HU228383B1 - Overexpression of phosphoenolpyruvate carboxylase - Google Patents

Overexpression of phosphoenolpyruvate carboxylase Download PDF

Info

Publication number
HU228383B1
HU228383B1 HU0303658A HUP0303658A HU228383B1 HU 228383 B1 HU228383 B1 HU 228383B1 HU 0303658 A HU0303658 A HU 0303658A HU P0303658 A HUP0303658 A HU P0303658A HU 228383 B1 HU228383 B1 HU 228383B1
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
plant
pepc
plants
promoter
transformed
Prior art date
Application number
HU0303658A
Other languages
English (en)
Inventor
Jean Vidal
Matthieu Jeanneau
Pascual Perez
Denise Gerentes
Original Assignee
Biogemma Fr
Centre Nat Rech Scient
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from FR0104602A external-priority patent/FR2823063B1/fr
Application filed by Biogemma Fr, Centre Nat Rech Scient filed Critical Biogemma Fr
Publication of HUP0303658A2 publication Critical patent/HUP0303658A2/hu
Publication of HU228383B1 publication Critical patent/HU228383B1/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C12N15/8247—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving modified lipid metabolism, e.g. seed oil composition
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8273—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for drought, cold, salt resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
    • Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

Foszfoenol-piruvát-karboxiláz fokozott mértékű expressziója
A találmány tárgyát képezi eljárás vízsíresszel szemben fokozottan ellenálló, cirokból származó foszfoenol-piruvát-karlxjxíiázt (PEPC) fokozottan termelő CA-növények előállítására, amely által kedvezőbbek a növény mezőgazdasági tulajdonságai
Korlátozott vízmennyiség körülményei között a Q-típusó növények (röviden: Qnövények) a szénanyagcseréi ükét oly módon képesek megváltoztatni, hogy a R.UBISCO-í körülvevő tápközeg CQrtartalmát koncentráljak, hogy az enzim karboxiláz-aktivitását serkentsék az. oxigenáz-aktivitásának - és következményének, a fotorespiráeionafc - a hátrányára, így végeredményben a fotoszintetikus hozamot növeljék.. Ez a mechanizmus a CA-cíklns aktivitását érinti, amelynek első lépését egy kafboxiláz, a foszfoenol-piruvát-karboxiláz (PERC EC 4.1.1,31) katalizálja, amelynek nagy az affinitása a CCA felé (hidratált formában) és nagy a katalitikus aránya. A Cs-növényekben ezzel szemben nincs ilyen rendszer a CO? koncentrálására, és a fotorespiráció jelentősen korlátozza a fotoszintetikus hozamot- Ezekben a növényekben ráadásul a vízhasznosítás is kevésbé hatékony (2-es faktorral). A CA-növényeknek tehát vízstressz körülményei közepette szelektív előnyük van a C.rnövényekkel szemben.
Ezzel magyarázható, hogy 1992 óta közölt számos tanulmányban célul tűzték ki C.?~ növényekben CA-típtisú PEPC fokozott mértékű expresszáiását, hogy ily módon kíséreljék meg fokozni a COj koncentrációját a RUB.1SCÖ közelében, ezáltal korlátozva a fotorespíráeiöi a fotoszintetikus hozam és a biomassza javára (Kudspeth és mtsai,, 1992; Kogami és mtsai., 1994; Gehlen és mtsai., 1996; Ku és mtsai',, 1999; Ltpka és mtsai., 1999),
A találmányi leírásban az előző tanulmányokhoz képest egy teljesen új megközelítési módot teszünk közzé, mivel egy C«-növényből származó PEPC-nek ezt endogén módon tartalmazó Cj-n-övényben történő· fokozott mértékű expresszáiását tűztük ki célul, az eredetileg Is nagyon hatékony szénanyagcsere optimalizálása érdekében, előnyösen vízstressz körülményei között. A levélben ez normál körülmények között a. fotorespiráció többnyire nagyon .alacsony szintjének kiigazításán múlik, és amelynek, várható hozzájárulása a fotoszintetikus működéshez minden bizonnyal korlátozott mértékű, A vízstressz azonban a CO? nettó asszimilációjának szignifikáns csökkenését okozza elsősorban a gázcserenyílások (sztómák)· nyitottságának csökkentésével, ilyen fejlődési körülmények között, amikor a víz és a CO^ hozzáférhetősége korlátozott, a PEPC fokozott mértékű expressziója hozzájárulhat a RtlBÍSCO közelében a kontroilnövényeknél magasabb gázkoncentráció kialakításához, és ily módon szervetlen szén fokozottabb asszimi lác lójához.
* <Az enzimnek különböző izoformáí léteznek minden növényben, C4- vagy Ősnövényben, amelyek előnyösen a leveleken kívül. a gyökerekben és a magokban is megtalálhatok. Az izofonnák legfontosabb funkciója a sejt energiatermelésének fenntartása, amikor a Krebs-eiklus vegyületet (előnyösen az o-ketoglutarát) más anyagcsere5 útvonalakban hasznosulnak, példán! aminosavak szintézisében (aszpartái, gl mamát és rokon aminosavak). Ez az anapleroiikus” funkció előnyösen a szemtermésben működik, ahol a fehérjékkel történő feltöréshez jánd hozzá [Gonzalez és mtsak, 1998; Macnieo! és mtsai,, 1998), Ebben a szervben a PEPC a zsirsavszintézishez szükséges szénvázak, valamint a fejlődő lipídraktárak kialakításában is szerepet játszik [Smith és mtsai., 1992],
A szemtermésben a PEPC .fokozott mértékű expressziója tehát alkalmas a fehérje- és lipidféitöltési képességének szignifikáns növelésére normál körülmények között, ha az érintett, anyagcsere-útvonalak egyéb korlátozó lépései nem gátolják, és ez még biztosabban bekövetkezik vízstressz körülményei között, amely károsítja a vízgyűjtők („weli”) működését és a növény forrás-vízgyűjtő kapcsolatát („sonree-weil relation”). Ebben a vonatko15 zásban azt is ki kell emelni, hogy a kedvezőbb fotoszintetikus képességnek (a levélben lévő PEPC fokozott mértékű expressziójának köszönhetően) pozitív hatása lehet a szemtermésre, amelynek telítődése az érés folyamán a levelekben lévő nitrogén és szén újra mozgósításától függ.
A találmány célkitűzése a technika eddigi állása szerinti hátrányok leküzdése, és a ta20 Iálmány tárgyát képezi eljárás módosított szénanyageseréjű, CHÍpusű növények előállítására, amely során
- legalább egy, C^típusú növényi sejtbe foszfoenol-pimvát-karboxilázt (PEPC) kódoló nnkleotídszekvenciát tartalmazó expresszié» kazettát viszünk be,
- az így transzformált sejtet oly módon tenyésztjük, hogy az expressziós vektort a genomjában tartalmazó -C^nővéayt állítsunk elő.
A módosított szénanyagcsere a PEPC-nek a nem transzformált növényekhez képest, fokozottabb mértékű vagy alacsonyabb mértékű expressziőját jelenti, Az eljárás során a PEPC előnyösen fokozott mértékben expresszálódik a regenerált, transzformált növényekben.
Egy megvalósítási mód szerint az el járás tárgyát képezi a nem transzformált növényekhez képest megváltozott szénanyageseréjű növényekké regenerálni képes, transzformáit sejtek azonosítása és kiválasztása, A kiválasztás jellemzően markergénekkel történik.
Előnyösen az első lépés szerint transzformált sejtet még egy vagy több nukieinsawal transzformáljuk az alábbiak közül:
- a transzdukclós lánc és a PEPC íosziórilációjának megváltoztatására szolgáló fehégekomponenst, például fbszh>mozÍfol~foszfólípáz~C-t (P1PI.C) (Coorsol és mtsai., 2000) vagy iószfoenol-piruvát-karboxiláz-kináz-t (PEFCK) (Hartwell és mtsai., 1999; Tayhi és mtsai,, 2ÖŐÖ) kódoló nukleínsavval,
- a Crcáklös egy másik fehérjéjét, például pimvát-foszíát-dikinázt (PPDK) (Imalzumí és mtsai., 199?) kódoló nukleínsavval.
A leírás szeristi értelemben a PBPC-et kódoló szekvencia egy C^növényben természetes módon expresszálödő enzimei kódoló szekvencia, amely enzim a foszíóenolpirnvát gyakorlatilag irreverzibilis β-karboxiláeióját katalizálja bikarbónát és kétértékű kation jelenlétében, és így oxaloaeetát és szervetlen foszfát képződik (Bandnrski és Greiner, 1953). A C^-novényekben található PEPC-íípusok közöl a leírás szerint a QPBPC-forma enzimeit (anaplemtikus funkció) vagy a OPEPC-fomta enzimeit (fotoszintetikus 4- anapleroíikns funkció) kódoló rurkleotirlszekveneiákat alkalmazzuk.
Szemléltetésképpen megemlíthető előnyösen cirokból (őőrg&tun vnígnre) származó
Q-PEPC (Crétin és mtsai., 1990), amelynek nukleinsavszekveneiája azonos vagy homológ az 1. azonosítószámú szekvencia szerinti, okokból származó szekvenciával.
Előnyösen az alábbi nnkleotidszekveneiákat tartalmazó nakiems&vafc alkalmazhatók:
a) az 1, azonosítószámú szekvencia szerinti nnkleotidszekvencia,
b) az a) pont szerinti szekvenciával; piruvát-karboxiláz aktivitással bíró fehérjét kódol veneia, amely feszfoenolc) az 1, azonosítószámú szekvencia szerinti szekvenciával vagy a b) pont szerinti szekvenciával komplementer nukleckidszekveneia,
d) az a), b) vagy e) pontok szerinti szekvencia egy j ellemző fragmense,
e) az. a), h) c) vagy d) pontok szerinti szekvenciát tartalmazó mddeotidszekveneia,
f) az a), b) c) d) vagy e) pontok szerinti nuldeolidszekvencia módosított nukleotidszekvenciája.
Egy másik lehetőségként mutáns Q-PEPC (Serb/AspS) (Wasg és mtsai., 1992) alkalmazható, amelyre a foszfbriláll enzim (nem mverzihilis) tulajdonságai jellemzőek, amely a katalitikus arány és az. L-malát inhibitorra való érzékenység tekintetében a legha30 lekonyabb forma.
Előnyösen Q-FEPC-eket kódoló szekvenciák is alkalmazhatók, például amelyeknek nukleinsavszekveneiája azonos vagy homológ a Crétin és munkatársai (Crétin és mtsai., 1991) vagy Lepímee és munkatársai (tspimee és mtsai., 1991) által ismertetett nukleinsavszekvenciákkal.
A nukleinsav”,, nukleinsavszekvencia, poiimikleotid, oSgonukleotid”, polinakleotid-szeks,'encia és ntAleotidszekvencía” kifejezések a leírás szerinti értelemben nem lényeges kifejezések, és nukleotídok pontos sorozatát jelölik - amelyek lehetnek módosítottak vagy nem módosítottak és amelynek segítségével egy nukleinsav egy frag5 mense vagy egy szakasza. meghatározható, amely tartalmazhat nem természetes nukleotidokat, és amely pontosan megfelelhet egy keltés szálú DNS-nek, egy egyszalu DMS-nek és a l>NS-ek transzkripciós termékének,
A homológ nukleoüdszdcvencia kifejezésen minden olyan nukleotidszckveneiál értünk, amely az 1. azonosítószámú szekvencia szerinti szekvenciától egv nukleotid vagy kevés számú nukleotid szubsztitúciójában, deléciójában és/vagy inszeroiójában tér el, olyan helyzetekben, ahol ezek a homológ nukleotidszekveneiák homológ pohpeptldeket kódolnak, mint ezt az alábbiakban ismertetjük,
Előnyösen a homológ nukleotídszekveneia legalább 75%-ban, előnyösen legalább 85%-ban, előnyösebben legalább 95%-han azonos az 1, azonosítószámú szekvencia szerin15 ti szekvenciával.
A leírás szerinti értelemben két nukleinsav- vagy aroinosavszekveneia közötti százalékos azonosságé kifejezésen a nukleotidok vagy az arohmsavak azon százalékát értjük, amelyek azonosak a két összehasonlítandó szekvenciában, ha a legjobb egymás mellé rendezést alkalmazzuk. Ez a százalék teljes mértékben statisztikai jellegű, és a két szekvencia közötti különbségek véletlenszerű eloszlásban találhatók a teljes hosszban. A legjobb egymás mellé rendezés vagy “optimális egymás mellé rendezés kifejezéseken azt az egymás mellé rendezést értjük, amelynél az alábbiakban megbatározott százalékos azonosság a legmagasabb, A két nukleinsav- vagy a két arninosavszekvencia közötti szekvenciaösszehasonlításokat általában az optimális módon egymás mellé rendezett szekvenciák összehasonlításával végezzük, és az összehasonlítást szegmens vagy összehasonlítási ablak” vizsgálattal hajtjuk végre oly módon, hogy a szekveneíahasonlöságok helyi szakaszait azonosítjuk és hasonlítjuk össze. Az összehasonlításhoz a szekvenciák optimális egymás mellé rendezése manuális elrendezésen kívül helyi horoológia algoritmussal [Smith és Watermas, Ad. App. Matb. 2, 482 (1981); Neddleman és Wunsch, 1. Mól. Bioi. 48, 443
