JP2002080497A - プロリルエンドペプチダーゼ阻害ペプチド - Google Patents
プロリルエンドペプチダーゼ阻害ペプチドInfo
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Abstract
(57)【要約】
【課題】新規かつ有用なプロリルエンドペプチダーゼ阻
害剤の提供。 【解決手段】Ｌ体のアミノ酸から構成される下記のペプ
チドを有効成分とするプロリルエンドペプチダーゼ阻害
ペプチド。 （ペプチドＡ） Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇ
ｌｕ （ペプチドＢ） Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｐ
ｈｅ 本発明のペプチドは、ワインから取得することができ、
優れたプロリルエンドペプチダーゼ阻害活性を有する。
また、天然物由来であるため安全性は高く、痴呆症の予
防、治療に使用することが期待される。
害剤の提供。 【解決手段】Ｌ体のアミノ酸から構成される下記のペプ
チドを有効成分とするプロリルエンドペプチダーゼ阻害
ペプチド。 （ペプチドＡ） Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇ
ｌｕ （ペプチドＢ） Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｐ
ｈｅ 本発明のペプチドは、ワインから取得することができ、
優れたプロリルエンドペプチダーゼ阻害活性を有する。
また、天然物由来であるため安全性は高く、痴呆症の予
防、治療に使用することが期待される。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、天然物であるワイ
ンから分離された新規ペプチドおよびそれらを有効成分
とするプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤に関する。
ンから分離された新規ペプチドおよびそれらを有効成分
とするプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】プロリルエンドペプチダーゼ（ＥＣ
３．４．２１．２６）はペプチド鎖中のプロリン残基に
おけるカルボキシル基側のペプチド結合を特異的に認識
し、切断するペプチダーゼであり、記憶の固定場所とさ
れている脳の海馬部分に高い酵素活性が観られるほか、
動物臓器に広く分布することが知られている（Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ １７３，８２７（１９７１）、Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ＆Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３
０，１１１（１９８０）、日本農芸化学会誌 ５８，１
１４７（１９８４））。また、同様の酵素がＦｌａｖｏ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細菌からも発見されている（Ｊ．
Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．，２５５，４７８６（１９８
０））。
３．４．２１．２６）はペプチド鎖中のプロリン残基に
おけるカルボキシル基側のペプチド結合を特異的に認識
し、切断するペプチダーゼであり、記憶の固定場所とさ
れている脳の海馬部分に高い酵素活性が観られるほか、
動物臓器に広く分布することが知られている（Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ １７３，８２７（１９７１）、Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ＆Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３
０，１１１（１９８０）、日本農芸化学会誌 ５８，１
１４７（１９８４））。また、同様の酵素がＦｌａｖｏ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細菌からも発見されている（Ｊ．
Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．，２５５，４７８６（１９８
０））。
【０００３】本酵素は神経伝達物質とされているサブス
タンスＰやニューロテンシン、記憶に関係していると考
えられるＴＨＲ（甲状腺刺激ホルモン）やステップスル
ー型受動的回避学習法で記憶保持活性があるとされてい
