで決定したヒトＴＮＦαに対するモノクロー
ナル抗体の特異性を示す。
関係抗原と共にインキュベーション後に抗体１００ｎｇ
／ｍｌがＴＮＦαに結合し続ける残留結合能を測定する
ＥＬＩＳＡで決定したヒトＴＮＦαに対するモノクロー
ナル抗体の特異性を示す。
【図２】種々の用量のヒトＴＮＦαに対するモノクロー
ナル抗体１μｇ／ｍｌ（６．２５×１０-9Ｍ）の中和活
性を示す。
ナル抗体１μｇ／ｍｌ（６．２５×１０-9Ｍ）の中和活
性を示す。
【図３】種々の用量のヒトＴＮＦαに対するモノクロー
ナル抗体１μｇ／ｍｌの中和活性を示す。
ナル抗体１μｇ／ｍｌの中和活性を示す。
【図４】該モノクローナル抗体へのヒトＴＮＦαの結合
のスキャッチャードプロットを示す。
のスキャッチャードプロットを示す。
【図５】本発明のモノクローナル抗体からのヒトＴＮＦ
αの解離を示す。
αの解離を示す。
【図６】オクテルロニー寒天二重免疫拡散を示す。中央
のトラフにはモノクローナル抗体２０μｇを加え、左
上、右上、左下及び右下のトラフにはヒトＴＮＦα夫々
１０μｇ、５μｇ、１．２５μｇ及び２．５μｇを加え
た。
のトラフにはモノクローナル抗体２０μｇを加え、左
上、右上、左下及び右下のトラフにはヒトＴＮＦα夫々
１０μｇ、５μｇ、１．２５μｇ及び２．５μｇを加え
た。
【図７】ヒトＴＮＦα単独１００μｇ（２×１０-6Ｍ）
（−−−−パネルＡ）、該モノクローナル抗体単独１０
０μｇ（６．２５×１０-6Ｍ）（−パネルＡ）、ヒトＴ
ＮＦα１００μｇ（２×１０-6Ｍ）とモノクローナル抗
体３０μｇ（２×１０-7Ｍ）との混合物（パネルＢ）、
及びヨウ素化ヒトＴＮＦα５ｎｇ（１０-10Ｍ）とモノ
クローナル抗体２ｎｇ（１．２５×１０-11Ｍ）との混
合物（パネルＣ）の高圧液体クロマトグラフィー（ＦＰ
ＬＣ）サイズ排除プロフィルを示す。
（−−−−パネルＡ）、該モノクローナル抗体単独１０
０μｇ（６．２５×１０-6Ｍ）（−パネルＡ）、ヒトＴ
ＮＦα１００μｇ（２×１０-6Ｍ）とモノクローナル抗
体３０μｇ（２×１０-7Ｍ）との混合物（パネルＢ）、
及びヨウ素化ヒトＴＮＦα５ｎｇ（１０-10Ｍ）とモノ
クローナル抗体２ｎｇ（１．２５×１０-11Ｍ）との混
合物（パネルＣ）の高圧液体クロマトグラフィー（ＦＰ
ＬＣ）サイズ排除プロフィルを示す。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所
Ａ６１Ｋ 39/395 ＡＢＧ Ｄ 8413−4Ｃ
Ｃ０７Ｋ 15/28 7731−4Ｈ
Ｃ１２Ｎ 5/20
// Ｃ１２Ｎ 15/06
(Ｃ１２Ｐ 21/08
Ｃ１２Ｒ 1:91）
(72)発明者 マルタ・ギスリエリ
イタリー国、20137・ミラン、ビア・カド
リーニ・４
(72)発明者 フアブリツイオ・マルクツチ
イタリー国、20025・レニヤーノ・（ミラ
ン）、ピアツツア・デル・カロツチヨ・23
(72)発明者 ドメニコ・トリツイオ
イタリー国、22070・カツシーナ・リツツ
アルデイ・（コモ）、ビア・ボルタ・４
Claims (17)
- 【請求項１】 ヒト腫瘍致死因子（ＴＮＦ）αを中和す
ることが可能なモノクローナル抗体又はその結合フラグ
メントであって、ヒトＴＮＦαを沈殿させ高分子量抗原