3Ö (197Ö)], hasoníoságkeresési eljárással [Pearson és Lípman, Proc. Natk Acad.. Sci, USA 85, 2444 (1988)j, GAP-, BBSTPFT-, BLASTP-, BLASTN-aigoriímusokai (lásd, HCBí weblap) és 'FASTA- és TFASTA-algnritmusokat (Wiseonsin Genetícs Software Package, Geneties Computer Group, 575 Science Dr„ Madíson, Wí) használó számítógépes programokkal végezhető. Az optimális egymás mellé rendezés eléréséhez elönvösen a BLASTalkalmazzuk BLOSÜM62~máírixsasal. A PAM- vagy PAM250-mátríxok szintén
A két nnkleinsav- vagy aminosavszekvencía közötti százalékos azonosság ezen két szekvencia optimális egymás mellé rendezésének összehasonlításával határozható meg, amikor az összehasonlítandó nnkleinsav- vagy aminosavszekveneiák addieiőkal vagy delécíőkat tartalmazhatnak a refemnciaszekvencíához képest a két szekvencia közötti optimális egymás mellé rendezésben. A százalékos azonosságot a két szekvenciában azonos helyzetben lévő nnkleotidoknak vagy aminosavaknak a számával határozzuk meg oly módon, hogy az azonos helyzetek számát az összehasonlított helyzetek teljes számával osztjuk és az eredményt löö-zal szorozzuk, hogy a két szekvencia közötti százalékos azonosságot
Előnyősén egy homológ nukleotidszekveneia specifikusan hibridizái az 1, azonosítószámú szekvenciával komplementer szekvenciával sztríngens körülmények között, Á körülmények sztríngens mértékét meghatározó paraméterek attól a hőmérséklettől függnek, amelynél a párosodott szálak 50%-a szétválik (Tm). A 30 bázisnál hosszabb szekvenciák esetében a Tm a következő egyenlettel határozható meg: Tm81,5 * θ31 (%GH3) + 16,6
Molecular Cloning, A laboratory mannal, 9.54-9.Ó2. Cold Spríng Harbor Laboratory Press (1989)]. A 30 bázisnál rövidebb szekvenciák esetében a Tm a következő egyenlettel batá20 rozható meg: Tm ~ 4{O+C) +· 2(A4'f). Megfelelően sztríngens körülmények között, amikor a nem specifikus szekvenciák nem hibridizálnak, a hibridizációs hőmérséklet körülbelül S-3öcC~kal, előnyösen 5~löeC~kal alacsonyabb a Tm-nél, és az alkalmazott hibridizációs pufferefc előnyösen nagy ionerősségn. oldatok, példánl 6 X SSC.
A ’^ukleotidíragmens kifejezésen az 1. azonosítószámú szekvencia szerinti szek25 vencia vagy' az 1. azonosítószámú szekvenciával homológ nnkleotidszekvencíák bármilyen fragmenséí értjük, amelyfek} tbszfbenol-pirnváí-karboxíláz enzimaktivitású pepiidet vagy fehérjéi kődol(nak), mint ezt az előzőekben ismertettük. A nokleofidfiagmensek legalább I S egymást követő nukleotídoh előnyősén legalább 30, 75, 150,300 és 450 egymást követő nukleotidot tartalmaznak abból a szekvenciából, amelyből szármájuk,
A módosított nukleotidszekveneia kifejezésen minden olyan nnkleofidszekvenciát értünk, amelyet szakember számára jól ismert mutagenezis technológiákkal nyerünk, és amelyek a normál szekvenciához képest módosításokat tartalmaznak, például mutációkat a polipeptid expressziójáfeoz szükséges szabályozó és/vagy pmmóterszekyenciákban, arne15
Ivek előnyösen a polipeptid expressziós szintjének vagy aktivitásának változásához vezetnek;
A módosított nnkleotidszekveneia kifejezésen minden, módosított poiípeptídet kódoló nukleotidszekvenciát is értünk.
A találmány szerinti, reprezentatív fragmensek próbák vagy iáncinditól amelyek nukleinsavszekveuciák kimutatására, azonosítására, vizsgálatára vagy mégse rnzására alkalmazhatók. Ilyen eljárások például a PCR ampliíikácíós technológiák (ismertetése például az US 4.683.202 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratban található) vagy a PCR-szerú technológiák, például az SOA-módszer (”strand displacement 10 amplifeatinn, szálklszorításos ampliíikáeió) [Walke? és mtsai., Nucleic Ácíds Rés. 20, 196.1 (1992)], a TAS-technológía (transeríption-hased amplífeatíon system, transzkripción alapuló ampliSkáeiös rendszer) [Kwoh és mtsai., Proe. Natl. Acad. Scí. USA 86, 1173 )}, a 3SR-technolőgia f’self-susíaíned sequence replication, önfenntartó szekvencia©uaíetii es mtsai., Proe, Natl. Acad. Sci. USA 87, 1874 (1990)], a NASRAa (nueieie acíd sequenee based ampIiScation”, nukleinsavszekveneíán alapuló ampü&Káctó) [Kievítis és mtsal., X VíroL Methods 35. 273 (1991)], a TMA-íeelmológia (hanscripíion medíated amplification teehrtique, transzkripció közvetítette amphhkáciő), -az LCR-technolőgia (ligásé chain reaetion, lígáz-láncreakció) [tandegren és mtsai,, Science 241. 1077 (1988)], az RCR C'repaír chain reaetion”, javító láncreakció) (Segev, 20 Kessler C, 197-205, Springer Verlag, Berlin, Mew York (1992)], a CPR (cyclíng probe macison, ciklusos próbareakció) [Bock és mtsal., Biotechniqnes 9, 142 (1990) és a Qbéta-replíkáz amphhkációs technológia [Miele és mtsai., 3. MoL Bioi. 171,2S1 (1983)].
A leírás szerinti értelemben a próba vagy láncindítő kifejezések alatt egyszálo nukieinsavBagmensi vagy denaturált, kettős szálú fragmenst értünk, amely például 12 bá25 zistól néhány kb nagyságú lehet előnyösen 15-íöl néhány száz bázis nagyságú, előnyösen 15-töl 50 vagyr 100 bázis nagyságú, és a hibridizáció specifitása olyan, hogy az adott körülmények között hibridizációs komplexet képez a célzott nukieínsavvaí,
A találmány egyik megvalósítási módja szerint a PEPC-fehérjét kódoló nukleinsavat szensz orientációban egy mddeínsav-konrimkeióba építjük, amelyet, expressziós kazetta30 nak vagy konstrukciónak neveznek, és olyan elemekhez kapcsoljuk., amelyek lehetővé teszik az expresszióját és adott esetben a szabályozását. Szakember számára jói ismert, különböző módszerekkel készíthető BNS-expressziós kazetta. A DNS-koastrukcióban általában 5’ és 3' szabályozó szekvenciák találhatók a PBPC-génhez működőképesen kapcsolva. A működőképesen kapcsolt kifejezésen az 5' és 3‘ szabályozó szekvenciák és az ellenőr15 zendö nekleinsavszekveneia közötti működőképes kapcsolatot értjük. Az 5' szabályozó szekvencia jellemzően egy kiválasztott promóter, Egy működőképesen kapcsolt promóterrel végzett, ellenőrzött transzkripció működőképes rnRNS-t hoz létre, amelynek transzkripciója tévén termelődik a PEPC. Az. expressziós kazettában a FEPC-et kódoló nukleinsavszekvencia jellemzően egy transzkripciós ínicíációs szakaszhoz (promóterszekvenciához) és egy transzkripciós terminációs szakaszhoz kapcsolódik oly módon, hogy az a transzformált növényben működőképes legyen.
Promóterek közül elsősorban konstitutív promóter alkalmazható, például rizs aktinpromótere, amelyet rizs aktmmtronja követ (KAP-RAi) a pActl-T.őö979ÓÖ68949Ő42 plazmádban (Me Elroy és mtsat, 1991) vagy a 35S-promot.er (Kay és mtsai., 198?) vagy egy szövetspecifikus promóter. Előnyösen búza nagy molekolatömegő glutenin (’-hi^t molecnlar weíght glutenin”) KMWG-promóíere [Biechl és mtsai., 1994) vagy cirokeredetű foszfoenol-ptmvál~karboxiláz~gén PEPC-promótere alkalmazható (Crétin és mtsai., 1991), amelyek a kérdéses fehérjének az expresszíőját a magban, illetve a levelekben teszik teke· tővé, Vízstressz körülményei között expressziét indukáló promóterszekvenciák szintén alkalmazhatók (Kasuga és mtsai., 1999). A találmány szerinti konstrukciókban alkalmazható terminátorok közül megemlíthető például Xgro&mteAum mnmfhefemr nopalin-szintázgénjének 3!-vége (Depicker és .mtsai., 1982), Említést érdemel még karfiol mozaikvirus r) 3SS-poliA~termmáiora, amelyet Pranek és .munkatársai írtak le (Franck és mtsai.,
EPC-fehétje expressziója alkalmas szekvenciákkal szintén szabályozható, példá20
ul;
- íntronokkal, például kukorica adhlS-intron-1 (Callis és mtsai., 1987), dohányaövény sárga mozaikvirus DSV-ínírooja (Morris és mtsai., 1992) és rizs aktin-l-intronja (McElroy és mtsai,, 1990), serkentő szekvenciákkal, y mozaikvirus (ΊΈΥ) transzkripciós aktiválom (Cs ésPred, 1990)
- vezetűszekvenciákkal, például az EMCV-vezetöszekvenela (Eneephalomyocarditis 5’ nem kódoló szakasz) [0. Elroy-Stein, T. R. Fueresl és δ. Moss, PNAS USA Só, 612630 ó 130 (1989)1, TE V (dohánynövény kareolatos vírus) vezetőszekvenciája (Állison és mtsai., 1986), MDMV (kukorica törpe mozaikvirus) vezetöszekveneiája {Vírology 154. 9-20 (198ő)j, BiP-humán kötő fehérje vezető szekvenciája |D. G. Maeejaek és P. Samow, Hature 353, 90-94 0991)), AMV RNS 4 vezetöszekveneiája [S. A. Johling és I,. Gehrke,
Natúré 325. 622-625 (1987)] és IMV' vezetószekveneiája (D, R. GslHe és mtsai., Moleodar Biology of RNA, 237-256 (1989)],
A találmány tárgyát képezi az előzőekben ismertetett expresszié» kazettát tartalmazó vektor is.
A találmány egyik megvalósítási módja szerint az expressziős kazettát egy nnkleotidvektorba építjük be, például egy piazmidba, amely markergém is tartalmazhat, például egy olyan gént, amely lehetővé teszi a transzformált növény kiválasztását a transzfektált, idegen DNS-t nem tartalmazó növények közül. Markergénként megemlíthető egy antibiotikumra, például higromieínre rezíszteneíát biztosító gén (Herrera-Estrella és mtsai., 1983) vagy egy gyomirtó szene, például a szulfonamíd asulamra rezisztenciát biztosító gén (WO 98/493lő). Előnyösen Óírgofomvcm Myrawop/evs foszfinotricin-aeenltranszferázt kódoló Bar-génjének szekvenciája alkalmazható (nyilvántartási szám X17228), amely acetilálással bontja a foszímotríeint (BastMEiberty'® gyomirtó szer szelek15 tív hatóanyaga) (White és mtsat.,
Az előzőekben ismertetett vektorral növényi sejteket transzformálunk olyan módon.
hogy a vektort egy, a növényi sejteket fertőzni képes sejtes gazdába visszük, amely integrálni képes az eredetileg a fentiekben ismerteted vektorban lévő nukleotidszekveneiákat a növényi sejtek genomjába. Az alkalmazott sejtes gazda előnyösen baktériumtörzs, például rtgroóoemráím /w^ereas, előnyösen A.n és munkatársai közleményében leirt eljárás szerint (An és mtsai,, 1986), vagy .dgroóőcíerinm ráízegenes előnyösen Guerche és munkatársai közleményében leírt eljárás szerint (Guerche és mtsai., 1987). A transzformált sejtek jellemzően kallnszből, embrióból, merisztémasejtekből és/vagy szuszpenziós te. lévő sejtekből származó sejtek.
A növények transzformációja a szakember számára jól ismert, különböző, alkalmas módszerekkel végezhető, ismertetés például Meihods in Enzymology 153. kötetében (1987) található (Reeombinant DNA Part D). A transzformáció” kifejezésen egy növény, sejt, sejtvonal, kallusz, szövet, növényi rész vagy hasonlók genetikai manipuláeiőíát értjük. Egy ilyen alkotórészt transzformálunk rekombináns DNS jelenlétében, amelyet a növényi alkotórész genetikai anyagába juttatunk kromoszómáhsan vagy' extrakromoszómálisan. A rekombináns DNS lehet idegen DNS, beferológ DNS vagy kiméra DNS. A rekombináns DNS véletlenszerűen épülhet be, vagy célzottan, egy konkrét helyre, amely homológ rekombinációval kivitelezhető a szakember számára ismert módszerekkel.
