HU219339B

HU219339B - Dermatan sulphate with low heparin or heparane sulphate content and pharmaceutical compositions comprising them

Info

Publication number: HU219339B
Application number: HU9501542A
Authority: HU
Inventors: Mikio Arai; Mamoru Kyogashima; Satoshi Miyauchi; Junichi Onaya; Akikazu Takada; Keiichi Yoshida
Original assignee: Seikagaku Kogyo Co Ltd
Priority date: 1993-09-30
Filing date: 1994-09-30
Publication date: 2001-03-28
Also published as: EP1125977A1; EP0671414A4; DE69429576T2; PL309218A1; NO952137D0; EP0671414B1; FI952593A0; AU7708594A; JP3813169B2; EP0671414A1; WO1995009188A1; ES2173124T3; CN1115182A; AU699371B2; SG67928A1; HU9501542D0; US5801162A; CA2150552C; DE69429576D1; NO952137L

Abstract

A találmány alacsony heparin- vagy heparán-szulfát-tartalmú dermatán-szulfátokra és sóikra vonatkozik, amelyeknek belső viszkozitása 0,8dl/g vagy e feletti, és heparin- vagy heparán-szulfát-tartalma a)0,15% vagy kevesebb, a heparin vagy heparán-szulfát enzimatikuslebontásával és nagynyomású folyadékkromatográfiás eljárássalmeghatározva, vagy b) 0,07% vagy kevesebb az aktív faktor Xantitrombin III jelenlétében való gátlásával meghatározva, amelyhezstandardként marhabélből származó heparint használnak, vagy c) 0,05%vagy kevesebb az aktív faktor II antitrombin III jelenlétében valógátlásával meghatározva, amelyhez standardként marhabélből származóheparint használnak. Ezek a készítmények trombózisellenes szerekhatóanyagaként alkalmazhatók. ŕ

Description

A találmány alacsony heparin- vagy heparán-szulfáttartalmú dermatán-szulfátokra és sóikra, továbbá ezeket tartalmazó gyógyszerkészítményekre vonatkozik.

A találmány szerinti készítmények trombózisellenes szerekként alkalmazhatók, amelyek megelőzik a trombusok kiterjedését, és stimulálják azok lízisét.

A trombózist az élő vérerekben a vérlemezkék, a koaguláció és a fibrinolitikus rendszer egyensúlyának felbomlása következtében létrejött vérkoaguláció okozza, amely rendszernek alapvetően fenn kellene tartania a vérerekben a vér folyékonyságát. A trombusok a szívkoszorú-verőerekben miokardiális infarktust, a vénás erekben az alsó végtagokban és így tovább mély phlebothrombosist okoznak. A koagulációs rendszer súlyos fertőzéses betegségek vagy daganatok miatt bekövetkező abnormális aktivációja a szisztémás kapilláris vérerekben vezet rögök képződéséhez, és elszórt intravaszkuláris koagulációs szindrómát (disseminated intravascular coagulation, a továbbiakban DIC-t) eredményez. A súlyos fertőzéses betegségek által okozott DIC gyakran többszörös szervi elégtelenséggel és nagyon rossz prognózissal komplikálódik. Különféle ellenintézkedéseket fejlesztettek ki a trombózis kezelésére, amely a fellépés helyétől függően igen különböző tüneteket mutat. Urokináz szövetplazminogén-aktivátort (a továbbiakban t-PA) vagy heparint és másokat használtak a miokardiális infarktus és mély vénás trombózis kezelésére, és a heparint DIC kezelésére is alkalmazták. Azonban az urokináz hátránya, hogy a fibrinhez kicsi az affinitása, és a t-PA drága, és nagyon rövid a felezési ideje. Emellett a perkután transzluminális koszorúér-rekanalizáció és a t-PA közvetlen perifériás intravénás adagolásával végzett reperfuziós terápia valószínűleg a trombózis ismételt fellépését okozza. A heparinnal az a gond, hogy az antitrombin III meghatározott koncentrációjánál vagy a felett biztosítani kell azt, hogy kifejthesse a kívánt gyógyászati hatást. Továbbá ezen gyógyszerek komolyan káros hatása, hogy vérzést okoznak, így szintetikus proteázellenes szereket fejlesztettek ki a problémák megszüntetésére. Azonban a káros hatással kapcsolatban nem kaptak kielégítő eredményt és a problémák, így a különösen rövid felezési idő, megoldatlanok maradtak.

A Merck Index 11. kiadása a dermatán-szulfátokkal kapcsolatban ismerteti, hogy azok a lágy kötőszövetek, a bőr, az érfalak és a véredények alkotórészei, továbbá hogy azokkal arterioszklerózisos betegeken klinikai vizsgálatok folynak.

A dermatán-szulfátokról azt közölték továbbá, hogy a heparin kofaktor Π-n keresztül antikoaguláns hatást fejtenek ki, de a fibrinolitikus hatásukról azt írták, hogy a t-PA felszabadulását gyorsítják (Abbadini M. és munkatársai, Blood, 1987, 70, 1858-1860), míg Tripodi A. és munkatársai (Thromb. Rés., 1991, 62, 663-672) arról számoltak be, hogy a dermatán-szulfátoknak a t-PA mennyiségére vagy fibrinolitikus aktivitására nincs hatása, és a fibrinolitikus rendszerre gyakorolt kifejezett hatás tisztázatlan.

A dermatán-szulfátok, amelyeket különféle kísérletekben alkalmaztak, vagy amelyek gyógyszerré való fejlesztés alatt állnak, sertés- vagy marhabéiból vagy -bőrből származnak (Fareed J. és munkatársai, Recent Advances in Blood Coagulation, 1993, 6, 169-187). Más eredetű dermatán-szulfátok hatása nem volt ismert.

A jelen találmány feltalálói dermatán-szulfátoknak a fibrinolitikus rendszerre gyakorolt hatását vizsgálták, és azt találták, hogy a távollétükben vizsgált állapotokhoz képest jelenlétükben a trombolitikus aktivitás fokozódik. Emellett a feltalálók azt is megállapították, hogy az élő testbe beadott dermatán-szulfátok kumulált trombolitikus hatása, amely koagulációellenes és fibrinolitikus hatásból tevődik össze, különösen szignifikáns olyan speciális dermatán-szulfátok esetében, amelyek belső viszkozitása 0,8 dl/g vagy e feletti, 0,15% vagy kevesebb heparint vagy heparán-szulfátot tartalmaznak, a heparin vagy heparán-szulfát enzimatikus lebontásával és nagy teljesítményű folyadékkromatográfiás eljárással meghatározva, 0,07% vagy kevesebb heparint vagy heparán-szulfátot tartalmaznak az aktív faktor X antitrombin III jelenlétében való gátlásával meghatározva, amelyhez standardként marhabélből származó heparint használunk, vagy 0,05% vagy kevesebb heparint vagy heparán-szulfátot tartalmaznak az aktív faktor II antitrombin III jelenlétében való gátlásával meghatározva, amelyhez standardként marhabélből származó heparint használunk; különösen olyan speciális dermatán-szulfátok esetében, amelyek taréjból származnak (a taréj a jelen leírásban mind a kakastaréjt, mind a csirketaréjt magában foglalja), valamint olyan speciális dermatán-szulfátok esetében, amelyekben az alkotó diszacharidokban a ADi-OS (lásd a 2. táblázatot) értéke 2-7%, vagy olyan speciális dermatán-szulfátok esetében, amelyek átlagos molekulatömege 25 000-100 000 D a későbbiekben leírt módszerrel meghatározva. A találmány a fentebb említett felismerésen alapul.

A jelen találmány trombózisellenes szene, amely a fenti dermatán-szulfátok hatásos mennyiségét tartalmazza, vagy dermatán-szulfátok és szövetplazminogén-aktivátor (t-PA) kombinált alkalmazására vonatkozik.

A dermatán-szulfátok fő szerkezete ismétlődő diszacharidból áll, amelyet N-acetil-D-galaktoz-amin-4szulfát és L-iduronsav alkot, illetve kis mennyiségben előfordul D-glükuronsav is; attól függően, hogy milyen állatból és szervből stb. származik a dermatán-szulfát, különféle mennyiségű kénsavat és D-glükuronsavat foglal magában, és a kénsav kötődési helye is különböző lehet.

