HUT61487A

HUT61487A - Process for producing aerosol pharmaceutical composition comprising autoantigens

Info

Publication number: HUT61487A
Application number: HU922072A
Authority: HU
Inventors: David A Hafler; Howard L Weiner
Original assignee: Brigham & Womens Hospital; Autoimmune Inc
Priority date: 1989-12-20
Filing date: 1990-12-17
Publication date: 1993-01-28
Also published as: CA2070281A1; DE69033487T2; KR0185747B1; HU9202072D0; ATE190496T1; ES2144398T3; HU210715A9; IL96734A0; AU6979191A; JP2625253B2; EP0506785A4; DE69033487D1; EP0506785B1; BR9007950A; DK0506785T3; KR920703081A; AU642693B2; EP0506785A1; CA2070281C; JPH05504341A

Description

A találmány javított eljárással foglalkozik autoimmun betegségek kezeléséhez. Pontosabban a találmány autoantigéneknek és az ilyen autoantigének biológiailag aktív fragmentumainak vagy analógjainak beadására irányul aeroszol formában autoimmun betegségek megel-őzésére vagy gyógykezelésére. A találmány magában foglalja az autoimmun betegségek emlősökben való kezelésében használatos aeroszolos kezelést is.

Az autoimmun betegségeket abnormális immunválasszal lehet jellemezni, amelyben sejtek vagy antitestek érdekeltek, és amely minden esetben normális autológ szövetek ellen irányulnak.

Az autoimmun betegségeket emlősökben általában két különböző kategória valamelyikébe lehet osztályozni: sejt-közvetített (pl. T-sejt-közvetített) betegségek vagy antitest-közvetített rendellenességek. A sejt-közvetített betegségekre nem korlátozó jellegű példák a sokoldalú bénulás (sclerosis multiplex), izületi csúz (rheumatoid arthritis), autoimmun pajzsmirigy gyulladás (thyroiditis), cukorbaj (diabetes mellitus; ifjúkori rohamszerű cukorbaj) és az autoimmun uveoretinitisz. Az antitest-közvetített autoimmunbetegségek közt található a súlyos izomgyengeség (myasthenia gravis) és a szisztémás vörhenyes bőrfarkas (systhematic lupus erythematosus ; SLE ) .

Az autoimmun betegségek mindkét kategóriájánál a jelenlegi kezelés olyan gyógyszerek beadását foglalja magában, amelyek nem fajlagosan szorítják vissza az immunválaszt. Az ilyen gyógyszerekre példák lehetnek a metotrexát, ciklofoszfamid, imuran (azatioprin) és ciklosporin A. Több esetben alkalmazhatók szteroid vegyületek is, mint pl. prednizon és metil-prednizolon. Ezeknek a gyógyszereknek korlátozott hatékonysága van mind a sejt-, mind az anti

- 3 test-közve£ített autoimmun-betegségekre. Az ilyen gyógyszerek alkalmazása toxikus mellékhatásaik miatt korlátozott, és a miatt is korlátozott, mert ezek globális immun-elfojtást indukálnak azokban a betegekben, akik hosszantartó kezelést kapnak a gyógyszerrel; így pl. a normális védő immunválasz patogén mikroorganizmusokra alulszabályozódik, ezáltal növekszik az ezen patogének által okozott fertőzések kockázata. Fokozott a· kockázata annak és ez további hátrány -, hogy rosszindulatú betegségek fejlődnek ki az olyan betegekben, akik megnyujtott idejű globális immun-elfojtást kapnak.

Más terápiákat is javasoltak autoimmun betegségek kezelésére. A 65,794 számon bejelentett amerikai egyesült államok-beli bejelentés, amelyet 1987. június 24-én nyújtottak be (és most visszavonták) és az ezzel összefüggő PCT/US88/02139 számú nemzetközi szabadalmi bejelentés, amelyet 1988. június 24-én nyújtottak be, leírja, hogy a mielin bázisos fehérje (MDP)és betegség-indukáló és nem-indukáló fragmentumai és analógjai viszonylag magas szintjeinek orális vagy enterális beadása hatékony az akut monofázisos kísérleti allergiás enkefalomielitisz (experimental allergic encephalomyelitis; EAE), egy T-sejt közvetített, a mielin bázisos fehérje ellen irányuló autoimmun betegség elfojtásában. Az EAE ismert és széles körben alkalmazott állati modell a sokoldalú bénuláshoz (sclerosis multiplex; MS). A fentebb megnevezett bejelentések azt is leírják, hogy a Mycobacterium tubercolosis orális vagy enterális beadása hatékony kezelést jelent az adjuváns izületi gyulladás visszafojtására, és a fenti eredményeket extrapolálják más autoimmun betegségek kezelésére.

A függőben levő 379,778 bejelentési számú amerikai egyesült

J

- 4 államokbeli szabadalmi bejelentés, amelyet 1989. július 14-én jelentettek be, leírja S-antigén orális vagy enterális beadását autoimmun uveoretinitisz kezeléséhez.

Sokféle eljárást alkalmaztak az EAE antigén-fajlagos elfojtásának indukálására, pl. immunizálást inkomplett Freund féle adjuvánsban emulgeált MBP-vel ^Lando Z. és munkatársai: J.P. Immunoi. 126, 1526 (1981) , vagy limfoid sejtekkel kapcsolt MBP intravénás injektálását [^Sriram és munkatársai: Cell Immunoi., 75., 378 (1983)].

Traugott és munkatársai . Neurol. Sci. 5 6, 65-73 (1982)], és Raine és munkatársai |_Lab. Investigation 48 , 275-84 (1983 )J azt a kitanítást adják, hogy krónikusan visszatérő EAE-ben szenvedő tengerimalac törzsnek a kezelése MBP parenterális beadásával önmagában vagy inkomplett Freund-féle adjuvánsban (IFA) vagy galaktocerebroziddal, a mielin egy lipid hapténjével kombinálva elfojtja az EAE klinikai tüneteit.

Belik és munkatársai ]vopr. Mev. khin. 24 , 372-377 (1978)] az angol nyelvű kivonat szerint leírják alkálikus mielin fehérje fragmentum (AMPF) és szintetikus enkefalitogén peptid (SEP) parenterális beadását tengeri malacoknál EAE esetében. Az állatokat előzőleg szarvasmaha AMPF-fel vagy szintetikus SEP-pel érzékenyítették, de AMPF beadásával meggyógyították.

Braley-Mullen és munkatársai ]_Cell. Immun. 5 1 , 408 (1 980)] leírják a kísérleti autoimmun pajzsmirigy-gyulladás tüneteinek visszafojtását tengeri malacokban tiroglobulin antigén injekciójával IFA-ban .

Nagler-Anderson és munkatársai ^Proc. Natl. Acad. Sci. USA • · · ·

83, 7443-7446 (1936) leírják a kollagén orális beadását a kollagénnel indukált izületi.gyulladás elfojtására egér modellen. A II. típusú kollagénnel indukált izületi gyulladást (artritiszt) az egerekben visszaszorítja az oldható, de nem denaturált, II. típusú antigén gyomron keresztüli beadása az állat immunizálása előtt II. típusú kollagénnel valamely adjuvánsban. A Nagler-Anderson antigént nem adták be aeroszol formában.

Más kutatók megvizsgálták az aeroszol formájú fehérjék hatásait a genetikai betegségek kezelésére az IgE válasz módosítására emlősökben.

Hubbard R.C. és munkatársai £ Proc. Na11. Acad. Sci. USA 86, 680-684 (1989)J bemutatták az emlősöknek aeroszol formában beadott fehérjék alkalmazhatóságát. Hubbard és munkatársai leírják egy viszonylag nagy a 1fa-antitripszin (AAt) fehérje beadását a tüdő hámfelületen keresztül alfa anti-tripszin hiány, egy öröklött genetikai betegség kezelésére. Az AAt-t, ezt a 45000 dalton molekulatömegű egyláncú polipeptidet (amely a neutrofil elasztáz inhibitoraként működik), juhoknak adták be aeroszol formájában. Az aeroszolba vitt AAt teljesen működőképes és ép maradt azoknak az emlősöknek a szöveteiben, amelyeknek az anyagot beadták, és k e resztüldiffun ált az alveoláris hámszöveten, amelyet az AAt jelenléte bizonyított a tüdő-, nyirokmirigy- és vérszövetekben.

Holt P.G. és munkatársai [immunoi. 42 , 409-41 7 ( 1 981 )] leírták a fajlagos IgE válaszok gátlását egerekben olyan módon, hogy belélegzett antigénes előkezelést biztosítottak. Az egereket aeroszol formájú ovalbumin hatásának tették ki hetenként egyszer hét héten át; ez az IgE válaszok elfojtását idézte elő, amikor ezeket az állatokat intraperitoneálisan oldott vagy timsóval kicsapott ovalbuminnal provokálták.

Sedgwick J.D. és munkatársai Immunoi. 56, 635-642 (1985) • «

- 6 beszámoltak egy fajlagos IgE válasz belélegzett antigénre adott alulszabályozásáról ,. Patkányok ismételt kitevése aeroszol formájú ovalbuminnak hordozó-fajlagos tűrést indukált az ezt követő provokálás során azonos antigénnel.

