HU220346B - Defektív rekombináns adenovírusok és alkalmazásuk a génterápiában rák kezelésére - Google Patents

Defektív rekombináns adenovírusok és alkalmazásuk a génterápiában rák kezelésére Download PDF

Info

Publication number
HU220346B
HU220346B HU9503035A HU9503035A HU220346B HU 220346 B HU220346 B HU 220346B HU 9503035 A HU9503035 A HU 9503035A HU 9503035 A HU9503035 A HU 9503035A HU 220346 B HU220346 B HU 220346B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
gene
recombinant adenovirus
defective recombinant
cell
dna sequence
Prior art date
Application number
HU9503035A
Other languages
English (en)
Other versions
HUT73464A (en
HU9503035D0 (en
Inventor
Hedi Haddada
Evelyne May
Michel Perricaudet
Original Assignee
Rhone-Poulenc Rorer S.A.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Rhone-Poulenc Rorer S.A. filed Critical Rhone-Poulenc Rorer S.A.
Publication of HU9503035D0 publication Critical patent/HU9503035D0/hu
Publication of HUT73464A publication Critical patent/HUT73464A/hu
Publication of HU220346B publication Critical patent/HU220346B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/82—Translation products from oncogenes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/76—Viruses; Subviral particles; Bacteriophages
    • A61K35/761—Adenovirus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A61K38/1758—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals p53
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/10043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10211—Aviadenovirus, e.g. fowl adenovirus A
    • C12N2710/10241—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/10243—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10332—Use of virus as therapeutic agent, other than vaccine, e.g. as cytolytic agent
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Abstract

A találmány tárgyát egy defektív rekombináns adenovírus képezi, amelytartalmaz egy heterológ DNS-szek- venciát, melynek expressziója egyrendellenesen osztódó célsejtben legalább részlegesen lehetővé teszi asejtosztódás gátlását és amelynek genomjából hiányoznak a célsejtbentörténő replikációhoz szükséges régiók, ahol az említett DNS-szekvencia tartalmaz – legalább egy intracelluláris fehérjét kódolótumorszupresszor gént, melynek expressziója a célsejtben lehetővéteszi a sejtproliferáció gátlását vagy egy olyan gént, melynekexpressziós terméke a fertőzött sejt apoptózisát indukálja; és – egy,az említett gén expresszióját a fertőzött sejtben biztosító, azemlített géntől eltérő eredetű promoter- szekvenciát. A találmánytovábbá a fenti defektív rekombináns adenovírusok alkalmazására isvonatkozik rákok kezelésére és/vagy megelőzésére szolgálógyógyszerkészítmények előállítására. ŕ

