HUT61322A

HUT61322A - Process for producing peptide derivatives suitable for treating glaucoma and pharmaceutical compositions comprising same as active ingredient

Info

Publication number: HUT61322A
Application number: HU921883A
Authority: HU
Inventors: Fred Widmer; Kailash Kumar Gauri
Original assignee: Carlbiotech Ltd As
Priority date: 1989-12-07
Filing date: 1990-12-07
Publication date: 1992-12-28
Also published as: ATE149517T1; DK615889D0; JPH05504336A; EP0504207B1; DK615889A; FI922620A0; FI922620A; LV10107A; AU636427B2; DK167813B1; US5411942A; HU9201883D0; WO1991009053A1; KR927003631A; CA2069449A1; LV10107B; AU6898991A; EP0504207A1; DE69030100D1

Description

A találmány új peptidszármazékokra, az előállításukra szolgáló eljárásra, az ezeket tartalmazó gyógyászati készítményekre, valamin glaukoma kezelésére alkalmas eljárásra vonatkozik.

A glaukoma egy nagyon gyakori szembetegség, amely az idősebb emberek millióit érinti. A glaukomát abnormálisán magas intraokuláris nyomás jellemzi és - hogy ha nem kezelik károsodnak a szemidegek, amely a látómező beszűkülését eredményezheti, és esetenként gyógyíthatatlan vakságot is okozhat.

Az intraokuláris nyomást a befolyás és kifolyás sebessége, azaz a csarnokvíz dinamikája határozza meg. A csarnokvíz a szem hátulsó kamrájába lép be, majd a pupillákon keresztülfolyva az elülső kamrába jut, és végül a trabekuláris hálózaton keresztül távozik a szemből.

A csarnokvíz látja el a lencséket és a szaruhártyát tápanyagokkal, és annak helyes adagolása így a legfontosabb a szem egészsége szempontjából.

A csarnokvíz dinamikájának bármilyen zavara, amelyet túlzott befolyás vagy a csökkent kifolyás okoz, az intraokuláris nyomás normális érték (felnőtteknél 2193-2580 Pa) fölé való emelkedésében nyilvánul meg, vagyis a szem hipertenziwé válik. A túl hosszan tartó hipertenziv állapot idegkárosodáshoz és vaksághoz vezet. A glaukoma részletes leírása az alábbi irodalmi helyeken található: An Outline of Ophthalmology [R.L. Coakes, és P.J. Holmer Sellars, kiadó: Wright, Bristol (1985), pp. 54-57. oldal]; és Current Topics in Eye Research [szerkesztő J.A. Zadunaisky és K. Davson, Academic Press].

-3Α kereskedelmi forgalomban lévő összes ismert glaukomaellenes szer az intraokuláris nyomást csökkenti, vagy a csarnokvíz képződésének csökkentésével, vagy a kifolyás, azaz a csarnokvíz szemből való eltávozásának növelésével. A glaukomaellenes szerek így mind vérnyomást csökkentő szerek.

A glaukomaellenes szerek leggyakoribb típusát az adrenerg antagonisták képezik, ezeknek többsége β-blokkoló (a legelterjedtebben alkalmazott ebből a típusból a timolol), adrenerg agonisták, dopaminerg szerek, kolinerg szerek (ebben a típusban leggyakrabban alkalmazott szer a pilokarpin) lehetnek, és még számos egyéb vegyülettípus is alkalmazható. Részletes összefoglalásukat lásd például az Annual Reports in Medicinái Chemistry-ben [20. kötet, 9. fejezet, M.F. Sugrue és R.L. Smith: Antiglaucoma Agents” (1985, Academic Press)] és A. Goodman és L. Gilmans: The Pharmacological Basis of Therapeutics.

A glaukomaellenes szerek egyik jellemzője tehát a kémiai szerkezeti típusok nagyon széles választéka, amelyek mind alkalmasak a túlságosan magas intraokuláris nyomás csökkentésére.

A jelenleg alkalmazott gyógyszerek egyike sem teljesen kielégítő. Komoly mellékhatásokkal rendelkeznek, amely a szivet, a veséket, a tüdőt és a libidót befolyásolják. Ezenkívül a metabolikus stabilitással is problémák vannak, amelynek következtében a szemcseppeket naponta több alkalommal kell adagolni. Ezért intenzív kutatás folyik olyan glaukomaellenes szerek kifejlesztésére, amelyek a fenti hátrányoktól mentesek. Újabban egy teljesen új kémiai szerkezeti típust, mégpedig

peptideket és peptidszármazékokat ismertettek mint glaukomaellenes aktivitással rendelkező vegyületeket, vagyis hipotenzív szereket. Példaként említhetjük a karboxi-alkil-dipeptideket (88350 számú európai szabadalmi leírás) és a szívpitvari nátriuretikus faktort, amely egy hosszú, 29 aminosavat tartalmazó peptid [Fortschritte dér Ophthalmologie, 89, 89-91. (1989)].

Ezenkívül tejproteinek hidrolizátumairól is kimutatták, hogy glaukomaellenes aktivitással rendelkeznek (W0 86/04217 számon közzétett nemzetközi szabadalmi leírás).

A találmány szerinti új szintetikus peptidek - amelyek legfeljebb 5 aminosavból állnak - és származékaik csökkentik az intraokuláris nyomást megfelelő állatmodellben.

A találmány közelebbről az (I) általános képletű peptidszármazékokra, vagy ezek N-C gyűrűs formájára, vagy diszulfid híddal összekötött, N-C gyűrűs vagy lineáris dimerjeire vonatkozik, a fenti képletben

A jelentése hiányzik, vagy nem-hidrofob, töltés nélküli

D- vagy L-aminosavat vagy annak dezamino-származékát jelenti, amely az amid oldallánc hidrogénatomján adott esetben mono- vagy diszubsztituálva van egy egyenes vagy elágazó szénláncű vagy gyűrűs alkil-, aralkilvagy arilcsoporttal, amelyek bármelyike adott esetben halogénatommal, nitrocsoporttal, aminocsoporttal, szulfocsoporttal, foszfocsoporttal vagy karboxilcsoporttal lehet mono- vagy poliszubsztituálva, és mindegyik aralkil- vagy aril-szubsztituens ezenkívül alkilcsoporttal is szubsztituálva lehet,

B jelentése hiányzik, vagy töltés nélküli aminosavat, vagy töltés nélküli N-metilezett aminosavat jelent,

C jelentése töltés nélküli aminosav, vagy töltés nélküli N-metilezett aminosav,

D jelentése nem-hidrofil oldalláncú vagy oldallánc nélküli, töltés nélküli aminosav,

E jelentése cisztein vagy cisztein-homológ, amelynek merkaptocsoportja szabad állapotban van, vagy az alábbi szubsztituensek egyikével van szubsztituálva: -CR3R4NHCOCR5 általános képletű csoporttal, ahol R3 és R₄ jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom vagy halogénatom, és

R5 jelentése egyenes vagy elágazó szénláncú vagy gyűrűs alkilcsoport, aralkilcsoport vagy arilcsoport, amelyek bármelyike adott esetben halogénatommal, karboxilcsoporttal, szulfocsoporttal, foszfocsoporttal, aminocsoporttal vagy nitrocsoporttal lehet monovagy poliszubsztituálva, és az egyes aralkil- és aril-szubsztituensek alkilcsoporttal is szubsztituálva lehetnek,

-S—CRgRyRg általános képletű csoporttal, ahol

Rg, R7 és Rg jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom, halogénatom, egyenes vagy elágazó szénláncú vagy gyűrűs alkilcsoport, aralkilcsoport vagy arilcsoport, amelyek bármelyike adott esetben az

R5 jelentésére megadott módon mono- vagy *·4·

-6poliszubsztituálva lehet, vagy

E ^R1 ^R1 ^R1

-CR₉R₁₀Rii általános képletű csoporttal, ahol r₉, Rio ®s jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom, alkilcsoport, aralkilcsoport vagy árilesöpört, amelyek bármelyike az R5 jelentésére megadott módon adott esetben mono- vagy poliszubsztituálva lehet, vagy jelentése adott esetben szubsztituált, dekarboxilezett cisztein- vagy cisztein-homológ-származék, jelentése hidrogénatom vagy R-CO- általános képletű csoport, ahol

R jelentése hidrogénatom, egyenes elágazó szénláncú vagy gyűrűs, legfeljebb 20 szénatomos alkilcsoport, amely adott esetben kettős kötéseket és/vagy szubsztituenseket tartalmazhat, amely szubsztituens halogénatom, nitrocsoport, aminocsoport, szulfocsoport, foszfocsoport vagy karboxilcsoport lehet; vagy aralkil- vagy arilcsoport, amelyek adott esetben az alkilcsoportra megadott módon lehetnek szubsztituálva, és további szubsztituensként alkilcsoportot tartalmazhatnak, vagy glikozilcsoport vagy nukleozilesöpört, vagy jelentése L- vagy D-α aminosav, vagy jelentése hiányzik, ha A jelentése szubsztituálatlan dezaminoszármazék, vagy ha a peptid N-C ciklusos formában van, és

R2	jelentése -NRi₂R13 általános képletű csoport, ahol R₁₂ és R₁₃ jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom, egyenes vagy elágazó szénláncú vagy gyűrűs alkilcsoport, aralkilcsoport vagy arilcsoport, amelyek adott esetben az R5 jelentésére megadott módon lehetnek szubsztituálva, vagy -0R₁₄ általános képletű csoport, ahol ^r14 jelentése hidrogénatom, egyenes vagy elágazó szénláncú vagy gyűrűs alkilcsoport, aralkilcsoport vagy arilcsoport, amelyek adott esetben az R₅ jelentésére megadott módon lehetnek szubsztituálva, -O-glikozil-csoport, vagy L- vagy D-a-aminosav, vagy
R2	jelentése hiányzik, ha E jelentése cisztein vagy cisztein-homológ dekarboxilezett származéka, vagy a peptid N-C gyűrűs formában van,
valamint	fenti képletnek megfelelő olyan peptidekre, amelyek

egy vagy több retroinverz, ketometilén- vagy metil-szulfid peptidkötést tartalmaznak.

A találmány szerinti vegyületek egyik előnyös csoportjában

A	jelentése Asn, Ser, Gin,	Gly, Pro,	Sár,	Thr, Alá	vagy
	a megfelelő N-alkilezett	aminosav,
B	jelentése Gly, Alá, Leu,	Pro, Sár,	Ser,	Met, Thr	vagy
	a megfelelő N-alkilezett	aminosav,
C	jelentése Ser, Gly, Pro,	Sár, Leu,	Met,	Thr vagy

-8a megfelelő N-alkilezett aminosav,

D jelentése Val, Gly, Thr, Alá, His, Ile, Leu, N-Leu, N-Val, Met, terc-Leu és aromás aminosavak, és

E, Rí és R₂ jelentése a fent megadott.

Különösen előnyösek azok a találmány szerinti peptid-származékok, amelyek (I) általános képletében

A	jelentése	Asn,
B	jelentése	Gly,
C	jelentése	Gly,
D	jelentése	Val,
E	jelentése	Cys(Acm)
*1	jelentése	H és
R2	jelentése	NH₂;
illetve
A	jelentése	Asn,
B	jelentése	Leu,
C	jelentése	Gly,
D	jelentése	Val,
E	jelentése	Cys(Acm)
^Ri	jelentése	H, és
^R2	jelentése	NH₂;
illetve
A	jelentése	Asn,
B	jelentése	Alá,
C	jelentése	Gly,
D	jelentése	Val,
E	jelentése	Cys(Acm)
^Ri	jelentése	H, és

R2	jelentése	nh₂;
illetve
A	jelentése	hiányzik,
B	jelentése	Asn,
C	jelentése	Leu,
D	jelentése	Gly,
E	jelentése	Cys(Acm),
^Ri	jelentése	H, és
^R2	jelentése	NH₂;
illetve
A	jelentése	hiányzik,
B	jelentése	hiányzik,
C	jelentése	Gly,
D	jelentése	Val,
E	jelentése	Cys(Acm),
^Ri	jelentése	acetil-, és
^R2	jelentése	NH₂;
illetve
A	jelentése	hiányzik,
B	jelentése	hiányzik,
C	jelentése	Asn,
D	jelentése	Val,
E	jelentése	Cys(Acm),
^Ri	jelentése	H, és
^R2	jelentése	NH₂.
	A találmány a fenti vegyületek előállítására szolgáló

eljárásra is vonatkozik, amelynek értelmében a megfelelő védett aminosavakból a peptidkémiában szokásos módszereket al —10— kalmazva előállítjuk a védett peptideket, majd adott esetben ezeket a védőcsoportokat ismert módon lehasítjuk.

A találmány szerinti előnyösen eljárás értelmében a C-terminális aminosavat vagy az előállítandó peptid C-terminális aminosavat tartalmazó, adott esetben az oldalláncban lévő funkciós csoportokon védett fragmensét vagy a C-termináis aminosav származékát vagy a fenti peptid-fragmens karboxilcsoportján valamilyen egyéb módon védett származékát az előállítandó peptid aminosav-szekvenciájában a megelőző, terminális nitrogénatomján és adott esetben oldalláncban lévő funkciós csoportján védett, karboxilcsoportján aktivált aminosawal vagy az előállítandó peptid aminosavszekvenciájában a megelőző aminosavat tartalmazó, terminális nitrogénatomján és adott esetben oldalláncban lévő funkciós csoportján védett, karboxilcsoportján aktivált peptid-fragmenssel acilezzük, és adott esetben a kapott, terminális nitrogénatomján védett intermedier peptidet az acilezendő terminális nitrogénatom védőcsoportjának ismert módon történő eltávolítása után egy következő lépésben az előállítandó peptid aminosav-szekvenciájában a megelőző, terminális nitrogénatomján és adott esetben oldalláncban lévő funkciós csoportján védett, karboxilcsoportján aktivált aminosawal vagy az előállítandó peptid aminosav-szekvenciájában a megelőző aminosavat tartalmazó, terminális nitrogénatomján és adott esetben oldalláncban lévő funkciós csoportján védett, karboxilcsoport ján aktivált peptid-fragmenssel újra acilezzük, amelynek eredményeként terminális nitrogénatomján védett újabb intermedier peptidet kapunk, és az N-terminális • ·

-11védőcsoport eltávolításából és acilezésből álló ciklust addig folytatjuk, míg a kívánt aminosav-szekvenciájú peptidet vagy annak sóját, komplexét, amidját vagy alkil-észterét megkapjuk, és az így kapott peptidből kívánt esetben eltávolítjuk a terminális nitrogénatom védőcsoportját és az adott esetben jelenlévő egyéb védőcsoporto(ka)t.

A találmány ezenkívül gyógyászati készítményekre is vonatkozik, amelyek a találmány szerinti peptidszármazékot glaukoma kezelésére hatásos mennyiségben tartalmazzák, valamely gyógyászatilag elfogadható hígítóanyaggal vagy egyéb segédanyaggal együtt.

A találmány ezenkívül glaukoma és intraokuláris hipertenzió kezelésére alkalmas eljárásra is vonatkozik, oly módon, hogy a kezelendő emlősnek glaukomaellenes vagy intraokuláris nyomást csökkentő mennyiségben adagoljuk a találmány szerinti peptidszármazékot.

A találmány szerinti peptidszármazékokat előnyösen helyileg alkalmazható vizes, izotóniás és steril oldatok vagy olajos steril oldatok vagy diszperziók formájában alkalmazzuk a szem helyi kezelésére. A szem kezelésére alkalmas olajként például steril ricinusolajat alkalmazhatunk. A fenti helyileg alkalmazandó oldatok vagy diszperziók 0,1 - 10 tömeg%, közelebbről 0,2-5 tömeg%, előnyösen 0,25 - 1 tömeg% mennyiségben tartalmaznak legalább egy találmány szerinti peptidszármazékot. A fenti oldatok szokásos adagja 1-5 csepp, amelyet a szem kötőhártyazsákjára adagolunk. Ezt az adagolást rendszerint 2-6 alkalommal végezzük naponta. [DAB-9 csepegtetőbői (a Deutsches Arzneibuch 9 szerinti cseppszámláló) adagolt

csepp körülbelül 1 ml-nek felel meg].

A glaukoma kezelésére különösen hatásosan alkalmazható

peptid az (1-1) képlettel jellemezhető, a fenti képletben

H	jelentése szabad N-terminális aminocsoport,
Asn	jelentése aszparagin-maradék,
Gly	jelentése glicin-maradék,
Val	jelentése valin-maradék,
Cys	jelentése cisztein-maradék,
Acm	jelentése acetamido-metil-csoport, és
-nh₂	jelentése C-terminális karboxamidocsoport. Ezt az új peptidet és ezzel szerkezetileg rokon

hatásos származékokat az 1. igénypontban ismertetjük. Aminosav alatt nemcsak a 20 természetes aminosavat értjük, hanem a szakirodalomból ismert aminosav-cseréket és aminosav-szubszti tuciókat is.

Peptid alatt értjük a peptidkötés-cseréket és/vagy peptid mimetikumokat, azaz pszeudopeptideket is, amelyek szintén a szakirodalomból ismertek (lásd például Proceedings of the 20th European Peptide Symposium, szerkesztő: G. Jung, E. Bayer, 289-303. oldal, és az abban hivatkozott irodalmakat), valamint a sókat és gyógyászati preparátumokat és/vagy készítményeket is, amelyek a biológiailag aktiv peptide(ke)t különösen alkalmassá teszik helyi alkalmazásra, például cseppként vagy orális alkalmazásra. A fenti sók, készítmények, aminosav-cserék és pszeudopeptid szerkezetek a stabilitás növelése, a formálás, az adagolhatóság vagy az előállítás gazdaságosságának javítása céljából válhatnak szükségessé, és ezek olyan mértékben elfogadhatók, amennyiben nem befolyásolják negatívan a « · · · peptid biológiai aktivitását, azaz megnövekedett intraokuláris nyomás és glaukoma kezelésére alkalmas hipotenziv szerként! alkalmazását.

A szubsztitúcióktól eltekintve három különleges formája lehet a peptid mimetikus és/vagy analóg szerkezeteknek, amelyek különösen jelentősek akkor, amikor olyan biológiailag aktiv peptideket tervezünk, amelyek receptorhoz kötődnek, miközben ki vannak téve a vérben vagy bárhol máshol a proteinázok és peptidázok általi lebontásnak, ezek az alábbiak:

1) a szénváz királis centrumainak D-aminosav-maradék szerkezetekhez vezető inverziója, különösen az N-terminális végen - fokozott stabilitást eredményez a proteolitikus lebontással szemben - miközben az aktivitás nem romlik [lásd például Smith C.S. és munkatársai: Tritriated D-ala^-Peptide

T Binding, Drug Development Rés. 15, 371-379 (1988)].

2) A stabilitást és néha a receptorhoz kötődést is növelhetjük gyűrűs analógok előállításával [lásd például Goldstein G. és munkatársai: Conformationally restricted thymopentin-like compounds, 4 547 489 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás (1985)].

3) A peptidkötés helyettesítésére ketometilén, metil-szulfid vagy retroinverz kötéseket bevezetve, azaz a -C0- és -NH-maradékokat felcserélve mind a stabilitásban, mind a hatékonyságban óriási növekedést érhetünk el [az utóbbi típusra lásd például Sisto A. és munkatársai: Biologically active retroinverso analogues of thymopentin, in Peptides, Chemistry, Structures and Biology, szerkesztő: Rivier J. E. és Marshall G.R., Escom, Leiden, 722-773 oldal (1990)].

• <*

A találmány szerinti peptideket különféle, szakirodalomból ismert eljárásokkal állíthatjuk elő, például kémiai kapcsolási eljárásokkal [lásd például Wunsch E.: Methoden dér organischen Chemie, 15. kötet, 1+2 rész, Synthese von Peptiden, Thieme Verlag, Stuttgart (1974), és Barrany G., Merrifield R.B.: The Peptides, szerkesztő: E. Gross, J. Meienhofer, 2. kötet, 1. fejezet, 1-284. oldal, Academic Press (1980)], vagy enzimatikus kapcsolási eljárásokkal [például Widmer F., Johansen J.T., Carlsberg Rés. Commun. , 44., 37-46 (1979); Kullmann W.: Enzymatic Peptide Synthesis, CRC Press Inc. Boca Raton, Florida (1987), és Widmer, F., Johansen, J.T.: Synthetic Peptides in Biology and Medicine, szerkesztő: Alitalo K., Partanen P., Vatieri A., 79-86. oldal, Elsevier, Amsterdam (1985)], vagy kémiai és enzimatikus eljárások kombinálásával, ha ez a találmány szerinti eljárás kivitelezése és gazdaságossága szempontjából kedvező.

A találmány szerinti peptideket a fenti általános szintetikus eljárásokkal, vagy ezek előnyös kombinációival állíthatjuk elő.

A találmány szerinti peptideket glaukoma kezelésére alkalmazhatjuk gyógyászati preparátumokban, adott esetben gyógyászatilag elfogadható hordozóanyagokkal és adagoló rendszerekkel és/vagy egyéb megfelelő gyógyászatilag elfogadható segédanyagokkal kombinálva.

Állatkísérletekben, amikoris nyulak szemének intraokuláris nyomását kísérletesen a normális szint fölé emeltük, kimutattuk, hogy a találmány szerinti glaukomaellenes pentapeptid és annak bizonyos származékai 0,1, 0,5 és 1,0 % kon • · ·

-15centrációban azonos vagy jobb intraokuláris nyomást csökkentő hatást mutattak, mint a glaukoma kezelésére szokásosan használt β-blokkoló timolol (összhasonlítható koncentrációban), amely azonban β-blokkoló lévén súlyos mellékhatásokat fejt ki a szívre, tüdőre és a szexuális funkciókra.

Feltételezzük, hogy a találmány szerinti peptidek alkalmazásakor a fenti mellékhatások nagy része elkerülhető. Egy találmány szerinti pentapeptidet, az AsnLeuGlyValCys(Acm)NH₂~t alaposan meg is vizsgáltunk a mellékhatások, különösen a vérnyomáscsökkentő hatás, toxicitás és mutagenicitás szempontjából, valamint helyi izgató vagy érzéstelenítő hatás szempontjából különféle állat- és mikroba-modellekben.

Egerek és patkányok még 40 mg/kg intravénás dózisban is könnyen tolerálták ezt a vegyületet, nem befolyásolta a vérnyomást, például 10 mg/kg dózisban patkányok esetében, ami azt jelenti, hogy nincs β-blokkoló hatása még néhány nagyságrenddel magasabb dózisban sem, mint a várható lokális terápiás dózisok. Nem találtunk toxikus vagy káros hatásokat hasonló dózisokban szubkután adagolás esetén sem patkányokban, még akkor sem, ha a kezelést egy hónapon keresztül végeztük. Salmonella törzseken végzett Ames teszt szerint a vegyület nem mutagén. Végül 5%-os oldat formájában helyileg alkalmazva szemcseppként nyulak szemének kezelésére, sem érzéstelenítő hatást, sem irritáló hatásokat nem találtunk, még egy hónapon keresztül végzett kezelés során sem.

Az állatmodell, amelyen a glaukomaellenes peptidek intraokuláris nyomást csökkentő hatását először megállapítot-16-

tuk, egy klinikailag alkalmazható modell, amelyet saját laboratóriumunkban fejlesztettünk ki, és ezen a modellen számos ismert β-blokkoló (például timolol) és adrenerg agonista nyomáscsökkentő hatását is kimutattuk, ezáltal bizonyítottuk a modell klinikai alkalmazhatóságát ismerten és feltételezetten glaukomaellenes hatású hatóanyagok kimutatására.

A fenti klinikai modellnek jellemzője az, hogy nyulak szemének intraokuláris nyomását valamely stresszel indukálva emeljük a kiindulási és normális érték fölé. A stresszt azzal okozzuk, hogy mérjük a nyomást 12 órás időközökben egy SHIOTZ-Tonometer segítségével, amely 7,5 g-mal van terhelve. A nyomás először 5 mérés után kezd emelkedni, azaz 2,5 nap múlva, és a maximumot 10 mérés után, azaz 5 nap múlva éri el.

Az ismert glaukomaellenes szerek csökkentik az intraokuláris nyomást, amikor azokat a megnövekedett intraokuláris nyomás (I0P) kialakítása után alkalmazzuk, annak ellenére, hogy a trauma - azaz a nyomás mérése - a kezelés alatt is folytatódik.

Ha a glaukomaellenes szerekkel való kezelést a traumatizálással (azaz az állatkísérlet megkezdésekor a nyomás mérésével indukált stresszel) egyidőben kezdjük el, a glaukomaellenes hatású szerek antagonizálják az intraokuláris nyomás kiindulási és normális érték fölé való növekedését, ugyanakkor az inaktív vegyületek nem antagonizálják azt, és így kialakul a nyomásnövekedés. A fenti modell alkalmazhatóságát számos kísérletben bizonyítottuk klinikailag alkalmazott glaukomaellenes szerekkel.

A fenti módszer részletes leírása Steinbach T., • ♦« ·

-17disszertációjában található (Universitats-Augenklinik Hamburg-Eppendorf, 1986: Adrenergica und neue Peptide bei Augeninnendruck: Beziehung zum Prostaglandin im Kammerwasser von Kaninchen). A találmány szerinti glaukomaellenes pentapeptid és annak aktív származékai hatékonyságát szintén bizonyítottuk a fenti modellkísérletben, és ezt a példákban le is írjuk. A találmány szerinti peptid vegyületek fenti hatásuk következtében várhatóan alkalmasak a glaukoma kezelésére.

A fenti doktori értekezésben ismertetett peptidek nem olyan jól definiált kémiai vegyületek, mint a találmány szerinti peptidszármazékok, hanem tej-proteinek hidrolízisével kapott elegyek. Ezeket a peptideket és különféle aktivitásukat, például glaukomaellenes aktivitásukat a 210204 számú európai szabadalmi leírásban ismertetik.

Az intraokuláris nyomást csökkentő hatásra vonatkozó, stresszel indukált nyúl modellben kapott eredményeket megerősítettük és tovább tanulmányoztuk egy másik, megnövekedett szemnyomás tanulmányozására alkalmas nyúl modellben. Ebben a modellkísérletben, a széles körben alkalmazott vízterheléses modellben az intraokuláris nyomás növekedését úgy érjük el, hogy a nyúlba intraperitoneálisan nagy térfogatú steril vizet injektálunk. Az egyik szemet a szemcseppel kezeljük, míg a másik szemet sóoldatos placeboval, majd mind a két szemben mérjük az intraokuláris nyomást különböző időközökben, és a gyógyászati hatás kifejezésére a két szem közötti nyomáskülönbséget alkalmazzuk. Ebben a kísérletben pozitív kontrollként egy ismerten nyomáscsökkentő hatású kolinerg szert, a pilokarpint használjuk.

-18A találmány szerinti peptidszármazékok előnye, hogy meghatározott kémiai szerkezettel rendelkeznek, amely lehetővé teszi azonosításukat, és amennyiben kívánatos, logikus és szisztematikus szerkezeti módosításukat olyan analógok előállítására, amelyek még jobb tulajdonságokkal rendelkeznek, mint a találmány szerinti vegyületek.

Ezenkívül a találmány szerinti peptidek kis mőltömegűek (< 600), és így helyileg alkalmazhatók, szemben az ismert szívpitvari nátriuretikus faktorral [Fortschritte dér Ophthalmologie, 86, 89-91 (1989)], amelynek moltömege körülbelül 3000, ezért glaukomaellenes hatás elérésére injektálással kell alkalmazni. Frissen kimetszett nyúltvelői kötőhártyát és elülső szemfehérjét alkalmazva in vitro vizsgálatokban valóban sikerült kimutatni néhány találmány szerinti pentapeptid penetrációját lucit-tömb Ussing kamrában felerősített, levegőztetett glutation-hidrogén-karbonát Ringer-oldatban szuszpendált szövetmintákon keresztül. Ezek szerint az AsnGlyGlyValCys(Acm)NH₂ mindként szövetfajtán áthatol, és az AsnLeuGlyValCys(Acm)NH₂ a szemfehérje szöveten hatol át.

Ezenkívül, a szívpitvari nátriuretikus faktor kardiovaszkuláris hormon, ezért nem alkalmas arra, hogy glaukoma kezelésére hosszabb időn keresztül alkalmazzák. Végül mind a peptidszeru protein-hidrolizátum elegyek (amelyek nem szükségszerűen csak peptidek kémiai szerkezetüket tekintve), mind a szívpitvari nátriuretikus faktor olyan méretűek, amelyek immunválaszt indukálnak, amelyet antitestek termelése követ. Válószínűtlen, hogy ilyen válasz a találmány szerinti glaukomaellenes pentapeptidek és azok aktív szár mazexai aiKaimazasanax eseten megjeieniK. Eziaaig vaionan nem lehetett detektálni ilyen antitesteket ELISA-vizsgálatban, AsnLeuGlyValCys(Acm)NH₂ nagy dózisaival egy hónapon keresztül szubkután kezelt patkányokból származó szérum-mintákban.

A találmány szerinti peptidek hatásmechanizmusa ezidáig részleteiben nem ismert, és lehetséges, hogy ezidáig nem ismert típusú hatásmechanizmusa van, vagy bizonyos ismert mechanizmusokhoz hasonló módon hat. A B-blokkoló hatások nyilvánvaló hiánya esetén egyéb ismert mechanizmusok a karbo-anhidráz enzimre vagy a csarnokvíz kifolyásra fejtenek ki hatást. Az utóbbi típusú mechanizmusra utal néhány in vitro vizsgálat eredménye. így in vitro vizsgálatban bizonyítottuk, hogy az AsnGlyGlyValCys(Acm)NH₂ jelentősen és határozottan csökkenti a glükozaminok felvételét marha trabekuláris hálózati sejtek tenyészetében. A peptiddel hasonló módon inkubált sejttenyészetek normálisan növekedtek, és ultrastruktúrájuk is hasonló volt, és nem észleltünk változást a kollagén és fibronektin szintézisében. A glükózamin felvétel jelentős csökkenéséből és ugyanakkor a glikoproteinek, mint például a fibronektin, normális szintéziséből a glükózamino-glikánok képződésének befolyásolására lehet következtetni, amely a csarnokvíz szemből való kifolyása szabályozásának fontos paramétere.

A találmányt közelebbről az alábbi példákkal kívánjuk megvilágítani.

Glaukomaellenes pentapeptidek szintézise

A leírásban az aminosavakra és védőcsoportokra alkalmazott rövidítések a IUPAC-IUB standard nevezéktan! szabályaival összhangban vannak. Ezenkívül az alábbi rövidítéseket al-20-

kalmazzuk:

HOSU	N-hidroxi-szukcinimid,
-OSU	N-hidroxi-szukcinimid-észter,
DCC	diciklohexil-karbodiimid,
CPD-Y	karboxipeptidáz-Y,
Boc	terc-butoxi-karbonil-csoport,
OBzl	benzil-észter,
Acm	acetamido-metil-csoport (CH3CONHCH2-)
pTos	p-toluolszulfonát,
DMF	dimetil-formamid,
DCU	diciklohexil-karbamid,
HAC	ecetsav

HCOOH hangyasav.

1. példa

HAc·H-AsnGlyGlyValCys(Acm)-NH₂ előállítása

A szintézis reakcióvázlata az 1. ábrán látható.

BocAsnGlyOBzl g (0,25 mól) BocAsnOH-t és 29 g HOSu-t 250 ml DMFban oldunk és az oldatot -20 °C-ra hűtjük. Hozzáadunk 52 g

DCC-ot 250 ml DMF-ban oldva. A reakcióelegyet szobahőmérsék leten 4 órán keresztül keverjük, majd hozzáadunk 85 g

GlyOBzl.pTos-ot és 35 ml TEA-t. Az elegyet 1 éjszakán keresztül keverjük, majd a DCU-ot leszűrjük, a DMF-ot Rotavappal vákuumban eltávolítjuk, és a kapott olajat EtAc-ban oldjuk.

Telített nátrium-klorid-oldattal, telített nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal és 10%-os citromsavoldattal végzett extra hálás után az oldatot vízmentes nátrium-szulfáttal szárítjuk, és bepároljuk. A kapott kristályos anyagot exszikkátorban szá-21rítjuk. Hozam: 64 g (67%).

BocGlyValOBzl g (0,25 mól) BocGlyOH-t és 29 g HOSu-t 250 ml DMF-ban oldunk. Az oldatot -20 °C-ra hűtjük, majd hozzáadunk 52 g DCC-ot 250 ml DMF-ban oldva. A reakcióelegyet szobahőmérsékleten 4 órán keresztül keverjük, majd hozzáadunk 95 g ValOBzl.pTos-ot, és 35 ml TEA-t. A reakcióelegyet 1 éjszakán keresztül szobahőmérsékleten keverjük, majd a DCU-ot leszűrjük, a DMF-ot eltávolítjuk, a kapott olajat EtAc-ban felvesszük, és telített nátrium-klorid-oldattal, telített nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal, majd 10%-os citromsav-oldattal mossuk. Az EtAc-os fázist vízmentesen nátrium-szulfát felett szárítjuk, és a kapott kristályos anyagot exszikkátorban szárítjuk. Hozam: 59 g (65%).

BocAsnGlyGlyValOBzl g fenti lépésben kapott BocAsnGlyOBzl-t 500 ml MeOH-ban oldunk, és 20 órán keresztül 5 g 10% fémet tartalmazó szénhordozós palládiumkatalizátorral hidrogénezzük. A katalizátort leszűrjük, és az oldószert eltávolítjuk. A kapott BocAsnGlyOH-t 200 ml DMF-ban oldjuk, -20 °C-ra hűtjük, majd 20 g HoSu-val és 35 g DCC-del 2 órán keresztül aktiváljuk. 59 g BocGlyValOBzl-ből a Boc védőcsoportot HCl-EtAc kezeléssel eltávolítjuk, a HCl-EtAc-ot elpárologtatjuk, a kapott olajat 100 ml DMF-ban felvesszük, és 24 ml TEA-nal semlegesítjük. Ezt azután hozzáadjuk az előaktivált BocAsnGlyOSu-hoz. Az elegyet 1 éjszakán keresztül keverjük, a DCU-ot leszűrjük, és a DMF-ot bepárlássál eltávolítjuk. A maradékot EtAc-ban felvesszük, telített nátrium-klorid-oldattal, telített nátrium-22-hidrogén-karbonát-oldattal és 10%-os citromsavoldattal mossuk. Az EtAc-os fázist vízmentes magnézium-szulfát felett szárítjuk, majd elpárologtatjuk. A kapott port exszikkátorban szárítjuk. Hozam: 60 g (70%).

HAc·H-AsnGlyGlyValCys(Acm)-NH₂ g BocAsnGlyGlyValOBzl-t HCl-EtAc-DMF-ban oldunk. 5 óra elteltével az oldószert elpárologtatjuk. A maradékot éterrel kezeljük, és a kapott kristályokat szűréssel összegyűjtjük, majd exszikkátorban szárítjuk. Hozam: 10 g (95%).

g fenti módon kapott HC1Ή-AsnGlyGlyValOBzl-t 20 ml DME-ben oldunk. A kapott oldatot részletekben hozzáadjuk 12,1 g Cys(Acm)NH2 150 ml 0,1 mol/liter KCl-t, 1 mmol/liter EDTA-t és 35 Mmol/liter CPD-Y-t tartalmazó oldattal (pH 8,0) készült oldatához. A reakció lejátszódása alatt 0,5 mol/liter nátrium-hidroxid hozzáadásával a pH-t állandó értéken tartjuk. 5 óra múlva, amikor a HPLC vizsgálat szerint a reakció befejeződött, a reakciót leállítjuk oly módon, hogy HCOOH-val a pH-t 3-ra állítjuk. A reakcióelegyet 2 Prep 500 (Waters) fordított fázisú oszlopon kromatografáljuk, 50 mmol/liter koncentrációjú CHgCOOH-t használva kiindulási pufferként és EtOH-t szerves eluensként. A kívánt terméket tartalmazó frakciókat bepárlássál koncentráljuk, és végül fagyasztva szárítjuk. Hozam: 5,62 g (70%).

Analízis: Összegképlet: C^gHgsNgOySCl Móltömeg: 555,057

Móltömeg (szabad bázis): 518,56

FAB-MS: 519: M⁺ = [H-AsnGlyGlyValCys(Acm)NH₂]⁺

-23448: M⁺.-Acm = [H-AsnGlyGlyValCysNH2]⁺ (Acm = 71)

Aminosavanalízis:

a) 6 n HC1: Asp (0,9), Gly (2,0), Val (1,0), Cys elbomlik,

b) amino-peptidáz M: Asn (0,9), Gly (2,0), Val (1,1), Cys(Acm) (1,1)·

A HPLC-analízis eredmények (2 Waters 600A szivattyú, Waters

480 detektor, Waters 660 oldószerprogramm, Waters UK 6 injektor és Hewlett-Packard 3390A kiíró/integrátor) szerint a minta legalább 95% tisztaságú az alábbi körülmények között vizsgál va :

minta:

μΐ, tömény, körülbelül 4 mg/ml oszlop:

8C18 10 Mm

A-puffer:

TEAP pH 3

B-puffér:

80% CH₃CN, 20% TEAP eluciós programm: 2% B 50% B 20 perc alatt, lineáris grádiens alkalmazásával hőmérséklet: 20-25 °C nyomás: körülbelül 6,897·10⁶ Pa átfolyási sebesség: 2 ml/perc papír-sebesség: 0,5 cm/perc hullámhossz: 230 nm

AUFS: 0,2 gyengítés: 3

2. példa

H-AsnLeuGlyValCys(Acm)NH₂ előállítása

A cím szerinti vegyületet az 1. példában leírtak szerint eljárva állítjuk elő, és azonos módon analizáljuk.

A termék HPLC analízise azt mutatja, hogy a termék

-2495%-nál nagyobb tisztaságú.

Aminosavanalízis:

Asp (1,00)*, Leu (0,95), Gly (0,05), Val (0,85), Cys (0,65)** * az Asn Asp-vá hidrolizálódik a minta savas hidrolízise során ** a Cys részlegesen lebomlik a minta savas hidrolízise folyamán.

3. példa

HAc·H-AsnAlaGlyValCys(Acm)NH₂ előállítása

A cím szerinti vegyületet az 1. példában leírtak szerint állítjuk elő, és azonos módon analizáljuk.

HPLC-analízis szerint a termék 95%-nál nagyobb tisztaságú.

Aminosavanalízis:

Asp (1,10)*, Alá (1,00), Gly (0,95), Val (0,90), Cys (0,70)** * az Asn Asp-vé hidrolizálódik a minta savas hidrolízise során ** a Cys részlegesen lebomlik a minta savas hidrolízise folyamán.

4. példa

HAc·H-AsnLeuGlyValCys(Acm)NH₂ előállítása

A szintézis teljes menete a 2. ábrán látható.

BocValCys(Acm)NH₂

77,6 g (405 mmol) szabad bázis formában lévő

Cys(Acm)NH₂-t 1350 ml DMF-ban oldunk, és az oldatot 4-5 °C-ra lehűtjük. Hozzáadunk 85,0 g (270 mmol) BocValONSu-t, és a reakcióelegyet 4-5 °C-on 1 napon keresztül, majd szobahőmér

-25seKieren i napon Keresztül Keverjux. a reaxcioeiegy szuresevei és az 1. példában leírtak szerint végzett preparativ RP-HPLC kromatográfiás tisztításával tiszta terméket tartalmazó frakciókat kapunk, amelyeket szárazra párolva kapjuk a terméket. Hozam: 66,4 g (63%).

TFA·H-ValCys(Acm)NH₂

47,3 g (121,1 mmól) BocValCys(Acm)NH₂-t 120 ml TFAban oldunk. Az oldathoz keverés közben 450 ml dietil-étert adva a termék 15 perc múlva kicsapódik. A reakcióelegyet 2 órán keresztül keverve homogénebb terméket kapunk. Szűrés, és 40 °C-on 1 napon keresztül vákuumban szárítás után szilárd terméket kapunk. Hozam: 65,0 g (99%).

BocLeuGlyOBz1

102,2 g (442 mmol) BocLeuOH-t, 98,1 g (485 mmol) GlyOBzl’HCl-t és 55,9 g (478 mmol) HONSu-t 760 ml diklór-metánban oldunk, és hozzáadunk 54 ml N-metil-morfolint. Az oldatot 4 °C-ra hűtjük, és hozzáadjuk 100,1 g (485 mmol) DCC 190 ml diklór-metánnal készült, 4 °C-ra hűtött oldatához. A reakcióelegyet 1 napon keresztül 4 °C-on keverjük. Az elegyet ezután szűrjük, és a szerves fázist 500 ml 0,1 mol/liter koncentrációjú ecetsavval egyszer, majd 1000 ml telített nátrium-klorid-oldattal kétszer extraháljuk. A szerves fázist vízmentes magnézium-szulfát felett szárítjuk, és az oldószert vákuumban 40 °C-on elpárologtatjuk. 192,6 g nyers terméket kapunk olaj formájában.

HCl-H-LeuGlyOBzl

192,6 g fent kapott BocLeuGlyOBz1-t lassan 500 ml n etil-acetátos HCl-ban oldunk keverés közben. A reakció a

-26teljes oldódás után (körülbelül 30 perc) befejeződik. A hidrogén-kloridot tartalmazó szerves fázist vákuumban 40 °C-on szárazra pároljuk. 300 ml etil-acetát kétszeri hozzáadásával, és szárazra párlássál olaj formában kapjuk a nyersterméket. Hozam: 163,5 g.

BocAsnLeuGlyOH

71,8 g (309 mmol) BocAsnOH, 163,5 g (körülbelül

309 mmol) HCl-H-LeuGlyOBzl, 41,8 g (309 mmol) HOBt és 34,0 ml (309 mmol) NMM 250 ml ............készült oldatát °C-ra hűtjük keverés közben. A fenti oldathoz hozzáadjuk 63,8 g (309 mmol) DCC 80 ml DMF-dal készült, 2 °C-ra hűtött oldatát. Az így kapott oldatot lassan szobahőmérsékletre melegítjük, és 1 napon keresztül keverjük. A nyers reakcióelegyből szűréssel eltávolítjuk a DCU-ot, és keverés közben mól/liter koncentrációjú nátrium-hidrogén-karbonát-oldatba öntjük, ily módon a termék kismennyiségű HOBt-vel együtt csapadék formájában kiválik.

A nyersterméket kétszer 1,5 liter 1 mól/liter koncentrációjú nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal tovább mosva és szűrve tisztított terméket kapunk. A nyers BocAsnLeuGlyOBzl-t 2,0 liter 50%-os etanolban szuszpendáljuk. Hozzáadunk 10 g 10% fémet tartalmazó szénhordozós palládiumkatalizátort, és 3'10^ Pa hidrogéngáz-nyomáson keverés közben 1 órán keresztül hidrogénezünk. A reakcióelegyet szűrjük, és a pH-t 1 n hidrogén-klorid-oldattal 3-ra állítjuk. Az etanolt vákuumban 40 °C-on eltávolítjuk, a kristályos formában kapott terméket szűrjük, és vákuumban 40 °C-on 2 napon keresztül szárítjuk. 72,3 g (58%) tiszta terméket kapunk.

• · · ·

-27HAc·H-AsnLeuGlyValCys(Acm)NH₂

61,0 g (151,6 mmol) BocAsnLeuGlyOH és 19,2 g (165,3 mmol) HONSu 500 ml DMF-val készült oldatát -10 °C-ra hűtjük. Hozzáadjuk 34,12 g (165,3 mmol) DCC 170 ml DMF-dal készült, -10 ’C-ra hűtött oldatát, és a reakcióelegyet 1 napon keresztül 4-5 °C-on keverjük. A nyers reakcióelegyből szűréssel eltávolítjuk a DCU-ot és hozzáadjuk 63,8 g (165,1 mmol) TFA-H-Val-Cys(Acm)-NH₂ és 18,2 ml (165,1 mmól) NMM 200 ml.........készült oldatát. A reakcióelegyet szobahőmérsékleten 1 órán keresztül tovább keverjük. Az oldószert vákuumban 40 °C-on eltávolítva kapjuk a BocAsnLeuGlyValCys(Acm)NH₂ nyersterméket, a hozam 150,0 g.

A nyersterméket 400 ml HCOOH-ban oldjuk és 1 napon keresztül szobahőmérsékleten keverjük. Az oldószert és reagenst vákuumban 40 ’C-on eltávolítjuk. A maradékot 3,0 liter 50%-os etanolban (pH körülbelül 3,0) oldjuk, és DOWEX AG 50 X 4 (H⁺-alak) kationcserélőn kromatografáljuk. A termék eluálását 1 n NH₄Ac/50% EtOH oldattal végezzük. A terméket tartalmazó frakciókat 400 ml-re koncentráljuk, és RP-HPLC kromatográfiás eljárással tisztítjuk az 1. példában leírtakkal analóg módon. A tiszta terméket tartalmazó frakciókat 400 ml-re koncentráljuk, 0,22 μιπ-es szűrőn sterilre szűrjük, és 2 napon keresztül fagyasztva szárítjuk. Hozam: 27,0 g (33%) .

Analízis:

víztartalom Kari Fisher titrálással: 2,6% acetát-tartalom GC-val: 7,6%

maradék oldószerek:

Aminosavanalízis: szabad aminosavak: Asp:

Gly:

Val:

Cys:

Leu:

DMF < 0,05% etanol < 0,1% < 0,2 tömeg%

1,0

1,0 azonosítva

1,0 tisztaság HPLC-vel (220 nm) : 98,9%.

5. példa

HAc·H-AsnValCys(Acm)NH₂ előállítása

A szintézis teljes sémája a 3. ábrán látható.

BocAsnValCys(Acm)NH₂

2,32 g (10 mmol) BocAsnOH, 4,45 g (11 mmol) 4. példa szerint előállított TFA’ValCys(Acm)-NH₂ és 1,21 ml (11 mmol) NMM 20 ml DMF-dal készült oldatát 2 °C-ra hűtjük. Hozzáadjuk 2,17 g DCC 5 ml DMF-dal készült jéghideg oldatát. Az így kapott oldatot 1 napon keresztül 4-5 °C-on keverjük. A reakcióelegyet szűrjük, és 500 ml 50%-os etanollal hígítjuk. A HOBt-t anioncserélő DOWEX anion AG 1-X4 gélen (Ac“-forma) eltávolítjuk. A terméket tartalmazó frakciókat szárazra pároljuk, és 200 ml H₂0-ben újra feloldjuk. A nyers oldatot RP-HPLC kromatográfiás eljárással tisztítjuk, az 1. példában leírtak szerint. A tiszta terméket tartalmazó frakciókat 40 °C-on vá kuumban szárazra pároljuk. Hozam: 3,15 g (69%).

• · ·

-29HAc·H-AsnValCys(Acm)NH₂

3,15 g (6,2 mmol) BocAsnValCys(Acm)NH₂-t 15 ml

TFA-ban oldunk. A reakció a teljes oldódás után (körülbelül 10 perc) befejeződik. A terméket 350 ml dietil-éter hozzáadásával kicsapjuk, szűrjük, és vákuumban 40 °C-on szárítjuk. Hozam: 2,2 g (76%).

A terméket 1000 ml 50%-os etanolban (pH körülbelül 5,0) újra feloldjuk. DOWEX AG 50 x 4 (H⁺-forma) kationcserélő oszlopon kromatografáljuk. A terméket 0,5 n NH₃/50% etanollal eluáljuk. A tiszta terméket tartalmazó frakciókat 40 °C-on vákuumban szárazra pároljuk. A maradékhoz 1 ekvivalens HOAc-ot adunk, és 1 napon keresztül fagyasztva szárítjuk. 2,2 g (76%) tiszta, cím szerinti terméket kapunk.

Analízis:

HPLC módszerrel meghatározott tisztaság (220 nm): > 95%

Farmakológiai példák

Terápiás aktivitás: intraokuláris nyomás szabályozása nyúlszem modellben

A glaukomaellenes pentapeptid csökkenti a kísérletesen megnövelt intraokuláris nyomást, nyúl állatkísérleti modellben, vagy antagonizálja, azaz megakadályozza a nyomás növekedését, hogyha azt a nyomásnövekedést kiváltó kezeléssel együtt alkalmazzuk.

A kísérletekben csoportonként 3-10, véletlenszerűen választott korú és nemű 2,5 - 3,0 kg-os felnőtt nyulat használunk. A fagyasztva szárított por formájú peptidet a nyúl szemébe, mint port vagy mint cseppet alkalmazzuk, 0,9 %-os nátrium-klorid-oldatban oldva. Pozitív kontrollként kereske-30-

delmi forgalomban kapható glaukomaellenes szereket - timololt vagy pilokarpint - alkalmazunk, és negatív kontrollként 0,9 %-os vizes nátrium-klorid-oldatot.

Gyógyászati hatás vizsgálata stressz-indukálta modellben

6. példa

HAC’HAsnGlyGlyValCys(Acm)NH₂ glaukomaellenes pentapeptid hatása stressz által indukált okuláris hipertenzióra nyulakon

Összesen 60 mg peptidet alkalmazunk por formájában, négyszer naponta, 4 napon keresztül, azaz összesen 16 kezelés alkalmával. A peptid kezelésenként! mennyisége így 3,75 mg, amely moláris alapon a kezelésenként alkalmazott timolol menynyiségének felel meg.

A helyi kezelést a glaukoma indukálása (azaz 10 stressz-egység után) kezdjük el, és a stresszt - vagyis a traumát - a peptiddel való kezelés folyamán fenntartjuk. Az intraokuláris nyomást mmHg-ben mérjük.

• ·

	Kezdeti nyomás (stresszhatás nélkül)	Nyomás 5 napos stresszelés után (kezelés beindításakor)	Nyomás 10 napos stresszelés után (5 napos kezelés)	IOP változása	IOP-t csökkentő hatékonyság timololhoz viszonyítva
0,5%-os peptid	19,0	32,0	16,5	-15,5	150%
0,25%-os timolol	19,0	30,0	19,5	-10,5	100%
0,9%-os sóoldat	18,0	29,0	32,0	+14,0

7. példa

Glaukomaellenes peptid antagonizáló hatása stresszel indukált intraokuláris nyomásra nyúlszemben mg peptidet 0,6 ml 0,9%-os vizes nátrium-klorid-oldatban oldunk, és 60 μΐ-es alikvotokat alkalmazunk naponta 4 alkalommal 2,5 napon keresztül.

A kezelést a kísérlet megkezdésekor a stresszeléssel egyidejűleg kezdjük el. 5 stressz-egységet alkalmazunk 12 órás interva1lumokban.

*·· ·

IOP változása (mmHg) 2,5 nap után

Abszolút kontrolihoz viszonyítva

0,9%-os sóoldat	+4,5	-
peptid	-4,7	-9,2

Ebben a kísérletben nem alkalmaztunk pozitív kontrollt timolollal.

8» példa

Glaukomaellenes peptid dózisfüggő hatása stresszel indukált okuláris hipertenzióra nyülszemben

A peptid 0,9%-ós nátrium-kloriddal készült 1%-os és

0,1%-os oldatát alkalmazzuk négyszer (2 csepp alkalmanként) 5 napon keresztül egy kezdeti 5 napos stresszel való indukálási periódus után (stressz-egységek 12 órás időközönként). Az intraokuláris nyomást mmHg-ben mérjük.

	Kiindulási nyomás	• Nyomás 5 nap múlva	Nyomás 10 nap múlva (5 nap kezelés)
0,9%-os
sóoldat	18	29	32
1% peptid	21	32	18

0,1% peptid 18

15,5 * ·· ·

-339. példa

Glaukomaellenes peptid és két analógja antagonizáló hatása kísérletesen hipertenzíwé tett nyúlszemre

A stressz-egységeket 12 órás időközökben alkalmazzuk

5,5 napon keresztül, azaz összesen 11 alkalommal végezzük a stresszelést. A peptideket naponta háromszor adagoljuk ez alatt az időszak alatt, 0,9%-os vizes nátrium-klorid-oldattal készített 0,5%-os oldatból, cseppek formájában.

A nyomást mmHg-ben mérjük.

	Kiindulási nvomás	Nyomás 5,5 nap után	Nyomásváltozás
0,9%-os
sóoldat	14	25	+11
Timolol	15	16	+ 1

H-AsnGlyGlyValCys(Acm)NH₂ 14 14 0

H-AsnLeuGlyValCys(Acm)NH₂ 15 16 + 1

10. példa

Glaukomaellenes peptid egy tetra-, illetve két tripeptid analógjának antagonizáló hatása kísérletesen hipertenzíwé tett nyúlszemre

A stessz-egységeket 12 órás időközönként 5,5 napon kereksztül alkalmazzuk, azaz összesen 11 alkalommal végezzük a ·< ···· • . - *·· ··· · .. .:. ·..· ·,.♦

-34stresszelést. A peptideket naponta három alkalommal adagoljuk O.Q^-oc nátrium-klor-id—oldattal kácziilt. l.OSr — űc oldatból cseppek formájában.

A tetra- és a tripeptidek oldatainak stresszel indukált intraokuláris nyomásnövekedést antagonizáló képességét nyomás mérésével bizonyítottuk, amelynek eredményeként megállapíthattuk, hogy jelentősen csökkent a nyomásnövekedés mind a három kezelés esetén a 0,9%-os sóoldattal végzett kezeléshez képest.

így mind a három rövidebb analóg, azaz az AsnValCys(Acm) NH₂-vel, AcGlyValCys(Acm)NH₂-vel és AsnLeuGlycys(Acm)NH₂-vel végzett kezelés esetében a nyomás növekedése kisebb volt, mint a negatív kontroll sóoldatok esetében mért nyomásnövekedés 70%-a.

Gyógyászati hatás vizsgálata vízterheléses modellben nyulak szemében

A vizsgálatokban a vízterheléses állatkísérleti modellt alkalmazzuk.

A gyógyszeroldat beadagolása előtt 30 perccel a nyulaknak intraperitoneálisan 60 ml/kg dózistérfogatban steril, injekció készítésére alkalmas desztillált vizet (30 °C) injektálunk kevés antibiotikum eleggyel (Sigma P9032) együtt. A 0 időpontban 50 μΐ gyógyszeroldatot csepegtetünk az egyik szembe, és azonos térfogatú sóoldatot csepegtetünk a másik szembe. Mindkét szemben mérjük az intraokuláris nyomást a megadott időpontokban. Az intraokuláris nyomás (IOP) változását az egyes időpontokban úgy számítjuk ki, hogy a kezelt szemben mért IOP-t levonjuk a kezeletlen szemben mért IOP-ből.

« «« • ** ♦ _ ·· ··» »»* *_Η* ·»_%*

-35Α fenti adatokból görbét szerkesztünk, amelyben az IOP-t az idő függvényében ábrázoljuk, a standard deviációval együtt n = 10 esetén. Ezekből a görbékből számítjuk ki a maximális IOP hatást, az ennek eléréséhez szükséges időt, és a zéró vagy elhanyagolható mértékű intraokuláris nyomáscsökkentő hatásra való visszatéréshez szükséges időt. Ezeket a számokat tekintjük a hatékonyság és a hatás időtartama mértékének. A különböző dózisszinteken mért teljes.gyógyászati hatás mértékének a görbe alatti területek (AUC) összegét tekintjük.

11. példa

Glaukomaellenes pentapeptidek hatása vízterheléssel indukált hipertenzióra nyúlszemben, egyetlen dózissal végzett kezelés esetén

Az egyik szembe egy 0,5%-os peptidoldatot vagy 2,6%-os pilokarpin-nitrátot (pozitív kontroll) csepegtetünk 0,9%-os vizes nátrium-klorid-oldatban, és negatív kontrollként a másik szembe 0,9%-os vizes nátrium-klorid-oldatot csepegtetünk, és mind a két szemben 3 órán keresztül mérjük az IOP-t.

Az intraokuláris nyomást mmHg-ben, és az időt percben adjuk meg.

» · · ·

Kezelés	Maximális válasz IOP	Idő a maximális válaszicr	Hatás időtartama
0,9%-os NaCl	0	0	0
2,6%-os pilokarpin-
-nitrát	-5,0	30	120

AsnGlyGlyValCys(Acm)-

NH₂	-5,0	30	120
AsnLeuGlyValCys(Acm)- nh₂	-5,5	30	120

12. példa

Glaukomaellenes pentapeptidek dózistól függő hatása vízterheléssel indukált hipertenzióra nyúlszemben, egyetlen dózissal végzett kezelés esetén

A peptideknek 0,9%-os vizes nátrium-klorid-oldattal készült 0,25%-os, 0,5%-os és 1,0%-os oldatát csepegtetjük az egyik szembe, és a másik szembe 0,9%-os nátrium-klorid-oldatot adagolunk, és mindkét szemben 3 órán keresztül mérjük az IOP-t.

Az intraokuláris nyomást mmHg-ben, az időt percben, és a görbe alatti területet (AUC) mmHg x percben adjuk meg.

Peptid	Koncentráció	Maximális válasz IOP	Idő a maximális válaszig	Hatás időtartama	AUC
AsnGlyGlyVal- Cys (Acm)NH₂	0,25%	-2,0	30	80	160
AsnGlyGlyVal- Cys (Acm)NH₂	0,5%	-5,0	30	120	360
AsnGlyGlyVal- Cys (Acm)NH₂	1,0%	-4,0	30	120	410
AsnLeuGlyVal- Cys (Acm) NH₂	0,25%	0	0	0	0
AsnLeuGlyVal- Cys (Acm)NH₂	0,5%	-5,5	30	120	400
AsnLeuGlyVal- Cys (Acm)NH₂	1,0%	-5,0	30	120	550

Claims

Szabadalmi igénypontok

1. (I) általános képletű peptidszármazékok és ezek N-C gyűrűs formái vagy diszulfid híddal összekötött, N-C gyűrűs vagy lineáris dimerjei, a fenti képletben

A jelentése hiányzik, vagy nem-hidrofob, töltés nélküli

D- vagy L-aminosavat vagy annak dezamino-származékát jelenti, amely az amid oldallánc hidrogénatomján adott esetben mono- vagy diszubsztituálva van egy egyenes vagy elágazó szénláncú vagy gyűrűs alkil-, aralkilvagy arilcsoporttal, amelyek bármelyike adott esetben halogénatommal, nitrocsoporttal, aminocsoporttal, szulfocsoporttal, foszfocsoporttal vagy karboxilcsoporttal lehet mono- vagy poliszubsztituálva, és mindegyik aralkil- vagy aril-szubsztituens ezenkívül alkilcsoporttal is szubsztituálva lehet,

B jelentése hiányzik, vagy töltés nélküli aminosavat, vagy töltés nélküli N-metilezett aminosavat jelent,

C jelentése töltés nélküli aminosav, vagy töltés nélküli N-metilezett aminosav,

D jelentése nem-hidrofil oldalláncú vagy oldallánc nélküli, töltés nélküli aminosav,

E jelentése cisztein vagy cisztein-homológ, amelynek merkaptocsoportja szabad állapotban van, vagy az alábbi szubsztituensek egyikével van szubsztituálva: -CR3R4NHCOCR5 általános képletű csoporttal, ahol R₃ és R₄ jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom vagy halogénatom, és

-39···« β · · · ♦ ···· • ·· · · « ·· · ····· r₅ jelentése egyenes vagy elágazó szénláncú vagy gyűrűs alkilesöpört, araikilesöpört vagy arilcsoport, amelyek bármelyike adott esetben halogénatommal, karboxilcsoporttal, szulfocsoporttal, foszfocsoporttal, aminocsoporttal vagy nitrocsoporttal lehet monovagy poliszubsztituálva, és az egyes aralkil- és aril-szubsztituensek alkilcsoporttal is szubsztituálva lehetnek,

-S-CR₆R7Rg általános képletű csoporttal, ahol

Rg, R7 és Rg jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom, halogénatom, egyenes vagy elágazó szénláncú vagy gyűrűs alkilcsoport, aralkilcsoport vagy arilcsoport, amelyek bármelyike adott esetben az R5 jelentésére megadott módon mono- vagy poliszubsztituálva lehet, vagy

-CRgRxgRxi általános képletű csoporttal, ahol

Rg, R_Xq és R_X1 jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom, alkilcsoport, aralkilcsoport vagy arilcsoport, amelyek bármelyike az R5 jelentésére megadott módon adott esetben mono- vagy poliszubsztituálva lehet, vagy

E jelentése adott esetben szubsztituált, dekarboxilezett cisztein- vagy cisztein-homológ-származék,

R_x jelentése hidrogénatom vagy R-CO- általános képletű csoport, ahol

-40^R1 ^R1 ^R2 r jelentése hidrogénatom, egyenes vagy elágazó szénláncú vagy gyűrűs, legfeljebb 20 szénatomos alkilcsoport, amely adott esetben kettős kötéseket és/vagy szubsztituenseket tartalmazhat, amely szubsztituens halogénatom, nitrocsoport, aminocsoport, szulfocsoport, foszfocsoport vagy karboxilesöpört lehet; vagy aralkil- vagy arilcsoport, amelyek adott esetben az alkilcsoportra megadott módon lehetnek szubsztituálva, és további szubsztituensként alkilcsoportot tartalmazhatnak, vagy glikozilcsoport vagy nukleozilesöpört, vagy jelentése L- vagy D-a-aminosav, vagy jelentése hiányzik, ha A jelentése szubsztituálatlan dezaminoszármazék, vagy ha a peptid N-C ciklusos formában van, és jelentése -NRj.₂Ri3 általános képletű csoport, ahol R₁₂ és R13 jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom, egyenes vagy elágazó szénláncú vagy gyűrűs alkilcsoport, araikilesöpört vagy arilcsoport, amelyek adott esetben az R5 jelentésére megadott módon lehetnek szubsztituálva, vagy

-0R₁₄ általános képletű csoport, ahol ^r14 jelentése hidrogénatom, egyenes vagy elágazó szénláncú vagy gyűrűs alkilcsoport, aralkilcsoport vagy arilcsoport, amelyek adott esetben az R5 jelentésére megadott módon lehetnek szubsztituálva,

-O-glikozil-csoport, vagy

L- vagy D-a-aminosav, vagy jelentése hiányzik, ha E jelentése cisztein vagy cisztein-homológ dekarboxilezett származéka, vagy a peptid N-C gyűrűs formában van, valamint a fenti képletnek megfelelő olyan peptidek, amelyek egy vagy több retroinverz, ketometilén- vagy metil-szulfid peptidkötést tartalmaznak.
2. Az 1. igénypont szerinti peptidszármazékok, amelyek (I) általános képletében jelentése Asn, Ser, Gin,

Gly, Pro,

Sár,

Thr, Alá vagy a megfelelő N-alkilezett aminosav, jelentése Gly, Alá, Leu,

Pro, Sár,

Ser,

Met, Thr vagy a megfelelő N-alkilezett aminosav, jelentése Ser, Gly, Pro,

Sár, Leu,

Met,

Thr vagy aminosav,

E,

R1 jelentése Val, Gly,

-Val, Met, terc-Leu és R₂ jelentése az 1.

Thr,

Alá, His,

Ile,

Leu, N-Leu, Nés aromás aminosavak, és igénypontban megadott.

3. Az 1. igénypont szerinti peptidszármazék, amelynek (I) általános képletében jelentése

Asn, jelentése

Gly, jelentése

Val, jelentése

Cys(Acm), ^Ri jelentése

H és

*2 jelentése NH₂ · peptidszármazék, amelynek 4. Az 1. igénypont szerinti (I) általános képletében A jelentése Asn, B jelentése Leu, C jelentése Gly, D jelentése Val, E jelentése Cys(Acm), ^Ri jelentése H, és *2 jelentése NH₂. 5. Az 1. igénypont szerinti peptidszármazék, amelynek (I) általános képletében A jelentése Asn, B jelentése Alá, C jelentése Gly, D jelentése Val, E jelentése Cys(Acm), R1 jelentése H, és *2 jelentése NH₂. 6. Az 1. igénypont szerinti peptidszármazék, amelynek (I) általános képletében A jelentése hiányzik, B jelentése Asn, C jelentése Leu, D jelentése Gly, E jelentése Cys(Acm), ^Ri jelentése H, és ^R2 jelentése NH₂.

-43* · * • · »« · · · • ·

7. Az 1. igénypont szerinti peptidszármazék, amelynek (I) általános képletében jelentése hiányzik, jelentése hiányzik, jelentése

Gly, jelentése

Val, jelentése

Cys(Acm), ^R1 jelentése acetil-, és ^r2 jelentése

NH₂,
8. Az 1. igénypont szerinti peptidszármazék, amelynek általános képletében (I)

A jelentése hiányzik, B jelentése hiányzik, C jelentése Asn, D jelentése Val, E jelentése Cys(Acm), ^R1 jelentése H, és ^r2 jelentése nh₂.
9. Eljárás az 1-8. igénypontok bármelyike szerinti peptidszármazékok előállítására, azzal jelle m e z v e , hogy a megfelelő védett aminosavakból a peptidkémiában szokásos módszereket alkalmazva előállítjuk a védett peptideket, majd adott esetben ezeket a védőcsopor tokat ismert módon lehasítjuk.
10. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a C-terminális aminosavat vagy az előállítandó peptid C-terminális aminosavat tartalmazó, adott esetben az oldalláncban lévő funkciós csoportokon • ·« *

9» »· ·· 4

Λ ·*··«·· • · · · « · *·· · · Λ» · védett fragmensét vagy a C-termináis aminosav származékát vagy a fenti peptid-fragmens karboxilcsoportján valamilyen egyéb módon védett származékát az előállítandó peptid aminosav-szekvenciájában a megelőző, terminális nitrogénatomján és adott esetben oldalláncban lévő funkciós csoportján védett, karboxilcsoportján aktivált aminosawal vagy az előállítandó peptid aminosav-szekvenciájában a megelőző aminosavat tartalmazó, terminális nitrogénatomján és adott esetben oldalláncban lévő funkciós csoportján védett, karboxilcsoportján aktivált peptid-fragmenssel acilezzük, és adott esetben a kapott, terminális nitrogénatomján védett intermedier peptidet az acilezendő terminális nitrogénatom védőcsoportjának ismert módon történő eltávolítása után egy következő lépésben az előállítandó peptid aminosav-szekvenciájában a megelőző, terminális nitrogénatomján és adott esetben oldalláncban lévő funkciós csoportján védett, karboxilcsoportján aktivált aminosawal vagy az előállítandó peptid aminosav-szekvenciájában a megelőző aminosavat tartalmazó, terminális nitrogénatomján és adott esetben oldalláncban lévő funkciós csoportján védett, karboxilcsoportján aktivált peptid-fragmenssel újra acilezzük, amelynek eredményeként terminális nitrogénatomján védett újabb intermedier peptidet kapunk, és az N-terminális védőcsoport eltávolításából és acilezésből álló ciklust addig folytatjuk, míg a kívánt aminosav-szekvenciájú peptidet vagy annak sóját, komplexét, amidját vagy alkil-észterét megkapjuk, és az így kapott peptidből kívánt esetben eltávolítjuk a terminális nitrogénatom védőcsoportját és az adott esetben jelenlévő egyéb védőcsoporto(ka)t.

• •44 • ·*· ·· ·* * · # ««,*··» · « * » * * ·< * · 11«
11. Gyógyászati készítmények, amelyek gyógyászatilag elfogadható hígítóanyagot vagy egyéb segédanyagot és hatóanyagként az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti legalább egy peptidszármazékot tartalmaznak glaukomaellenes hatást kiváltó vagy intraokuláris nyomást csökkentő mennyiségben.
12. A 11. igénypont szerinti gyógyászati készítmény, amely hatóanyagként a 3. igénypont szerinti peptidet tartalmazza.
13. A 11. igénypont szerinti gyógyászati készítmény, amelyben a hatóanyag mennyisége 0,01 - 10 tömeg%.
14. A 11. igénypont szerinti gyógyászati készítmény, amelyben a hatóanyag mennyisége 0,1-5 tömeg%.
15. A 11. igénypont szerinti gyógyászati készítmény, amelyben a hatóanyag mennyisége 0,25 - 1 tömeg%.
16. Eljárás glaukoma és intraokuláris hipertenzió kezelésére, azzal jellemezve, hogy a kezelendő emlősnek az 1-8. igénypontok bármelyike szerinti legalább egy peptidszármazékot adagoljuk glaukomaellenes hatást kiváltó vagy intraokuláris nyomást csökkentő mennyiségben.