A dermatán-szulfátok általában emlősből származó nyersanyagokból, így marha- vagy sertésbél-nyálkahártyából, vagy bőrből vagy taréjból állíthatók elő.

A jelen feltalálók azt találták, hogy egy- vagy kétláncú t-Pa plazminogén aktiválása ezekből a nyersanyagokból előállított dermatán-szulfátok vagy gyógyászatilag elfogadható sóik jelenlétében fokozható a távollétükben vizsgált esethez képest. A jelen feltalálók azt is megállapították, hogy a jelen találmány szerinti speciális dermatán-szulfátok, amelyek belső viszkozitása 0,8 dl/g vagy e feletti, előnyösen 0,9-2,0 dl/g, és amelyek taréjból származnak, az őket felépítő diszacharidban a ADi-OS

HU 219 339 Β

2-7%, előnyösen 3-6%, és átlagos molekulatömegük 25 000-100 000, előnyösen 30 000-60 000 D, a későbbiekben ismertetett, a Biochim. Biophys. Acta 1117, 60-70 (1992) irodalmi helyen leírt gélszűréssel meghatározva, különösen azok, amelyek nagyon kevés heparint vagy heparán-szulfátot tartalmaznak, vagy gyógyászatilag elfogadható sóik élő testbe adagolva a vérben hosszabb ideig tarthatók fenn, mint más dermatán-szulfátok, és teljesen felhasználható trombózisellenes hatást fejtenek ki, amely nemcsak fibrinolitikus hatást, hanem antikoaguláns hatást is magában foglal. A találmány ezen felismeréseken alapul.

A dermatán-szulfátok gyógyászatilag elfogadható sói többek között a nátrium-, kálium-, lítium- és kalciumsók, de általában a nátriumsót adjuk be. A jelen találmányhoz használt szövetplazminogén-aktivátorok lehetnek endogének és exogének, egy- vagy kétláncúak, természetes és génrekombináns termékek. Továbbá az olyan t-PA analógok, amelyek az aminosav-összetételben részben hibásak vagy több aminosavat tartalmaznak, szintén használhatók, amennyiben plazminogénaktiváló tulajdonságúak (lásd EP-A 112122).

A dermatán-szulfátok vagy gyógyászatilag elfogadható sóik (a későbbiekben DS) megfelelően fejtik ki hatásukat egyszeri és egyedüli vagy egyszeri vagy ismétlődő beadás esetén. A dermatán-szulfátokat intravénásán, intraartériásan vagy koszorúérbe adott injekció formájában adagolhatjuk, és szubkután vagy intramuszkulárisan is alkalmazhatjuk. A DS és t-PA beadható egyidejűleg ugyanolyan módon vagy külön is.

Amikor a DS és t-PA vérkoncentrációja várhatóan meghaladja a fentebb említett, koszorúérbe történő vagy intravénás adagolás esetén hatásos koncentrációt, akkor intramuszkuláris vagy szubkután adagolás alkalmazható a fentebb említett módok helyett.

A dermatán-szulfátokból alkalmasan a szokásos gyógyászatilag elfogadható adjuvánsokkal, így stabilizátorokkal, emulgeálószerekkel, ozmózisnyomást csökkentő anyagokkal, pH-t beállító szerekkel és hasonlókkal állíthatunk elő gyógyászati készítményeket.

A DS-ot egyedül 50-3000 mg/nap összdózisban adjuk be egy felnőtt betegnek, és egyidejűleg 10 000-500 000 IU (nemzetközi egység) t-PA-t is adagolhatunk. Ezeket a hatóanyagokat egyszerre vagy két vagy több részre osztva, megfelelő időközönként, egy nap alatt is beadhatjuk. A DS-ot intravénásán is adagolhatjuk egymást követő több napon át.

Mint fentebb megmutattuk, a DS vagy gyógyászatilag elfogadható sói hasznos trombolitikus gyorsítóként fibrinolitikus hatás aktiválására használhatók. Különösen a jelen találmány szerinti specifikus DS, amelyre jellemző a 0,8-2,0 dl/g belső viszkozitás, taréjból származik, az alkotó diszacharidban a ADi-OS 2-7%, vagy átlagos molekulatömege 25 000-100 000 D a később leírt módszerrel meghatározva, különösen azok, amelyeknek kicsi a heparin- vagy heparán-szulfát-tartalma, vagy gyógyászatilag elfogadható sói jelentős hatást fejtenek ki. Ugyanakkor azok, amelyeknek a belső viszkozitása 2,0 dl/g feletti vagy átlagos molekulatömege 100 000 D feletti, megemelkedett viszkozitást mutatnak nagy koncentrációjú oldatokban, és nem ajánlatosak, mivel zavarják a vér folyási sebességét. Továbbá a fentebb leírt DS vagy gyógyászatilag elfogadható sói és t-PA egyidejű adagolása jelentősen növeli a trombolitikus aktivitást, és értékes trombolitikus szerként csökkenheti a t-PA-nak a trombózis kezeléséhez és megelőzéséhez szükséges dózisát.

A fentebb említett, találmány szerinti speciális DS vagy gyógyászatilag elfogadható sói élő testbe adagolva a hatásos vérkoncentrációt hosszabb ideig tartják fenn, mint más dermatán-szulfátok vagy azok gyógyászatilag elfogadható sói, és megakadályozzák a trombus növekedését, és gátolják a trombogenezist vagy stimulálják a trombolízist. Ezért a jelen találmány szerinti trombózisellenes szerek miokardiális infarktus, szétszórt intravaszkuláris koagulációs (DIC) szindróma, több szervnél fellépő elégtelenségek, amelyeket többszörös trombózis kísér, mélyvénás trombózis és mások kezelésére és megelőzésére alkalmasak. Ezeket a hatásokat nemcsak a fenti betegségek esetében, hanem minden típusú trombus esetében megfigyelhetjük, és azok kezelésére és megelőzésére használhatjuk ütőerekben, kapillárisokban és vénákban. Továbbá a találmány szerinti speciális DS vagy gyógyászatilag elfogadható sói vérrögképződés megelőzésére is használhatók testen kívül keringetett vérben, például vesebetegségben szenvedők hemodialízise során.

A dermatán-szulfátot szennyező heparint (Hep) vagy heparán-szulfátot (HS) eltávolíthatjuk, ekkor heparinmentes vagy heparin-szulfát-mentes dermatánszulfátot [DS-H(-)-t] kapunk, amely a káros reakciók, így a vérzés fellépését csökkenti. Különösen a csökkent vérlemezkeszám és koagulációs faktorok következtében vérzékeny betegek esetében csökkenti a káros reakciók, így a vérzés fellépését, és ezért használata különösen biztonságos.

A rajzok rövid ismertetése

1. ábra: a taréjból származó (lásd az 1. referenciapéldát, RCDS) és marhavékonybélből származó (lásd a 2. referenciapéldát, BIDS) nátrium-dermatánszulfátok vérkoncentrációjának változását mutatja patkányban (lásd az 1. példát);

• mutatja a BIDS adagolását, O mutatja az RCDS adagolását, A mutatja a BIDS-H(-) adagolását, Π mutatja az RCDS-H(-) adagolását és χ jelzi a ·, O, A és Π átfedését; a

2. ábra: azt mutatja, milyen mértékben stimulálja a BIDS az egyláncú szövetplazminogén-aktivátomak (sc-tPA) a plazminogént aktiváló hatását; a

3. ábra: azt mutatja, hogy a BIDS milyen mértékben stimulálja a kétláncú szövetplazminogén-aktivátomak (tc-tPA) a plazminogént aktiváló hatását; a

4. ábra: azt mutatja, hogy az RCDS milyen mértékben stimulálja az egyláncú szövetplazminogén-aktivátomak (sc-tPA) a plazminogént aktiváló hatását; az

5. ábra: azt mutatja, hogy az RCDS milyen mértékben stimulálja a kétláncú szövetplazminogén-aktivátornak (tc-tPA) a plazminogént aktiváló hatását; a

6. ábra: a BIDS-nak a humán plazmarög lízisére kifejtett stimuláló hatását mutatja.

HU 219 339 Β

Az ábrákon a T-szerű jel minden esetben a standard hibát mutatja.

A jelen találmányt gyakorlati szempontból a következő referenciapéldákkal és példákkal szemléltetjük.