- 9 Növényi sejtek például árme/öetens tumorkeltő, extrakromoszómális, cirkuláris Ti-plazmidja T-szakaszának átvitelével transzformálbatők bináris rendszer alkalmazásával (Watson és mtsai., 1994), Ennek érdekében két vektort készítünk. Az egyik vektorban a T~szakaszt deléelóval eltávolítotíuk a jobb- és baloldali határok kivételével, és történő szelekciót teszi lehetővé. A bináris rendszer másik résztvevője egy segítő Ti-plazmid, amely oly módon átalakított plazmíd, hogy sincs benne T-szakasz, de még tartalmazza a növényi sejt transzformációjához szükséges vte virnieneiagéneket.
Egy előnyös megvalósítási mód szerint Ishida és munkatársai eljárása alkalmazható (Ishida és mtsai., 1996j egyszikűek tmnszfonnálására.
Az expresszíós kazettának növényi sejtbe juttatására más megvalósítási módok is lehetségesek, előnyősén géneknek növényi sejtekbe történő bevitelére szolgáló közvetlen átviteli módszerek említhetők, például közvetlen mikromjeketó növényi embriókba (Neuhaus és mtsai., 19S7), vákuum alatti infíltráciő (Bedüoid és mtsai., 1993) vagy elektroporáciő (Chupeau és mtsai., 1989) vagy PEG-gel történő közvetlen kiesapás (Schöcher és mtsai., 1986) vagy a kérdéses plazmid-DHS-sel borított részecskékkel történő bombázás részeeskeágyúval (Fromm és mtsai., 1990).
Egy másik módszer szerint a transzformációt Finer és munkatársai (Fmer és mtsai., : eljárása szerint, végezzük részeeskeágyúval, volffám- vagy aranyrészeeskékfceí.
Karfiol mozaikvámsa {CaMV) is alkalmazható vektorként idegen nukleínsavnak növényi sejtekbe történő bevitelére [Hohrt és mtsai., Molecular Blology of Plánt Tumors, 549-560 kiad.: Ácademie Press, New York (1982); Howell, US 4.407.956). A CaMV vírus-DNS-t a szülői bakteriális plaztnídba építjük, így egy rekombináns DNS-molekuláí kapunk, amely baktériumban megsokszorozható. Klónozást kővetően a rekombináns plazmrd újra klónozható, és ágy módosítható, hogy a kívánt DNS-szekveneíát egy egyedi restrikciós hasítási helybe visszük he. A rekombináns plazmld módosított, víruseredetü része azután kivágható a szülői bakteriális plazmidbóL és növények vagy növényi sejtek oltására alkalmazható,
A találmány tárgyát képezi az előzőekben ismertetett nukleinsavszekvenciákkaí 30 transzformált gazdasejt is, valamint az előzőekben ismertetett eljárások valamelyikével nyerhető növény vagy növényi rész, előnyösen termés, mag, szemtermés, pollen, levél vagy gumó. Az ilyen növényi kiónok vagy leszármazottaik szintén a találmány tárgyát képezik.
#* ♦
10Á növények többek között Q-íípusfo szántóföldi terménynövények, zöldségnövévagy virágok, lehetnek, például kukorica és cirok,
Legalább egy, találmány szerinti növénynek egy másikkal történő keresztezéséből nyeri, hibrid, transzgénikus növények szintén a találmány tárgyát képezik,
Az expressziós kazetta általában stabilan integrálódik a .sejt genomjába,
Egy másik szempont szerint a találmány tárgyát képezi:
- PEPC-fehérjét kódold nakleinsav alkalmazása olyan C^dpnsú, transzgénikus növények előállítására, amelyekben a szénalapú asszimilációs termékek tartalma megváltozott, amely elősegíti a termés érését és a mag telítődését,
- PEPC-fehétjét kódoló nakleinsav alkalmazása olyan C^típnsú, transzgénikus növények előállítására, amelyekben a szénalapú asszimilációs termékek tartalma megváltozott, amely vízstresszel szemben ellenállóbbá teszi a növényi.
Egy másik szempont szerint a találmány tárgyát képezi PEPC-fehérjét kódoló nuklemv vagy egy fragmensének próbaként vagy amplifikáolóboz láncindílőként történő ΜΙ 5 kalmazása vízstresszel szemben dlenáltőhb és/vagy megváltozott magtelítődést matató, az előzőek szerint transzformált növények kiválasztására,
A találmány tárgyát képezi olyan növény, amelyben a PEPC-fehérje a nem transzformált növényhez képest fokozottabb mértékben expresszálódik a levelekben és a szemtermésekben, például kétszer vagy háromszor nagyobb mértékben.
A transzformált növényekben a PERC fokozottabb mértékű expressziója révén a CO2 a RCBISCO környékére koncentrálható, amely így elősegíti a CO? asszimilációját, annak ellenére, hogy vízstressz körülményei között kevésbé hozzáférhető (mivel a gázcserenyílások nyitottsága csökkent). Kimutattuk. hogy CCh asszimilációja (karboxílázaktivitás) fokozható vízstressz körülményei között, konkrétan, szárazság idején PEPC fo25 kozott mértékű expresszié)a és a giricserenyílások nagyobb ellenállása lehetővé teszi a fotoszintetikus szénáram és a REBISCO-aktivitás fokozását.
A találmány szerinti, transzformált növényeknek a kontrolinövényekhez képest fokozottabb vízstresszel szembeni ellenállóképessége fiziológiai, morfológiai és/vagy biokémiai eljárásokkal mérhető. Például a PEPC-aktiviíás mérése (funkcionális ítdajdonságok), a
PEPCk-aktivitás mérése, a PEPC íbszforiláeiós szintjének mérése a növényekben, a CO2 nettó asszimilációjának mérése, a CO2~kompenzáeiős pont mérése, a CO2-beu szegény légkörben való fotoszintetikus hatékonyság mérése, a vízhasznosítás hatékonyságának mérése, a friss tömeg és a száraz tömeg normál körülmények között és vízstressz körülményei között történő mérése említhető.
♦ *<* * *« «
-π
A találmánv tárgyát képezi a FEFC-fehérie fokozása (fotoszintetikus
asszimilációs termékek tartalmát, így elősegíti a szemtermés telítődését.
A találmány szerinti, transzformált növényekben a szemtermés telítődésének a nem transzformált növényekhez képest tapasztalt megváltozása morfológiai, fiziológiai, és/vagy biokémiai
A
az infravörös spektrofotometriás technogetéssel és gázkromatográfis vizsgalat (Metcatte és mtsaí., 19óő; Bligh és Dyer, 1959).
-át képezi továbbá PEFC-et kódoló nukleinsav vagy ftagmensének íhoz láncinditóként történő alkalmazása megváltószénalapú anyagcserével bíró, transzformált növények kiválasztására, amelyeknek így jobb a vízstresszel szembeni ellenálióképessége és megváltozott a mag telítődése.
FEPC-et. kódoló nukleínsavszekvencia, példán! az 1. azonosítószámú szekvencia szerinti szekvencia, és az ebből a szekvenciából nyerhető bármilyen oligonakleodd próbaként 15 alkalmazható markerrel segített szelekciós programokban, például a FEPC-fehérjét kódoló a növénybe történő átkerülésének nyomon követésére. Ennek érdekében a próbák egyikét például radioaktív izotóppal jelölj ők., majd kapcsolatba hozzak a növény restrikciós enzimekkel emésztett, genomi DNS-ével olyan körülmények között, amely a radioaktív próbának a kérdéses DNS-hez történő specihkos hibridizációjához megfelelő, PEFC-fehérjét kódoló nukleinsav vagy egy fragmense próbaként vagy FCRamplrfikáeíőhoz láncinditóként alkalmazható FEPC-et természetes módon fokozott mértékben expresszáló növények kiválasztására, amelyek így vízstresszel szemben ellenállób-
bak és/vagy megváltozott a mag telítődése.
A találmány egyéb előnyei nyilvánvalóak lesznek a következő leírásból, amelyet az ábrákkal szemléltetünk. A következőkben az ábrákat Ismertetjük.
Áz 1. ábrán a proFEPc-FEPCSl FNosPolyA-konstníkcióí tartalmazó pMj26plazanrd restrikciós térképét mutatjuk be.
A 2. ábrán a 35S~PEFC31CKNosFolyA-konstmkcíóí tartalmazó pM|19-plazmíd restrikciós térképet .mutatjuk be.
Á 3. ábrán a pAerin-introm-bamaseÁNosPölyÁ-konstnátciót tartalmazó pWP2S0plazmid restrikciós térképét mutatjuk be,
A 4. ábrán a pAedn-intron-többszötös klónozó hely-NosFolyA-konstrukeiól tartalmazó pBÍÖS298-plazmid restrikciós térképét mutatjuk be.
**:
-.12Αζ 5. ábrán a pActin-intron~PEPC3í í'NosPolyÁ-konstmkcíót tartalmazó pMj30plazmtd restrikciós térképei mutatjuk be.
A 6. ábrán a pHMWO-FBTCSll-NosPölyA-kon^ukciőt tartalmazó pM)31~ plazmid restrikciós térképét mutatjuk be.
A 7, ábra diagramján a proPEPC-PEPC-konsbaikcióval transzformált T2~növények leveleiből származó, oldható fehérjekivonat PEPC-aktívitását és immunológiai kimutatását ábrázoljuk.
A 8. ábrán a proHMWG-PEPC-konstrukclőval transzformált növények T2- és T3~ csöveiből származó egyedi szemtermések oldható feheqekivonatának PEPC-aktivdtását és lö immunológiai kimutatását ábrázoljuk.
A 9. ábrán a B6-E1 .3-növények vízhasznosításának (δ) hatékonyságát mutatjuk be.
Példák
1. Rekomblnáns vektorok készítése
A cirokból (Q-növéxry) származó PEPC-cDNS-t az irodalomban közölt eljárás szerint izoláltuk (Crétín és mtsai., 1990), A. cirokból (cv Tamaran) származó, C^-formájú PEPC-cDNS teljes szekvenciájának nyilvántartási száma XI7379.
Először négy, alapul szolgáló plszmidvekfort készítettünk, a pMj-26-ot, a pMj~19-eí, a pMj-30»at és a pMj31-et, amelyek mindegyike tartalmazza (sorrendben) a PEPC20 promőtert vagy a 355-prométert vagy az aktínpromőter-aktininhon szakaszt (pAct) vagy a líMWG-promőterb és minden konstrukcióban a PEPC-gén cDNS-et és a nopalin-sziníáz terminátorát (forNos), amely a sok növényi fajban funkcionális poliadeniiáews szignált alakítja ki.
A közbenső vektorokat rigmónríerixo» ínme/bcfons LBA 4404 törzsében lévő, a
Ispán Tobacco cég pSBl-vektorávaal (EP 672752) történő homológ rekombinációval készítjük el (Boekema és mtsai., 1983).
A génátvbel, amelyet a gének (a szelekciós gén és a kérdéses gén) expresszíőja követ kukoricában, Jgroboeforium rime/bcms természetes tulajdonságain (Zambrisky és mtsai., 1989) és a szuperbináris plazmid elvén alapul (fiiéi és mtsai,, 1994; és ishída és mtsai,,
1996).
A klónozáshoz használt restrikciós enzimek a New Engiand Biolabstől származtak (New Engiand Biolabs, UK). Az enzimes reakciókat Samhrook és munkatársai könyvében leírt módokon végeztük (Samhrook es mtsai., Moleenfear Cloning; A Laboratory Manuai, Colé Spring Harbot Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989)}.
-131-1, Az alapul szolgáló plazmidvektorok 1-1-1, A pMj-26-konstrukclő: oPEPC-PEPC
A pCaMVNeo Nos-terminátotát (0,4 kb BrnaHlZ//Z«íöIí-inszert) (fromm és latsai,, 1986) SumHl- és PimHH-enzimekkel emésztett pUC9~plazrmdha klónoztuk (Vieira és
Messing, 1982), A plazmídot RnmHÍ-gyel nyitottak fel, és a végeit Klenow-pohmerázzal alakítottuk tompa végűvé, majd a PEPC-cDNS CP311-et ligáitok hozzá (Klenowpolimerázzal tompa végűvé alakított ámnE/AWlll-inszert, amely egy csendes mutációt tartalmaz az ATGH2Ö bp A'eol-helyben; Wang és mtsah, 1992). A Nos-terminátor és a cDNS orientációját és a kapcsolódásukat emésztésekkel és szekvenálással határoztuk meg.
A CP46 genorní klón 1530 bp nagyságú Akrol-inszertjét (Lepimec és mtsah, 1992), amelynek teljes szekvenciája az alábbi, 2. azonosítószámú szekvencia szerinti szekvencia (proPEPe-promöterszekvencía), az így nyert plazmíd ófcol-helyébe klónoztuk. Az orientációját emésztésekkel és szekvenálással határoztuk meg, A pMj-26 térképét az 1. ábrán mutatjuk be, í 5 1-1-2 A ρΑίί-19-konstrukcló: p3 5S-PEBC
A PEPC-cDNS CP3IÖ-et (Klenow-polimerázzal tompa végűvé alakított ^nlWműIÍ-inszert; Crétin és mtsai, 1991) pCaMVNeo tompa végűvé alakított heiyébe klónoztuk a 35S-promóter (0,4 kb) és a Nos-terminátor (0,25 kb) kézé. A /ímíflllmszertet (3,7 kfo) azután pSK+ ffindíll-helyébe klónoztuk (<3enhank No. 52325). A 35S20 promóter és a cDNS orientációját és a kapcsolatukat emésztésekkel és szekvenálással határoztuk meg, A pMj-19 térképét a 2. ábrán mutatjuk be.
