JPH06169790A - 酵素を用いるペプチド合成方法 - Google Patents
酵素を用いるペプチド合成方法Info
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- JPH06169790A JPH06169790A JP35080492A JP35080492A JPH06169790A JP H06169790 A JPH06169790 A JP H06169790A JP 35080492 A JP35080492 A JP 35080492A JP 35080492 A JP35080492 A JP 35080492A JP H06169790 A JPH06169790 A JP H06169790A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 安全且つ簡便な、特定有用ペプチドの製造方
法の提供 【構成】 アミノ基が保護されていてもよいペプチド又
はアミノ基が保護されたα−アミノ酸（カルボキシル成
分）とＸ−Ｙ（式中、Ｘはα位がイミノ基であるα−ア
ミノ酸の残基を表し、Ｙは任意のα−アミノ酸の残基を
表す）又は Ala−Ｘ（Ｘは前記と同義である）で表され
るジペプチド（アミン成分）とを水溶性有機溶媒を５〜
５０容量％含有する緩衝液中、上記カルボキシル成分と
アミン成分とを結合し得る能力を有するジペプチジルカ
ルボキシペプチダーゼの存在下、カルボキシル成分に対
しアミン成分を１０〜２５倍モル用いて反応させ、つい
で必要に応じアミノ保護基を除去することを特徴とする
カルボキシル成分のカルボキシ末端にアミン成分がペプ
チド結合した、アミノ基が保護されていてもよいペプチ
ドを製造する方法。
法の提供 【構成】 アミノ基が保護されていてもよいペプチド又
はアミノ基が保護されたα−アミノ酸（カルボキシル成
分）とＸ−Ｙ（式中、Ｘはα位がイミノ基であるα−ア
ミノ酸の残基を表し、Ｙは任意のα−アミノ酸の残基を
表す）又は Ala−Ｘ（Ｘは前記と同義である）で表され
るジペプチド（アミン成分）とを水溶性有機溶媒を５〜
５０容量％含有する緩衝液中、上記カルボキシル成分と
アミン成分とを結合し得る能力を有するジペプチジルカ
ルボキシペプチダーゼの存在下、カルボキシル成分に対
しアミン成分を１０〜２５倍モル用いて反応させ、つい
で必要に応じアミノ保護基を除去することを特徴とする
カルボキシル成分のカルボキシ末端にアミン成分がペプ
チド結合した、アミノ基が保護されていてもよいペプチ
ドを製造する方法。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は酵素を用いるペプチド合
成方法、さらに詳しくは特異的酵素を用いてペプチド又
はアミノ酸のカルボキシル末端に、α位がイミノ基であ
るα−アミノ酸（例えばプロリン）のカルボキシル末端
に任意のα−アミノ酸がペプチド結合したジペプチド又
はアラニンのカルボキシル末端に上記α−アミノ酸がペ
プチド結合したジペプチドをペプチド結合させたペプチ
ドを製造する方法に関する。本発明方法によって、例え
ば医薬品又は食品への利用が期待されるペプチドを合成
することができる。
成方法、さらに詳しくは特異的酵素を用いてペプチド又
はアミノ酸のカルボキシル末端に、α位がイミノ基であ
るα−アミノ酸（例えばプロリン）のカルボキシル末端
に任意のα−アミノ酸がペプチド結合したジペプチド又
はアラニンのカルボキシル末端に上記α−アミノ酸がペ
プチド結合したジペプチドをペプチド結合させたペプチ
ドを製造する方法に関する。本発明方法によって、例え
ば医薬品又は食品への利用が期待されるペプチドを合成
することができる。
【０００２】
【従来の技術】ペプチドは通常有機化学的な合成方法に
よりアミノ酸を段階的に導入する方法により製造される
が、他に、天然タンパク質の酵素加水分解法、酵素法に
よるペプチド合成、遺伝子工学的方法によって製造する
ことも可能である。有機化学的な合成方法によりアミノ
酸を段階的に導入する方法としては固相ペプチド合成ま
たは液相ペプチド合成法が知られており、例えば泉屋信
夫他著「ペプチド合成の基礎と実験」丸善（株）に詳細
に記載されている。液相ペプチド合成では、カルボキシ
ル末端に位置すべきアミノ酸のカルボキシル基をベンジ
ル基（Bzl)、ｔ−ブチル基(t-Bu)等で保護し、カルボキ