7. referenciapélda (1) DS előállítása kakastaréjból

Egy kg kakastaréjt felaprítunk, forró vízben forralunk, és 5 g Pronase-zal (Kaken Pharmaceutical Co., Ltd., kereskedelmi név) 50 °C-on 12 órán átemésztünk. Az emésztett keveréket diatómaföldön át szűrjük, és a szűrletet pH-jának 5,8-6,3 értékre állítása után 1000 TRU Streptomyces mikroorganizmusokból származó hialuronidázzal (Seikagaku Corp.) 40 °C-on 3 órán át emésztjük. Az emésztett keveréket nátriumkloriddal 0,65 mólosra állítjuk, és 3x20 cm-es (Diaion^R™ HPA-10, Mitsubishi Kaséi Corp.) anioncserélő oszlopra visszük, amelyet 0,5 mólos nátriumklorid-oldattal hoztunk egyensúlyba. Az oszlopot egymást követően 0,5 liter 0,65 mólos nátrium-klorid-oldattal és 0,3 liter 1,1 mólos nátrium-klorid-oldattal mossuk, majd 1,8 mólos nátrium-klorid-oldattal eluáljuk. Az eluátumot frakciókban gyűjtjük és csökkentett nyomáson bepároljuk. Az egyesített bepárolt frakciókat 1 éjszakán át desztillált vízzel szemben dializáljuk. A dializátumot 10 ml-re bepároljuk és 5 mólos nátrium-hidroxid-oldattal elegyítjük, így 0,5 mólos nátrium-hidroxid-oldatot kapunk. Az alkalikus oldatot 90 percig 37 °C-on tartjuk, majd hűtjük és jégecettel semlegesítjük. A semlegesített oldatot kétszeres térfogat etanollal elegyítjük. A képződött csapadékot egymást követően 70%-os etanollal, tiszta etanollal és dietil-éterrel mossuk, és foszfor-pentoxid felett csökkentett nyomáson szárítjuk.

125 ml vízben 5 g szárított csapadékot hagyunk állni 1 éjszakán át, és a kis mennyiségű oldatlan csapadékot 10 °C-on, 10 000 fordulatszám mellett, 15 percen át végzett centrifugálással elkülönítjük. A felülúszót 125 ml 10%-os vizes nátrium-acetát-oldattal hígítjuk, majd etanollal elegyítjük jégfürdőben hűtve, így 45%-os végkoncentrációt kapunk, és az elegyet 4 °C-on 20 órán át hagyjuk állni. A centrifugált csapadékot egymást követően 90%-os etanollal, tiszta etanollal és dietil-éterrel mossuk, csökkentett nyomáson foszfor-pentoxid felett szárítjuk, így tiszta DS-nátriumsót (a következőkben RCDS-ot) kapunk.

A dermatán-szulfátokat a kakastaréjból nemcsak a fentebb bemutatott, hanem más, a 9042 (1985) és 21241 (1986) számú, közzétett, vizsgált, japán szabadalmi bejelentésekben leírt eljárásokkal is elkülöníthetjük és tisztíthatjuk.

(2) Heparin (Hep) és heparán-szulfát (HS) eltávolítása dermatán-szulfátból

A DS-ot szennyező kis mennyiségű heparint és heparán-szulfátot a következő eljárások egyikével távolíthatjuk el.

1. Ioncserés kromatográfiás eljárás

Az előző (1) eljárással kapott 50 g RCDS-ot Diaion^R™ ΗΡΑ-11 (Mitsubishi Kasé Corp.) anioncserélő gyantából készült, előzőleg 1,1 mólos nátriumklorid-oldattal egyensúlyba hozott 4,5x27 cm-es oszlopra viszünk fel, majd az oszlopot 8 liter 1,1 mólos nátrium-klorid-oldattal mossuk, és 8 liter 1,5 mólos nátrium-klorid-oldattal eluáljuk. Az egyesített eluátumot forgó készülékben bepároljuk, dializáljuk, és etanol hozzáadásával (ami elérheti a 42%-ot) kicsapjuk vagy liofilizáljuk, így standard RCDS-ot [RCDS-H(-)-t] kapunk, amely heparintól és heparán-szulfáttól mentes.

2. Salétromsavas hasítási eljárás

A hasítást Shively és Conrad (Biochemistry, 75, 3932-3942, 1976) szerint végezzük a következőképpen. 400 ml 0,124 g/ml koncentrációjú bárium-nitrit-monohidrát-oldat és 400 ml 1 n kénsav elegyét -10 °C-on 3000 fordulatszám mellett 2 percig centrifugáljuk, így 500 ml felülúszót kapunk. 500 ml 0,1 mg/ml koncentrációjú RCDS-oldathoz 500 ml fenti felülúszót adunk, és az elegyet 10 percig szobahőmérsékleten hagyjuk állni, majd nátrium-karbonát-oldattal semlegesítjük. A bepárlás után az 1. alatti eljárásban leírt műveleteket végezzük el, így standard RCDS-ot [RCDS-H(-)-t] kapunk, amely heparintól és heparánszulfáttól mentes.

2. referenciapélda

DS előállítása marhavékonybél-nyálkahártyából kg marhavékonybelet a feces és zsír eltávolítása után darabokra vágunk. Ezután a nyálkahártyát elkülönítjük és annyi nátrium-hidroxiddal elegyítjük, hogy 3 liter 2,5 mólos nátrium-hidroxid-oldatot kapjunk, és 37 °C-on 2 órán át extrakciót végzünk. Az extraktumot semlegesítjük, diatómaföldön átszűrjük, dializáljuk és centrifugáljuk. A felülúszót azonos mennyiségű etanollal és 5 g nátrium-acetáttal elegyítjük, így csapadékot kapunk. Az összegyűjtött csapadékot 0,65 mólos nátrium-klorid-oldatban oldjuk, és azután az 1. referenciapéldában leírt módon anioncserélő oszlopra öntjük. Az oszlopot egymást követően 0,65 mólos és 1,1 mólos nátrium-klorid-oldattal mossuk és 1,5 mólos nátriumklorid-oldattal eluáljuk. Az egyesített eluátumfrakciókat desztillált vízzel szemben dializáljuk, és a dializátumot kalcium-acetáttal és ecetsavval elegyítjük 5%, illetve 0,5 M végkoncentrációig. Az oldathoz etanolt adunk, és a 15-30 térfogat/térfogat%-nál kivált csapadékot összegyűjtjük. Az összegyűjtött csapadékot ioncserélő gyantával nátriumsóvá alakítjuk, az 1. referenciapéldában leírt módon mossuk és szárítjuk, így DSnátriumsót kapunk (amelyre a következőkben BIDSként utalunk).

A BIDS-ban jelen levő heparint vagy heparán-szulfátot az 1. referenciapéldában (2) 2. leírt módon távolítjuk el, így BIDS-H(-)-t kapunk.

A dermatán-szulfátok jellemzőit a sertésbél-nyálkahártyából származó (Celsus Láb. Inc. és a forgalmazó Cosmobio Co., Ltd.) és a sertésbőrből származó (Seikagaku Corp.) dermatán-szulfátéval hasonlítjuk össze.

3. referenciapélda

A különböző eredetű, különféle dermatán-szulfátok fizikai-kémiai tulajdonságainak összehasonlítása (1) Az átlagos molekulatömeg meghatározása

HU 219 339 Β

Az átlagos molekulatömeget Arai és munkatársai (Biochim. Biophys. Acta, 1117, 60-70,1992) módszerével határozzuk meg. Nagy teljesítményű folyadékkromatográfiás eljárással végzett gélszűrést alkalmazunk, amelyhez ismert molekulatömegű glikozamino-glikánokat használunk standard mintaként, és a molekulatömeget a viszonylagosan eluált frakcióikból határozzuk meg. Egy sor 7,8 mm belső átmérőjű és 300 mm hosszúságú oszlopot készítünk TSKgelG4000PWX_L, G30 OOOPWX_L és G2500PWX_L (TOSOH Corp.) adszorbensekből, ezeket 0,2 mólos nátrium-klorid-oldattal 0,6 ml/perc sebességgel eluáljuk, és differenciális refraktométerrel detektáljuk.