1-1 -3 A pMl-30-konstrukeló: pAciln mtroa-PPPC Az aktin-promóter-PEPC'-NosJ'-konstrukció klónozásához a pActiníntron-Barstar~Nos-pohA-kazettát tartalmazó pWT280-píazmídoí alkalmaztuk alap25 plazmádként (3. ábra), amelyben a Barstar-fragmenst a PPPC-lragmenssel helyettesítettük. Az alappíazmidot a következő lépésekkel állítottuk elő: a harstar-gént [Hartley, J.
Mól, Bioi. 202, 913-915 (1988)] AbelZPóudl-lmgmensként vittük be a pW90-plazmid AbuIZSmnl-helyéhe, amely plazmid a plíDÖ-plazmidból származik [Guérineau és mlsat., Plánt Moh Biok 15, 127-136 (1990)] (a CaMV 35S-promótert a kettős 35S-promóterrel helyettesítettük, és az Xhal- és FeoRI-helyek közötti polihnker-szakaszt φοί-, PnmHl-, ómul- és Pari-helyekre cseréltük). Az így kapott plazmíd CaMV-poliA-szakaszát a pED23 pohA-szakaszával helyettesítettük [Balé és mtsai., Gene 91, 79-85 (1990)1, így kaptuk a pWP266-ot A kettős CaMV 35S-promólerszakaszt végül pCOR 113-ból származó
-14[McElroy és mtsai., Mot Gén. Génét 23 1. 150-169 (1991)}, rizs aktinptomóterével és bömjával helyettesítettük, amellyel kialakult a p WP2$Ö-plazmid,
A p3VP28ö-plaz,midből azután Pstl-enzimss emésztéssel kivágtuk a harstaríragmenst, majd önmagával ligáitok, így nyertük az aktinpromóter-intron-többszörös klónozó tely-Nos3’-terminátor-ú'agmenst tartalmazó pBIÖS298-vektort (4, ábra). Λ pBIOS-298~konstrukeiőt az aktimatroa és a Nos-termiaátor közötti PeoRV-helyen felnyitottuk, majd defosz&riláltuk, A pM3-2ő~ban lévő .hfc»I-ScoRV-insa;eitet Klenowtompa végűvé, és pBÍOS-298-ba klónoztok. A konstrukció orientációját emésztéssel vizsgáltuk, és az aktinintron-PEPC kapcsolódást szekvenáituk. A pM3~
30 térképét az 5, ábrást mutatjuk be,
1-1-4 Á pMj-31-koustrukeió: p.RMWG-PEFc ml (Stratagene) származik, ameiyavzí f’high moleenlar weight riáját (Róbert és mtsai,, 19S9)
A pBL3214-vektor a pBlnesen): be búzából származó, a mag gksternn’'', nagy molekulatömeg» £ és .dg?-oóneto?7u?n mzue/hetons Nos3!-íerminátorszekveneiáját (Depieker és mtsai., 1982} inszertáltok specifikus restrikciós enzimek kiválasztásával, amely a szakember számára jól Ismert,
A pBL32Í4~konstrnkeiót a IdMWG-pnunótor és a Nos-tenuínátor közötti Sírnihelyen felnyitottuk, és defösxforiláliuk, A pMJ-26 Aeol-FeoRV-inszertjét Kíenew20 polimerázzal tompa végűvé alakítottuk, majd p3214-fee klónoztuk. A konstrukció orientációját emésztéssel igazoltok, és a pHMWG-FEPC kapcsolódást szekvenáituk. A pM3-3I a ő, ábrán n
1-2 Közbenső vektorok készítése pSBl-gyel történő homológ rekombinációhoz
amelyet két
Az ..dgrobuefertnm mm^ótoensben. történő homológ rekombinációhoz alkalmazott vektorok a pBIOS273-vektorból készültek.
1-2-1 A pBIOS273-. oBÍOS2?4- és;
A: A homológ i állítottunk elő.
- az első lépésben a pDM302-vekter (Cao és mtsai,, 1992) .RspDEkhoI-fragmensét klónoztuk (p-Acf-Bar-íerNos) a pSB12-vektor ómul- és RspDl-helyébe (Japan Tobacco), A klónozás után keletkező vektort pBK)S272~nek nevezzük,
- a pBlÖS2?2-vektor 3363 helyzetében lévő Aání-helyet kivágtuk Mvl-enzímmel történő részleges emésztéssel és a ragadós végek. DNS-polimeráz I nagy (Klenow) ** *
-15tagmensével történő kitöltésével Az így kapott vektort, amelyben csak egyetlen Almihely van pBÍOS273-nak nevezzük.
B: A pBíÖS274-ptazmid készítése
- a pWP128-vektor (Paul és mísaú, 1992) ..fhol-fragmensét klónoztuk (Pro A95 Barnase-íerCaMV9) AM~gyel emésztett pBIÖS273-vektofba.
C: A pBiöS30S-plazund készítése
- &pBIOS308 a pBIGSSÖh-píaznűdból származik, amelyet az előzőekben ismertetett, AeoRV-tel emésztett pBIGS29S~vektor 795 bp nagyságú I/A7ml~fragmensébe (Asrí cDNS) történő klónozással kaptunk.
- a pBIOS30ó-vektor 2970 bp nagyságú Sn/I/AAuI-fragmensének a pB108274
RspDEASol-belyeibe történő klónozásával állítottuk elő a pBÍOS308-at
1-2-2 A FEFC-eDNS-t tartalmazó, közbenső rekombinációs vektorok készítése
Ezeket a konstrukciókat a pBIOS274-, a pBíGS273- és a pBIOS308~vektorokböl állítottuk elő.
A: ApBK)S326~vektor
Ezt a vektort a pMl-30-vekíor ApuRBstBI-fragmensének a pBIOS3Ö8-vektor BínelWtBl'-belyébe történő klónozásával állítottuk elő,
B: ApBIÖS327-vektor
Ezt a vektort a p'MJ-31-vektor .Ool-íragmensének a pBIOS274-vektor Alol-helyéfee 20 történő klónozásával kaptak.
A: A pBiOS356-vebor
Ezt a vektort a. pMJ-26~vektor Smub'//mdIIl-&agmensének a pB!OS273-vektor Bmel-helyébe történő klónozásával nyertük.
2. Kukorica transzformációja 25 2-1 Részecskeágyú
Az alkalmazott eljárás J. Fmer 0. Finer, 1992) részecskeágyú alkalmazásán alapuló módszerén alapul. A célsejtek erősen osztódó differenciálatlan sejtek, amelyek megőrizték azt a képességüket, hogy teljes növénnyé regeneráljanak. Ilyen sejtek például kukorica emhriogén ka!iuszáhan találhatók (B-típnsú kallusz). Ilyen kalluszok Hííf-genotípusú, éret30 len embriókból nyerhetők Ármstrong és munkatársai által ismertetett eljárással és táptalajokon (Ármstrong és mtsak, Maíze Handbook 665-671, M. Freeling, kiad,: V. Walbot (1994)], A körülbelül 10-20 mm2 felületű kalluszdarabokat, Petó-csészénként 16 darabot; 4 órával a bombázás előtt a kafluszinicíáeiös tápközeggel azonos, 0,2 M mamuttal és 0,2 M szorbittal kiegészített tenyésztő tápközeget tartalmazó Peíti-csésze közepére helyezzük. Az ·· W * 1» * *♦· .♦ * ν * 3»Φ« < φ Φ β Φ
9 Φ $Φ<* χ »*, * ♦ΦΧ X X- χ φφ % *.ζ
-16előző példákban ismerteteti, a beviondő FEFC-szekvenciákat hordozó plazmídokat Qiagen^-oszlopon tisztítottuk a gyártó útmutatásai szerint. A tisztított DNS-eket voürámrészecskékre (Mlö) csapatjuk Klem leírása szerint (Klein, 1987), Az ilyen módon borított részecskéket részecskeágyú segítségével a célsejtekbe lőjük Finer eljárása szerint (Finer,
1992). A bombázott kalluszlemezeket Scellofeais^-szal lezárjuk, majd sötétben tenyészt27°C-om Az első órával két resztül minden 15. napon a szelekciós anyaggal kiegészített, imciáeiós tápkőzeggel azonos múltán, vagy egyes esetekben korábban, olyan kallnszokat kaszaporonasár a szelekciós anyag nem gátolja, és amelyeket általában és Ιοί 0 ként olyan sejtek alkotnak, amelyek a génnek, amelyre a szelekció történik, egy vagy több kópiáját a genetikai örökítő anyagukba beépítették, ilyen kultuszok keletkezésének gyakorisága körülbelül Ö,S kailnsz bombázott csészénként
A kallnszokat azonosítjuk, elválasztjuk adöbbí közül, megsokszorozzuk, és oly módón tenyésztjük, hogy esíranóvönnyé regeneráljanak. Ennek, érdekében a sejtek hormon és 15 ozmotikus egyensúlyát Vain és munkatársai eljárása szerint változtatjuk (Vain és mtsai.,
1989). A növényeket űvegházhan akklimatizáljuk, ahol keresztezzük őket, hogy hibrideket vagy önmegtermékenyttésből származó utódokat kapjunk.
Előnyösen egy hasonló módszert alkalmazunk, amelynek elvi alapjai a Metbods of Moleeular Biology című műben találhatók [Metbods of Molecular Bíology 49. 113-123 20 (.1995)|» és amelyben a Hili-genotípusú éretlen embriókat közvetlenül bombázzuk a beviborítptt. aranyreszecskékket Ezt az eljárást Bareelo és Lazzeri szerint hajtottuk végre (Bareelo és Lazzeri, 1995). A transzformáció lépéseit, a szelekciót, az érést és a regenerációt lényegében az előző módszerhez hasonlóan végeztük.
történő transzformáció
Egy másik, a találmány szerint alkalmas transzformációs technológiában rígroűöíZerium nnneámíenst alkalmazunk ísbída és munkatársat szerint (isbkla és mtsai., .1996), előnyösen a megtermékenyítés után IÖ nappal kivett, éretlen embriókat használunk. Valamennyi alkalmazott tápközeg leírása megtalálható az Idézett hivatkozásokban. A transzformációt egv együtt tenyésztési fázissal kezdjük, amelyben a kukoricannvények éretlen embrióit legalább öt percen keresztül kapcsolatba hozzuk a szuperbináris vektorokat tartalmazó ztgroűseferium tumeynriens LB4404 törzsével. A .szuperbináris plazmíd a kérdéses géni és/vagy az előző példákban ismertetett plazmídokból származó szelekciós markert tartalmazó T-DNS-i hordozó, közbenső vektor és a Japan Tobacco pSBl -vektora (ΕΡ 672752) közötti homológ rekombináció eredménye, ez utóbbi a következőket tartalmazza: rto»e^de»s szupervíruless A281 törzsében (ATCC 37349) lévő pTiBo$42-plaznúd vírB- és virG-génjeit és egy, a közbenső vektorban található homológ szakaszt, amely a homológ rekombinációt teszi lehetővé. Az embriókat ezután három napra, 2SöC~ra, sötétbe, l-SA-tápközegre helyezzük. Az első szelekciót a transzformált kalluszokon hajtjuk végre: az embiogén kalluszokat 5 mg/ml foszfinotneini ős 250 mg/I cefotaximot tartalmazó LS.D5-tápközegre visszük az JgroÓocte/mm mm^üefenssel való szennyeződés megszüntetése vagy csökkentése érdekében. A kalluszokat két héten keresztül sötétben, 25*€-on:
lépést az LSDS-tápközegen kifejlődött embrióknak eeíotaxlm jelenlétében LSBlö-tápközegre (foszimofricm 10 mg/i) történő átvitelével hajtjuk vépe három héten keresztül az előzőekkel megegyező körülmények között, A harmadik szelekciós lépést a következők szerint végezzük: az I-típusú kallnszokat (1-2 «sshs darabokat) kivágjuk, és három hétre sötétbe, 25°C-ra helyezzük LSDIG15
A kifejlődött, I-típusá kalluszokat kivágjuk, és LSZ-tápközegre visszük foszfinotriem (5 mg/1) és eefotaxhn jelenlétében, és cstranövényeket regenerálunk belőlük két hét alatt, 22°€-οη, folyamatos megvilágításban, A kifejlesztési lépesben a regenerált esiranövényeket 180 mg/1 Augmentint tartalmazó RM-M32 tápközegre visszük két hétre, 22®C~ra, folyamatos megvilágításba. Az így kapott növényeket üvegházba telepítjük akk20 Iknatizálás céljából.
3-1 FEPC extrafceióla kakoriealeveiekhól és;
- A leveleket leszedjük, és folyékony nitrogénben azonnal lefagyasztjuk. Az eldörzsölést 1 00%-os etanollal előzetesen megtisztított és jégen lehűtött mozsárban végezzük.
Egy 18 mm átmérőjű levéllemezt 200· pl exírakdős pufferben extrahálunk [Tris-HCI pH 8A 20% glicerin, 10 mM MgCl2, l mM EDTA, 1 mM OTT, 2% (t/tí) oldhatatlan PVP, Fontainehleau homok és proteáz inhibitorok: 2 mg/1 leupepdn, 2 mg/1 chymostatin, 1 mM PMSF és 1 mg/1 Eő4j. Ha a levélben PEPC foszforilációjának mérését is tervezzük, foszfatáz-inhibitorokat, okadaiksavat (0,1 tngZl) és mierocystin-LR-t (10 nM) is hozzá30 adunk. Az eldörzsölt anyagot 4cG-on, 15 percen keresztül centrifugáljuk. 20000 g-vef a
- A magokat előzetesen golyós malomban porrá őröljük (Retsch). A fehérjéket 100 pl pornak 400 pl, az előzőekben ismertetett pufferben, jégen történő sznszpendáiásávat *·# * X *
V < V **·< 4 κ ί Φ * * * *»$* 9/ vonjuk ki. A keveréket vortexszcl összekeverjük, és 4eC-on, 15 percen keresztül centrifugáljuk 2ÖÖOO g-vel a sqttörmelék eltávolítása céljából.
Mindkét esetben a felülűszó tartalmazza az oldható fehérjék nyers kivonatát. Ez közvetlenül alkalmazható PEPC-akfivítás mérésére, vagy folyékony ható, és -20®C-on tárolható a későbbi, Western-blothoz történő 3-2 Az expresszié mérése 3-2-1 Westem-hlot
Pohakrilamid-gélelektroforézissel SDS jelenlétében a fehérjék molekulatömeg szerint elválaszthatók. Ez a Laemmh-íele módszer (Laemmli, 1970),