Holt E.G. és munkatársai ^Immunoi. 60, 97-102 (1987)J leírják, hogy egerek vagy patkányok ismételt inhaláltatása alacsony szinten ovalbuminnal előnyösen tűrést indukált az IgE antitest osztályra, és lehetségesnek vélték, hogy ez a folyamat egy fontos védekező mechanizmust képvisel, amely normálisan megakadályozza egy emlős allergiás túlérzékenyítéséta levegő-eredetű antigénekre.

Sedgwick J.D. és munkatársai ^Cell Immunoi. 94, 182-194 (1985 leírták, hogy a nagy IgE-válasszal bíró patkányok ismételt kitevése hetenként egyszer valamely antigén aeroszoljának beindította az antigén-fajlagos IgG fokozatosan növekvő szintjeit a szérumban. Splenociták adoptált átvitele aeroszolnak kitett állatokból eredeti patkányokba az IgE válaszok visszafojtását idézi elő a nélkül, hogy hatással lenne az IgG válaszokra.

Senki sem javasolt vagy írt le ezekben az irodalmi helyekben eljárást vagy/echnikát autoimmun betegségek kezelésére vagy megelőzésére. A találmány egyik tárgya eljárás autoimmun betegségekben szenvedő emlősök kezelésére.

A találmány másik tárgya gyógyászati kiszerelés autoimmun betegségekben szenvedő emlősök kezeléséhez.

A találmány még további tárgya kiszerelés emlősöknek való beadáshoz abból a célból, hogy az ilyen emlősökben megakadályozzuk vagy kezeljük az autoimmun betegségeket.

A találmány ezen tárgyai és további tárgyai szakember számára nyilvánvalóak lesznek az ez után következő leírásból, ábrákból ···· *4 · 4 ·· ··

- 7 és igénypontokból.

Az alábbiakban röviden ismertetjük az ábrákat.

Az 1. ábra olyan grafikus ábrázolás, amely az orálisan bevezetett MBP különböző koncentrációinak betegség-e1fojtó hatásait mutatja be az EAE lefolyására és súlyosságára.

A 2. ábra grafikus ábrázolás, amely az aeroszol formájában bevezetett MBP különböző koncentrációinak betegség-elfojtó hatásait mutatja be az EAE lefolyására és súlyosságára.

A 3(A-D) ábra grafikonok sorozata, amelyek közvetlenül öszszehasonlítják GP-MBP különböző dózisainak hatását az EAE lefolyására és súlyosságára, amikor orálisan vagy aeroszol formájában adják be ezeket.

A 4. ábra grafikus ábrázolás, amely bemutatja a GP-MBP fragmentumok hatását az EAE lefolyására és súlyoságára.

Az 5. ábra grafikus ábrázolás, amely bemutatja az állatok kezelését EAE indukálása után.

A 6. ábra grafikus ábrázolás, amely bemutatja a különböző, aeroszollal bevezetett fehérjék hatását az EAE-re.

A 7. ábra grafikus ábrázolás, amely bemutatja az aeroszolba vitt kollagén hatását a kollagénnel indukált izületi gyulladás lefolyására és súlyosságára.

A 8. ábra grafikus ábrázolás, amely bemutatja az EAE elleni immunitás átvitelét befogadó állatokba a találmány szerinti eljárással kezelt állatokból izolált lépsejtek közvetítésével. Az alábbiakban röviden összefoglaljuk a találmányt.

Arra jöttünk rá, hogy javított és hatékonyabb eljárást jelent az autoimmun betegségek megelőzésében és kezelésében emberekben, ha a megelőzendő vagy kezelendő autoimmun betegségre fajla • ·

- 8 gos egy vagy .több autoantigént aeroszol formában adjuk be az említett emlősnek.

Egyik szempontja szerint a találmány eljárást nyújt autoimmun betegség kezelésére vagy megelőzésére emlősökben, amely eljárás abban áll, hogy emlősnek egy aeroszol kompozíció hatékony mennyiségét adjuk be, amely kompozíció legalább egy autoimmun elfojtó szert tartalmaz az alábbiak közül: az adott autoimmun betegségre fajlagos autoantigének az ilyen autoantigének autoimmun elfojtó fragmentumai és analógjai.

Egy másik szempontja szerint a találmány magában foglalja az aeroszolos kiszerelési formákat az autoimmun betegségek emlősökben kezelésére való felhasználásra. Az adagolási kiszerelések magukban foglalnak legalább egy autoimmun elfojtó szert az alábbiak közül: az adott autoimmun betegségre fajlagos autoantigének, és az ilyen autoantigének autoimmun elfojtó fragmentumai és analógjai.

Az alábbiakban részletesebben ismertetjük a találmányt.

Az összes'szabadalmi bejelentés, szabadalmi leírás és irodalmi hivatkozás, amelyre a leírásban utalunk, teljes terjedelmében beépül a jelen bejelentésbe.

Arra jöttünk rá, hogy autoantigéneknek( vagy ezek autoimmun elfojtó fragmentumainak vagy analógjainak) beadása aeroszol formában hatékony autoimmun betegségek kezelésére emlősökben. Ebben a felfedezésben az a különösen meglepő és nem várt fejlemény, hogy az autoantigének beadása aeroszol formában hatékonyabb az autoimmun betegségek megelőzésében és kezelésében emlősökben, mint ugyanannak az antigénnek a beadása szilárd formában szájon keresztül. A felfedezésben az is meglepő, hogy az autoimmun betegségek haté• « 4 ·««

- 9 kony elfojtását és megelőzését el lehet érni emlősökben az ilyen autoantigének kisebb mennyiségét alkalmazva aeroszol formában, mint a szilárd adagolási formák beadásánál. Az autoantigének aeroszolos beadásáról úgy találjuk, hogy hatékony mind a sejtközvetített, mind az antitest-közvetített autoimmun válaszok elfojtásában .

Az autoimmun betegségekre, amelyeket a találmány szerinti eljárást alkalmazva kezelhetünk vagy megelőzhetünk, nem korlátozó jellegű példák a sokoldalú bénulás (sclerosis multiplex), az izületi csúz (rheumatoid arthritis), a súlyos izomgyengeség (myasthenia gravis), az autoimmun pajzsmirigy-gyulladás (thyroiditis) , a cukorbaj (diabetes mellitus; ifjúkori rohamszerű cukorbaj), az autoimmun uveoretinitisz, a szisztémás vörhenyes bőrfarkas (systemic lupus erythematosus; SLE vagy lupusz), adrenalitisz és a krónikus aktív májgyulladás (hepatitisz).

Ahogyan itt használjuk, az aeroszol kifejezés olyan finoman eloszlatott szilárd vagy folyékony részecskékre utal, amelyeket valamely nyomás alatt álló rendszer, pl. porlasztó alkalmazásával lehet kialakítani. A folyadék vagy szilárd forrásanyag tartalmaz autoantigeneket és/vagy ezek autoimmun betegségeket elfojtó fragmentumait vagy analógjait, amint ezeket itt meghatározzuk.

Egy autoimmun betegség emlősök (beleértve az embert is) immunrendszerének hibás működése. Egy ilyen betegségben szenvedő emlősben az immunrendszer nem tud különbséget tenni vagy nem tesz különbséget az emlősön belül exogén (idegen) anyagok és az autológ szövetek vagy anyagok között. Ennek megfelelően az immunrendszer úgy kezeli autológ szöveteit (ön-antigének) és anyagait, mintha azok idegenek lennének, és kiváltja a burjánzási immun védekezést, • * · · > · ♦ « * ««· · ·· « · « · · ♦ · * »· * • •«1 »· ·» * * * ♦

- 10 amely pedig általában az exogén (idegen) szövetek vagy behatoló mikroorganizmusok elleni felhasználásra vannak fenntartva. Lényegében a normális immunrendszer egyik karja megváltozik és burjánzási válasz indul be az autológ szövetek ellen.

Ahogyan itt használjuk, az emlős kifejezés minden olyan életformára utal, amelynek immunszabályozó rendszere van és ennél fogva fogékony lehet autoimmun betegségekre.

Ahogyan itt használjuk, az autoantigén kifejezés bármely olyan anyagra utal, amely normálisan megtalálható egy emlősön belül, és (1) amelyet nem úgy ismernek fel az adott emlős limfocitái vagy antitestei, mint részeit az emlősnek magának, (2) amelyet megtámad az emlős immunzabályozó rendszere, mintha az ilyen antigén idegen anyag lenne, és (3) amely úgy működik, hogy alulszabályozza az immunrendszernek azt a karját, amely a fajlagos autoimmun betegség előidézéséért felelős. Az autoantigén kifejezés magában foglalja azokat az antigén anyagokat is, amelyek egy autoimmun betegség tüneteivel bíró körülményeket indukálnak, amikor emlősökbe vezetjük be ezeket.

Ahogyan itt használjuk, az autoimmun elfojtó fragmentum magában foglal bármely olyan peptidet vagy polipeptidet, amely az autoantigének részleges aminosavszekvenciáit vagy részeit tartalmazzák, és amelyek rendelkeznek azzal a képességgel, hogy aeroszol formában beadva elfojtsák vagy megakadályozzák az autoimmun választ. Az ilyen fragmentumoknak nem szükséges birtokolniok a teljes autoantigén tulajdonságait. Nem korlátozó példaként megemlítjük, hogy amikor MBP-t vezetünk be parenterálisan emlősökbe valamely adjuváns jelenlétében, ez fogékony emlősökben

EAE-t indukál . Arra jöttünk rá, hogy az MBP-nek bizonyos, betegséget nem indukáló fragmentumai (vagyis az MBP olyan fragmentumai, amelyek .valamely adjuvánssal együtt parenterálisan beadva nem indukálnak EAE-t) mégis bírnak autoimmun-e1 főj tó aktivitással, amikor ezeket orálisan (vagy enterálisan) vagy aeroszol formában vezetjük be EAE-ben szenvedő emlősökbe. Az ilyen fragmentumokra példákat adnak meg a 65,734 számon benyújtott amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés, a PCT/US88/02139 számú nemzetközi bejelentés, valamint a jelen bejelentés 2. és 6. példái.