(2) A diszacharidok összetételének analízise

A kénsavrész DS-beli kapcsolódási helyének a meghatározását a New Biochemical Experiments 3, Saccharid II, 49-62. oldal (1991) (kiadó Tokyo Kagaku Dozin Co., Ltd.) irodalmi helyen leírtak szerint végeztük. A DS-ot kondroitináz ABC-vel emésztettük, és a keletkezett, telítetlen kötést tartalmazó diszacharidot (telítetlen diszacharidot) HPLC-eljárással analizáltuk, és a kondro-6-szulfatázzal kezelt, fentebb említett diszachariddal hasonlítottuk össze. A kondroitináz ABC-vel való emésztés, a kondro-6-szulfatázzal történő deszulfatálás és a HPLC-eljárással végzett analízis körülményeit az alábbiakban mutatjuk be.

a) Emésztés kondroitináz ABC-vel

Yoshida eljárása szerint [Anal. Biochem., 77, 327-332 (1989)] 20 μΐ 10 mg/ml vizes DS-oldat, 20 μΐ 0,4 mólos trisz-HCl-puffer (pH 8,0), 20 μΐ 0,4 mólos nátrium-acetát-oldat és 20 μΐ 0,1 %-os marhaszérumalbumin-oldat elegyéhez 120 μΐ vizet, majd 20 μΐ 5 U/ml kondroitináz ABC-t adtunk, és az elegyet 37 °C-on 2 órán át inkubáltuk.

b) Emésztés kondro-6-szulfatázzal

100 μΐ fentebb említett kondroitináz ABC-vel emésztett termékhez 20 mmólos trisz-ecetsav-pufferrel (pH 7,0) készült 20 μΐ 5 U/ml koncentrációjú kondro-6szulfatázt adtunk, és az elegyet 37 °C-on 2 órán át inkubáltuk.

c) HPLC-analízis

A kondroitináz ABC-vel vagy még kondro-6-szulfatázzal is emésztett oldat 50 mikroliterét HPLC-készülékkel (Hitachi Ltd.) analizáltuk. Egy 2,6 mm belső átmérőjű és 250 mm hosszú ioncserélő oszlopot (YMCPack PA-120-S5) használtunk, és az elnyelést 232 nm-en mértük. Az eluálást 800 mM-os nátriumhidrogén-foszfát-oldat 0%-tól 100%-ig változó koncentráció gradiensével 1,5 ml/perc átfolyási sebesség mellett 60 percig végeztük. Az eluált, a kénsavcsoportot különböző helyen tartalmazó telítetlen diszacharidokat azonosítottuk.

(3) A belső viszkozitás meghatározása

A belső viszkozitás meghatározását a XII. Japán Gyógyszerkönyv szerint automata viszkoziméterrel (Rigosha Co., Ltd., VMC-052 típus) végeztük. Oldószerként 0,2 mólos nátrium-klorid-oldatot használtunk, és a kifolyási idő Ubbelohde-viszkoziméterben való meghatározásához is ezt alkalmaztuk. A viszkozitást 30±0,l °C-on mértük, és 0,1 másodpercen belüli eltérést mutató, egymást követően meghatározott három kifolyási időt használtunk a belső viszkozitás kiszámításához. A kifolyási időt 0,01 másodpercre kerekítettük, és a belső viszkozitás értékeit a következő egyenlet alapján számítottuk:

n«d=(Vto-iyc ahol t_s=az oldat folyási sebessége, to=az oldószer folyási sebessége és C=a minta koncentrációja (g/dl).

A redukált viszkozitást [Ti_red=(t_s/to-l)/C]^a függőleges tengelyen, a koncentrációt a vízszintes tengelyen ábrázoltuk, és a belső viszkozitást egy függőleges tengelymetszetből a kapott egyenes vonalnak a „0” koncentrációra való extrapolálásával kaptuk.

(4) Eredmények

Az 1. táblázat foglalja össze az (1)-(3) kísérletek eredményeit. A kakastaréjból kapott DS átlagos molekulatömege 38 000 D volt, belső viszkozitása pedig 1,21. Ezzel szemben a másik három DS egészen eltérő fizikai-kémiai tulajdonságokkal rendelkezett, átlagos molekulatömege 14 0000-16 000 D és belső viszkozitása 0,44-0,68 volt, ami jelentős eltérésre utal a kakastaréjból származó és a más forrásokból származó DS-ok között. A marha- és sertésbélből kapott DS-ok átlagos molekulatömege 16 000 és 18 500 volt az 1. táblázatban láthatóan, a jelen feltalálók módszerével meghatározva, noha az irodalomban megadott érték 25 000 (Thromb. Rés., 71, 417-422, 1993), illetve 35 700 (Blood, 74, 1577-1582,1989).

1. táblázat

Különféle forrásból származó, nem heparinmentesített dermatán-szulfátok fizikai-kémiai tulajdonságai

A dcrraatán-szulfát eredete	Marhabéi	Sertésbél	Sertésbőr	Taréj
Átlagos molekulatömeg	16 000	18 500	14 000	38 000
Belső viszkozitás (dl/g)	0,68	0,58	0,44	1,21
A diszacharid összetétele (%)
ADi-OS	0,69	0,69	0,34	4,97
AD-6S	2,52	4,85	0,85	4,41
ADÍ-4S	87,22	83,83	90,22	82,91
ADi-diS_D	0,16	0,51	0,22	0,92

HU 219 339 Β 2

1. táblázat (folytatás)

A dermatán-szulfát eredete	Marhabéi	Sertésbél	Sertésbőr	Taréj
ADi-diS_B	7,65	6,31	8,38	6,13
ADi-diS_E	1,58	3,59	0,00	0,65
ADi-triS	0,18	0,24	0,00	0,00

A diszacharidok összetételét kifejező rövidítések a

2. táblázatban láthatók.

2. táblázat

	R¹	R²	R³
ADi-OS	H	H	H
ADÍ-6S	so₃-	H	H
ADÍ-4S	H	so₃-	H
ADi-diS_D	so₃-	H	so₃-
ADi-diS_E	so₃-	so₃-	H
ADi-diS_B	H	so₃-	so₃-
ADi-triS	so₃-	so₃-	SO₃

A jelen találmányt részleteiben a következő gyakorlati referenciapéldával és példákkal világítjuk meg.

4. referenciapélda

A heparin vagy heparán-szulfát meghatározása a DS-ban

1. Eljárás

A DS-ban levő heparin vagy heparán-szulfát meghatározását a következő három módszerrel végeztük.

a) Enzimes emésztési eljárás A következő három enzim csak heparint vagy heparán-szulfátot emészt, de DS-ot nem (New Biochemical Experiments, 3, Saccharide II., 244-249, 1991, kiadó Tokyo Kagaku Dozin Co., Ltd.), így ezeket a tulajdonságaikat használtuk fel a meghatározáshoz. Az 1. vagy 2. referenciapélda szerint kapott 500 pg DS-hoz 10 pl 10 mM kalcium-kloridot tartalmazó 20 mmólos triszHCl (pH 7,0) pufferben oldott három enzimet, így 20 mU heparitináz I-t, 20 mU heparitináz ΙΙ-t, illetve 50 mU heparitináz IV-t adtunk, és az elegyet 37 °C-on 2 órán át inkubáltuk. A reakcióelegyet az átlagos móltömeg meghatározásához használt körülmények között HPLC-eljárással analizáltuk, és a képződött telítetlen diszacharidokat differenciális refraktométerrel azonosítottuk.

b) Az aktív típusú X faktort gátló hatás meghatározása

Hep vagy HS antitrombin ΠΙ-t aktiváló hatása alapján A heparin vagy heparán-szulfát gátlóhatást fejt ki az aktív típusú X faktorral (Xa) szemben, (a továbbiakban anti-Xa hatásként utalunk rá), amely egyike a koagulációs faktoroknak, az antitrombin III aktiválása révén, míg a DS-nak nincs ilyen hatása (Tollfsen, „Heparin”, 257-273, szerkesztők: Dávid A. Lane és

Ulf Lindahl, Edward Amold, London 1989). Ezt a tulajdonságot alkalmazva az anti-Xa hatást a heparin különböző koncentrációi esetében meghatároztuk, és azt találtuk, hogy egy tartományban dózisfüggő viszony van a gátlóhatás és a heparin dózisa között. Megtalál25 tűk a heparin maximális gátlást okozó minimális dózisát, ahol a gátlás arányát 100%-nak tekintettük, és a gátlási arányt pusztán antitrombin III jelenlétében és heparin távollétében 0%-nak vettük. Az összefüggést ábrázolva kalibrációs görbét szerkesztettünk. Hasonló meghatározást végeztünk a jelen találmány szerinti DS-minták esetében is, és a heparin vagy heparánszulfát mennyiségét a kapott anti-Xa aktivitásnak a kalibrációs görbéhez való hasonlításával határoztuk meg.