Description

A jelen bejelentés defektív rekombináns adenovírusokra és azok génterápiában, rák kezelésére való felhasználására vonatkozik. Részletesebben olyan defektív rekombináns adenovírusokra vonatkozik, amelyek egy olyan heterológ DNS-szekvenciát tartalmaznak, amely DNS-szekvencia expressziója egy rendellenesen osztódó sejtben legalább részlegesen lehetővé teszi az illető sejt osztódásának gátlását.
A találmány ezen adenovírus-vektorok előállítására és alkalmazására, valamint találmány szerinti adenovírusokat tartalmazó gyógyszerkészítményekre is vonatkozik.
A sejtnövekedés szabályozását két eltérő típusú szignál végzi különlegesen kifinomult módon. Az egyik típus a sejtosztódást segíti elő, míg a másik, épp ellenkezőleg, a sejteket nyugalmi állapotba vagy a sejtdifferenciálódás irányába vezeti át a szervezet igénye szerint. A rákokat az jellemzi, hogy a sejtosztódást kontrolláló mechanizmus elveszti szabályozottságát, ami rendellenes proliferációhoz vezet. A leggyakrabban egy rák kialakulása magában foglalja tehát azon gének aktiválását, amelyek a sejtosztódást segítik elő (az úgynevezett protoonkogének, amelyek onkogénekké aktiválódnak) és azon gének eliminálódását, illetve inaktivációját, amelyek gátolják a sejtosztódást. A jelen találmány lehetőséget nyújt a rák génterápiás kezelésére azáltal, hogy a tumoros sejtekbe egy vagy több olyan gént visznek be, amelyek expressziója lehetővé teszi, hogy a sejtosztódás legalább részlegesen gátlódjon.
A génterápia abból áll, hogy az érintett sejtbe vagy szövetbe genetikai információt vezetnek be, és így korrigálnak egy hiányosságot vagy rendellenességet (mutációt, aberráns expressziót). Ezt a genetikai információt bevihetik in vitro egy, a szervezetből kivont sejtbe, és az így transzformált sejtet azután visszavezetik a szervezetbe, vagy közvetlenül in vivő a megfelelő szövetbe. Ebben a második esetben különböző technikák léteznek, közöttük különböző transzfekciós eljárások, amelyek DNS és DEAE-dextrán [Pagano et al., J. Virol., 1, 891 (1967)], DNS és nukleáris proteinek [Kaneda et al., Science 243, 375 (1989)], DNS és lipidek [Felgner et al., PNAS 84, 7 413 (1987)] komplexeit, illetve liposzómákat [Fraley et al., J. Bioi. Chem., 255, 10 431 (1980)] stb. alkalmaznak. Nemrégen felmerült a vírusok, mint vektorok alkalmazásának lehetősége géntranszfer céljából, mint egy ígéretes alternatíva a fenti fizikai transzfekciós technikákkal szemben. Ebben a tekintetben különböző vírusokat teszteltek azon képességükre, hogy bizonyos sejtpopulációkat fertőznek-e. Különösen a retrovírusokat (RSV; HMS; MMS; stb), a HSV-vírust, az adenoasszociált vírusokat, és az adenovírusokat vizsgálták.
A génterápia alkalmazásának lehetőségét a rák kezelésére már a WO 91/15 580 számon közzétett nemzetközi szabadalmi bejelentésben említették. Ez a bejelentés egy olyan ribozimot kódoló gént tartalmazó retrovírus előállítását hja le, amelynek sejtkultúrában való expressziója lehetővé teszi egy onkogén mRNS-ének elbontását.
A jelen találmány annak a felismerésnek az eredménye, hogy az adenovírusok különösen hatékony vektoroknak minősülnek a tumorok kezelésében használható gének expressziójára és transzferére. Részletesebben, az adenovírusoknak megvan az az előnye, hogy nem integrálódnak a fertőzött sejt genomjába, és hogy igen stabilan fennmaradnak, ami hosszú távú terápiás hatás elérését teszi lehetővé, és hogy igen széles gazdaspektrumuk van, ami lehetővé teszi, hogy bármely típusú sejtet érintő rák kezelésére alkalmazzák. Másrészt a találmány azon a felismerésen is alapul, hogy az adenovírus típusú vírusok képesek átvinni és kifejezni a sejtosztódást legalább részben gátló géneket közvetlenül a tumorok szintjén.
A találmány tárgya tehát egy defektív rekombináns adenovírus, amely egy olyan heterológ DNS-szekvenciát tartalmaz, amelynek expressziója lehetővé teszi legalább részben a sejtosztódás gátlását egy rendellenesen osztódó célsejtben.
A találmány tárgya továbbá egy ilyen deficiens rekombináns adenovírus alkalmazása rákok kezelésére vagy megelőzésére szolgáló gyógyszerkészítmény előállítására.
A jelen bejelentés értelmében a „defektív adenovírus” kifejezés olyan adenovírust jelent, amely nem képes autonóm módon replikálódni a célsejtben. Általában a jelen bejelentés keretein belül alkalmazott defektív adenovírusok genomja tehát hiányos legalább az adott vírusnak a fertőzött sejtben való replikációjához szükséges szekvenciákban. Ezeket a régiókat vagy eliminálhatjuk (részlegesen vagy egészen), vagy működésképtelenné tehetjük, vagy más szekvenciákkal, nevezetesen a beépített génnel helyettesíthetjük. Előnyösen a defektív vírus mindamellett megőrzi azokat a szekvenciákat, amelyek a vírusrészecskék enkapszidációjához szükségesek.
Különböző szerotípusú adenovírusok léteznek, amelyek szerkezete és tulajdonsága kissé eltér. Mindamellett ezek a vírusok nem patogének az emberre, és nem immundepresszánsok. Ezen szerotípusok közül a jelen találmány keretein belül előnyben részesítjük az 5 és 2 típusú adenovírusok (Ad 2 vagy Ad 5) használatát. Az Ad 5 adenovírusok esetében a replikációhoz szükséges szekvenciák az E1A és E1B régiók.
