HUT57794A - Enzymatic process for producing immunomodulatory pentapeptides and intermediates usable in the process - Google Patents

Description

A találmány tárgya eljárás az (1) általános képletü r₁-a-b-c-d-e-r₂ peptidek és az eljárásban alkalmazható intermedierek előállítására. Az (1) általános képletben A, B, C, D és E peptidkötésekkel kapcsolódó aminosavmaradékokat jelentenek, és

A jelentése L- vagy D-konf iguráció jó, (J-amino- vagy íű-guanidino-csoporttal szubsztituált bázisos aminosavmaradék, vagy adott esetben ilyen aminosavmaradékok adott esetben szubsztituált dezaminoszármazéka;

B jelentése bázisos, (J-amino- vagy óJ-guanidino-csoporttal szubsztituált L-aminosavmaradék; vagy B L-Pro vagy L-dehidroPro maradékot is jelenthet;

C jelentése L- vagy D-konfigurációjű, savas jellegű aminosavmaradék ;

D jelentése nempoláris, hidrofób, alifás L-aminosavmaradék; vagy olyan L-aminosavmaradék, amely az arilcsoporton adott esetben nitro-, hidroxil-, alkoxi- vagy alkilcsoporttal és/vagy halogénnel szubsztituált homo- vagy heteroaromás aril- vagy aralkilcsoportot tartalmaz;

E jelentése nempoláris, L- vagy D-konfigurációjű, hidrofób, alifás aminosavmaradék; vagy L- vagy D-konfigurációjű olyan aminosavmaradék, amely az arilcsoporton adott esetben nitro-, hidroxil-, alkoxi- vagy alkilcsoporttal és/vagy halogénnel szubsztituált homo- vagy heteroaromás aril- vagy aralkilcsoportot tartalmaz; vagy ilyen aminosavmaradékok adott esetben szubsztituált dekarboxiszármazéka;

jelentése hidrogénatom; vagy cÁ-amino-szubsztituens csoport, így kémiai vagy enzimes úton lehasítható <Á-amino-védőcsoport;

vagy hiányzik, ha A szubsztituálatlan dezaminoszármazékot jelent; és

Rz jelentése hidroxilcsoport; vagy (/--karboxil-szubsztituens csoport, így kémiai vagy enzimes úton lehasítható oC-karboxil-védőcsoport; vagy hiányzik, ha E jelentése szubsztituálatlan dekarboxiszármazék.

Ennek alapján az 6J-szubsztituált A és B aminosavmaradékoknak megfelelő bázisos aminosavak szerkezeti típusát az (I) vagy (II) általános képlet fejezi ki, ahol n értéke 1-től 7-ig terjedő egész szám; és R^' és Rz' jelentése egymástól függetlenül? hidrogénatom; 1-3 szénatomos alkilcsoport; piranozilcsoport; vagy R^' és Rz' együttesen (CHz)_ni általános képletű csoportot is jelenthet, amelyben n' értéke 3-tól 8-ig terjedő egész szám.

Amint fentebb említettük, az A maradék D-konfigurációjú is lehet, valamint az említett aminosavak dezaminoszármazékait is jelentheti, amelyek kívánt esetben 1-4 szénatomos alkil-, hidroxi-(l-4 szénatomos alkil)- vagy halogén-(l-4 szénatomos alki1)-csoporttal szubsztituálva lehetnek.

Az A maradéknak megfelelő előnyös aminosavak például: Arg

Z(11) általános képletű vegyület, amelyben n értéke 3_7; Lys Z(I) általános képletű vegyület, amelyben R^' és Rz' jelentése hidrogénatom, és n értéke 3.7; Homo-Arg Z(II) általános képletű vegyület, amelyben n értéke 4_7; valamint Homo-Lys Z(I) általános képletű vegyület, amelyben R^' és Rz' hidrogénatomot jelent, és n értéke 5.7. Ezek az aminosavak mind L-, mind D-konfigurációjűak lehetnek.

Az A maradéktól függetlenül a B bázisos aminosavmaradékok jelentése előnyösen Arg, Lys, Drn, Homo-Arg, Homo-Lys L-konfigurá óiéban, vagy L-Pro maradék.

A C savas jellegű aminosavmaradék előnyösen egy (III) általános képletű 6J-karboxi-szubsztituált aminosavból ered, ahol a (III) képletben m értéke O-tól 7-ig terjedő egész szám.

E típusban előnyös aminosavmaradék az Asp (m=l), Glu (m = 2) vagy Homo-Glu (m=3) akár L-, akár D-konfigurációban.

A C savas jellegű aminosavak azonban további karboxil-szubsztituenst vagy az íJ-karboxil-csoport helyett a (III) általános képletben (J-szulfonsavcsoportot is tartalmazhatnak.

A nempoláris, hidrofób, alifás D aminosavmaradékok a (IV) általános képletű aminosavakból erednek, ahol a (IV) képletben R-p R? és R} jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom, vagy egyenes vagy elágazó szénláncű alkilcsoport. Előnyös savak például az alábbi L-konfigurációjú egységek:

Val (R^H, R₂ = R₃ = CH₃)

Ile (R₁=H, R₂=CH₃, R₃=CH₃CH₂)

Leu (R₁=R₂=H, R₃=(CH₃)₂CH₂)

Nor-Leu (R₁=R₂=H, R₃=CH₃(CH₂)₂)

Nor-Val (R₁=R₂=H, R₃=CH₃CH₂)

Tért-Leu (R₁ = R₂ = R₃ = CH₃)

Alá (R₁=R₂=R₃=H)

D továbbá homo- vagy heteroaromás aril- vagy aralkil-csoportos L-amino-savmaradékot is jelenthet, amelynek arilcsoportja nitro-, hidroxil-, alkoxicsoporttal és/vagy halogénatommal szubsztituálva lehet; ezek szerkezetét az (V) általános képlet fejezi ki, ahol p értéke 0, 1, 2, 3, 4 vagy 5, és Ar adott esetben szubsztituált hetero- vagy homoarilcsoport. E savak közül előnyös a fenil-alanin és a tirozin.

Végül az E maradéknak megfelelő aminosavak azonosak lehetnek azokkal az aminosavakkal, amelyekből a D maradékok erednek, és mind L-, mind D-konfigurációban lehetnek.

Az E maradék előnyösen olyan (V) általános képletű L-aminosavmaradék, amelyben p értéke 1, és aralkilcsoportot tartalmaz. A legelőnyösebbek az alábbiak:

Tyr (ahol Ar jelentése 4-hidroxi-fenil-csoport);

TrP (ahol Ar jelentése iondolilcsoport);

Phe (ahol Ar jelentése fenilcsoport);

His (ahol Ar jelentése imidazolilcsoport); vagy

Nal (ahol Ar jelentése (b-naf til-csoport; a

3-(2 '-naftil)-alanin maradéka).

Az E maradék továbbá a fenti aminosavak dekarboxiszármazékait is jelentheti, amelyek kívánt esetben 1-4 szénatomos alkil-, hidroxi-(l-4 szénatomos alkil)- vagy halogén-(l-4 szénatomos alkil)-csoporttal, vagy halogénatommal - előnyösen fluoratommal - vagy 1-4 szénatomos alkilcsoporttal szubsztituáltak lehetnek; az E maradék továbbá nitro-, alkoxi-, hidroxilcsoporttal és/vagy halogénatommal szubsztituált Trp, Phe vagy His maradékok dekarboxiszármazékait is jelentheti.

Amint fentebb említettük, és R₂ enzimesen lehasítható védőcsoportokat - így PGlu-, BzArg-, BzPro-, AcPhe-GlyNH₂ csoportot - is jelenthet; vagy jelentése glikozil-savcsoport vagy c<-amino-szubsztituens csoport - például uretán-típusú csoport (Z-, Boc- vagy ezekhez hasonló csoport) - vagy acilcsoport (például acetil-, benzoil-, szukcinil- vagy trif luor-acetil-csoport) is lehet. E védőcsoportok a tapasztalt szakember számára jól ismertek, és leírásuk megtalálható például a 4 339 534, a 4 420 424 és

- 6 a 4 369 137 számú amerikai egyesült államok-beli szabadalmi leírásokban, valamint az ott idézett irodalomban. továbbá hidrogénatomot is jelenthet.

R2 jelentése lehet valamilyen glikozil-amino-csoport vagy valamilyen ©í-karboxil-szubsztituens csoport, például észter-típusú csoport (-0R általános képletű csoport, amelyben R például metil-, etil- vagy benzilcsoportot jelenti), vagy amino-típusú csoport (beleértve az anilin-típust is), például -Nl·^ vagy NR^R^ csoport, ahol R^ és R^ jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom, alkilvagy arilcsoport; vagy R2 jelentése hidrazid-típusú csoport is lehet /például -NHNHR^ csoport, amelyben jelentése alkil-, arilcsoport, hidrogénatom, -CONl·^ (szemikarbazid-csoport)vagy uretáncsoportZ; és R2 jelentése hidroxilcsoport is lehet. E védőcsoportok szintén jól ismertek, megtalálhatók például a 4 339 534 számú amerikai egyesült államok-beli szabadalmi leírásban.

A találmány szerinti eljárással szintetizált pentapeptidek immunmoduláló hatást fejtenek ki, vagy várható, hogy ilyen hatással rendelkeznek; ezt az alábbiakban részletesebben kifejtjük.

E leírásban a peptidkémia területén elfogadott, szokásos rövidítéseket használjuk. Az aminosav-szimbólumokat a Commission on Biochemical Nomenclature (Biokémiai Nomenklatúra Bizottság; IUPAC-IUB) által elfogadott formában alkalmazzuk, és ha erre vonatkozó külön megjegyzést nem teszünk, akkor az aminosavak L-konfigurációban vannak jelen. Ezeken kívül az alábbi rövidítéseket használjuk:

Z = Cbz:	benzil-oxi-karbonil-,
BOC:	terc-butoxi-karbonil-,
Me :	metil-,
Et:	etil-,

• · • ·· · ·

tBu :	terc-butil-,
Glp:	piroglutamil-,
Ac:	acetil-,
Bzl:	benzil-,
Bz:	benzoil-,
iPr:	izopropil-,
Z(OMe) :	(4-metoxi-benzil)-oxi-karbonil-csoport,
SÁR:	szarkozin,
HONSu:	N-hidroxi-szukcinimid,
DDC:	diciklohexil-karbodiimid,
DMF:	dimetil-formamid,
TRIS:	trisz(hidroxi-metil)-metil-amin,
NMM:	N-metil-morfolin,
DME:	dimetoxi-etán,
TEA:	trietil-amin,
HOBT:	1-hidroxi-benzotriazol,
HONp:	4-nitro-fenil-,
Fmoc:	(9-fluorenil-metil)-oxi-karbonil-csoport; és
HOOBT:	3,4-dihidro-3-hidroxi-4-oxo-l,2,3-benzotriazin.

Az alábbiakban az (..S₂, , S₁*, S₂' ...) nevezéktant alkalmaztuk az enzimek al-kötőhelyi specifitásának a definíciójára; hasonló módon (... P₂, Pp P^', P₂' ..) nevezéktant alkalmaztuk a szubsztrátumok megfelelő kötődési helyzetének jelölésére az enzimnek ezen helyein /lásd: Schechter és Berge: Biochem. Biophys. Rés. Comm. , 27, 157 (1967)7.

Az utóbbi években fokozódott az érdeklődés a fenti szerke zetű olyan pentapeptidek iránt, amelyek számos betegség, így az immunhiány következtében fellépő kóros állapotok kezelésére alkalmazhatók. E peptidek egyik speciális képviselője a • ·· · ·

- 8 H-ArgLysAspValTyrOH timopentin, amelynek biológiai hatása a hosszú láncú, természetes eredetű timopoietin-II polipeptid hatásához hasonló /Schlesinger és munkatársai: Cell 5_, 361 (1975); valamint a 4 002 740 számú amerikai egyesült államok-beli szabadalmi leírás (1977).7, s amelynek a timopentin a 32.-36. helyzetű fragmentuma.

A timopoietin biológiai hatását több szerző közölte /például: M.E. Weksler és munkatársai: J.Exp.Med. 148, 995 (1978); G.Goldstein és mtsai: Science 204, 1309 (1979); valamint a 4 190 646 számú amerikai egyesült államok-beli szabadalmi leírás (197 9)7. E pentapeptid elsősorban a T-sejtes immunrendszerre gyakorol hatást, különösen a T-sejtek differenciálódását, érését és aktivitását befolyásolja, azonban nem hat a B-sejt-rendszerre,E hatásokról összefoglaló közlemény is megjelent /immunologic Research 4_ (SÍ), 1 (1985).7, ahol több betegség kísérleti kezelését is leírták.

Úgy látszik, hogy a timopentin moduláló hatást fejt ki állatok és emberek immunrendszerére, s ennek alapján széles körben alkalmazható olyan betegségek kezelésére, amelyek az immunrendszer nem megfelelő, vagy más szempontból abnormális működéséből, valamint fokozott vagy hiányos működéséből erednek; hasonlóképpen, a fertőző betegségekben szenvedő, más hatóanyagokkal sikertelenül kezelt egyének prognózisa egyes esetekben jelentős mértékben javul. Erre példaként szolgál a DiGeorges tünetcsoportnak nevezett immunhiánybetegség (a veleszületett timuszhiány) kezelése; a B-sejtek és T-sejtek közötti egyensúlyhiány következtében, valamint az antitestek (ellenanyagok) túltermelése következtében kialakuló autoimmunbetegségek (például a reumás izületi gyulladás és a szisztémás lupus erythematosis) kezelése; végül krónikus fertőzések - többek • ·· · *···

- 9 között a lepra, a heveny és krónikus vírusfertőzések, például a Hepatitis B és Herpes simplex előidézte vírusfertőzések - kezelési vagy megelőzési prognózisának a javulása. Nyilvánvaló, hogy a timopentin egy feltételezhetően igen értékes terápiás anyag.

Hasonló szerkezetű a

H-ArgLysGluValTyrOH összetételű szpleninopentin, amelyet a megfelelő, természetes eredetű szplenin hormonról neveztek el /lásd Audhya és mtsai: Biochemistry 20, 6195 (1981); Azdhya és mtsai: Proc.Nat.Acad.Sci. (USA) 81, 2847 (1984).7, s amely a természetes hormonhoz hasonlóan a T-sejtek differenciálódásán kívül a B-sejtek differenciálódását és érését is kiváltja, s ennek alapján - többek között - az X-helyhez kötött csecsemőkori hipogammaglobulinémia kezelésére alkalmazható (e betegségben a fentebb említett mechanizmus hiányosan működik).

Általánosabban megfogalmazva: az e bejelentésben leírt típusú peptidek, amelyekben C jelentése Glu maradék - amelyek többek között a 4 505 853 és 4 420 424 számú amerikai egyesült államok-beli szabadalmi leírásokból ismertek - szpleninopentin-szerű hatásokkal ruházhatók fel, míg azok a peptidek, amelyekben C jelentése Asp maradék, timopentin-szerű hatásokra tesznek szert abban az esetben, ha bizonyos szerkezeti követelményekkel rendelkeznek ZHeavner és mtsai: Archives of Biochemistry and Biophysics, 242, 248 (198517.

A közleményekből kitűnik többek között, hogy e vizsgálatok során a timopentin-szerű hatás az A helyzetű, pozitív töltésű Arg maradéktól és a C helyzetű, negatív töltésű Asp maradéktól függ; továbbá szükséges egy hidrofób aminosavmaradék jelenléte az E helyzetben, amely Tyr, Phe,Trp, Val vagy His, valamint szubsztituált • · • · • «·· ·«· • · · · ·«« ··· · « • · ♦« · · ·

- 10 Tyr lehet; ezzel szemben a B és 0 helyzetű maradékok inkább variálhatók. Többek között a 4 505 853 számú amerikai egyesült államok-beli szabadalmi leírásban ezt az elvet alkalmazták enzimekkel szemben rezisztensebb analógok, például olyan változatok előállítására, ahol B Pro maradékot jelent; míg az E helyzetben Phe, Trp vagy His maradékokkal helyettesített analógok a 2892/85 alapszámú dán szabadalmi bejelentés és a fentebb idézett közlemény szerint az addig ismert vegyületeknél hatásosabbak, különösen azok az analógok, amelyekben a helyettesítő maradék Phe.

A fenti típusú peptidek ismert kémiai kapcsoló reakciókkal állíthatók elő /lásd például: The Peptides 1. és 2. kötet, szerk.: Gross és Meienhofer, Academic Press, N.Y.: A peptidek elemzése, szintézise és biológiája (1979 és 1980).7. Ezeknek az előállítási eljárásoknak közös vonása azonban, hogy az aminosav-oldalláncokat kielégítően el kell látni védőcsoportokkal, és ennek következtében a szintézis során mindenütt szükségesek a védőcsoportok eltávolításának lépései, aminek következtében veszteségek, mellékreakciók és egyes esetekben oldhatósági problémák jelentkeznek; gyakran nagy mennyiségű szerves oldószer és erélyes reakciókörülmények alkalmazása szükséges. A fenti eljárások egy másik közös jellemzője a racemizálódás lényeges veszélye (lásd például: D.S.Kemp, a fentebb idézett műben, l.köt. 315-382.old.), különösen a viszonylag erélyes szintetikus feltételek következtében; emiatt egyéb mellékreakciók is nagy számban felléphetnek /lásd például: M.Bodanszky és mtsai: Mellékreakciók a peptidek szintézise során a következő helyen: Int.O. of Meth. in Synthetic Org.Chem. 5, (198117.

A timopentin előállítása további speciális kérdéseket vet fel, amelyeket az alábbiakban említünk.

* * «««· ««·« «· ·

- 11 Mindezek alapján a klasszikus, szilárd fázisú Merrifield-módszert ZÓ.Am.Chem.Soc. 85, 2149 (1963).7 eredeti vagy némileg módosított formájában alkalmazzák a 4 190 646, 4 258 152, 4 261 886, 4 505 853 számú amerikai egyesült államok-beli, a 446 867 számú svéd, a 0 018 182 számú európai és a 149 093 számú dán szabadalmi leírásokban, valamint az 5455/84 és 2892/85 számú publikált dán szabadalmi bejelentésekben, jóllehet, a hagyományos, standardizált oldatban végrehajtható eljárásokat is említik, és néhány példát is közölnek. A klasszikus módszernek megfelelő, kémiai kapcsolással végrehajtott szintézis általános hátrányain kívül a szilárd fázisú eljárások további hátránya, hogy nagyobb (például 100 g feletti) mennyiségek szintézise szempontjából kényelmetlenek és nem gazdaságosak (lásd például a 4 369 137 számú amerikai egyesült államok-beli és a 0 042 291 számú európai szabadalmi leírás erre vonatkozó megjegyzését). A szilárd fázisú eljárással kapott termék viszonylag szennyezett lehet mellékreakciók és nem teljes reakciók, valamint az erélyes reakciófeltételek és védőcsoport-lehasító eljárások következtében.

A klasszikus, oldatban végrehajtott szintézisre módszereket és példákat adnak meg a 4 505 853 és a 4 547 489 számú amerikai egyesült államok-beli szabadalmi leírásokban.

A 4 298 523 és a 4 369 137 számú amerikai egyesült államok-beli, valamint a megfelelő 0 042 291 számú európai szabadalmi leírások oldatos eljárásokat közölnek olyan peptidek előállítására, ahol az (I) általános képletben jelentése hidrogénatom, A Arg, B Lys vagy Sár, C Asp vagy Glu, D Val vagy Sár és E Tyr maradékot jelent, és R? jelentése -Nh^, hidroxil- vagy adott esetben szubsztituált -OBzl csoport.

E leírásokban a szintézisek háromféle stratégiáját írják le:

• » • ·♦ ♦ ···«

- 12 két fragmentum-kapcsolási módszer szerint C-vel kapcsolódó fragmentumokat használnak; vagy egy fordított sorrendű lépésekből álló eljárást alkalmaznak, azaz a klasszikus módszer szerint járnak el. A peptidkötéseket az összes esetekben klasszikus, ismert kémiai módszerekkel alakítják ki, elsősorban aktív észterek segítségével, jóllehet az aktiválás céljára a vegyes vagy szimmetrikus anhidridet, savkloridot vagy azidos módszert is említik. Valójában azonban a fenti szabadalmi leírások és bejelentések fogalmazása olyan jellegű, hogy egyéb aktiválási módszerek kizártak.

A 3 421 614 számú német közrebocsátási irat és a 2549/85 számú publikált dán szabadalmi bejelentés olyan Arg-Lys-C-Val-E-R₂ általános képletű peptidek oldatfázisban végrehajtott szintézisére vonatkozik, ahol C Glu vagy A-amino-adipinsav-maradékot jelent (akár L-, akár D-konfigurációban), E jelentése L- vagy D-konfigurációjú Trp vagy Tyr, és R₂ jelentése hidrogénatom, -NH₂, -NH-R vagy -0R csoport, ahol R alkil- vagy arilcsoportot jelent. Azt állítják azonban, hogy az eljárás általánosabban is alkalmazható, például olyan analógok előállítására, ahol A vagy B jelentése Orn vagy homo-Arg maradék. E vegyületek a T-sejtek érését befolyásolják.

A klasszikus kondenzációs módszereket alkalmazzák például DCC/HOOBt felhasználásával, és közlik, hogy a racemizálás veszélye csekélyebb, de ki nem küszöbölhető. A szokásos védócsoportokat alkalmazzák, és újabban Fmoc, főként Z és benzilcsoportot használnak. Közlik, hogy az előzőleg ismert szintetikus eljárások (többek között a 4 420 424 számú amerikai egyesült államok-beli szabadalmi leírásban ismertetett módszerek) alkalmazása során mind a Trp, mind a Tyr maradékok melléktermékeket képeznek.

Ennek az eljárásnak az újdonsága abban áll, hogy az oldal13 *·· *·· ···£ ···· ··· ·4· · · * · · « · «« láncban védett R|-A(x)-B(x)-C(x)D-OH általános képletű származékot állítják elő, amelyet H-Trp-R₂ vagy H-Tyr-R₂ származékkal kondenzálnak, utána az és x szubsztituenseket lehasítják és adott esetben az R₂ szubsztituenseit katalitikus transzfer-hidrogénezéssel hangyasav/DMF/dimetil-acetamid elegyekben eltávolítják. Kiemelik, hogy például a ZArg(Z₂)Lys(Z)Glu(OBzl)ValTrpOBzl képletű termék - amely még kevéssé sem oldódik a számos védőcsoport következtében - előőállítása másként csak nehezen lehetséges. Várható azonban, hogy a hangyasav alkalmazásával kivitelezett transzfer-hidrogénezés mellékreakciókat, például formilezést okoz.

A jelen találmány tárgya új eljárás a fentiekben meghatározott (1) általános képletű peptidek előállítására proteolítikus enzimek segítségével. A találmány szerinti eljárásban a fenti maradékoknak megfelelő aminosavak adott esetben védett, reakcióképes származékait szekvenciálisán (megfelelő sorrendben) kapcsoljuk, és/vagy a fenti ’ aminosavmaradékokból álló, adott esetben védett, reakcióképes di-, tri- vagy tetrapeptid-fragmentumot kapcsolunk egy vagy több célszerűen választott A+B, C+D, D+E, AB+C, C+DE, CD+E, ABC+D, AB+CD, AB+CDE, ABC+DE vagy ABCD+E típusú reakció útján, majd kívánt esetben az esetleg jelenlévő terminális és/vagy oldallánc-védőcsoportokat eltávolítjuk, és a kívánt ABCDE peptid kialakítása után vagy egy előző kapcsolási reakció során vagy az előtt az R^ és R₂ csoportokat - kívánt esetben egymástól függetlenül - bevezetjük.

A találmány szerinti eljárásra jellemző, hogy intermedierként olyan Z-^-AB-Y₂ általános képletű dipeptidszármazékot alkalmazunk, ahol Zp A és B jelentése a fentiekben meghatározott, Y₂ hidroxilcsoportot vagy ©(-karboxil-szubsztituens csoportot jelent, és az oldalláncok védőcsoportot nem tartalmaznak, és ezt a dipeptidet egy

·* · · • · · « • · ·· Λ • V ·· «

- 14 C(X₃)-Y₃, C(X₅)-D(X₄)-Y₄ vagy C(X₃)-D(X₄)-E(X₅)-Y₅ általános kép letű reakcióképes aminosavszármazékkal vagy peptidszármazékkal

- ahol: C, D és E jelentése a fentiekben meghatározott; Y-j, Y₄ és Y^ jelentése hidroxilcsoport vagy valamilyen oi-karboxil-szubszti tuens csoport, amelyek az csoporttal azonosak vagy különbözők lehetnek; és X^, X₄ és X^ jelentése hidrogénatom vagy íű-oldallánc

-védőcsoport - vizes vagy részben vizes közegben 3-12 közötti pH-érték mellett, előnyösen 5-10 pH-érték mellett valamilyen karbonsavészter-hidroláz vagy peptid-hidroláz enzim, így tiol-endoproteáz, például bromelain, klosztripain, papain, kimopapain vagy ficin, vagy valamilyen szerin-endoproteáz, így Achromobacter lyticus proteáz-I, trombin, szubtilizin vagy poszt-prolin-specifikus endopeptidáz, vagy valamilyen karboxi-peptidáz, így CPD-MI vagy előnyösen CPD-Y vagy CPD-MII, vagy dipeptidil-peptidáz-I vagy dipeptidil-karboxi-peptidáz-II jelenlétében reagáltatva peptiddé alakítjuk, majd az így kapott peptidet kívánt esetben ugyanazon vagy valamilyen más proteolítikus enzim jelenlétében - amely a reaktánsok közötti peptidkötés kialakítására képes - egy reakcióképes aminosavszármazékkal vagy peptidszármazékkal kapcsoljuk, szükség esetén további enzimes vagy kémiai kapcsoló reakciókat hajtunk végre a fenti reakciótípusok útján, s így egy adott esetben védett

Z₁-A-B-C(X₃)-D(X₄)-E(X₅)-Y₅ általános képletű peptidszármazékhoz jutunk, ahol A, B, D,

C,

Z|, Xp X₄, X^ és Y^ a fentiek szerint meghatározott, majd ezt követően kívánt esetben a szubsztituens csoportokat kémiai vagy enzimes úton eltávolítjuk, és szükséges esetben az és/vagy R£ csoportot bevezetjük.

Jóllehet a találmány szerinti peptideket enzimes szintézis15 •9 ··*«* •· « sel eddig még nem állították elő, a peptidszintézis enzimes eljárás útján elvben ismert. Erre vonatkozóan alapvető és részletes vizsgálatok találhatók a 4 339 534 számú amerikai egyesült államok-beli és a megfelelő 0 017 485 számú európai szabadalmi leírásban.