−抗体複合体を形成することが可能であることを特徴と
するモノクローナル抗体。 - 【請求項２】 ヒトＴＮＦαと共に形成される最小の抗
原−抗体複合体が実質的に少なくとも２個の該抗体分子
と少なくとも１個のヒトＴＮＦα分子とを含み且つ少な
くとも４００ｋＤの分子量を有することを特徴とする請
求項１に記載のモノクローナル抗体又はその結合フラグ
メント。 - 【請求項３】 ｉｎ ｖｉｔｒｏでヒトＴＮＦαを２：
１未満のモル比で中和できることを特徴とする請求項１
に記載のモノクローナル抗体又はその結合フラグメン
ト。 - 【請求項４】 １μｇ／匹未満の用量で抗原非投与時に
は致死量のヒトＴＮＦαからマウスに完全な保護を提供
できることを特徴とする請求項１に記載のモノクローナ
ル抗体又はその結合フラグメント。 - 【請求項５】 ヒト腫瘍致死因子βも同様に認識できる
ことを特徴とする請求項１に記載のモノクローナル抗体
又はその結合フラグメント。 - 【請求項６】 Ｆｖ、Ｆａｂ又はＦ（ａｂ’）2フラグ
メントを表すことを特徴とする請求項１に記載のモノク
ローナル抗体。 - 【請求項７】 請求項１に記載のモノクローナル抗体を
分泌する安定なハイブリドーマ細胞系及びその子孫。 - 【請求項８】 ハイブリドーマ細胞系７８（ＥＣＡＣＣ
仮受託番号９０１１０７０７）及びその子孫。 - 【請求項９】 請求項７に記載の安定ハイブリドーマ細
胞系の製造方法であって、不滅化細胞を、ヒトＴＮＦα
で免疫したマウス由来細胞と融合することを特徴とする
方法。 - 【請求項１０】 ハイブリドーマ細胞系７８から得られ
るような請求項１に記載のモノクローナル抗体又はその
結合フラグメント。 - 【請求項１１】 活性成分として請求項１に記載のモノ
クローナル抗体又はそのフラグメントと、医薬上許容可
能なキャリヤー及び／又は希釈剤とを含有する医薬組成
物。 - 【請求項１２】 ヒトＴＮＦα及び／又はヒトＴＮＦβ
が病原効果を発揮する疾患状態において予防薬及び／又
は治療薬として使用するための請求項１に記載のモノク
ローナル抗体又はその結合フラグメント。 - 【請求項１３】 抗細菌又は抗新生物治療から生じる副
作用を予防又は治療するために使用される請求項１に記
載のモノクローナル抗体又はその結合フラグメント。 - 【請求項１４】 請求項１に記載のモノクローナル抗体
又はその結合フラグメントと、抗生物質、抗微生物剤も
しくは抗細菌剤又はその２種以上の混合物とを含有し、
抗微生物及び抗細菌療法において同時、別々又は順次使
用される組み合わせ調製物としての製品。 - 【請求項１５】 請求項１に記載のモノクローナル抗体
又はその結合フラグメントと抗腫瘍剤とを含有し、抗癌
療法において同時、別々又は順次使用される組み合わせ
調製物としての製品。 - 【請求項１６】 体液サンプル中のヒトＴＮＦα濃度の
検出方法であって、請求項１に記載のモノクローナル抗
体又はその結合フラグメントにサンプルを接触させるこ
とを特徴とする方法。 - 【請求項１７】 ヒトＴＮＦαレセプター及びヒトＴＮ
Ｆβレセプターに結合することを特徴とするモノクロー
ナル抗イディオタイプ抗体。
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