A jelen bejelentés értelmében a heterológ DNSszekvencia, amelynek expressziója legalább részben lehetővé teszi a sejtosztódás gátlását, legalább egy, a következők közül választott gént tartalmaz: tumorszupresszorok (vagy antionkogének) vagy ezek bármely aktív származéka; vagy olyan gének, amelyek expressziós termékei a fertőzött sejt apoptózisát indukálják.
A jelen bejelentésben alkalmazható tumorszupresszor gének közül különösen a következőket említhetjük meg:
p53 gén:
A p53 gén egy 53 kD proteint kódol. E gén deléciós mutáns formája és/vagy más mutációi a legtöbb emberi rák kialakulásában szerepet játszanak [Baker et al., Science 244, 217 (1980)]. Mutáns formái képesek a ras onkogénekkel is együttműködni a patkányfibroblasztok transzformációja esetén. Ezzel ellentétben a natív p53-at kódoló vad gén, gátolja a különböző onkogénkombi2
HU 220 346 Β nációkkal transzfektált rágcsálófíbroblasztokban a transzformációs gócpontok kialakulását. A közelmúlt eredményei megerősítik, hogy a p53 protein maga egy transzkripciós faktor lehet, és más tumorszupresszor gének expresszióját stimulálhatja.
Rb gén:
Az Rb gén egy körülbelül 927 aminosavat tartalmazó nukleáris foszfoprotein szintézisét határozza meg [Friend et al., Natúré 323, 643 (1986)], amelynek funkciója az, hogy a sejtek osztódását megakadályozza azáltal, hogy azokat nyugalmi fázisba viszi át. Az Rb gének inaktív formáit különböző tumorok kialakulásáért tartják felelősnek, többek között a retinoblasztóma vagy a mezenchimás rákok, valamint az oszteoszarkómák esetében. Ha ezen géneket olyan tumoros sejtekbe vezetik be, ahol azok inaktiválva lettek, a sejtek visszatérnek a normális állapotba, és elvesztik tumorigemtásukat [Huang et al., Science 242, 1563 (1988)]. A közelmúltban leírták, hogy az Rb protein normális, nem mutált formái megakadályozzák a c-fos protoonkogén expresszióját, amely gén elengedhetetlenül szükséges a sejtek proliferációjához.
rap 1A gén:
A rap 1A gén (k-revl-nek is nevezik) egy 21 kD proteint kódol, amely a citoplazmamembrán belső felszínéhez kötődik. Ez a protein képes magas szinten revertálni a mutált ras onkogéneket expresszáló transzformáit sejteket [Kitayama et al., Cell 56, 77 (1989)].
DCC gén:
A DCC gén a N-CAM családba tartozó sejtadhéziós proteinekkel homológ proteint kódol. Ez a gén igen gyakran deletált a vastagbél-karcinómákban [Fearon et al., Science 247, 49 (1990)].
Más antitumorális hatású gének is használhatók a jelen találmány keretein belül, többek között az irodalomban leírt tumorszupresszor gének vagy más olyan gének, amelyek expressziós termékei a sejtek apoptózisát indukálhatják.
Amint fentebb jeleztük, a heterológ DNS-szekvencia hordozhatja a natív tumorszupresszor gént vagy annak valamely aktív származékát. Egy ilyen származékot a gén szekvenciájában levő egy vagy több bázispár mutációjával, deléciójával, szubsztitúciójával és/vagy addíciójával kaphatunk a molekuláris biológia klasszikus módszerei szerint. Az így kapott származék aktivitását azután in vitro, a szakember számára ismert tesztekkel igazolhatjuk, például azokkal, amelyeket a példákban leírunk.
A heterológ DNS-szekvencia olyan promoterszekvenciákat is tartalmaz, amelyek lehetővé teszik a sejtosztódást legalább részben gátló gén vagy gének expresszióját a célsejtben. A találmány értelmében az említett géntől eltérő eredetű, azaz heterológ promoterszekvenciákat (más proteinek expressziójáért felelősek, vagy szintetikusak) alkalmazunk. Szó lehet többek között eukarióta vagy virális promoterekről. Például szó lehet a fertőzni kívánt sejt genomjából származó promoterekről. Szó lehet azonkívül egy vírusból származó promoterszekvenciáról, beleértve a használt adenovírust is. Ebben a tekintetben megemlíthetjük például az
E1A, MLP, CMV, RSV stb. gének promotereit. Másrészt, ezeket a promoterszekvenciákat módosíthatjuk aktivációs, regulációs stb. szekvenciák hozzáadásával. Azonfelül amennyiben a heterológ DNS-szekvencia nem tartalmaz expressziós szekvenciákat, beépíthetjük a defektív vírus genomjába, egy ilyen szekvenciától lefelé. Használhatunk indukálható promotereket is.
Másrészt, a találmány egy előnyös megvalósítási módjában a heterológ DNS-szekvencia a tumorszupresszor génen kívül tartalmazhat egy, a tumorra specifikus antitestet kódoló gént és/vagy egy limfokint kódoló gént. E gének kombinációja lehetővé teszi (i) egy tumorban a sejtosztódás gátlását, és ezáltal a tumor regresszióját, és (ii) a szervezet immunválaszának fokozását az említett tumor ellen.
A tumorspecifikus antigének a tumoros sejtek felszínén megjelenő antigenikus elemek, amelyek nem fordulnak elő az ugyanolyan típusú nem tumoros sejtek felszínén. Az ilyen antigéneket általában a rákok diagnózisában használják. Nemrég antitumor vakcinák létrehozására való alkalmazást írtak le [EP 259 212]. De soha nem kombinálták azokat más terápiás génekkel, mint a jelen találmány keretein belül.