る脳内バソプレシン（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２１，１３１
０（１９８３）、Ｎａｔｕｒｅ ３０８，２７６（１９
８４））に作用し、不活性化することが知られている。
バソプレシンは腎臓で水分再吸収に働くペプチドホルモ
ンであるが、脳内においては学習、記憶の過程にも関与
しており、このホルモンの分解能が不活性化されると記
憶保持に障害が現われると言われている。また、痴呆症
患者のバソプレシン量は、正常人のそれより少ないこと
が知られている（ＢＩＯＩＮＤＵＳＴＲＹ ４，７８８
（１９８７））。従って、本酵素の活性を阻害すること
による痴呆症の治療を目指す研究がなされている。
タンスＰやニューロテンシン、記憶に関係していると考
えられるＴＨＲ（甲状腺刺激ホルモン）やステップスル
ー型受動的回避学習法で記憶保持活性があるとされてい
る脳内バソプレシン（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２１，１３１
０（１９８３）、Ｎａｔｕｒｅ ３０８，２７６（１９
８４））に作用し、不活性化することが知られている。
バソプレシンは腎臓で水分再吸収に働くペプチドホルモ
ンであるが、脳内においては学習、記憶の過程にも関与
しており、このホルモンの分解能が不活性化されると記
憶保持に障害が現われると言われている。また、痴呆症
患者のバソプレシン量は、正常人のそれより少ないこと
が知られている（ＢＩＯＩＮＤＵＳＴＲＹ ４，７８８
（１９８７））。従って、本酵素の活性を阻害すること
による痴呆症の治療を目指す研究がなされている。
【０００４】実際に、Ｚ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ＣＨ2Ｃ
ｌ、Ｚ−Ｐｒｏ−ｐｒｏｌｉｎａｌ、Ｚ−Ｖａｌ−ｐｒ
ｏｌｉｎａｌ、Ｂｏｃ−Ｐｒｏ−ｐｒｏｌｉｎａｌ等の
合成されたプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤が抗健忘
作用を示すことが動物試験で確認され（日本農芸化学会
誌 ５８，１１４７（１９８４）、化学と生物 ２５，５
５４（１９８７））、その後、微生物や食品成分由来の
阻害剤も報告されている（１９９０年薬学会年会講演要
旨集 ３５、Ａｇｒｉｃ． Ｂｉｏ． Ｃｈｅｍ．，５
５，８２５（１９９１）、Ｊ． Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ
ｓ ４４，９５６（１９９１）、特開平５−３３１０７
２号公報、特開平１０−７７３００号公報）。
ｌ、Ｚ−Ｐｒｏ−ｐｒｏｌｉｎａｌ、Ｚ−Ｖａｌ−ｐｒ
ｏｌｉｎａｌ、Ｂｏｃ−Ｐｒｏ−ｐｒｏｌｉｎａｌ等の
合成されたプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤が抗健忘
作用を示すことが動物試験で確認され（日本農芸化学会
誌 ５８，１１４７（１９８４）、化学と生物 ２５，５
５４（１９８７））、その後、微生物や食品成分由来の
阻害剤も報告されている（１９９０年薬学会年会講演要
旨集 ３５、Ａｇｒｉｃ． Ｂｉｏ． Ｃｈｅｍ．，５
５，８２５（１９９１）、Ｊ． Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ
ｓ ４４，９５６（１９９１）、特開平５−３３１０７
２号公報、特開平１０−７７３００号公報）。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、優れたプロ
リルエンドペプチダーゼ阻害作用を有する、天然物由来
の特定のペプチドおよびそれらを有効成分とする安全性
の高いプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤を提供するこ
とを目的とする。
リルエンドペプチダーゼ阻害作用を有する、天然物由来
の特定のペプチドおよびそれらを有効成分とする安全性
の高いプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤を提供するこ
とを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、ブドウを
原料とするワインに豊富なプロリンとともにアミノペプ
チダーゼ等の加水分解酵素が存在することに着目し、ワ
インには未知のペプチドが存在するものと考え、上記課
題を解決するために、ワインからプロリルエンドペプチ
ダーゼ阻害物質を鋭意検索した。その結果、ワイン中に
本阻害物質の存在を認め、該物質がある種のペプチドで
あることを見出し、本発明を完成した。
原料とするワインに豊富なプロリンとともにアミノペプ