シル末端から２番目に位置すべきアミノ酸のアミノ基を
ｔ−ブチルオキシカルボニル基(Boc) 、ベンジルオキシ
カルボニル基（Ｚ）等で保護し、側鎖に官能基を有する
アミノ酸は適当な保護基によって保護した後、これらを
ジメチルホルムアミド（DMF)等に溶解し、ジシクロヘキ
シルカルボジイミド(DCC) 及び１−ヒドロキシベンゾト
リアゾール(HOBT)の存在下４℃で１８時間反応させる。
ついで、生成物のアミノ保護基の常法（トリフルオロ酢
酸などによる）による除去の後に得られるジペプチドを
第３のアミノ酸（これもアミノ基を保護してある）とと
もに上記と同様にして反応させる。更に、同様な手順を
繰り返して順次必要なアミノ酸を結合させ、保護基の結
合した状態の目的ペプチドを得る。最後にこれらの保護
基を接触還元やフッ化水素(HF)などにより除去し、目的
とするペプチドを得ることができる。この方法は任意の
ペプチドや複雑な構造のペプチドを合成するには適して
いるが、煩雑であり、危険な試薬を多量に使用するなど
の問題がある。
よりアミノ酸を段階的に導入する方法により製造される
が、他に、天然タンパク質の酵素加水分解法、酵素法に
よるペプチド合成、遺伝子工学的方法によって製造する
ことも可能である。有機化学的な合成方法によりアミノ
酸を段階的に導入する方法としては固相ペプチド合成ま
たは液相ペプチド合成法が知られており、例えば泉屋信
夫他著「ペプチド合成の基礎と実験」丸善（株）に詳細
に記載されている。液相ペプチド合成では、カルボキシ
ル末端に位置すべきアミノ酸のカルボキシル基をベンジ
ル基（Bzl)、ｔ−ブチル基(t-Bu)等で保護し、カルボキ
シル末端から２番目に位置すべきアミノ酸のアミノ基を
ｔ−ブチルオキシカルボニル基(Boc) 、ベンジルオキシ
カルボニル基（Ｚ）等で保護し、側鎖に官能基を有する
アミノ酸は適当な保護基によって保護した後、これらを
ジメチルホルムアミド（DMF)等に溶解し、ジシクロヘキ
シルカルボジイミド(DCC) 及び１−ヒドロキシベンゾト
リアゾール(HOBT)の存在下４℃で１８時間反応させる。
ついで、生成物のアミノ保護基の常法（トリフルオロ酢
酸などによる）による除去の後に得られるジペプチドを
第３のアミノ酸（これもアミノ基を保護してある）とと
もに上記と同様にして反応させる。更に、同様な手順を
繰り返して順次必要なアミノ酸を結合させ、保護基の結
合した状態の目的ペプチドを得る。最後にこれらの保護
基を接触還元やフッ化水素(HF)などにより除去し、目的
とするペプチドを得ることができる。この方法は任意の
ペプチドや複雑な構造のペプチドを合成するには適して
いるが、煩雑であり、危険な試薬を多量に使用するなど
の問題がある。
【０００３】天然タンパク質の酵素加水分解によりペプ
チドを得る方法としては、牛乳カゼインをトリプシンで
加水分解し、或はとうもろこし蛋白質を微生物由来のサ
ーモライシンで加水分解し血圧降下ペプチドを得る方法
などが知られている（丸山進、バイオサイエンスとイン
ダストリー、４７巻、38〜42頁、１９８９年）。一方、
酵素法によるペプチド合成法は主としてサーモリシン、
パパイン、ズブチリシン、ペプシン、トリプシン、キモ
トリプシンなどのエンド型プロテアーゼ或はカルボキシ
ペプチダーゼＹなどのエキソ型プロテアーゼを利用して
行われ、これまでにアスパルテーム（甘味料）、エンケ
フアリン（鎮痛剤）などが合成されてきた。また、ブタ
インシュリンのヒト型インシュリンへの変換なども行わ
れている（森原、プロテアーゼによる合成反応、「プロ
テアーゼ」一島英治編、２３７〜２６５頁、１９８３
年）。酵素法によるペプチド合成法は、縮合、置換の２
種の方法があり前者ではフリーのカルボキシル基を有す
るカルボキシル成分にアミン成分を置換させ、後者では
エステルまたはアミド化したカルボキシル成分にアミン
成分を置換させる。また、酵素の基質特異性の問題から
有機化学的合成法のような任意のペプチドを合成するこ
とは困難である。しかし、酵素法によるペプチド合成法
はアミノ酸の側鎖保護基を必要としていない、合成副産
物が少ない、安全、簡便であるなどの理由から食品、機
能性食品、医薬品などとして使われるペプチドの合成に
極めて有用な手段である。
チドを得る方法としては、牛乳カゼインをトリプシンで
加水分解し、或はとうもろこし蛋白質を微生物由来のサ
ーモライシンで加水分解し血圧降下ペプチドを得る方法
などが知られている（丸山進、バイオサイエンスとイン
ダストリー、４７巻、38〜42頁、１９８９年）。一方、
酵素法によるペプチド合成法は主としてサーモリシン、
パパイン、ズブチリシン、ペプシン、トリプシン、キモ
トリプシンなどのエンド型プロテアーゼ或はカルボキシ
ペプチダーゼＹなどのエキソ型プロテアーゼを利用して
行われ、これまでにアスパルテーム（甘味料）、エンケ
フアリン（鎮痛剤）などが合成されてきた。また、ブタ
インシュリンのヒト型インシュリンへの変換なども行わ
れている（森原、プロテアーゼによる合成反応、「プロ
テアーゼ」一島英治編、２３７〜２６５頁、１９８３
年）。酵素法によるペプチド合成法は、縮合、置換の２
種の方法があり前者ではフリーのカルボキシル基を有す
るカルボキシル成分にアミン成分を置換させ、後者では
エステルまたはアミド化したカルボキシル成分にアミン
成分を置換させる。また、酵素の基質特異性の問題から
有機化学的合成法のような任意のペプチドを合成するこ
とは困難である。しかし、酵素法によるペプチド合成法
はアミノ酸の側鎖保護基を必要としていない、合成副産
物が少ない、安全、簡便であるなどの理由から食品、機
能性食品、医薬品などとして使われるペプチドの合成に
極めて有用な手段である。
【０００４】近年、ペプチド系の機能性食品、医薬品と
してアンジオテンシン変換酵素阻害剤（血圧降下剤）
〔末綱邦男，発酵と工業 46 (No.3) ，179 〜182 (198
8); 丸山進, バイオサイエンスとインダストリー 47
(No.11), 38〜42 (1989);昭和63年度日本醗酵工学会大
会講演要旨集23頁(1988); 丸山進ら，平成１年度日本農
芸化学会講演要旨集８頁(1989); 三吉新介ら, 平成１年
度日本栄養食糧学会要旨集113頁(1989); 三吉新介ら，
日本農芸化学会誌 64 (3),1990 年度大会講演要旨集 5
55頁; 他〕、プロリルエンドペチダーゼ阻害剤（抗健忘
薬）〔日本農芸化学会誌 58 (111),1147 (1984); 化学
と生物 25 (9),554(1987); Agric. Biol. Chem. 55,
825 (1991); 特開平3-31298; 1990 年薬学会年会講演要
旨集p119；他〕などが注目されている。それらのいくつ
かはカルボキシル末端側にPro-Pro 、Ala-Pro などの構
造を有している。また、一般に、カルボキシル末端にプ
ロリンを有するペプチドは動物の体内においてもカルボ
キシペプチダーゼによる分解に対する抵抗性が高い。一
方、本発明者らは以前に、ペプチドのカルボキシル末端
Pro-Pro 、Ala-Proなどの構造を認識し、Pro-Pro 、Ala
-Pro を遊離させる新規なペプチダーゼ（プロリン特異
的ジペプチジルカルボキシペプチダーゼ TU-212)を発明
している〔Journal of Biochemistry, 112, 253 (199
2) ; 特開平4-58886 〕。本酵素は、ペプチドカルボキ
シル末端側の２アミノ酸残基に対する高い特異性があ
り、カルボキシル末端から２番目のアミノ酸残基として
プロリン、ピペコリン酸、Ｎ−メチルアラニンなどのα
位がイミノ基であるα−アミノ酸の残基を有するペプチ
ド、又はカルボキシル末端に、アラニンのカルボキシル
末端にα−アミノ基がイミノ基であるα−アミノ酸がペ
プチド結合したジペプチドの残基を有するペプチドをよ
く加水分解し、カルボキシル末端側ジペプチドを遊離さ
せる性質を有している（生化学、６３巻、９６６頁、１
９９１年）。
してアンジオテンシン変換酵素阻害剤（血圧降下剤）
〔末綱邦男，発酵と工業 46 (No.3) ，179 〜182 (198
8); 丸山進, バイオサイエンスとインダストリー 47
(No.11), 38〜42 (1989);昭和63年度日本醗酵工学会大
会講演要旨集23頁(1988); 丸山進ら，平成１年度日本農
芸化学会講演要旨集８頁(1989); 三吉新介ら, 平成１年
度日本栄養食糧学会要旨集113頁(1989); 三吉新介ら，
日本農芸化学会誌 64 (3),1990 年度大会講演要旨集 5
55頁; 他〕、プロリルエンドペチダーゼ阻害剤（抗健忘
薬）〔日本農芸化学会誌 58 (111),1147 (1984); 化学