A limfokineket kódoló gének közül megemlíthetjük különösen az interleukinokat (IL-1-től IL-13), az interferonokat, a tumomekrózis-faktorokat, a kolóniastimuláló faktorokat (G-CSF, M-CSF, GM-CSF, stb.), a TGFp-t kódoló géneket. Másrészt a limfokint kódoló gén általában tartalmaz a kódolószekvencia felett egy a kiválasztásért felelős szekvenciát és egy szignálszekvenciát, amelyek a szintetizált polipeptidet a célsejt szekréciós útvonalán irányítják. Ez a szignálszekvencia lehet a limfokin természetes szignálszekvenciája, de teljesen más funkcionális vagy mesterséges szignálszekvenciáról is szó lehet. Az ilyen konstrukciók lehetővé teszik a limfokinek mennyiségének lokalizált emelését, és így egy tumorspecifikus antigén jelenlétében egy adott tumortípus elleni immunválasz megsokszorozását, ami egy igen előnyös hatást biztosít. Az ilyen rekombináns adenovírusok különösen antitumor vakcinák előállítására használhatók.
A találmány szerinti defektív rekombináns adenovírusok bármely, a szakemberek számára ismert eljárással előállíthatok [Levrero et al., Gene 101, 195 (1991), EP 185 573; Graham, EMBO I, 3, 2917 (1984)]. Előnyösen homológ rekombinációval állíthatók elő egy adenovírus, és egy, többek között a heterológ DNSszekvenciát is hordozó plazmid között. A homológ rekombináció egy megfelelő sejtvonalnak az említett adenovírussal és plazmiddal való kotranszformációja után következik be. A használt sejtvonalnak előnyösen (i) transzformálhatónak kell lennie az említett elemekkel, és (ii) tartalmaznia kell olyan szekvenciákat, amelyek képesek komplementálni a defektív adenovírus genomjának egy részét, előnyösen integrált formában, a rekombináció veszélyét elkerülendő. Példaként megemlíthetjük a humán 293 embrionális vesesejtvonalat [Graham et al., J. Gén. Virol., 36, 59 (1977)], amely genomjába integrált módon tartalmazza egy Ad5 adenovírus genomjának bal részét (12%).
HU 220 346 Β
Azután az elszaporodott adenovírusokat a molekuláris biológia klasszikus módszerei szerint összegyűjtjük és tisztítjuk, amint azt a példák bemutatják.
A jelen találmány egy vagy több, az előzőekben leírt defektív rekombináns adenovírust tartalmazó gyógyszerkészítményre is vonatkozik. A találmány szerinti gyógyszerkészítmény előnyösen tartalmaz egy gyógyszerészetileg elfogadható hordozót, a kezelendő tumorokhoz való közvetlen injektálhatóság biztosítására. Különösen steril, izotónikus oldatokról vagy szárított, nevezetesen liofilezett készítményekről lehet szó, amelyeket az eset szerint steril víz vagy fiziológiás szérum hozzáadásával alakíthatunk injektálható oldattá. A kezelendő tumorba való közvetlen injektálás előnyös, mivel lehetővé teszi a terápiás hatás koncentrálását az érintett szövetekre.
Az injekcióhoz használt defektív rekombináns adenovírusok dózisát különböző paraméterek, nevezetesen a bevezetés módja, a vonatkozó patológia, a kifejezni kívánt gén, vagy az előírt kezelés időtartama figyelembevételével határozhatjuk meg. Általában a találmány szerinti defektív rekombináns adenovírusokat 104 és 1014 pfú/ml, előnyösen 106 és 1010 pfu/ml közötti dózisban formulázhatjuk és adhatjuk be. A pfu („plaque forming unit”) kifejezés egy vírusoldat fertőzőképességét fejezi ki, és egy megfelelő sejtkultúra fertőzésével, és a fertőzött sejteken keletkezett plakkok általában 48 óra elteltével történő megszámlálásával határozzák meg. Egy virális oldat pfú titerének meghatározási technikái az irodalomban jól dokumentáltak.
A jelen találmány így egy igen hatásos módot nyújt rákok kezelésére vagy megelőzésére. Másrészt ez a kezelés vonatkozhat épp úgy az emberre, mint bármely állatra, mint például a juhra, a szarvasmarhára, a háziállatokra (kutya, macska stb.), a lovakra, a halakra stb.
A találmányt teljesebben leírják az itt következő példák, amelyek csak bemutatják, de nem korlátozzák a találmányt.
Az ábrák leírása
1. ábra: az mp53wtI-.CMV vektor bemutatása
2. ábra: az mp53pIX.CMV vektor bemutatása
A molekuláris biológia általános technikái
A molekuláris biológiában használt klasszikus eljárások, mint például a plazmid-DNS preparatív extrakciója, a plazmid-DNS cézium-klorid-gradiens centrifúgálása, az akrilamid- vagy agaróz-gélelektroforézis, a DNS-fragmentumok elektroelúcióval való tisztítása, a proteinek fenolos vagy fenol-kloroformos extrakciója, a DNS etanolos vagy izopropil-alkoholos kicsapása, az Escherichia coli transzformálása stb., a szakemberek számára jól ismertek, és az irodalom részletesen tárgyalja azokat [Maniatis T. et al., „Molecular Cloning, a Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y., 1982; Ausubel F. M. et al. (eds), „Current Protocolls in Molecular Biology”, John Wiley & Sons, New York, 1987],
A pBR322, pUC plazmidok és az M13 sorozat fágjai a kereskedelemből beszerezhetők (Bethesda Research Laboratories).
A ligálásokhoz a DNS-fragmentumokat agarózvagy akrilamid-gélelektroforézissel méretük szerint elválasztjuk, fenollal vagy fenol-kloroform keverékével extraháljuk, etanollal kicsapjuk, majd a forgalmazó (Biolabs) előírásai szerint T4 DNS ligáz jelenlétében inkubáljuk.
A túllógó 5’-végek betöltését E. coli DNS-polimerázának Klenow-fragmentumával (Biolabs) végezhetjük, a forgalmazó előírásai szerint. A túllógó 3’-végek emésztését T4 DNS-polimeráz jelenlétében végezzük, a gyártó előírásai szerint. A túllógó 5’-végek emésztését SÍ nukleázos kezeléssel végezzük.