チダーゼ等の加水分解酵素が存在することに着目し、ワ
インには未知のペプチドが存在するものと考え、上記課
題を解決するために、ワインからプロリルエンドペプチ
ダーゼ阻害物質を鋭意検索した。その結果、ワイン中に
本阻害物質の存在を認め、該物質がある種のペプチドで
あることを見出し、本発明を完成した。
【０００７】すなわち、本発明は、Ｌ体のアミノ酸から
構成され、下記の配列を有するペプチドＡまたはペプチ
ドＢ並びにそれらの塩を提供するものである。 （ペプチドＡ） Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇ
ｌｕ （ペプチドＢ） Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｐ
ｈｅ また本発明は、前記ペプチドＡ、ペプチドＢおよびそれ
らの塩の少なくとも１種を有効成分とするプロリルエン
ドペプチダーゼ阻害剤を提供するものである。
構成され、下記の配列を有するペプチドＡまたはペプチ
ドＢ並びにそれらの塩を提供するものである。 （ペプチドＡ） Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇ
ｌｕ （ペプチドＢ） Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｐ
ｈｅ また本発明は、前記ペプチドＡ、ペプチドＢおよびそれ
らの塩の少なくとも１種を有効成分とするプロリルエン
ドペプチダーゼ阻害剤を提供するものである。
【０００８】本発明のペプチドの塩としては、酸付加塩
および塩基付加塩が包含され、酸付加塩としては、製薬
上許容される酸（無機酸および有機酸）との塩、例えば
塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩、酢酸塩、安息
香酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、酒石
酸塩、クエン酸塩、シュウ酸塩、メタンスルホン酸塩、
トルエンスルホン酸塩、アスパラギン酸塩、グルタミン
酸塩等が例示される。また、塩基付加塩としては、製薬
上許容される塩基（無機塩基および有機塩基）との塩、
例えばナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩、カ
ルシウム塩、マグネシウム塩、アルミニウム塩等の無機
塩基との塩、塩基性アミノ酸（例えば、アルギニン、リ
ジン等）との塩等が例示される。
および塩基付加塩が包含され、酸付加塩としては、製薬
上許容される酸（無機酸および有機酸）との塩、例えば
塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩、酢酸塩、安息
香酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、酒石
酸塩、クエン酸塩、シュウ酸塩、メタンスルホン酸塩、
トルエンスルホン酸塩、アスパラギン酸塩、グルタミン
酸塩等が例示される。また、塩基付加塩としては、製薬
上許容される塩基（無機塩基および有機塩基）との塩、
例えばナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩、カ
ルシウム塩、マグネシウム塩、アルミニウム塩等の無機
塩基との塩、塩基性アミノ酸（例えば、アルギニン、リ
ジン等）との塩等が例示される。
【０００９】本発明のペプチドは、当該ペプチドを含有
するワインから常法に準じて採取することができ、かか
る方法としてはワインを限外ろ過膜、ゲルろ過、種々の
クロマトグラフィー、例えば、ＳＰ−セファデックスＣ
−２５（ファルマシア社製）、ＳＰ−トヨパール６５０
Ｓ（東ソー社製）によるイオン交換クロマトグラフィ
ー、セファデックスＧ−１５（ファルマシア社製）、ト
ヨパールＨＷ−４０（東ソー社製）によるゲル濾過、Ｃ
ＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫＣ１８（資生堂社製）、Ｃｏｓｍ
ｏｓｉｌＣ１８（ナカライテスク社製）等による逆相ク
ロマトグラフィー等、後述する方法に従い、プロリルエ
ンドペプチダーゼ阻害活性を指標として実施することが
できる。
するワインから常法に準じて採取することができ、かか
る方法としてはワインを限外ろ過膜、ゲルろ過、種々の
クロマトグラフィー、例えば、ＳＰ−セファデックスＣ
−２５（ファルマシア社製）、ＳＰ−トヨパール６５０
Ｓ（東ソー社製）によるイオン交換クロマトグラフィ
ー、セファデックスＧ−１５（ファルマシア社製）、ト
ヨパールＨＷ−４０（東ソー社製）によるゲル濾過、Ｃ
ＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫＣ１８（資生堂社製）、Ｃｏｓｍ