Gyakorlatilag a következő eljárást végeztük el. 0,3 ml 50 mM trisz-HCl-ot (pH 8,0), 150 mM nátriumkloridot, 10 mM kalcium-kloridot (puffer), 0,1 ml 1 U/ml antitrombin ΠΙ-t (marha, Sigma) és 0,1 ml heparint (0,03-2 pg/ml, marhabéi, Syntex) vagy 0,1 ml, az előzőekben leírt módon heparinmentes vagy heparán-szulfát-mentes formában előállított DS-mintát (50-100 pg/ml) elegyítettünk 4 °C-on, és azután az elegyet 37 °C-on 2 percig inkubáltuk. Ezt követően 0,1 ml Xa-t (7,1 nkat/ml, marha, Chromogenic AB Co., Ltd., forgalmazó Seikagaku Corp.) adtunk az elegyhez, és 37 °C-on inkubáltuk. 5 perc eltelte után 0,1 ml 100 pM szintetikus szubsztrátot (Boc-Iler-Glu-Gly-Arg-MCA, kód 3094V, Peptide Research Inst.) adtunk a keverékhez és 37 °C-on 3 percig inkubáltuk, majd a reakciót

0,3 ml 30%-os ecetsav hozzáadásával leállítottuk. Végül 1 ml oldatot, amely 7 térfogat 50 mM-os fenti puffért és 3 térfogat 30%-os ecetsavat tartalmazott, adtunk a keverékhez, így megkaptuk a meghatározáshoz szükséges mintát. A meghatározást fluorfotométerrel (Japan

Spectroscopic Co., Ltd., FP-777) 350 nm gerjesztési hullámhosszon és 444 nm fluoreszcencia-hullámhosszon végeztük.

Előzőleg bizonyítottuk, hogy az antitrombin III-nak magának az anti-Xa aktivitása heparin vagy heparán60 szulfát távollétében szinte elhanyagolható a jelen meg6

HU 219 339 Β határozást körülmények között. A gátlási arányt a következő egyenlet alapján számítottuk:

szulfát távollétében szinte elhanyagolható a jelen meghatározási körülmények között. A gátlási arányt a következő egyenlet alapján számítottuk:

A: heparint vagy DS-t tartalmazó minta meghatározott értéke,

B: antritrombin III, Hep vagy DS helyett puffer és Xa jelenlétében kapott érték a fenti eljárásban,

C: antitrombin III helyett puffer jelenlétében kapott érték a fenti eljárásban.

c) A heparin vagy heparán-szulfát aktív típusú faktor ΙΙ-t gátló hatásának meghatározása antitrombin III aktiválóhatás alapján

A heparin vagy heparán-szulfát gátlóhatást fejt ki a koagulációs faktor II (Ha) aktív típusával szemben, amely a koagulációs faktorok egyike, azáltal, hogy az antitrombin IlI-t aktiválja, azaz antitrombin hatású (amelyre a továbbiakban anti-IIa hatásként utalunk), míg a DS-nak nincs ilyen hatása (Tollfsen, „Heparin”, 257-273, szerkesztő Dávid A. Lane és Ulf Lindahl, Edward Amold, London, 1989). Az anti-IIa hatást különféle heparinkoncentrációk alkalmazásával határoztuk meg, és a fentebb említett tulajdonság felhasználásával állapítottuk meg a gátlóhatás és a heparindózis dózisfiiggő tartományát. Megtaláltuk a heparin maximális gátlást okozó minimális dózisát, ahol a gátlás arányát 100%-nak tekintettük, és a gátlási arányt pusztán antitrombin III jelenlétében és heparin távollétében 0%nak vettük. Az összefüggést ábrázolva kalibrációs görbét szerkesztettünk. Hasonló meghatározást végeztünk a jelen találmány szerinti DS-minták esetében is, és a heparin vagy heparán-szulfát mennyiségét a kapott anti-IIa aktivitásnak a kalibrációs görbéhez való hasonlításával határoztuk meg.

Gyakorlatilag a következő eljárást végeztük el. 0,35 ml 20 mM trisz-HCl-ot (pH 7,4), 150 mM nátrium-kloridot, 10 mM kalcium-kloridot, 0,1% marhaszérumalbumint (puffer), 0,1 ml 1 U/ml koncentrációjú antitrombin ΠΙ-t (marha, Sigma) és heparint (0,03-20 pg/ml, marhabéi, Syntex) vagy az előzőekben leírt módon heparinmentes vagy heparán-szulfátmentes formában előállított DS-mintát (50-100 pg/ml) elegyítettünk 4 °C-on, és azután az elegyet 37 °C-on 2 percig inkubáltuk. Ezt követően 0,05 ml Ila-t (50 mU/ml, marha, Boehringer) adtunk az elegyhez, és 37 °C-on inkubáltuk. 5 perc eltelte után 0,1 ml 70 pM szintetikus szubsztrátot (Boc-Val-Pro-Arg-MCA, kód 3093V, Peptide Research Inst.) adtunk a keverékhez, és 37 °C-on 3 percig inkubáltuk, majd a reakciót 0,3 ml 30%-os ecetsav hozzáadásával leállítottuk. Végül 1 ml oldatot, amely 7 térfogat 50 mM fenti puffért és 3 térfogat 30%-os jégecetet tartalmazott, adtunk a keverékhez, így megkaptuk a meghatározáshoz szükséges mintát. A meghatározást fluorfotométerrel (Japan Spectroscopic Co., Ltd., FP-777) 350 nm gerjesztési hullámhosszon és 444 nm fluoreszcencia-hullámhosszon végeztük.

Előzőleg bizonyítottuk, hogy az antitrombin III-nak magának az anti-IIa aktivitása heparin vagy heparánA: heparint vagy DS-ot tartalmazó minta meghatározott értéke,

B: antitrombin III, Hep vagy DS helyett puffer és Ila jelenlétében kapott érték a fenti eljárásban,

2. Eredmények

A fentebb említett három módszerrel kapott eredmények a 3. táblázatban láthatók.

3. táblázat

Dermatán-szulfátok heparin/heparán-szulfát-tartalma

	Vizsgálati eljárás
a) eljárás	b) eljárás	c) eljárás
BIDS-H(-)*	0,00%	0,013%	0,000%
RCDS-H (-) **	0,00%	0,023%	0,003%
BIDS	0,81%	0,30%	ND
RCDS	0,26%	0,16%	ND

ND: nem határoztuk meg.

* A heparinmentesítést a 2. referenciapélda ismerteti (10. oldal).

** Az 1. referenciapéldában (2) 1. említett ioncserélő kromatográfiás eljárással készített, heparintól vagy heparán-szulfáttól mentes minta.

1. példa

Az RCDS-, BIDS-, RCDS-H(-)- és BIDS-H(-)-adagolás utáni vérkoncentrációinak tartósságában mutatkozó különbségek vizsgálata patkányokban (1) Anyagok és eljárás

6,5-7,5 hetes hím Sprague-Dawley (SD)-patkányokat (Charles River Japan, Inc.) használtunk. A vizsgálandó minták RCDS, BIDS, RCDS-H(-) és BIDSH(-) voltak. A patkányokat éterrel elaltattuk, és a farki vénába 10-10 mg/kg vizsgálandó anyagot adagoltunk. Az altatás alatti adagolás után 5 és 120 perccel a véna cava inferiorból vért vettünk 9 térfogat vérre vonatkoztatva 1 térfogat 3,2%-os citromsavat tartalmazó csövekbe. A plazmát centrifugálással elkülönítettük, és a plazmában a DS mennyiségét a „New Biochemical Experiments”, 3, Saccharides II, 175-179. irodalmi helyen leírt módszerrel meghatároztuk, azaz a plazmát egy PD- 10^R™ oszlopon (Pharmacia Biochemicals Inc.) sómentesítettük, liofilizáltuk, kondroitináz ABC-vel emésztettük, 5000 molekulatömeget kizáró membránon át ultraszűrtük, és a kapott szűrletet HPLC-eljárással analizáltuk.