Ahogyan itt használjuk, az ilyen autoantigéneknek vagy fragmentumainak analógjai)' kifejezés olyan anyagokra utal, amelyek szerkezetileg rokonok ezekkel az antigénekkel vagy immun-elfojtó fragmentumaikkal, és amelyek azonos biológiai aktivitással bírnak, azaz képesek eltüntetni vagy visszafojtani az autoimmun választ aeroszolos beadás esetén. Nem korlátozó példaként ez a kifejezés magában foglal olyan aminosav-szekvenciájú peptideket,· amelyek különböznek az autoantigén vagy betegségelfojtó fragmentumai aminosavszekvenciájától egy vagy több aminosavgyökkel (miközben az autoantigén vagy fragmentum autoimmun-elfojtó aktivitása megőrződik), továbbá magában foglal olyan anyagokat, vegyületeket vagy kompozíciókat, amelyek utánozzák az autoantigén autoimmun-visszafojtó aktivitását, amennyiben képesek elfojtani vagy enyhíteni a betegség tüneteit. Példa lehet egy szövet valamely olyan szervből, amely az autoimmun betegségben az immunrendszer egyik karja támadásának célpontja, pl. a hasnyálmirigy a cukorbajban vagy a központi idegrendszer fehér állománya sokoldalú bénulásban. Az analógra másik példa lehet az S79 peptid, amelyet a függőben levő 65,734 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelntés ismertet (benyújtva 1984. június 24-én).

• ·

- 1 2 Ahogyan itt alkalmazzuk az autoimmun-betegség visszafojtó szer vagy autoimmun visszafojtó szer kifejezés olyan anyagokra vagy kompozíciókra utal, amelyeket aeroszol formában be lehet vezetni emlősökbe, hogy elfoj tsa^ megakadályozzák vagy halsszzák az adott autoimmun betegség klinikai kitörését vagy megnyilvánulását. A kifejezés magában foglalja azokat az autoantigéneket, amelyek aktívak egy adott autoimmun betegség ellen, valamint ezek autoimmun-elfojtó fragmentumait vagy analógjait a fentebbi meghatározás szerint.

Ahogyan itt alkalmazzuk, a kezelés megelőző beavatkozásra utal, hogy megelőzzünk valamely autoimmun betegséget valamely fogékony egyénben, vagy egy érintett egyénben már aktív autoimmunbetegség kezelésére utal.

A találmány szerinti autoimmun-visszafojtó szerek által indukált tűrés dózisfüggő; az aeroszol anyag széles dózistartományának vizsgálata után arra jöttünk rá, hogy a betegség (EAE) klinikai megnyilvánulásainak elfojtása (vagy gyengítése) növek„ szik a beadott aeroszollá alakított autoimmun-visszafojtó szer növekvő adagolási szintjeivel, amint ezt a 2-9. példákban a későbbiekben bemutatjuk. Dózisfüggés látható az izületi gyulladások rendszerében is. Ezen kívül valamely nem idetartozó antigén (pl. olyan antigén, amely nem érdekelt az adott autoimmun betegségben, vagy pl. az MBP bizonyos szintetikus fragmentumai) aeroszolos beadásának nincs hatása az autoimmun betegség klinikai megnyilvánulására.

Az autoantigének beadása és az aeroszolos út az autoimmun betegségek kezelésére számos előnnyel bír a beadás más útjaival összehasonlítva. A beadás könnyű volta az egyik fontos előny. Amint • · · ·

- 13 a 2. példában látható, az-MBP aeroszolos beadása lényegében kisebb dózisokban is hatásos az EAE kezelésében, mint azok a dózisok, amelyek ennek a betegségnek a kezeléséhez az esetben szükségesek, amikor ugyanazt a szert orálisan adjuk be, szájon át szilárd adagolási formában. További előny az, hogy az aeroszolos beadási út a találmány szerinti autoimmunogén szereket kevésbbé teszi ki a gyomornedvek bontó hatásának, amelyek pedig csökkenthetik az ilyen szerek hatékonyságát.

Meg kell jegyeznünk, hogy a találmány szerinti autoimmun elfojtó szerek, amelyeket a kezelt állat aeroszolos beadás segítségével megkap, mennyisége lényegesen kevesebb, mint a szer összes mennyisége, amelyet beadunk. Úgy véljük, hogy a porlasztóban jelen levő teljes adagnak ténylegesen csak 1/200 részét veszi fel a kezelt állat tüdőfelülete. A ketrecekbe porlasztóit autoimmun elfojtó szer többségét az állatok nem lélegzik be, hanem _{ez ne;n} fajlagosan megtapad a ketreceken és az állatokon. Ennek megfelelően az aeroszolos beadás jóval hatásosabb, mint az orális vagy enterális beadás, ahol az utóbbi esetben az autoimmun visszafojtó szer teljes mennyiségét átadjuk a kezelt állatnak.

Különböző modell-rendszereket fejlesztettek ki az autoimmun betegségek tanulmányozására. A kísérleti allergiás enkefa 1omielítisz (EAE) indukált, T-sejt közvetített autoimmun betegség, amelyet egerekben és más emlős fajokban tanulmányoztak, mint a sokoldalú bénulás (MS) modelljét számos emlősfajban. A betegséget MBP és egy adjuváns (pl. Freund-féle komplett adjuváns) parenterális beadása indukálja. Ez a kezelés indukálja a demielinező betegség mind monofázisos, mind súlyosbodó/enyhülő formáját (a fajtól és a beadás részletéitől függően). Az indukált betegség az MS jellem • · · · • · • · • ·

- 14 zőivel bír. A Mycobacterium tubercolosis parenterális beadása Freund-féle komplett adjuváns-olajbán fogékony állatok hátoldali faroktövébe olyan betegséget indukál, amely a humán izületi csúz tulajdonságaival bír. Ezen kívül S-antigén és valamely adjuváns beadása Lewis patkányoknak autoimmun uveoretinitiszt indukál. Cukorbaj fejlődik ki spontán a NŐD egerekben és a BB patkányokban. Ezen modellrendszerek különböző típusait alkalmazhatjuk, hogy bemutassuk a találmány által nyújtott javított kezelési mód hatékonyságát.

A találmányt alkalmazhatjuk sokféle autoimmun betegség kezeléséhez, legyen az akár antitest-közvetített, akár sejt-közvetített. Amint a későbbi 6. és 7. példákban bemutatjuk, valamely autoantigén (tengerimalac MBP) és betegség elfojtó fragmentumai aeroszolos beadása visszafojtást idéz elő mind a sejt-közvetített (pl. késleltetett típusú túlérzékenységi reakciók), mind az antitest-közvetített immunválaszokban. Ezen kívül, amint a 3. példában szereplő adatokban bemutatjuk, ezt az elfojtást aktívan közvetítik a lépsejtek, ebben a tünetben az aktív celluláris elfojtás szerepét sejtetve. Ennél fogva - akárcsak ez az autoantigének beadása által közvetített immun elfojtás esetében amelyet a 65,734 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentésben és az ezzel kapcsolódó PCT/US88/02139 számú nemzetközi bejelentésben ismertetnek - az autoantigé^ne.k aeroszolos beadásáról úgy véljük, hogy legalábbis részben az elfojtó (szuppresszor) T-sejtek tevékenysége játszik közvetítő szerepet. Azokra az autoimmun betegségekre, amelyek sejt-közvetítettek, nem korlátozó jellegű példák az alábbiak: sokoldalú bénulás (sclerosis multiplex), izületi csúz (rheumatoid arthritis), autoimmun uveoretinitisz, cukorbaj, és autoimmun pajzsmirigy-gyu11 adás (thyroiditisz). Az antitest-kőzve- 15 -

···· ·« · · ·· ·· tített betegségek között találjuk a súlyos izomgyengeséget (myasthenia gravis), szisztémás vörhenyes bőrfarkast(lupus erythematosus; SLE), a bőrhólyagosodást(pemphigus) és a trombikus trombocitopéniás purpuriát.A betegség-modellek és az ezen betegségek aeroszolos formájú kezelésében hatékony fajlagos antigének nem korlátozó jellegű listáját az 1. táblázatban adjuk meg.

1. TÁBLÁZAT

Betegség modell

Sokoldalú bénulás (sclerosis multiplex)

Izületi csúz (rheumatoid arthritis)

Autoimmun pajzsmirigy-gyulladás (thyroiditis)

Súlyos izomgyengeség (myasthenia gravis)

Autoimmun uveoretinitisz

Szisztémás vörhenyes bőrfarkas (lupus erythematosus)

Krónikus aktív májgyulladás (hepatitis)

Adrenalitisz

Polimiozitisz

Fajlagos autoantigén

MBP

Kollagén

Tiroglobulin

Acetilkolin receptor

S-antigén

DNS

Májkivonat

Mellékvese-kivonat

Izomkivonat

Autoimmun hemolitikus vérszegénység

Reumás szívizomgyulladás

Bőrhegesedés (scleroderma)

Hematopoietikus sejtek

Szívkivonat

Bőrsejt-kivonat • ·

- 16 Bármely autoimmun betegségnél alkalmazhatunk szővetkivonatokat, valamint fentebb leírt fajlagos antigéneket.

További autoimmun betegségeket és ezek fajlagos autoantigénjeit és/vagy célszöveteit írják le Schwartz R.S. és munkatársai a Fundamental Immunology című szakkönyvben ^2. kiadás; szerkesztő: Paul W.E., kiadó: Raven Press, New York (1989), 819-859. oldal].

A találmányban való felhasználáshoz antigéneket izolálhatunk abból a szövetből, amely az adott autoimmun betegség célpontja, így pl. a mielin bázisos fehérje (MBP), amely az MS kezelésében nyerhet alkalmazást, emlősökből izolálható és tisztítható Diebler és munkatársai (fentebb idézett munka) eljárása szerint, amint ezt később az 1. példában bemutatjuk.

Amikor valamely betegséget, amely az izületi csúz tüneteivel bír, kezelünk, az ehhez szükséges kollagént Trenthon és munkatársai eljárásával izolálhatjuk és tisztítjuk Exp. Med. 146, 857 ( 1977 )] .

Az autoimmun uveoretinitisz kezeléséhez a tisztított S-antigént úgy kaphatjuk meg, ahogyan ezt a 379,778 számú, még függőben levő amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentésben leírják.

A súlyos izomgyengeség kezeléséhez tisztított acetil-kolin receptor Mclntosh és munkatársai eljárásával izolálható . Neuroimmunol. 2j>, 75 ( 1 989 )] .

Az autoantigének fragmentumai és analógjai a jelen találmányban való hasznosításhoz szintetizálhatok a szakterületen jól ismert szilárd fázisú szintézis technikájában, ilyeneket ismertetnek pl. az alábbi közlemények: Merrifield R.B.; Fed. Proc. Am. Soc. Ex. Bioi. 2 1, 41 2 ( 1 962 ); J. Am. Chem. Soc. 85 , 21 49 ( 1 963);

• 4 · és Witchel A.R. és munkatársai, valamint Tam J. és munkatársai: J. Am. Chem. Soc. 98 , 7357 ( 1 976) . Analógokat úgy alkothatunk meg, hogy azonosítunk egy ekvivalens aminosavszekvenciát, és ennek előállításához felhasználjuk a fentebb leírt peptid-szintézis technikákat.

Analógokat szolgáltathatunk a GP-MBP ismert j^Hashim G. a Meylin: Chemistry and Biology című könyvében, szerkesztő: Lisa

Alan R., New York aminosavszékvéneiáj át alkalmazva, továb bá alkalmazva a fentebb leírt technikákat és az alábbi szakkönyvben leírtakat: Eyler E.H.: Advances in Experimental Medicine and Biology 98 , 259-281 ( 1 978 ). így pl. így pl. egy peptidet, amely a GP-MBP 72.-85. aminosavainak megfelelő szekvenciával bír (lásd Hashim fentebb idézett munkáját) kémiai úton szintetizálhatunk a fentebb leírt technikát alkalmazva, azzal a változtatással, hogy a terminálisnál az aszparagint glutaminnal helyettesítjük. A peptidet megvizsgálhatjuk betegség-elfojtó hatásra aeroszolos formában azt a technikát alkalmazva, amelyet a későbbiekben a 2. példában leírunk.

Betegség-elfojtó analógokat és fragmentumokat kaphatunk rekombináns DNS technikák alkalmazásával is a szakterületen jól ismert eljárásokkal.

A találmány aeroszolos gyógyászati kiszereléseket és adagolási formákat is nyújt autoimmun betegségekben szenvedő emlősök kezeléséhez. Általában az ilyen adagolási formák egy vagy több autoimmun elfojtó szert tartalmaznak az alábbiak közül: az autoimmun betegség ellen irányuló autoantigének és az ilyen autoantigének betegség-e 1fojtó fragmentumai és analógjai; a kiszerelési forma ezeket olyan mennyiségben tartalmazza, amely hatékony az • · » · · • ··· ··· · · • ·· «· · · · ·· ·· *♦ ·♦

- 18 adott autoimmun betegség klinikai tüneteinek kezelésére vagy megelőzésére. Az autoimmun betegség egy vagy több tünetének statisztikailag szignifikáns gyengítése, amelyet a jelen találmány eljárása szerinti kezeléssel értek el, úgy tekintendő, mint az ilyen betegség ^{ne:< 3} találmány oltalmi körén belül levő kezelése.

Tudatában kell lenni annak, hogy az egyes adagolási formák egyedi aeroszolos dózisában levő aktív alkotórész-tartalomnak egymagában nem szükséges hatékony mennyiséget alkotnia az adott autoimmun betegség kezeléséhez, mivel a szükséges hatékony mennyiséget a dózis-egység többszörös beadásával érhetjük el.

A találmány szerinti gyógyászati kiszerelés magában foglalhat kívánt esetben alkotórészként a szakterületen jól ismert gyógyászatilag elfogadható hordozókat, hígítókat, szolubilizáló és emulgeáló szereket, valamint sókat. Az ilyen anyagokra példák lehetnek a normális konyhasóoldatok, pl. a pufferolt fiziológiás konyhasóoldat, és a víz.

A találmány szerinti elfojtó szerek beadásának útja lehet aeroszolos vagy inhalált beadás. A találmány szerinti elfojtó szert beadhatjuk száraz porként, vagy vizes oldatban. Az előnyös aeroszolos gyógyászati kiszerelések tartalmazhatnak pl. valamely fiziológiailag elfogadható, pufferolt fiziológiás sóoldatot, amely mintegy 0,15 mg és 300 mg közti mennyiségben tartalmaz találmány szerinti, a kezelendő autoimmun betegségre fajlagos autoimmun-elfojtó szereket.

A találmány gyakorlai kivitelezésében alkalmasak lehetnek a száraz aeroszolok is finoman eloszlatott, szilárd autoantigén részecskék formájában, amelyek nincsenek folyadékban oldva vagy ·· « *♦ ·· ** ·· • · · · · · · • ««··**· 4 · • * ·« · · ·· · *«·* 9>· ·· *· ··

- 19 szuszpendálva. Az autoantigének lehetnek hintőpor formájában és tartalmazhatnak nagyon finom eloszlású részecskéket, amelyek átlagos részecskemérete 1 és 5yAm, előnyösen 2 és 3jAm között van. Finoman eloszlatott autoantigén részecskéket állíthatunk elő porítással és szitán átengedéssel, a szakterületen jól ismert technikákat alkalmazva. A részecskéket bevezethetjük a finoman eloszlatott anyag - amely lehet por formájában - előre meghatározott mennyiségének inhalálásával. ·

A találmány szerinti gyógyászati kiszerelésekben alkalmas hordozókra és/vagy hígítókra speciális, nem-korlátozó példák lehetnek a víz és a fiziológiailag elfogadható, pufferolt sóoldatok, pl. a foszfáttal pH 7,0-8,0 értékre pufferolt fiziológiás konyhasóoldat.

Általában az autoantigént, fragmentumot vagy analógot valamely emlősbe aeroszol formában olyan mennyiségben adjuk be az említett emlősnek, amely a 0,1 mg/testtömeg kg és 15 mg/testtömeg kg között van naponta; és bevezethetjük egyetlen adagolás formájában vagy többszörös adagolás formájában. Az autoantigént, fragmentumot vagy analógot előnyöen olyan mennyiségben adjuk be a nevezett emlősnek, amely 1 mg és 10 mg/testtöemg kg között van naponta. A betegnek beadandó pontos mennyiség változó a beteg betegségének súlyosságától és a beteg fizikai állapotától függően.

A találmány szerinti gyógyászati kiszerelést beadhatjuk aeroszolos permet formájában, pl. olyan porlasztó alkalmazásával, amelyet az alábbi lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírások ismertetnek: 4,624,251 (megadva 1986. november 25én); 3,703,173 (megadva 1972. november 21-én); 3,561,444 (megadva 1971. február 9-én), és 4,635,627 (megadva 1971, január 13-án).

Az aeroszolba vitt anyagot a kezelendő személy vagy állat inhai • * · · * · · • ····»··· · • · ·· · · ♦ · · ···« ·· ·« ·« «·

- 20 lálja. A jelen példákban (és a pontosság céljából) az aeroszollal kezelt állatokat hermetikusan zárt ketrecekben tartjuk, amelyben az aeroszolt eloszlatjuk. így a területegységre eső anyagmennyiséget meg tudjuk határozni, és az eredmények mennyiségi összefüggéseit úgy adjuk meg, mint aeroszol anyag egység/ketrec területegység.

Az aeroszol szolgáltatás más rendszerei, pl. a nyomás alatti, egység adagolóval ellátott dózis inhaláló (MDI) és a száraz por inhaláló - amint ezt Newman S.P. és munkatársai leírták [az Aerosols and the Lung (Aeroszolok és a tüdő) című szakkönyvben,‘ Clarké S . W. és Davia, D.(szerkesztők), 1 97-224. oldal; Butterworths, London, Anglia (1984)^ - alkalmazhatók a találmány gyakorlati kivitelezésében.

Az itt leírt típusú aeroszolos szolgáltató rendszerek számos kereskedelmi forrásból beszerezhetők, pl. a Fisons Corporation (Bedford, Massachussets), Schering Corp. (Kenilworth, New Jersey) és American Pharmoseal Co. (Valencia, Kalifornia) cégektől.

Az alább következő kiviteli példák azt mutatják be, hogy az MBP és a II. típusú kollagén aeroszol formában hatékonyak az EAE, illetve a kollagén-indukált izületi csúz elfojtásában dózis-függő módon, széles dózistartományon belül. Az MBP beadása aeroszol (folyadék) formájában hatékony az EAE elfojtásában, amikor a betegség indukálása előtt vagy után adjuk be, és eredményezi mind a betegség tünetei kitörésének késleltetését, mind a betegség súlyosságának csökkenését a kezelt állatokban. Mind a fajlagos antitestközvetített, mind a sejt-közvetített (pl. késleltetett túlérzékenységi) reakciókat lefelé szabályozza a fajlagos autoantigének vagy • * · · V ·♦ » » ··· ··· 4· * * ·« 4 · ··· • ••4 44 «4 »·· betegség-elfojtő fragmentumaik aeroszolos beadása. Ezekben a példákban az autoantigén aeroszolos beadása által indukált fajlagos immun-elfojtást a kezelt állatok lépsejtjei közvetítik és nem a csecsemőmirigyből izolált sejtjei. Ezek a lépsejtek képesek aktívan védelmet átvinni EAE ellen az ép (kezeletlen) befogadóba. Ezen kívül a szarvasmarha mielint is hatékonynak találjuk az EAE elfojtásában, akárcsak a tengerimalac MBP-t, bár az utóbbi hatékonyabb betegség-e1fojtó szer olyan patkányokban, amelyeket előzőleg GP-MBPvel immunizáltunk EAE indukálására. Végül az aeroszollal kezelt állatok hisztológiai vizsgálata azt mutatja, hogy a sejtek aktívan nem szűrődnek be a találmány szerint kezelt állatok agyába, így valamely autoantigén aeroszolos beadásáról autoimmun betegségben szenvedő állatokba kimutatható, hogy hat a betegség klinikai tüneteire, és megakadályozza, hogy a sejtek a kezelt állatok agyába vándoroljanak. Az utóbbiról úgy hisszük, hogy lehetséges mechanizmusa az EAE tüneteit okozó demielinezésnek.

A találmány további részleteit az alábbi kiviteli példákban adjuk meg.

1. PÉLDA

A jelen találmány gyakorlati kivitelezésében alkalmazott autoantigéneket az alább ismertetett eljárásokkal és technikákkal kapjuk meg.

A GP-MBP Diebler G.E. és munkatársai eljárásával [[_Prep. Biochem. _2 , 1 39 ( 1972 )[J volt tisztítva tengerimalac agyszövetből; ez Pel Freeze-től (Rogers, Arkansas) szerezhető be. Az eljárást röviden ismertetve: központi idegrendszer szövetet izolálunk és homogenizálunk kloroform-metanol oldatban, acetonnal extraháljuk,

Ο · t * · «·4· «4 ·· > ··· ··* ·

-22szűrjük, majd ugyanolyan oldatban újra szuszpendáljuk. Az oldatot acetonnal extraháljuk, leszűrjük, újra szuszpendáljuk vízben, pHját 3,0 értékre állítjuk be, és 1 órán át inkubáljuk. Az oldatot azután centrifugáljuk és extraháljuk 8 mól/literes karbamid oldattal, CM-5-öt adunk hozzá, pH-ját 11-re állítjuk be, az oldatot szűrjük, és kétszer újra szuszpendáljuk karbamidban. Az oldatot azután újból szűrjük, kétszer újra szuszpendáljuk vízben, szűrjük, újra szuszpendáljuk 0,121 n HCl-ben, szűrjük, dializáljuk 10 térfogat desztillált vízzel szemben, és felhasználás előtt liofilizáljuk.

Az alábbi példákban alkalmazott II. típusú kollagént a Genzyme cégtől (Boston, Massachussets) szerezzük be.

2. PÉLDA

Az a 1 ább^L eírt kísérletekben 6-8 hetes Lewis-patkányokát (Charles River, Wilmington, Maryland) a 0. napon az 1. igénypont szerint tisztított tengerimalac mielin bázisos fehérje (GP-MBP) 10 mikrogrammjáva1 beoltva indukálunk, ahol az aktív anyag Freundféle komplett adjuvánsban található. [_Az eljárást a J. Immunoi .140, 440 ( 1 988 ) irodalmi hely ismerteti .j.A patkányokat GP-MBP különböző , alább leírt koncentrációival kezeljük, amely koncentrációk a 0,005 és 5 milligamm között vannak, a kezelést vagy orálisan, vagy aeroszol permettel végezve.

Az orális és aeroszolosGP-MBP-1 azonos dózisban vezetjük be azonos napokon, 5 patkányból álló csoportokba.

Az aeroszolos GP-MBP-t foszfáttal pufferolt fiziológiás konyhasóoldatban adjuk be porlasztó alkalmazásával. Az aeroszolt a vizsgálati állatokba egy olyan nyilason keresztül visszük be, amely az állatokat tartó ketrec oldalában van perforálva. Az aeroszol készítéséhez egy porlasztót (American Pharmoseal Co., t

- 23 Valencia, Kalifornia, katalógusszám: 002038) rögzítünk a levegőnyomás kivezetéséhez, amely 7,4 liter oxigén-ekvivalenst szolgáltat (ez az az oxigén-mennyiség, amelyet a kórházban a porlasztáshoz használnak). A porlasztó olyan permet-cseppeket alakít ki, amelyek átmérője 0,3 mikrométer és 0,5 mikrométer között van. 25 mg GP-MBP-t, amely Diebler és munkatársai fentebb idézett munkája szerint van tisztítva, feloldunk 5 ml PBS-ben (foszfáttal pufferolt fiziológiás konyhasóoldat). Ezután 10-15 percen át permetezzük ketrecenként 5 patkánynak i^a ketrec méretei (magasság x hoszszuság x szélesség): 35 cm x 28 cm x 17,5 cm^. Az aeroszolos kezelés során finom köd alakul ki a ketrecben és a patkányok ebben csaknem szabadon mozognak. A kezelés időterve az alábbi;kezelést (orális vagy aeroszolos) adunk a -10.; -7.; -5.; -3.; 0.; +2.;

és +4. napon. Az immunizálás EAE indukálására a 0. napon akut paralitikus betegséghez vezet, amelynek tünetei a 12.-14. napon manifesztálódnak az immunizálás után. A pontozási szisztéma az alábbi: 0= normális; 1= a farok tónusának elvesztése; 2= a hátsó lábak elgyengülése; 4= az első lábak elgyengülése, és 5= haldoklás. Az EAE súlyossága 2 és 5 között változik a kísérlettől függően. Az állatokat klinikailag vizsgáljuk vak módszerrel.

Az orális GP-MBP-t úgy vezetjük be, amint ezt a PCT/US88/02139 számú nemzetközi bejelentésben és a 65,734 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentésben leírják.

Az eredményeket az 1. és 2. ábrában mutatjuk be.

Az 1. ábrában levő grafikus ábrázolás azt mutatja be, hogy a kontroll állatoknál a betegség tünetei az EAE indukálása után mintegy 12 nappal manifesztálódnak. A GP-MBP orális beadása szig

I

- 24 nifikáns csökkenést okoz a betegség tüneteiben és elhalasztja a betegség tüneteinek megjelenését az összes vizsgált csoportban; a maximális késleltetési hatások akkor lépnek fel, amikor orálisan 0,5 mg vagy 5 mg GP-MBP-t adunk állatonként.

A 2. ábrában az látható, hogy a 0,005 mg és 5 mg közti tartományban aeroszolban beadott GP-MBP szignifikánsan csökkenti az EAE betegség súlyosságát az összes vizsgált állatban. 5 mg GP-MBP teljes mértékben megvéd minden állatot az összes betegségi tünet elfojtásával. Az aeroszolos beadás hatékonyabb, mint az orális beadás, vagyis a GP-MBP beadása aeroszol (permet) formájában a betegség tüneteit kisebb hatékony koncentrációkban (dózisszinten) csökkenti, mint a GP-MBP beadása szilárd formában orális úton.

Az egyes dózisok (azaz 0,005; 0,05; 0,5; és 5 mg/állat) közvetlen összehasonlítását a 3A-D. ábrában mutatjuk be; a gyógyszert orálisan vagy aeroszol formában vezetjük be. A kísérleteket pontosan úgy végezzük el, mint korábban, 5 állatot alkalmazva kísérleti csoportonként. Az eredmények azt igazolják, hogy az aeroszolos beadás hatékonyabb, mint az orális beadás; az aeroszol formájú GP-MBP-ből kisebb mennyiségek szükségesek, hogy elfojtsák az EAE betegség tüneteit. Ezek az adatok azt mutatják,hogy a tüdőben indukált anyag beadásának útja okozza az 1-3 ábrában bemutatott hatásokat, és ez nem egyszerűen magának a beadott anyagnak tulajdonítható, hiszen az orálisan beadott GP-MBP-ből sokkal több anyag szükséges, hogy ugyanazt a hatást érje el, mint amikor aeroszol formában adjuk be.

Megvizsgáljuk a GP-MBP különböző fragmentumait EAE-re való hatásukra. Az MBP fragmentumok-, szilárd fázisú peptid szintézissel készülnek el (és beszerezhetők a Bioresearch cégtől, San Ra • ·· · • · • ·

- 25 phael, Kalifornia). A GP-MBP 16.-35.; 51.-70.; és 121.-138. aminosav gyökinek megfelelő fragmentumokat adunk be 5 állatnak 0,14 mg/ állat mennyiségben, ahogy fentebb leírtuk. A fenti beadott fragmentumok egyike sem enkefalogenikus (vagyis a fragmentumok egyike sem indukál EAE-t parenterális beadáskor valamely adjuvánssal együtt). Az adatokat a 4. ábrában mutatjuk be.

A 4. ábra szerint a GP-MBP 16.-35.; és 51.-70. aminosavgyökeinek megfelelő fragmentumok hatékonyak az EAE betegségi tüneteinek elfojtásában. A GP-MBP 121.-138. aminosavgyökeinek megfelelő fragmentumnak nincs védő hatása EAE ellen a kezelt állatokban, és a kontrollokhoz hasonló eredményeket mutat.

Abból a célból, hogy bemutassuk: a GP-MBP aeroszolos beadása hatékony EAE kezelésére, amikor az autoimmun betegség indukciója után adjuk be, állatokat kezelünk 5 mg GP-MBP-vel (állatonként) 3 nappal az EAE indukálása előtt, vagy a betegség indukciója után a +7; +9, és +11. napon. Az eredményeket az 5. ábrában mutatjuk be .

Az 5. ábrában levő adatok azt illusztrálják, hogy a GP-MBP aeroszolos beadása hatékony az elfojtásban, akár 3 nappal az EAE indukálása előtt, akár az EAE indukálása után a +7; +9; vagy +11. napon adjuk be.

Abból a célból, hogy bemutassuk az autoimmun elfojtó kezelés fajlagosságát, a GP-MBP és a GP-MBP egyik fragmentuma (amely a GP-MBP 21.-40. ami nosav-győkeinek felel meg) különböző koncentrációit, vagy hiszton fehérjét (5 mg/állat; ez a Sigma Chemical Co.tól, St.Louis, Missouri, szerezhető be) adunk be aeroszolban olyan patkányoknak, amelyekben előzőleg EAE-t indukáltunk. Az eredményeket a 6. ábrában mutatjuk be.

• · * · · ♦

-26Α 6. ábra adatai azt mutatják, hogy amikor 5 mg GP-MBP-t adunk be aeroszol formájában, ez teljes mértékben megvédi a kezelt állatot az EAE indukálódásától. 1 mg, aeroszolban bevezetett GP-MBP szintén védő hatású. A hisztón fehérje 5 mg-nál nem véd az EAE ellen. A hisztont kontrollként alkalmazzuk, mivel ez pozitívan töltött fehérje (akárcsak az MBP), és az MBP-hez hasonló molekulatömegű (18000 dalton, míg az MBP-é 16000 dalton).

Ebben a kísérletben a beadott GP-MBP fragmentum (21.-40.) szintén nem ad védelmet. A 6. ábrában látható, hogy 1 mg GP-MBP orálisan beadva védi az állatokat EAE ellen, de nem véd ugyanúgy, mint amikor azonos mennyiségű GP-MBP-t aeroszolos formában adunk be.

3. PÉLDA

Az alább megadott adatok egy sor in vitro kísérletet képviselnek, és bemutatják, hogy az aeroszolba vitt GP-MBP-vel kezelt állatokból kinyert lépsejtek erőteljesen elfojtják az' in vitro burjánzás! válaszokat. Az állatok hat különböző alkalommal kapnak antigént aeroszol formájában azonos beadási időrendet alkalmazva, mint a 2. példában, azzal a különbséggel, hogy nem kapnak -10. napi kezelést. A modulátor sejtek a timociták vagy splenociták a kezelt vagy nem kezelt állatokból. A válaszadó sejtek az NLB, amely egy mielin bázisos fehérje-fajlagos, Lewis patkányokból származó sejtvonal, és az NLA, amely Mycobacteriumok által indukált Lewis patkányokból származó vonal; az utóbbit negatív kontrollként alkalmazzuk. Az NLB és NLA sejtvonalak vagy GP-MBP-vel, vagy Mycobacterium tubercolosissal Freund-féle komplett adjuvánsban immunizált Lewis patkányok térdhajlati nyirokcsomóiból származnak, a szakterületen jól ismert technikákat alkalmazva £ J . Immunoi . 131, 281 0 ( 1 9 8 8 )3 · Az izolált nyirokcsomó sejteket in vitro • · *

- 27 újra stimuláljuk alkalmazás előtt antigénnel és interleukin-2vel (lL-2). A kísérletet úgy hajtjuk végre, amint ezt Lider és munkatársai leírták . Immunoi. 142, 748-752 (1988)3· Az in vitro alkalmazott MBP vagy konkanavalin A (Con A) mennyisége 10 mikrogramm/ml, illetve 1,25 mikrogramm/ml. A Con A-t mint nem fajlagos kontrollt alkalmazzuk. Az eredmények az alábbi 2. és 3. táblázatban láthatók.

- 28 ·*·· ·· ·«

2. TÁBLÁZAT

SEJTVONALAK ELFOJTÁSA₍MODULÁTORKÉNT

KEZELT ÁLLATOK TIMOCITÁIT ALKALMAZVA

VÁLASZADÓK	KONTROLL PATKÁNYOK AEROSZOLLAL KEZELT	% ELFOJTÁS
			( A CMP x 1O³)	PATKÁNYOK
				( Δ CMP x 10³)
NLB	+	CON A	24,648^0,9	29,950^6,6	-17%
NLB	+	GP-MBP	20^647-6,9	22,480^5,6	Q 0/ — O /0
NLA	4-	CON A	19,690-5,9	15,941-2,1	1 9?í
			3.	TÁBLÁZAT

SEJTVONALAK ELFŐJTÁSA₍MODULÁTORKÉNT KONTROLL

ÉS AEROSZOLLAL KEZELT PATKÁNYOK SPLENOCITÁIT ALKALMAZVA

KONTROLL PATKÁNYOK	AEROSZOLLAL KEZELT	% ELFOJTÁS
	( Δ CMP x 10³)	PATKÁNYOK
VÁLASZADÓK		( Δ CMP x 10³)
NLB + CON A	93,404-1,4	87,635^8,1	6%
NLB + GP-MBP	63,023-12,9	35,523^8,9	44?ó
NLA + CON A	19,892- 4,6	30,553-3,6	-53%

• · · • 4 ·* ··

- 29 A 2. és 3. táblázatokból látható, hogy amikor GP-MBP-t adunk az NLB vonalhoz az aeroszollal (GP-MBP-vel) kezelt patkányok lápéból izolált modulátor sejtek jelenlétében, az immunválasz 44%-os elfojtása figyelhető meg (3. táblázat). Ennél fogva az MBP szükséges az immunválaszhoz az aeroszollal kezelt állatokban, és az elfojtás antigén-fajlagos. Amikor csak Con A-t adunk az NLB vagy NLA sejtekhez, ez nem indukál elfojtást.

A 2. táblázat adatai azt mutatják, hogy a timociták nem vesznek részt ebben az immun-elfojtásban, mivel sem a kontroll (NLB + Con A), sem az MBP-kezelt vonalak nem mutatnak semmiféle bizonyítékot az elfojtásra. Ennél fogva az autoantigének aeroszolos formájának egyik működési mechanizmusa, úgy tűnik, olyan sejtek kialakítása, amelyek aktívan elfojtják a fajlagos in vitro autoimmun választ a kezelt állatokban. Ezt demonstrálja az oltalom adaptív átvitele az aeroszollal kezelt állatokból származó lépsejtek által, amint ezt a későbbi 9. példa bemutatja.

4. PÉLDA

Az adjuváns izületi gyulladás az izületi csúz modellje, amelyhez az izületi gyulladást Freund-féle komplett adjuvánsnak a patkányfarok tövébe adott injektálásával indukáljuk. Az immunizálás után mintegy 14 nappal az ilyen módon kezelt állatok ízületeinek súlyos duzzadása fejlődik ki, amely az emberek izületi csúzának jellemzője.

Tanulmányozzuk a kollagén aeroszolos beadásának hatását az adjuváns izületi gyulladásra. A kísérleteket a következőképpen hajtjuk végre.

A II. típusú kollagén aeroszolos beadását úgy hajtjuk végre, ···· •♦ » ·· · · « · *9 ·· ··

- 30 mint a 2. példában a GP-MBP-nél, állatonként 0,003; 0,03; és 0,3 milligramm dózisokban. Az izületi gyulladást úgy indukáljuk, hogy a párkányok faroktövébe Freund-féle komplett adjuvánst injektálunk. Az egyes kísérleti csoportokban 5 állatot alkalmazunk, amint ezt a 2. példánál leírtuk. Az állatokat a -5; -3; 0; és +4 napokon kezeljük az izületi gyulladás indukálásához viszonyítva az aeroszollal kezelt állatokban.

Az átlagos izületi gyulladást (artritisz) 0-4 közötti értékskálán osztályozzuk a patkányok mind a négy mancsán, amint ezt a J. Exp. Med. 146, 857 (1977) irodalmi helyen leírják; az osztályozás a következő: 0 - normális, 1 - csak vörösség; 2 - vörösség és enyhe duzzanat; 3 - súlyos duzzanat; 4 - izületi deformálódás. Az átlagos izületi gyulladás pontszámot minden nap kiszámítjuk mindegyik kísérleti á11atcsoportnál. Az egyedi pontértékeket a csoportban levő minden egyes állatnál meghatározzuk. Az átlagos pontszámot úgy határozzuk meg, hogy a csoport teljes pontértékét elosztjuk a vizsgált állatok számával.

Példaként megadunk egy átlagos izületi gyulladás pontozást.

- 31 ·4

4. TÁBLÁZAT

A teljes pontszám

Az állat száma	Pontérték az egyes mancsoknál	az eqyes állatoknál
1	1, 1, 1, 1	4
2	2, 2, 2, 2	8
3	3, 3, 3, 3	1 2
4	4, 4, 4, 4	16

A négy állatra az adott csoportban az átlagos izületi gyulladás pontszáma a következő:

+ 8 + 12 + 16 _ 4J0

4

A fenti kísérletek eredményeit a 7. ábrában mutatjuk be, ahol az x-tengely az immunizálástól eltelt napok száma, és az y-tengely az átlagos izületi gyulladás pontszám.

Amint a 7. ábrában látható, a kollagén aeroszolos beadása

0,03 és 0,3 milligramm/patkány koncentrációban szignifikánsan csökkenti az átlagos izületi gyulladás pontszámot, a 0,003 milligramm/patkány koncentrációban viszont nem. Ennél fogva, akárcsak az MBP aeroszolos beadása esetében az EAE kezelésénél, a kollagén beadása az adjuváns izületi gyulladásban szenvedő állatoknak dózis-függő módon hatékony.

• · ·?·· *··* ·· ·· ··

5. PÉLDA

Szarvasmarha mielint és szarvasmarha MBP-t vizsgálunk azon képességükre, hogy elfojtják az EAE-t, amikor orálisan vagy aeroszolos formában adjuk be. A szarvasmarha mielint a Biopure cégtől (Boston, Massachussets) szerezzük be; ez szacharóz gradiensen, a szakterületen jól ismert rutin eljárás szrint tisztított izolált mielinből áll. EAE-t indukálunk, és a szarvasmarha mielint és az MBP-t orális vagy aeroszolos formában úgy adjuk be, amint ezt a 2. példában leírtuk. Az eredményeket a 4. táblázat mutatja b e.

				4.	TÁBLÁZAT
		NAPOK	AZ	IMMUNIZÁLÁS	UTÁN
CSOPORT	1 2	1 3		14	15	1 6	17	18	1 9		20
Kontroll	1 0,9	‘ b	7	2,3	2,4	1,9	b³	0,9	b	7	0,2
Szarvasmarha	mielin,
1000 mg	0		0	0,3	0,4	0,3	0,2	0		0	0
Szarvasmarha	mielin ,
100 mg	0_r3	°T	4	0,6	0,8	0,5	0,5	0,1		0	0
Szarvasmarha	mielin,
MBP, 10 mg	0_r2	b	2	0,5	0,7	0,4	0,4	0,3		0	0
Szarvasmarha	mielin,
10 mg (A)	0		0	0	0,4	0,7	0,5	0,7	'0,	2	0
Szarvasmarha	mielin,
1 mg	0,8	b	7	0,8	b³	1,1	0,7	0,4	0,2	0
Szarvasmarha	mielin,
0.1 mg	0,7	b	1	b³	1,2	b³	0,9	0,4	b	3	0,1

Szarvasmarha-MBP,

1 mg	0,2	0,4	0,7	0,6	0,4	0/	2	0	0	0
GP-MBP, 1 mg	0	0	0	0,1	0,3	b	4	0,1	0	0

Is Átlagos paralizis pontszám aeroszol

A fenti 4. táblázat adatai alapján a szarvasmarha mielin hatékony az EAE kezelésére, amikor orális vagy aeroszol formában adjuk be. 10 mg, aeroszol formában beadott szarvasmarha mielin éppen olyan hatékony az autoimmun betegség tüneteinek elfojtásában, mint 1000 mg ugyanabból az anyagból, ha orálisan adjuk be folyadék formájában. Ezen kívül a szarvasmarha MBP orális beadása hatékony a GP-MBP által indukált EAE tünetek elfojtására is.

6. PÉLDA

Késleltetett típusú hiperszenzitivitási ^^elay^_1ype hypersensitivity (DTH)J válaszokat mérünk olyan Lewis patkányokban, amelyekben előzőleg EAE-t indukáltunk és kezeltük vagy orálisan, vagy aeroszolosan beadott GP-MBP-vel. A késleltetett típusú h i perszenzitivitás (DTH) klassszikus mérőszáma az in vivő sejt-közvetített immunitásnak.

Patkányokat (csoportonként 5 db-ot) kezelünk 5 mg GP-MBPvel, amelyet vagy orálisan, vagy aeroszol formájában adunk be, és a DTH válaszokat a fentiek szerint mérjük. A késleltetett típusú hiperszenzitivitást úgy indukáljuk, hogy 10 mikrogramm GP-MBP-t injektálunk a patkány fülcimpájába, és az ezt követő duzzanatot 48 óra múlva mérjük a J. Immunoi. 125, 283 (1980) irodalmi helyen leírt eljárás szerint.

Mérjük a DTH válaszokat különböző kezelések után azokban a patkányokban, amelyekben a fenti 2. példa szerint EAE-t indukáltunk. Patkányokat (csoportonként 5-öt) kezelünk 5 mg/állat különböző MBP készítménnyel aeroszolos formában, és a DTH válaszokat mérjük. Az eredményeket az 5. táblázatban mutatjuk be.

- 35 • · · · • ··· ··· · • · · · ·

5. TÁBLÁZAT

DTH válasz (X 10~². hüvelyk¹)

Kezelés	Kontroll	Kezelt	Sziqni fikancia
GP-MBP, -3	1,150	0,180	0,000
GP-MBP, +7, + 9, +11	1,150	0,580	0,004
GP-mielin	1,150	0_t040	0,000
GP-MBP fragmentum(16-35 )	1,150	0,850	0,036
GP-MBP fragmentum(51-70)	1.150	1 , 000	0,251³
GP-MBP fragmentum (121-138)	1,150	0,911	0,096³
Szarvasmarha MBP	1 1150	0,330	0,000
Patkány MBP	1,150	1 ,080	0,585³

1 hüvelyk = 2,54 cm

Student-féle teszttel meghatározva

A Student-féle teszttel nem szignifikáns

Az 5. táblázatban található adatok alapján a GP-MBP beadása 3 nappal az EAE indukálása előtt (-3) vagy 7, 9, és 11 nappal az EAE indukálása után (+7; +9; +11) szignifikánsan elfojtja a DTH válaszokat az aeroszollal kezelt patkányokban. Az aeroszolos kezelés - teljes tengerimalac mielint alkalmazva és a -10; -7; -5; -3; 0; +2; és +4 napokon bevezetve - szintén hatékony a DTH válaszok elfojtására a kezelt állatokban.

A GP-MBP bizonyos fragmentumai (a fentebbiek szerint beadva) szintén hatékonyak a DTH válaszok elfojtásában aeroszollal kezelt állatokban. Az a GP-MBP fragmentum, amely a GP-MBP 16.-35. aminosav-gyökeinek felel meg, elfojtja a DTH válaszokat, amikor aeroszol formában adjuk be (5. táblázat); az a fragmentum, amely a DTH válaszok elfojtásában; és az a fragmentum, amely a GP-MBP 121.-138. aminosav-gyókeinek felel meg, a DTH válaszok alacsony szintű elfojtását indukálja. Ezek az adatok azt mutatják, hogy a

···· • · · · · ··« «·· · · • · · · · · · ·· ·· ··

-36GP-MBP bizonyos fragmentumai hatékonyak a DTH válaszok elfojtásában.

Végül az aeroszolba vitt szarvasmarha MBP hatékony a DTH válaszok elfojtásában GP-MBP-vel immunizált állatokban, míg az aeroszolba vitt patkány MBP ebből a szempontból hatástalan. Ezek az állatok azt is mutatják, hogy egy fehérje aeroszolba vitele önmagában nem felelős a DTH immun-elfojtásáért, és csak fajlagos fehérjék alakítják ki ezt a hatást.

7. PÉLDA

Megvizsgáljuk a GP-MBP aeroszolos beadásának hatásait olyan patkányokban, amelyekben előzőleg EAE-t indukáltunk.

Az antitest válaszokat mérjük olyan állatokban, amelyek aeroszolba vitt GP-MBP-vel és többféle kontroll antigénnel, közöttük hisztonnal és szarvasmarha szérum albuminnal (BSA) vannak kezelve. Ezekben a kísérletekben szérumot veszünk és antitest-titerek'et mérünk csoportonként 5 állatban, ahol az egyes csoportok a -10; -7; -5; -3; 0; +2; és +4 napokon vannak kezelve a GP-MBP-vel Freund-féle komplett adjuvánsban végzett immunizálástól számítva; a szérum levétele három héttel a kezelt patkányokban végzett immunizálás után történik. Az antitest-titereket ELISA-val- mérjük ^amint ezt Lider és munkatársai leírják: J. Immunoi. 142, 748752 (1989)J. Az eredményeket a 6. táblázatban mutatjuk be.

V

6. TÁBLÁZAT

SZÉRUM ANTITEST SZINTEK

Csoport	1/10.000	1/20.000	1/40.000	1/80.000
Kontroll	0f 520	0,239	0,382	0,143
GP-MBP 5 mg(A)	0,276	0,121	0,089	0,074
GP-MBP, 1 mg (A)	0,579	0,380	0,349	0,250
GP-MBP, 1 mg (0)	0,437	0,275	0,203	0,157
Hiszton, 5 mg	1,405	1 , 229	0,782	0,644
BSA, 5 mg	0,405	0,489	0,382	Oj 315
PBS	0,913	0,953	0,769	0,624
BP--MBP-fragmentum
(21-40, 0.174 mg/patkány	0,226	0,243	0,192	0,132
A táblázatban megadott eredmények azt	mutatják,	hogy az
5 mg aeroszolba vitt GP	-MBP-vel	kezelt állatokban statisztikailag
szignifikáns csökkenés	van az antitest szintekben a	kontrollokhoz

viszonyítva. Sem a PBS, sem a szarvasmarha szérum albumin (BSA; Boehringer Mannheim), sem a hiszton (Sigma Chemical Co., St.Louis, Maryland) nem fojtja el az antitest válaszokat. Ezen kívül a GPMBP 21.-40. aminosav-gyökeinek megfelelő GP-MBP fragmentum szintén elfojtja statisztikailag szignifikáns módon a fajlagos MBP antitest válaszokat, amikor aeroszol formában adjuk be. A fentebb megadott eredmények az antitest válasz csökkenését mutatják be MBP-re olyan állatokban, amelyek 5 mg aeroszolba vitt MBP-vel vannak kezelve.

8. PÉLDA

EAE-t indukálunk patkányokban, és az állatokat GP-MBP-vel kezeljük aeroszolban, amint ezt a 2. példában fentebb leírtuk (25 mg GP-MBP 5 ml PBS-ben, csoportonként 5 patkányba a

-10; -7; -5; -3; 0; +2; és +4 napokon beadva). A kontroll álla ···· ·· • ·

- 38 tokát csak PBS-sel kezeljük. 16 nappal az immunizálás után a patkányokat leöljük, agyukat formaldehidben fixáljuk, parafinba ágyazott metszeteket készítünk az. egyes patkányokból, és a patkányagyakban a párenchimális gyulladásoss gócok számát megszámoljuk vak elrendezésben. A patkányokon hisztológiai elemzést hajtunk végre £_Higgins és munkatársai: J. Immunoi. 140, 440 (1988)]. Ennek a biológiai elemzésnek az eredményeit az alábbiakban közüljük.

Ezekben a tanulmányokban jellemző az agy parenchimába beszűrődő sejtek távolléte az MBP-vel kezelt állatokban. Az eredmények a következők:

kontroll (n = 6): gócok = 48; 25; 14; 11; 8; 4; átlagos góc/ állat: 18,3·aeroszollal kezelt (n = 4): gócok = 2; 0; 0; 0; átlagos góc/állat = 0,5

Ez azt demonstrálja, hogy az aeroszolos kezelés nemcsak a klinikai betegségre és az immunológiai működésre hat, hanem meg is akadályozza a sejtek behatolását az agyba. A sejtek behatolása az agyba az a primer mechanizmus, amely az EAE-ben a betegség lefolyását előidézi.

9. PÉLDA

Az állatok EAE-től való megvédésével kapcsolatban a fő kérdés a fajlagos immun elfojtás hatásmechanizmusa a GP-MBP aeroszolos bejuttatása után. Az alább leírt kísérletek azt mutatják, hogy az aktív celluláris mechanizmust az MBP aeroszolos beadása indítja be. Ezekben a kísérletekben azokat a sejteket, amelyek adaptívan átviszik a védelmet az EAE ellen ép állatokba, kinyerjük az aeroszollal kezelt állatok lépeiből.

Lewis patkányokat kezelünk úgy, ahogyan ezt a 2. példában

V . ♦······ * ·«··«····· • · ·> ·· ·· · ···· · a ·♦ ·· ··

-39leírtuk, csoportonként 5 állatot használva (5 mg GP-MBP/patkány, PBS-ben beadva 7 alkalommal). Az utolsó kezelés után 3 nappal lépsejteket veszünk ki a kezelt állatokból, egyedi sejt-szuszpenziót készítünk, ezt intraperitoneálisan injektáljuk 5 ép állatba β (9.10 sejt/befogadó) , amelyeket előzőleg MBP-vel immunizáltunk Freund-féle komplett adjuvánsban. Az eredményeket a 8. ábrában mutatjuk be.

Amint a 8. ábrában látható, a betegség súlyosságának határozott csökk enésealakul ki olyan patkányokban, amelyek MBP-vel kezelt állatokból való lépsejteket kaptak. Ezen kívül mérjük a DTH válaszokat is a befogadó állatokban: az MBP-re adott DTH válaszok erőteljes gátlása lép fel az aeroszollal kezelt patkányokban (adatokat nem mutatunk be).

Ennél fogva az aeroszollal kezelt állatokból való lépsejtek képesek adaptívan védelmet átvinni ép befogadókba EAE ellen, továbbá képesek alulszabályozni a FTH válaszokat ezekben az állatokban.

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1.) Eljárás valamely autoimmun betegség kezelésére vagy kitörésének megelőzésére valamely emlősben azzal jellemezve, hogy az említett emlősbe aeroszol formájában bevezetjük az említett autoimmun betegség kezeléséhez vagy megelőzéséhez alkalmas legalább egy szer hatékony mennyiségét az alábbiak közül: az említett betegség ellen fajlagosan irányuló autoantigének; az említett autoantigének betegséget elfojtó fragmentumai; és az említett autoantigének analógjai .

2. ) Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az em- lített autoantigén mielin bázisos fehérje. 3.) Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az eln- lített autoantigén kollagén. 4.) Az 1. igénypont szerinti élj ár ás azzal jellemezve, hogy az em- lített autoimmun betegség sokoldalú bénulás (sclerosis multiplex). 5.) Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal j ellemezve, hogy az em-

lített autoimmun betegség izületi csúz (rheumatoid arthritis).
6.) Gyógyászati kiszerelés valamely autoimmun betegségben szenvedő emlős kezelésére azzal jellemezve, hogy aeroszolos formában az említett autoimmun betegség kezeléséhez alkalmas legalább egy szer hatékony mennyiségét tartalmazza az alábbiak közül: az említett betegség ellen fajlagosan irányuló autoantigének, az említett autoantigének betegséget elfojtó fragmentumai, és az említett autoantigének analógjai.

7.) A 6. igénypont szerinti kiszerelés azzal jellemezve, hogy az említett autoantigén mielin bázisos fehérje. 8.) A 6. igénypont szerinti kiszerelés azzal jellemezve, hogy az említett autoantigén kollagén. 9. ) A 6. igénypont szerinti kiszerelés azzal jellemezve, hogy az

« ·· ·*· ···· « 9 ·· ·

99«··

-41említett autoantigén a mielin bázisos fehérje valamely betegségelfojtó fragmentuma.
10. ) A 6. igénypont szerinti kiszerelés azzal jellemezve, hogy tartalmaz még egy gyógyászatilag elfogadható hordozót vagy higítót is.
11. ) A 6. igénypont szerinti kiszerelés azzal jellemezve, hogy az említett autoimmun betegség sokoldalú bénulás (sclerosis multiplex)
12. ) A 6. igénypont szerinti kiszerelés azzal jellemezve, hogy az említett autoimmun betegség izületi csúz (rheumatoid arthritis).
13. ) Eljárás a sokoldalú bénulás (sclerosis multiplex) tüneteit mutató autoimmun betegség kezelésére az említett tünetekben szenvedő emlősökben azzal jellemezve, hogy az említett emlősnek a tüdőszerveken keresztül legalább egy alábbi szernek az említett betegség elfojtásához alkalmas mennyiségét vezetjük be aeroszolos formában: az említett autoimmun betegségre fajlagos autoantigének; az említett autoantigének autoimmun betegség elfojtó fragmentumai; és az említett autoantigének analógjai.
14. ) A 13. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az említett autoantigén mielin bázisos fehérje.
15. ) Eljárás az izületi gyulladás (arthritis) tüneteit mutató autoimmun betegség kezelésére azzal jellemezve, hogy aeroszol formájában beadjuk legalább egy szernek az említett betegség elfojtásához hatékony mennyiségét az alábbiak közül: az említett betegségre fajlagos autoantigének; az említett autoantigének betegséget elfojtó fragmentumai, és az említett autoantigének analógjai.
16. ) A 15. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az említett autoantigén kollagén.
17. ) Eljárás valamely autoimmun betegségben szenvedő emlős keze- ·· • ·« ·« ·· ·* • 4 4 · • »·· »·· · • « · · · · · lésére azzal jellemezve, hogy az említett emlős tüdőszervébe egy finoman eloszlatott permetnek az említett betegség elfojtására hatékony mennyiségét juttatjuk be, ahol a permet aeroszolos formában legalább egy szert tartalmaz az alábbiak közül: az említett autoimmun betegségre fajlagos autoantigének; az említett autoantigének betegséget elfojtó fragmentumai; és az említett autoantigének analógjai.
18.) Gyógyászati kiszerelés azzal jellemezve, hogy valamely autoimmun betegség kezeléséhez hatékony mennyiségű vizes aeroszolt tartalmaz, ahol az aeroszol legalább egy szert tartalmaz az alábbiak közül: az említett autoimmun betegségre fajlagos autoantigének; az említett autoantigének betegséget elfojtó fragmentumai; és az említett autoantigének analógjai.