ｏｓｉｌＣ１８（ナカライテスク社製）等による逆相ク
ロマトグラフィー等、後述する方法に従い、プロリルエ
ンドペプチダーゼ阻害活性を指標として実施することが
できる。
【００１０】また本発明のペプチドは有機化学的な合成
方法によりアミノ酸を段階的に導入する方法、加水分解
酵素の逆反応を利用したペプチド合成法、遺伝子工学的
方法等によって製造することも可能である。これまで多
くのペプチド合成方法が知られており、例えば「ペプチ
ド合成の基礎と実験」丸善（株）に詳細に記載されてい
る。本発明で用いるペプチドはこれらの合成法のいずれ
かによって、例えばいわゆる固相ペプチド合成または液
相ペプチド合成によって製造することができる。
方法によりアミノ酸を段階的に導入する方法、加水分解
酵素の逆反応を利用したペプチド合成法、遺伝子工学的
方法等によって製造することも可能である。これまで多
くのペプチド合成方法が知られており、例えば「ペプチ
ド合成の基礎と実験」丸善（株）に詳細に記載されてい
る。本発明で用いるペプチドはこれらの合成法のいずれ
かによって、例えばいわゆる固相ペプチド合成または液
相ペプチド合成によって製造することができる。
【００１１】液相ペプチド合成は上述の「ペプチド合成
の基礎と実験」に記載されており、それに従って、例え
ば本ペプチドのＣ末端に位置すべきアミノ酸であってそ
のカルボキシル基がベンジル基（Ｂｚｌ）、ｔ−ブチル
基（ｔ−Ｂｕ）等で保護されたアミノ酸とＣ末端アミノ
酸に隣接して位置するべきアミノ酸であってそのα−ア
ミノ基がｔ−ブチルオキシカルボニル基（Ｂｏｃ）、ベ
ンジルオキシカルボニル基（ｚ）等で保護されたアミノ
酸をジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルアセト
アミド等に溶解し、それらをジシクロヘキシルカルボジ
イミド（ＤＣＣ）および１−ヒドロキシベンゾトリアゾ
ール（ＨＯＢＴ）の存在下室温で一夜反応させることに
よって行うことができる。
の基礎と実験」に記載されており、それに従って、例え
ば本ペプチドのＣ末端に位置すべきアミノ酸であってそ
のカルボキシル基がベンジル基（Ｂｚｌ）、ｔ−ブチル
基（ｔ−Ｂｕ）等で保護されたアミノ酸とＣ末端アミノ
酸に隣接して位置するべきアミノ酸であってそのα−ア
ミノ基がｔ−ブチルオキシカルボニル基（Ｂｏｃ）、ベ
ンジルオキシカルボニル基（ｚ）等で保護されたアミノ
酸をジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルアセト
アミド等に溶解し、それらをジシクロヘキシルカルボジ
イミド（ＤＣＣ）および１−ヒドロキシベンゾトリアゾ
ール（ＨＯＢＴ）の存在下室温で一夜反応させることに
よって行うことができる。
【００１２】次いで生成物のアミノ保護基の常法による
除去の後に得られるジペプチドをアミノ保護した第３の
アミノ酸と同様に反応してアミノ保護基を除去し、次い
で同様な手順を繰り返して本ペプチドを得ることができ
る。最終反応の終了後、これらの保護基を除去するが、
これらの脱保護は常法によって、例えば上述の「ペプチ
ド合成の基礎と実験」に記述されたようにして行うこと
ができる。例えば、アミノ保護基については、Ｂｏｃは
トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）またはギ酸によって、Ｚは
接触還元によって、カルボキシル保護基については、Ｂ
ｚｌは、例えば、接触還元によって、ｔ−ＢｕはＴＦＡ
またはＨＣｌ／ジオキサンによって除去することができ
る。
除去の後に得られるジペプチドをアミノ保護した第３の
アミノ酸と同様に反応してアミノ保護基を除去し、次い
で同様な手順を繰り返して本ペプチドを得ることができ
る。最終反応の終了後、これらの保護基を除去するが、
これらの脱保護は常法によって、例えば上述の「ペプチ
ド合成の基礎と実験」に記述されたようにして行うこと
ができる。例えば、アミノ保護基については、Ｂｏｃは
トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）またはギ酸によって、Ｚは
接触還元によって、カルボキシル保護基については、Ｂ
ｚｌは、例えば、接触還元によって、ｔ−ＢｕはＴＦＡ
またはＨＣｌ／ジオキサンによって除去することができ
る。
【００１３】一方、固相ペプチド合成については、ペプ
チドシンセサイザー（例えばアプライドバイオシステム
ズ社によって生産された４３０Ａ型ペプチドシンセサイ
ザー）を用いる合成が最近広く用いられている。すなわ
ち、この方法においては基本的には、アミノ基がＢｏｃ
で保護されたα−アミノ酸（Ｂｏｃ−アミノ酸）を、出
発物質としての、アミノ酸が結合したフェニルアセトア