(2) Eredmények

Az eredményeket a DS-nak a 0 időre vonatkoztatott relatív maradékarányában (%) fejeztük ki, és az 1. ábrán foglaltuk össze. Az RCDS és RCDS-H(-) maradékaránya körülbelül kétszer volt nagyobb, mint a BIDS és

HU 219 339 Β

BIDS-H(-) aránya 5 perccel az adagolás után. Az RCDS és RCDS-H(-) körülbelül 10% maradékarányt mutatott az adagolás után 20 perccel, míg a BIDS alig volt kimutatható. Az RCDS-H(-) kevéssé magasabb maradékarányt mutatott, mint az RCDS 5 és 120 perccel az adagolást követően.

5. referenciapélda

A DS trombózisellenes hatását vizsgáltuk patkány véna cava inferior trombózismodellben (1) Anyagok

6,5-7,5 hetes hím Sprague-Dawley (SD) patkányokat (Charles River Japan, Inc.) használtunk. DS-ként RCDS-ot és BIDS-ot vizsgáltunk.

(2) Eljárás

A kísérleti trombózismodell előállítása

Reyers és munkatársai módszerével [Thromb. Rés., 18, 669-674 (1980)] állítottunk elő patkánytrombózismodellt. A patkányok hasát Nembutal^R™-lal (Dynabott-Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) végzett altatás közben felmetszettük, és a véna cava inferiort közvetlenül a bal renális véna elágazása alatt sebészeti selyemmel (No. 7,0,48-0,56 mm átmérőjű: Shin-ei Co., Ltd.) elkötöttük. Az RCDS és BIDS mintáit a farki vénába adagoltuk 1, 3 és 10 mg/kg mennyiségben az elkötés előtt 1 perccel. A kontrollcsoport sóoldatot kapott. A patkányok hasát éteres altatás közben az elkötés után 3 órával felnyitottuk, és a vénát a trombus eltávolítására felmetszettük. A trombust 1 éjszakán át 37 °C-on állni hagytuk, és a száraztömegét mértük. A kapott adatokat Newman-Keuls módszerével statisztikusan analizáltuk.

(3) Eredmények

Az eredmények a 4. táblázatban láthatók. A két, 1 mg/kg mennyiségű DS-ot kapott csoportok esetében a trombusnak a kontrollcsoporthoz viszonyított relatív száraztömege 60%-os gátlási arányt mutatott. Azonban az RCDS csoport trombusának tömege 2,4%-ra és 0,0%-ra csökkent a 3 és 10 mg/kg és e feletti dózisok esetében, míg a BIDS csoporté csak 34,1%-ra és 2,4%ra csökkent a kontrolihoz viszonyítva, ami az RCDS használhatóságát mutatja.

4. táblázat

Trombózisellenes hatás vizsgálata patkány véna cava inferior trombózismodellben

Vizsgálati minta	Dózis (mg/kg)	A trombus átlagos száraztömege (mg)	Relatív tömegarány (g)
Sóoldat (kontroll)	-	4,1 ±0,7	100
	1	2,5±0,9	61,0
RCDS	3	0,l±0,l**	2,4
	10	0,0±0,0**	0,0
	1	2,6±0,6	63,4
BIDS	3	l,4±0,8*	34,1
	10	0,l±0,l**	2,4

*: p<0,05, **: p<0,01, a kontrolihoz viszonyítva.

A kontrollcsoport 14 patkányból állt, és a két DS csoportban 6-6 patkány volt, ezek értékeiből átlagot számítottunk.

6. referenciapélda

A DS trombogenezisre és trombolizisre kifejtett hatásának vizsgála patkány véna cava inferior trombózismodellben (1) Anyagok

6,5-7,5 hetes hím Sprague-Dawley (SD)-patkányokat (Charles River Japan, Inc.) használtunk. DSként RCDS-ot és BIDS-ot vizsgáltunk.

(2) Eljárás

1. A kísérleti trombózismodell előállítása

A patkány-trombózismodellt a véna cava inferior elkötésével állítottuk elő az 5. referenciapéldában leírt módon. A vizsgálati mintákat a farokvénába adtuk 3, 10 és 30 mg/kg mennyiségben, 0,5 ml/kg térfogatban. A kontrollcsoport sóoldatot kapott. A kontrollcsoportban 6 órával az elkötés után és a vizsgálati csoportokban 2 órával az adagolás után (8 órával az elkötés után) a patkányok hasát éteres altatás közben felnyitottuk, és vért vettünk. Ezután a vénákat felmetszettük, a trombusokat eltávolítottuk, és 1 éjszakán át 37 °C-on hagytuk állni a száraztömeg meghatározására. A kapott adatokat Newman-Keuls módszerével statisztikusan analizáltuk.

2. Euglobulinffakció előállítása

Műanyag kémcsőbe 0,5 ml plazmát helyeztünk, és 9,5 ml mélyen hűtött 0,01 n acetátpuffert (pH 4,85) mértünk, az elegyet 1 órán át hűtőszekrényben hagytuk állni, majd 3000 fordulatszám mellett 5 percig centrifugáltuk, így euglobulinfrakciót kaptunk. A csapadékot 0,5 ml trisz-HCl-pufferrel (pH 7,4) kevertük, ekkor tiszta oldat képződött.

3. A fibrinolitikus hatás meghatározása

Egy fibrin tesztlemez üregébe 10 μΐ euglobulinfrakciót mértünk, és egy inkubátorban 37 °C-on 18 órán át hagytuk állni, majd a fibrinolitikus területet (átmérőnégyzet) mértük. A fibrinolitikus terület arányos a plazminaktivitás erősségével. A kapott fibrinolitikus adatokat Newman-Keuls módszerével statisztikusan analizáltuk.

(3) Eredmények

Az eredmények az 5. táblázatban láthatók.

Az 5. táblázatban a 6 órás kontroll azt a csoportot jelenti, amelyen a véna elkötése után 6 órával altatás közben hasfelmetszést végeztünk, azután vért vettünk, és a trombust eltávolítottuk. A 8 órás kontroll azt a csoportot jelenti, amelynek a véna elkötése után 6 órával sóoldatot adtunk, majd további 2 óra eltelte után vért vettünk, és a trombust eltávolítottuk.

1. A trombogenezis gátlására és a trombolizisre kifejtett hatás

Minden csoportban figyeltünk meg trombusokat, azonban jelentős különbségek voltak a csoportok között, ahogy az az 5. táblázatban látható. Az RCDS és BIDS csoportok mindegyike dózisfuggő trombustömeg-csökkenést mutatott a 8 órás kontrollcsoporthoz hasonlítva. A 30 mg/kg BIDS-ot és 10 mg/kg vagy több RCDS-ot

HU 219 339 Β kapott csoportok esetében a trombusok tömege kisebb volt a 6 órás kontrolihoz viszonyítva, ami nemcsak a trombogenezis gátlását mutatja, hanem trombolitikus hatásra is utal. Más szóval, az RCDS erőteljesebb gátlóhatást fejt ki a trombogenezisre és erőteljesebb hatást fejt ki a trombolízisre kisebb koncentrációkban, mint a BIDS.

2. A fibrinolitikus rendszerre gyakorolt hatás Az RCDS-ot és a BIDS-ot 3, 10 és 30 mg/kg mennyiségben adagoltuk, és a plazminaktivitást a plazmában 2 óra (a véna elkötésétől számított 8 óra) eltelte után határoztuk meg. Az eredményeket az 5. táblázatban foglaltuk össze. A plazminaktivitás a 10 mg/kg dózisú RCDS csoportban és a 30 mg/kg vagy e feletti dózisú BIDS csoportban szignifikánsan nagyobb volt, mint a kontrollcsoportban. Ezek az eredmények az RCDS kitűnő hatását mutatják.

5. táblázat

A vizsgálati minta	Dózis (mg/kg)	A trombus száraztömege (a 8 órás kontrolihoz viszonyított %-os arány)	Fibrinolitikus hatás FA¹(a 8 órás kontrolihoz viszonyított %-os arány)
6 órás kont-		70±9	nem határoz-
roll		tűk meg
8 órás kontroll	-	100±ll	100±4
	3	73±9	110±5
RCDS	10	56±12	165±10⁺⁺
	30	54±11	204±15⁺⁺
	3	90±18	108±6
BIDS	10	79±16	114±5
	30	60±8	158±6⁺⁺

¹: A fibrinolízis területe a 8 órás kontrolihoz viszonyítva. ^{+ +}: p<0,01.