A szintetikus oligonukleotidok által irányított in vitro mutagenezist a Taylor és munkatársai [Nucleic Acids Rés. 13, 8 749-8 764 (1985)] által kifejlesztett eljárással, az Amersham által forgalmazott kitet használva végezhetjük.
Az úgynevezett PCR technikával (Polymerasecatalyzed Chain Reaction, polimerázkatalizált láncreakció, Saiki R. K. et al., Science 230, 1 350-1 354 (1985); Mullis K. B. et Falcona F. A., Meth. Enzym., 755, 335-350 (1987)] történő enzimatikus DNSamplifikációt egy „DNA thermal cycler”-t alkalmazva (Perkin Elmer Cetus) végezhetjük, a gyártó előírásai szerint.
A DNS-szekvenciák meghatározását a Sanger és munkatársai által kifejlesztett módszer [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5 463 -5 467 (1977)] szerint végezhetjük, az Amersham által forgalmazott kittel.
Példák
1. példa
A p53 gént a citomegalovírus promoterének kontrollja alatt hordozó mp53wtI-CMV vektor szerkesztése (1. ábra)
Az mp53wtI-CMV eukarióta expressziós vektort a pUC19 plazmidból kiindulva hoztuk létre, a következő elemek inszerciójával:
- egy vírus eredetű promoter régió, amely a citomegalovírus (CMV) korai promoterének felel meg. Ezt a régiót a vektorban az egyedi EcoRI-Sphl restrikciós helyek veszik körül a CMV/pUC kapcsolódásnál, és BamHI helyek a CMV/p53 kapcsolódásnál. A promoterrégió végein levő egyedi restrikciós helyek lehetővé teszik a CMV-régió bármely más promoterrel való helyettesítését, így a vektorok egy második sorozatát kaptuk, amelyekben a p53 gén egy indukálható promoter: a nehézfémekkel (kadmium és cink) indukálható metallotionin-promoter kontrollja alatt áll.
- egy 1173 bp szekvencia, amely az egér p53 proteinjét kódoló cDNS-nek felel meg, vad formájában [Zakut-Houri et al., Natúré 36, 594 (1983)]. Ebben a felépítésben a szupresszor gén cDNS formájában van, azaz az intronok hiányoznak. Ez lehetővé teszi a vektor méretének csökkentését. Másrészt igazolták, hogy az expressziós szint összehasonlítható intronok nélkül vagy intronok jelenlétében.
- az SV40 vírus késői génjeinek poliadenilációs szignáljai, amelyek egy igen hatásos poliadenilációs szignálnak felelnek meg. A poliadenilációs hely alatt két egyedi Sáli és HindlII restrikciós hely helyezkedik
HU 220 346 Β el. Ezek a helyek lehetővé teszik az adeno vírus (Cf E3) pIX régiójának inszercióját.
2. példa
A mp53wtI-CMV vektor in vitro aktivitása
A mp53wtI-CMV vektor működőképességét in vitro, HeLa sejteken végzett átmeneti expresszióval igazoltuk. Ehhez a vektort a sejtekbe transzfekcióval vezettük be, és 40 óra múlva immunfluoreszcenciával és immunprecipitációval mértük a p53 protein mennyiségét. A kapott eredmények azt mutatják, hogy a fertőzött sejtek több mint 50%-a termel jelentős szintű p53 proteint.
3. példa
A mp53pIX.CMV vektor szerkesztése
A p53 gént kifejező rekombináns adenovírusok homológ rekombináció útján való képzésére használt plazmidokat a következő módon állítottuk elő:
Az eukarióta expressziós mp53pIX.CMV vektort az adenovírus-genomból származó pIX szekvenciának a mp53wtI-CMV vektor Sáli és EcoRI helyei közé történő inszerciójával állítottuk elő. A pIX szekvenciát a rekombináns pLTR-pgal pIX plazmidól [Stradford-Perricaudet et al., J. Clin. Invest., 90, 626 (1992)] EcoRV és HindlII enzimekkel való emésztéssel izoláltuk.
Az így kapott expressziós mp53pIX.CMV vektornak (2. ábra) egy egyedi HindlII helye van a pIX inszertum alatt, ami lehetővé teszi a konstrukció linearizálását (CfE4.).
4. példa
A p53 gént a CMV-promoter kontrollja alatt hordozó defektív rekombináns adenovírus szerkesztése
A mp53pIX.CMV vektort linearizáltuk, és egy defektív adenovírus-vektorral kotranszfektáltuk az adenovírus El régiói (ElA és E11B) által kódolt funkciókat transz-helyzetben hordozó helper sejtekbe (293 sejtvonal).
Az Ad.p53 adenovírust a mutáns Ad-dl324 adenovírus [Thimmappaya et al., Cell 31, 543 (1982)] és a mp53pIX.CMV vektor in vivő homológ rekombinációjával kapjuk a következő eljárást követve: a mp53pIX.CMV plazmidot HindlII-mal linearizáltuk, majd a dl324 adenovírussal kalcium-foszfát jelenlétében kotranszformáltuk a 293 sejtvonalba, amely lehetővé tette a homológ rekombinációt. Az így generált rekombináns adenovírusokat plakktisztítással szelektáltuk. Izolálás után a rekombináns adenovírus DNS-ét 293 sejtvonalban amplifikáltuk, amely olyan felülúszóhoz vezetett, amely körülbelül 1010 pfu/ml titerű nem tisztított defektív rekombináns adenovírust tartalmazott.
Ezután a vírusrészecskéket cézium-klorid gradienscentrifugálással tisztítottuk az ismert technikák szerint [lásd nevezetesen Graham et al., Virology 52, 456 (1973)]. Az Adp53 adenovírust -80C°-on 20% glicerinben konzerválhatjuk.
Azt, hogy az Ad-p53 adenovírus képes kultúrákban a sejteket fertőzni, és a vad p53-at biológiailag aktív formában kiválasztani a tápközegbe, humán 293 sejtvonal sejtjeinek fertőzésével igazoltuk. A p53 jelenlétét a felülúszóban p53 specifikus monoklonális antitesttel mutattuk ki.
Ezek a vizsgálatok bebizonyították, hogy az adenovírus valóban a p53 egy biológiailag aktív formáját fejezi ki.