A PEPC immunológiai kimutatása blokkolást követően níítoeeliulóz membránon történik az első ellenanyag hozzáadásával, amely a következő:
a) cirokeredetű CQ-PEPC poliklonális ellenanyag, amely Vidal és munkatársai módszere szerint állítható elő (Vidal ésmtsai,, 198(1),
b) föszferilácíós hellyel szembeni ellenanyag, amelyet eirokeredetű C^-PEPC ISIS terminális szekvenciájának 23 anűnosavból álló szintetikus peptldjévei {ERÍiiiSlDAQLRÁLAPCsK.VSEE(YG)j (Crétin és mtsai., 1990) szemben állítunk elő, amely tartalmazza a feszforiláeiós helyet Az ellenanyagot nyűlhan termeltettük, és prnteoszlopon történő afEmtáskromatográfiával tisztítottunk. Az ellenanyagok az enzim foszfbrilált vagy nem foszforllált formáját egyforma hatékonysággal ismerik fel.
Az alkalmazott hígítás 1/2000.
c) C-terminálissal szembeni 2C
Töj :, amelyet eirokeredetű C^-PEPC C-terminális álló szintetikus peptldjévei állítunk elő, amely tartalmazza a állítottuk elő, majd tisztítottuk. Az alkal25 mázod hígítás 1/15 000.
d) eirokeredetű PEPC CQ-formájával szembeni monoklonálís ellenanyag, amelyet hibridómatecbnifcával készítettünk. Több mint 400 ellenanyag-termelő hihrídómát állítottunk elő immmúzált egerek „somén” sejtjeinek NSl-mielómasejtekket történő fúziójával. A 83 és 91 számú ellenanyagok rendkívül nagy speciíilást mutattak eirokeredetű PEPC C<30 formájára (Thomas és mtsai., 1987),
Cirokeredetü, Crtípusű PEPC-nek a növényekben történő immunológiai kimutatásával a tmnszgénikus fehérje szignifikáns jelenlétét sikerült detektálni, előnyösen a proPEPC-PEPC-konstrukelőval. A fokozott mértékű expresszié kapcsolatba hozható továbbá a tmnszgénikus növények és a kontrollnövények között megfigyelt aktivításheli kn* * V * ** V $ «Λ* » ¥ * .» *
-19lönbségekkel, amely akár 2,2-szerese is tehet a levelekben megfigyelt endogén PEPCszínűtek,
A proHMWG-FEPC konstrukció (magok) szintén megfelelő eredményt hozott, mivel a PEPC expressziójának szintje akár hatszor nagyobb is lehet, mint a transzformált ÍGtípusú növényekből származó magokban az endogén PEPC expressziós szintje.
3-2-2 Az
A PEPC maximális aktivitását spektrofotométerrel mértük (Cary 50, Varian). A mérés elve két kapcsolt reakción alapok a PÉP PEPC által történő β-karboxiláeiőjával oxaloaeetát keletkezik, amelyet NAf>~Bggő malát-defeidrogenázzal (MDH) malátiá redukálunk, A 340 nrn-nél mért abszorpció csökkenése a NADH SO^C-on történő oxidációjának következménye. A reakcióelegy 1 ml végtérfogatban 100 mM Hepes/RGH-1 pH 8, 5 mM magnézium-kloridot, 0,2 mM NADö-t, S mM nátrium-bidrogéíikarbonátot, 5-10 mM Na-PEP-t (Roche) és 8 enzimegység NAD-filggö MDB-t (Roehe) tartalmaz. A reakciót S~
50 pk PEPC-et tartalmazó, magból vagy levélből kivont fehérjekivonat hozzáadásával indítjuk, Egy enzimegység egy gmói terméknek egy pere alatt' történő képződését jelenti a
2,2-szeres növeke-
lis enzimaktivitásában (7.
A biokémiai vizsgálattal a levélben lévő kontroHszinthez dést lehetett kimutatni a
Magok esetében az enztmakuvuasoan hatszoros xuiönnseg ngyetnetö meg az ugyanabban a csőben lévő transzformált magok javára a sem transzformált magokhoz képest (8. ábra). Bármelyik generációban, amely áanszformáit növény és nem transzformált növény közötti keresztezésből vagy visszafcewsztezésből származik, az ugyanabban a esőben lévő transzformált magok aránya 50%-tól 100%-ig terjed a transzgént kifejező helyek számától függően. A legtöbb esetben az ugyanabban a esőben lévő transzformált szemek aránya 50%.
A PBPC-aktivitás növekedése mennyiségi kapcsolatba hozható a transzgéníkus fehérével (immunológiai kimutatás).
Konkrétabban, a transzgén (proPEPC~PEPC) állal kódolt enzim expressziós szintjét a transzformált kukoricanövényekben a levél fehégekivonaíában a katalitikus aktivitás mérésével és Westem-hlottal határoztuk meg.
-20Ötven növényt vizsgáltunk;
-15 növény 6 Λ tmszfbraációs -eseménynek felel meg (Aó-B, C, D, E,
FJ),
- 35 növény 14 biobsztikus transzformációs eseménynek felel meg (Bő-A, B, C, D, 5 E, F, G, H J, J, K, L, Μ, N).
Néhány növényi (B6-TL98183722408633, B6-A4.2) pontosabban jellemeztönk, A fokozott mértékű expresszié szintje a PEPC specifikus aktivitás tekintetében (optimális pH-nál és lö naM PEP-koneentrácíó esetében) 4-112% ± 13 (két mérés) a B6-T .1.98183722408633 számú növény transzgénikus leszármazotíainál, és 4-17% ± 16 a B6lö A4.2 növény transzgénikus ieszármazottainál, a megfelelő levélkivonatok tartalmazzák a eirokeredetű PEP€~eí (immunológiai kimutatás).
Kimutattuk, hogy a rekombináns fehérje fokozott mértékű expressziója esetén a legmagasabb szinten expresszáló növényekben (B6-T ,15244901723741 és B6-A4 btolisztikusan tramzformált) a transzgének száma is a legmagasabb (3-7 kópia).
Vizsgáltuk, hogy a transzgénikus fcnkorieanövényekben a C4-PEPC aktivitásának szintje kapcsolatban áÓ-e a íranszkrlptomok felhalmozódásának szintjében történt változással.
Először is bizonyítottuk, hogy a transzgénrol ténylegesen képződik mRN'S. NorthernBioinál az alkalmazott próba (65 bp a eirokeredetű CG-PEPC-cDNS-ének 5 - végén) nem teszi lehetővé a cirokból és a kukoricából származó enzimeket kódoló tnRNS-ek megkülönböztetését (ezek valóban nagymértékben homológok, beleértve az 5’ és 3’ nem transziatálí szakaszokat). Másrészről viszont az RX-PCR-íechnológia alkalmazásával ki lehetett mutatni a ttanszkriptnm specifikus jelenlétét a PEPC-aktivitásban pozitíy vagy negatív irányban változást mutató növények levélkivonatának teljes BNS-ében.
Továbbá, Northem-blot kísérletekkel (a két, termelődött ÍG-PEPC’-mRNS-sel hibridízáló próbával) kimutattuk, hogy a C4-PEPC-transzkriptumok teljes mennyisége az enzim mennyiségével együtt változik.
Igazolttá: azt is, hogy az alkalmazott promóter (proPEPC; 1.530 bp a eirokeredetű C4~ géntől S'-irányhan) míormáeiót hordoz a transzgén expresszíójának specifikus ellenőrzésé30 re a cirokeredetű Q-PEPC-et fokozott mértékben expresszáló, transzformált növények mezőiül urnában.
» »« .1
1.
-21fe) A PÉP S& j értékének mérése és PEPC malária való érzékenységének meghatározása
Az S03 enzimkonstans az a PEP-koncenriáciő, amelynél a katalitikus sebesség a maximális sebesség 50%-a.
Eredményeink szerint a magokban lévő FBPC S04 értéke PÉP esetében szignifikánsan nagyobb, mint a kontrollmagokban az enzim 8^5 értéke, amellyel egy (rekombináns) Crforma jelenléte bizonyítható a transzformált magokban.
A maint a PEPC fiziológiás gátfészere. Mértük a PEPC aktivitását nem optimális körülmények kozott (3 mM PÉP, pH 7,3) 1,2 mM. L-malát jelenlétében és hiányában. Az eredményeket a malát jelenlétében mért aktivitás / malát nélkül mért aktivitás X 100 egyenlet alapján számolt értékben fejezzük. ki. A defoszforüált forma sokkal érzékenyebb maláttal történő gátlásra (70%), mint a íoszforiíáit forma (30%). Ezzel a vizsgálattal megbecsülhető a levélben lévő enzim foszforüáclós állapota, amikor a növényt különböző hatásoknak tesszük ki (fény, sötétség, stressz).
Előzetes vizsgálatok azt mutatják, hogy nincs szignifikáns különbség a rekombináns
PEPC-et erősebben vagy' gyengébben expresszálő növények között a malátra való érzékenységben. Ily módon az exogén PEPC a levélben, fényben ugyanolyan arányban fpszforilálődik, mint az endogén PEPC. Ez azt matatja, hogy erős megvilágítás esetén a PEPC aktivitásban történő növekedést nem egyenlíti ki kisebb mértékű foszfioriláeió,
3-2-3 Malát mérése
Az anyagcseretermékek kivonatát 10 mg anyagnak (levél vagy mag) 100 μΐ 5%-os (tfi'tf) perklorsavas homokkal és 2% (t/íf) oldhatatlan PVP-vel történő eldörzsölésével állítottuk elő. Az alapanyagot 20000 g-vel, 4°C-on. 5 percen keresztül centrifugáljuk. A felülúszó pH-jál ló pl 50%-os kálium-karbonáttal 7,6-ra állítjuk. A vizsgálat (Roebe reagens25 készlet) elve L-malátnak oxaloacetáitá történő oxidációján alapul (MDH) malátdehldrogenáz közreműködésével NÁD jelenlétében, A reakciói az oxaloaeetát. képződésének irányába teljesen véghez visszük oly módon, hogy ezt. a reakciót glutamát-oxalcacetáttranszamináz reaketójához kapcsoljuk az alábbi reakcióegyenletek szerint.
MDH oxaloaeetát + NADH + H* _??w ΐ, «»« « * < χ # » * « ««XX x ♦ *K X« * »*« w
GOT {2} oxafoaeetát +· glulamát
-f- ?.
a-
meöiásan mérjük. 340 rnn-nét, és a következő képlet alapján számoljak az L€ ~ ΔΑ χ [(V x MW)/(a xdxvx 1000)J, ahol v - a ki vonat térfogata ml-ben kifejezve
MW ~ L-malát molekulatömege g/möl hányadossíd kifejezve d:::: az optikai üt hossza cm-ben kifejezve ε NADH specifikus abszorpciós .koefficiense, amely 340nm-nél - ó,3 mmól'5.cm'!
A malátíarialomban szignifikáns különbséget nem lehetett kimutatni a transzformált magok és a kontrollmagok között. Ha a malát fokozottabb mértékben termelődött a transzformált magokban, akkor valószínűleg tovább is alakult az anyagesere-úA'onalakon,
3-3 Molekuláris vizsgálatok
A transzfomtánsok közül előnyösen azokat választottuk ki, amelyek egy lökusz-'égy kópia lőszereiét mutattak (1 kópia a kérdéses génből és 1 kópia szelekciós markergén) minden kedvezőtlen piazmidszekvencia nélkül. Többféle alkalmas restrikciós enzimmel és 20 többféle alkalmas próbával Southem-íedmológiát alkalmaztunk (Southern, 1975) a növény genomjába történt inszereiő azonosítására és jellemzésére, amellyel a ímnszíbrmáeiós események elkülöníthetők. Ezzel a módszerrel a genom meghatározott helyzeteinek megfelelő, egyedi különbségek, mutathatók ki az adott enzimmel és adott próbával nyeri restrikciós fmgmensek méretéten,
A következő módszereket alkalmaztuk.:
pBIOS327: ,φαί- vagy AcoRI-emésztés, aktinintron-prőbával vagy
- proAcíio pB10S326: Ajmhemészíés, BAR-próba. Ezen a konstrukción az aklinpromőter es -intron redundanciája miatt egyetlen próba nem elegendő. Második hit ciős anyagként RB-prőba alkalmazható.
- pmFEPC pBIOS356: ΧρηΙ-emésxtés, BAR-próba és PEFC-promóter.
A kapott profilok a várakozásainknak megfelelőek voltak.
-234. Fiziológiai mérések kukorieanövényekben korlátozott víz- és CQg-hozzáférés körülményei között
4.1. Szén-dioxíd asszimilációja és száraz/nedves tömeg mérése vizstressz körülményei között
Az alkalmazott eljárás a következő lépésekből áll (PeUesehí és mtsai., í 997):
A transzformált vonalak magjait (24) periites földbe vetjük 10 cm átmérőjű és 25 cm magasságú virágeserepekbe (cserepenként egy magot), amelyeket Üvegházba helyezitek. A hőmérsékletet nappal 2ő0C-ra, éjjel 18°C-ra állítjuk, a relatív nedvességtartalom 70%, és szükség esetés a természetes fényt mesterséges fénnyel pótoljuk (Philips Sun-T Agro lám10 pa), amellyel legalább 400 pE-t biztosítunk. A tápoláatot (Hydrocani €2) Sequestrene (g/1) oldattal egészítettük, ki, amely a kukorica vasigényét elégíti ki.