A trombusok tömegét a 8 órás kontroll arányában fejeztük ki, amit 100%-nak vettünk. A 8 órás kontrollcsoportban 16, a többi csoportban 8-9 patkány volt, és ezek értékeit átlagoltuk.

2. példa

A DS endotoxinnal indukált patkány-DIC-modellre gyakorolt trombózisellenes hatásának összehasonlító vizsgálata (1) Anyagok

5,5-6,5 hetes hím Sprague-Dawley (SD)-patkányokat (Charles River Japan, Inc.) használtunk. A patkányokat Nembutal^R™ intraperitoneális injektálásával elaltattuk, és a bal combot felmetszettük. Egy polietilénkanült (PE-10, Imamura Col, Ltd.) illesztettünk be a hasi vénába a felmetszett helytől hátrafelé haladva, attól 4 cm távolságra, és a kanült rögzítettük. Miután az állat magához tért, egy fecskendőn keresztül, infúziós pumpa segítségével (Model-22M, HARVARD) egy endotoxint (Escherichia coli 055 :B5, Difco Co., Ltd.) adagoltunk folyamatos infúzió formájában 3,75 mg/kg/óra mennyiségben 4 órán át. A vizsgálati mintát az RCDS-H(-)-t vagy BIDS-H(-)-t az endotoxinnal egyidejűleg és folyamatos infúzió formájában adagoltuk 4 órán át a jobb vénába csatlakoztatott kanül segítségével. A kontrollcsoport a vizsgálandó anyagot kapott csoporttal ekvivalens térfogatú sóoldatot kapott 4 órán át.

(2) A vizsgálat tárgyai

Az endotoxin adagolása után vért vettünk, és a veséket eltávolítottuk, és a következő meghatározásokat végeztük.

1. Vérlemezkeszám: a vérlemezkéket egy automata hemacitométer (Celltac MEK-4500: Nippon Denko Col, Ltd.) segítségével számoltuk meg.

2. Fibrinogén: a plazmát elkülönítettük és fibrinogénmeghatározó kit segítségével vizsgáltuk (Sunassay Fibrinogen^R™, gyártó: NITTO BOSEKJ Co., Ltd., forgalmazó : Sanko Junyaku Co., Ltd.).

3. Fibrinogén-fibrin lebomlási termékek (FDP): szérumot különítettünk el, és a fibrinogén-fibrin lebomlási termékeket FDP meghatározó latex reagenssel (FPDL^R™ teszt, Teikoku Hormon Mfg. Co., Ltd.) meghatároztuk.

4. Renális glomeruláris fibrin csapadékarány (%GFD, glomerular fibrin deposit): a veséket 10%-os semleges formalin-pufferoldattal fixáltuk, paraffinba ágyaztuk, felszeleteltük, és foszfo-volfrámsav-hematoxilinnel megfestettük. A veseminták teljes területén mikroszkóp segítségével megfigyeltük a renális glomerulusokat, és a fibrinlerakódást megszámoltuk, és %-os formában kifejeztük. A kapott adatokat Newman-Keulsmódszerrel statisztikusan analizáltuk.

(3) Eredmények

Az eredményeket a 6. táblázatban foglaltuk össze. A vérlemezkeszám, a fibrinogén és az FDP 75 χ 10^{2 * 4} μΐ, 216 mg/dl és 2,5 pg/ml vagy kisebb, és a normálcsoportban %GFD-t nem mutattunk ki. Azonban azok a patkányok, amelyekben endotoxinnal DIC-t indukáltunk, abnormális, azaz 14 χ 10⁴ pl, 35 mg/dl, 34,3 pg/ml és 61% vérlemezkeszám, fibrinogén- és FDP-értékeket mutattak.

A DS-H(-) csoport javulást mutatott mindezen paraméterek tekintetében, és az RGDS-H(-) csoportban jobb eredményeket kaptunk minden paraméter vonatkozásában, mint a BIDS-H(-) csoportban. Különösen a GFD%, amely a veseelégtelenség oka, 16,1% maradt a BIDS-H(-) csoportban, míg az RCDS-H(-) csoport jelentős javulást mutatott, az értéke 1%-ra csökkent, ami az RCDS-H(-) hasznosságára utal.

HU 219 339 Β

6. táblázat

A DS endotoxinnal indukált patkány-DIC-modellre gyakorolt trombózisellenes hatásának összehasonlító vizsgálata

	Dózis (mg/kg/óra)	Vérlemezke (χΚΤ'μΙ)	Fibrinogén (mg/dl)	FDP (pg/ml)	GFD%
Normál		75±1	216±5	<2,5	0,0
Kontroll (csak LPS^a)		14±1	35±3	34,3 ±2,5	60,7±5,3
RCDS-H(-)+LPS	5,0	22±3	120±6*	4,6±0,4*	l,2±0,7*
BIDS-H(-)+LPS	5,0	18±3	107±10*	8,6±2,6*	16,1 ±5,5*

(^a: endotoxin, *: a kontrolihoz viszonyítva, p>0,01.)

A kísérletet a normálcsoportban 19, a kontrollcsoportban 20 és a DS-ot kapott csoportokban 7-7 patkánnyal végeztük, és a mért értékeket átlagoltuk. 20

7. referenciapélda

A DS stimuláló hatása Glu-plazminogénre (természetes plazminogén, a továbbiakban plazminogén) t-PA-val történő aktiválására 25 (1) Eljárás

DS (BIDS, RCDS) különböző koncentrációiból vagy kondroitin-szulfátból (kontrollcsoport) 50-50 μΐ-t, 25 μΐ 1,6 μΜ-os plazminogénoldatot, 25 μΐ 20 nM-os egyláncú vagy kétláncú t-PA-oldatot és 100 μΐ 0,6 mM-os 30 S-2251 (H-D-Val-L-Leu-L-Lys-p- nitroanilid.2 HC1) szintetikus szubsztrátot összekevertünk, és az abszorbenciát 405 nm-en minden 2 percben meghatároztuk egy automata mikrotiterlemez-leolvasóval. A reakciót 37 °C-on, 50 mM trisz-HCl-ból és Tween^R™80-ból 35 készült pufferben végeztük.

A plazminogén aktiválásának kezdeti értékét a következőképpen számítottuk: a t időben 405 nm-en mért abszorbenciának, A₄₀₅-nek az idő négyzete szerinti differenciálhányadosát (öA₄₀₅/8t²) 40 000-rel osztottuk 40 (Chibber Β. A. K. és munkatársai, Biochemistry, 1985, 3429-3434). A stimulálás értékét a DS- vagy kondroitin-szulfát-mentes körülményekre vonatkoztatott arányokból számítottuk, ahol a kezdeti értéket 1-nek vettük. 45 (2) Eredmények

A BIDS-re vonatkozó eredmények a 2. és 3. ábrán láthatók. A DS dózisfuggően stimulálta a plazminogén aktiválását, 1,5-4,5-szeresére az egyláncú t-PA (sc-tPA) esetében és 1,5-3,5-szeresére a kétláncú t-PA 50 (tc-tPA) esetében, ahogyan ezt az ábrák mutatják. Ugyanakkor a kontroll kondroitin-szulfát-csoport gyengébb, maximum 2,5-szeres stimulálási értéket mutatott egyláncú t-PA jelenlétében, és maximum 1,5-szerest a kétláncú t-PA jelenlétében a DS csoporthoz viszonyít- 55 va. Az RCDS-ra vonatkozó eredmények a 4. és 5. ábrákon láthatók. Az RCDS szintén stimulálta a plazminogén aktiválását 2,0-4,5-szeresen az egyláncú t-PA (sctPA) jelenlétében és 2,0-4,0-szeresére a kétláncú t-PA (tc-tPA) jelenlétében. 60

8. referenciapélda

A DS-nek patkány fibrinolitikus rendszerre gyakorolt hatását vizsgáltuk (1) Anyagok és módszer

9-11 hetes hím Wistar-patkányokat SomnopentüRTM (Kyoritsu Shoji Co., Ltd.) beadásával elaltattunk, és a hátukba szukbután 40 mg/kg DS-ot (BIDS-ot) adagoltunk. 1,6,12 és 24 óra eltelte után citromsavat tartalmazó fecskendőbe vért vettünk le. A 6. referenciapéldában leírt módon a plazmából euglobulinfrakciót állítottunk elő, és a fibrinolitikus aktivitást a fibrin lemezmódszerrel értékeltük. A kapott adatokat Newman-Kleusmódszerrel statisztikusan analizáltuk.

A plazmában és az euglobulinfrakcióban meghatároztuk a DS mennyiségét („New Biochemical Experiment”, 3, Saccharides II, 175-179). A kontrollcsoportban sóoldatot alkalmaztunk. Ezeket a kísérleteket előre meghatározott időben végeztük, tekintettel a patkány koagulációs és fibrinolitikus aktivitásának 24 órás ritmusára.

(2) Eredmények

A kapott eredményeket a 7. és 8. táblázatban foglaltuk össze.

A DS a 6. táblázat adatai szerint a beadást követő 12 óráig mutatott fibrinolitikus aktivitást. A plazmában levő DS körülbelül 70-80%-a az euglobulinfrakcióban volt jelen, és a 8. táblázatban feltüntetett fibrinolitikus aktivitást fejtette ki. Az RCDS hasonló eredményeket adott.

7. táblázat

Fibrinolitikus aktivitás fibrin lemezmódszerrel meghatározva¹

A vizsgált minta	Az adagolás után eltelt idő (óra)
6	12	24
Kontroll	57,4±3,5	54,1±3,9	42,3 ±4,6
DS	85,3 ±8,4*	71,9±3,5	46,1 ±3,7

¹: Fibrinoldódási terület (mm²).

*: p<0,01 a kontrolihoz viszonyítva.

Mind a kontroll-, mind a DS-csoportokban 4-5 patkány volt, és a mért értékeket átlagoltuk.

HU 219 339 Β

8. táblázat

DS a plazmában és az euglobulinírakcióban (pg/ml)

Frakció	Az adagolás után eltelt idő (óra)
1	6	12	24
Plazma	3,62±0,61	3,58±0,27	2,20±0,26	0,45 ±0,04
Euglobulin	2,51 ±0,62	2,80±0,27	l,60±0,16	ND
Kontroll	0,03±0,02

ND: nem határoztuk meg.

9. referenciapélda

A DS humán plazmarög lízisére kifejtett stimuláló 20 hatását vizsgáltuk (1) Módszer

Egy 96 mérőhelyes mikrotiterlemez üregeibe a DS (BIDS) különböző koncentrációjú oldataiból 40-40 pl-t (a végkoncentráció 50,0-200 pg/ml), 20 pl egyláncú 25 t-PA-t (végkoncentráció 166,7 U), 40 pl trombint (végkoncentráció 20 U/ml) és 100 pl humán plazmát mértünk, majd a komponenseket összekevertük. Az elkészítés után közvetlenül 340 nm-en meghatároztuk az abszorbenciát, és azután minden 10 percben mértük a 30 minimális abszorbencia eléréséig. A fibrinolitikus aktivitást a DS-PLT1/2 (perc) érték, amelyet úgy kapunk, hogy a DS jelenlétében mért maximális abszorbencia (Max) és minimális abszorbencia összegét kettővel osztjuk, és a kontrollcsoporttal kapott Kontroll-PLTl/2 ér- 35 ték arányával fejezzük ki.

(2) Eredmények

Az eredmények a 7. táblázatban láthatók. A DS dózisfüggő módon stimulálja a plazmarög fibrinolitikus aktivitását, amint azt a 6. ábra is mutatja. Az RCDS- 40 tai végzett mérések során hasonló eredményeket kaptunk.

3. példa

A dermatán-szulfát toxicitásának vizsgálata egyet- 45 len intravénás adagolást követően egérben (1) Anyagok és módszer hetes, mindkét nemhez tartozó Crj:CD-l egereket (Charles River Japan, Inc.) alkalmaztunk. Az RCDS-H(-) és BIDS-H(-) izotóniás oldatait steril 50 desztillált vízzel és steril sóoldattal készítettük, és 2000 mg/kg mennyiségben intravénásán adagoltuk az egér farki vénájába üvegfecskendő segítségével. Az állatokat 14 napon át figyeltük, hogy megjelennek-e a toxicitásra utaló jelek. 55 (2) Eredmények

Még a 2000 mg/kg-os nagy dózist kapott DS-csoportoknál sem pusztult el egy állat sem, ahogy azt a 8. táblázat mutatja. A jelen vizsgálati körülmények között a letális dózis feltehetően 2000 mg/kg felett van. 60

9. táblázat

Vizsgált minta	Dózis (mg/kg)	Elpusztult állatok/vizsgált állatok száma
Hím	Nőstény
RCDS-H(-)	2000	0/5	0/5
BIDS-H(-)	2000	0/5	0/5

4. példa

Gyógyászati készítmény (1) Az 1. referenciapélda szerint kakastaréjból előállított DS [RCDS vagy RCDS-H(-)] sterilizált nátriumsójából 500-5000 mg-ot steril sóoldatban vagy steril desztillált vízben oldottunk, így izotóniás oldatokat állítottunk elő, ezeket 100 ml-re egészítettük ki. Az oldat 10-10 ml-es részleteit ampullákba töltöttük, így intravaszkuláris, szubkután vagy intramuszkuláris injekciós készítményeket kaptunk.

(2) Az 1. referenciapélda szerint kakastaréjból előállított DS [RCDS vagy RCDS-H(-)] nátriumsóból 250 mg-ot és 1 000 000 IU t-PA-t Idilön-külön csomagoltunk, így olyan injekciós készítményeket kaptunk, amelyeket közvetlenül felhasználás előtt oldunk fel. Az injekciós készítmények koszorúérbe vagy vénába adható injekcióként használhatók.

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Alacsony heparin- vagy heparán-szulfát-tartalmú dermatán-szulfát és sója, amelynek belső viszkozitása 0,8 dl/g vagy e feletti, és heparin- vagy heparán-szulfát-tartalma

a) 0,15% vagy kevesebb, a heparin vagy heparán-szulfát enzimatikus lebontásával és nagynyomású folyadékkromatográfiás eljárással meghatározva, vagy

b) 0,07% vagy kevesebb az aktív faktor X antítrombin III jelenlétében való gátlásával meghatározva, amelyhez standardként marhabélből származó heparint használunk, vagy

c) 0,05% vagy kevesebb az aktív faktor II antítrombin III jelenlétében való gátlásával meghatározva, amelyhez standardként marhabéiból származó heparint használunk.

HU 219 339 Β
2. Az 1. igénypont szerinti dermatán-szulfát, amelynek a belső viszkozitása 0,9-2,0 dl/g.
3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti dermatán-szulfát, amely taréjból származik.
4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti dermatán-szulfát, a dermatán-szulfátot vagy sóját alkotó diszacharidokban 2% és 7% közötti mennyiségű 2-acetamido-2-dezoxi-3-0-(4-dezoxi-a-treo-hex-L-4-enopiranoziluronsav)-D-galaktóz (ADi-OS) van.
5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti dermatán-szulfát, amelynek átlagos molekulatömege 25 000 D és 100 000 D közötti.
6. Gyógyszerkészítmény, amely az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti dermatán-szulfát vagy sója hatásos mennyiségét tartalmazza.
7. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti dermatán-szulfát vagy sója, vagy a 6. igénypont szerinti gyógyszerkészítmény különböző trombózisok megelőzésére vagy kezelésére történő alkalmazásra.
8. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti dermatán-szulfát vagy sója, vagy a 6. igénypont szerinti gyógyszerkészítmény alkalmazása trombózisgyanús állapot, vagy a csökkent vérlemezkeszám vagy csökkent koagulációs faktorok okozta vérzékenység következtében kialakult trombózis kezelésére történő alkalmazásra.
9. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti dermatán-szulfát vagy sója, vagy a 6. igénypont szerinti gyógyszerkészítmény alkalmazása szétszórt intravaszkuláris koagulációs szindróma megelőzésére vagy kezelésére történő alkalmazásra.
10. Készítmény, amely egy- vagy kétláncú szövetplazminogén-aktivátort (t-PA-t) és az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti dermatán-szulfátot vagy annak gyógyászatilag elfogadható sóját tartalmazza.
11. Gyógyszerkészítmény, amely a 10. igénypont szerinti készítmény hatásos mennyiségét tartalmazza.
12. A 10. igénypont szerinti gyógyszerkészítmény, vagy all. igénypont szerinti gyógyszerkészítmény miokardiális infarktus kezelésére történő alkalmazásra.