Claims (14)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Defektív rekombináns adenovírus, amely tartalmaz egy heterológ DNS-szekvenciát, melynek expressziója egy rendellenesen osztódó célsejtben legalább részlegesen lehetővé teszi a sejtosztódás gátlását, és amelynek genomjából hiányoznak a célsejtben történő replikációhoz szükséges régiók, ahol az említett DNSszekvencia tartalmaz
    - legalább egy intracelluláris fehérjét kódoló tumorszupresszor gént, melynek expressziója a célsejtben lehetővé teszi a sejtproliferáció gátlását, vagy egy olyan gént, melynek expressziós terméke a fertőzött sejt apoptózisát indukálja; és
    - egy, a fertőzött sejtben az említett gén expresszióját biztosító promoterszekvenciát, amely az említett géntől eltérő eredetű.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti defektív rekombináns adenovírus, amelyben a heterológ DNS-szekvencia vad típusú p53 fehéijét kódoló szekvenciát tartalmaz tumorszupresszor génként.
  3. 3. A 2. igénypont szerinti defektív rekombináns adenovírus, amelyben a heterológ DNS-szekvencia a vad típusú p53 proteint kódoló szekvenciát a citomegalovírus korai promoterkontrollja alatt tartalmazza.
  4. 4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti defektív rekombináns adenovírus, amely egy Ad5 típusú adenovírus.
  5. 5. Az 1. igénypont szerinti defektív rekombináns adenovírus, amelyben a heterológ DNS-szekvencia egy olyan gént tartalmaz, melynek expressziós terméke a célsejt apoptózisát indukálja.
  6. 6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti rekombináns adenovírus, amelyben a heterológ DNS-szekvencia egy tumorspecifikus antigént kódoló gént és/vagy egy limfokint kódoló gént is tartalmaz.
  7. 7. Egy, az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti defektív rekombináns adenovírus alkalmazása rák kezelésére és/vagy megelőzésére szolgáló gyógyszerkészítmény előállítására.
  8. 8. A 7. igénypont szerinti alkalmazás, melyben egy
    2. igénypont szerinti defektív rekombináns adenovírust p53 fehérje mutáns formájának jelenlétéhez társult rákok kezelésére és/vagy megelőzésére szolgáló gyógyszerkészítmény előállítására alkalmazunk.
  9. 9. A 7. vagy 8. igénypont szerinti alkalmazás egy, a kezelendő tumorba közvetlenül bevezetendő gyógyszerkészítmény előállítására.
  10. 10. A 7. igénypont szerinti alkalmazás egy tumor elleni vakcina előállítására.
  11. 11. Gyógyszerkészítmény, amely egy vagy több, az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti defektív rekom5
    HU 220 346 Β bináns adenovírust tartalmaz gyógyszerészetileg elfogadható hordozóval együtt.
  12. 12. A 11. igénypont szerinti gyógyszerkészítmény, amely injektálható formában van.
  13. 13. A 11. vagy 12. igénypont szerinti gyógyszerké- 5 szítmény, amely a defektív rekombináns adenovírust
    104 és 1014 pfu/ml, előnyösen 106 és 1010 pfu/ml közötti mennyiségben tartalmazza.
  14. 14. Egy 2. igénypont szerinti defektív rekombináns adenovírus alkalmazása sejtes apoptózis előidézésére szolgáló gyógyszerkészítmény előállítására.
HU9503035A 1993-04-22 1994-04-15 Defektív rekombináns adenovírusok és alkalmazásuk a génterápiában rák kezelésére HU220346B (hu)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR9304745A FR2704234B1 (fr) 1993-04-22 1993-04-22 Virus recombinants, preparation et utilisation en therapie genique.
PCT/FR1994/000421 WO1994024297A1 (fr) 1993-04-22 1994-04-15 Adenovirus recombinants defectifs pour la therapie genique des tumeurs

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HU9503035D0 HU9503035D0 (en) 1995-12-28
HUT73464A HUT73464A (en) 1996-08-28
HU220346B true HU220346B (hu) 2001-12-28

Family

ID=9446321

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9503035A HU220346B (hu) 1993-04-22 1994-04-15 Defektív rekombináns adenovírusok és alkalmazásuk a génterápiában rák kezelésére

Country Status (15)

Country Link
EP (2) EP1652931A3 (hu)
JP (1) JPH08508879A (hu)
AT (1) ATE332386T1 (hu)
AU (1) AU696245B2 (hu)
DE (1) DE69434781T2 (hu)
DK (1) DK0695360T3 (hu)
ES (1) ES2264123T3 (hu)
FI (1) FI118011B (hu)
FR (1) FR2704234B1 (hu)
HU (1) HU220346B (hu)
NO (1) NO321454B1 (hu)
NZ (1) NZ265306A (hu)
PT (1) PT695360E (hu)
WO (1) WO1994024297A1 (hu)
ZA (1) ZA942778B (hu)

Families Citing this family (36)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0575518A1 (en) 1991-03-06 1993-12-29 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for the selective inhibition of gene expression
US6410010B1 (en) * 1992-10-13 2002-06-25 Board Of Regents, The University Of Texas System Recombinant P53 adenovirus compositions
US5747469A (en) * 1991-03-06 1998-05-05 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions comprising DNA damaging agents and p53
FR2717496B1 (fr) * 1994-03-18 1996-04-12 Rhone Poulenc Rorer Sa Virus recombinants, préparation et utilisation en thérapie génique.
FR2705686B1 (fr) * 1993-05-28 1995-08-18 Transgene Sa Nouveaux adénovirus défectifs et lignées de complémentation correspondantes.
US6682728B1 (en) * 1993-10-13 2004-01-27 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Efficient and selective adenoviral-mediated gene transfer into vascular neointima
ES2256842T4 (es) * 1993-10-25 2007-02-01 Canji, Inc. Vector de adenovirus recombinante y metodos de uso.
US6210939B1 (en) 1993-10-25 2001-04-03 Canji, Inc. Recombinant adenoviral vector and methods of use
TW442569B (en) * 1993-10-25 2001-06-23 Canji Inc Recombinant adenoviral vector
FR2717495B1 (fr) * 1994-03-18 1996-04-12 Rhone Poulenc Rorer Sa Virus recombinants, préparation et utilisation en thérapie génique.
FR2717497B1 (fr) * 1994-03-18 1996-04-12 Rhone Poulenc Rorer Sa Virus recombinants, préparation et utilisation en thérapie génique.
US7252989B1 (en) 1994-04-04 2007-08-07 Board Of Regents, The University Of Texas System Adenovirus supervector system
EP1548118A2 (en) 1994-06-10 2005-06-29 Genvec, Inc. Complementary adenoviral vector systems and cell lines
FR2725213B1 (fr) * 1994-10-04 1996-11-08 Rhone Poulenc Rorer Sa Vecteurs viraux et utilisation en therapie genique
FR2726285B1 (fr) * 1994-10-28 1996-11-29 Centre Nat Rech Scient Adenovirus depourvus de particules contaminantes viables, preparation et utilisation
US6015665A (en) * 1995-02-13 2000-01-18 The Regents Of The University Of Michigan Method and composition for regulating apoptosis
US6060238A (en) * 1995-02-13 2000-05-09 The Regents Of The University Of Michigan Method and composition for regulating apoptosis
US7097972B1 (en) 1995-02-13 2006-08-29 Regents Of The University Of Michigan Method and composition for regulating apoptosis
US5637456A (en) * 1995-02-17 1997-06-10 The University Of Texas, Board Of Regents Rapid test for determining the amount of functionally inactive gene in a gene therapy vector preparation
WO1996025507A2 (en) * 1995-02-17 1996-08-22 The Government Of The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Methods of preparation and use of recombinant adenoviral vectors
FR2730637B1 (fr) 1995-02-17 1997-03-28 Rhone Poulenc Rorer Sa Composition pharmaceutique contenant des acides nucleiques, et ses utilisations
US5707618A (en) * 1995-03-24 1998-01-13 Genzyme Corporation Adenovirus vectors for gene therapy
US7807783B1 (en) 1995-04-03 2010-10-05 The Regents Of The University Of Michigan Methods and compositions for regulating FAS-associated apoptosis
US6747138B1 (en) 1995-04-03 2004-06-08 Regents Of The University Of Michigan Methods and compositions for regulating Fas-associated apoptosis
DE69638058D1 (de) 1995-06-15 2009-11-26 Crucell Holland Bv Verpackungssysteme für humane rekombinante Adenoviren zur Gentherapie
US6783980B2 (en) 1995-06-15 2004-08-31 Crucell Holland B.V. Packaging systems for human recombinant adenovirus to be used in gene therapy
US6482803B1 (en) 1995-09-01 2002-11-19 Board Of Regents, The University Of Texas System Modification of mutated P53 gene in tumors by retroviral delivery of ribozyme A
US7087582B1 (en) 1995-09-26 2006-08-08 Regents Of The University Of Michigan Combination for site-specifically transforming cells in vivo comprising a double-balloon catheter and nucleic acid comprising a gene encoding P21
US6054467A (en) * 1996-07-05 2000-04-25 Sidney Kimmel Cancer Center Down-regulation of DNA repair to enhance sensitivity to P53-mediated apoptosis
US5958892A (en) 1996-07-30 1999-09-28 Board Of Regents, The University Of Texas System 2-methoxyestradiol-induced apoptosis in cancer cells
US6696423B1 (en) 1997-08-29 2004-02-24 Biogen, Inc. Methods and compositions for therapies using genes encoding secreted proteins such as interferon-beta
US6113913A (en) 1998-06-26 2000-09-05 Genvec, Inc. Recombinant adenovirus
FR2790484B1 (fr) 1999-03-01 2003-01-03 Michel Marcel Andre Loiselet Petrins malaxeurs fermenteurs, dotes de dispositifs novateurs en la matiere, pour le petrissage des pates visco-elastiques et la production de levain pateux
FR2829136B1 (fr) 2001-08-29 2006-11-17 Aventis Pharma Sa Derives lipidiques d'aminoglycosides
US20030158112A1 (en) 2002-02-15 2003-08-21 Johns Hopkins University School Of Medicine Selective induction of apoptosis to treat ocular disease
EP2331071A1 (en) 2008-09-05 2011-06-15 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale Novel multimodular assembly useful for intracellular delivery