A második levél fehérjék! vonatának Westera-bloí vizsgálatával meghatározzuk a növények genotípusát, és így a szegregánsok véletlenszerűen oszthatók el az üvegházban. A vízstresszt akkor alakítjuk ki, amikor a növények 90%~áa a negyedik levél ligulaja már látható, amely általában 15-20 nappal a vetés után figyelhető meg. A fotoszintetikus paramétereket rendszeresen mérjük (IRC?A CIRAS Ϊ készülék PP Sysiemstől) minden egyes egyedetu 15 napon keresztül, hogy a szárazság kialakulását nyomon kövessük, a két csoportban, A kezelés végén megmérjük, a hatodik levél vízpoleneiáljáf, a föld feletti részek nedves és száraz tömegét, és a biokémiai vizsgálatokhoz egy mintát fagyasztunk.
A kísérleti körülmények között a fotoszintetikus paraméterek mérése azt mutatja, hogy:
- a szén-díoxid nettó asszimilációja növekszik, a kontrolihoz képest átlagosan akár 7%~kal mind normál körülmények között, mind pedig vizstressz körülményei között,
- a vizstressz végén a vízhasznosítás hatékonysága szintén növekszik a kontrollokhoz .25 képest. 25%-kal,
- a vizstressz 18 napját követően a nedves és száraz tömegek 10%-kal illetve 2Ö%~ kai növekednek a kontroliakhoz képest
Konkrétahhatt, a fotoszintetikus paraméterek mérését olyan növényeken végeztük, amelyeknél korlátoztuk a vlzhozzáférést az üvegházban. Az automatikus öntöziető heten30 dezést leállítottuk, amint a negyedik levél hgulája. megjelent. A vízkoriátozás kialakulása idején a méréseket rendszeres időközökben végeztük. Azonos fotoszintetikus asszimiláció esetén a vizsgált Bő-T jelű transzgénlkus növények szignifikánsan különböztek a kontrolinövényektől az A/Gs értékben (CQh uettó asszimiláció/ sztómás vízkonduktaneia aránya), mint ez a 9. ábrán látható. Ezen az ábrán annak az állapotnak az eredményei láthatók, amiφφφ
-24kor a növények 9054-án a negyedik levél lignléja kifejlődőd, ekkor az öntözési leállítottuk és a fotoszintetikus paramétereket rendszeresen mértük, A pontok a mérési átlagokat jelentik (±SE), a tovább öntözött növényeket A, a koniroiínövényeket ·, a transzformált növényeket □ jelöli. A transzgénikus és a nem transzgénikus növények között megfigyelt kü~ lönbsegek statisztikai konfidenciájának mértéket csillagokkal jelöljük, ** p < 0,01, A stressz lö, napjától ez a paraméter a transzgénikus növényeknél sokkal gyorsabban emelkedik, és eléri a 21,6 értéket, amely 30,154 ± 20,5 növekedés (p < 0,005). A csírázás heterogenitása ellenére, amely eltéréseket okoz a mérésekben, negyven Bó-T-növényen végzett második kísérletsorozattal meg lehetett erősíteni az előzetes adatokat (316%, p < 0,2). Ezek az eredmények azt mutatják, hogy szárazságnak kitett transzgénikus növényekben jobb a víz hasznosítása.
Ezzel szemben az A6-T .15244901723741 transzgénikus növényekben, amelyekben a GrPEPC nem található meg, az A és az Á/Gs értékek sokkal alacsonyabbak a kontrolihoz képest korlátozott vízhozzáférés idején, A stressz végén a transzgénikus növényekben csökkennek az A és az. AZGs értékek 3854 ± 13,5 (p < 0,001), illetve 47% ± 4 (p < 0,001),
4.2 Szén-dioxid snzáeiós pont és fotoszintetikus szenA termesztésnél két csoport alakítottunk a magokból: a magokat (kukoricának megfelelő) tápoldsthan áztatott perínbe vagy sngárkezelt komposztra ültettük, és üvegházban neveltük.
A esíranövények 8-10 napos korában - 4-5 leveles állapotban - végeztük el a Bastatesztet: a harmadik levelet 0,75 gd koncentrációjú ammóniom-glüfoszinát vizes oldatába áztatott szivaccsal bekenjük (4 cm2 felületen).
A Basta-tesztet 5 nappal később értékeljük ki: a nekrotíkns levelek azt mutatják, hogy a növény nem transzformált, ezeket a növényeket a továbbiakban kontrollként alkalmazzuk.
A növényeket ezután btotronkamrákba helyezzük, és a CO?·
20-25 nap múlva határozzuk meg.
A Cörkíeserélődésí méréseket 21 napon keresztül végeztük a következő termesztési 30 körülmények között tartott növényeken: CCh-koncentrácíó 50 ppm, lény 800-1000 pE, m'2 s'\ hőmérséklet 26°C nappal és 20°C éjszaka, 8054-os nedvességtartalom nappal és éjszaka, A légkörinél alacsonyabb CÖj-koncentrációval utánozni lehet a vízstressz hatását, és előnyösen a gázcserenytlások nyitottságának csökkenését.
A kísérlet végén mindegyik mir a növények nedves és száraz
Kísérleteink szerint a transzgéníküs nővé pont 2-4 ppm-mel alacsonyabb (26-30%-os nyékben.
Konkrétabban, a kísérletbe vont növés az alábbiakban foglaltok össze.
kben (egész, növények) a kompenzációs mint a nem transzformált névénevelttik. Az eredményeket
B6-T1
NT
Látható levelek szánra 10 nap- 2,48 ± 0,59 I 2,77 ± 0,42
pal az ültetést követően $
| Látható levelek száma 2.0 nappal az ültetést kővetően levél szélessége (cm) levél felü levél szélessége (cm) 5 levél felülete (cm2)
5,58.+ 0,47 5,79 ±0,42 1 p~02I +3,8
227 + 0,17 2,44 + 0,25 p~0J)2 ””+73*
36,2 + 6,0 38,7 ± 8,3 p > 0,2 +6,9
1,34 +0,34 ‘6,7 ± 18,5 3,56 + 0,36 | p-0,02 82,7 ±11,8 | p >02 | +6,6* 1 +7,8
•»22 ± 0,42 4,61 ±0,17 | p-0,01 ί +9,2*
levél felülete a stressz 18
n (cm”) g a 4. levélen I 49,0 + 5,0 (szlómaszám/mnü) [ Sztórnasürüség a 10. levélen j 39,3 + 1,7 (sztőmaszám/mm2)
Nedves súly a stressz 18 napját követően (g)
Száraz súly a stressz 18 napj át követően (g)
165 ±24,6 I p>0»2 +5,8
p-0,007 I -22** p«Ö,03 | -7,6* |
22,18 ±1,74 j 24,49 ±2,53 | p-0,03 +10,4*
2,77 + 0,52 | 3,32 + 0,50 | p-0,02 | +19,8
Megfigyeltük, hogy & transzformáció pleioíróp hatásokban nyilvánul meg:
- A tenyésztés kezdetén (10 nappal az ültetést kővetően) a íranszgéntkns B6-TIcsúanövények gyorsabban növekednek, ami körülbelül 0,3 levél előnyt jelent a nem « * « « * >
íranszgénikus növényekkel szemben. Ez a különbség, amely az auxotróf fázis végén észrevehető, a növény korával csökken, mivel a tenyésztés 20. napja után az előny mindössze 0,2 levél.
- A levélszélesség a transzformált növényekben nagyobb 7,5% (4 levél) és 6,6% (5 5 levél) normál tenyésztési körülmények között, 6 levélnél pedig még nagyobb eredményt kaptunk (49,2%) a 18 napig fartő stressz végén.
Á légkör COz-tartalma, amelyben a knkorieanövények nevelkednek, befolyásolja a sztőmasürüségef A 4. és 1 <k leveleken a PEFC-akfivitásheli különbség az egységnyi felületre eső gázeserenyílások számában történő szignifikáns csökkenésnek feleltethető meg.
lö Végül pedig, valamennyi, a transzformált növényekre specifikus fotoszintetikus és biometrisi jellemző a stressz végén a nedves tömeg (410,4%) vagy a száraz tömeg (419,8%) szignifikáns növekedésében nyilvánul meg a transzformált növényeknél a kontrollokkal összehasonlítva. Ez a növekedés valószínűleg a hatékonyabb fotoszintetikus működés eredménye, amely egy Integráló jelenségen keresztül (abszolút értékben exponeneiá15 lis) lehetővé teszi, hogy a növény fokozza a növekedési sebességét.
Másrészről viszont, amikor a fotoszintetikus PEPC-kapacitás 78%-kal csökken, a kukorica fotoszintetikus teljesítménye jelentősen gyengül (Aó-F 1.1 -növények, amelyekben nincs Ch-PBPC). A levelek kevésbé szélesek (-10%), a mért száraz tömeg kisebb (-30%) és a gázeserenyrlások száma nő (413,5%) a kontroilnövényekhez képest, amelyek kinézetre gyengébbeknek tűnnek, amely elsősorban a hüvely méreteinek csökkenésében és pigmentációjáhan mutatkozik.
4.3 Egyéb, szántóföldi mérések
A találmány szerinti, transzformált növényeknek a kontroilnövényekhez viszonyított, vízsíresszel szetnlreni ellenállóképessége különböző fénoöpikus, fiziológiai és/vagy bio25 kémiai vizsgálati eljárásokkal értékelhető ki, előnyösen árasztásos körülmények között, normál feltételek mellett (hagyományos termelés öntözéssel) és vízstressz körülményei között
Az osztályozást a virágzás és a betakarítás különböző időszakaiban végeztük, mértük a stresszel szembeni tolerancia hatását a maghozamra, előnyösen a megtermékenyülés szá3(1 zalékát (a csővenkénti magok száma / a megtermékenyíthető magkezdemények száma), a csővenkénti sorok számát, a soronkénti magok számát, a magok víztartalmát, 1000 mag súlyát.
-275. A fehérje- és hpldtartalom kvantitatív és kvalitatív változásai
5.1 Infravörös technológia
Á közeli infravörös (NIR, near infiared”) vizsgálat természetes elektromágneses spektrumot alkalmazó, spektroszkópos technológia, A közeli infravörös tartomány az a szakasz, amelyben a spektrum 700 nrn és 2500 nm közötti hullándrosszál jellemezhető. Ily módon a látható tartomány és a közepes hosszúságú infravörös tartomány közötti átmenetet képezi, A közeli Infravörös tartomány folyadékok, szilárd vagy gáz halmazállapotú minták vagy snrn szuszpenziöban lévő minták kémiai tulajdonságainak mérésére igen kedvező. A közeli infravörös tartományt alkalmazó készülékek diszperziós szűrövei ellátott monokromáforok, Ez a technológia meglehetősen precíz, gyors és nem roncsoló-, A NÍRvizsgálatban jellemzően CH-, Ofi- és NB-kötéseket tartalmazó molekulák mérhetők, előnyösen zsírsavas anyagok, fehérjék, keményítő és oldható cukrok.
A különböző anyagcsere-útvonalak, például a szerves savak, a zsírsavak és az aminosavak szintézise közötti egyensúlyban bekövetkezett változások ezzel a technológiával vizsgálhatók teljes magban.
5.2 Elem vizsgálat (C, N)
Az elemek szárazon történő vizsgálatának eljárása (Dumas) a szilárd részecskéknek kemencében, l'20ööC~on történő teljes és nagyon gyors elégetésével történő gáz halmazállapotúvá alakításári alapul A kemencéből az összes keletkező gázt egy nem reaktív gáz (hélium) folyamatos áramával hajtjuk ki.. Az égés folyamán a szén szén-dfoxíddá. alakul, és a nitrogéntartalmú vegyüietek Nrgázzá vagy különböző nitrogén-oxídokká alakulnak <NGS). A gázok réz redukciós oszlopon (őCXTC) haladnak keresztül, ahol a nitrogénoxidokhól felszabadul az oxigén és az oszlopot H? formájában hagyják el. A vízét, magnézi um-perklorát oszlopon nyeletjnk el A keveréket ezután gázkromatográfiás oszlopra (Chromosorh) vezetjük, amely elválasztja a nitrogént (először mosódik le) a széndioxidtól. Katarométerrel mérjük a referencia-gázáram (hélium) és a vizsgálandó gázáram vezetőképességében lév© különbségeket
Ezzel a mtkísxerrel a teljes fehérjetartalomnak a szénhidráttartalomhoz képest bekövetkezett változása mutatható ki minden egyes mag eldörzsölt anyagában,
í.ipidfartafom (zsírsavak és trighceridek)
Az Összes lípídet Bligh és Dyer eljárása szerint vonjuk ki (Bligh és Dyer, 1959). Áz eldörzsölt .magokból nyert anyagot eíanolhan történő forralással fixáljuk, majd azonos térfogatú kloroform, majd víz hozzáadásával extraháljuk (1/1/1, v/v/v). Az extrakciós közeg* χ * * « ♦
-2810 hez ismert mennyiségű heptadekanoátot (Cl 7:0) adunk. Ez egy kukoricában nem található zsírsav, amely belső standardkent szolgál.
A zsírsavkivonatot médiaijuk, és a metilésztereket gázktomatográriával vizsgáljuk. A medlálási Metealfe és munkatársai eljárása szerint végezzük (Metcalié és mtsai., 1966). Ezzel a technológiával a zsírsavak metilészterei a szénatomok száma és a tebtetlenség mértéke szerint választhatok el. Egy integrátor segítségévei az egyes zsírsavak mennyisége a
Ezzel az eljárással a teljes iipidtartalomnak a száraz tömeghez képest bekövetkezett változása mutatható ki az egyes magkivönatokhan.
Az oxaloacetátnak majd a malátnak a leukopiasztok felé történő áramlásának íbko(PEPC-en. keresztül) a zsírsavtartalom növekedéséin
A szekveneiahstáhan található kötetlen szövegrészek (223 kod) fordításai;
<2ÍO>1 <223> PEPC-eDNS-szekvencia <2W> 2 <223> PEPC--promóter-székveneia