Az enzimes peptidszintézist egyes esetekben előnyösen alkalmazták ipari méretekben /lásd például F.Widmer és 3.T. 3ohansen összefoglaló közleményét a következő helyen: Synthetic Peptides in Biology and Medicine Elsevier, 79-86, (1985)7, ahol megemlítik a módszer általános előnyeit; a közleményből azonban nyilvánvaló, hogy a módszer jelenleg még nem általános, és a területen átlagosan jártas egyén számára sem egykönnyen alkalmazható . Ezt a nézetet M. Bodánszky is osztja /int.3.Pept.Protein Rés. 25, 449 (1985).7 megállapítván, hogy a peptidkötések biokémiai úton történő kialakítása ígéretes módszer, jelenleg azonban még nem alkalmazható általánosan, és ez fragmentumok kapcsolására is érvényes. Bodánszky azt következteti, hogy a peptidszintézis klasszikus módszereinek a jelentősége a jövőben is nagy lesz.

Mindezek alapján nem volt biztonsággal várható a területen átlagosan tapasztalt egyén számára, hogy az (I) általános képletű, különleges szekvenciaként bázisos-bázisos-savas-hidrofób-hidrofób aminosavmaradékokból álló peptidek - amely maradékok közül egyesek D-formában is lehetnek - enzimes peptidszintézis útján létrehozhatók.

Az alábbiakban részletesen kifejtjük, hogy - tekintettel az egyedileg előnyös kapcsolási körülményekre - a találmány szerinti eljárás a technika jelenlegi állása szerint ismert, hasonló enzimek alkalmazásával végzett reakcióktól is jelentősen különbözik.

A technika jelenlegi állására jellemző, hogy az enzimes peptidszintézisre számos példa felhozható, de ezek közül egyikben sem írják le D-aminosavak vagy D-aminosavakat tartalmazó peptidek beépítését. A jelen szabadalmi bejelentés benyújtója a fentebb említett, 0 017 485 számú európai szabadalmi leírásban eljárást ismertet

A -B -Z

XXX általános képletű peptidek előállítására, ahol Α_χ jelentése N-terminálisán védett aminosavmaradék vagy adott esetben N-terminálisán védett peptidmaradék, amely C-terminálisán L-aminosavmaradékot tartalmaz; Β_χ L-aminosavmaradékot jelent; és Ζ_χ jelentése hidroxilcsoport vagy a C-terminálison elhelyezett védőcsoport. Ezeket a peptideket úgy állítják elő, hogy egy szubsztrátum-komponenst egy aminokomponenssel valamilyen enzim jelenlétében reagáltatnak, majd kívánt esetben az adott esetben jelenlévő terminális védőcsoportokat lehasítják, s így jutnak az Α_χ-Β_χ-Ζ_χ általános képletű peptidekhez. Erre az eljárásra jellemző, hogy egy aminosavésztert, peptidésztert, depszipeptidet vagy adott esetben N-szubsztituált aminosavamidot vagy peptidamidot vagy adott esetben N-terminálisán védett

A -0R , A -NR R ' x x ’ x y y vagy

A -X -OH x x általános képletű peptidet - ahol a képletekben

R_x jelentése alkil-, aril-, heteroaril-, aralkilcsoport, vagy egy aminosavmaradék o<-dezamino-fragmentuma;

jelentése a fentiekben meghatározott;

és R ' jelentése hidrogénatom, alkil-, aril-, heteroaril- vagy aralkilcsoport; és

L-aminosavmaradékot jelent ·· ··· ·· • · • · · •· ···* «·*« « · • *· ·

- 17 valamilyen aminkomponenssel (mint nukleofillel), adott esetben a ^{H B}x‘^NRz^Rz' ^{vagy H B}x“^0Rw általános képletű N-szubsztituált L-aminosav-amiddal, L-aminosavval vagy L-aminosavészterrel - ahol

B jelentése a fentiekben meghatározott;

R_z és R ' jelentése hidrogénatom, hidroxil-, amino-, alkil-, aril-, heteroaril- vagy aralkilcsoport; és

R jelentése hidrogénatom, alkil-, aril-, heteroaril- vagy w

aralkilcsoport valamilyen L-specifikus szerin- vagy tiol-karboxi-peptidáz enzim jelenlétében - amely élesztőből vagy állatból ered, növényi vagy mikrobiális eredetű - 5 és 10,5 közötti pH-érték mellett, vizes oldatban vagy diszperzióban, előnyösen 20-50 °C hőmérséklettartományban reagáltatunk. E célra előnyösen alkalmazható enzim az élesztőből származó karboxi-peptidáz Y (amelyet az alábbiakban röviden CPD-Y-nak nevezünk). Megjegyezzük félreértések elkerülése végett, hogy a betűszimbólumok fentebb említett jelentései nem azonosak a 0 017 485 számú európai szabadalmi leírásban használt szimbólumokkal.

Az utóbb említett szabadalom az abban az időben meglepő felismerésen alapul, hogy karboxi-peptidáz enzimek az enzimes peptidszintézisben alkalmazhatók.

A leírás és részletes példák alapján a CPD-Y enzim specifitása igen széles, és számos példában írták le felhasználását kapcsolási reakciókban. Megállapítják azonban, hogy oldalláncként karboxilcsoportot tartalmazó aminosavak (Asp vagy Glu) aminkomponensként történő beépítése nehéz, valamint heterociklusos aminosavak, így Pro és His beépítése szabad sav alakjában rendkívül nehéz. E szabadalmi leírásban nincsenek példák pentapeptidek előállítására; azonban az egyidejűleg benyújtott 545 416 számú osztrák szabadalmi leírásban ismertetik a metenkefalin, azaz Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-OH előállítását Bz-Arg-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-OH triptikus hasításával, és az utóbbi peptidet CPD-Y által katalizált, lépésenkénti (lépcsőzetes) szintézissel állítják elő.

Ez az aminosavszekvencia az (1) általános képletű peptidektől nagyon eltérő jellegű, különösen azért, mert sem Pro-t, sem savas jellegű aminosavmaradékot nem tartalmaz. Számos tetra- és tripeptid szintézisét közlik, azonban ezek egyike sem tartalmaz bázisos-savas-hidrofób-sav vagy Pro-savas-hidrofób-sav tripeptid szekvenciát, mindössze a megfelelő, további N-terminális bázisos aminosavat tartalmazó tetrapeptid szekvencia előállítását közlik. Alább A.J. Andersen-re hivatkozva kifejtjük, hogy a CPD-Y enzim nem képes katalizálni egy Arg-Pro kötés kialakulását.

Összegezve a fenti tényeket, valamint a fenti szabadalomcsalád alapján a területen átlagosan tapasztalt egyénnek komoly kételyei támadhatnak, vajon az enzimes peptidszintézis számba vehető-e az (1) általános képletű, különös szerkezetű pentapeptidek szintézise céljából.

Az enzimes peptidszintézisre egy másik reprezentatív példával szolgál az Isowa és mtsai által benyújtott 3 972 773 számú amerikai egyesült államok-beli szabadalmi leírás, amely megfelel a 2 518 256 számú német szabadalmi leírásnak. E szabadalmi leírás eljárást közöl az

X-A-B-C-Y általános képletű peptidek előállítására - ahol

A jelentése Alá, Gin, Asn, (o-BOC-Lys, Leu, Gly, Glu, GluCOCH^),

Pro maradék; vagy A A^-A^ maradék is lehet, amelyben A^ hidrofil aminosavmaradékot jelent, amely Alá, Gin, Asn, ω-BOC-Lys, Leu, Gly, Glu, Glu(OCH^) vagy Pro maradék lehet, és A₂ jelentése Val, Met, Leu vagy Gin maradék;

B jelentése Phe, Tyr, Leu, Met, Glu, Asp, Gin, Asn vagy Trp maradék;

C jelentése Phe, Leu, Ile, Tyr, Cys(SBzl), Ser(OBzl), Trp vagy

Met maradék; és

X és Y védőcsoportót vagy terminálisán védett aminosav- vagy peptidmaradékot jelent amelyre jellemző, hogy egy X-A-B-OH általános képletű peptidet H-C-Y általános képletű peptiddel vagy aminosavval pepszin enzim jelenlétében reagáltatnak.

A szabadalmi leírásban hangsúlyozzák az A-B-C szekvencia kritikus jellegét és úgy látszik, hogy az adott jellemzés nem fedi a bázisos-bázisos vagy Pro-savas-hidrofób-hidrofób szekvenciát, mivel az egyetlen bázisos aminosavat (Lys) ^Λ, 6O-B0C-Lys alakban alkalmazzák, azaz védőcsoporttal látják el a pozitív töltés kiküszöbölése céljából. Egyes példákban X jelentése B0C-Arg(N0₂), tehát a bázisos jelleget ebben az esetben is közömbösítik, s így a végtermék oldhatósága csökken.

Az a tény, hogy a bázisos aminosavakat védőcsoporttal kell ellátni a beépítés céljából, a tapasztalt szakembert nem serkentené arra, hogy a jelen találmányban leírt vegyületek előállítására az ismert eljárást alkalmazza, mivel a bázisos jelleg az immunmoduláló hatás szempontjából kritikus, továbbá mert az oldalláncban lévő védőcsoportok eltávolítása több nemkívánt mellékterméket eredményezne, amelyek elkülönítése nehéz.

Az Isowa-féle szabadalmi leírás példáiból kitűnik, hogy A, B és C definíciója nem kombinálható minden formában. így egyetlen • «

- 20 esetben sem kapcsolják a Pro-maradékot savas jellegű aminosavval (Glu vagy Asp maradékkal), sem a védett, és ennélfogva nem bázisos í*,6J-B0C-Lys vagy B0C-Arg(N02) maradékkal. Az egyetlen olyan példában, ahol Asp maradékot alkalmaznak, a hozam mindössze 17 %. A proteázok, mind a peptidszintézis biokatalizátorai című összefoglaló közleményben /Die Pharmazie 37, 101 (1982),7 rámutatnak arra, hogy a pepszin a Z-Val-Tyr-OH és H-Phe-ODpm reakcióját nem katalizálja (a hozam 0 %).

A jelen találmány szerinti vegyületek között a legfontosabb az Arg-Lys-Asp-Val-Tyr előállítása, s a fentiek értelmében Isowa és munkatársai eljárásának részletesebb tanulmányozása alapján a tapasztalt szakember komolyan kételkedhetne abban, hogy az enzimes peptidszintézis alkalmas-e e fontos vegyület előállítására.

Az enzimes reakciók (enzimreakciók) oldatban játszódnak le; az enzim azonban lehet szuszpenzió, emulzió formájában vagy immobiklizált állapotban, vizes vagy részben vizes közegben, ahol a közeg 0-90 % vízzel elegyedő vagy vízzel nem keveredő szerves oldószert tartalmaz. An enzimreakciók enyhe pH-feltételek (körülmények) között, általában 5-10 pH-érték mellett mennek végbe. Ennek következtében az előállítás olyan körülmények között valósítható meg, amelyek nem idéznek elő racemizálást, és az ilyen enyhe feltételek alkalmazása során számos más, fentebb említett mellékreakció sem megy végbe. Az oldallánc-védőcsoportok mellőzhetők, így a szintézis lépéseinek száma és a szükséges tisztítási lépések száma csökken, és kisebb veszteségek lépnek fel még adott esetben erélyesebb védőcsoport-eltávolítási körülmények között is. A védőcsoportok mellőzése biztosítja továbbá a vizes közegben elérhető kedvező oldhatóságot, ami egyrészt megkönnyíti a szintézist és a tiszti tást, másrészt lehetővé teszi a tisztítást a fordított fázisú HPLC (túlnyomásos folyadékkromatográfia) vagy ioncserélő kromatográfia útján. Megjegyezzük, hogy egyes esetekben az enzimes kapcsolás során is előnyös lehet néhány oldallánc-védőcsoport bevezetése, mert így a termék a vizes közegből csapadék formájában leválik, vagy szerves oldószerrel extrahálható, s így csaknem kvantitatív hozam érhető el. A találmány szerinti eljárásban a C maradékot különösen -OBzl alakban védjük, ami meglepően kedvező eredményt biztosít az enzimes módszer szempontjából, tekintet nélkül arra, hogy a C Asp vagy Glu maradékot jelent, vagy a C maradék a szubsztrátum P^-helyzetében van.

E leírásban a szubsztrátum és nukleofil elnevezésen

- az enzimes kapcsolás vonatkozásában - a karboxil- és az aminkomponenst értjük, amelyekből a peptidkötést kialakítjuk.

Végül: az a tény, hogy az alkalmazott enzimek mind abszolút, mind kinetikai értelemben sztereospecifikusak, lehetővé teszi egyes helyzetekben egyrészt D-aminosavak beépítését - például ha az E maradék D-alakban van - másrészt enzimes, kinetikai vagy abszolút rezolválás végrehajtását keverék esetében, ha az alkalmazott enzim jellemzőit figyelembe vesszük. E tény ismét két szintetikus előnyt kínál: egyrészt viszonylag szennyezett kiinduló anyagokat használhatunk, amelyek ennek következtében olcsóbbak, másrészt a szintézis egy vagy több lépését a klasszikus kapcsolási módszerekkel is megvalósíthatjuk, ha ez gazdaságos; majd a következő lépésekben enzimek alkalmazásával kizárhatjuk, hogy egy esetleges racemizálódás következtében keletkezett izomer egy további reakcióban vegyen részt, vagy az átalakulását igen lassúvá és kismértékűvé tehetjük. Itt például P.Thorbek és F.Widmer munkájára • ·

- 22 hivatkozhatunk: D-aminosavat tartalmazó peptidek enzimes szintézise a következő helyen: Peptides: Structure and Function, Proceedings of the 9th American Peptide Symposium, szerk. C.M. Deber és mutsai, Illinois, Pierce, 359-362. old. (1985).

E közleményből többek között kitűnik, hogy a szubsztrátum-komponensben a sztereospecifitás nagy, ami kiaknázható egyrészt a megfelelő kapcsolási lépésben, másrészt például E-f^ kötések kialakítására sztereospecifikusan, enzimes úton történő védőcsoport-eltávolítással; a nukleofil komponens esetében azonban fennáll a lehetőség D-aminosavak beépítésére bizonyos helyzetekben, az enzimtől függően; a viszonylag alacsonyabb hozam annak a következménye, hogy a nukleofilban jelenlévő racém szennyezések a megfelelő enzimes lépések során kiküszöbölődnek, ha tiszta L-izomer előállítása kívánatos.

Egyes körülmények között N-<£-védőcsoportot nem tartalmazó, D-konfigurációjú aminosavszármazékok is alkalmazhatók a D-L-kötés kialakítása során szubsztrátumokként: lásd például az 1988. augusztus 25-én publikált 88/06187 PCT szabadalmi bejelentést.

Az (1) általános képletű vegyületek találmány szerinti előállítása enzimek alkalmazásával a kapcsolás alkalmazott stratégiája szerint többféle változatra osztható. Az alábbi I)-VI) reakcióvázlatokban Z(_np Y_(n), illetve Χζ_η) jelentése οί-amino-, illetve d-karboxil-, illetve á>-oldallánc-szubsztituens az n-edik aminosavon (aminosavmaradékon) az A maradéktól az E maradékig végzett számozás szerint. A és X(_n) azonban hidrogénatomot is jelenthetnek és

Υζ_η) hidroxilcsoportot is jelenthet. Mivel X jelentése előnyösen hidrogénatom egy olyan stratégia alkalmazása során, ahol az oldalláncokat csak minimális mértékben kell védeni, egyéb jelentése csak akkor van, ha ez különösen fontos, és ez a találmányt semmiképpen sem korlátozza. Ugyanez érvényes arra, hogy a reakciósorban védjük az oldalláncot, illetve védőcsoport-eltávolítást végzünk. Ennek alapján az alábbiakban védőcsoport nélküli aminosavon (aminosavmaradékon) oldalláncban védőcsoportot nem tartalmazó egységet értünk, ha erre vonatkozóan külön megjegyzést nem teszünk.

A kapcsolási reakció az egyes lépéseket tekintve négy alapvetően különböző úton játszódhat le:

1) enzimes úton végzett kondenzációval;

2) amidok enzimes aminolízisével;

3) észterek enzimes aminolízisével; és

4) kémiai úton aktivált o(-karboxilcsoport kondenzációs reakciója útján.

A fentiek közül az első három reakciótípust részletesen ismerteti F.Widmer és 3.T. Johansen a következő helyen: Synthetic Peptides in Biology and Medicine, szerk. K. Alitato és mtsai, Elsevier (1985), amely számos idézetet is tartalmaz. E közleményt hivatkozás céljából beépítjük e leírásunkba. A megértés könnyítése céljából a három reakciótípust az alábbi példákkal mutatjuk be (amelyeket Widmer és Johansen idézett munkájából vettünk):

1. Kondenzáció:

R'^AlaOH + HLeuNHo _χ > R '/laLeuNl·^ + H₂0

2. Amidok aminolízise (transzpeptidálás):

a) R'AlaGlyOH + HLeuNH₂ -------> R'^AlaLeuNl·^ + GlyOH

b) R'₁AlaGlyNH₂ + HLeuNH₂ -------> R'/laLeuNl·^ + GlyNH₂ • · ·

- 24 3. Észterek aminolízise:

R^AlaOEt + HLeuNH₂ —----? R'₁AlaLeuNH₂ + EtOH (R'l hidrogénatomot vagy védőcsoportot jelent; E jelentése enzim).

A kémiai úton aktivált ot-karboxilcsoport előállítási módszerei a következő helyen találhatók: The Peptides, 1. és 2. kötet, szerk. Gross-Meienhofer, Academic Press, N.Y., Analysis Synthesis and Biology (1979. és 1980.). E közleményt leírásunkba hivatkozásként szintén beépítjük.

Ami a szubsztitúciót illeti, az n-edik és (n+l)-edik aminosavmaradék közötti peptidkötés kialakítása szempontjából röviden hangsúlyoznunk kell a következőket:

- ezen reakciótípusokban mindig hidrogént jelent;

- Kondenzáció esetén Υζ_π) mindig hidroxilcsoportot jelent;

- Amidok enzimes aminolízise esetén Y(_n) jelentése -N-R^R^ csoport, ahol R^ és R^ jelentése egymástól függetlenül: alkilvagy arilcsoport; vagy hidrogénatom; vagy adott esetben R^ hidrogénatomot és R^ peptidmaradékot jelenthet, és ebben az esetben a reakció valódi transzpeptidálás; általában azonban egyszerű amidot vagy adott esetben anilidet alkalmazunk.

- Az észter enzimes aminolízise esetén Y(_n) jelentése -0R általános képletű csoport, amelyben R jelentése egyszerű vagy összetettebb, vagy adott esetben szubsztituált alkil- vagy arilcsoport; előnyösen egyszerű alifás vagy aromás észtereket alkalmazunk, így például -0R jelentése -OMe, -OEt, -OiPr- vagy -OBzl lehet.

A negyedik módszerben a kémiai aktiválás során Y(_n) például valamilyen aktív észter lehet, jelentése például -ONSu, -OOBt vagy -ONp csoport, amelyek valamilyen karbodiimiddel végrehajtott reak • · • ·

- 25 cióval, így diciklohexil-karbodiimid segítségével, vagy még egyszerűbben az aktivált karbodiimid-komplexszel alakíthatók ki; vagy Υζ_η) például azidcsoport, szimmetrikus vagy vegyes anhidrid vagy savklorid is lehet.

A találmány szerinti eljárásban a fentebb felsorolt négy kondenzációs módszert alkalmazhatjuk egymás kiegészítéseként, az aminosavszekvencia és az esetleg jelenlévő védőcsoportoktól függően. Ha kémiai aktiváló lépéseket vezetünk be, akkor azonban szükséges lehet megfelelő enzimes lépések, például kapcsolási lépések végrehajtása annak biztosítására, hogy az esetleg keletkezett, nem megfelelő izomerek kiküszöbölését biztosítsuk. Egy ilyen típusú speciális eset - amely nem foglal magában kapcsolást - a C-terminális módosítása, ami például az E-R₂ kötés enzimes bevezetése során megy végbe. Az N-terminális módosítását is alkalmazhatjuk.

Más típusú C-terminális módosítás - mind kémiai, mind enzimes úton - amely során Y(_n) θ kapcsolás előtt megváltozik, a szintézis során végbemehet. Egyszerűség kedvéért az I)-VI) stratégia-vázlatokból ezeket a módosításokat elhagytuk. Ez a találmány oltalmi körét egyáltalában nem korlátozza. Ilyen típusú módosítás alkalmazására a stratégia során egy példa az enzimes dezamidálás, amelyet kémiai észterezés útján érhetünk el, s így Υζ_η) észterhez juthatunk. Ezt ismerteti többek között K. Breddam (Carlsberg Rés. Commun. 49, 535).

Az Rp R₂ és X-j csoportok identitásáról, bevezetéséről és eltávolításáról az alábbiakat jegyezzük meg.

Világosság és egyszerűség kedvéért megállapítjuk az összes stratégiákra vonatkozóan, hogy az R₂ csoportot csak az utolsó kapcsolási lépés után építjük be, utána vezetjük be az csoportot, • · ···« · · * ♦ • · · » ··· ··· · · * · · · · * *

- 26 s végül eltávolítjuk az X^ csoportot; tehát mindezt három különálló lépésben végezzük. Ez azonban semmiképpen sem korlátozza a találmányt. Ha például jelentése Cbz- csoport, és és Y-j jelentése OBzl-csoport, akkor e három csoport katalitikus hidrogénezéssel egyidejűleg eltávolítható. Ezáltal R-^ és R£ egyidőben bevezethető, ha jelentésük H-, illetve -OH. Egyes esetekben célszerű R| és R2 kezdetben történő bevezetése: például ha peptidmaradékot, így PGlu-t és R2 -NH2 csoportot jelent. Ebben az esetben a stratégiavázlatokban R^ jelentése Z^ jelentésével azonos, R2 jelentése Y^ jelentésével azonos, és a megfelelő szintetikus lépés elmarad. Továbbá X-j korai fázisban eltávolítható például egyidejű hidrogénezés utján, ha X-j OBzl- és Z-j Cbz- csoportot jelent: ekkor a reakcióvázlatban X^ jelentése -H és az utolsó lépés elmarad. X^ jelentése kezdettől fogva -H lehet. Még általánosabban: jelentheti a tapasztalt szakember számára jól ismert oldalláncok valamennyi szokásos védőcsoportját (vagy -H-t is jelenthet), valamint jelenthet enzimes úton lehasítható csoportokat, például Glp csoportot; és jelentése lehet valamennyi szokásos amino-védőcsoport, beleértve az enzimes úton lehasítható csoportokat, például a BzArg- csoportot, vagy -H-t. Z(_n) különösen előnyös jelentése azonban Cbz- vagy Boc- csoport, és X^ különösen előnyösen -OBzl-t vagy -H-t jelent. A védőcsoportok katalitikus hidrogénezéssel vagy savas kezeléssel távolíthatók el, általában azonban valamennyi szokásos védőcsoport-lehasító módszer alkalmazható, így az enzimes megoldás is.

Az I)-IV) stratégiában közbenső termékként Z^-A(X^)-B(X?)-Y₂ képződik, ahol Y2 legtöbbnyire valamilyen észter, és B-Y2 meglepő módon e formában kapcsolható. A legtöbb esetben X^ és X2 jelentése •·♦♦ ··♦· • · · · • · · •·· ··· » •« ·« ·♦ *

-H. Ez utóbbi nem védett közbenső termék különösen alkalmas nak bizonyult a soron következő, észterolízissel járó enzimes kapcsolási reakcióra, többek között fragmentumok kapcsolására endoproteáz enzimek segítségével. Az I) stratégia során egymást lépésenként követő kapcsolást végzünk és egyszerre csak egyetlen aminosavmaradékot vezetünk be A-tól E-ig. A II) stratégia során a CDE-Y^ fragmentummal végzünk kapcsolási reakciót, ahol C védett oldallánc lehet, meglepő módon azonban enzimes kapcsolás során ez nem szükséges, és ugyanez a III) stratégia során a CD-Y^-vel végzett megfelelő fragmentummal végbemenő kapcsolási reakcióra is érvényes. A II) stratégia során a CDE-Y^ fragmentumot fordított irányban, lépésenként szintetizáljuk, és ennek során a DE-Y^ meglepő módon katalitikus hatású a kondenzációs típusú, enzimes reakciókban. A II) stratégia során a szintézist az E-Y^ bevezetésével zárjuk hasonlóan az I) stratégiához. A IV) stratégiát egy

II) stratégia-szerű reakcióval fejezzük be úgy, hogy a DE-Y^ fragmentummal kapcsolunk, s így a katalitikus hatásnak hasonló előnye it aknázhatjuk ki, mint a II) stratégiában; ezenkívül meglepő módon kedvező eredményeket érhetünk el egyes esetekben, ha X-j -OBzl csoportot jelent, és X^, valamint X₂ hidrogént jelent. Egészen hasonló eset áll fenn az V) stratégiában, amelyet hasonló lépéssel zárunk.

Ez utóbbi esetben a Z-^ABC-Y^ fragmentumot szintetizáljuk, amelyben C adott esetben védőcsoporttal van ellátva; e szintézist lépésen ként, fordított irányban hajtjuk végre, és utoljára Z^A-Y^-vel kapcsolunk. Hasonló kapcsolással fejezzük be a VI) stratégiát, ahol A Z₂-BC-Y^ és a DE-Y^ fragmentumokat előzőleg összekötjük.

Három további stratégia lehetséges, ezek közül az egyik a lépésen ként végrehajtott, fordított irányú szintézis, és további két stra• 4 ·· ···< · · · · •·· ♦·· · ·

- 28 tégia a Z2-BCD-Y4 közbenső terméken alapul, amelyet először E-Y^, illetve Z-^-A-Y-^ fragmentumokkal kapcsolunk, majd az így kapott Z2-BCDE-Y5, illetve Z^-ABCDY^ közbenső terméket az N-védőcsoport eltávolítása után Z^-A-Y-^ fragmentummal, illetve a C-védőcsoport eltávolítása után E-Y^ fragmentummal kapcsoljuk.

A kötés kialakításának enzimes módszerei

A találmány szerint valamilyen endoproteázt vagy dipeptidil-karboxi-peptidázt vagy -peptidázt alkalmazhatunk peptidkötések enzimes kialakítására, ha az (n+l)-edik aminosavat (n+2)-edik aminosavhoz kötjük peptidkötés útján; ha nem ez az eset áll fenn, akkor endoproteázokat vagy monokarboxi-peptidázokat használhatunk. Ezek az enzimek eredhetnek élesztőből vagy állatból, növényi vagy mikrobiális eredetűek lehetnek, és hatásukat kovalens vagy nem-kovalens mechanizmus útján, például szerin-, tiol- vagy metallo- (fém-) csoportok, mint aktiváló csoportok közreműködésével fejtik ki; lehetnek oldatban, szuszpenzióban vagy emulzióban, vagy adott esetben valamilyen vivőanyaghoz kötött, immobilizált formában. A reakciók részben vizes (vizet tartalmazó) közegben, 0-90 % vízzel elegyedő vagy nem elegyedő szerves oldószer jelenlétében, előnyösen 0-40 % vízzel elegyedő oldószer jelenlétében, 3-12 pH-tartományban - kondenzációs reakciók esetén előnyösen 4-8 pH-tartományban, eszterolítikus reakciók során előnyösen 8-10 pH-tartományban - játszódnak le. Általában előnyös enyhe reakciókörülmények - így 5 és 10 közötti pH-tartomány - alkalmazása, azonban az alkalmazott enzimtől, hőmérséklettől és reaktánsoktól függően a pH 3 és 12 között is lehet. Az alkalmazott enzimtől és körülményektől függően 0-70 °C hőmérséklettartományban, előnyösen 20-35 °C közötti hőmérsékleten dolgozunk.

•· ···« *··· • · · « ··· ♦·· β · ·· ♦ · · · *

- 29 A nukleofil komponens koncetrációja 0,05-2,0 mól/liter, előnyösen 0,1-1,0 M, a szubsztrátum koncentrációja 0,01-1,0 M, és az enzim koncentrációja 0,5-200/uM, előnyösen 1-5/uM a reakció típusától függően.

Szükség szerint sókat, például nátrium- vagy kalcium-kloridot és/vagy nedvesítőszereket vagy más segédanyagokat - például karbamidot vagy guanidin hidrokloridot - adhatunk a reakcióelegyekhez; hasonlóképpen tiolcsoportot stabilizáló reagenseket, például 2-merkapto-etanolt vagy ditio-treitet (az alábbiakban röviden: DTT) és/vagy fémkelátozó vegyületeket, például EDTA-t adhatunk szükség szerint - például tiol-proteázok alkalmazása esetén - a reakcióelegyekhez .

Az alábbiakban számos konkrét példát adunk meg olyan karboxil-észter-hidroláz és peptid-hidroláz enzimekre (sorszámuk az enzimkatalógusban: E.C.3.I., illetve E.C.3.4.), amelyek képesek az A, B, C, D és E maradékok közötti kötések kialakítására. Az I. táblázatban foglaljuk össze ezen enzimeket típusuk és forrásuk feltüntetésével. E táblázatban találhatók azok az enzimek, amelyek a találmány szerinti eljárás reakcióiban különösen előnyösen alkalmazhatók, azonban egyéb peptidázokat is figyelembe kell venni, amelyek hasonló reakciókat katalizálnak. Ez érvényes a kémiai vagy biológiai úton módosított peptidázokra és más, adott esetben bioszintetikus úton előállított katalizátorokra is. A táblázatban feltüntetett források csak példaként szerepelnek. A táblázatban példákat nevezünk meg olyan enzimekre is, amelyek felhasználhatók az E-R? vagy R^-A kötések kialakítására, vagy más, hasonló N- vagy C-terminális módosítások - például dezamidálás és észterhasítás végrehajtására.

···« ····

- 30 • · ··· ♦ · ·

I. táblázat

I. Endoproteázok;

A) Tiol-proteázok:

Enzim	(Röv.)	Általános forrás (eredet)
Papain	(P)	Papaya
Kimopapain	(CP)	Papaya
Bromelain	(B)	Ananász
Ficin	(F)	Füge (Ficus)
Klosztripain	(CL)	Clostridium histolyticum

B) Szerin-proteázok: Tripszin Kimotripszin Elasztáz Szubtilizin

T ermitáz

Proteináz K Va1i1-proteiπáz Poszt-prolin-specifikus endopeptidáz

Drapeau V8 Achromobacter lyticus proteáz-I ArgC endoproteináz LysC endoproteináz Trombin (T) Hasnyálmirigy (CT) Hasnyálmirigy (E) Hasnyálmirigy (S) Bacillus licheniformis vagy subtilis (TV) Thermoactinomyces vulgáris (K) Tritirachium album (VP) Candida tropicalis

Flavobacterium (PPSE) meningosepticum (V8) Staphylococcus aureaus V8 (Al-I) Achromobacter lyticus (AC) Állcsont alatti mirigyek (LC) Lysobacter enzymogenes (TB) Vérplazma

C) Egyéb: metallo- és aszparaginil-proteázok:

Termolizin

Pepszin (Th) Bacillus thermoproteolyticus Rokko (PE) Gyomor

II. Exopeptidázok:

A) Tiol-peptidázok:

Piroglutamináz (PG) Máj

Dipeptidil-peptidáz-I (E.C.3.4.14.1) (DPI) Lép

N-Acil-peptid-hidroláz (NP) Máj φ· *· Μ··« «···

- 31 • · ·«« ··· * * ·

8)	Szerin-peptidázok:	Karboxi-peptidáz Y	(CPD-Y, Y)	Élesztő
	(lásd a 4 339 534	Karboxi-peptidáz MI	(CPD-MI)	Maláta
	számú amerikai	Karboxi-peptidáz MII(CPD-MII)	Maláta
	egyesült államok-	Katahepszin A	(CHA)	Vese
	-beli szabadalmi
	leírást)
C)	Metallo-peptidázok	:Karboxi-peptidáz B	(CPD-B)	Hasnyálmirigy
	(a 4 339 534 számú	Dipeptidáz	(DP)	Élesztő
	amerikai egyesült	(E.C.3.14.13.11)
	államok-beli sza-	Dipeptidil-karboxi-
	badalmi leírás-	-peptidáz-II	(DC II)	E .coli
	ból kizárva)	(E.C.3.4.15.3)
		Prolinimino-peptidáz	(Pl)	E. coli
		Prolidáz
		(E.C.3.4.13.9)		Mikrobiális
				eredetű
III	. Egyéb hidrolázok	:Peinillin G vagy V
		aciláz	(GV)	E. coli
		Észterázok (E.C.3.1.	1.1)	Állati, mikrobi-
		Triacil-glicerin-lipázok	ális vagy nővé-
		(E.C.3.1.1.3)	(L)	nyi eredetű

A fentebb felsorolt enzimek közelebbi leírásában - tekintettel az abban az időben már jól ismert enzimekre - hivatkozunk G.E. Perlmann és mtsai munkájára a következő helyen: Methods of Enzym. 19, Academic (Press (1970) és 45 , (1976), szerk. S.P. Colowich és mtsai., lásd továbbá: S. Fruton: Adv. Enzymol. 53, 239, (1982); A.Abassi és mtsai: Biol.Chem. Hoppe-Seyler 367, 441 (1986); valamint K. Breddam: Carlsberg Rés. Commun. 52» 83 (1986). Általánosan alkalmazható lipázok és észterázok leírása megtalálható G.M.R. Tombo és mtsai közleményében: Biocatalysis in Organic Media, szerk. C. Laane és mtsai., Elsevier, Amsterdam, 43. old. (1987). Mindezen közleményeket e leírásunkba hivatkozás céljából beépítjük.

»4 «4·* ···4

- 32 Általánosan megjegyezzük, hogy az a tény, amely szerint egy adott peptidkötés egy adott enzimmel hidrolizálható, nem feltétlenül jelenti azt, hogy ugyanaz a peptidkötés ugyanazzal az enzimmel kialakítható; példaként hivatkozunk A.J. Andersen közleményére (1985): Arginin-prolin-peptidkötések enzimes szintézise klosztripain mint katalizátor alkalmazásával a következő helyen: Peptides: Structure and Function, Proceedings of the 9th American Peptide Symposium, szerk. C.M. Deber és mtsai, 355-358. old. (Illinois, Pierce). E közlemény hat idézetet sorol fel, amelyekben hiábavaló kísérleteket írnak le prolin, mint nukleofil komponens alkalmazásával peptidkötés enzimes kialakítására olyan esetekben, amikor az alkalmazott enzimek - többek között a CPD-Y - képesek vagy képesnek kell tekinteni azokat a megfelelő kötések hidrolízisére. Andersen azonban igazolta, hogy e kötés szintetizálható klosztripainnal, az addig ismert és közölt egyetlen olyan ezimmel, amely ilyen aktivitással rendelkezik.

Az enzimek - hidrolítikus sajátságaiknak megfelelően - azonos hatásmechanizmusú és azonos szubsztrátum-specifitású főcsoportokra oszthatók; várható, hogy az ilyen enzimek gyakran rendelkeznek kölcsönösen egységes, minőségileg szintetikus jellegű tulajdonságokkal. Ha egy ilyen főcsoportba tartozó valamilyen enzimet hatásosnak találunk egy konkrét képletben egy bizonyos kötés képzésére, ebből gyakran azt a következtetést vonhatjuk le, hogy ugyanahhoz a csoporthoz tartozó más enzimek is képesek lehetnek ugyanazon kötés kialakítására.

A fenti tényekre való tekintettel egyes igénypontokban meghatározzuk a különböző kötéstípusok képzésére alkalmazható enzimkategóriákat, és más, megfelelő igénypontokban meghatározzuk azo · » « ·*· «·« ♦ · β » · « · · «

- 33 kát a főcsoportokat, amelyekhez az alkalmazható, valamint előnyösen alkalmazható enzimek tartoznak.

E főcsoportokra való felosztás jobb megértése végett az alábbiakban számos példát adunk meg, amelyekben az I. táblázatban feltüntetett rövidítéseket alkalmazzuk az egyes enzimek megnevezésére. E magyarázat és az alábbi, konkrétabb vizsgálatok a tapasztalt szakember számára lehetővé teszik az egyes kapcsolási reakciókban alkalmazható enzimek kiválasztását, az adott karboxil- és aminkomponenstől függően.

A T, Al-I, AC, LC és TB szerin-endoproteázok, valamint a CL tiol-endoproteáz aktivitással rendelkeznek az S^-helyzetű bázisos aminosavakkal szemben; a CL, TB és AC enzimek legtöbbnyire az arginilcsoportra specifikusak, míg az Al-I és LC enzimek leginkább lizil-specifikusak. A P, CP, B és F tiol-endoproteázok a növényi eredetű tiol-endoproteázok olyan csoportjába tartoznak, amelyek hasonló S|-specifitást mutatnak pozitív töltésű aminosavak iránt, azonban ezt erősen befolyásolják S₂~helyzetű hidrofób csoportok.

A konkrét összetételtől függően, ezek az enzimek tehát képesek az A-B vagy B-C kötés kialakítására; és felhasználhatók az R-^-A kötés bevezetésére, ha az A-tól és B-től eltérő, adott esetben hidrofób csoporttal szubsztituált bázisos aminosavmaradékot jelent.

A papain enzimcsoport felhasználható továbbá az E-R₂ kötés bevezetésére, mivel D hidrofób aminosavmaradék.

A CT, S és TV szerin-endoproteázok az S^-helyzetű hidrofób aminosavakra hatnak, ezért felhasználhatók C-D beépítésére, ha C hidrofób csoporttal védett aminosavmaradék. Ha C védőcsoport nélküli alakban van, akkor a V8 enzim alkalmazható, mivel elsősorban ·« »· ·*·· » *·· • ♦ > · ·«· 4 · * * *♦·* *·.* 2

S^-helyzetű, negatívan töltött csoportokkal szemben hatásos. A TH enzim mind védett, mind védőcsoport nélküli C esetén alkalmazható, azon feltétellel, hogy az S'^-helyzetben lévő D hidrofób .

Mivel D és E hidrofób aminosavmaradékok, ebből következik, hogy az összes fenti enzimek - megfelelő meggondolással minden egyes esetben - felhasználhatók a D-E kötés képzésére mindaddig, amíg az enzimek nem kezdik meg a C-D kötés hasítását is.

Végül, ha C hidrofób védőcsoporttal ellátott, akkor a D-E kötés P, CP, B és F enzimekkel is létrehozható.

Különösen abban az esetben, ha D kisméretű hidrofób aminosavmaradék - például Alá, Val vagy Ile - az egyik legalkalmasabb enzim az elasztáz, a CPD-Y karboxi-peptidázon kívül.

Mivel mind D, mind E hidrofób jellegűek, az E-R₂ kötés P, CP, B, CT, S és TV enzimekkel beépíthető (az utóbbi két enzim különösen észterek esetében alkalmazható). Ha a D-E kötés ellenálló, és Y^ hidrofób aminosavmaradékot jelent, akkor a TH vagy PE enzim alkalmazható. Ha Y5 észtercsoportot jelent, akkor valamilyen lipázt vagy észterázt is alkalmazhatunk.

A fentebb említett enzimeken kívül - a konkrét képlettől és a Z^ jellegétől függően - különböző más enzimek is alkalmazhatók az R^-A kötés bevezetésére. így például a hidrofób S^-et előnyben részesítő szerin-endo-proteázok, például CT, S és TV alkalmazhatók, ha hidrofób -védőcsoportot tartalmazó, D-től eltérő aminosavmaradékot jelent. Ha Z^ acetilezett aminosavmaradék, akkor NP alkalmazható; és ha Z^ nem védett aminosa vmaradék, akkor megfelelő amino-peptidáz használható, például ha Z^ Pro maradékot jelent, akkor a Pl enzimet alkalmazhatjuk. Ha például Z^ fenoxi35 *f 9999 ·**· ' · ♦ · >·· ··· · · • · · · ♦ ·

4« ·4 ·· 9

-acetil-csoportot jelent, akkor R^-A a Penicillium V aciláz enzim segítségével vezethető be.

A teljes megvilágítás céljából - a fenti némileg általános formában vizsgált kritériumok után, amelyek alapján az alkalmazható enzimeket megválaszthatjuk - az alábbiakban az egyes kötéstípusokat részletesen kifejtjük. A fő hangsúlyt azokra az enzimekre helyezzük, amelyek - a különböző stratégiáktól függően - az egyes lépések szempontjából előnyösek.

Az A és B közötti kötés kialakítására alkalmas enzimek példáiként hangsúlyozzuk a következő endoproteázok különös jelentőségét: klosztripain, papain és kimopapain, különösen akkor, ha Cbz-, Boc- vagy AcPhe- csoportot jelent; továbbá a tripszin, különösen, ha Y₂ az észtercsoporttól eltérő, vagy ha a B-C kötést már előzőleg megvalósítottuk. A klosztripain előnyösen alkalmazható, ha B jelentése Pro (lásd például A.J. Andersen idézett közleményét). Az I)-IV) stratégiák megvalósításában az A-B kötést úgy alakítjuk ki, hogy exopeptidézők is alkalmazhatók: ezekre példaként szolgál a CPD-Y és CPD-MII, amelyeket a 4 339 534 számú amerikai egyesült államok-beli szabadalmi leírásban ismertetnek. Ez esetben különösen előnyös, ha Y₂ az észtertől különböző. A CPD-MII enzimet leírja többek között K. Breddam ZCarlsberg, Rés. Commun. 51, (1986X7.

A B és C közötti kötés kialakítására előnyösen alkalmazható például a tripszin, különösen akkor, ha előzőleg a C-D kötést már létrehozott, és X^, valamint Y^ egyaránt -OBzl csoportot jelent; a B és C közötti kötés kialakítására a poszt-prolin-specifikus endopeptidáz is alkalmazható, ha B jelentése Pro maradék. Az I), IV), V) és VI) stratégiák megvalósítása során a B-C kötés kialakítására exopeptidázok is alkalmazhatók. Különösen ki kell ··*·

- 36 ·# 4· * · · •·· ··· « ♦ * » · · >· · «· ·« ·· * emelnünk az MI és MII karboxi-peptidázokat, és Y jelentését is figyelembe kell venni, különösen akkor, ha jelentése a H-tól eltérő, és Y-j jelentése -Nl·^ csoport.

A C-D kötés kialakítható például a Drapeau V8 endopeptidázzal, ha jelentése -H; és például kimotripszinnel vagy szubtilizinnel, ha X^ jelentése -H-tól eltérő. A termolizin mindkét esetben alkalmazható. Meglepően kedvező eredmények érhetők el termolizinnel, ha Y^ hidroxilcsoportot jelent. Az I) és III) stratégiák megvalósítása során a C-D kötés létesítése exopeptidázokkal is lehetséges. E helyen különösen kiemeljük az Y és MII karboxipeptidázokat, ezek esetében Y^ hidroxilcsoportot is jelenthet. Lipázok és észterázok szintén alkalmazhatók.

A D-E kötés kialakítható endoproteázokkal, például elasztázzal, ha D például Ile vagy Val maradékot jelent; vagy kimotripszinnel, ha D jelentése Leu, előnyösen akkor, ha Y^ jelentése az észtercsoporttól eltérő, vagy E D-konfigurációjú aminosavmaradékot jelent. A D-E kötés kialakítása valamennyi stratégia megvalósítása során megvalósítható exopeptidázokkal, és e célra minden esetben az Y karboxi-peptidáz alkalmazása előnyös; alkalmazhatunk azonban lipázokat vagy észterázokat is. Ez az enzim különösen előnyös a C-terminális sztereospecifikus módosítására, aminek útján az E-R2 kötés beépítése lehetővé válik. E célra azonban olyan endoproteázokat is felhasználhatunk, amelyek hidrofób aminosavmaradékokra fejtenek ki hatást, ilyen például a kimotripszin és a szubtilizin. Alkalmazhatunk továbbá észterázokat vagy lipázokat is.

Az R|-A kötés bevezethető például piroglutaminázzal, ha jelentése Glp; vagy klosztripain endoproteázzal, ha például ···· ··«« • « • · • · « · ·· (4· • V ··· ··· ♦ · · ·· ·· ·· · jelentése BzArg, és A, valamint B jelentése lizin; vagy papinnal, ha R£-ként hidroxilcsoportot már bevezettünk. Ha jelentése Pro maradék, akkor prolinimino-peptidázt használhatunk; és ha Z·^ acetilezett aminosavmaradékot jelent, akkor N-acil-peptid-hidroláz alkalmazható.

A következőkben részletesebben tárgyaljuk a technika jelenlegi állása szerint ismert enzimes kapcsolási eljárásokat. E kapcsolási eljárások egyes pontjaikon hasonlítanak a találmány szerinti előnyös kapcsolások némelyikéhez, azonban egyetlen esetben sem alkalmazták azokat az (1) általános képletű peptidek szintézisére. így Mitin és mtsai Z~Int. J.Pept. Protein Rec. 23 , 528 (1984)J ismerteti papain felhasználását különböző peptidszintézisek során. Mitin karboxil-komponensként acil-aminosav-alkil-észtereket alkalmaz, gyakorlatilag Bz vagy Z védőcsoportos aminosav-metil-észtereket, például a BzAlaOCH-j, ZGlyOCH^ és BzArgOCH^ komponenseket, ezek közül a legutóbbi megfelel a találmány szerinti Z-^-A-Y^ egységnek. Mitin azonban aminkomponensként mindig aminosavak vagy peptidek amidjait vagy terc-butil-észtereit - például Asp(OH)ValNh^, Vall·^ vagy LeuOtBu komponenseket - vagy nem védett peptideket, például GlyPheLeu vagy PheGly komponenst alkalmaz.

Az aminosavamidok, aminosav-terc-butil-észterek, aminosav-fenil-hidrazidok és a di-, valamint tripeptidek aminkomponensként (nukleofilként) való alkalmazása igen elterjedt az enzimes peptidszintézisben. Ennek oka valószínűleg az, hogy - ha csak lehetséges kívánatos egy jól definiált kapcsolási termék minden kétséget kizáró szintézise. Ez nem várható, ha az aminkomponens például egy egyszerű aminosav-alkil-észter vagy peptid, mivel az így kapott kapcsolási termék gyakran ismét az alkalmazott enzim

.·· .·· ··· ··· • · · · ·· «· »··» ··<« • ·

szubsztrátuma. Ennek következtében a kapcsolási termék tovább reagál, új termék képződik, és polimerizációs folyamat indul meg. Ilyen keverékből nehéz az egyes termékek elkülönítése, eltekintve attól a ténytől, hogy a kívánt kapcsolási termék hozama csekély. Másrészt, ha karboxil-védőcsoportot tartalmazó aminkomponenseket, például amidokat vagy védőcsoport nélküli amidokat használunk, akkor olyan kapcsolási termékeket kapunk, amelyek a fentebb említett másodlagos hidrolízissel szemben sokkal stabilisabbak, mert azok a peptidek, amelyek karboxi-terminálisan amidformában vannak, gyakran 1000-10000-szer lassabban alakulnak át, mint a megfelelő észter-szubsztrátum.

Ennek alapján különösen meglepő, hogy papainnal kapcsolás érhető el ZArg-alkil- vagy benzil-észterek és HLys-alkil- vagy benzil-észterek között, mivel a papain specifitást mutat a bomlástermék karboxi-végződésén lévő bázisos aminosavakkal szemben, s így fennáll a képződött ZArgLys-észter szekunder hidrolízisének a veszélye ZTzuzuki és mtsai: O.Biochem. 88, 669 (1980); valamint Morihara: Tibtech 168 (1987)7. Ennek következtében nem volt várható, hogy a lizin az oldallánc védelme nélkül alkalmazható. Egészben véve meglepő, hogy ZArgLys-alki1-észterek, különösen a ZArgLysOEt könnyen, magas hozamokkal, olcsó kiinduló anyagokból szintetizálhatok.

Ezek az alkil-észterek, főként a ZArgLysOEt, különösen értékes Ζ·^-ΑΒ-Υ2 típusú közbenső termékek, amelyek az I), II), III) és IV) stratégiák megvalósításában alkalmazhatók.

A fentebb említett, oldalláncban nem védett közbenső termék különösen előnyösnek bizonyult az észterolítikus, enzimes, szukcesszív kapcsolás során, különösen az endoproteázok segítségé53 π

vei - például tripszinnel /II) és III) stratégia/ - végzett fragmentum-kapcsolás és a lépésenként végzett kapcsolás /IV) stratégia/ megvalósítása során.

Az alábbi A. példában /II) stratégia/ megmutatjuk, hogy

Λ különösen meglepő módon a ZArgLysOEt (Z|-AB-Y₂) tripszin jelenlétében HAspValTyrNH₂ (CDE-Y^) fragmentummal 50 %-os hozammal, a C maradék oldalláncának védelme nélkül kapcsolható. Ez azért meglepő, mert Oka és Morihara /J.Biochem. 87, 1057 (1977)/ kimutatták, hogy a BzArgOEt a HGluNH₂-vel tripszin jelenlétében mindössze 11 % hozammal kapcsolható.

Továbbá az E. példában /III) stratégia/ megmutatjuk, hogy a ZArgLysOEt a nem védett HAspValOEt (CD-Y^) fragmentummal tripszin jelenlétében 65 % hozammal kapcsolható.

Meglepő továbbá az is, hogy a bromelain endoproteáz, amely

- mint fentebb említettük - ugyanabba az enzimkategóriába tartozik, mint a papain, és primer specifitása is a papainéval azonos - képes a ZArgLysOEt, mint cZ-etil-észter hidrolizálására anélkül, hogy az Arg és Lys maradékok közötti peptidkötés bármilyen hasadást szenvedne. Ennek alapján - amint ezt az E. példában illusztráljuk a bromelain felhasználható a ZArgLysAspValOEt fragmentum-kapcsolásos szintézisének katalízisére, aminek során 63 % hozam érhető el mellékreakciók nélkül.

A C. példában /IV) stratégia/ igazoljuk, hogy a ZArgLysOEt HGlu(OBzl)₂~val is kapcsolható, amely utóbbi könnyen és olcsón előállítható /különösen a HGlu(OBzl)OH-va1 összehasonlítva/. E kapcsolási reakció tripszin jelenlétében valósítható meg, és ZArgLysGlu(OBzl)£ tripeptidet eredményez, amely érdekes közbenső termék.

Mindkét védőcsoportot katalitikus hidrogénezéssel távolítottuk el, és az így kapott ArgLysGlu pepiidet jellemeztük (azonosítottuk).

Szukcesszív kapcsolási reakcióban azonban előnyös az X-j oldallánc-védőcsoport megtartása - nem szintetikus okokból, mint a klasszikus kémiai szintézisek során, hanem - mivel az oldallánc-védőcsoport következtében a választott reakciókörülmények között elérhető, hogy a kapcsolási termék a reaktánsokkal ellentétben csapadék formájában kiválik. A csapadék kiválása azt jelenti, hogy a kapcsolási termék elkülönül a reakcióterméktől, ennek következtében a reakció egyensúlya a szintézis irányában, tehát a kívánt termék irányában eltolódik. Az enzimes szintézis elegáns jellege tehát abban, áll, hogy a ZArgl_ysGlu(OBzl)₂ védett tripeptidet észteráz-aktivitással rendelkező alkalmas proteázzal - az adott esetben szubtilizinnel - kezeljük, s így az -benzil-észtert szelektíven hasítjuk, miközben melléktermék nem képződik. A kapott termék tisztítása nélkül a reakcióelegyet egy másik alkalmas proteázzal - ebben az esetben termolizinnel - elegyítjük, és kialakítjuk a C-D közötti kötést.

A C és D közötti kötés kialakítására előnyös a termolizin alkalmazása, tekintet nélkül arra, hogy a II) stratégia szerinti ZjC(X₃) + DE-Y^ kapcsolási reakció, vagy a IV) és V) stratégiák szerinti Z^ABC(X^) + DE-Y^ kapcsolást, vagy a III) stratégia szerinti Z-jC(X-j) + D-Y^ kapcsolást hajtjuk végre.

Isowa és mtsai /Bull. Chem . Soc . Jap. 52, 796 (1979).7 közük, hogy N-védőcsoportos, oldalláncban védett Asp és Glu például ValOMe, LeuOMe, IleOMe és ValNl·^, LeuNH₂ és MetNH₂ komponensekkel termolizin jelenlétében kapcsolható. Továbbá Isowa és mtsai /Tetrahedron Letters 28, 2611 (1979)[valamint a 0 099 585 számú publikált európai szabadalmi bejelentésben/ N-védőcsoportot tartalmazó, oldalláncban nem védett Asp és Glu komponenseket L-Phe-alkil-észterekkel kapcsoltak, s így minden esetben a dipeptid és a Phe-alkil-észter addíciós termékéhez (sójához), például Z-L-Asp-L-PheOMe’L-Phe-OMe sótermékhez jutottak. Amennyiben racém szubsztrátumokat vagy nukleofileket alkalmaztak, akkor a kondenzációs reakcióban csak az L-izomerek vettek részt, és így az L-L dipeptidek képződtek, míg a sók aminkomponense majdnem kizárólag D-izomerből állt. E szerzők azonban csupán dipeptidek szintézisét és az optikai rezolválás lehetőségét vizsgálták, és a kapott hozamok lényegesen alacsonyabbak, mint a találmány szerinti eljárással elért hozamok, összehasonlításra alkalmas szubsztrátumok kés nukleofilek alkalmazásakor. Isowa és munkatársai a Z(0Me)Glu(0Bzl)0H komponenst HValNl·^ komponenssel reagáltatva 66 % hozamot értek el, míg Oka és Morihara ZJ.Biochem. 88, 807 (1980)7 ZPheOH-t HValNH^-vel reagáltatva 49 % hozamot kaptak. Figyelemre méltó e hozamok összehasonlítása a találmány szerinti eljárással kapható 90 % körüli értékkel.

A termolizin erősen sztereospecifikus mind az S^-helyzettel (Isowa és mtsai), mint különösen az '-helyzettel szemben

ZŰakubke és mtsai: Die Pharmazie, 37, 89 (1982)7- Ebből a szempontból meglepő, hogy - amint az alábbi Q. példában bemutatjuk a Z-D-Asp(0Bzl)0H D-aminosavszármazék mint szubsztrátum beépítése lehetséges az S^-helyzetben egy termolizinnel katalizált reakció útján; meglepő az is - amint ezt az alábbi S. példában igazoljuk -, hogy az S?'-helyzetben D-aminosavat tartalmazó HPheD-TyrNl·^ nukleofilként analóg eljárással beépíthető.

Morihara és mtsai /Biochem. Biophys. Rés. Comm., 84, 95 (1978X7 kimutatták, hogy a termolizin képes két hidrofób aminosav transzpeptidálására. Jakubke és mtsai (az idézett közleményben) leírták, hogy mind a Val, mind a Tyr a termolizin szubsztrátumaként szerepelhet. Ennek alapján nem volt előre látható, hogy DE-Y^ típusú aminkomponensek - például a ValTyrNH₂ - problémamentesen kapcsolható a C komponenssel (Asp vagy Glu), mivel az volt várható, hogy a Val és Tyr közötti kötés felhasad, és ennek következtében a transzpeptidálás veszélye áll fenn; hasonlóképpen meglepő, hogy - amint ezt az alábbi R. példában leírjuk - HTyrTyrOEt Glu-val kapcsolható volt transzpeptidálás nélkül; nem utolsó sorban azért is meglepő ez a tény, mert - mint ezekben és más példákban - a Val és Tyr hasonló reakciókban a nukleofil szerepét is játszhatja. Meglepő módon kitűnt azonban, hogy a ValTyrNl·^ az Asp vagy Glu termolizinnel végzett kapcsolása során aktiváló nukleofilként hat, s így lehetővé válik a termolizin alkalmazása rendkívül csekély mennyiségben; meglepő továbbá, hogy a ValTyrNl·^ termolizin jelenlétében hidrolízissel és/vagy transzpeptidálással szemben ellenálló. A ValTyrNH₂ katalitikus hatása 10-100-szor erősebb, mint más, rövidebb méretű nukleofileké, s ennek megfelelően az enzim kívánt mennyisége csökken.

Ennek következménye az a további előny, hogy a kapcsolási reakcióban viszonylag szennyezett ValTyrNH₂, például az alábbiakban részletesen leírt kémiai kapcsolással kapott termék alkalmazható. Ennek következtében a ValTyr nukleofilban a Val bizonyos mértékű racemizálódása megengedhető, mivel a következő, kapcsolási lépés során a termolizinnel az ilyen szennyezések kiküszöbölhetők.

Az irodalomból ismert /Matos és mtsai: Biotechnology Letters

9_, 2 23 (1987)./, hogy LD-konfigurációjú dipeptidek is szintetizál- 43 hatók védett, töltésmentes aminosav-észter és D-aminosavszármazék lipázzal katalizált reakciója után, például D-AlaOiPr és D-Val-OBzl komponensekkel. E reakciók megvalósítása során azonban egyszer sem kísérelték meg hosszabb peptidek szubsztrátumként való alkalmazását vagy töltést viselő aminosavakat tartalmazó szubsztrátumok használatát - például csupán Arg, Lys, Asp és Valin komponenseket alkalmaztak nukleofilként észterformában.

Ennek alapján nem volt várható, hogy - amint ezt az alábbi

D. példában megmutatjuk - hosszabb, bázisos és savas jellegű, nem védett aminosavak szubsztrátumként alkalmazhatók valin-észter, mint aktiváló észter részvételével. A D-ValOBzl komponenst előzőleg nukleofilként alkalmazták. Mivel az így kapott termék stabilis, nem volt várható, hogy L-Val-észter-szubsztrátumok különösen alkalmasak egyéb D-nukleofilek beépítésére is.

Ez a felismerés lehetővé teszi egy szintetikus probléma megoldását. Az irodalomból ismert (Thorbek és Widmer, Peptides, idézett mű, 359.old.), hogy a kimotripszin képes ugyan D-nukleofilek kapcsolására, valin-szubsztrátumokra azonban hatástalan ZFruton: idézett közlemény (1982).7; viszont a CPD-Y és az elasztáz - amelyek valin-szubsztrá tumok alkalmazása során hatékonyak - egyáltalában nem, vagy csak nagyon kevéssé katalizálják D-aminosavak kapcsolását.

Ismert továbá az irodalomból ZWalter és Yoshimoto: 3ACS 17,

4139 (197 8).7, hogy a poszt-prolin-specifikus endoproteáz az S₂-helyzettel szemben erősen sztereospecifikus. Ennek alapján nagyon meglepő, hogy - amint alább a T. példában igazoljuk - ez az enzim katalizálja a ZDArgProAspValOEt szintézisét.

A találmány szerinti eljárást az alábbi, nem korlátozó jellegű példákban részletesen ismertetjük. Az eljárások megvalósítása során az alábbi általános módszereket alkalmazzuk.

···· ···« • ··

- 44 Általános módszerek

A példákban leirt valamennyi reakció menetét fordított fázisú elemző HPLC módszerrel követtük, és erre 50 mM trietil-ammónium-foszfátot tartalmazó 3,0 pH-értékü eluáló rendszereket alkalmaztunk, amelyek gradiens szerint növekvő koncentrációban 0-80 % acetonitrilt tartalmaztak. Az eluálás menetét UV-detektorral követtük a 220-280 nm tartományon belül, megfelelő hullámhosszon. A szintéziseket - ha erre vonatkozóan külön megjegyzést nem teszünk - szobahőmérsékleten valósítottuk meg.

Az enzimes szintézisek során a reakciót kezdettől fogva és 9 közötti pH-tartományon belüli, megfelelő értéken rögzítettük, és ezt az értéket alkalmas bázis folyamatos hozzáadásával a reakció teljes időtartamán át megtartottuk. Ha erre vonatkozó egyéb megjegyzést nem teszünk, akkor a termékeket fordított fázisú HPLC alkalmazásával izoláltuk, és liofilizálás utján hoztuk szilárd formába.

Az izolált termékeket 6 M koncentrációjú sósavoldattal 110 °C hőmérsékleten vákuumban 16-36 órán át hidrolizáltuk, majd aminosavanalizissel (az alábbiakban rövidítve: AAA) azonosítottuk.

Az alábbi példákban a Z betüszimbólum jelentése benzil-oxi-karbonil-csoport; a Cbz szimbólumot az igénypontokban használjuk abból a célból, hogy az általában Z^, Z^ stb.-vei jelölt védőcsoportokkal lehetséges összetévesztést elkerüljük.

A. példa

ZArgLysAspValTyrNHz (Z-timopentin-amid) szintézise a

II) stratégia szerint (lásd az 1) reakcióvázlatot)

1. lépés: ZArgLysOEt.2Ac0H előállítása

a) ZArgOMe.HCl előállítása ···· ··· · • ·· » •· •·· ···* ·

- 45 Reakcióegyenlet:

ZArgOH ü,Cl/MeOH _> ZArgOMe.HCl

Rel. mól.- Rel. mól.-tömeg tömeg

308,3 358,8

69,5 g ZArgOH-t (225 mmol) 360 ml száraz metanollal szuszpendálunk, és száraz-hidrogén-kloridot vezetünk be hűtés közben megközelítőleg 2 M HC1 koncentráció eléréséig. E közben a kiinduló anyag feloldódik. Ezután további mennyiségű hidrogén-kloridot vezetünk be mindaddig, amíg a kon verzió az analitikai HPLC vizsgálat szerint körülbelül 95 Vban lejátszódik. A reakcióelegyet keverés közben szobahőmérsékleten körülbelül 2 órán át állni hagyjuk, majd vákuumban ismételten bepároljuk, és a bepárlások ismétlésekor a maradékot száraz metanolban ismét oldjuk. így amorf, üvegszerü termékként 78,4 g (97 %) hozammal kapjuk a kívánt terméket.

b) ZArgLysOE-t.2AcOH előállítása papainnal katalizált kapcsolás utján

Reakcióegyenlet:

ZArgOMe.HCl + HLysOEt.2HCl J-P^ain---> ZArgLysOEt.2Ac0H

358,8 247,3 584,5

264 g (1,07 mól) L-lizin-etil-észter dihidrokloridot

570 ml víz és 500 ml metanol elegyében oldunk, és 1,6 g EDTA-NA.H2Ot adunk hozzá, majd a pH értékét 290 ml nátrium-hidroxid oldat hozzáadásával 8,5-re állítjuk. Ezután hozzáadjuk 77,0 g előbbi lépésben készült ZArgOMe.HCl (215 mmol) 820 ml metanolos oldatát, a pH értékét ismét 8,5-re állítjuk, és az oldathoz 0,75 g 2-merkapto-etanolt adunk. Ezután megindítjuk a reakciót 0,1 g papain hozzá• · · · · ·

- 46 adásával, amelyet 2-merkapto-etanol-oldatban előzőleg aktiváltunk. A reakció menetét analitikai HPLC alkalmazásával követjük, miközben a reakcióelegyet szobahőmérsékleten keverjük. Körülbelül 2 óra múlva a hozam megközelítőleg 80 %, a konverzió meghaladja a 95 %-ot. Ekkor a reakciót a pH-érték 2,5-re csökkentésével leállítjuk, és a keveréket tisztítjuk. A HLPC szerinti hozam 80 % (ezt 254 nm hullámhosszon határoztuk meg).

c) ZArgLysOEt. 2AcOH tisztítása

Az előző lépésből származó reakcióelegyből a metanolt lepároljuk, és a terméket RP-HPLC-C18 oszlopokon tisztítjuk. Az oszlopokat 50 nM AcOH koncentrációjú vizes oldattal eluáljuk, amelyben az alkohol koncentrációját gradiens szerint növeljük. A tiszta terméket tartalmazó frakciókat egyesítjük, és száraz etanol hozzáadásával ismételten szárazra pároljuk. így a tisztított terméket amorf, üvegszerü alakban 90,5 g =72 %) hozammal kapjuk. Elemezés:

AAA: Arg: 1,02

Lys: 0,99

d) ZArgLysOEt szintézise klosztripainnal katalizált kapcsolás utján

Reakcióegyenlet:

ZARgOMe.HCl + 2HCl.LysOEt _^KlosztriP^ain > ZArgLysOEt

358,8 247,3 464,5

2,47 g (10 mmol) LysOEt.2HCl-t 12 ml viz és 2 ml 99,9 Vos etanol elegyében oldunk, 0,22 g kalcium-acetátot és 31 mg DTT-t adunk hozzá, a pH értékét 0,95 ml TEA hozzáadásával 8,5-re állítjuk, majd 0,72 g ZArgOMe.HCl-t (2 mmol) teszünk hozzá, és a pH értékét 0,25 ml TEA hozzáadásával 8,5-re állítjuk. Ekkor 20 ml ·» ···· ···· • ♦ · ♦ • ·· · · · * · ·· ·· ·· ·

- 47 vizet adunk hozzá, és a reakciót 2 mg előzőleg DTT oldatban aktivált 2 mg klosztripain hozzáadásával megindítjuk. A reakció menetét analitikai HPLC vizsgálattal követjük: 20 óra elmúltával a szubsztrátum teljes mennyisége átalakul. A HPLC szerinti hozam 90 % (meghatározása 254 nm-en).

2. lépés: HC1.HValTyrNH₂ előállítása

a) BocValONSu előállítása

Reakcióegyenlet:

BocValOH + HONSu ——-----> BocValONSu

217.3 115,3 314,4

76,5 g (352 mmol) Boc-L-valint 850 ml diklór-metánban addig pépelünk, míg csaknem teljesen nem oldódik. Ekkor 38,0 g (330 mmol) N-hidroxi-szukcinimidet adunk hozzá, miközben jégfürdővel hütve 0 °C-on tartjuk; majd a reakciót 80,0 g (288 mmol) DCC 150 ml jéghideg diklór-metánnal készült oldatával megindítjuk, a reakcióelegyet 1 órán át 0 °C-on, majd másnapig 4 °C hőmérsékleten állni hagyjuk. A keverék eközben oldattá alakul. A HPLC elemzés szerint a kiinduló anyag mintegy 20 óra alatt átalakul. A reakcióelegyből a képződött diciklohexil-karbamidot (DCU) kiszűrjük, a szürletet szárazra pároljuk, és ebben a formában alkalmazzuk az alábbi lépésben. A HPLC szerinti hozam 100 %.

b) BocValTyrNH₂ előállítása

Reakcióegyenlet:

NMM BocValONSu + HTyrNH₂.HCl --—------BocValTyrNH₂

314.4 216,7 379,5

110,7 g (352 mmol) előző lépésben előállított BocValONSut 1,0 liter DMF-ban oldunk, 114,5 g (528 mmol) L-tirozinamid hidrokloridot adunk hozzá, és a reakciót 59 ml N-metil-morfolin ♦ · * · « · ····

- 48 hozzáadásával megindítjuk. A reakcióelegyet keverés közben, szobahőmérsékleten állni hagyjuk, és a reakció előrehaladását analitikai HPLC vizsgálattal követjük. Mintegy 90 perc eltelte után 100 ml ecetsavat adunk hozzá, egy ideig állni hagyjuk, majd szűrjük, és a szürletet vákuumban szárazra pároljuk. így a b) lépés cim szerinti termékét a HPLC szerinti 95 % hozammal kapjuk (meghatározás 254 nm-en).

c) BocValTyrNHz izolálása

A lepárlási maradékot absz. etanolban ismét feloldjuk, és a terméket viz hozzáadásával jéghütés közben kicsapjuk, szűrjük, mossuk, és szárítjuk. így a kívánt terméket 113,5 g (85 %) hozammal nyerjük.

d) HC1.HValTyrl·^ előállítása

Reakcióegyenlet:

BocValTyrNH₂ --------7 HC1. HValTyrNH₂

379,5 315,9

113,5 g (299 mmol) előbbi c) lépésből származó száraz BocValTyrNH₂ terméket 2000 ml 2,0 M száraz hidrogén-kloridot tartalmazó etil-acetátban szuszpendálunk, és keverés közben 2 órán át állni hagyjuk. Az analitikai HPLC vizsgálat szerint a reakció ekkor leáll. Az elegyet vákuumban bepárolva a kívánt terméket 94,4 g (100 %) hozammal kapjuk.

Elemzés:

AAA: Val: 1,08

Tyr: 0,92

e) HC1.HValTyrNH₂ szintézise elasztázzal katalizált kapcsolás utján

Reakcióegyenlet:

♦ * · · · · ···· • · » · V· « · · · · * · « ·» ·♦ ·«A

- 49 ZValOMe + HC1. HTyrNH₂--^.^Sztáz > ZValTyrNH₂ ^H2^/Pd~^Cj

265,3 216,7413,4

->HCl.HValTyrNH₂

315,9

ZValTyrNH₂ előállítása

2,16 g (10 mmol) HTyrNH₂.HCl; 3,4 ml DMF, 4 ml 0,5 M

Tris oldat és 0,18 g kálium-klorid keverékét nátrium-hidroxid oldattal 8,6 pH-ra állítjuk. Az oldat térfogatát viz hozzáadásával 18 ml-re egészítjük ki, 0,3 g (1,1 mmol) ZValOMe-t teszünk hozzá, majd a reakciót 2,5 ml olyan oldattal indítjuk meg, amely 5 ml vízben 50 mg elasztázt tartalmaz. A reakció menetét analitikai HPLC vizsgálattal követve megfigyelhető, hogy 2 nap elmúltával mintegy 35 % kívánt termék képződik. A hozam a HPLC elemzés szerint 35 % (meghatározás 254 nm-en).

HC1.ValTyrNH₂ előállítása

Az előző folyamatból RP-HPLC segítségével izolált terméket oldatba visszük, hozzáadunk 10 tömegVos csontszenes palládium katalizátort, majd Parr-készülékben 2 mólegyenérték HC1 jelenlétében, 300 kPa hidrogénnyomáson hidrogénezzük. Ezután a reakcióelegyet szűrjük, és bepároljuk.

3. lépés: HAspValTyrNH₂ előállítása

a) ZAsp(0Bzl)ValTyrNH₂ előállítása

Reakcióegyenlet:

ZAsp(0Bzl)0H + HCl.HValTyrNH₂ termolizin^ zAsp(0Bzl)ValTyrNH₂

357,3 315,9 618,7

10,5 g (33,2 mmol) HC1.HValTyrNH₂-t 90 ml viz és 8 ml

DMF elegyében oldunk, 1,82 g kalcium-klorid-hexahidrátot és 0,5 g Tris-t adunk hozzá, és az elegy pH-értékét nátrium-hidroxiddal * · >·»« ···· ·♦ « · * » »β » ·«« « · • · * · · · · »· ♦· «· »

7-re állítjuk, majd 5,98 g (16,7 mmol) N-X-Z-L-aszparaginsav-(β-benzil)-észter 34 ml DMF-ban készült oldatát adjuk hozzá, és a pH értékét ismét 7-re állítjuk. Ekkor a reakciót 14 ml vízben oldott 47 mg termolizinnel megindítjuk. Rövid idő múlva a termék kicsapódása megkezdődik.a reakcióelegyet keverés közben szobahőmérsékleten körülbelül 1 napig tartjuk, s ekkor az analitikai HPLC vizsgálat megfelelő konverziót mutat. A pH értékét alkalmilag sósavoldat hozzáadásával csökkentjük. A terméket szűrjük, előbb DMF-viz eleggyel, majd 50 mM ecetsav oldattal mossuk.

Az oldathoz szilárd alakban további 4,06 g ZAsp(0Bzl)0H-t (11,4 mmol) adunk, a pH értékét folyamatosan 7-re szabályozzuk. Rövid idő elmúltával ismét csapadék képződik, amelyet néhány nap múlva szűrünk, és a fentiek szerint mosunk, majd az oldatot bepároljuk, hosszabb ideig állni hagyjuk, és további 20 mg termolizint adunk hozzá. így a HPLC vizsgálat szerint a ZAsp(0Bzl)0H mintegy 90 %-os konverzióját érhetjük el. A kiszűrt csapadékot közvetlenül használjuk a következő lépésben. HPLC szerinti hozam 90 % (meghatározás 254 mn-en).

Elemzés:
AAA: Asp:	1,10
Val:	1,03
Tyr :	0,86

b) AspValTyrNH₂ előállítása

Reakcióegyenlet:

ZASp(0Bzl)ValTyrNH₂ ^H2^/Pd'^C _y HASpValTyrNH₂

618,7 394,4

Az előző lépésben kapott kiszűrt csapadékot, amely körülbelül 15,5 g (25 mmol) ZAsp(0Bzl)ValTyrNH₂-t tartalmaz, ** ··♦· ♦ ♦··

- 51 • 4 • 4 * · *4· *44 · · * · » * · · *

175 ml DMF-ban szuszpendáljuk, és 25 ml ecetsavat és egy kevés sósavoldatot teszünk hozzá. Ezután 2 ml vízben szuszpendált 0,15 g 10 %-os csontszenes palládiumkatalizátort adunk hozzá, és az elegyet Parr-készülékben 300 kPa nyomáson hidrogénezzük, amig az analitikai HPLC vizsgálat szerint a reakció teljessé nem válik.

Ezután a katalizátort kiszűrjük, mossuk, és az oldatot bepároljuk.

A HPLC szerinti hozam 98 % (meghatározás 254 nm-en).

Elemezés:

AAA: Asp: 1,00

Val: 1,02

T y r: 0,98

c) ZAspValTyrNH₂ előállítása oldalláncban védőcsoportot nem tartalmazó kiinduló anyagokból

Reakcióegyenlet:

ZAsp(0H)₂ + HCl.HValTyrNH₂ -Ϊ£^{Γίηο11ζ1π}___> ZAspValTyrNH₂

267,2 315,9 528,6

20,0 g (63 mmol) HC1.HValTyrNH₂-t 190 ml vízben oldunk, hozzáadunk 0,61 g Tris-t és 1,86 g kalcium-klorid-dihidrátot, a pH-t nátronlugoldattal 7-re állítjuk, és ezen az értéken tartjuk, miközben 8,45 g (32 mmol) N-o<-Z-aszparaginsavat adagolunk hozzá. Az elegy térfogatát 20 ml vízzel kiegészítjük, majd a reakciót 2 ml vízben oldott 48 mg termolizin hozzáadásával megindítjuk. A reakcióelegyet keverés közben szobahőmérsékleten 5 napig tartjuk, ezalatt a kívánt termék csapadék alakjában kiválik. Ekkor az analitikai HPLC vizsgálat szerint a konverzió 85 %-os.

Λ 278 nm-en mért extrinkció 254 nm-en mért extinkcióhoz viszonyított aránya arra utal, hogy a kapott termék a Z és Tyr kromofórokat 1:1 arányban tartalmazza.

·· ··«« ··*· • · < · ··· »*t · ♦ » · » · 4 · 4 «· ·· ·· »

A HPLC szerinti hozam 85% (meghatározás 254 nm-en).

ZAspValTyrNl·^ izolálása

A vizes reakcióelegyet az üledékkel együtt etil-acetáttal extraháljuk, a terméket szűrjük, vízzel mossuk, majd ismételten száraz etanolban oldva újra bepároljuk. így a kívánt terméket 1,35 g (80 %) hozammal kapjuk.

A termék katalitikus hidrogénezés utján AspValTyrNP^-vé alakítható.

4. lépés: ZArgLysAspValTyrNHz.AcOH szintézise fragmentum-kapcsolás utján

Reakcióegyenlet:

ZArgLysOEt.2AcOH + HAspValTyrNl·^ —tripszin_^ ZArgLysAspValTyrNh^.AcOH

584,5 394,4 873,0

2,6 g guanidin hidrokloridot megporitunk, összekeverjük mg kalcium-klorid-hexahidráttal, és hozzáadjuk 0,16 g Tris

2,6 ml vízzel készült, közömbösített oldatát. A keverést teljes oldódásig folytatjuk, majd 6,6 ml olyan oldatot adunk hozzá, amely 2,21 g HAspValTyrNh^-t (5,6 mmol) savas DMF-ban oldva tartalmaz, s utána a pH-t 12 n nátronlugoldattal 8,5-re állítjuk. Ezután keverés közben 1,49 g (2,5 mmol) ZArgLysOEt.2Ac0H-t adunk hozzá, és a reakciót 0,18 ml vízben oldott 12 mg tripszinnel megindítjuk. A reakció előrehaladását analitikai HPLC vizsgálattal követjük. Megfigyelhető, hogy 90 perc múlva az átalakulás 95 %-kal nagyobb. Ekkor a pH-t 10 n sósavoldattal 2,0-ra állítjuk, majd az igy kapott keveréket tisztítjuk. A HPLC szerinti hozam 50 % (meghatározás 254 nm-en).

ZArgLysAspValTyrNH£ izolálása

A reakcióelegyet RP-HPLC módszerrel C18-oszlopokon tisztítjuk, eluálószerként alkohol és 50 mM ecetsav keverékét alkal53 •· ···V*· • 9· mázzuk. A tiszta terméket tartalmazó frakciókat egyesítjük,

bepároljuk és liofilizáljuk. így fehér, amorf por alakjában

0,98 g (45 %) hozammal kapjuk a kívánt terméket.

Elemzés:

AAA: Asp: 1,03

Arg: 1,08

Val: 1,00

Tyr: 0,89

Lys: 0,99

B. példa

ZOrnLysAspValTyrNl·^ szintézise a II) stratégia szerint (lásd a 2) reakcióvázlatot)

1. lépés: ZOrnitin-metil-észter előállítása

Reakcióegyenlet:

ZOrnOH _.^HC1/^Me0H ^.ZOrnOMe.HCl

266,3 316,8

2,0 g (7,5 mmol) Cbz-L-ornitint 30 ml száraz metanolban elkeverünk, és 16 ml 7,2 M száraz metanolos hidrogén-klorid oldatot adunk hozzá, majd a keveréket keverés közben 90 percig szobahőmérsékleten tartjuk, miközben a reakció menetét analitikai HPLC vizsgálattal követjük. A reakcióelegyet szárazra pároljuk, majd száraz metanol hozzáadása után vákuumban 40 °C alatti hőmérsékleten ismét szárazra pároljuk. így a kívánt terméket amorf alakban

2,4 g (100 %) hozammal nyerjük.

2. lépés: ZOrnLysOEt.2AcOH előállítása

Reakcióegyenlet:

ZOrnOMe.HCl + HLysOEt.2HCl papain

316,8

247,2

ZOrnLysOEt.2Ac0H

542,5 «4 *4 ···· ·»·« • · « · ··* ··· 9 e • 9 · · · · · ·· ·· ·· ·

8,2 g (33 mmol) lizin-etil-észter dihidrokloridot 19 ml víz és 10 ml metanol elegyében oldunk, és az oldat pH-értékét 3 ml 6 n nátronluggal 7,5-re állítjuk, majd 1,3 ml 0,1 M EDTAnátriumsó oldatot és 1 ml 1 M 2-merkapto-etanol oldatot teszünk hozzá, végül 2,1 g (6,6 mmol) Z-L-ornitin-metil-észter 16,4 ml metanollal készült oldatát adjuk az elegyhez. A pH értékét 6 n nátronluggal 7,5-re állítjuk, majd az elegy térfogatát vízzel 66 ml-re egészítjük ki. A reakciót 0,24 ml 20 mg/ml koncentrációjú papinoldattal indítjuk, amelyet előzőleg 40 percig 40 °C hőmérsékleten 0,3 M 2-merkapto-etanol oldattal aktiváltunk. A reakcó menetét analitikai HPLC vizsgálattal ellenőrizve megfigyelhető, hogy mintegy 40 perc almultával a szubsztrátumnak több mint 95 %-a átalakult, s ekkor a reakciót leállítjuk úgy, hogy az elegyhez 10 n sósavoldatot adva a pH-t 3,0-ra csökkentjük. A hozam az analitikai HPLC vizsgálat szerint 90 % (meghatározás 254 nm-en) a hidrolízissel összehasonlítva. Az igy kapott keveréket tisztítjuk.

ZOrnLysOEt.2AcOH tisztítása

A fentiek szerint kapott reakcióelegyből a metanolt vákuumban lepároljuk, és a maradékot vízzel hígítjuk, majd RP-HPLC C18 oszlopra visszük, amelyet előzőleg 50 mM ecetsavval 3,0 pH mellett egyensúlyoztunk. Az eluálást szukcesszív oszloptérfogatu alkohol/ /víz és 50 mM ecetsavban növekvő alkoholtartalom alkalmazásával végezzük. A terméket tartalmazó frakciókat egyesitjük, szárazra pároljuk, és liofilizáljuk. így fehér, amorf por alakjában 2,3 g (64 %) hozammal jutunk a kívánt termékhez.

Elemzés:

AAA: Lys: 1,00

Orn: 1,00

3. lépés: ZOrnLysAspValTyrNH^ előállítása

Kiinduló anyagok: A B. példa 2. lépése szerint előállított ZOrnLysOEt.2AcOH;

H-AspValTyrNH₂ 0,9 M oldatban (előállítása az A. példa

3. lépése szerint).

Reakcióegyenlet:

tripszin

ZOrnLysOEt.2AcOH + HAspValTyrNH₂ * ZOrnLysAspValTyrNH₂.AcOH

542,5 394,5 831,0

2,34 g guanidin hidrokloridot 32 mg kalcium-klorid-hexahidráttal és 2,24 ml 0,5 M Tris oldattal, valamint 1,9 g (4,8 mmol) AspValTyrNH₂-t tartalmazó 5,6 ml savas DMF oldattal összekeverünk, a pH értékét gyorsan 8,5-re állítjuk 1,9 ml 12 n nátronlúggal, hozzáadunk poralakban 1,18 g (2,2 mmol) ZOrnLysOEt.2AcOH-t, majd a reakciót 0,2 ml 0,1 M kalcium-klorid oldatban oldott 11 mg tripszinnel megindítjuk. A reakció menetét analitikai HPLC vizsgálattal követjük; 45 perc eltelte után további 0,4 g (0,7 mmol) ZOrnLysOEt-t és további 11 mg tripszint adunk hozzá (az utóbbit 0,2 ml 0,1 M kalcium-klorid oldatban). 90 perc után a reakció teljessé válik, ekkor a pH-t 2,3 ml 10 n sósavoldat hozzáadásával 2,3-ra csökkentjük. A hidrolízissel összehasonlítva a HPLC szerinti hozam 72 % (meghatározás 254 nm-en).

Z0rnLysAspValTyrNH₂ tisztítása

A reakcióelegyet egy másik sarzzsal - ahol 0,15 g (0,3 mmol) ZOrnLysOEt.2AcOH-ból indulunk ki - egyesítjük (összesen tehát 1.73 g ZOrnLysOEt-ból indulunk ki). Az elegyet hígítjuk, majd RP-HPLC C18 oszlopra helyezzük, amelyet előzőleg 50 mM ecetsavval kiegyensúlyoztunk. Eluálószerként alkohol és víz elegyét, és 50 mM koncentrációjú ecetsavoldatot alkalmazunk, és az alkoholtar• ·

- 56 talmat fokozatosan növeljük. A terméket tartalmazó frakciókat egye sítjük, bepároljuk, és liofilizáljuk. így fehér, amorf por alakjában

1,23 g (56 %) hozammal jutunk a kívánt termékhez.

Elemzés:

AAA: Asp:	1,08
Tyr:	0,94
Val:	0,98
Lys:	0,95
Orn:	1,06

Idegen vagy szabad aminosavakat a termék nem tartalmaz.

A termék jellemzői:

UV-maximum:	275 nm (0,1 n nátronlugban 293 nm)
Acetáttartalom:	8,3 % (HPLC-meghatározással)
Kloridtartalom:	0,05 %-nál kisebb (potenciometrikus titrálással)
Víztartalom:	5,5 % (Kari Fischer meghatározással)

C. példa (szpleninopentin-có-amid)

HArgLysGluValTyrNH₂ szintézise a IV) stratégia szerint (lásd a 3) reakcióvázlatot)

1. lépés: ZArgLysOEt.2AcOH előállítása

E fragmentumot az A. példa 1. lépése szerint állítjuk elő.

2. lépés: ZArgLysGlu(OBzl)₂ előállítása

Reakcióegyenlet:

ZArgLysOEt. 2AcOH + HGlu(0Bzl)₂.HCl —^^%>ZArgLysGlu(0Bzl)₂.2Ac0H

584,5 363,8 865,9

7,63 g (13,00 mmol) ZArgLysOEt.2AcOH-t és 7,9 g (21,7 mmol) HC1.HGlu(OBzl)₂~t 27 ml metanol és 11 ml viz elegyében oldunk, a pH-t vizes nátronluggal 8,0-ra állítjuk, majd a reakciót 0,15 ml

0,1 M kalcium-klorid oldatban oldott 2 mg szarvasmarha-tripszin hozzáadásával megindítjuk. A reakcióelegyet 70 percig szobahőmérsékleten keverjük, miközben vizes nátronlug hozzáadásával a pH értékét 8,0-n tartjuk, és a reakció előrehaladását analitikai HPLC vizsgálattal ellenőrizzük. A konverzió teljes bekövetkezte után a reakciót 6 n sósavoldat hozzáadásával a pH-t 3-ra csökkentve leállítjuk, és az igy kapott elegyet tisztítjuk.

ZArgLysGlu(0Bzl)2 tisztítása

A reakcióelegyet kationcserélő oszlopra visszük, és eluálószerként gradiens szerint növekvő koncentrációjú ammónium-acetá't sósavoldatokat alkalmazunk. Az igy eluált, kívánt terméket tartalmazó frakciókból az oldószert lepároljuk, és a maradékot ecetsavval tiszta oldattá hígítjuk, az igy kapott oldatot RP-HPLC oszlopra visszük, és növekvő alkoholtartalmú 50 mM ecetsavoldatokkal tisztitjuk.Az eluált terméket tartalmazó frakciók analitikai HPLC vizsgálata homogén, tiszta termékre mutat. A hozam 4,2 g (37 %).

Elemzés:

AAA: Glu: 1,01

Arg: 1,05

Lys: 0,94

3. lépés: ArgLysGlu peptid speciális jellemzése

Reakcióegyenlet:

H_?/Pd-C

ZArgLysGlu(OBzl)₂.2AcOH ---------> HArgLysGluOH

865,9 431,5

4,2 g (4,8 mmol) fentebb leirt módon szintetizált ZArgLysGlu(0Bzl)₂-t ecetsav, etanol és viz elegyében oldunk, 10 tömeg% 5 %-os csontszenes palládiumkatalizátort adunk hozzá, és az elegyet másnapig 300 kPa nyomáson Parr-készülékben hidrogénezzük, majd szűrjük.

HArgLysGluOH tisztítása

A fenti oldatot kationcserélő oszlopra visszük, eluálószerként ammónium-acetát oldatot alkalmazunk. A terméket tartalmazó frakciókat egyesitjük, sómentesitjük, majd bepároljuk, és liofilizáljuk. így a kívánt terméket fehér, amorf por alakjában kapjuk. A hozam 2,0 g (96 %, a viz- és acetáttartalomra korrigálva).

E terméket az alábbi elemzési eredményekkel jellemeztük.

Fajlagos forgatóképesség:	/c<_7q4 5 -4,3° (c = 1,5, vízben)
Acetáttartalom:	0,2 % (HPLC meghatározással)
Kloridtartalom:	50 ppm-nél kisebb (ezüst-nitrát próbával)
Víztartalom:	7,9 % (Kari Fischer meghatározással)
Hatóanyagtartalom:	8Θ % (perklórsavas titrálás alapján)

Idegen vagy szabad aminosavak: 0,7 % Phe

AAA:	Glu: 0,99 Arg: 1,09 Lys: 0,92

Tisztasági fok (HPLC alapján): 99,8 % (meghatározás 220 nm-en)

Szekvencia-analízis:

Arg, Lys, Glu = 12 3

4. lépés: HC1.HValTyrNH₂ előállítása

E vegyületet az A. példa 2. lépése szerint állítjuk elő.

5. lépés: ZArgLysGlu(0Bzl)ValTyrNH₂ előállítása

a) ZArgLysGlu(OBzl)OH előállítása

Reakcióegyenlet:

• ·

- 59 ZArgLysGlu(0Bzl)₂.2Ac0H —szubtilizin_^ ZArgLysGlu(OBzl)OH

865,9 655,8

1,08 g (1,2 mmol) ZArgLysGlu(OBzl)₂.2AcOH-t és 0,19 g kálium-kloridot 12,5 ml 0,2 M Tris oldat és 10 ml etanol elegyében oldunk, a pH értékét 2 n nátronluggal 8,0-ra állítjuk, és a reakciót 0,3 ml 5 mg/ml koncentrációjú szubtilizin A oldattal megindítjuk. A reakcióelegyet szobahőmérsékleten 100 percig keverjük, miközben a reakció menetét HPLC vizsgálattal ellenőrizzük. Ennek során a glutaminsav -benzil-észtere szelektíven hidrolizál. Az enzimet úgy inaktiváljuk, hogy a reakcióelegy pH-értékét sósavoldat hozzáadásával 3-ra csökkentjük. A HPLC szerinti hozam 95 % (meghatározás 254 nm-en).

b) ZArgLysGlu(0Bzl)ValTyrNH₂ előállítása

Reakcióegyenlet:

ZArgLysGlu(0Bzl)0H + HC1.HValTyrNH₂ ^termollzln _> ZArgLysGlu(0Bzl)ValTyrNH₂.2Ac0H

655,8 315,9 1037,1

A ZArgLysGlu(0Bzl)0H előző lépésben készült oldatát 6 ml-re bepároljuk (ezzel eltávolítjuk a szerves oldószert), és a maradékhoz 0,97 g (3,1 mmol) HC1.HValTyrNH₂-t és 0,1 g kalcium-klorid-dihidrátot adunk. A hig szuszpenziót 12 ml-re hígítjuk, pH-érfékét 7-re szabályozzuk, majd a reakciót szilárd alakban hozzáadott 15 mg termolizinnel megindítjuk. A maradék oldatlan rész 1 óra elteltével feloldódik, és megindul a termék kicsapódása. Az elegyet keverés közben szobahőmérsékleten másnapig állni hagyjuk, a reakció előrehaladását analitikai HPLC vizsgálattal követjük. A kívánt termék majdnem kvantitatív mennyiségben kicsapódik; a pH értékét 4-re állítjuk, s utána a csapadékot kiszűrjük. így körülbelül 90 % hozammal jutunk a kívánt termékhez.

6. lépés: HArgLysGluValTyrNH₂ előállítása ···· ··«·

1,0 g előbbi lépésből származó sóterméket 600 ml 60 %-os etanolban oldunk, 1 ml ecetsavat és 0,1 g 10 tömeg%-os csontszenes palládiumkatalizátort adunk hozzá, és néhány órán át Parr-készü-

lékben 300	kPa	nyomáson hidrogénezzük. Szűrés után az oldatot be-
pároljuk,	és a	maradékot elemezzük. Az	alábbi	eredményeket kaptuk:
AAA: Glu:	0,97
Arg:	1,06
Tyr :	1,04
Val:	1,03
Lys:	0,91
Idegen vagy szabad aminosavak mennyisége: 0,1	%-nál kevesebb (AAA)

Tisztasági fok (HPLC alapján): 95,6 % (meghatározás 220 nm-en).

A termékben klorid mutatható ki.

D. példa

HArgLysGluValTyrNH₂ (szpleninopentin-íJJz-amid) szintézise az V) stratégia szerint (lásd a 4) reakcióvázlatot)

1. lépés: Boc₂LysGlu(0Bzl)₂ előállítása

Reakcióegyenlet:

BocLys(Boc)0H + HONSu > BocLys(Boc)0NSu + HGlu(0Bzl)₂pTos

346,4 115,3 443,5 499,6

BocLys(Boc)Glu(0Bzl)₉

DME

9,0 g (26 mmol) BocLys(Boc)0H-t és 3,3 g (28,6 mmol) N-hidroxi-szukcinimidet 50 ml DME-ban oldunk, és az oldatot jéggel hütjük. A komponensek reakcióját 40 ml hideg DME-ben oldott 5,9 g (28,6 mmol) diciklohexil-karbodiimid hozzáadásával indítjuk meg. Két óra eltelte után analitikai HPLC vizsgálattal ellenőrizzük a konverzió teljességét, majd az elegyhez 13,5 g (22 mmol) HGlu(0Bzl)₂pTos 60 ml DME-val készült oldatát, majd 3,74 ml (22 • * ···· ····

- 61 mmol) trietil-amint adunk. Az elegyet másnapig szobahőmérsékleten állni hagyjuk, majd további 2,7 g HGluíOBzl^pTos-t teszünk hozzá, valamint ekvivalens mennyiségű trietil-amint adunk hozzá, és a reakcióelegyet további 3 órán át állni hagyjuk, majd szűrjük, bepároljuk, és a maradékot etil-acetátban oldjuk. Az etil-acetátos oldatot rendre előbb nátrium-hidrogén-karbonát oldattal, utána citromsavoldattal, végül konyhasóoldattal mossuk, vízmentes magnézium-szulfáton szárítjuk, szűrjük és bepároljuk.

2. lépés: 2HC1.LysGlu(OBzl)2 előállítása

Reakcióegyenlet:

BocLys(Boc)Glu(0Bzl)₂ ^0Ac > 2HC1.LysGlu(0Bzl)₂

655,8 528,6

Az előbbi lépésből származó bepárlási maradékhoz 50 ml

M koncentrációjú, száraz etil-acetátos hidrogén-klorid oldatot adunk, és az elegyet szobahőmérsékleten 45 percig keverjük, majd bepároljuk, és a terméket etil-acetát és petroléter elegyével kicsapjuk. A csapadékot szűrjük, metanolban oldjuk, és preparativ HPLC-módszerrel RP-HPLC C18 oszlopon tisztítjuk. Eluálószerként 50 mM vizes ecetsavoldatot alkalmazunk, amely gradiens szerint növekvő mennyiségű alkoholt tartalmaz. A terméket tartalmazó frakciókat egyesitjük, és bepároljuk. A hozam 9,0 g (65¾).

3. lépés: ZArgLysGlu(OBzl)2.2AcOH előállítása

Reakcióegyenlet:

ZArgOEt.HCl + 2HCl.HLysGlu(0Bzl)₂ ^tripsz-^ ZArgLy sGlu (OBzl) ₂.2AcOH

372,9 528,6 865,9 g (39,7 mmol) LysGlu(OBzl)_?2HCl-t és 11,1 g (29,8 mmol) ZArgOEt.HCl-t 60 ml DME és 139 ml viz elegyében oldunk, a pH-t TEA-val 8,0-ra állítjuk, majd a reakciót 0,2 ml 1 mM kon•» ·· ··«· ···· • · · · • ♦ * ··· · ·

- 62 centrációju szarvasmarha-tripszin oldat hozzáadásával megindítjuk, és menetét analitikai HPLC vizsgálattal követjük. Két óra eltelte után a reakciót leállítjuk, mert ebben az időpontban a szubsztrátum teljes mennyisége átalakult. Leállítás céljából a pH-t 6 n sósavoldat hozzáadásával 3-ra csökkentjük.

ZArgLysGlu(0Bzl)₂.2Ac0H tisztítása

Az előbbi keveréket szűrjük, és RP-HPLC C18-oszlopokra visszük. Eluálószerként növekvő koncentrációban alkoholt tartalmazó 50 mM ecetsavoldatokat alkalmazunk. így a kívánt terméket tisztán izolálhatjuk úgy, hogy a terméket tartalmazó frakciókat egyesítjük és bepároljuk. A hozam 7,7 g (30 %).

Elemzés:

AAA: Glu: 1,09

Arg: 0,95

Lys: 0,96

4. lépés: Az ArgLysGlu peptid speciális jellemzése

Reakcióegyenlet:

H_?/Pd-C

ZArgLysGlu(OBzl)₂.2AcOH —-------> HArgLysGluOH

865,9 431,5

52,0 g (60 mmol) fentebb ismertetett eljárással szintetizált ZArgLysGlu(OBzl)₂-t ecetsavas etanol-viz elegyben oldunk, 10 tömeg% 5 Vos csontszenes palládiumkatalizátort adunk hozzá, másnapig Parr-készülékben 300 kPa nyomáson hidrogénezzük, majd szűrjük.

HArgLysGluOH tisztítása

A fentebb készült oldatot kationcserélő oszlopra visszük, majd ammónium-acetát oldattal eluálunk. A terméket tartalmazó frakciókat egyesítjük, és sómentesitjük. Bepárlás és liofilizálás után a kívánt terméket fehér, amorf por alakjában kapjuk. A hozam »··· ·*··

26,9 g (95 % a viz- és acetáttartalom szerint korrigálva). Az igy kapott terméket az alábbi elemzési eredményekkel jellemeztük:

Elemzés:

AAA: Glu: 0,96

Arg: 1,06

Lys: 0,99

Idegen vagy szabad aminosavak mennyisége: nem volt kimutatható (AAA)

Fajlagos forgatóképesség: “5,1° (c = 1,5, vízben)

Acetáttartalom:	4,4 % (HPLC meghatározás alapján)
Kloridtartalom:	50 ppm-nél kisebb (az ezüst-nitrát- próba alapján)
Víztartalom:	7,6 % (Kari Fischer meghatározással)
Hatóanyagtartalom:	91,4 % (perklórsavas titrálás alapján)
Tisztasági fok (HPLC	alapján): 99,1 % (meghatározás 220 nm-en)
Szekvencia-analízis:	Arg, Lys Glu = 12 3

5. lépés: ZArgLysGlu(0Bzl)0H, HC1.ValTyrNH₂, ZArgLysGlu(OBzl)ValTyrNH₂ és HArgLysGluValTyrNH₂ előállítása

Ezeket a vegyületeket a C. példa 4.-6. lépései szerint állítjuk elő.

E. példa

ZArgLysAspValTyrNH₂ (Z-timopentin-amid) szintézise a

III) stratégia szerint (lásd az 5) reakcióvázlatot)

1. lépés: ZArgLysOEt.2AcOH előállítása

E vegyületet az A. példa 1. lépése szerint állítjuk elő.

2. lépés: ZAsp(0Bzl)ValOEt előállítása

Reakcióegyenlet:

•·*« ·«·« • · · · » · · · ·· ♦ · ·· · · • · · · · · · • * · ♦ · · ·

- 64 ZASp(0Bzl)0H + HCl.ValOEt > ZAsp(OBzl)ValOEt

357,3 181,7 484,5

45,5 g (250 mmol) HValOEt.HCl-t 50 ml DMF és 390 ml víz elegyében oldunk, Tris-t és 7,6 g (50 mmol) kalcium-klorid-dihidrátot adunk hozzá, és a pH-t megközelítőleg 15 ml nátronlugoldat hozzáadásával 7-re állítjuk. Ezután 200 ml DMF-ban oldott 35,4 g (99 mmol) ZAsp(0Bzl)0H-t adunk az oldathoz, és a pH-t megközelítőleg 20 ml 12 n nátronluggal ismét 7-re állítjuk. A reakciót 250 ml vízben szuszpendált 1,1 g termolizin hozzáadásával indítjuk meg. A termék kiválása 15 perc múlva kezdődik; a reakcióelegyet 3 napon át erélyesen keverjük, majd a csapadékot szűrjük, vízzel mossuk, etil-acetátban oldjuk, és ezt a szerves oldatot vízzel többször mossuk, majd szárazra pároljuk, a maradékot etanol és víz elegyével mossuk, és száraz etanol, majd metanol hozzáadása után bepároljuk. így 47 g (98 %) hozammal olajszerü termékként kapjuk a kívánt anyagot (ninhidrin-próbája negatív).

3. lépés: HAspValOEt.AcOH előállítása

Reakcióegyenlet: Η,/Pd-C

ZASp(0Bzl)Val0Et —--------9 AcOH.HAspValOEt

484,5 320,3 g (97 mmol) ZAsp(08zl)Val0Et-t 1250 ml etanolban oldunk, 250 ml vízzel és 12 ml (202 mmol) ecetsavval elegyítjük, majd 4,7 g 5 tömegVos csontszenes palládiumkatalizátort adunk hozzá vizes szuszpenzió alakjában. Az elegyet Parr-készülékben 300 kPa nyomáson másnapig hidrogénezzük, majd a katalizátort szűréssel eltávolítjuk, és a szürletet - amelynek analitikai HPLC vizsgálata azt mutatja, hogy a konverzió a 99 Vöt is meghaladja - viz hozzáadásával ismételten bepároljuk. így a kívánt •··fc · · · *

- 65 ·· · · · · terméket 31 g (100 %) hozammal nyerjük.

Elemzés:

AAA: Asp: 1,00

Val: 1,00

4. lépés: ZArgLysAspValOEt.AcOH előállítása

a) Tripszin, mint katalizátor alkalmazásával

Reakcióegyenlet:

ZArgLysOEt.2AcOH + AcOH.HAspValOEt -*£^ιρ5Ζ·^ιη· > ZArgLysAspValOEt.AcOH

584,5 320,3 738,8 g (94 mmol) AcOH.HAspValOEt-t szuszpendálunl 61 ml DMF, ml 0,25 M Tris, 0,05 M kalcium-klorid oldat és 8,5 ml 10 n sósavoldat elegyében. Ha oldatlan rész marad, akkor további 5 ml 50 %-os DMF oldatot adunk hozzá, majd a pH-t körülbelül 14 ml 12 n nátronluggal 8,5-re állítjuk. Ezután szilárd alakban 12,0 g (21 mmol) ZARgLysOEt.2AcOH-t teszünk az oldathoz, és a pH-t ismét

8,5-re szabályozzuk. A reakciót 1,8 ml vízben oldott 12,7 mg tripszin hozzáadásával indítjuk meg, és előrehaladását analitikai HPLC vizsgálattal követjük. 50 perc eltelte után a konverzió körülbelül 70 Vos; 90 perc után további 11,9 g (20 mmol) ZArgLysOEt.2AcOH-t adunk hozzá szilárd formában, és további 12,7 mg tripszint adunk hozzá; majd 150 perc eltelte után még 12,5 g (21 mmol)

ZArgLysOEt.2AcOH-t és 30 perccel ezt követően 35 mg viz-DMF elegyben oldott tripszint adunk a reakcióelegyhez. Négy és fél óra után a szubsztrátum konverziója 95 %-os, ekkor a pH-t 10 n sósavoldat hozzáadásával 3,5-re csökkentjük, és utána az elegyet tisztítjuk. A HPLC szerinti hozam 65 % (meghatározás 254 nm-en).

b) Bromelain, mint katalizátor alkalmazásával ·♦ ·· * · ·· · · · <

• ·<·» ····

Reakcióegyenlet:

ZArgLysOEt.2AcOH + HAspValOEt.AcOH bromelain

ZArgLysAspValOEt.AcOH

584,5 320,3 738,8

0,26 g (0,8 mmol) AspValOEt.AcOH-t 0,7 ml DMF, 0,8 /U1 víz és kis mennyiségű sósavoldat elegyében szuszpendálunk. Ha az oldatlan rész marad, akkor 0,088 ml 0,1 M EDTA-t adunk hozzá, majd a pH-t nátronlugoldattal 8,5-re állítjuk. Ezután 117 mg ZArgLysOEt.2AcOH-t (0,2 mmol) adunk hozzá poralakban, és a pH-t ismét 8,5-re szabályozzuk. Ezután 20 ^ul 1 M BME-t és 0,1 ml vizet adunk hozzá, és a reakciót 6 yul 10 mg/ml koncentrációjú bromelain oldattal - amelyet 35 °C hőmérsékleten BME-val előzetesen aktiváltunk - megindítjuk. A reakció időtartama körülbelül 2 óra, a HPLC szerinti hozam 63 % (meghatározás 254 nm-en).

5. lépés: ZArgLysAspValOEt.AcOH tisztítása

Az előző lépésben előállított reakcióelegyet vizzel hígítjuk, és RP-HPLC C18-oszlopokon tisztítjuk. Az eluálást előbb 50 mM ecetsavoldattal, majd gradiens szerint növekvő mennyiségű alkoholt tartalmazó, 50 mM koncentrációjú ecetsavoldatokkal folytatjuk. A tisztított terméket tartalmazó frakciókat egyesítjük, bepároljuk, és liofilizáljuk. így fehér, amorf por alakjában

27,3 g (60 %) izolált hozammal kapjuk a kívánt terméket, amelynek tisztasági foka 254 nm-en HPLC vizsgálattal meghatározva

98,3 %.
Elemzés:
AAA: Asp:	1,00
Arg:	1,05
Val:	1,06
Lys:	0,95

»· ···♦ ·*·· ·* ♦ · « « ··« · ·4 · a • · · « » · ·

6. lépés: ZArgLysAspValTyrNH₂ .AcOH előállítása

Reakcióegyenlet:

ΓΡΠ-Υ

ZArgLysAspValOEt,AcOH + HTyrNh^.HCl —- ¹ > ZArgLysAspValTyrNH₂.AcOH

738,8 216,7 873,0

17,3 g (80 mmol) HTyrNH₂.HCl-t adunk 30 ml DMF, 80 ml

0,5 M közömbösített Tris oldat és 8 ml 0,1 M EDTA oldat elegyéhez, a pH-t körülbelül 7 ml 6 n nátronluggal 8,8-ra állítjuk, és a tiszta oldathoz 6,8 g (9,2 mmol) ZArgLysAspValOEt.AcOH-t és további 72 ml vizet adunk, és a pH-t 8,8-ra visszaállítjuk. Ekkor a reakciót 15 ml 18 mg/ml koncentrációjú CPD-Y oldat hozzáadásával indítjuk meg, és menetét analitikai HPLC vizsgálattal követjük, amely szerint 20 óra után a szubsztrátum konverziója 85 Vos. Ha állni hagyjuk, akkor a termék helyben dezamidálódik. A HPLC szerinti hozam 62 % (254 nm-en meghatározva és az át nem alakult szubsztrátumra korrigálva).

Elemzés:

Asp:	1,16
Arg:	1,09
Tyr:	0,78
Val:	1,00
Lys:	0,97

F. példa

ZArgLysAspValTyrNH₂ szintézise a III) stratégia szerint elasztáz, mint katalizátor alkalmazásával (lásd az 5) reakcióvázlatot)

1. lépés: ZArgLysAspValOEt.AcOH előállítása

E vegyületet az E. példa 1.-5. lépései szerint állítjuk elő.

·· *· ·«·· 9··· • · · · «·· · ·4 ·« * · * · 9» a

2. lépés: ZArgLysAspValTyrNH2 előállítása

Reakcióegyenlet:

ZArgLysAspValOEt.AcOH + HTyrNH₂.HCl . ^el^asz^taz._> ZArgLysAspValTyrNH^AcOH

738,8 2215,7873,0

4,6 g (21 mmol) HTyrNH₂.HC1-t adunk 4 ml DMF, 8 ml 0,5 M

Tris oldat és 0,15 g (2 mmol) kálium-klorid elegyéhez, az oldat pH-értékét 2,5 ml 6 n nátronluggal 8,5-re állítjuk, a tiszta oldathoz 0,68 g (0,92 mmol) ZArgLysAspValOEt.AcOH-t keverünk, további 2,5 ml vizet adunk hozzá, és a pH-t nátronlug hozzáadá sával ismét 8,5-re szabályozzuk. Ezután megindítjuk a reakciót 3,1 ml 17 mg/ml koncentrációjú elasztáz oldat hozzáadásával. A reakció menetét analitikai HPLC vizsgálattal követve megállapítható, hogy 20 órán belül a szubsztrátum teljes mennyisége átalakul. A HPLC szerinti hozam 21 % (meghatározás 254 nm-en).

Elemzés:

AAA: Asp:	1,16
Arg:	1,20
Tyr:	0,77
Val:	0,83
Lys:	1,05
G. és H.	példák

ZArgLysAspValE-NH₂ - ahol E jelentése Val vagy His - szintézise a III) stratégia szerint (lásd a 6) reakcióvázlatot)

G. példa

ZArgLysAspValValNH₂ szintézise a III) stratégia szerint

1. lépés: ZArgLysAspValOEt.AcOH előállítása

E vegyületet az E. példa 1.-5. lépései szerint állítjuk elő.

·· *· ···· ·*»· • * · · ··· ··· « «

2. lépés: ZArgLysAspValValNH₂ előállítása

Reakcióegyenlet:

ZArgLysAspValOEt.AcOH + HCl.HValNH₂ ... ^CPD~^Y__» ZArgLysAspValValNH₂

738,8 152,7 749,0 mg (0.6 mmol) HC1.HValNH₂-t elegyítünk 0,3 ml DMF, 0,8 ml 0,5 M Tris oldat és 0,08 ml 0,1 M EDTA oldat elegyéhez, az oldat pH-értékét nátronlugoldattal 8,9-re állítjuk, majd 70 mg (0,1 mmol) ZArgLysAspValOEt.AcOH-t adunk hozzá, a pH-t ismét 8,9-re szabályozzuk, és 0,74 ml vizet adunk hozzá. A reakciót 0,15 ml 18 mg/ml koncentrációjú CPD-Y oldat hozzáadásával indítjuk meg. A reakció szobahőmérsékleten, keverés közben 20 órán belül befejeződik. A HPLC szerinti hozam 40 % (meghatározás

254 nm-en).
Elemzés: Asp:	0,99
Arg:	1,02
Val:	1,97
Lys:	1,02
H. példa

ZArgLysAspValHisNH₂ szintézise a III) stratégia szerint

1. lépés: ZArgLysAspValOEt.AcOH előállítása

E vegyületet az E. példa 1.-5. lépéseiben leirt módszerrel állítjuk elő.

2. lépés: ZArgLysAspValHisNH₂ előállítása

Reakcióegyenlet:

ΓΡΠ-Υ

ZArgLysAspValOEt.AcOH + HisNH₂.2HCl - ^u > ZArgLysAspValHisNH₂

738,8 227,2 787,0

181 mg (0,8 mmol) H-HisNH₂.2HCl-t 0,3 ml DMF, 0,8 ml 0,5 M

Tris oldat és 0,08 ml 0,1 M EDTA oldat keverékéhez adunk, a pH-t ·· ·«·* ···<

• · · · J·· ··· · 9 ·· »· *·· Í nátronlugoldattal 8,8-ra állítjuk, majd 68 mg (0,09 mmol) ZArgLysAspValOEt.AcOH-t elegyítünk az oldathoz, és a pH-t ismét 8,8-ra szabályozzuk. Az oldat térfogatát 0,72 ml vízzel egészítjük ki, majd a reakciót megindítjuk 0,2 ml 19 mg/ml koncentrációjú CPD-Y oldat hozzáadásával. A reakció menetét HPLC vizsgálattal követve megfigyelhető, hogy szobahőmérsékleten, keverés közben órás reakció után a konverzió 75 %-os.

Ha a reakcióelegyet állni hagyjuk, akkor helyben dezamidálás megy végbe.

Elemzés:

Asp :	1,05
Arg:	1,05
Val:	0,95
His :	1,02
Lys :	0,93

I. példa

ZArgLysAspValTyrOMe (Z-timopentin-c<-metil-észter) szintézise a II) stratégia szerint (lásd a 7) reakcióvázlatot)

1. lépés: ZArgLysOEt.2AcOH előállítása

E vegyületet az A. példa 2. lépésében leirt módszerrel állítjuk elő.

2. lépés: BocValTyrOMe előállítása

Reakcióegyenlet:

BocValONSu + HTyrOMe.HCl ——BocValTyrOMe

314,4 231,7 394,5

4,27 g (18 mmol) HTyrOMe.HCl-t 30 ml DMF-ben oldunk, 2,5 ml (18 mmol) trietil-amint, és ezt követően 25 ml DMF-ban oldott •A l

3,28 g (10 mmol)

BocValONSu-t (amelyet az A. példa 2. lépésében leírt eljárással állítottunk elő) adunk az oldathoz. A reakcióelegyet másnapig szobahőmérsékleten keverjük, majd bepároljuk, a maradékot ismét feloldjuk, és preparativ RP-HPLC módszerrel C18oszlopokon tisztítjuk. Eluálószerként gradiens szerint növekvő mennyiségű alkoholt tartalmazó 50 nM ecetsavoldatokat alkalmazunk.

A terméket tartalmazó frakciókat összegyűjtjük, bepároljuk, majd a maradékhoz etanolt adva ismételten bepároljuk. így 3,74 g (95 %) hozammal izolálhatjuk a kívánt terméket.

3. lépés: HValTyrOMe.HC1 előállítása

Reakcióegyenlet:

HCl/EtOAc

BocValTyrOMe

HCl.HValTyrOMe

394,5

330,9

3,68 g (9,3 mmol) BocValTyrOMe-t 105 ml száraz etil-acetátbán oldunk, és 70 ml száraz, 2,7 n etil-acetátos hidrogén-klorid oldatot adunk hozzá. A reakcióelegyet szobahőmérsékleten 3 órán át keverjük, majd szárazra pároljuk, a maradékhoz ismételten etil-acetátot adunk, és ismét szárazra pároljuk. A

HPLC vizsgálat szerint a konverzió mintehy 95 %-os. A hozam 3,1 g (100 %).

4. lépés: ZAsp(0Bzl)ValTyr0Me előállítása

Reakcióegyenlet:

ZAsp(0Bzl)0NSu + HCl.HValTyrOME ^NMM· > ZAsp(0Bzl)ValTyr0Me

454,4

330,9

633,7

2,3 g (7,0 mmol) HC1.HValTyrOMe-t adunk 14 ml DMF-ban oldott 2,0 g (4,4 mmol) ZAsp(0Bzl)0NSu-hoz, s az igy kapott ol dathoz 0,75 ml (6,9 mmol) N-metil-morfolint adagolunk. A reakció elegyet másnapig szobahőmérsékleten keverjük, közben megkezdődik a termék leválása. A reakció menetét analitikai HPLC vizsgálattal η a követjük. A reakció befejezése után az elegyet 28,5 ml vízzel hígítjuk, így a termék kicsapódik, leszűrjük, és DMF-viz eleggyel mossuk.

5. lépés: HAspValTyrOMe.AcOH előállítása

Reakcióegyenlet: H_?/Pd-C

ZASp(OBzl)ValTyrOMe —-------> HAspValTyrOMe.AcOH

633,7 469,5

3,2 g (5,1 mmol) ZAsp(OBzl)ValTyrOMe-t 75 ml DMF-ban szuszpendálunk, 25 ml ecetsavat, és ezt követően 5 ml vízben szuszpendált 3,5 g 5 tömegVos csontszenes palládiumkatalizátort adunk hozzá. Az elegyet másnapig Parr-készülékben 300 kPa nyomáson hidrogénezzük, igy a reakció az analitikai HPLC vizsgálat szerint teljessé válik. A terméket 50 ml további ecetsav hozzáadásával oldatba visszük, majd a katalizátort kiszűrjük, és az oldatot szárazra pároljuk. A hozam 2,3 g (95 %).

6. lépés: ZArgLysAspValTyrOMe.AcOH előállítása

Reakcióegyenlet:

ZArgLys0Et.2Ac0H + AcOH.HAspValTyrOMe ^tripsziQ>ZArgLysAspValTyrOMe.AcOH

584,5 469,5 888,0

1,40 g (3,0 mmol) HAspValTyrOMe.AcOH-t oldunk 9,0 ml DMF,

4,0 ml 0,5 M Tris oldat, 3,0 ml 0,1 M kalcium-klorid oldat, 3,0 ml viz és 1,86 g (4,4 mmol) litium-klorid elegyében gyengén savas pH mellett, utána a pH-t 8,5-re állítjuk, 1,33 g (2,3 mmol) ZArgLysOEt.2AcOH-t adunk hozzá, majd a reakciót 0,3 ml 11 mg/ml koncentrációjú tripszinoldat hozzáadásával megindítjuk. A reakció menetét analitikai HPLC vizsgálattal követve megfigyelhető, hogy a reakció mintegy 20 perc alatt teljessé válik. Ekkor a pH-t 2-re állítjuk. Az analitikai HPLC szerinti hozam 33 % (254 nm-en meghatározva) .

A terméket az alábbi adatokkal jellemeztük:

Elemzés:
AAA: Asp:	0,94
Arg:	0,94
Tyr:	1,08
Val:	1,09
Lys:	0,95

.1. példa

HArgLysAspValTyrNH₂ szintézise a IV) stratégia szerint (lásd a 8) reakcióvázlatot)

A H-ArgLysAspValTyrNh^-t a H-ArgLysGluValTyrNH₂ előállításához hasonlóan szintetizáljuk a C. példában leirt eljárással, az alábbi lépésekben:

1. lépés: ZArgLysOEt.2AcOH előállítása

E vegyületet az A. példa 1. lépésében leirt eljárással állítjuk elő.

2. lépés: ZArgl_ysAsp(0Bzl)2 előállítása

Reakcióegyenlet:

ZArgLysOEt. 2AcOH + HAsp(0Bzl)₂.HCl —^^£§^^iD-^ZArgLysAsp(0Bzl)₂

584,5 349,8 731,9

5,3 g (15 mmol) H-ASp(0Bzl)₂.HCl-t, 0,4 g kalcium-klorid-dihidrátot és 1,3 g Tris-t 15ml DMF és 6 ml viz elegyében oldunk, és a pH-t nátronlugoldattal 8,5-re állítjuk, majd 1,9 g (3,3 mmol) szilárd ZArgLysOEt.2Ac0H-t adunk hozzá, és a reakciót 0,5 ml kalcium-klorid oldatban feloldott 16 mg tripszinnel megindítjuk. A reakció előrehaladását analitikai HPLC vizsgálattal követjük, és a megfelelő konverzió elérésekor további két alkalommal 1,0 g szilárd ZArgLysOEt.2AcOH-t adunk a reakcióelegyhez. A reakció 4 órán belül befejeződik, ekkor a pH-t 3,0-ra csökkentjük, és az elegyet tisztításnak vetjük alá. Az analitikai HPLC szerinti hozam % (254 nm-en meghatározva).

ZArgLysAsp(OBzl)₂ tisztítása

A terméket tartalmazó frakcióból az oldószert eltávolítjuk, a bepárolt maradékot ismét feloldjuk, és RP-HPLC C 18-oszlopra visszük. Az eluálást gradiens szerint növekvő mennyiségben alkoholt tartalmazó 50 mM ecetsavoldatokkal végezzük. A terméket tartalmazó frakciókat egyesítjük, és bepároljuk.

3. lépés: HCl.HValTyrNH₂ előállítása

E vegyületet az A. példa 2. lépésében leirt módszerrel állítjuk elő.

4. lépés: ZArgl_ysAsp(OBzl)ValTyrNH₂ előállítása

a) ZArgLysAsp(OBzl)OH előállítása

Reakcióegyenlet:

ZArgLysAsp(OBzl)₂.2AcOH ^szubtL.^1:L?2.^ri _> ZArgLysAsp(DBzl)OH 852,0 641,8

4,5 g (5,3 mmol) ZArgLysAsp(OBzl)₂.AcOH-t 42 ml etanol és ml víz elegyében oldunk, ezt az oldatot 1,3 g közömbösített Tris oldattal és 0,8 g kálium-kloriddal elegyítjük, az oldat pH-értékét nátronlugoldattal 8,0-ra állítjuk, és a reakciót 0,7 ml vizes oldattal, amely 41 mg szubtilizint tartalmaz, megindítjuk. A pH-t nátronlugoldat adagolásával 8,0-értéken tartjuk, és a reakció menetét analitikai HPLC vizsgálattal követjük. A reakció 1 óra eltelte után befejeződik. Ennek során az oÁ-benzil-észter szelektíven hidrolizál. Ekkor az enzimet az oldat pH-értékének sósavoldattal 3-ra történő csökkentésével inaktiváljuk. Amennyiben esetleg HAsp(0Bzl)₂ marad a reakcióelegyben, akkor az 8-as pH mellett etil-acetáttal extrahálható. A reakcióelegyet ezután 35 ml-re bepároljuk, és igy visszük a következő lépésbe. A HPLC szerinti hozam 95 % (254 nm-en meghatározva).

r

b) ZArgLysAsp(0Bzl)ValTyrNH₂ előállítása

Reakcióegyenlet: termolizin

ZArgLysAsp(OBzl)OH + HCl.HValTyrNH2 * ZArgLysAsp(0Bzl)ValTyrNH₂.2Ac0H

641,8 315,9 1023,1

Az előző lépésből származó, 35 ml térfogatra bepárolt ZArgLysAsp(0Bzl)0H oldathoz 4,2 g (13,3 mmol) HC1.HValTyrNH₂~t, 10 ml vizet, 0,4 g kalcium-klorid-dihidrátot adunk, az elegy pHértékét nátronlugoldattal 7-re állítjuk, majd 80 g termolizinnel indítjuk a reakciót. A reakcióelegyet 2 napon át szobahőmérsékleten keverjük, majd a reakció optimális hozamának elérése után a pH-t 3-ra csökkentük. A HPLC szerinti hozam körülbelül 40 % (254 nm-en meghatározva).

ZArgLysAsp(OBzl)ValTyrNH₂ tisztítása

A reakcióelegyet szűrjük, a nucstortát gondosan mossuk mM ecetsavoldattal, majd alkohol és viz elegyében oldjuk, és RP-HPLC C18-oszlopon tisztítjuk, eluálószerként alkohol-viz keveréket, 50 mM ecetsavoldatot alkalmazunk. A terméket tartalmazó frakciókat egyesitjük, és bepároljuk.

5. lépés:

HArgLysAspValTyrNH₂ előállítása

1,0 g előző lépésből eredő terméket 600 ml 60 %-os etanolban oldunk, 0,1 ml ecetsavat és 0,l.g 10 tömeg%-os csontszenes palládiumkatalizátort adunk hozzá, majd másnapig Parr-készülékben 300 kPa nyomáson hidrogénezzük. Szűrés után az oldatot szárazra pároljuk, a maradékot ismét feloldjuk, és liofilizáljuk.

K. példa

HArgLysAspValTyrOH.AcOH (timopentin acetát) szintézise ZArgLysAspValTyrNH₂.AcOH-ból a védőcsoport enzimes eltávolításával (lásd a 9) reakcióvázlatot) ♦ · · · « « · · · ··· · · · · « ·· ·4 4· 4

1. lépés: ZArgLysAspValTyrOH előállítása

Reakcióegyenlet:

ΓΡΠ-Υ ZArgLysAspValTyrNH₂.AcOH ——ZArgLysAspValTyrOH.AcOH

873,0 874,0

6,8 g (7,8 mmol) ZArgLysAspValTyrNH₂.AcOH-t adunk 80 ml 0,5 M Tris oldat, 8 ml O,1M EDTA oldat, 1,2 g (20 mmol) nátrium-klorid és 30 ml DMF keverékéhez, a pH-t körülbelül 8 ml 6 n nátronlugoldat hozzáadásával 9,0-ra állítjuk, s igy tiszta oldatot kapunk, amelyhez 62 ml vizet adunk, majd a reakciót 20 ml 18,8 mg/ml koncentrációjú CPD-Y oldattal megindítjuk. A 254 nm-en és 278 nm-en végzett analitikai HPLC vizsgálattal követve megfigyelhető, hogy a reakció 3 órán belül teljessé válik. A HPLC szerinti hozam 98 %.

A 278 nm hullámhosszon megfigyelt extinkció 254 nm hullámhosszon megfigyelt extinkcióhoz viszonyított aránya mind a termék, mind a szubsztrátum esetében azonos. Ennek alapján a termék a kromofórokat, azaz a Z és Tyr csoportokat a molekula két végén tartalmazza 1:1 arányban.

ZArgLysAspValTyrOH.AcOH izolálása

A reakcióelegyet preparativ RP-HPLC segítségével C18-oszlopon tisztítjuk, az eluálást 50 mM ecetsav-pufferoldatban alkoholviz keverékkel végezzük. A terméket tartalmazó frakciókat egyesítjük, bepároljuk és liofilizálhatjuk. így a kívánt terméket 6,4 g (94 %) hozammal fehér por alakjában nyerjük.

2. lépés: HArgLysAspValTyrOH.AcOH (timopentin acetát) szintézise

Reakcióegyenlet:

H_?/Pd-C

ZArgLysAspValTyrOH.AcOH —-------;> HArgLysAspValTyrOH.AcOH

874,0 739,8

13,1 g (15 mmol) ZArgLysAspValTyrOH. AcOH-t 1 liter, 40 % etanolt és 60 % vizet tartalmazó keverékben oldunk, és 5 ml ecet• « · • ·* · ··· savat tartalmazó vízben szuszpendált 1,3 g 10 tömeg%-os csontszenes palládiumkatalizátort adunk hozzá. Az elegyet Parr-készülékben 300 kPa nyomáson addig hidrogénezzük, amig az analitikai HPLC vizsgálat alapján a kiinduló anyag konverziója csaknem teljessé válik. így a kívánt terméket a HPLC elemzés szerint 98 % hozammal kapjuk.

HArglLysAspValTyrOH.AcOH izolálása

A fenti reakcióelegyet szűrjük, és bepároljuk. A maradékot vizes-ecetsavas pufferoldatban ismét feloldjuk, és oszlopkromatográfiával tisztítjuk. A tiszta terméket tartalmazó frakciókat egyesítjük, bepároljuk, és viz-ecetsav elegyben való oldás után liofilizáljuk. A Hozam 10,7 g (90 % a termék viz- és acetáttartalmára korrigálva).

Az igy kapott termék fehér, amorf por, idegen anyagrészecskéket nem tartalmaz, és az alábbi adatokkal jellemezhető: UV-maximum: 275 nm-nél

Hatóanyagtartalom: 86,7 % (293 nm UV-hullámhosszon, 0,1 n

Fajlagos forgatóképesség:

Acetáttartalom:

nátronlugoldatban végzett meghatározással) -22,1° ( c = 1, 0,1 n ecetsavban)

9,4 %

Kloridtartalom:

az ezüst-nitrát próbában negatív

Víztartalom:

4,7 % (Kari Fischer meghatározás alapján)

Idegen vagy szabad aminosavak: nincsenek (lásd az AAA elemzést)

Elemzés:

AAA: Asp: 0,95

Arg: 1,06

Tyr: 0,95

Val: 0,98

Lys: 1,07

	• · · ♦ ····« * · · •« · · · * ·	> · · · •
Szekvencia-	-analízis:	- 78 - Arg,	Lys, Asp,	Val,	Tyr
Tisztasági	fok (HPLC	= 1 alapján): 99,7	2 3 4 % (meghatározás 220	5 nm-en)

L. példa

HArgLysGluLeuDTrpNH₂ és HArgLysGluLeuLTrpNH₂ szintézise az

I) stratégia szerint (lásd a 10) reakcióvázlatot)

1. lépés: ZArgLysGlu(OBzl)0H.AcOH előállítása

E vegyületet a C. példa 5a) lépése szerinti eljárással állítjuk elő.

A vegyületet RP-HPLC C18-oszlopon végzett tisztítás, bepárlás és liofilizálás után acetátja alakjában izoláljuk.

2. lépés: ZArgLysGlu(OBzl)LeuOBzl.2Ac0H előállítása

Reakcióegyenlet:

ZArgLysGlu(OBzl)OH.AcOH + HLeuOBzl.HCl ZArglysGlu(OBzl)LeuOBzl.2AcOH

715,8 257,8 979,1

2,00 g (2,8 mmol) ZArgLysGlu(OBzl)OH.AcOH-t és 3,00 g (11,6 mmol) HLeuOBzl.HCl-t 24 ml vizben oldunk, 0,19 g kalcium-klorid-dihidrátot és 0,63 g Tris-t adunk hozzá, majd az oldat pH-értékét vizes nátronlugoldattal 7,0-ra állítjuk. Ezután a reakciót 26 mg termolizin hozzáadásával megindítjuk. A reakcióelegy hamarosan megzavarosodik. Az elegyet azonos hőmérsékleten 2 órán át keverjük, majd a pH-t vizes sósavoldattal 4-re csökkentjük.

így a kívánt terméket az analitikai HPLC vizsgálat szerint 61 % hozammal kapjuk (meghatározás 254 nm-en).

ZArgLysGlu(03zl)Leu0Bzl tisztítása

AZ előbbiekben kapott reakcióelegyet vízzel hígítjuk, és RP-HPLC C18-oszlopon tisztítjuk. Eluálószerként gradiens szerint növekvő koncentrációban alkoholt tartalmazó 50 mM koncentrációjú ecetsavoldatokat alkalmazunk. A tiszta terméket tartalmazó frak·· * · ···»···· • · «. « • ·· ·· · · · * « · · · * ·

- 79 ciókat egyesítjük, vákuumban bepároljuk, majd liofilizáljuk. A kívánt termék hozama 1,48 g (52 %).

3. lépés: ZArgLysGlu(OBzl)LeuDTrpNH₂ előállítása

Reakcióegyenlet:

ZArgLysGlu(0Bzl)Leu0Bzl.2Ac0H + H-D-Trp-NH₂.HC1 -^P-⁰*^riP^s^P—y

979,1 '----------> ZArgLysGlu(OBzl)LeuDTrp-NH₂.2AcOH

1074,2

240 mg (1,0 mmol) HC1.DTrpNH₂~t (amely az elemzés alapján %-nál kevesebb L-izomert tartalmaz) 0,6 ml DMF és 1,2 ml viz elegyében oldunk, és az oldat pH-értékét vizes nátronlugoldattal

8,5-re állítjuk. Ekkor 88 mg (0,1 mmol) ZArgLysGlu(OBzl).2AcOH-t adunk hozzá, és a pH-t ismét 8,5-re szabályozzuk. A reakciót 0,3 mg kimotripszin hozzáadásával indítjuk; a reakció időtartama szobahőmérsékleten, keverés közben 1 óra. A kívánt termék HPLC szerinti

hozama 41 % (290 nm-en meghatározva).
Elemzés:
AAA: Glu:	1,04
Arg:	1,02
Leu:	1,00
Trp:	0,78
Lys:	0,94

A termék UV-extinkcióját 290 nm-en mértük.

4. lépés: ZArgLysGlu(0Bzl)LeuLTrpNH₂ előállítása

Reakcióegyenlet:

ZArglysGlu(OBzl)LeuOBzl.2AcOH + HTrpNH₂.HCl J<i^|?^otrlP^sziri----

979,1 239,7 •-----------a ZArgLysGlu(OBzl)LeuTrpNH₂.2AcOH

1074,2 • · ·· ·V·« ···· • · · · »*···» · · • · ♦ · · « · ♦ · · · ·♦ ·

- 80 A fenti reakciót a 3. lépésben leirt eljáráshoz hasonlóan végezzük, azonban 240 mg L-Trp-NH₂.HCl-t használunk a D-izomer helyett. A HPLC szerinti hozam 63 % (290 nm-en meghatározva). Elemzés:

AAA: Glu: 1,08

Arg: 0,96

Leu: 1,04

Trp: 1,73

Lys: 0,95

A termék UV-extinkcióját 290 nm-en mértük.

5. lépés: H-ArgLysGluLeuTrpNH? és H-ArgLysGluLeuTrpNH₂ előállítása A 3. és 4. lépésben előállított termékeket - a RP-HPLC utján végzett izolálás után - viz és etanol elegyében oldjuk, 10 tömeg% 10%-os csontszenes palládiumkatalizátort adunk hozzá, és az elegyet másnapig 400 kPa nyomáson hidrogénezzük. A védőcsoporttól mentesített vegyületet bepárlással, és ezt követően liofilizálással nyerjük.

M. példa

HArgLysGluLeuDTyrNH₂ és HArgLysGluLeuTyrNH₂ szintézise az

I) stratégia szerint (lásd a 11) reakcióvázlatot)

1. lépés: ZArgLysGlu(0Bzl)Leu0Bzl.2AcOH előállítása

E vegyületet az L. példa 1. és 2. lépésében leirt eljárással állítjuk elő.

2. lépés: ZArgLysGlu(0Bzl)LeuDTyrNH₂ előállítása

Reakcióegyenlet:

ZArgLysGlu(OBzl)LeuOBzl.2AcOH + H-D-TyrNH₂.HCl kimotnpszin-----

979,1 216,7

------------> ZArgLysGlu(0Bzl)Leu0TyrNH₂

931,1 «· ·· · ·· «··« • « * <

··· ··« · · • « · · « · · ·· ·· ·· ·

- 81 216 mg (1,0 mmol) HC1. DTyrNH2^{_t (amely az elemzés} szerint

1%-nál kevesebb L-izomert tartalmaz) 0,6 ml DMF és 1,2 ml viz elegyében oldunk, és a pH-t vizes nátronlugoldattal 8,5-re állítjuk. Ekkor 88 mg (0,1 mmol) ZArgLysGlu(OBzl)LeuOBzl.2AcOH-t adunk hozzá, a pH-t ismét 8,5-re szabályozzuk, és a reakciót 0,3 mg kimotripszin hozzáadásával megindítjuk. A reakcióelegyet 2 órán át szobahőmérsékleten keverjük. A HPLC vizsgálat szerint a kívánt termék hozama 88% (254 nm-en meghatározva).

Elemzés:

AAA: Glu: 0,99

Arg: 1,04

Tyr: 0,80

Leu: 1,02

Lys: 0,95

A termék UV-extinkcióját 278 nm-en mértük.

3. lépés: ZArgLysGlu(OBzl)LeuTyrNH₂ előállítása

Reakcióegyenlet:

ZArgLysGlu(0Bzl)Leu0Bzl.2Ac0H + HTyrNH₂.HCl ^kltnotriP^5Zin—

979,1 216,7

----------> ZArgLysGlu(OBzl)LeuTyrNH₂

931,1

A reakciót a 2. lépésben leirt eljáráshoz hasonlóan végezzük, azonban 216 mg mg L-TyrNH₂.HCl-t alkalmazunk a D-izomer helyett. így a terméket a HPLC vizsgálat szerint 95 % hozammal kapjuk (254 nm-en meghatározva).

4. lépés: HArgLysGluLeuDTyrNH₂ és HArgLysGluLeuTyrNH₂ szintézise

E vegyületeket a 2. lépésben és 3. lépésben előállított termékekből az M. példa 5. lépésében leirt eljárással állítjuk elő.

< · • · · · «·*·

- 82 N. példa

HArgLysGluLeuDLeuNH₂ és HArgLysGluLeuLeuNH₂ szintézise az I) stratégia szerint (lásd a 12) reakcióvázlatot)

1. lépés: ZArgLysGlu(OBzl)LeuOBzl.2AcOH előállítása

E vegyületet az L. példa 1. és 2. lépéseiben leirt eljárással állítjuk elő.

2. lépés: ZArgLysGlu(0Bzl)LeuDLeuNH₂ előállítása

Reakcióegyenlet:

ZArgLysGlu(0Bzl)Leu0Bzl.2Ac0H + H-D-LeuNH₂ J2.Tg^t.^riP^szin

979,1 130,2

---------> ZArgLysGlu(OBzl)LeuDLeuNH₂

881,2 mg (0,3 mmol) HC1. DLeuNH₂~t (amely az elemzés szerint 1%-nál kevesebb L-izomert tartalmaz) 0,6 ml DMF és 1,2 ml víz elegyében oldunk, az oldat pH-értékét vizes nátronlug-oldattal

8,5-re állítjuk, 88 mg (0,1 mmol) ZArgLysGlu(OBzl)LeuOBzl.2Ac0H-t adunk hozzá, és a pH-t ismét 8,5-re szabályozzuk. A reakciót

O, 3 mg kimotripszin hozzáadásával indítjuk, majd a reakcióelegyet 30 percig szobahőmérsékleten keverjük. A kívánt termék HPLC szerinti hozama 15¾ (254 nm-en meghatározva).

AAA: Glu:	0,99
Arg:	1,05
Leu:	1,95
Lys:	1,00

3. lépés: ZArgLysGlu(OBzl)LeuLeuNH₂ előállítása

Reakcióegyenlet:

ZArgLysGlu(0Bzl)Leu0Bzl.2Ac0H + HLeuNH₂ —kimotripszin_ZArg_LysGlu(_0Bzl)_LeuLeuNH2

979,1

130,2

881,2 ··4· ···· »4>·

- 83 A reakciót a 2. lépésben leirt eljáráshoz hasonlóan végezzük, azonban 38 mg L-LeuNl·^.HCl-t viszünk reakcióba a D-izomer helyett. A kívánt termék HPLC szerinti hozama 85 % (254 nm-en meghatározva) .

4. lépés: HArgLysGluLeuDLeuh^ és HArgLysGluLeuLeuNl·^ előállítása

E vegyületeket a 2. és 3. lépés termékeiből az M példa

5. lépésében leirt módszerrel állítjuk elő.

0. példa

ZArgLysAspValDTyrNl·^ és ZArgLysAspValTyrNl·^ szintézise a

III) stratégia szerint (lásd a 13) reakcióvázlatot)

1. lépés: ZArgLysAspValOEt.AcOH előállítása

E vegyületet az E. példa 1.-5. lépéseiben leirt eljárással állítjuk elő.

2. lépés: ZArgLysAspValDTyrNH2 előállítása

Reakcióegyenlet:

ZArgLysAspValOEt.AcOH + HDTyrh^.HCl —PP~lipáz_> zArgLysAspValDTyrh^

738,8 216,7 813

216 mg (1,0 mmol) HC1.DTyrNH₂-t (amely az elemzés szerint 1%-nál kevesebb L-izomert tartalmaz) 1,5 ml vízben oldunk, a pH-t vizes nátronlugoldattal 8,5-re állítjuk, utána 68 mg (0,1 mmol) ZArgLysAspValOEt.AcOH-t adunk az oldathoz, és a pH-t ismét 8,5-re szabályozzuk. A reakciót 14 mg sertés-hasnyálmirigy-lipázzal (PP-lipáz) megindítjuk, s a reakcióelegyet 8 órán át szobahőmérsékleten keverjük. Erre az időpontra a konverzió 75%-os. A HPLC szerinti hozam 36% (254 nm-en meghatározva).

Elemzés:

AAA: Asp: 1,35

Arg: 0,80

Val: 0,82 • 4 ··· ··» •*·4 ··«· « I

Tyr: 1,29

Lys: 0,73

Az UV-extinkciót 278 nm-en mértük.

3. lépés: ZArgLysAspValTyrNH₂ (Ζ-ΤΡ-5-amid) előállítása

Reakcióegyenlet:

ZArgLysAspValOEt. AcOH + H-LTyrh^.HCl ZArgLysAspValTyrNH?

738,8 216,7 813

A reakciót a 3. lépésben leirt eljáráshoz hasonlóan hajtjuk végre, azonban 216 mg L-TyrNH₂.HCl-t használunk a D-izomer helyett.

A reakció időtartama 4 óra. A konverzió 75%-nál kisebb. A HPLC szerinti hozam 22¾ (254 nm-en meghatározva).

Elemzés:

AAA: Asp:	0,80
Arg:	1,00
Val:	1,36
Tyr :	0,66
Lys:	1,18

Az UV-extinkciót 278 nm-en mértük.

P. példa

HArgLysGluAlaValNH₂ szintézise az I) stratégia szerint (lásd a 14) reakcióvázlatot)

1. lépés: ZArgLysGlu(OBzl).2AcOH előállítása

E vegyületet a C. példa 2. lépésében leirt eljárással állítjuk elő.

2. lépés: ZArgLysGlu(0Bzl)AlaNH₂ előállítása

Reakcióegyenlet:

ZArgLysGlu(OBzl)₂.2AcOH + HAlaNH^HCl .^szubtlllzirL» ZArgLysGlu(0Bzl)AlaNH₂

725,9

865,9

124,6 •r ♦ ··« ·*·· • < · · ··· ♦ *· 4* • « 4 « «4 ·· 44 ·«·

- 85 200 mg (1,6 mmol) L-AlaNl·^.HCl-t 0,4 ml DMF és 1,4 ml

0,1 M kálium-klorid oldat, valamint 0,1 M Tris oldat elegyében oldunk, a pH-t vizes nátronluggal 8,5-re állítjuk, az oldathoz 86 mg (0,1 mmol) ZArgLysGlu(0Bzl)₂. 2AcOH-t adunk, és a pH-t ismét

8,5-re szabályozzuk. A reakciót 0,1 mg szubtilizin hozzáadásával megindítjuk, a reakcióelegyet 20 percig szobahőmérsékleten keverjük, majd a pH értékének 3-ra csökkentésével a reakciót leállítjuk.

A kívánt termék HPLC szerinti hozam 36% (254 nm-en meghatározva). Elemzés:

AAA: Glu: 1,04

Arg: 1,10

Alá: 0,95

Lys: 0,91

3. lépés: HArgLysGluAlaAlaValNH₂ előállítása

A fenti 2. lépésben előállított peptidet RP-HPLC módszerrel elkülönítjük a reakcióelegyből, és elasztáz, vagy fenacil-bromiddal módosított CPD-Y alkalmazásával dezamidáljuk. Az igy kapott terméket ismét észterezzük, és az észtert H-ValNH₂-vel kapcsoljuk a G. példa 2. lépésében leirt eljárással. Végül a védőcsoportokat az L. példa 5. lépésében leirt katalitikus hidrogénezési eljárással távolitjuk el.

Q. példa

HArgProDAspValTyrNH₂ szintézise a II) stratégia szerint (lásd a 15) reakcióvázlatot)

1. lépés: H-ValTyrNH₂.HC1 előállítása

E vegyületet az A. példa 2. lépésében leirt eljárással állítjuk elő.

2. lépés: ZDAsp(03zl)ValTyrNH₂ előállítása

·· · • · ··· ··· • * » ·· ·»

Reakcióegyenlet:

ZDAsp(OBzl)OH + HValTyrNH₂.HCl

357,4 315,9 termolizin _{> ZDAsp}(oBzl)ValTyrNH2

618,7 mg (0,2 mmol) ZDAsp(OBzl)OH-t (amely az elemzés szerint %-nál kevesebb L-izomert tartalmaz) 0,4 ml DMF-ban oldunk, és 126 mg (0,4 mmol) HC1.ValTyrNH₂ 1,4 ml vízzel és 00,1 ml DMF-val készült oldatához adjuk, amely utóbbi oldat pH-értékét előzőleg

7-re állítottuk. Az oldathoz 14 mg kalcium-kloridot és 48 mg Tris-t is adunk. A reakciót 8 mg termolizin hozzáadásával indítjuk meg, majd 2 napig az elegyet szobahőmérsékleten keverjük.

A HPLC szerinti hozam 12% (254 nm-en meghatározva).

Elemzés:

AAA: Asp: 1,16

Val: 0,91

Tyr: 0,93

Az UV-extinkciót 278 nm-en mértük.

3. lépés: ZArgProDAspValTyrNH₂ előállítása

A fenti 2. lépésben előállított terméket az A. példa

3. lépésében leirt eljárással hidrogénezzük, azonban sav minőségében csak sósavat adunk az elegyhez. Az igy kapott terméket ZArgProONSu.HCl-val reagáltatjuk olyan vízmentes OMF-oldatban, amely a reaktánsokat és az NMM-t ekvimoláris mennyiségekben tartalmazza.

R. példa

HArgLysGluTyrTyrOEt szintézise a IV) stratégia szerint (lásd a 16) reakcióvázlatot)

1. lépés: ZArgLysGlu(OBzl)OH.AcOH előállítása

E vegyületet az L. példa 1. lépésében leirt eljárással ·

··· ··· • · · · ·· ·· • · *·

- 87 állítjuk elő.

2. lépés: HC1.TyrTyrOEt előállítása

A ZTyrTyrOEt-t a 16) reakcióvázlatban feltüntetett standard kémiai módszerekkel állítjuk elő, és C18 RP-HPLC alkalmazásával tisztítjuk, majd a védőcsoportot sósavoldat jelenlétében hidrogénezéssel eltávolítjuk, és a HCL.TyrTyrOEt-ι fehér, amorf por alakjában izoláljuk. A kapott termék fajlagos optikai forgatóképességével jellemezhető.

3. lépés: ZArgLysGlu(OBzl)TyrTyrOEt előállítása

Reakcióegyenlet:

ZArgLysGlu(0Bzl)0H.Ac0H + H-TyrTyrOEt.HCl ^t.^e-^rmollzin> ZArgLysGlu(OBzl)TyrTyrOEt

715,8 408,9 1010,2 mg (0,1 mmol) ZArgLysGlu(OBzl)OH. AcOH-t és 82 mg (0,2 mmol) HTyrTyrOEt.HCl-t 0,25 ml DME és 0,75 ml, 7 mg kalcium

-klorid-dihidrátot és 25 mg Tris-t tartalmazó víz elegyében oldunk, a pH-t vizes sósavoldat hozzáadásával 7-re állítjuk, majd a reakciót 5 mg termolizin hozzáadásával megindítjuk. A reakcióelegyet szobahőmérsékleten 4 órán át keverjük (tiszta oldat marad). A HPLC szerinti hozam 23 % (254 nm-en meghatározva).

Elemzés:

AAA: Glu:	1,07
Arg:	1,03
Tyr:	1,93
Lys:	0,97

Az UV-extinkciót 278 nm-en mértük.

4. lépés: HArgLysGluTyrTyrOEt előállítása

E vegyületet a fenti 3. lépés termékéből állítjuk elő az

L. példa 5. lépésében leirt eljárással.

5. példa

HArgLysGluPheDTyrNl^ szintézise a IV) stratégia szerint (lásd a 17) reakcióvázlatot)

1. lépés: ZArgLysGlu(OBzl)0H.AcOH előállítása

E vegyületet az L. példa 1. lépésében leirt eljárással állítjuk elő.

2. lépés: HTrpDPheh^ .AcOH előállítása

a) ZPheDTyrNH2 előállítása

Reakcióegyenlet:

ZPheOEt + HDTyrNH₂.HCl -Kimotripszin _? zPheDTyrNH₂

327,4 216,7 461,5

0,46 g (1,4 mmol) ZPheOEt-t és 1,21 g (5,6 mmol) H-DTyrl·^.HC1t (amely az elemzés szerint 1 %-nál kevesebb L-izomert tartalmaz) 5,6 ml DMF és 7,5 ml víz elegyében oldunk, a pH-t vizes nátronlugoldattal 8,5-re állítjuk, majd a reakciót 3,5 mg kimotripszin hozzáadásával megindítjuk, és a reakcióelegyet másnapig keverjük. Eközben a termék csapadék alakjában kiválik. A pH-t vizes sósavoldat hozzáadásával 3-ra csökkentjük, majd a reakcióelegyet nátrium-hidroxid hozzáadásával oldatba visszük.

ZPheDTyrNH2 tisztítása

A fentebb kapott elegyet C18 RP-HPLC utján tisztítjuk, a tiszta terméket tartalmazó frakciókat egyesítjük, és vákuumban betöményitjük, majd a maradékhoz vízmentes etanolt adunk, amelyet vákuumban ledesztillálunk. így száraz maradékhoz jutunk, amely a kívánt termék, a hozam 0,37 g (57¾).

b) HOAc.HPheDTyrNH2 előállítása

Reakcióegyenlet:

ZPheDTyrNH₂

461

H₂/Pd-C

AcOH.HPheDTyrNH₂

387

A fentebb a) lépésben kapott terméket 200 ml etanolban oldjuk, 1 ml jégecetet, s utána 50 mg 10 tömegVos csontszenes palládiumkatalizátort adunk hozzá, és másnapig Parr-készülékben 300 kPa nyomáson hidrogénezzük. Szűrés után az oldatot vákuumban bepároljuk. így a kívánt terméket 3,1 g (100 hozammal nyerjük.

3. lépés: ZArgLysGlu(OBzl)PheDTyrNH₂ előállítása ZArgLysGlu(0Bzl)0H.Ac0H + HPheDTyrNH^AcOH _íermolizin_^

715,8 387,4

-----------* ZArgLysGlu(0Bzl)PheDTyrNH₂

965,5 mg (0,1 mmol) ZArgLysGlu(OBzl)OH.Ac0H-t és 77 mg (0,2 mmol) HPheDTyrNH₂.AcOH-t 7 mg kalcium-kloridot és 25 mg Tris-t tartalmazó 0,9 ml vízben oldunk, az oldat pH-értékét vizes sósavoldattal 7-re állítjuk, majd a reakciót 10 mg termolizin hozzá adásával megindítjuk, és utána a reakcióelegyet 2 napon át szobahőmérsékleten keverjük. A kívánt termék HPLC szerinti hozama 10 % (254 nm-en meghatározva).

Elemezés:

AAA: Glu:	1,19
Arg:	1,03
Tyr:	0,94
Phe:	0,92
Lys:	0,90

Az UV-extinkciót 278 nm-en mértük.

4. lépés: HArgLysGluPheDTyrNH₂ előállítása

E vegyületet a fenti 3. lépés termékéből az L. példa 5.

lépésében leirt eljárással állítjuk elő.

• ·

T. példa

ZDArgProAspValTyrNH2 és ZLArgProAspValTyrNl·^ szintézise a III) és II) stratégia szerint (lásd a 18) reakcióvázlatot)

Megjegyzés a 18) reakcióvázlathoz: Ha A jelentése DArg, és R hidrogénatomot jelent, akkor COUPL kémiai kapcsolást jelent; ha A jelentése L-Arg, és R jelentése OEt csoport, akkor COUPL klosztripain enzimmel végzett kapcsolást jelent.

1. lépés: ZDArgProOBzl.AcOH előállítása

E vegyületet a hagyományos kémiai kapcsolással állítjuk elő, amint ez a 18) reakcióvázlatból látható. A terméket C18 RP-HPLC eljárással tisztítjuk, az eluáláshoz gradiens szerint növekvő koncentrációban alkoholt tartalmazó 50 mM ecetsavoldatokat alkalmazunk. A tiszta terméket tartalmazó frakciókat egyesitjük, és bepárlás után liofilizáljuk. így a kívánt terméket fehér, amorf por alakjában kapjuk.

2. lépés: AcOH.HAspValOEt előállítása

E vegyületet az E. példa 3. lépésében leirt eljárással állítjuk elő.

3. lépés: ZDArgProAspValOEt előállítása

Reakcióegyenlet:

PPSF

ZDArgProOBzl. AcOH + HAspValOEt. AcOH ZDArgProAspValOEt

555,6 320,3 647.8

191 mg (0,6 mmol) AspValOEt. AcOH-t 0,15 ml DMF és 0,1 ml mM koncentrációjú foszfát-pufferoldat elegyében oldunk, a pH-t vizes nátronlugoldattal 8,5-re állítjuk, majd az oldathoz 17 mg (0,03 mmol) ZDArgProOBzl.AcOH-t adunk, és a reakciót 0,5 mg poszt-prolin-specifikus endoproteáz hozzáadásával megindítjuk. A reakcióelegyet 2 napon át szobahőmérsékleten keverjük. (Ez idő után körülbelül 10 %-os konverzió érhető el.) A HPLC szerinti hozam 42 % (meghatározva hidrolízis után 254 nm-en).

Elemzés:
AAA: Asp:	1,05
Arg:	0,94
Pro:	0,98
Val:	1,02
4. lépés:	ZLArgProOBzl.AcOH előállítása

Reakcióegyenlet:

ZArgOEt.HCl + HProOBzl.HCl ^KlosztriP^ai0_;> ZArgProOBzl.AcOH

372,8 241,7 555,6

0,15 g (0,4 mmol) ZArgOEt.HC1-t és 0,48 g (2,0 mmol)

HProOBzl.HCl-t 1,2 ml DMF és 2,8 ml, 6 mg kalcium-klórid-dihidrátot és 1 mg DTT-t tartalmazó viz elegyében oldunk, az oldat pH-értékét TEA hozzáadásával 8,5-re állítjuk, majd a reakciót 2 mg előzőleg aktivált klosztripain hozzáadásával megindítjuk. 30 perc elmúltával megközelítőleg 10 %-os a konverzió; a reakcióelegyet másnapig szobahőmérsékleten keverjük. A HPLC szerinti hozam 31 % (meghatározva hidrolízis után 254 nm-en).

Elemzés:

A terméket kémiai utón szintetizált összehasonlító (referens) vegyülettel analitikai HPLC módszerrel koeluáltuk, és igazoltuk, hogy mindkét termék 254 nm hullámhosszon mutatott UV-extinkciójának a 230 nm hullámhosszon mutatott extinkciójához viszonyított aránya azonos.

5. lépés: ZArgProAspValOEt előállítása • · • · · ·

Reakcióegyenlet:

PPAF

ZArgProOBzl.AcOH + HAspValOEt.AcOH——> ZArgProAspValOEt

555,6 320,4 647,8 mg (0,8 mmol) HASpValOEt.AcOH-t 0,3 ml DMF és 1,5 ml víz elegyében oldunk, és a pH-t 8.5-re állítjuk. Ekkor 56 mg (0,1 mmol) ZArgProOBzl.AcOH-t adunk hozzá, és a reakciót 0,5 mg poszt-prolin-specifikus endoproteáz hozzáadásával megindítjuk. A reakcióelegyet szobahőmérsékleten 1 órán át keverjük, ekkor a konverzió 50 %-os. A HPLC szerinti hozam 51 % (meghatározva hidrolízis után 254 nm-en).

Elemzés:
AAA: Asp:	1,00
Arg:	1,02
Pro:	1,00
Val:	0,98

A termék bázisokkal szemben nem stabilis.

6. lépés: ZArgProAspValTyrNH^ és ZDArgProAspValTyrNH2 előállítása

A fenti 3. és 5. lépésekben kapott termékeket C18

RP-HPLC módszerrel tisztítjuk, és CPD-Y enzim, mint katalizátor jelenlétében az E. példa 6. lépésében leirt eljáráshoz hasonlóan tirozin-amiddal reagáltatjuk.

Eljárhatunk úgy is, hogy az Asp\/alTyrNH₂-t közvetlenül kapcsoljuk a fenti 5. lépésben leirt reakcióhoz hasonló reakcióban, s igy ZArgProAspValTyrNH₂-hoz jutunk, amelynek elemzési eredményei az alábbiak:

Elemzés:
AAA: Asp:	1,01
Arg:	1,32
Pro:	0,95

Tyr: 0,86

Val: 0,86

U. példa

ZDArgArgAspValTyrNH₂ és ZArgHomoArgAspValTyrNH₂ szintézise a II) stratégia szerint (lásd a 19) reakcióvázlatot)

1. lépés: ZDArgArgOEt.2HC1 előállítása

a) H-D-ArgArgOH.2AcOH előállítása

Reakcióegyenlet:

H-D-ArgOEt.2HC1 + H-ArgOH - ^CPD~^Y > H-D-ArgArgOH.2AcOH

275,2 174,2 450,4

3,04 g (11,1 mmol) H-DArgOEt.2HC1-t és 31,0 g (178 mmol) HArgOH-t oldunk 180 ml vízben, amely 80 mg EDTA-t tartalmaz, a pH-t vizes sósavoldattal 9,0-ra állítjuk, majd a reakciót 350 mg CPD-Y enzim hozzáadásával megindítjuk. A reakcióelegyet szobahőmérsékleten 2 napig keverjük, majd leállítjuk úgy, hogy a pH-t 11-re növeljük, s ezután a reakcióelegyet tisztítjuk. A HPLC elemzés szerint a hozam 20 % (meghatározva 230 nm-en).

b) H-D-ArgArgOH.2AcOH tisztítása

A fentebb előállított reakcióelegyet Dowex AG-50 kationcserélő oszlopon bázisos pH mellett, acetát-pufferban nátrium-klorid sógradiens szerint növekvő koncentrációjával eluálva a terméket tartalmazó többi frakcióban az analitikai HPLC szerint homogén peptidet kapunk. A tiszta terméket tartalmazó, sótartalmú frakciókat egyesítjük, vákuumban betöményitjük, az esetleg kivált sót szűréssel eltávolítjuk, majd szárazra pároljuk, és a maradékot alkalmazzuk a következő lépésben.

c) ZDArgArgOH.AcOH előállítása

Reakcióegyenlet:

• · *

- 94 ZONSu + H-DArgArg0H.2Ac0H ------------> Z-DArgArgOH.AcOH

231,2 450,4 524,5

A b) lépésből eredő sótartalmú maradékot vízben újra feloldjuk, és az oldat pH-értékét vizes sósavoldattal 8,2-re állítjuk. Ekkor 0,56 g (2,4 mmol) ZONSu acetonitriles oldatát adjuk hozzá, és az elegyet szobahőmérsékleten 1 órán át erélyesen keverjük, miközben a pH-t állandó értéken tartjuk. Végül a némi feleslegben jelenlévő bármelyik reagens feleslegét úgy bontjuk el, hogy a pH-t rövid időre 10-re növeljük, majd 3-ra csökkentjük.

d) Z-DArgArgOH.AcOH izolálása

A c) lépésből származó reakcióelegyet vákuumban bepároljuk; igy az acetonitril eltávozik, majd a maradékot C18 RP-HPLC utján tisztítjuk, eluálószerként 50 mM koncentrációjú ecetsavban gradiens szerint növekvő koncentrációban alkoholt tartalmazó oldatokat alkalmazunk. A tiszta terméket tartalmazó frakciókat egyesítjük, vákuumban bepároljuk, végül liofilizáljuk. így a kívánt termékhez 0,64 g (55 %) hozammal jutunk.

Elemzés:

AAA: Arginint azonosítottunk.

A terméket továbbá úgy jellemeztük, hogy standard kémiai módszerrel előállított ZDArgArgOH referens anyaggal analitikai HPLC eljárásban koeluáltuk.

e) ZDArgArgOEt.2HC1 előállítása

Reakcióegyenlet:

ZDArgArgOH. AcOH -----HCl/EtQH----_ZDArgArgOEt.2HCl

524,5 565,5

A fenti d) lépés termékét 3 M száraz etanolos hirogén-klorid oldatban oldjuk, másnapig szobahőmérsékleten keverjük, majd szárazra

- 95 pároljuk, és e műveletet száraz etanolnak a maradékhoz való hozzáadásával és ledesztillálásával többször megismételjük. így a kívánt észtert 0,68 g (98 %) hozammal kapjuk.

2. lépés: HAspValTyrNH₂ előállítása

E vegyületet az A. példa 3. lépésében leírt eljárással állítjuk elő.

3. lépés: ZDArgArgAspValTyrNH₂ előállítása

Reakcióegyenlet:

ZDArgArg0Et.2HCl + HAspValTyrNH₂ —Trigszir^^ zg_argArgAspValTyrNH₂

565,5 394,5 841

394 mg (1,0 mmol) AspValTyrNH₂-t és 57 mg ZDArgArgOEt.2HCl-t (0,1 mmol) 0,6 ml DMF és 1,3 ml víz elegyében oldunk, és a pH-t TEA hozzáadásával 8,7-re állítjuk 35 °C hőmérsékleten. A reakciót 0,3 mg tripszin hozzáadásával indítjuk meg. A reakció 1 órán belül teljesen végbemegy. A HPLC szerinti hozam 42 % (254 nm-en meghatározva).

Elemzés:
AAA: Asp:	1,07
Arg:	2,14
Tyr :	0,90
Val:	0,90

Az UV-extinkciót 278 nm-en mértük.

4. lépés: HArgHomoArgOH előállítása

Reakcióegyenlet:

ΓΡΠ-Υ

HArgOEt.2HCl + H-HomoArgOH - -^ru· > HArgHomoArgOH

274,2 188,2 344,2 mg (0,1 mmol) L-ArgOEt.2HCl-t és 301 mg (1,6 mmol) L-homoarginint 4 mg EDTA-t tartalmazó 1,8 ml vízben oldunk, a pH-t vizes nátronlugoldattal 8,5-re állítjuk, és a reakciót 2 mg CPD-Y hozzáadásával megindítjuk. A reakció 3 órán belül »··· ··*· ···

- 96 teljesen végbemegy, ekkor a pH-t 3-ra szabályozzuk. A HPLC szerinti hozam 11 % (230 nm-en meghatározva).

Elemzés:

AAA: Arginin: 0,85

Homoarginin: 1,15

5. lépés: ZArgHomoArgAspValTyrNH₂ előállítása

A fenti 4. lépésben készült terméket az 1. lépésben leirt módszerrel dolgozzuk fel, s igy ZArgHomoArgOEt.2HCl-t kapunk, amelyet tripszinnel katalizált reakcióban a 3. lépésben leirt eljárást követve AspValTyrNH₂-vel kapcsolunk, s igy ZArgHomoArgAspValTyrNH₂-hoz jutunk.

W. példa

ZDArgArgDAspValTyrNH₂ szintézise a (IV) stratégia szerint (lásd a 20) reakcióvázlatot)

1. lépés: ZDArgArgOEt.2HC1 előállítása

E vegyületet az U. példa 1. lépésében leirt eljárással állítjuk elő.

2. lépés: ZArgArgDAsp(0Et)₂ előállítása

Reakcióegyenlet:

ZDArgArgOEt.2HC1 + HDAsp(0Et)₂ .^triP^szin.> ZDArgArgDAsp(0Et)₂

562,5 225,5 635,7 g (0,07 mmol) ZDArgArgOEt.2HCl-t és 20 mg (0,9 mmol) H-DAsp(0Et)₂.HCl-t 0,6 ml DMF és 1,4 ml viz elegyében oldunk, és a pH-t vizes nátronlugoldattal 8,5-re állítjuk. A reakciót 0,5 mg tripszin hozzáadásával indítjuk. A reakció 30 percen belül teljessé válik, ekkor leállítjuk úgy, hogy az elegy pH-értékét 3-ra csökkentjük. A HPLC szerinti hozam 14 % (254 nm-en meghatározva) .

«··· »·♦<

• * ·* ·

- 97 Elemzés :

AAA: Asp: 1,01

Arg: 1,99

3. lépés: HC1.HValTyrNH₂ előállítása

E vegyületet az A. példa 2. lépésében leirt eljárással állítjuk elő.

4. lépés: ZDArgArgDAspValTyrNH₂ előállítása

A 2. lépés termékét megfelelő karboxil-észter-hidroláz enzimmel (például lipázzal) kezeljük vizes oldatban, közel semleges pH-érték mellett.

Az igy kapott ZDArgArgDAsp(OEt)OH-t a reakcióelegyből ioncserélő kromatográfiával vagy előnyösen C18 RP-HPLC utján különítjük el. A tiszta terméket tartalmazó frakciókat egyesítjük, majd feleslegben vett 2 mól, vizes sósav jelenlétében liof ilizál juk. Az igy kapott ZDArgArgDAsp(0Et)0H.2HC1 sóterméket C-komponensként alkalmazzuk DCC-vel közvetített HO-BT katalízis segítségével végzett standard kémiai kapcsolásban, ahol aminokomponensként HValTyrNH₂.HCl-t használunk; a reaktánsokat és az NMM-t ekvimoláris mennyiségekben alkalmazzuk, oldószerként DMF-t használunk.

A ZDArgArgDAsp(OEt)ValTyrNH₂-t C18 RP-HPLC eljárással izoláljuk, és 0,1 n vizes nátronluggal kezelve jutunk a 4. lépés cim szerinti termékéhez.

Claims (23)

1. Szabadalmi igénypontok

   1. Eljárás az (1) általános képletű r₁-a-b-c-d-e-r₂ peptidek előállítására, ahol A, B, C, D és E peptidkötéssel kapcsolódó aminosavmaradékokat jelentenek, és

   A jelentése L- vagy D-konf igurációjú, &z-amino- vagy íű-guanidino-csoporttal szubsztituált bázisos aminosavmaradék, vagy adott esetben ilyen aminosavmaradékok adott esetben szubsztituált dezaminoszármazéka;

   B jelentése bázisos, AT-amino- vagy CJ-guanidino-csoporttal szubsztituált L-aminosavmaradék; vagy B L-Pro vagy L-dehidroPro maradékot is jelenthet;

   C jelentése L- vagy D-konfigurációjú, savas jellegű aminosavmaradék;

   D jelentése nempoláris, hidrofób, alifás L-aminosavmaradék; vagy olyan L-aminosavmaradék, amely az arilcsoporton adott esetben nitro-, hidroxil-, alkoxi- vagy alkilcsoporttal és/vagy halogénnel szubsztituált homo- vagy heteroaromás aril- vagy aralkilcsoportot tartalmaz;

   E jelentése nempoláris, L- vagy D-konfigurációjú, hidrofób, alifás aminosavmaradék; vagy L- vagy D-konfigurációjú olyan aminosavmaradék, amely az arilcsoporton adott esetben nitro-, hidroxil-, alkoxi- vagy alkilcsoporttal és/vagy halogénnel szubsztituált homo- vagy heteroaromás aril- vagy aralkilcsoportot tartalmaz; vagy ilyen aminosavmaradékok adott esetben szubsztituált dekarboxiszármazéka;

   • · · « 9 · · • * * ··· ♦ ·· · *

   - 99 R^ jelentése hidrogénatom; vagy pt-amino-szubsztituens csoport, így kémiai vagy enzimes úton lehasítható oL-amino-védőcsoport; vagy hiányzik, ha A szubsztituálatlan dezaminoszármazékot jelent; és

   R₂ jelentése hidroxilcsoport; vagy o(-karboxil-szubsztituens csoport, így kémiai vagy enzimes úton lehasítható ci-karboxil-védőcsoport; vagy hiányzik, ha E jelentése szubsztituálatlan dekarboxiszármazék olyan módon, hogy a fenti maradékoknak megfelelő aminosavak adott esetben védett, reakcióképes származékait szekvenciálisán (megfelelő sorrendben) kapcsoljuk, és/vagy a fenti aminosavmaradékokból álló, adott esetben védett, reakcióképes di-, tri- vagy tetrapeptid-fragmentumot kapcsolunk egy vagy több célszerűen választott A+B, C+D, D+E, AB+C, C+DE, CD+E, ABC+D, AB+CD, AB+CDE, ABC+DE vagy ABCD+E típusú reakció útján, majd kívánt esetben az esetleg jelenlévő terminális és/vagy oldallánc-védőcsoportokat eltávolítjuk, és a kívánt ABCDE peptid kialakítása után vagy egy előző kapcsolási reakció során vagy az előtt az R^ és R₂ csoportokat - kívánt esetben egymástól függetlenül - bevezetjük, azzal jellemezve , hogy intermedierként olyan ZpAB-Y₂ általános képletü dipeptidszármazékot alkalmazunk, ahol Z·^, A és B jelentése a fentiekben meghatározott, Y₂ hidroxilcsoportot vagy o^-karboxil-szubsztituens csoportot jelent, és az oldalláncok védőcsoportot nem tartalmaznak, és ezt a dipeptidet egy C(X})-Y-j, C(X₃)-D(X₄)-Y₄ vagy C(X-j)-D(X₄)-E(X^)-Y5 általános képletű reakcióképes aminosavszármazékkal vagy peptidszármazékkal - ahol: C, D és E jelentése a fentiekben meghatározott; Y^, Y₄ és Y^ jelentése hidroxilcsoport vagy valamilyen -karboxi1-szubszti• · ·*·· · *♦· • · * · • 44 · ·· ·* • · · 4 4 ·4 • 4 · 4 · ··

   - 100 tuens csoport, amelyek az R₂ csoporttal azonosak vagy különbözők lehetnek; és X-j, X^ és X^ jelentése hidrogénatom vagy &j-oldallánc-védőcsoport - vizes vagy részben vizes közegben 3-12 közötti pH-érték mellett, előnyösen 5-10 pH-érték mellett valamilyen karbonsavészter-hidroláz vagy peptid-hidroláz enzim, így tiol-endoproteáz, például bromelain, klosztripain, papain, kimopapain vagy ficin, vagy valamilyen szerin-endoproteáz, így Achromobacter lyticus proteáz-I, trombin, szubtilizin, vagy poszt-prolin-specifikus endopeptidáz, vagy valamilyen karboxi-peptidáz, így CPD-MI vagy előnyösen CPD-Y vagy CPD-MII vagy dipeptidil-peptidáz-I vagy dipeptidil-karboxi-peptidáz-II jelenlétében reagáltatva peptiddé alakítjuk, majd az így kapott peptidet kívánt esetben ugyanazon vagy valamilyen más proteolítikus enzim jelenlétében - amely a reaktánsok közötti peptidkötés kialakítására képes - egy reakcióképes aminosavszármazékkal vagy peptidszármazékkal kapcsoljuk, és szükség esetén további enzimes vagy kémiai kapcsoló reakciókat hajtunk végre a fenti reakciótípusok útján, s így egy adott esetben védett

   Z₁-A-B-C(X₃)-D(X₄)-E(X₅)-Y₅ általános képletű peptidszármazékhoz jutunk, ahol A, B, C, D, Z^, Xj, X/p X5 és Y^ a fentiek szerint meghatározott, majd ezt követően kívánt esetben a szubsztituens csoportokat kémiai vagy enzimes úton eltávolítjuk, és szükséges esetben az R^ és/vagy R₂ csoportot bevezetjük .
2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve , hogy olyan Z₁-AB-Y₂ általános képletű intermediert alkalmazunk, amelyet Z-^-A-Y^ és H-B-Y₂ általános képletű vegyületek reakciójával - ahol Zp A, B és Y₂ jelentése az 1. igénypontban meghatározott, és Y^ jelentése Y₂ jelentésével azonos - az 1. igénypontban meg·« «* »»·· ·♦··

   101 határozott körülmények között valamely tiol-endoproteáz, így bromelain, ficin vagy előnyösen klosztripain, papain vagy kimopapain vagy szerin-endoproteáz, egy Achromobacter lyticus proteáz-I, ArgC vagy LysC endoproteináz, trombin, szubtilizin vagy előnyösen tripszin, dipeptidil-peptidáz-I vagy karboxi-peptidáz, így CPD-MI vagy előnyösen CPD-Y vagy CPD-MII enzim jelenlétében állítunk elő.
3. 3. Eljárás az (1) általános képletű r₁-a-b-c-d-e-r₂ peptidek előállítására, ahol A, B, C, D, E, R^ és R₂ jelentése az 1. igénypontban meghatározott, oly módon, hogy a fenti maradékoknak megfelelő aminosavak adott esetben védett, reakcióképes származékait megfelelő sorrendben kapcsoljuk és/vagy a fenti aminosavmaradékokból álló, adott esetben védett, reakcióképes di-, tri- vagy tetrapeptidszármazékot kapcsolunk egy vagy több célszerűen választott A+B, B+C, D+E, AB+C, A+BC, C+DE, BCD+E, B+CDE, BC+DE, A+BCDE, AB+CDE vagy ABC+DE típusú reakció útján, majd kívánt esetben az esetleg jelenlévő terminális és/vagy oldallánc-védőcsoportokat eltávolítjuk, és kívánt esetben a kívánt ABCDE peptid kialakítása után, vagy egy előző kapcsolási reakció során vagy előtt az R^ és R₂ csoportokat - kívánt esetben egymástól függetlenül - bevezetjük, azzal jellemezve , hogy intermedierként olyan D(X^ ^-ΕζΧ^-Υ^ általános képletű dipeptidszármazékot alkalmazunk, ahol D, E és Y^ jelentése a fentiekben meghatározott, és ezt az intermediert egy lános képletű, reakcióképes aminosavszármazékkal vagy peptidszármazékkal - ahol A, B, C, Z^, Z-j, X-j és Y^ jelentése a fentiekben meghatározott, Z₂ hidrogénatomot vagy amino-szubsztituens ·* ·· ·>·· ···♦ • » · ♦ · ··· ♦ * ·····»· »« ♦· *· *

   - 102 csoportot jelent, és valamint jelentése hidrogénatom vagy /J-oldallánc-védőcsoport - vizes vagy részben vizes közegben, 3 és 12 közötti, előnyösen 5 és 10 közötti pH-érték mellett, valamely karboxil-észter-hidroláz vagy peptid-hidroláz enzim, így valamilyen metalloproteináz, előnyösen termolizin, szerin-endoproteáz, így szubtilizin, termitáz vagy előnyösen Drapeau V8 vagy kimotripszin, vagy karboxi-peptidáz, így CPD-Y vagy CPD-MII vagy dipeptidil-karboxi-peptidáz-II enzim jelenlétében reagáltatva peptiddé alakítjuk, majd az így kapott pepiidet kívánt esetben ugyanazon vagy valamilyen más proteolítikus enzim jelenlétében, amely a reaktánsok közötti peptidkötés kialakítására képes, egy reakcióképes aminosavszármazékkal vagy peptidszármazékkal kapcsoljuk, és szükség esetén további enzimes vagy kémiai kapcsoló reakciókat hajtunk végre a fenti reakciótípusok útján, s így egy adott esetben védett

   X₁-A(X₁)-B(X₂)-C(X₃)-D(X₄)-E(X₅)-Y₅ általános képletű peptidszármazékhoz jutunk, ahol A, B, C, D, Z|, X|, X₂, X₃ és Y^ jelentése a fentiekben meghatározott, majd ezt követően kívánt esetben a szubsztituens csoportokat kémiai vagy enzimes úton eltávolítjuk, és szükséges esetben az és/vagy R? csoportot bevezetjük.
4. 4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás olyan (1) általános képletű peptidek előállítására, amelyekben

   A és B W'-szubsztituált bázisos aminosavmaradékoknak megfelelő áJ-szubsztituált bázisos aminosav az (I) vagy (II) általános képletű aminosav - ahol n értéke 1-től 7-ig terjedő egész szám;

   R^¹ és R₂' jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom, ·« »· ·»»»»·>« * » · · ·«-· · ·· · * • · » · · · « • · · · · · ·

   - 103 1-3 szénatomos alkilcsoport vagy piranozilcsoport; vagy R^' és R2* e9Yüttes jelentése általános képletű csoport, amelyben n' értéke 3-tól 8-ig terjedő egész szám;

   vagy az A maradék D-konfigurációjú is lehet és/vagy a fenti aminosavmaradékok dezaminoszármazékait is jelentheti, amelyek kívánt esetben 1-4 szénatomos alkil-, hidroxi-(l-4 szénatomos alkil)vagy halogén-(l-4 szénatomos alkil)-csoporttal szubsztituálva lehetnek; C savas jellegű savmaradéknak megfelelő íiPkarboxi-szubsztituált aminosav egy (III) általános képletű aminosav - ahol m értéke O-tól 7-ig terjedő egész szám; vagy további karboxil-szubsztituens csoport vagy W-szulfonsavcsopor tót vagy foszfonsavcsoportot tartalmaz az áGkarboxilcsoport helyett;

   D nempoláris, hidrofób, alifás aminosavmaradéknak megfelelő aminosav a (IV) általános képletű aminosav, ahol R^, R£ és R^ jelentése egymástól függetlenül: hidrogénatom vagy egyenes vagy elágazó szénláncú alkilcsoport; vagy D egy (V) általános képletű L-aminosav maradéka is lehet, ahol az (V) képletben p értéke 0, 1, 2, 3, 4 vagy 5, és Ar jelentése adott esetben nitro-, hidroxil-, alkoxicsoporttal és/vagy halogénatommal szubsztítuált hetero- vagy homoarilcsoport;

   E aminosavmaradékoknak megfelelő aminosavak a D maradékoknak megfelelő aminosavakkal azonosak, azonban: mind L-, mind D-konfigurációjúak lehetnek; vagy ezen aminosavak dekarboxiszármazékai vagy kívánt esetben 1-4 szénatomos alkil-, hidroxi-(l-4 szénatomos alkil)-csoporttal vagy halogénatommal szubsztituáltak lehetnek, előnyösen azok fluorral szubsztítuált származékai; vagy nitro-, ·· *·«· · ···

   - 104 alkoxi-, hidroxilcsoporttal és/vagy halogénatommal szubsztituált

   Trp, Phe vagy His maradékok lehetnek; és és R₂ jelentése az 1. igénypontban meghatározott, azzal jellemezve , hogy a megfelelő kiinduló anyagokat alkalmazzuk.
5. 5. A 4. igénypont szerinti eljárás olyan (1) általános képletű peptidek előállítására, ahol

   A jelentése L- vagy D-konfigurációjú Arg, Lys, Orn, HomoArg vagy HomoLys;

   B jelentése L-konfigurációjú Arg, Lys, Orn, Homo-Arg, Homo-Lys vagy Pro;

   C jelentése L- vagy D-konfigurációjú Asp, Glu vagy Homo-Glu;

   D jelentése L-konfigurációjú Val, Ile, Leu, Nor-Leu, Nor-Val,

   Tert-Leu, Phe, Tyr vagy Alá;

   D jelentése L-konfigurációjú Val, Ile, Leu, Nor-Leu, Nor-Val, Tert-Leu, Phe, Tyr vagy Alá;

   E jelentése L- vagy D-konfigurációjú Val, Ile, Leu, Nor-Leu, Nor-Val, Tert-Leu, Tyr, Trp, Phe, His vagy Nal;

   vagy azok dekarboxiszármazékai; vagy nitro-, alkoxi-, hidroxilcsoporttal és/vagy halogénnel szubsztituált Trp, Phe vagy His; és R| és R₂ jelentése az 1. igénypontban meghatározott, azzal jellemezve , hogy a megfelelő kiinduló anyagokat alkalmazzuk .
6. 6. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve , hogy karboxilkomponensként a Z^-AB-Y₂ általános képletű dipeptidszármazékot egy adott esetben védett 0(Χ^)-ϋ(Χ^)-Ε(Χ^)-Υ5 általános képletű tripeptidszármazékkal, mint aminkomponenssel - ahol a betűszimbólumok jelentése az 1. igény·« ··»· ♦··*

   105 pontban meghatározott - egy endoproteáz vagy dipeptidil-peptidáz enzim jelenlétében - amely a komponensek közötti peptidkötés kialakítására képes - kapcsoljuk, majd kívánt esetben az esetleg jelenlévő védőcsoportokat eltávolítjuk, és szükséges esetben az R^ és/vagy R? csoportokat bevezetjük.
7. 7. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve , hogy az alkalmazott C(Xj)-D(X₄)-E(X₅)-Y₅ általános képletű tripeptidszármazékot egy Z^-C(X-j)-Y-j általános képletű aminosavszármazék DCX^-ECX^-Y^ általános képletű dipeptidszármazékkal valamilyen endoproteáz vagy dipeptidil-karboxi-peptidáz enzim jelenlétében végzett kapcsolási reakciójával állítjuk elő.
8. 8. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve , hogy karboxilkomponensként egy adott esetben védett Z₁-A(X₁)-B(X₂)-C(X₅)-Yj általános képletű tripeptidszármazékkal, mint aminkomponenssel - ahol e képletekben a betűszimbólumok jelentése az 1. igénypontban meghatározott - egy endoproteáz, lipáz vagy dipeptidil-karboxi-peptidáz enzim jelenlétében

   - amely a komponensek közötti peptidkötés kialakítására képes - kapcsolunk, majd kívánt esetben az esetleg jelenlévő védőcsoportokat eltávolítjuk, és szükséges esetben az R^ és R₂ csoportokat bevezetjük.
9. 9. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az alkalmazott Z-_l-A(X-^)-B(X₂)-C(X-₅)-Y-j általános képletű tripeptidszármazékot egy Z|-A(X-^)-Y| általános képletű aminosavszármazék B(X₂)-C(X-j)-Y-j általános képletű dipeptidszármazékkal valamilyen endoproteáz vagy dipeptidil-peptidáz enzim jelenlétében végzett kapcsolási reakciójával, vagy egy Ζ·^-Α(Χ|)-Β(Χ₂)-Υ₂ általános képletű dipeptidszármazék Z^-C(X^)-Y^ aminosavszármazékkal valamilyen endoproteáz vagy karboxi-peptidáz enzim jelenlétében ·· ·« •♦•j ♦·*!

   ··« ··♦ · · • · « · * * ?

   ·· *· ♦

   106 végzett kapcsolási reakciójával állítjuk elő.
10. 10. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve , hogy karboxilkomponensként egy adott esetben védett Zi-A-B-C(X2)-D(X₄)-Yáltalános képletű tetrapeptidszármazékot egy adott esetben védett E(X^)-általános képletű aminosavszármazékkal, mint aminkomponenssel - ahol a betűszimbólumok jelentése az 1. igénypontban meghatározott - egy endoproteáz, lipáz vagy karboxi-peptidáz enzim jelenlétében - amely a komponensek közötti peptidkötés kialakítására képes - kapcsolunk, majd kívánt esetben az esetleg jelenlévő védőcsoportokat eltávolítjuk, és szükséges esetben az és/vagy R₂ csoportokat bevezetjük.
11. 11. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az alkalmazott Ζ-^-Α-Β-0(Χ₃)-0(Χ^)-Υ^ általános képletű tetrapeptidszármazékot egy Z₁-A-B-Y₂ általános képletű dipeptidszármazék és egy C(X-j)-D(X₄)-Y₄ általános képletű dipeptidszármazékkal valamilyen endoproteáz vagy dipeptidil-peptidáz vagy dipeptidil-karboxi-peptidáz enzim jelenlétében végzett fragmentum-kapcsolási reakciójával vagy egy Ζ^-Λ-Β-ί/Χ^-Υ^ általános képletű tripeptidszármazék DCX^-Y^ általános képletű aminosavszármazékkal valamilyen endoproteáz vagy karboxi-peptidáz enzim jelenlétében végzett fragmentum-kapcsolási reakciójával állítjuk elő.
12. 12. Az 1-11. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve , hogy az A és B maradékok közötti kötés kialakításához valamilyen tiol-endoproteáz, szerin-endoproteáz, karboxi-peptidáz, dipeptidáz vagy dipeptidil-peptidáz enzimet alkalmazunk.
13. 13. Az 1-12. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve , hogy az A, B és C maradékok közötti kötés kialakításához valamilyen tiol-endoproteáz, szerin-endoproteáz, karboxi- • V ·· • · ··· ··· •••g *··ζ

    - 107 -peptidáz, dipeptidáz, dipeptidil-peptidáz vagy dipeptidil-karboxi-peptidáz enzimet alkalmazunk.
14. 14. Az 1-13. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve , hogy a C és D maradékok közötti kötés kialakításához valamilyen szerin-endoproteáz, metallo-endoproteáz, aszparagin-proteáz, karboxi-peptidáz, dipeptidáz, észteráz, lipáz vagy dipeptidil-karboxi-peptidáz enzimet alkalmazunk.
15. 15. Az 1-14. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve , hogy a D és E maradékok közötti kötés kialakításához valamilyen tiol-endoproteáz, szerin-endoproteáz, metallo-endoproteáz, karboxi-peptidáz, dipeptidáz, észteráz vagy lipáz enzimet alkalmazunk.
16. 16. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve , hogy termolizint vagy valamilyen tiol-endoproteázt, így kimopapaint, ficint vagy előnyösen papaint vagy bromelaint, vagy valamilyen szerin-endoproteázt, így termitázt, vagy előnyösen szubtilizint, elasztázt, valil-proteinázt vagy kimotripszint, vagy valamilyen karboxi-peptidázt, így CPD-MII-t vagy előnyösen CPD-Y-t alkalmazunk.
17. 17. Eljárás a Z^-A-B-OR általános képletű, védett dipeptidek - ahol Z^, A és B jelentése az 1. igénypontban meghatározott, és R egyenes vagy elágazó szénláncú 1-6 szénatomos alkilcsoportot vagy adott esetben szubsztituált benzilcsoportot jelent - előállítására, azzal jellemezve , hogy a megfelelő kiinduló anyagokat alkalmazzuk.

    1B. A 17. igénypont szerinti eljárás a CbzArgLysOR általános képletű - ahol R jelentése a 17. igénypontban meghatározott védett dipeptidek előállítására, azzal jellemezve , hogy a megfelelő kiinduló anyagokat alkalmazzuk.

    •β ···· ·♦♦!

    • · ··· «·· · · • · · · · _β* ·

    - 108 -
18. 19. Eljárás a Z₁~A-B-C(OR')(OR) általános képletű - ahol Z^, A, B és C jelentése az 1. igénypontban meghatározott, és R', valamint R jelentése egymástól függetlenül azonos az R csoport 17. igénypontban meghatározott jelentésével - védett tripeptidek előállítására, azzal jellemezve , hogy a megfelelő kiinduló anyagokat alkalmazzuk.
19. 20. A 19. igénypont szerinti eljárás a CbzArgLysC¹(OR)₂ általános képletű - ahol C' jelentése Asp vagy Glu, és R jelentése a 17. igénypontban meghatározott - védett tripeptidek előállítására, azzal jellemezve , hogy a megfelelő kiinduló anyagokat alkalmazzuk .
20. 21. Eljárás a Z-^-A-B-C(0R)0H általános képletű - ahol Z^, A, B, C és R jelentése a 19. igénypontban meghatározott - védett tripeptidek előállítására, azzal jellemezve , hogy a megfelelő kiinduló anyagokat alkalmazzuk.
21. 22. A 21. igénypont szerinti eljárás a CbzArgLysC'(OR)0H általános képletű - ahol 0' jelentése Asp vagy Glu, és R jelentése a

    17. igénypontban meghatározott - védett tripeptidek előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiinduló anyagokat alkalmazzuk .
22. 23. Eljárás a Z^-A-B-CCOR')-D(0R') általános képletű - ahol A, B, C és D jelentése az 5. igénypontban meghatározott, Z^ jelentése az 1. igénypontban meghatározott, R', valamint R' 1-6 szénatomos alkilcsoportot vagy adott esetben szubsztituált benzilcsoportot jelent, és R' hidrogénatomot is jelenthet - védett tetrapeptidek előállítására, azzal jellemezve , hogy a megfelelő kiinduló anyagokat alkalmazzuk.

    . - 109 - ·· ·»·· ·♦··
23. 24. A 23. igénypont szerinti eljárás a CbzArgLysC'(0R¹)-0(0R ') általános képletü - ahol C' jelentése Asp vagy Glu, és D, R', valamint R' jelentése a 23. igénypontban meghatározott - védett tetrapeptidek előállítására, azzal jellemezve , hogy a megfelelő kiinduló anyagokat alkalmazzuk.