ミドメチル（ＰＡＭ）樹脂（アプライドバイオシステム
ズ社より入手し得る）のＮ−側からアミノ酸の導入とＢ
ｏｃの除去の繰り返しによって段階的に延長する。試薬
の選定、反応条件等の具体的な実験の操作はアプライド
バイオシステムズ社による４３０Ａ型ペプチドシンセサ
イザーユーザーズマニュアルに従って行うことができ
る。
チドシンセサイザー（例えばアプライドバイオシステム
ズ社によって生産された４３０Ａ型ペプチドシンセサイ
ザー）を用いる合成が最近広く用いられている。すなわ
ち、この方法においては基本的には、アミノ基がＢｏｃ
で保護されたα−アミノ酸（Ｂｏｃ−アミノ酸）を、出
発物質としての、アミノ酸が結合したフェニルアセトア
ミドメチル（ＰＡＭ）樹脂（アプライドバイオシステム
ズ社より入手し得る）のＮ−側からアミノ酸の導入とＢ
ｏｃの除去の繰り返しによって段階的に延長する。試薬
の選定、反応条件等の具体的な実験の操作はアプライド
バイオシステムズ社による４３０Ａ型ペプチドシンセサ
イザーユーザーズマニュアルに従って行うことができ
る。
【００１４】本発明のペプチドおよびそれらの塩は後述
するとおり、プロリルエンドペプチダーゼ阻害作用を有
し、ヒトの痴呆症の治療、予防に有効であると期待され
る。
するとおり、プロリルエンドペプチダーゼ阻害作用を有
し、ヒトの痴呆症の治療、予防に有効であると期待され
る。
【００１５】
【実施例】以下、本発明を実施例に基づいてさらに具体
的に説明するが、本発明をこれらの例に限定することを
意図するものではない。
的に説明するが、本発明をこれらの例に限定することを
意図するものではない。
【００１６】実施例１：プロリルエンドペプチダーゼ阻
害ペプチドの精製 赤ワイン（カベルネ・ソービニオン種：メルシャン社
製）２Ｌに蒸留水８Ｌを加えたものをＣｏｓｍｏｓｉｌ
１４０Ｃ１８−ＯＰＮカラム（ナカライテスク社製、
φ４８×１５０ｍｍ）に直接吸着させ、蒸留水で洗浄
後、１０％エタノールで溶出して活性画分を回収した。
次いで、この活性画分をトヨパールＨＷ−４０Ｓカラム
（東ソー社製、φ２６×２８０ｍｍ）に吸着させ、１０
０ｍＭ酢酸緩衝液で溶出して活性画分を回収した。さら
にこの活性画分を０．１％トリフルオロ酢酸溶液で平衡
化したＳｕｐｅｒｄｅｘ Ｐｅｐｔｉｄｅ ＨＲ１０／３
０カラム（ファルマシア社製、φ１０×３００ｍｍ）に
付し、同溶液にて活性画分を溶出し回収した。上記のカ
ラムより溶出された活性画分はＳＯＵＲＣＥ ５ＲＰＣ
ＳＴ ４．６／１５０カラム（ファルマシア社製、φ４
６×１５０ｍｍ）を用いたクロマトグラフィーで、１０
ｍＭ酢酸アンモニウムを含む２〜７０％のアセトニトリ
ルの直線濃度勾配溶出で分画し、２種の活性画分を得
た。得られた画分はそれぞれ、ＳＯＵＲＣＥ ５ＲＰＣ
ＳＴ ４．６／１５０カラムにより同条件下で、再度精
製し、プロリルエンドペプチダーゼ阻害を有する２種類
のペプチドのピーク（保持時間、ペプチドＡ：２２分、
ペプチドＢ：２５分）を得た。
害ペプチドの精製 赤ワイン（カベルネ・ソービニオン種：メルシャン社
製）２Ｌに蒸留水８Ｌを加えたものをＣｏｓｍｏｓｉｌ
１４０Ｃ１８−ＯＰＮカラム（ナカライテスク社製、
φ４８×１５０ｍｍ）に直接吸着させ、蒸留水で洗浄
後、１０％エタノールで溶出して活性画分を回収した。
次いで、この活性画分をトヨパールＨＷ−４０Ｓカラム
（東ソー社製、φ２６×２８０ｍｍ）に吸着させ、１０
０ｍＭ酢酸緩衝液で溶出して活性画分を回収した。さら
にこの活性画分を０．１％トリフルオロ酢酸溶液で平衡
化したＳｕｐｅｒｄｅｘ Ｐｅｐｔｉｄｅ ＨＲ１０／３
０カラム（ファルマシア社製、φ１０×３００ｍｍ）に
付し、同溶液にて活性画分を溶出し回収した。上記のカ
ラムより溶出された活性画分はＳＯＵＲＣＥ ５ＲＰＣ
ＳＴ ４．６／１５０カラム（ファルマシア社製、φ４
６×１５０ｍｍ）を用いたクロマトグラフィーで、１０
ｍＭ酢酸アンモニウムを含む２〜７０％のアセトニトリ
ルの直線濃度勾配溶出で分画し、２種の活性画分を得
た。得られた画分はそれぞれ、ＳＯＵＲＣＥ ５ＲＰＣ
ＳＴ ４．６／１５０カラムにより同条件下で、再度精
製し、プロリルエンドペプチダーゼ阻害を有する２種類
のペプチドのピーク（保持時間、ペプチドＡ：２２分、
ペプチドＢ：２５分）を得た。
【００１７】次いで、これらの阻害ペプチドの構造をヒ
ューレットパッカード社製プロテインシークエンサーＧ
１００５Ａにより解析した。その結果、上記のペプチド
ＡおよびＢは、Ｌ体のアミノ酸から構成され、下記の配
列で示される構造を有していた。 （ペプチドＡ） Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇ
ｌｕ （ペプチドＢ） Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｐ
ｈｅ
ューレットパッカード社製プロテインシークエンサーＧ
１００５Ａにより解析した。その結果、上記のペプチド
ＡおよびＢは、Ｌ体のアミノ酸から構成され、下記の配
列で示される構造を有していた。 （ペプチドＡ） Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇ
ｌｕ （ペプチドＢ） Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｐ
ｈｅ
【００１８】なお、各精製工程においては、下記のプロ
リルエンドペプチダーゼ阻害測定法を用いた阻害活性を
指標として精製を進めた。 （プロリルエンドペプチダーゼ阻害活性の測定方法）
Ｆ．ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ由来プロリルエン
ドペプチダーゼ（生化学工業社製）をリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．０）に溶解し、０．１ｕｎｉｔ／ｍｌの酵素溶液
とした。また、２ｍＭ Ｚ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ｐＮＡ
（生化学工業社製、Ｚはベンジルオキシカルボニル基、
ｐＮＡはパラニトロアニリドを示す）をリン酸緩衝液
（ｐＨ７．０、４０％ジオキサンを含む）に溶解し基質
溶液とした。各種ペプチドを含むサンプルを１．５ｍｌ
容量のプラスチックチューブに５０μｌ入れ、これにリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７．０）２００μｌ、基質溶液１００
μｌを添加し、３０℃で５分間保温した後、上記プロリ
ルエンドペプチダーゼ溶液１００μｌを加え、よく混合
して、３０℃で１０分間の反応を行った。その後、１Ｎ
ＨＣｌ ５００μｌを添加することにより反応を停止さ
せ、４１０ｎｍの吸光度を測定した。阻害率（％）は次
の式により算出した。
リルエンドペプチダーゼ阻害測定法を用いた阻害活性を
指標として精製を進めた。 （プロリルエンドペプチダーゼ阻害活性の測定方法）
Ｆ．ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ由来プロリルエン
ドペプチダーゼ（生化学工業社製）をリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．０）に溶解し、０．１ｕｎｉｔ／ｍｌの酵素溶液
とした。また、２ｍＭ Ｚ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ｐＮＡ
（生化学工業社製、Ｚはベンジルオキシカルボニル基、
ｐＮＡはパラニトロアニリドを示す）をリン酸緩衝液
（ｐＨ７．０、４０％ジオキサンを含む）に溶解し基質
溶液とした。各種ペプチドを含むサンプルを１．５ｍｌ
容量のプラスチックチューブに５０μｌ入れ、これにリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７．０）２００μｌ、基質溶液１００
μｌを添加し、３０℃で５分間保温した後、上記プロリ
ルエンドペプチダーゼ溶液１００μｌを加え、よく混合
して、３０℃で１０分間の反応を行った。その後、１Ｎ
ＨＣｌ ５００μｌを添加することにより反応を停止さ
せ、４１０ｎｍの吸光度を測定した。阻害率（％）は次
の式により算出した。
【００１９】阻害率＝（Ａ−Ｂ）／Ａ×１００ Ａ＝阻害剤を含まない場合の４１０ｎｍの吸光度 Ｂ＝阻害剤を含む場合の４１０ｎｍの吸光度 また、阻害率５０％のときのペプチド濃度をＩＣ50値と
した。
した。
【００２０】実施例２：プロリルエンドペプチダーゼ阻
害ペプチドの合成 上記のペプチドＡとＢをペプチドシンセサイザー（アプ
ライドバイオシステムズ社製、４３０Ａ型）により合成
し、目的とする標記のペプチドを得た。次いで、ペプチ
ドＡとＢのプロリルエンドペプチダーゼに対する阻害活
性を測定した。得られた結果は表１に示すとおりであ
り、ワインより精製されたものと同様の活性を示した。
害ペプチドの合成 上記のペプチドＡとＢをペプチドシンセサイザー（アプ
ライドバイオシステムズ社製、４３０Ａ型）により合成
し、目的とする標記のペプチドを得た。次いで、ペプチ
ドＡとＢのプロリルエンドペプチダーゼに対する阻害活
性を測定した。得られた結果は表１に示すとおりであ
り、ワインより精製されたものと同様の活性を示した。
【００２１】
【表１】
【００２２】
【発明の効果】本発明のプロリルエンドペプチダーゼ阻
害ペプチドは、天然物由来であるので安全性が高く、長
期間にわたって投与することも可能であり、特に痴呆症
の予防、治療に有用である。
害ペプチドは、天然物由来であるので安全性が高く、長
期間にわたって投与することも可能であり、特に痴呆症
の予防、治療に有用である。
Sequence Listing <110> Mercian Corporation <120> プロリルエンドペプチダーゼ阻害ペプチド <130> H12-0871 <160> 2 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 1 Val Glu Ile Pro Glu <210> 2 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 2 Tyr Pro Ile Pro Phe
Claims (2)
- 【請求項１】Ｌ体のアミノ酸から構成され、下記の配列
を有するペプチドＡまたはペプチドＢ並びにそれらの
塩。 （ペプチドＡ） Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇ
ｌｕ （ペプチドＢ） Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｐ
ｈｅ - 【請求項２】Ｌ体のアミノ酸から構成され、下記の配列
を有するペプチドＡ、ペプチドＢおよびそれらの塩の少
なくとも１種を有効成分とするプロリルエンドペプチダ
ーゼ阻害剤。 （ペプチドＡ） Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇ
ｌｕ （ペプチドＢ） Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｐ
ｈｅ
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| JP2000192624 | 2000-06-27 | ||
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| JP (1) | JP4485048B2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1941897A3 (de) * | 2006-10-07 | 2008-07-16 | Evonik Goldschmidt GmbH | Oligopeptide enthaltende dermatologische Zusammensetzungen zur Steigerung der Hautempfindlichkeit und der neuronalen Reizwahrnehmung |
| JP2016065038A (ja) * | 2014-08-18 | 2016-04-28 | 森永乳業株式会社 | プロリルオリゴペプチダーゼ阻害剤 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH05331072A (ja) * | 1992-05-27 | 1993-12-14 | Agency Of Ind Science & Technol | プロリルエンドペプチダーゼ阻害剤 |
| JPH1077300A (ja) * | 1996-09-04 | 1998-03-24 | Gekkeikan Sake Co Ltd | プロリルエンドペプチダーゼ阻害ペプチド |
-
2000
- 2000-12-19 JP JP2000385360A patent/JP4485048B2/ja not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| EP1941897A3 (de) * | 2006-10-07 | 2008-07-16 | Evonik Goldschmidt GmbH | Oligopeptide enthaltende dermatologische Zusammensetzungen zur Steigerung der Hautempfindlichkeit und der neuronalen Reizwahrnehmung |
| US7858580B2 (en) * | 2006-10-07 | 2010-12-28 | Evonik Goldschmidt Gmbh | Dermatological compositions including oligopeptides for increasing skin sensitivity and neuronal perception |
| JP2016065038A (ja) * | 2014-08-18 | 2016-04-28 | 森永乳業株式会社 | プロリルオリゴペプチダーゼ阻害剤 |
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