Claims (10)

SZABÁDALMI K'iÉNYPON'íOK
1 ö típusú növénnyé történő regenerálódásra alkalmas körülmények között tenyésztjük, ahol a CÁ-PEPCA fokozott mértékben expresszáljuk a regenerált, transzformált növényekben.
1. Eljárás vízstresszel szemben fokozottan ellenálló, Q-íipusű növények előállítására, azzal /e&mezve, hogy
2-0
2. Az 1, igénypont szerinti eljárás, ahol a Ca-ripusú növény kukorica.
3. Áz 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve. hogy azonosítjuk és kiválasztjuk
15 azokat a transzformált sejteket, amelyek a nem transzformált növényekhez képest vízstresszel szemben elienálióhb Ch-típusu növényekké képesek regenerálódni,
4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve hogy az expressziós kazettában olyan promótert alkalmazunk, amely a PEPC-t kódoló szekvencia konstitutív, célzott expresszióját teszi lehetővé,
5, A 4, igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az expressziós kazettában olyan promóíert alkalmazunk, amely az alábbiak bármelyike; aktinpromöier-imron, HMWO-promóter vagy PEPc-promóter,
5 - legalább egyetlen Ch-típusö növényi sejtbe beviszünk egy cirokból származó Cr típusú foszíbenol-piruvát-karboxílázt (PEPC) kódoló nukleoridszekvenciát tartalmazó expresszi ős kazettái, amely nukleotidszekveneia tartalmazza az 1. azonosítószámú szekvenciát,
- az így transzformált sejteket az expresszié» kazettát a genomjában tartalmazó C-r
6. Az 5, igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a promöter a 2, azonosítószám szerinti PEPc-promóter.
25
7. Áz 1. igénypont szerinti eljárással ny erhető növény vagy növényi rész, azzal jellemezve. hogy a növény, genomjába stabilan integrálódott -módon, olyan expressziós kazettát tartalmaz, amely cirokból származó Crtipusú feszfbenol-píruvát-karboxiíázt (PEPC) kódoló nnkleoiidszekveneíái hordoz, amely nukleotidszekveneia tartalmazza az 1. azonosítószámú szekvenciát.
30
8. A 7. igénypont szerinti növény vagy annak része, amely növény kukorica.
9. A 8. igénypont szerinti növényi rész, amely mag vagy szemtermés.
10-, Vektor, amely cirokból származó Ch-típusú foszíbenol-piruvát-karboxilázt (PEPC) kódoló nukleoiidszekvencíáí tartalmazó expressziós kazettát tartalmaz, amely nukleotidszekveneia tartalmazza az 1. azonosítószámú szekvenciát.
-30Π, Á 10. igénypont szerinti vektort tartalmazó gazdasejt.
12. A. 10. igénypont szerinti vektorral transzformált növényi sejt vagy ilyen sejt klórja,
13, A 12. igénypont szerinti növényi sejt, amely kukoricanövény sejtje.
A meghatalmazott:
Söt-3 ) SS , DANÜBIÁ
10 X PaIaeT, Szabadalmi és Jóst Iroda Kft.
HU0303658A 2001-04-04 2002-04-04 Overexpression of phosphoenolpyruvate carboxylase HU228383B1 (en)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR0104602A FR2823063B1 (fr) 2001-04-04 2001-04-04 Procede d'obtention de plantes c4 a metabolisme carbone modifie
FR0114822A FR2823064B1 (fr) 2001-04-04 2001-11-16 Procede d'obtention de plantes c4 a metabolisme carbone modifie
PCT/FR2002/001173 WO2002081714A2 (fr) 2001-04-04 2002-04-04 Surexpression de la phosphoenolpyruvate carboxylase