と生物 25 (9),554(1987); Agric. Biol. Chem. 55,
825 (1991); 特開平3-31298; 1990 年薬学会年会講演要
旨集p119；他〕などが注目されている。それらのいくつ
かはカルボキシル末端側にPro-Pro 、Ala-Pro などの構
造を有している。また、一般に、カルボキシル末端にプ
ロリンを有するペプチドは動物の体内においてもカルボ
キシペプチダーゼによる分解に対する抵抗性が高い。一
方、本発明者らは以前に、ペプチドのカルボキシル末端
Pro-Pro 、Ala-Proなどの構造を認識し、Pro-Pro 、Ala
-Pro を遊離させる新規なペプチダーゼ（プロリン特異
的ジペプチジルカルボキシペプチダーゼ TU-212)を発明
している〔Journal of Biochemistry, 112, 253 (199
2) ; 特開平4-58886 〕。本酵素は、ペプチドカルボキ
シル末端側の２アミノ酸残基に対する高い特異性があ
り、カルボキシル末端から２番目のアミノ酸残基として
プロリン、ピペコリン酸、Ｎ−メチルアラニンなどのα
位がイミノ基であるα−アミノ酸の残基を有するペプチ
ド、又はカルボキシル末端に、アラニンのカルボキシル
末端にα−アミノ基がイミノ基であるα−アミノ酸がペ
プチド結合したジペプチドの残基を有するペプチドをよ
く加水分解し、カルボキシル末端側ジペプチドを遊離さ
せる性質を有している（生化学、６３巻、９６６頁、１
９９１年）。
【０００５】酵素法によるペプチド合成法によりプロリ
ンを結合させた例としてはプロリンイミノペプチダーゼ
による Pro-Pheの合成例があるが(Biotechnology Lette
rs,14, 175-178 (1992)) 、カルボキシル末端にプロリ
ンを結合させた訳ではない。また、ジペプチジルカルボ
キシペプチダーゼによるペプチドの合成例としてはアン
ジオテンシンＩ変換酵素によりFuranacryloyl-Phe のカ
ルボキシル末端にGly-Gly を結合させた例があるのみで
あり(Biosci. Biotech. Biochem., 56, 804-805 (199
2)) 、アンジオテンシンＩ変換酵素はプロリンの酸イミ
ド結合の加水分解は不可能であるのでプロリンを結合さ
せることも不可能と思われる。
ンを結合させた例としてはプロリンイミノペプチダーゼ
による Pro-Pheの合成例があるが(Biotechnology Lette
rs,14, 175-178 (1992)) 、カルボキシル末端にプロリ
ンを結合させた訳ではない。また、ジペプチジルカルボ
キシペプチダーゼによるペプチドの合成例としてはアン
ジオテンシンＩ変換酵素によりFuranacryloyl-Phe のカ
ルボキシル末端にGly-Gly を結合させた例があるのみで
あり(Biosci. Biotech. Biochem., 56, 804-805 (199
2)) 、アンジオテンシンＩ変換酵素はプロリンの酸イミ
ド結合の加水分解は不可能であるのでプロリンを結合さ
せることも不可能と思われる。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明は機能性食品、
医薬品としてのアンジオテンシン変換酵素阻害剤（血圧
降下剤）、プロリルエンドペプチターゼ阻害剤（抗健忘
薬）などとして有用なカルボキシル末端側に Pro-Pro、
Ala-Pro などの構造を有するペプチド、より一般的には
ペプチド又はアミノ酸のカルボキシル末端に、α位がイ
ミノ基であるα−アミノ酸( 例えばプロリン) のカルボ
キシル末端に任意のα−アミノ酸がペプチド結合したジ
ペプチド又はアラニンのカルボキシル末端に上記α−ア
ミノ酸がペプチド結合したジペプチドがペプチド結合し
たペプチドを酵素法により安全かつ簡便に製造する方法
を提供することを目的とする。
医薬品としてのアンジオテンシン変換酵素阻害剤（血圧
降下剤）、プロリルエンドペプチターゼ阻害剤（抗健忘
薬）などとして有用なカルボキシル末端側に Pro-Pro、
Ala-Pro などの構造を有するペプチド、より一般的には
ペプチド又はアミノ酸のカルボキシル末端に、α位がイ
ミノ基であるα−アミノ酸( 例えばプロリン) のカルボ
キシル末端に任意のα−アミノ酸がペプチド結合したジ
ペプチド又はアラニンのカルボキシル末端に上記α−ア
ミノ酸がペプチド結合したジペプチドがペプチド結合し
たペプチドを酵素法により安全かつ簡便に製造する方法
を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】上記目的はＮ末端アミノ
基及び／又は存在する場合の側鎖アミノ基が保護されて
いてもよいペプチド、又はα−アミノ基及び存在する場
合の側鎖アミノ基が保護されたα−アミノ酸（カルボキ
シル成分）とＸ−Ｙ（式中、Ｘはα位がイミノ基である
α−アミノ酸の残基を表し、Ｙは任意のα−アミノ酸の
残基を表す）又は Ala−Ｘ（Ｘは前記と同義である）で
表されるジペプチド（アミン成分）とを、水溶性有機溶
媒を５〜５０容量％含有する緩衝液中、上記カルボキシ
ル成分とアミン成分とを結合し得る能力を有するジペプ
チジルカルボキシペプチダーゼの存在下、カルボキシル
成分に対しアミン成分を１０〜２５倍モル用いて反応さ
せ、ついで必要に応じアミノ保護基を除去することを特
徴とするカルボキシル成分のカルボキシル末端にアミン
成分がペプチド結合した、Ｎ−末端アミノ基及び／又は
存在する場合の側鎖アミノ基が保護されてもよいペプチ
ドを製造する方法によって達成された。
基及び／又は存在する場合の側鎖アミノ基が保護されて
いてもよいペプチド、又はα−アミノ基及び存在する場
合の側鎖アミノ基が保護されたα−アミノ酸（カルボキ
シル成分）とＸ−Ｙ（式中、Ｘはα位がイミノ基である
α−アミノ酸の残基を表し、Ｙは任意のα−アミノ酸の
残基を表す）又は Ala−Ｘ（Ｘは前記と同義である）で
表されるジペプチド（アミン成分）とを、水溶性有機溶
媒を５〜５０容量％含有する緩衝液中、上記カルボキシ
ル成分とアミン成分とを結合し得る能力を有するジペプ
チジルカルボキシペプチダーゼの存在下、カルボキシル
成分に対しアミン成分を１０〜２５倍モル用いて反応さ
せ、ついで必要に応じアミノ保護基を除去することを特
徴とするカルボキシル成分のカルボキシル末端にアミン
成分がペプチド結合した、Ｎ−末端アミノ基及び／又は
存在する場合の側鎖アミノ基が保護されてもよいペプチ
ドを製造する方法によって達成された。
【０００８】カルボキシル成分がペプチドである場合に
はそのアミノ基〔Ｎ末端アミノ基（イミノ基である場合
も含む）及び／又は存在する場合の側鎖アミノ基（イミ
ノ基である場合も含む）〕は保護されていてもいなくて
もよい（もっとも保護されている方が好ましい）が、ア
ミノ酸である場合にはそのアミノ基〔α−アミノ基（イ
ミノ基である場合も含む）及び存在する場合の側鎖アミ
ノ基（イミノ基である場合も含む）〕は保護されている
ことが一般に必須である。カルボキシル成分がペプチド
である場合、構成アミノ酸の数に特に制限はないが、通
常２〜100 、好ましくは２〜20である。ジペプチドであ
るアミン成分を構成するα−アミノ基がイミノ基である
α−アミノ酸はプロリン、オキシプロリン、デヒドロプ
ロリン、サルコシン、ピペコリン酸、Ｎ−メチルアラニ
ン等を包含する。又、ペプチド成分Ｘ−Ｙ中のＹは任意
のα−アミノ酸残基であり、従ってＸ−ＹはＸ−Ｘ（こ
こで２つのＸは前記定義を満たしている限り、同一であ
っても異なっていてもよい）を包含する。アミン成分は
カルボキシル成分に対し一般に10〜25倍モル使用する。
これは目的ペプチドを効率よく製造するためである。酵
素反応を行わせる際のカルボキシル成分及びアミン成分
の濃度は特に制限がなく、一般的に飽和濃度まで可能で
あるが、それぞれ１〜20mM及び10〜500mM であるのが適
当である。
はそのアミノ基〔Ｎ末端アミノ基（イミノ基である場合
も含む）及び／又は存在する場合の側鎖アミノ基（イミ
ノ基である場合も含む）〕は保護されていてもいなくて
もよい（もっとも保護されている方が好ましい）が、ア
ミノ酸である場合にはそのアミノ基〔α−アミノ基（イ
ミノ基である場合も含む）及び存在する場合の側鎖アミ
ノ基（イミノ基である場合も含む）〕は保護されている
ことが一般に必須である。カルボキシル成分がペプチド
である場合、構成アミノ酸の数に特に制限はないが、通
常２〜100 、好ましくは２〜20である。ジペプチドであ
るアミン成分を構成するα−アミノ基がイミノ基である
α−アミノ酸はプロリン、オキシプロリン、デヒドロプ
ロリン、サルコシン、ピペコリン酸、Ｎ−メチルアラニ
ン等を包含する。又、ペプチド成分Ｘ−Ｙ中のＹは任意
のα−アミノ酸残基であり、従ってＸ−ＹはＸ−Ｘ（こ
こで２つのＸは前記定義を満たしている限り、同一であ
っても異なっていてもよい）を包含する。アミン成分は
カルボキシル成分に対し一般に10〜25倍モル使用する。
これは目的ペプチドを効率よく製造するためである。酵
素反応を行わせる際のカルボキシル成分及びアミン成分
の濃度は特に制限がなく、一般的に飽和濃度まで可能で
あるが、それぞれ１〜20mM及び10〜500mM であるのが適
当である。
【０００９】本発明で使用する酵素は上記カルボキシル
成分とアミン成分とを結合し得る能力を有するジペプチ
ジルカルボキシペプチダーゼであればいずれの酵素でも
よいが、具体例として前出の特開平4-58886 に記載のプ
ロリン特異的ジペプチジルカルボキシペプチダーゼTU-2
12がある。プロリン特異的ジペプチジルカルボキシペプ
チダーゼTU-212の使用濃度は最終濃度１〜30ユニット／
mlであることが適当である。なおこの場合、酵素１ユニ
ットは１分間に１μmol のBoc-(Pro)4を分解する酵素量
である。使用する酵素の純度に特に制限はなく、純品の
みならず粗酵素であってもよい。例えばプロリン特異的
ジペプチジルカルボキシペプチダーゼTU-212の場合、酵
素生産微生物の培養液から分子量１万以下の夾雑物を除
去し、さらに原料ペプチドを分解する活性のある他のプ
ロテアーゼを除去して得られる粗酵素を用いることがで
きる。この酵素の精製も前出の特開平 4-58886に記載さ
れている。なお、酵素反応にあたって酵素の安定化剤と
して 0.1〜100mM の塩化カルシウム、0.001 〜0.1 ％の
牛血清アルブミンなどを添加してもよい。
成分とアミン成分とを結合し得る能力を有するジペプチ
ジルカルボキシペプチダーゼであればいずれの酵素でも
よいが、具体例として前出の特開平4-58886 に記載のプ
ロリン特異的ジペプチジルカルボキシペプチダーゼTU-2
12がある。プロリン特異的ジペプチジルカルボキシペプ
チダーゼTU-212の使用濃度は最終濃度１〜30ユニット／
mlであることが適当である。なおこの場合、酵素１ユニ
ットは１分間に１μmol のBoc-(Pro)4を分解する酵素量
である。使用する酵素の純度に特に制限はなく、純品の
みならず粗酵素であってもよい。例えばプロリン特異的
ジペプチジルカルボキシペプチダーゼTU-212の場合、酵
素生産微生物の培養液から分子量１万以下の夾雑物を除
去し、さらに原料ペプチドを分解する活性のある他のプ
ロテアーゼを除去して得られる粗酵素を用いることがで
きる。この酵素の精製も前出の特開平 4-58886に記載さ
れている。なお、酵素反応にあたって酵素の安定化剤と
して 0.1〜100mM の塩化カルシウム、0.001 〜0.1 ％の
牛血清アルブミンなどを添加してもよい。
【００１０】本発明では目的ペプチドを効率よく製造す
るため、酵素反応を水溶性有機溶媒を５〜50容量％含有
する緩衝液中で行う。水溶性有機溶媒は酵素反応に悪影
響を与えるものでない限り、特に制限なく使用でき、有
機合成反応に通常使用する水溶性有機溶媒の多くを包含
し、例えばメタノール、エタノール、イソプロパノール
等の低級アルカノール、メチルセロソルブ、エチルセロ
ソルブ、ブチルセロソルブ等のセロソルブ、１，４−ブ
タンジオール、アセトンなどが挙げられる。緩衝液のｐ
Ｈは使用する酵素の至適ｐＨを考慮して定める。プロリ
ン特異的ジペプチジルカルボキシペプチダーゼの場合、
ｐＨ５〜８が適当である。緩衝液はｐＨ５〜８に設定で
きる緩衝液はすべて使用可能であり、例えばトリス塩酸
緩衝液が挙げられる。本発明の酵素法によるペプチド合
成の手順は特に制限されないが、一例を示すとカルボキ
シル成分及びアミン成分を水溶性有機溶媒を含有する緩
衝液に溶解し、これにカルボキシル成分とアミン成分と
を結合し得る能力を有するジペプチジルカルボキシペプ
チターゼを添加して反応させる。反応は一般に10〜50℃
で行う。より具体的な一例を示すと、プロリン特異的ジ
ペプチジルカルボキシペプチダーゼTU-212の場合、例え
ば37℃で１〜24時間反応させる。反応終了後、反応生成
物は、ペプチド精製の常套手段により、例えば溶媒抽
出、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマト
グラフィー、逆相カラムによる高速液体クロマトグラフ
ィーなどにより単離精製することができる。
るため、酵素反応を水溶性有機溶媒を５〜50容量％含有
する緩衝液中で行う。水溶性有機溶媒は酵素反応に悪影
響を与えるものでない限り、特に制限なく使用でき、有
機合成反応に通常使用する水溶性有機溶媒の多くを包含
し、例えばメタノール、エタノール、イソプロパノール
等の低級アルカノール、メチルセロソルブ、エチルセロ
ソルブ、ブチルセロソルブ等のセロソルブ、１，４−ブ
タンジオール、アセトンなどが挙げられる。緩衝液のｐ
Ｈは使用する酵素の至適ｐＨを考慮して定める。プロリ
ン特異的ジペプチジルカルボキシペプチダーゼの場合、
ｐＨ５〜８が適当である。緩衝液はｐＨ５〜８に設定で
きる緩衝液はすべて使用可能であり、例えばトリス塩酸
緩衝液が挙げられる。本発明の酵素法によるペプチド合
成の手順は特に制限されないが、一例を示すとカルボキ
シル成分及びアミン成分を水溶性有機溶媒を含有する緩
衝液に溶解し、これにカルボキシル成分とアミン成分と
を結合し得る能力を有するジペプチジルカルボキシペプ
チターゼを添加して反応させる。反応は一般に10〜50℃
で行う。より具体的な一例を示すと、プロリン特異的ジ
ペプチジルカルボキシペプチダーゼTU-212の場合、例え
ば37℃で１〜24時間反応させる。反応終了後、反応生成
物は、ペプチド精製の常套手段により、例えば溶媒抽
出、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマト
グラフィー、逆相カラムによる高速液体クロマトグラフ
ィーなどにより単離精製することができる。
【００１１】
【実施例】次に本発明を実施例により説明する。実施例 Boc-Pro-Pro-Pro-Pro の合成 カルボキシル成分としての12.5mMのBoc-Pro-Pro ( シグ
マ社より購入) 、アミン成分としての125mM のPro-Pro
(国産化学より購入) を25% メチルアルコールおよび5mM
塩化カルシウムを含む50mMトリス塩酸緩衝液（ pH5〜8
) に溶解し、これに最終濃度３ユニット／mlのプロリ
ン特異的ジペプチジルカルボキシペプチダーゼTU-212を
添加し、37℃にて20時間反応させた。合成反応終了後、
反応生成物であるBoc-Pro-Pro-Pro-Pro は高速液体クロ
マトグラフィーにて精製した。HPLCよる精製条件を下記
に示す。 カラム：メルク社製 Superspher RP-18 (125 x φ4mm) 溶出液：0.1% トリフルオロ酢酸を含む3.5 〜 67%アセ
トニトリルのグラジエント 流速 ：1ml/mi 分取したBoc-Pro-Pro-Pro-Pro は減圧乾固によりトリフ
ルオロ酢酸、アセトニトリルを除去し最終試料とした。
本試料の上記条件下での高速液体クロマトグラフィーに
於ける溶出時間は別に化学合成したBoc-Pro-Pro-Pro-Pr
o （シグマ社より購入）と一致した。本試料のアミノ酸
分析を6N塩酸110 ℃24時間の加水分解後、日立835 型ア
ミノ酸分析装置により行った。その結果、プロリンのみ
が検出された。また、本試料をトリフルオロ酢酸処理に
よりBoc 基を除去したのちアプライドバイオシステム社
製477Aプロテインシークエンサーによる自動エドマン分
解により解析したところ、４残基のプロリンを有するこ
とが確認できた。なお、反応生成物の収率は、原料のBo
c-Pro-Pro の2%であった。
マ社より購入) 、アミン成分としての125mM のPro-Pro
(国産化学より購入) を25% メチルアルコールおよび5mM
塩化カルシウムを含む50mMトリス塩酸緩衝液（ pH5〜8
) に溶解し、これに最終濃度３ユニット／mlのプロリ
ン特異的ジペプチジルカルボキシペプチダーゼTU-212を
添加し、37℃にて20時間反応させた。合成反応終了後、
反応生成物であるBoc-Pro-Pro-Pro-Pro は高速液体クロ
マトグラフィーにて精製した。HPLCよる精製条件を下記
に示す。 カラム：メルク社製 Superspher RP-18 (125 x φ4mm) 溶出液：0.1% トリフルオロ酢酸を含む3.5 〜 67%アセ
トニトリルのグラジエント 流速 ：1ml/mi 分取したBoc-Pro-Pro-Pro-Pro は減圧乾固によりトリフ
ルオロ酢酸、アセトニトリルを除去し最終試料とした。
本試料の上記条件下での高速液体クロマトグラフィーに
於ける溶出時間は別に化学合成したBoc-Pro-Pro-Pro-Pr
o （シグマ社より購入）と一致した。本試料のアミノ酸
分析を6N塩酸110 ℃24時間の加水分解後、日立835 型ア
ミノ酸分析装置により行った。その結果、プロリンのみ
が検出された。また、本試料をトリフルオロ酢酸処理に
よりBoc 基を除去したのちアプライドバイオシステム社
製477Aプロテインシークエンサーによる自動エドマン分
解により解析したところ、４残基のプロリンを有するこ
とが確認できた。なお、反応生成物の収率は、原料のBo
c-Pro-Pro の2%であった。
【００１２】
【発明の効果】本発明により、機能性食品、医薬品とし
て有用で、生体内における安定性が高められた、前記ジ
ペプチド（Ｘ−Ｙ又は Ala−Ｘ）がカルボキシル末端に
結合したペプチドを安全且つ簡便に製造することができ
る。
て有用で、生体内における安定性が高められた、前記ジ
ペプチド（Ｘ−Ｙ又は Ala−Ｘ）がカルボキシル末端に
結合したペプチドを安全且つ簡便に製造することができ
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 田中 秀興 茨城県つくば市東１丁目１番３号 工業技 術院微生物工業技術研究所内 (72)発明者 前田 英勝 茨城県つくば市東１丁目１番３号 工業技 術院微生物工業技術研究所内 (72)発明者 三吉 新介 千葉県船橋市日の出２丁目20番２号 昭和 産業株式会社総合研究所内
Claims (1)
- 【請求項１】 Ｎ末端アミノ基及び／又は存在する場合
の側鎖アミノ基が保護されていてもよいペプチド、又は
α−アミノ基及び存在する場合の側鎖アミノ基が保護さ
れたα−アミノ酸（カルボキシル成分）とＸ−Ｙ（式
中、Ｘはα位がイミノ基であるα−アミノ酸の残基を表
し、Ｙは任意のα−アミノ酸の残基を表す）又は Ala−
Ｘ（Ｘは前記と同義である）で表されるジペプチド（ア
ミン成分）とを、水溶性有機溶媒を５〜５０容量％含有
する緩衝液中、上記カルボキシル成分とアミン成分とを
結合し得る能力を有するジペプチジルカルボキシペプチ
ダーゼの存在下、カルボキシル成分に対しアミン成分を
１０〜２５倍モル用いて反応させ、ついで必要に応じア
ミノ保護基を除去することを特徴とするカルボキシル成
分のカルボキシル末端にアミン成分がペプチド結合し
た、Ｎ−末端アミノ基及び／又は存在する場合の側鎖ア
ミノ基が保護されていてもよいペプチドを製造する方
法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP35080492A JP3353052B2 (ja) | 1992-12-04 | 1992-12-04 | 酵素を用いるペプチド合成方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP35080492A JP3353052B2 (ja) | 1992-12-04 | 1992-12-04 | 酵素を用いるペプチド合成方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06169790A true JPH06169790A (ja) | 1994-06-21 |
| JP3353052B2 JP3353052B2 (ja) | 2002-12-03 |
Family
ID=18412987
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP35080492A Expired - Lifetime JP3353052B2 (ja) | 1992-12-04 | 1992-12-04 | 酵素を用いるペプチド合成方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3353052B2 (ja) |
-
1992
- 1992-12-04 JP JP35080492A patent/JP3353052B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3353052B2 (ja) | 2002-12-03 |
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