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE69233013T2 (de) * 1991-08-20 2004-03-04 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of National Institute Of Health, Office Of Technology Transfer Adenovirus vermittelter gentransfer in den gastrointestinaltrakt
FR2688514A1 (fr) * 1992-03-16 1993-09-17 Centre Nat Rech Scient Adenovirus recombinants defectifs exprimant des cytokines et medicaments antitumoraux les contenant.
GB9223084D0 (en) * 1992-11-04 1992-12-16 Imp Cancer Res Tech Compounds to target cells

Also Published As

Publication number Publication date
EP1652931A3 (fr) 2006-05-17
NO954132D0 (no) 1995-10-17
NO954132L (no) 1995-10-17
ES2264123T3 (es) 2006-12-16
JPH08508879A (ja) 1996-09-24
DK0695360T3 (da) 2006-11-13
EP0695360B1 (fr) 2006-07-05
DE69434781T2 (de) 2007-06-14
HUT73464A (en) 1996-08-28
WO1994024297A1 (fr) 1994-10-27
HU9503035D0 (en) 1995-12-28
DE69434781D1 (de) 2006-08-17
FI954966A (fi) 1995-10-18
AU696245B2 (en) 1998-09-03
AU6572194A (en) 1994-11-08
FI954966A0 (fi) 1995-10-18
FR2704234A1 (fr) 1994-10-28
FI118011B (fi) 2007-05-31
PT695360E (pt) 2006-09-29
NO321454B1 (no) 2006-05-15
ZA942778B (en) 1995-01-09
EP1652931A2 (fr) 2006-05-03
ATE332386T1 (de) 2006-07-15
NZ265306A (en) 1997-10-24
EP0695360A1 (fr) 1996-02-07
FR2704234B1 (fr) 1995-07-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU220346B (hu) Defektív rekombináns adenovírusok és alkalmazásuk a génterápiában rák kezelésére
JP3816952B2 (ja) 治療遺伝子と免疫保護遺伝子とを含む欠陥アデノウイルス
KR100356615B1 (ko) 결함아데노바이러스벡터및유전자치료에서그의사용
JP3995259B2 (ja) 動物起源のアデノウイルスベクターおよび遺伝子治療におけるそれらの使用
WO1995014102A1 (fr) Adenovirus recombinants codant pour la thymidine kinase lors de therapie genique
AU699867B2 (en) Recombinant adenoviruses for gene therapy in cancers
JP2009072205A (ja) 高キャパシティーアデノウイルスベクターの開発の促進に使用するためのパッケージング細胞系
US5831062A (en) Use of the human interferon consensus gene for gene therapy
JP7074864B2 (ja) 組換えワクシニアウイルスおよびそれを含む医薬組成物
AU714867B2 (en) Adenovirus-derived viral vectors having two therapeutic genes: suicide and immunopotentiating
KR20030032841A (ko) 개선된 질환 치료 효과를 갖는 재조합 아데노바이러스 및그를 포함하는 약제학적 조성물
WO2008074189A1 (fr) Adénovirus recombinant comprenant un gène khp50 recombinant et son procédé de préparation et ses utilisations
MXPA97002078A (en) Adenovirus that comprise two therapeutic genes: suicide and immunoestimula
CA2158869C (fr) Virus recombinants, preparation et utilisation en therapie genique

Legal Events

Date Code Title Description
FH91 Appointment of a representative

Free format text: FORMER REPRESENTATIVE(S): BELICZAY LASZLO, S.B.G. & K. BUDAPESTI NEMZETKOEZI SZABADALMI IRODA, HU

Representative=s name: DANUBIA SZABADALMI ES JOGI IRODA KFT., HU

FH92 Termination of representative

Representative=s name: BELICZAY LASZLO, S.B.G. & K. BUDAPESTI NEMZETK, HU