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HUP0303658A2 HUP0303658A2 (hu) 2004-03-01
HU228383B1 true HU228383B1 (en) 2013-03-28

Family

ID=26212955

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU0303658A HU228383B1 (en) 2001-04-04 2002-04-04 Overexpression of phosphoenolpyruvate carboxylase

Country Status (10)

Country Link
US (1) US7462762B2 (hu)
EP (1) EP1383902B1 (hu)
AR (1) AR035811A1 (hu)
AT (1) ATE500335T1 (hu)
AU (1) AU2002307970B2 (hu)
CA (1) CA2443411C (hu)
DE (1) DE60239325D1 (hu)
FR (1) FR2823064B1 (hu)
HU (1) HU228383B1 (hu)
WO (1) WO2002081714A2 (hu)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007089610A1 (en) 2006-01-26 2007-08-09 Ceres, Inc. Modulating plant oil levels
US7329797B2 (en) 2004-12-08 2008-02-12 Ceres, Inc. Modulating plant carbon levels
CA2590923A1 (en) 2004-12-16 2006-06-22 Ceres Inc. Modulating plant nitrogen levels
EP1928227A4 (en) * 2005-08-30 2009-05-20 Monsanto Technology Llc TRANSGENIC PLANTS WITH IMPROVED AGRONOMIC CHARACTERISTICS
US20090199308A1 (en) * 2005-08-30 2009-08-06 Kimberly Zobrist Duff Transgenic plants with enhanced agronomic traits
AR067766A1 (es) * 2007-07-31 2009-10-21 Basf Plant Science Gmbh Metodo para modular la expresion de una planta de fosfoenolpiruvato carboxilasa (pepc), proteina de la caja u de clase iii y proteina de pqqc.
US10689633B2 (en) * 2008-02-29 2020-06-23 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Expression of β-mannanase in chloroplasts and its utilization in lignocellulosic woody biomass hydrolysis
WO2013063344A1 (en) * 2011-10-28 2013-05-02 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Engineered pep carboxylase variants for improved plant productivity

Family Cites Families (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4407956A (en) 1981-03-13 1983-10-04 The Regents Of The University Of California Cloned cauliflower mosaic virus DNA as a plant vehicle
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
JPH0630587B2 (ja) * 1985-08-23 1994-04-27 住友化学工業株式会社 クロ−ン化されたトウモロコシのｐｐｃ遺伝子
JPS62212649A (ja) * 1986-03-14 1987-09-18 Konishiroku Photo Ind Co Ltd スベリ性及び耐接着性の改良されたハロゲン化銀写真感光材料
US5767367A (en) * 1990-06-23 1998-06-16 Hoechst Aktiengesellschaft Zea mays (L.) with capability of long term, highly efficient plant regeneration including fertile transgenic maize plants having a heterologous gene, and their preparation
EP0672752B1 (en) 1993-09-03 2004-05-26 Japan Tobacco Inc. Method of transforming monocotyledon by using scutellum of immature embryo
JP3521161B2 (ja) * 1994-07-09 2004-04-19 日本たばこ産業株式会社 ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼをコードするｄｎａ、それを含む組換えベクター及び形質転換植物
JPH0965886A (ja) * 1995-06-22 1997-03-11 Japan Turf Glass:Kk 植物の光合成に関わる遺伝子のｄｎａ及びそれを導入した植物
JPH09107975A (ja) * 1995-10-19 1997-04-28 Mitsui Toatsu Chem Inc 単子葉ＣＡＭ植物のＰＥＰＣａｓｅ遺伝子
ID21006A (id) * 1997-02-10 1999-04-08 Japan Tobacco Inc Siklus c4 jenis pck
JP3210960B2 (ja) * 1997-03-11 2001-09-25 農林水産省農業生物資源研究所長 Ｃ４植物の光合成酵素を発現するｃ３植物体
GB9708542D0 (en) 1997-04-25 1997-06-18 Nickerson Biocem Ltd Resistance marker
JPH11341928A (ja) * 1998-03-31 1999-12-14 Japan Tobacco Inc リンゴ酸酵素を用いたｃ３植物へのｃ４光合成回路の付与
EP1100940A2 (en) 1998-08-04 2001-05-23 CropDesign N.V. Genes involved in tolerance to environmental stress
EP1129185A1 (en) * 1998-11-10 2001-09-05 Maxygen, Inc. Modified phosphoenolpyruvate carboxylase for improvement and optimization of plant phenotypes
US6653535B1 (en) 1999-05-28 2003-11-25 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods for modulating water-use efficiency or productivity in a plant by transforming with a DNA encoding a NAPD-malic enzyme operably linked to a guard cell or an epidermal cell promoter
GB9920816D0 (en) 1999-09-04 1999-11-10 Univ Glasgow Plant gene
CN1154745C (zh) 1999-11-09 2004-06-23 浙江省农业科学院 利用反义基因调控籽粒油脂含量的方法
US20030115638A1 (en) 2001-08-17 2003-06-19 Ajinomoto Co., Inc. Plants having increased amino acids content and methods for producing the same

Also Published As

Publication number Publication date
AU2002307970B2 (en) 2008-04-03
EP1383902B1 (fr) 2011-03-02
WO2002081714A2 (fr) 2002-10-17
WO2002081714A3 (fr) 2003-11-06
HUP0303658A2 (hu) 2004-03-01
US20040103457A1 (en) 2004-05-27
CA2443411C (fr) 2013-04-02
CA2443411A1 (fr) 2002-10-17
DE60239325D1 (en) 2011-04-14
ATE500335T1 (de) 2011-03-15
FR2823064B1 (fr) 2004-05-28
EP1383902A2 (fr) 2004-01-28
AR035811A1 (es) 2004-07-14
US7462762B2 (en) 2008-12-09
FR2823064A1 (fr) 2002-10-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN113549632B (zh) 水稻OsFLZ2基因在调控禾本科植物抽穗期中的应用
UA115768C2 (uk) Спосіб підвищення стійкості рослини до абіотичного стресу
WO2017177765A1 (zh) 一种als突变型基因在抗除草剂方面的应用
CN116179589B (zh) SlPRMT5基因及其蛋白在调控番茄果实产量中的应用
JPH08510645A (ja) 貯蔵ジャガイモの品質を改良する方法
HU226301B1 (en) Pisum plants with elevated sucrose and reduced starch content
KR20230009299A (ko) 벼의 입자 형태 및 천립중을 조절하는 단백질 gsw8 및 이의 코딩 유전자와 응용
EP2864486B1 (en) Methods and composition for enhanced forage quality
CN112813083B (zh) OsCIPK31基因及编码蛋白在调控水稻纹枯病抗性中的应用
CN112410308B (zh) 水稻ACCase突变型基因及其蛋白在植物抗除草剂中的应用
HU228383B1 (en) Overexpression of phosphoenolpyruvate carboxylase
CN116426538B (zh) 一种控制种子休眠和萌发的蛋白erf4以及编码基因的应用
CN102224243A (zh) 柳枝稷生物学防范
CN112824526A (zh) 一种水稻ACCase突变型蛋白及相应基因
US20120011599A1 (en) Hyddroperoxide genes and tolerance to abiotic stress in plants
CN103898078B (zh) 水稻耐热基因tog1及其应用
CN113293167B (zh) 控制番茄开花早晚的基因及应用
EP0967278A2 (en) Flowering regulating gene and its use
KR100737670B1 (ko) 고구마 유래 익스팬신 유전자의 ｃＤＮＡ 및 이를 이용한고 생산성 형질전환 식물체
CN110407922B (zh) 水稻耐冷基因qSCT11及其应用
CN114456242A (zh) Prp蛋白及其编码基因和应用
CN117402908B (zh) Gl6.1基因在调控水稻粒型中的应用
CN109182350A (zh) 玉米Zm675基因在植物品质改良中的应用
WO2024125590A1 (zh) 多核苷酸、蛋白质、生物材料及其在提升植物果实品质中的应用
CN115044592B (zh) 一种调控玉米株型和瘤黑粉病抗性的基因ZmADT2及其编码蛋白和应用

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees