JPH05504341A

JPH05504341A - 吸入投与形態をとる自己免疫疾患および／または予防用薬剤

Info

Publication number: JPH05504341A
Application number: JP91501992A
Authority: JP
Inventors: ハフラー，デビッド　アレン; ウェイナー，ハワード　エル
Original assignee: オートイミューン　インク
Priority date: 1989-12-20
Filing date: 1990-12-17
Publication date: 1993-07-08
Anticipated expiration: 2012-07-02
Also published as: DK0506785T3; IL96734A; CA2070281A1; IL96734A0; EP0506785A4; HU9202072D0; WO1991008760A1; JP2625253B2; AU642693B2; KR920703081A; AU6979191A; HUT61487A; KR0185747B1; BR9007950A; DE69033487T2; GR3033634T3; ES2144398T3; EP0506785A1; HU210715A9; CA2070281C

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】自己抗原の噴霧処理による、自己免疫疾患の改善された治療法及豆旦！！本発明は、自己免疫疾患の改善された治療法に関するものである。より詳しくは、本発明は、予防、および自己免疫疾患の治療上の処理のための、噴霧形状での自己抗原の様な類似体、または生物学上の活性フラグメント、および自己抗原の治療に関するものである。

本発明はまた、哺乳動物の自己免疫疾患の治療に有用な自己抗原の噴霧処方に関する。

自己免疫疾患は、細胞、または抗体を伴う異常な免疫性の反応によって特徴付けられる。それらは、通常の６己移植した組織に対する場合でもよい。

哺乳動物における自己免疫疾患は、一般に、２つの異なるカテゴリーの−っにに分類される。つまり、細胞介在疾患（例えば、Ｔ−細胞）、または抗体介在疾患である。細胞介在自己免疫疾患の例は、制限なく、多数の硬化、関節リウマチ、自己免疫甲状腺炎、真性糖尿病（若年型糖尿病）、およびブドウ膜網膜炎を含む。抗体介在自己免疫疾患は、重症筋無力症、および全身性のエリテマトーデス（または５ＬＥ）を含む。

自己免疫疾患の両′１５−のカテゴリーのための現行の治療は、非特異的に免疫反応を抑制する薬の投与を必要とする。そのような薬としては、メトトレキセイト（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）　、ンクロホスファミド、イムラン（Ｉｍｕｒａｎ）　（アザチオプリン）、およびシクロスポリンＡ　（ｅｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎ　Ａ　）を例示できる。プレドニゾン、およびメチルブレビニ／ロンのようなステロイド化合物は、多（の場合、使用される。これらの薬は、細胞介在自己免疫疾患、および抗体介在自己免疫疾患の両方に対して制限された効果を有している。そのような薬の使用は、ト牛ンノの副作用によりて制限されており、さらに、それらは、投薬治療が延期された患者において、”全体”免疫抑制を促すので、つまり、病原性微生物に対する通常の防衛的免疫反応が調節されるので、このため、これらの病原によって、感染の危険性が増加する。さらに、感染により、全体的な免疫抑制が延期されている患者に、悪性が発生するという危険性が増加する。

自己免疫疾患を治療するための他の方法が望まれている。１９８７年６月２４日に出願されたＵ、Ｓ、特許出願Ｎｏ、６５，７９４　（現在、放棄されている）、および１９８８年６月２４日に出願された国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ８８１０２１３９　（審査中）は、ミニリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）のレベルが比較的高い経口治療、または腸内治療、誘発された疾、１！、および誘発されないフラグメント、およびその類似体は、急性−相性症状の経験上のアレルギー性急性脳を髄炎（Ｅ　Ａ　Ｅ）、ミニリン塩基性タンパク質に対して、直に、誘発されたＴ細胞介在自己免疫疾患に効果があると、開示している。ＥＡＥは、承認され、そして、多種の硬化（ＭＳ）のための動物モデルに広く使用されている。さきに挙げられた出願はまた、人盟結ｒａｍの経口、または腸内治療は、アジュバント関節炎、および他の自己免疫疾患の治療に対して述べられた結果である外挿（ｅｘｔｒａｐｏｌａｔｅ　）の抑制に対して効果的な治療であると開示している。

現在審査中である１９８９年７月１４日に出願されたＵ、Ｓ、特許出願Ｎｏ。

３７９．７７８は、自己免疫ブドウ膜網膜炎の治療に対する、Ｓ−抗原の経口、または腸内治療について開示している。

種々の方法が、７０イノト不完全アドノ１バツト（Ｌａｎｄｏ、　Ｚ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、Ｐ。

１ｍｍｕｎｏ１．、１２６：１５２６．１９８１）において乳化されたＭＢＰを使用しての治療、またはＭ　Ｂ　Ｐ　ＩＪンパ球細胞と対になるＭＢＰの静脈内注入などのＥＡＥの抗原特異性抑制（Ｓｔｒｉｒａ創ｅｔ　ａｌ、　Ｃｅ目１ｓ＠ｕｎｏ１．７Ｓ：３７１１．１９８３）を誘発するために使用されている。

トララボ１トら（Ｊ、　Ｎｅｕｒｏｌ、　５６：６５−７３．１９８２）　、およびレイネら（Ｌａｂ、　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ　４８：２７５Ｊ４．１９８３　）は、ＭＢＰのみ、フロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）、ガラクトセレブロンド、ミニリンの液体ｌ＼ブテン、またはＥＡＥの臨床症状の抑制薬の腸管外投与による慢性再発ＥＡＥが悪化したモルモットの遺伝的傾向の治療について示している。

英語でかかれたアブストラクトを元に、Ｂｅ１ｉｋ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｖｏｐｒ、　Ｍｅｖ、　Ｉｈ１ｎ、　２４：３フ２−３７７、１９７８は、′アルカリンミニリンタン／ｆり質フラグメント（ＡＭＰＦ）”およびＥＡＥを有するモルモットに対する”合成脳炎誘発性ペプチド（ＳＥＰ）“の腸管外投与について開示している。動物は、牛のＡＭＰＦ、または合成ＳＥＰ（ＡＭＰＦを投与した後に回復した場合を除く。）によって、感覚を鋭くされていた。

プレーリーミ１−レンらは、Ｃｅ１ｌ　ｆｖｕｎ、ｓｌ：　４０Ｍ、１９８０において、ＩＦＡ＋こおけるサイグロブリン抗原の注入により、モルモットの経験的な自己免疫甲状腺炎の症状の抑制について開示している。

ナグラーーアンダーソンらは、Ｐｒｏｅ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８３ニア４４３−７４４６゜１９８６の中で、マウスモデルのコーラーゲン誘発関節炎を抑制するための、コラーゲンの経口投与について開示している。タイプＩＩフラーゲン誘発関節炎は、補助薬のタイプｌ！コラーゲンを使用して動物を治療する前に、可溶だが、変質しないタイプＴＩフラーゲンを胃内投与することによって、抑制された。ナグラーーアンダーソン抗原は、噴霧形状では、投与されない。

他の発明者らは、遺伝性疾患に対する治療、および哺乳動物におけるＩｇＥ反応のε形への噴霧化されたタンパク質の効果を調べている。

フバード、Ｒ，Ｃらは、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ８６：　６８０−６１１４．１９４９の中で、噴霧形状のタンパク質を、哺乳動物に投与する可能性について説明してｔする。

フバード、Ｒ，Ｃらは、遺伝性疾患であるα抗−トリブシン欠乏の治療のための、肺上皮表面を介する比較的大きいタンパク質α１−抗トリブシン（ＡＡｔ）の投与に付いて開示している。４５．０００ドルトン分子量を有する単結合ポリタンパク質にュートロフィルエラスターゼの抑制薬として機能する。）であるＡＡｔは、噴霧形状で、羊に投与される。完全に機能的に、そして、哺乳動物の組織にそのままの状態で残る噴霧化されたＡＡｔは、肺、リンパ、そして血液組織ににＡＡｔが存在することにより明らかなように、投与され、槽の上皮を通り、拡散される。

ホルト、Ｐ、Ｇらは、Ｉｍｍｕｎｏｌ、４２：　４０９−４１７．１９８１の中で、予め吸入された抗原に晒されることによる、マウスの特異的なＩｇＲ反応の抑制について開示している。週に１度、７週間に渡って、噴霧化されたオバルブミンにマウスを晒すと、これらの動物の腹腔内を可溶な、またはミ！ウバンー沈澱オバルブミンで攻撃されたとき、ＩｇＥ反応の抑制が生じる。

セジウイフク、ｊＤらは、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　５６：　６３５−６４２．　１９！Ｉｓの中で、吸入された抗原に対する特異的なＩｇＥ反応の低下した調節について、報告している。オバルブミンの噴霧で繰り返し晒されたうｙソは、しばしば、同じ抗原による攻撃に対して、キャリアー橿耐性を誘発している。

ナルト、ＥＧらは、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　６０：　９７−１０２．１９８７の中で、マウス、またはラブ八こよって、低レベルのオバルブミ／を繰り返し吸入すると、ＩｇＥ抗原クラスに対する耐性を優先的に誘発し、この工程は、エアーボーノ抗原に対する哺乳動物のアレルギー性誘発を、通常、防止する重要な防衛的メカニズムを再び出現させると仮定される、と開示している。

セジウイブク、ｊＤらは、Ｃｅ１ｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　９４：　１８２−１９４．　１１８５の中で、週に一度、噴霧化された抗原に繰り返し晒された高−１ｇＥ−レスボンプーラ１ノは、血清中の抗原−特異的１ｇＧのレベルが、徐々に増加していると開示している。

噴霧に晒された動物からの肺細胞を、天然のラップに移植すると、特異的な！ｇＧ反応に影響を与えることなく、ＩｇＥ反応を抑制できると開示している。

自己免疫疾患を治療したり、または防止するための方法、または技術は、これらの参考文献には、開示も示唆もされていない。本発明の目的は、自己免疫疾駆にかかった哺乳動物を治療するための方法を提供することにある。

本発明の他の目的は、自己免疫疾にかかった哺乳動物のための薬学上の処方を提供することにある。

さらに、本発明の目的は、哺乳動物類の自己免疫疾患を治療、または予防するための、哺乳動物に投与するための処方を提供することにある。

これら、および本発明の他の目的は、本明細書に鑑みた当業者、図面、およびクレームによって明らかになるであろう。

図１は、ＥＡＥの痛み、および発病経過をもとに、経口投与されたＭＢＰの種々の濃度に対する疾患抑制効果を示すグラフである。

図２は、ＥＡＥの痛み、および発病経過をもとに、噴霧形状で投与されたＭＢＰの種々の濃度の疾患抑制効果を示すグラフである。

図３　（Ａ−Ｄ）は、ＥＡＥの痛み、および発病経過をもとに、噴霧形状投与、または経口投与されたとき、ＧＰ−ＭＢＦの種々の投与量の効果を直接比較したグラフのンリーズを示すグラフである。

図４は、ＥＡＥの痛み、および発病経過をもとに、ＧＰ−ＭＢＰフラグメントの効果を示すグラフである。

図５は、ＥＡＥの注入後、動物の治療を示すグラフである。

図６は、ＥＡＥ上の種々の噴霧−投与タンパク質の効果を示すグラフである。

図７は、コラーゲンにより誘発関節炎の痛み、および発病経過をもとに、噴霧化されたコラーゲンの効果を示すグラフである６図８は、ＥＡＥに対する免疫を、本発明の方法にしたがって治療された動物から単離された肺臓細胞によって媒介となる動物に移すことを示すグラフである。

及呵旦ｉ！哺乳動物における自己免疫疾患の治療、または予防のための改善された方法、およびより効果的な方法は、上記哺乳動物において治療されるべき、または予防されるべき自己免疫疾患のための、噴霧形状からなる特異的な自己抗原の一つ、またはそれ以上を投与することを含む。

ある面では、本発明は、そのような哺乳動物に、自己免疫疾患に対して特異的な自己抗原、自己免疫抑制フラグメント、およびそのような自己抗原の類似体のからなるグループから選択された少なくとも一つの自己免疫抑制試薬を含有する噴霧形状の化合物を効果的な置投与することによって、哺乳動物の自己免疫疾駆を予防する方法、および治療する方法を提供できる。

他の面では、本発明は、哺乳動物における自己免疫疾患を治療するために使用される噴霧投薬形状をも含む。この投薬形状は、噴霧形状であり、自己免疫疾患に対して特異的な自己抗原、自己免疫抑制フラグメント、および上記自己抗原の類似体からなるグループから選択された少なくとも一つの自己免疫抑制試薬を含有する。

会凹ト１１皇３３１匹全ての特許出願、特許、および明細書中でテ照した文献は、それらの完全な参照によって、ここで具体化される。

噴霧形状の自己抗Ｒ（または自己免疫抑制フラグメント、またはその類似体）は、哺乳動物における自己免疫疾患の治療に効果的であるということが発見された。特に驚くべき、そして予期せぬ進展は、噴霧形状の自己抗原の投与が、経口ルートを介して固体形状の同じ自己抗原を投与するよりも、哺乳動物の自己免疫疾患を治療、および予防するためには、より効果的であるということの発見である。また、驚くべきことは、固体投与形状の投与よりも、噴霧形状の投与の方が、少ない量を使用して、哺乳動物の自己免疫疾患をより予防したり、抑制したりできるということの発見である。自己抗原の噴霧投与は、細胞介在、および抗体介在自己免疫反応の両方を抑制するのに効果的であるということが分かった。

本発明は、多種硬化、リウマチ様の関節炎、重症筋無力症、自己免疫甲状腺炎、真性糖尿病、（特に若年）（真性）Ｉ！尿病）、自己免疫ブドウ膜網膜炎、全身性紅班性狼そう（ＳＬＥ、または狼そう）、アドレナリスト、および慢性活動性肝炎を含む自己免疫疾患を防止できない、または治療できないと制限されるものはない。

ここに述べたように、”噴霧”という言謬は、ネブライザーのような加圧装置を使用して形成された細かく細分化された固体、または液体微粒子、を意味している。液体、または固体源物質は、自己抗原および／または自己免疫疾患抑制フラグメント、およびさきに限定したようなそれらの類似体を含有している。

自己免疫疾患は、人間を含む哺乳動物の免疫システムの機能不全である。そのような疾患に悩まされている哺乳動物において、免疫システムは、哺乳動物内の外因（外からの）物質と、自己組織、または目己物賀とのあいだの区別がない、または区別つかない。この結果、免疫システムは、自己組織（半抗原）、および物質を、まるで、それらが、外因（外からの）組織、または侵入有機体に対して、通常、使用するために保存されている外部から侵入した増殖性の免疫防衛かのように扱う。本質において、通常の免疫／ステムの一つの重要な点は、部分的に直され、自己組織に対する増殖性反応をし始めると言う点である。ここに使用されている”哺乳動物″という言葉は、免疫調整システムを有し、自己免疫疾患に対して影響され易い生命を意味している。

ここに使用されている”自己抗原”という言葉は、哺乳動物に通常発見できる物質であり、（１）哺乳動物の抗体、またはリンパ球によって、哺乳動物の一部として理解されていない、（２）＠乳動物の免疫調整／ステムによって、まるで、そのような抗原が、外部からの物質かのように、攻撃される、（３）特異的な自己免疫疾患の原因とされている免疫／ステムの重要な点を低下調整するために作用すると言うことを意味している。この自己抗原という言葉はまた、哺乳動物に投与したとき、自己免疫病、去の症状を有する状況を誘発させる抗原性物質と言う意味も含む。

ここで使用されている”自己免疫抑制フラグメント”という言葉は、一部のアミノ酸／−クエンス、または自己抗原の成分を含有し、噴ｉ投与に応じて、６己免疫を防いだり、または抑制できる能力を有しているタンパク質、またはポ゛リペプチドを意味する。そのようなフラグメントは、純粋な自己抗原の自己抗原的特性をを有することを必要としない。制限がないため、ＭＢＰを、補助薬の存在下で、哺乳動物の腸管外に投与すると、影響を受け易い哺乳動物にＥＡＥが誘発される。それにもかかわらず、ＭＥＰのある疾患を誘発しないフラグメント（っまり、腸管外に、補助薬を投与するとき、ＥＡＥを誘発しないＭＢＰのフラグメント）は、経口（または腸管内）、または噴霧形状で、ＥＡＥにかかっている哺乳動物に投与するとき、自己免疫抑制活性を有していると言うことが発見された。

そのようなフラグメントの例は、Ｕ、Ｓ　特許出願Ｎｏ、６５．７３４、国際特許出願Ｎｏ、ＰＣＴ／ＵＳ８８１０２１３９、および以下に示す実施例２、実施例６に報告されている。

ここで使用されているそれらの７ラグメノト、または自己抗原のような１類似体 ”という言葉は、化学構造上これらの自己抗原、または自己免疫抑制フラグメントに関連し、同様な生物学上の活性を有する、つまり、噴霧投与により、自己免疫反応を抑制、または限定する能力を有する化合物を意味している。制限がないため、その言葉は、疾患の症状を緩和、または抑制するその能力において、自己抗原の自己免疫抑制能力を模倣する化合物、または組成物と同様に、一つ、またはそれ以上のアミノ酸残さくしかし、自己抗原、またはフラグメントの自己免疫抑制能力は保持している）によって、その疾患抑制フラグメント、または自己抗原のアミノ酸ンークエンスとは翼なるアミノ酸／−クエンスを含有するタンパク質を含む。一つの例は、器官からの組織は、自己免疫疾患における免疫システムの重要な点によって攻撃されるターゲットとなることである。。つまり、糖尿病の肺臓、または多種硬化の中央神経システムの白質がターゲットとなる。他の典型的な類似体は、１９８７年６月２４日に出願された審査中のＵ、Ｓ、特許出願Ｎｏ、６５，７３４に開示されているようなタンパク質Ｓ７９があるここで使用されている”自己免疫疾患抑制試薬”または”自己免疫抑制試薬”という言葉は、特異的な自己免疫疾患の発病、または病的な始まりを遅らせたり、または防いだり、抑制するために、噴霧形状で、哺乳動物に投与される化合物、または組成物を意味している。この言葉は、さきに述べたように、それらの類似体、または自己免疫抑制７ラグメントと同様に、特異的な自己免疫疾患に対して作用する自己抗原という意味も含む。

ここで使用されている”治療”という言】は、個々に影響され易い目己疾虫を予防するため、または個々に影響を受けた活動的な自己免疫疾患の治療するための予防投与を意味する。

本発明の自己免疫抑制試薬によって誘発された耐性は、噴霧される物質の広いに投薬範囲の投薬量に依存している。そして、発病（ＥＡＥの発病）の抑制（または緩和）は、以下に示す実施例２から実施例９に示されたような噴霧化された自己免疫抑制試薬投与の増加された投与レベルを増加させるということが分かった。投薬量依存性は、関節炎／ステムにおいて見られる。さらに、不適切な抗原（つまり、ヒスト／タンパク質、またはＭＢＰのある合成フラグメントのような目己免疫疾、轡において影響を与えない）の噴霧投与は、自己免疫疾患の発病に効果を有していない。

自己免疫疾患の治療のための噴霧経路、および自己抗原の投与は、池の投与経路に対してもいくつかの利点を有している。投与の容易さは、一つの重要な利点である。また、以下の実施例２に示すように、ＭＢＦの噴霧投与は、同じ試薬が、固体投与形状で経口経路を介して、経口から投与されていたとき、この疾患を治療するために必要であった投与量よりも、実質的に低い投与量でＥＡＥを治療する場合、効果的を有している。さらなる利点は、噴霧投与経路により、そのような試薬の効果を減少させるように作用するであろう青汁を低下させる本発明の自己免疫的試薬が、短時間晒されるだけでよいということである。

噴霧投与を介して、治療される動物が受ける、本発明の自己免疫抑制試薬の量は、投与される試薬の総量より、実質的に少ないと言うことに注意しなければならない。ネブライザーに存在する総投与量のたったｌ／２００が、治療されるべき動物の肺表面に、実際、取り込まれると考えられている。ケージ内の霧状にされた自己免疫抑制試薬の多くは、動物によって吸われなかったり、動物、およびケージにくっついている。そのため、噴霧投与は、自己免疫抑制試薬が治療される動物に対して放出される後者の場合、経口、または腸管内投与よりも、多くの効果を膏している。

種々のモデル／ステムが、自己免疫疾患の研究のだめに開発された。実験的なアレルギー性脳を髄炎（ＥＡＥ）は、いくつかの哺乳動物種の多種硬化（ＭＳ）のためのモデルとして、マウス、または他の哺乳動物で研究がなされていた誘発されたＴ−細胞介在自己免疫疾患である。疾患は、ＭＯＰ、および補助薬（７０イ／ト不完全アドンユバノト）の腸管外投与によって誘発される。この治療は、− 次性症状、および髄鞘脱落疾患の悪化する／軽くなる形態の両方を誘発する。

この誘発された疾患は、ＭＳの特性を有している。影響され易い哺乳動物の後根尾に、フロイント不完全アトツユバントオイルを有する人望結核菌を腸管外投与することは、リウマチ様の関節炎の特徴を有する疾患を誘発させる。さらに、ルイスラアッへのＳ−抗原、および補助薬の投与は、自己免疫ブドウ膜網膜炎を誘発スる。糖尿病は、ＮＯＤマウス、およびＢＢラフツに、自発的に進行する。こレラノモテル／ステムの中のいくつかのものは、効果、および本発明による改善された治療法の効果を立証するために用いられる。

本発明は、抗体−１および細胞−介在する広い範囲に渡る自己免疫疾患を治療するために使用される。以下に示す実施例６、および実施例７に示したように、自己抗原（モルモ、）ＭＢＰ）、およびその疾患抑制フラグメントの、噴霧投与は、細胞−（つまり、遅延タイプの過敏症反応）、および抗体−介在免疫反応の両方を抑制する。さらに、実施例３のデータに示したように、この抑制は、この現象における活性細胞の抑制の役割を有する肺臓細胞によって介在され、活性を有するようなる。このため、自己抗原の経口投与（Ｕ、Ｓ、特許出願Ｎｏ、６５．７３４、および審査中である国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ８８１０２１３９）によって、介在された免疫抑制の場合のように、自己抗原の噴霧投与は、抑制Ｔ−細胞の活性を保持することによって、少なくとも部分的に、作用すると考えられている。細胞−介在自己免疫疾患は、いずれも多種硬化、リウマチ様の関節炎、自己免疫ブドウｌＢ網膜炎、糖尿病、および自己免疫甲状腺炎等を誘発する。抗体 −介在自己免疫疾患は、重症筋無力症、全身性紅斑性狼そう（ＳＬＥ）、天はうそう、トロンビック血小板減少紫斑病（ｔｈｒｏｍｂｉｅ　ｔｈｒｅｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉｃ　ｐｕｒｐｕｒｉａ）を誘発する。噴霧形状で投与されるとき、これらの疾患の治療における特異的な自己抗原効果、および疾患モデルのリストは、以下の表１に示す。

以下、余白。

−ｉｌに上　」１１１上五！多種硬化　ＭＢＰリウマチ様関節炎　コラーゲノ自己免疫甲状腺炎　サイログロブリン重症筋無力症　アセチルフリ／レセプタ自己免疫ブドウ膜網膜炎　Ｓ−抗原全身性紅斑性狼そう　ＤＮＡ糖尿病　イレフト細胞工牛ス（Ｉｓｅｌｅｔ　ｃｅｌｌ　ｅｘｔｒａｃｔ　）慢性活性肝炎　肝臓エキスアドレナリティス　副腎線エキス（Ａｄｒｅｎａｌｉｔｉｓ　）多発性筋炎　筋エキス０己免疫性溶血性貧血　増血細胞リウマチ様心臓炎　心臓工牛ス硬皮症　スキン細胞エキス自己免疫疾患のため、さきに示したような特異性抗原と同様に、組織エキスが使用される。

他の自己免疫疾患、その特異性自己抗原、および、／または目的細胞は、Ｓｃｈｗａｒｔｚ、　Ｒ，Ｓ、ｅｔ　ａｔ、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ　１ｍｓｕｎｏｌｏｇｙ、５ｅｃｏｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｐａｕｌ。

１１、Ｅ、、　Ｅｄ、、　ｐｇ８１９−８５９．　Ｒａｖｅｎ　Ｐｒｅｓｓ、　ＮＹ、１９８９　に開示されている。

本発明に使用される自己抗原は、特別な自己免疫疾患のためのターゲットとされている細胞から単離される。例えば、ＭＳ治療のために使用されるミニリン塩基性タンパク質（ＩＪＢＰ）は、以下の実施例１に示されているような、Ｄｉｅｂｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ、（下部）の方法を使用して、哺乳動物から単離精製される。

リウマチ様関節炎の症状を有する疾患を治療するとき、コラーゲンは、Ｔｒｅｎｔｈａｍ　ｅｔ　ａｌ、、　ＪＥｘｐ、　Ｗｅｄ、　１４６：０７，１９７７の方法によって、単離精製される自己免疫ブドウ膜網膜症を治療するためには、審査中の出願番号Ｎｏ、３７９．　７７８に開示されているように、精製されたＳ −抗原を得る。

重症筋無力症を治療するためには、精製されたアセチルコリンレ七ブタが、Ｍｃｌｎｔｏｓｈ　ａｔ　ａｌ、　Ｊ　Ｎｅｕｒｏｉｗ＋＋５ｕｎｏ１．２５：　７５．１９８９の方法によって単離される。

本発明に使用するための自己抗原の類似体、およびフラグメントは、Ｔａｎ、　Ｊ、ｅｔ　ａｍ　（Ｊ、＾ｗ＋、Ｃｈｅｗ、Ｓｏｅ、　９８　）３５フ、１９７６）　と同様に、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、　Ｒ，Ｂ、（Ｆｅｄ、　Ｐｒｏｅ、　Ａｍ、　Ｓｏｃ、　Ｅｌ、　Ｂｉｏｌ、　２１：　４１２，４９６２　、およ■ Ｊ、　Ａｔ　Ｃｈｅｔ　Ｓｏｅ、　８５：　２１４９．１９６３）、およびＭｉｔｃｈｅｌ、＾、Ｒ，ｅｔ、　ａｌ）の様な技術において周知の固相合成技術を使用して合成できる。類似体は、さきに開示されたタンパク質合成技術を使用して、等量のアミノ酸連続物と化合させることにより製造できる。

類似体は、Ｅｙｌｅｒ、　Ｅ、　Ｈ，、ｉｎ　Ａｄｖａｎｃｅｓ　ｉｎ　Ｅｚｏｅｒｉｓｅｎｔａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　ａｎｄ　ＢｉｏｌB ｇｙ　９８：　２５９−２８１．　１９７１１、およびＧ、　＋１ａｓｈｉｔ　ｉｎ　Ｍｅｙｌｉｎ：　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｂｉ盾撃盾■■ ＾１ｉｎ　Ｒ，Ｌｉ５ｔ、　Ｎ、Ｙ、、　１９１１０に開示されている技術のように、ＧＰ−ＭＢＰの周知のアミノ酸連続物を使用して形成できる。たとえば、Ｗａｓｈｉｓ　（上部）に開示されているようなＧＰ−ＭＢＰアミノ酸残さ７２ −８５に一致する連続物を有しているタンパク質は、末端のアスパラギ／位置を、グルタミンで置換したアミノ酸代替品に関する先に述べた技術を使用して、化学的に合成することができる。タンパク質は、以下の実施例２に示されたような技術を使用して、噴霧形状で、投与されたときの疾患抑制活性のテストがなされる。

疾患抑制類似体、およびフラグメントは、周知のＤＮＡ組替え技術を使用して得ることができる。

本発明はまた、噴霧薬学上の処方、および自己免疫疾患にかかっだ哺乳動物を治療するために使用される投薬形態を提供する。一般に、そのような投薬形態は、特異的な自己免疫疾、轡の症状を防止、または治療するために効果を有する量の、自己免疫疾患に対して支配される（ｄｉｒｅｃｔｅｄ）　＠己抗原、疾患抑制フラグメント、そのような自己抗原の類似体、からなるグループから選択される一つ、またはそれ以上の自己免疫抑制試薬を含有する。本発明の方法に従って治療される自己免疫疾患の一つ、またはそれ以上の症状の統計学上で、重要な衰弱は、発明の範囲内の疾患の治療を施すべきであると考えられる。

各々の投薬形状の個々の噴霧投薬に含有される活性成分の含有単位は、必要な効果的な置が、多くの投薬単位の投薬によってたどり着（ので、それ自体が、特に、自己免疫疾患を治療するために効果的な置から構成される必要はない、と言うことは好ましい。

本発明の薬学上の処方は、付随的な成分として、薬学的に受容可能なキャリアー、希釈水、溶解、またはエマルジヨン化させるための試薬、およびこの分野において周知のタイプの塩を含有する。そのような物質の例は、通常の塩類溶液、生理的なｉｕｉ塩溶液、および水を含む。

本発明の抑制試薬の投与経路は、噴霧、または注入形状である。本発明の抑制試薬は、乾燥粉末、または水溶液としても投与することができる。好ましい噴霧薬学上の処方は、例えば、治療されるべき自己免疫疾ものための特別な本発明の自己免疫抑制試薬の一つ、またはそれ以上の試薬を、約０．ｔｓｍｇから約３００ｍｇ含有する生理学上受容可能な緩衝塩溶液を有する。

液体に溶解しない、または懸濁しない細かく分けられた固体自己抗原粒子の乾燥噴霧は、本発明を実行するとき役に立つ。自己抗原は、ダスティング、ｆウダー形状でもよく、平均粒サイズが、１から５μｍ５好ましくは、２から３μｍである細かく細分化された粒子から構成される。細かく細分化された自己抗原粒子は、粉末化され、そして周知の技術を使用してスクリーン濾過することによって製造される。この粒子は、粉末形状である細か（細分化された物質の予め決められた量を注入することによって投与される。

特殊な本発明の薬学上の処方に宵月キャリヤー、および／または希釈水は、いずれも、水、ｐＨ７，０〜８．０の燐酸塩溶液のような、生理学上受容可能な緩衝塩溶液を含む。

一般に、自己抗原、フラグメント、および類似体は、噴霧形状で、−日に、０．１ｍｇ／上記哺乳動物の体重〜１５ｍｇ／上記哺乳動物の体重（ｋｇ）の範囲で、哺乳動物に導入され、そして−回の投与、または多数回の投与形態で投与される。好ましくは、自己抗原、フラグメント、または類似体は、−日に、Ｉｍｇから約ｌｏｍｇ／上記哺乳動物の体重（ｋｇ）の範囲の量において、投与される。

患者に投与されるべきエキス量は、患者の疾患の段階、および痛み、そしてｅ者の身体的な状況に非富に依存している。

本発明の薬学処方は、例えば、Ｕ、Ｓ、特許Ｎｏ、４，６２４，２５１．１９８６年１１月２５日に特許証が発行されたＵ、　Ｓ、特許Ｎｏ、３．　７０３゜１７３．１９７２年１１月２１日に特許証が発行されたＵ、Ｓ、特許Ｎｏ、３゜５６１．４４４．１９７１年１月１３日に特許証が発行されたＵ、　Ｓ、　！許Ｎｏ、４，６３５，６２７に開示されているようなネブライザーを使用して、噴霧スプレー形状で投与される。噴霧される物質は、治療される患者によって、吸入される。本願実施例（および精度のため）において、噴霧試薬で治療される動物は、中に噴霧が投薬されている閉じられたケージ（気密性を有するケージ）に入れておかれる。したがって、物質の量／範囲単位は、測定可能であり、噴霧物質の単位／ケージ範囲単位で測定される。

加圧液体投与吸入（ＭＤＩ）、およびＮｅｗ＋＋ｉｎ、　Ｓ、　Ｐ、　ｉｎ　Ａｅｒｏｓｏｌｓ　ａｎｄ　ｔｈｅＬｕｎｇ、　Ｃ１ａｒｋｅ、　Ｓ、Ｗ、　ａｎｄ　Ｄ’ａｖｉａ、　Ｄ、　ｅｄｓ、　ｐｐ、１９７−２２４．　ＢｕｔｔｅｒｖｏｒｔｈｓA　Ｌｏｎｄｏｎ。

Ｅｎｇｌａｎｄ、　１９８４に開示されている乾燥粉末吸入のような噴霧供給の他のシステムは、本発明を実行するときに使用することができる。

ここに開示されたタイプの噴霧供給／ステムは、Ｆｉｓｏｎｓ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｂｅｄｆｏｒｄ、　ＭＡ　）、　Ｓｃｈｅｒｉｎｇ　Ｃｏｒｐ、（Ｋｅｎｉｌｖｏｒｔｈ、　ＮＪ　）および、ＡｍｅｒｉｃａｎＰｈａｒｍｏｓｅａｌ　Ｃｏ、、　（Ｖａｌｅｎｃｉａ、　ＣＡ）を含む数多くの一般的な供給源を利用することができる。

以下に存在する実施例は、噴霧形状の、タイプＩＩコラーゲン、およびＭＢＰの投与は、各々広い投与範囲の投与量を有するＥＡＥ、およびコラーゲン誘発関節炎の症状を抑制するのに効果的であるということを示している。噴霧形状（液体）におけるＭＢＰの投与は、疾患が誘発された後に、または誘発される前には、効果的である。つまり、発病が遅れ、治療される動物の疾患の痛みが緩和される。特異的な抗体、および細胞−介在（つまり、遅延−過敏症）反応は、特異的な自己抗原、またはその疾も抑制フラグメントの噴霧投与により、調整（ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｅ）される。これらの場合、自己抗原の噴霧投薬によって誘発される特異的な免疫抑制は、治療される動物の胸線から１１離された細胞ではない肺臓細胞によって介在されている。これらの肺臓細胞は、ＥＡＥに対する防御を投薬を受けたことがない受容者に活発に移すことができる。さらになお、牛のミニリンもまた、モルモットＭＢＰのような抑制ＥＥにおいて、効果的であることが分かった。しかしながら、後者は、ＥＡＥを誘発させるために、ＧＰ−ＭＢＯに対して免疫化されているう、ノの疾患抑制試薬により効果的である。さらに、ＩＩＩ霧治療された動物の組職学上の実験は、本発明に従って治療される動物の脳に活性化して浸透する細胞の欠如があると示している。したがって、自己免疫病、ｖＡにかかった動物に対する自己抗原の噴霧投与は、疾患の症状に対して作用し、細胞が、治療される動物の脳の中への転移することを防止する。後者は、ＥＡＥの症状の原因となる脱髄の機構を可能することができると考えられている。

本発明のさらに詳しい説明は、以下に示す実施例によって行う。

Ｋ皿Ａよ本発明の方法を実行する際、使用される自己抗原は、以下に示す技術、および方法を使用して得た。

ＧＰ−ＭＢＰは、Ｄｉｅｂｌｅｒ、　Ｇ、　Ｅ、ｅｔ　ａｌ　（Ｐｒｅｐ、　Ｂｉｏｅｈｅｍ、　２：　１３９．１９７２）の方法によって、モルモットの脳組織から精製され、Ｐｅｔ　Ｆｒｅｅｚｅ　（Ｒｏｇｅｒｓ、　Ａｒｋａｎｓａｓ）から得られた。詳しくは、中央神経システム組織は、単離され、クロロホルム −メタノール溶液中で均質化され、アセト／で抽出され、濾過され、同じ溶液中で再び懸濁された。溶液は、アセトンで抽出され、濾過され、水で再び懸濁され、ｐＨ３に調整され、１時間保温された。その後、溶液は、円心分離され、８Ｍ尿素で抽出され、ＣＭ−５が加えられ、ｐＨ１ｌに調整され、その後溶液は、濾過され、尿素で二回に渡って再懸濁され、濾過され、Ｏ，１２１ＨのＭＣＩで再懸濁され、濾過され、希釈水１０体積に対して透析され、使用するまで凍結乾燥された。

以下の実施例で使用するタイプＩ＋フラーゲンは、Ｇｅｎｚｙｍｅ（Ｈｏｓｔｏｎ、　ＭＡ）から以下に示す実験において、ルイスラックは、生後６〜８週間（Ｃｈａｒｌｅｓ　Ｒｉｖｅｒ。

Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、　ＭＡ）であり、Ｊ、ｌｍ５ｕｎｏ１．　１４０４４０．１９８８に開示されているようなフロイ／ト完全アトシュバントにおいて、上記実施例Ｉにあるように精製されたタンパク質ペースのモルモットミニリン（ＧＰ−ＭＢＰ）の１０マイクログラムのファトパッド注入により、ＥＡＥが、０８間誘発しているラックである。ラックは、以下に示す、経口、または噴霧スプレーによる、０．００５ミリグラムから５ミリグラムの間の濃縮節回の種々の投薬により治療されている。

経口、および噴霧化ＧＰ−ＭＢＰは、５匹からなるラックのグループに対して、同じ日に、同１．：投薬量だけ投薬されている。

噴ＷＧＰ−ＭＢＰは、燐酸塩緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ７，４）において、をネブライザーを使用して投与された。噴霧は、動物を捕らえておくケージの側方に形成された孔を通してテスト動物に投与された。噴霧化のため、ネブライザー（＾ｍｅｒｉｃａｎ　Ｐｈａｒｍｏｓｅａｌ　Ｃｏ、、　Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ、Ｃａｔａｌｏｇ　Ｎｏ、００２０３８）が、７．４リツトルの酸素（ネブライザー用として病院で使用されている酸素量）を供給する加圧空気出口に取り付けられた。ネブライザーは、約０．　３μｍから、約０．５μｍの直径を有するスプレー小滴を形成する。Ｅｉａｂｌｅｒ　ｅｔ、　ａｌ　の方法（上部）により精製された２５ｍｇｏ）ＧＰ−ＭＢＰは、５ｍｌのＰＢＳに溶解された。そして、これは、５匹のラック／ケージ（１４”Ｘ１２“×７″　：高さ、幅、深さ）に対して、１０分から、１５分に渡って噴霧された。噴霧されている間、細かいミストがケージ内に形成され、う１ノは自由に動いていた。治療のスケジュールは以下に示す通りである。治療（経口、または噴霧）は、−１Ｏ１−７、−５、−３，０、＋２、そして＋４日行われた。０８目の誘発ＥＡＥに対する免疫は、免疫後、１２日から１４日の発現症状を有する急性麻酔疾患において生じた。

スコアリング／ステムは、０＝普通、ｌ−＋尻尾の緊張状態がない、２＝後ろ足が弱い、３；後ろ足が無力、４＝前足が弱い、５＝瀕死である。ＥＡＥの痛みは、実験に依存して２から５を変化していた。動物は、盲目的な機能（ｂｌｉｎｄｅｄｆａｓｈｉｏ）において、評価された。

経口ＧＰ−ＭＢＰは、１査中である国際特許出願Ｎｏ、ＰＣＴ／′υ５８８１０２１３９、およびＵ、Ｓ、　！許出願Ｎｏ、６５，７３４に開示されているように投与された。

結果を図１、および図２に示す。

図１のグラフは、ＥＡＥが誘発された後、対照動物は、約１２日経過した時点で疾患の症状が現れ始めた、ということを示している。ＧＰ−ＭＢＰの経口投与は、疾患症状が明かに減少し、動物に対して、０．５ｍｇ、または５ｍｇのＧＰ− ＭＢＰが、経口されたとき、最も効果的で、遅延している効果が発生しているテストされた全てのグループでは発病が遅れた。

図２において、０．００５ｍｇから５ｍｇのＧＰ−ＭＯＰ噴霧投与は、明かにＥＡＥ疾患の痛みが、全てのテストされた動物において減少しているということが分かる。ＧＰ−ＭＢＰの５ｍｇ投与は、全体的に、抑制された全ての疾患症状によって、全ての動物を保護した。噴霧投与は、経口投与よりも効果的であった。

つまり、噴霧形状（スプレー）でのＧＰ−ＭＢＰの投与は、口内を介して、固体形状でＧＰ−ＭＢＰを投与するよりも、より低い効果的な濃度（投薬レベル）で、疾患の症状を緩和させた。経口、または噴霧形状での投薬された各々の投薬（つまり、０．００５，０．０５，０．５、および５ｍｇ／動物）の直接の比較は、ず３Ａから３Ｄに示されている。これらの実験は、さきに示したように、５匹／実験グループを使用して、正確に行われた。この結果、噴霧は、経口投与よりも効果的であり、ＥＡＥ疾患症状を抑制するために必要な噴霧化されたＧＰ−ＭＢＰが少量でよいということが確認された。このデータは、肺に吸入される物質の投与経路により、図１、ないし図３に示された効果が生じでいると示している。そして、多くの量の経口投与されるＧＰ−ＭＢＰが、噴霧形状で投与されるときと同様の効果を得るためには必要なので、飲み込まれるべき物質のため、簡単ではないとも示している。

ＧＰ−ＭＢＰの真なるフラグメントが、ＥＡＥへのそれらの効果のためにテストされた。ＭＢＰフラグメントが、固相タンパク質合成（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ、　ＳａｎＲａｐｂａｅｌ、　ＣＡから得られる）によって製造された。アミ７Ｆ１１残さ１６−３５、およびＧＰ−ＭＢＰ！２１−１３８に一致するフラグメントが、さきに述べたように、０．１４ｎｎｇ／動物という濃度で、５匹の動物に対して投与された。さきの投与されたフラグメントのいずれも、エンセファロブトノエニ、り（ｅｎｅｅｐｈａｌｏｔｇｅｎｉｅ　）ではない（つまり、フラグメントのいずれもが、補助薬を含存した腸管外投薬によりＥＡＥを誘発している。

）。このデータは、図４に示す。

図４におＬＩＴ、アミノ酸残すｌ　６−３５、および５１−７０のＧＰ−ＭＢＰに相当するフラグメントは、ＥＡＥの疾を症状を抑制するのに効果的である。アミノ酸残さ！２＋−１３８のＧＰ−ＭＢＰに相当するフラグメントは、治療される動物におけるＥＡＥの保護効果は有さず、対照と同じである。

自己免疫疾患が誘発した後、ＧＰ−ＭＢＰの噴霧がＥＡＥ治療に効果的であると示すために、動物は、ＥＡＥが誘発される３日前、または誘発した’ｄｉ　４７゜＋９．そして＋１１日のどちらにも５ｍｇＧＰ−ＭＢＰ／動物の治療を施した。

結果を図５に示す。

図５のデータは、ＧＰ−ＭＢＰの噴霧投与は、ＥＡＥが誘発されてから３日前、または＋７．；９．→−１１のどちらにも抑制効果を有しているということを示している。

自己免疫抑制治療の＃！冥性を示すために、興なる１度め、ＧＰ−ＭＢＰ、ＧＰＭ　Ｂ　Ｐ　（７）７５グメ／ト（アミノ酸残さ２１−４０のＧＰ−ＭＢＰに一致する）、Ｉたはヒストツク／バク質（５ｍｇ／動物、Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、　ＳＬ、　Ｌｏｕｉｓ。

ＭＯ）をＥＡＥが予め誘発されたうツノに投与した。結果を図６に示す。

図６のデータは、５ｍｇのＧＰ−ＭＢＰが、噴霧形状で投与されたとき、それは、ＥＡＥの誘発から動物を完全に保護するということを示している。

ＧＰ−ＭＢＰの１ｍｇの噴霧形状での投与もまた保護した。５ｍｇのヒストンタンパク質は、ＥＡＥに対して保護しなかった。それは、明らかにタンパク質が充填（ｃｈａｒｇｅ）されており、ＭＢＰの分子量（ＭＢＰの１６，０００と比較して、１８．０００ドルトノ）と同じでなので、ヒストノは、制御のためとして使用される。

この実験において、投与されたＧＰ−ＭＢＰフラグメノト（２１−４０）’りまた、保護しない。図６には、ＧＰ−ＭＢＰの１ｍｇが経り投与されたときは、ＥＡＥに対して、動物を保護するが、噴霧形状で、ＧＰ−ＭＢＰの同じ量が与左られたときはもちろん保護しないということが示されている。

実施例３以下に示されたデータは、試験管内での実験の一連を説明しており、試験管内で、活発に増殖反応を抑制するｌ１ｊｌ霧化ＧＰ−ＭＢＰにより治療された動物がら肺臓細胞が再生されたということを示している。噴霧形状の自己抗原を受けた動物達を、−１０日治療を受けなかった動物を除いて、さきに示した実施例２にあるように、個々の摂生を使用して、６つに分けた。ｌＩ！膜神経組職細胞は、治療済みの、または治療されていない動物からの胸腺細胞、または肺細胞を含有する。ＮＬＢを有するレスボノダー（ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ　）細胞、これは、ルイスラ、ノから分けられた、ミニリン塩基性タンパク質特興性Ｔ−１１８胞系統であるが、この細胞と、ＮＬＡは、ルイスラ、ノから分けられた系統を誘発するミツバクテリア性であり、負の制御として使用されるこのＮＬＡとを含有している。ＮＬＢ、およびＮＬＡＩ［ｌ胞系統は、各々周知の技術（Ｊ、　ｆｖｕｎｏｌ、　１３１：　２８１０．１９８８）を使用するフロイント完全アドジニバ／トにおいて、ＧＰ−ＭＢＰ、または入車結核菌により、免疫化されたルイスラッノのひかがみ部のリンパ節から分割されている。単離されたり７２節細胞は、試験管内で、使用する前に、抗原十イノターロイキン−２（ＩＬ−２）により、再び刺激される。実験（；、Ｌｉｄｅｒ　ｅｔ、　ａｌ　（Ｊ、１ｗｕｎｏ１．１４２：　７４８−７５２．　１９８８　）に開示されているよう−こ行われた。

試験管内試験に使用されたＭＢＰ、またはコノカナバリン（フッ＾）は、各々１０μｇ／ｍｌ、および１２５μｇ　／　ｍ　＋であった。コノＡは、非−特異性制御として使用される。結果は、以下の表２１表３に示す。

ＮＬＢ　＊　ＣＯＮ　Ａ　２４．６４Ｂ±０．９　２９．９５０土６．５　−１７亀ＮＬＢ　＋　ＧＰ−ＭＢＰ　２０．６４７土６．９　２２．４８０土５．６　−８％ＮＬＡ　＋　ＣＯＮ　Ａ　１９．６９０　ｍ　５．９　１５．９４１　＋　２−１　１９％ＮＬＢ　＋ＣＯＮ　Ａ　９３．４０４　＋　１．４　８７．６３５　＋　８＋１　６％ＮＬＢ　＋　ＧＰ−ＫＢＰ　６３．０２３土１２．９　３５．５２３土８．９　４４亀ＮＬＡ　＋　ＣＯＮ　Ａ　１９．８９２土４．６　３０．５５３土３．６　−５３％表２、および表３において、ＧＰ−ＭＢＰが、噴霧治療（Ｇ　Ｐ　−Ｍ　Ｂ　Ｐとともに）されたう７ノの肺臓からＩＩＩＷｌされたモノニレイタ−細胞の存在下で、ＮＬＢ系統が添加されると、免疫反応の４４％抑制が観察された（表３）。そのため、ＭＢＰは、噴霧治療された動物の免疫反応を抑制するために必要であり、その抑制は、抗原特異性である。コンＡをＮＬＢ、またはＮＬＡ細胞のみに添加すると、それは、抑制を誘発しない。

表２のデータは、胸腺細胞は、対照（ＮＬＢ＋コノＡ）、またはＭＢＰ−治療された系列は、なんらかの抑制の形跡も示されていないので、この免疫抑制において、必要とされないということを示している。このため、自己免疫疾患の治療のための噴霧化された６己抗原作用の機構の一つが、治療される動物における、特異的な試験管内での自己免疫反応を活発に抑制する細胞の生産となって現れる。

これもまた、以下の実施例９に示されたように、肺臓細胞による、採用された噴霧治療された動物からの保護転移によってＪ明された。

実施例４アトシュバント関節炎は、ラノソの尻尾の元に７０イツト完全アトシユバントを注入することによって誘発された関節炎であるリュウマチ様関節炎のためのモデルである。免疫治療約１４日、人間のリュウマチ様関節炎の特徴であるそれらの関節の隆起膨化を開発された厳しい検査（ｄｅｖｅｌｏｐ　５ｅｖｅｒｅ）方法で治療されるアトツユバント関節炎への噴霧投与の効果が研究された。実験は、以下に示すように行われた。

タイプＩＩ）ラーゲ／の噴霧が、０００３．０．０３、および０．３ミリグラム／動物の投与量で、ＧＰ−ＭＢＰのため、上記実施例２にあるようにおこなわれた。関節炎は、フロイント完全アドジニバントをラッノの尻尾の元に注入することによって誘発された。上記実施例２で示されたように、５匹の動物が、各々の実験グループのために使用された。動物は、噴霧治療う１ノの関節炎の誘発に関係して−５、−３，０、↓２、そして＋４日治療された。

関節炎の段階を示す手段は、Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、１４６：　８５７．１９７７に開示されているように、（〇−普通、１−赤みのみ、２−赤み−やや腫れ、３−ひどい騰れ、４−奇形をともなう）ラフノの４本の各々足の０−４のスケールで分類されている。この関節炎の段階を示す手段は、各々のグループについて毎日測定が行われた。各々足に対する個々のスコアーも示され、それらは、グループの各々の動物に対して行われた。さらに、スコア一手段は、テストされた動物の数によって、グループの総合スコアーを分割して測定された。

関節炎の段階を示すスコアーを、例として以下に示す。

４匹からなるこのグループの関節炎の段階を示すスコアーは、４＋８↓１２↓１６　；　１立　＝ｌＯ上記実験の結果を図７に示す。この図７のＸ軸は免疫化された後の日数を示し、Ｙ軸は関節炎の段階を示すスコアーを示す。

図７に示したように、０．００３ｍｇ／ラフッではなく、０．０３ｍｇ／ラッノ、および０．３ｍｇ、’うＩノでのフラーゲノの噴霧投与では、明かに上記関節炎の段階を示すスコアーが、減少している。このため、ＥＡＥ治療のためのＭＢＰの噴霧投与する場合のように、アトシュバント関節炎に悩まされている動物に対するコラーゲ／投与は、独立した投与方法（ｄｏｓｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎ＋　ｍａｎｎｅｒ　）において、効果的である。

実施ｆＴ１５ボビンミニリン、およびボビンＭＢＰは、経口、または噴霧形状で投与されたときのＥＡＥの抑制効力についてテストされた。ボビンミニリンは、Ｂｉｏｐｕｒｅ（Ｂｏｓｔｏｎ、　Ｍ＾）から購入され、この分野において周知のルーチン手順であるスクロース勾配上で精製され、単離されたミニリンから構成されている。ＥＡＥは誘発され、ボビンミニリン、およびＭＢＰは、先の実施例２にあるように、経口、または噴霧形状で投与された。結果を以下の表４に示す。

ニニニーーーー二−−ｌ−ユＬ−豆一」Ｌニア　１９　２０灯ｐ＝、　Ｑ、９１　１．７　２．３　２．４　１．９１．ｓ　Ｏ，９０，７０，２７丁−’ｃンミＬす／１０００ｍｇ　０　０　０．３　０−４　０．３　０−２　０　０　０Ｘ−じ゛７ミＬリン１１００ｆｆＩ　Ｏ，３０，４０，６０，８０，５０−５０，Ｉ　Ｑ　Ｏ江、ビ〉ミニリンＭＢＰ、１０ｍｇ　Ｏ，２０，２０，５０，７０，４０，４０，３００、↑パビリミ１ワン１０ｍｇ（ＡＩ　ＯＯＯＯ，４０，７０，５０，７０−２０工′ヒ゛ンミエリン１ｍｇ　’ＯＪ　Ｏ−７０，８１，３１，１０，７０，４０，２０、Ｔ、：ζ′ にミニリン０．１ｍｇ　０．７　Ｃ１１−３１−２１，３０−９０−４０，３０，ＩＧＰ− ＫＢＰ、１ｍｇ　ＯＯ００−１０，３０，４０−１００１１１）采にｉン・ｌ− １スコアー三見コ七丁も上記表４を参咳すると、ボビンミニリンは、経口、または噴霧形状で投与されたとき、ＥＡＥを治療するには効果を有していると言うことが分かる。噴霧形状での１０ｍｇのボビンミニリン投与は、噴霧形状で経口投与される同じ物質の１０００ｍｇと自己免疫疾患を抑制するのと同じ効果を有している。さらに、ボビ７ＭＢＰの経口投与もまた、ＧＰ−ＭＢＰより誘発されたＥＡＥｌｉｆ状を抑制するのに効果を有している。

実施例６遅延タイプ過剰＠感性（ＤＴＨ）反応は、ＥＡＥが誘発され、ＧＰ−ＭＢＦの、経口および噴霧投与により治療されたルイスラフンにおいて測定された。遅延タイプ過剰敏感性（ＤＴＨ）は、免疫が介在している生体内細胞の典型的な測定である。

ラノソ（ｌグループが５匹）は、経口、および噴霧形状で、５ｍｇのＧＰ−ＭＢＰが投与され、ＤＴＨ反応は、さきに示したように測定された。遅延タイプ過剰敏感性は、ラワンの耳介に１０μｇのＧＰ−ＭＢＰ投与によって誘発され、Ｊ、ｌ冨曹ｕｎｏ１．１２５：２Ｂ３．１９８０に開示されている方法にしたがって、４８時間毎に腫れが測定された。

実施例２にあるようにＥＡＥが誘発されているラワンのＤＴＨ反応は、種々の治療が施された後、さきに示されたように測定された。ラワン（５匹／グループ）は、噴霧形状である５ｍｇ、／動物のＭＢＰ製剤で治療され、ＤＴＨ反応が測定された。結果を以下の表５に示す。

以下、余白 −Ｕ」ＧＰ−ＭＢＰ、−３１，１５００−１８００，０００ＧＰ−ＭＢＰ、＋７．＋９．＋１１　１．１５０　０．５８０　０．００４ＧＰ−ｍｙｅｌｉｎ　１．１５０　０．０４０　０．０００ＧＰ−ＭＢＰ　’７ラフ／ント　（１６−３５１１，１５００−８５００，０３６ＧＰ−ＫＢＰ　７ラフ゛メンｉ　（５１−７０１１，１５０１，００００，２５１２ＧＰ−ＭＢＰ　７籾メンｉ　（１２１−１３８１１，１５００，９１１０，０９６２丁：しン　旧Ｐ　ｌ−１５００−３３００，０００う・、トＫＢＰ　ｌ−１５０１，０８０ｏ−５ｓｓ２１　丁−壬寅コＬにメ・７Ｉ：９・１ｊＬ２　７−　ベし１＋＝　’ソ曳雪ｚ９１−表５のデータを比較すると、ＧＰ−ＭＢＰを噴霧投与する３日前、またはＥＡＥが誘発されてから７．９、そして１１日後（＋７、＋９、＋１１）は、噴霧治療されたラッノのＤＨＴ反応を明かに抑制していた。モルモットミニリンを使用した噴霧治療は、投与後、−１０、−７、−５、−３，０、＋２、そして＋４日では、治療された動物のＤＴＨ反応を効果的に抑制していた。

ＧＰ−ＭＢＰの特定のフラグメント（さきに示した投与）もまた、噴霧治療された動物のＤＴＨ反応を抑制することにおいて効果的であった。アミノ酸残さ１６ −３５に一致するＧＰ−ＭＢＰフラグメントは、噴霧形状で投与されたとき、ＤＴＨ反応を抑制していた（表５）：ＧＰ−ＭＢＰアミノ酸残さ５１−７０に一致するフラグメントは効果を有さず、ＧＰ−ＭＯＰアミノａｌ残さ１２１−１３８に一致するフラグメントはＤＴＨ反応の弱いレベルの抑制を誘発していた。このデータは、ＧＰ−ＭＢＰの７ラグメントは、ＤＴＨ反応抑制に効果を有するということを示している。

さらに、噴霧化されたボビ７ＭＢＦは、ＧＰ−ＭＢＦで免疫化した動物においてＤＴＨ反応抑制に効果を有しているのに対して、噴霧化ラップＭＢＰは、この点に付いて効果を有していない。これらのデータもまた、タン／ｆり質、それ６身の噴霧化は、ＤＴＨの免疫抑制の原因ではなく、特異的なタン、ｆり質のみがこの効果を作りだしているということを示している。

実施例７ＥＡＥが誘発されているラックの抗原製造に対するＧＰ−ＭＢＰの噴霧投与の効果が試験された。

抗体反応は、噴霧化されたＧＰ−ＭＢＰ、ヒストン、ボビンセーラムアルブミン（ＢＳＡ）を含む種々の制御抗原で治療された動物に対して測定された。これらの実験において、血清が使用され、治療されたラップの免疫化３週間後、フロイント完全アトシュバントのＧＰ−ＭＢＰに対する免疫に関係して、−１Ｏ，−７、−５、−３，０、＋２、そして＋４日の治療されたグループに対する５匹において、抗体滴定量が測定された。

抗体滴定量は、ＥＬ　Ｉ　ＳＡによって測定された（Ｌｉｄｅｒ、　ｅｔ、　ａｌ、Ｊ、１ｍ５ｕｎｏ１１４２＋　７４８−７５２１９８８に開示されている。

）。結果を、以下の表６に示す。

以下、余白。

一玉」０．５２Ｃ０−２３９０，３Ｂ２　０．１４３０−ＭＢＰ５■（Ａｌ　Ｏ，２７６０−１２１０，（１Ｂ９　０．０７４ＧＰ−ＭＢＰ、　１ｍｇ　ｆＡ）　０．５７９　０．３８０　０．３４９　０．２５０ロ−ＭＢＰ　、　シηｆｏｌ　０．４３７　０．２７５　０．２０３　０−１５７じストア、　Ｓ　ｍｇ　１．４０５　１．２２９　０．７８２　０Ｊ４４ＲＳＡ、　５　ｍｇ　Ｏ，４０５０，４８９０−３８２０，３１５ＰＢＳ　Ｏ，９１３０，９５３０，１６９０，６２４ジ−ＭＢＰ−７″７り／ンｌ−０，２２６０，２４３０，１９２０−１３２（２１−４０，Ｑ、１７４　π９／テ９．ト）この結果は、５ｍｇの噴霧化ＧＰ− ＭＢＰで治療された動物では、対照動物と比較されるような抗体レベルまで減少するという、充分満足のいく結果が得られたということを示している。ＰＢＳ、ボビンセーラムアルブミン（ＢＳＡ、ポーリングマンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇ −ｍａｎｎｂｅｉｍ　）　）　％　またはヒストン（Ｓｉｇｓ＋ａＣｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、　ＳＬ、　Ｌｏｕｉｓ、　ＭＤ　）のどちらも抗体反応を抑制しなかった。さらに、ＧＰ−ＭＢＰアミノ酸残さ２１−４０に一致するＧＰ−ＩＡＢＰフラグメントももた、噴霧形状で投与されたとき、統計学上満足のいく方法で、特異的なＧＰ−ＭＢＰ抗体反応を抑制した。さきに示された結果は、５ｍｇ噴霧化ＭＢＰ出治療された動物において、ＭＢＦに対する抗体反応が減少していることを示している。

実施例８ＥＡＥは、先の実施例２（−１０、−７、−５、−３，０、＋２、そして＋４日、５匹／グループに対して、５ｍｌのＰＢＳに、２５ｍｇのＧＰ−ＭＢＰが入っているものを投与した。）にあるような４霧によって、ＧＰ−ＭＢＰで治療された動物において、減少していた。対照動物は、ＰＢＳのみで治療された。ラップは、感染後、１６日後場牲になり、それらの脳１よ、ホルムアルデヒロ内に保管され、個々のうｙノ用のパラフイノー包埋ＨＩｉｍが用意され、う、ツの脳の実質上の炎症性病巣は、ブラインディト機能（ｂＨｎｄｅｄ　ｆａｓｈｉｏｎ　）　Ｉこおｔｌてカウントされた０組ｍ融解分析力（、１１１ｇｇ１ｎｓ　ａｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｉ＊＋＋ｕｎｏ１．１４０＋４４０，１１８８１こ開示されているようにラップに対して行われた。組繊融解分析の結果を以下もこホす。

これらの研究において、ＭＢＦ治療された動物にＣよ、細胞浸潤してしλる脳実質の欠如があった。結果は、以下の通りである。

対照動物（ｎ−６）　病巣の数＝４８．　２５．　１４．　１１．　８．４平均値（病巣の数／動物）−１８，３噴霧治療（ｎ−４）　病巣の数＝２．０．０．　０平均値（病巣の数／動物）＝Ｏ，Ｓこれは、噴霧治療は、＝床上の疾患、および免疫性機能に対して影響を及１にすだけでなく、脳ＩＩｌ胞の運動を防止すると−１うことを証明して（Ｘる。脳細胞の運動は、ＥＡＥの疾患プロセスの根本的な箪−機能である。

実施例９ＧＰ−ＭＢＰの噴霧化により起こる、動物のＥＡＥへの保護に関連した大きな問題は、特異的な免疫抑制の活動のメカニズムである。以下にホされた実験１よ、活性細胞のメカニズムは、ＭＢＰの噴霧投与によって、誘発されて−すると０うことを表している。これらの実験では、通常の動物４こ、ＥＡＥｉこ対する保護を組み込むように（ａｄｏｐｔ　１ｖｅｌｙ）移動させる細胞は、噴霧治療された動物の肺臓から採取された。

ルイスラ１ノは、５匹のラワノ２／グループを使用して、実施例２Ｉこあるよう１こ（ＰＢＳにおけるＧＰ−ＭＢＰの５ｍｇ／ラアノ単位を７回ｌこ渡って投与された。）、治療された。最後の治療、３日後、肺臓細胞１ま、治療された動物から取り除かれ、単−細胞懸だく液が用意され、治療されたことがなＬ１５匹の動物の腹膜内に注入（９Ｘ１０”細１１１／動物）、その後、７０インド完全アトシーツインドＩこおけるＭＢＰで免疫化された。結果を図８に示す。

図８に示されたように、ＭＢＰ治療された動物から肺臓細胞を受けたう１ツの疾その痛みの減少が示されている。さらに、ＤＴＨ反応が、受容動物で測定され、噴霧治療されたラップでは、ＭＢＰに対するＤＴＨ反応の抑制が示されて〜＼た（データは示されていない。）。

このため、噴霧治療された動物からの肺臓細胞は、ＥＡＥＩこ対する、治療を受けたことのない受容動物への組み込ませるような（ａｄｏｐｔｉｖｅｌｙ）移動が可能であり、さらにこれらの動物のＤＴＨ反応が下方へｍ整（ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｅ）された。

スつ１− スっ１− ヌファ− ！”ｉｌ　ＹＦ　会。ｉ’；　Ｉ’Ｍ　Ｅ　２、ｌｘっｙ’−要約書ここで開示されたことは、噴霧形状の、自己免疫疾患のための特異的な自己抗原、疾低抑制フラグメント、および自己抗原の類似体からなるグループから選択された一つ、またはそれ以上の試薬の投与による哺乳動物の自己免疫疾患の治療のための方法である。

国際調査報告 ′″＋１“ムー神″″’　ＰＣＴ／Ｌ！Ｓ如１０７４５％

Claims

【特許請求の範囲】

１．自己免疫疾患に対して特異的に支配する自己抗原、上記抗原の疾患抑制フラグメント、および上記自己抗原の類似体とからなるグループから選択される少なくとも一つの試薬を、自己免疫疾患を治療、または予防するために効果的な量噴霧形状で、上記哺乳動物に投与することからなる哺乳動物における自己免疫疾患の発病を抑制、または治製するための方法。
２．前記自己抗原が、ミエリン塩基性タンパク質（ｍｙｅｌｉｎｂａｓｉｃｐｒｏｔｅｉｎ）である請求項１記載の方法。
３．前記自己抗原がコラーゲンである請求項１記載の方法。
４．前記自己免疫疾患が、多種の硬化症からなる請求項１記載の方法。
５．前記自己免疫疾患が、リウマチ様の関節炎である請求項１記載の方法。
６．自己抗原、疾患抑制フラグメント、および噴霧の上記自己抗原の類似体とからなるグループから選択される少なくとも一つの試薬を、自己免疫疾患を治療するために効果的な量有する、自己免疫疾患にかかった哺乳動物の治療のための薬学上の処方。
７．前記自己抗原が、ミエリン塩基性タンパク質（ｍｙｅｌｉｎｂａｓｉｃｐｒｏｔｅｉｎ）である請求項６記載の処方。
８．前記自己抗原が、コラーゲンである請求項５記載の処方。
９．前記自己抗原が、ミエリン塩基性タンパク質（ｍｙｅｌｉｎｂａｓｉｃｐｒｏｔｅｉｎ）の疾患抑制フラグメントである請求項６記載の処方。
１０．さらに、薬学上許容可能なキャリア、または希釈水を含有する請求項６記載の処方。
１１．前記自己免疫疾患が、多種の硬化症を含む請求項６記載の処方。
１２．前記自己免疫疾患が、リウマチ様の関節炎を含む請求項６記載の処方。
１３．噴霧形状である、自己免疫疾患のための特異的な自己抗原、自己免疫疾患抑制フラグメント、および上記自己抗原の類似体とからなるグループから選択される少なくとも一つのもののを、抑制するために効果的な量、肺器官を介して哺乳動物に投与することからなる、多種の効果症に影響される哺乳動物における上記症状を呈する自己免疫疾患を治療するための方法。
１４．前記自己抗原が、ミエリン塩基性タンパク質（ｍｙｅｌｉｎｂａｓｉｃｐｒｏｔｅｉｎ）である請求項１３記載の方法。
１５．上記疾患のための特異的な自己抗原、自己免疫疾患抑制フラグメント、および上記自己抗原の類似体とからなるグループから選択された少なくとも一つのものを、抑制するために効果的な量、噴霧形状で投与することからなる関節炎の症状を呈する自己免疫疾患を治療するための方法。
１６．前記自己抗原が、コラーゲンである請求項１５記載の方法。
１７．噴霧形状からなる、前記自己免疫疾患のための特異的な自己抗原、自己免疫疾患抑制フラグメント、および上記自己抗原の類似体から構成されるグループから少なくとも一つ選択されるものを含む細かく分割されたスプレーを、上記疾患を抑制するために効果的な量、哺乳動物の肺器官に放出することからなる自己免疫疾患に影響を受ける哺乳動物を治療するための方法。
１８．自己免疫疾患に対して支配する（ｄｉｒｅｃｔｅｄ）少なくとも一つの自己抗原、自己免疫抑制フラグメント、および自己抗原の類似体を含む水性噴霧を、自己免疫疾患を治療するために効果的な量有する薬学上の処方。