PL177218B1

PL177218B1 - Siarczany dermatanu oraz środki przeciwzakrzepowe zawierające siarczany dermatanu

Info

Publication number: PL177218B1
Application number: PL94309218A
Authority: PL
Inventors: Akikazu Takada; Junichi Onaya; Mikio Arai; Satoshi Miyauchi; Mamoru Kyogashima; Keiichi Yashida
Original assignee: Seikagaku Kogyo Co Ltd
Priority date: 1993-09-30
Filing date: 1994-09-30
Publication date: 1999-10-29
Also published as: HU9501542D0; FI952593A0; DK0671414T3; EP0671414B1; US5801162A; HU219339B; RU95112534A; CA2150552C; FI952593L; RU2153506C2; NO952137L; DE69429576D1; ATE211487T1; NO952137D0; PL309218A1; EP0671414A4; EP0671414A1; PL177245B1; JP3813169B2; NO308856B1

Abstract

1. Siarczany dermatanu i ich sole o lepkosci wewnetrznej rzedu 0,8 dl/g lub wiecej, oznaczone wiskometrem Ubbelohde przy uzyciu 0,2 M roztworu chlorku sodu jako rozpusz- czalnika w temperaturze 30±0,1°C. 7. Srodki przeciwzakrzepowe, znamienne tym, ze zawieraja siarczany dermatanu lub ich farmakologicznie dopuszczalne sole w dopuszczalnej farmakologicznie ilosci razem z farmakologicznie dostepnymi dodatkami. PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku są także siarczany dermatanu lub ich farmakologicznie dopuszczalne sole w dopuszczalnej farmakologicznie ilości razem z farmakologicznie dostępnymi dodatkami, przy czym korzystnie środki przeciwzakrzepowe zawierają siarczany dermatanu pochodzące z grzebienia koguta.

Środki przeciwzakrzepowe jako składniki aktywne zawierają siarczany dermatanu lub ich farmakologicznie dopuszczalne sole posiadające 2-7% ADi-OS w ich dwucukrach zrębowych oznaczone metodą enzymatyczną i chromatografię ciekłofazową wysokiej rozdzielczości, średnią masę cząsteczkową 25000-100000 oznaczone filtracją na żelu według Biochim. Biophys. Acta, 1117, 60-70 (1992) i lepkość wewnętrzną rzędu 0,8 dl/g lub więcej, oznaczone wiskometrem Ubbelohde przy użyciu 0,2 M roztworu chlorku sodu jako rozpuszczalnika w temperaturze 30±0,1°C, przy czym korzystnie lepkość wewnętrzna wynosi 0,9-2,0 dl/g.

Środki przeciwzakrzepowe według wynalazku zawierają siarczany dermatanu zawierające 0,15% lub mniej heparyny lub siarczanu heparanu oznaczone metodą z użyciem enzymu degradującego heparynę i siarczany heparanu i chromatografię ciekłofazową wysokiej rozdzielczości, 0,07% lub mniej heparyny lub siarczanu heparanu oznaczone przez działanie hamujące na aktywny czynnik X w obecności antytrombiny III z użyciem heparyny uzyskanej z jelita wołowego jako substancji odniesienia; lub 0,05% lub mniej heparyny lub siarczanów heparanu oznaczone działaniem hamującym na aktywny czynnik II w obecności antytrombiny III z użyciem heparyny uzyskanej z jelita wołowego jako substancji odniesienia.

Dopuszczalne farmakologicznie sole siarczanów dermatanu obejmują sole sodowe, potasowe, litowe i wapniowe, przy czym sole sodowe są najkorzystniejsze.

1ΊΊ 218

Siarczany dermatanu lub ich farmakologicznie dopuszczalne sole (określane jako DS) przejawiają w stopniu wystarczającym aktywność farmakologiczną po podaniu pojedynczym jak i po kolejnych podaniach. Siarczany dermatanu mogą być podawane dożylnie, dotętniczo lub do naczyń wieńcowych lub podskórnie czy domięśniowo.

Preparaty farmaceutyczne mogą być odpowiednio przygotowane z użyciem standardowych, dopuszczalnych farmakologicznie adjuwantów jak stabilizatory, czynniki emulgujące, moderatory ciśnienia osmotycznego, czynniki zapewniające pH itd.

DS podawany jest w dawce rzędu 50-3000 mg/dzień pacjentom dorosłym. Te aktywne składniki mogą być podawane jednorazowo lub w dwóch i więcej dawkach podzielonych w ciągu dnia, z odpowiednimi przerwami.

Jak to opisano wyżej, DS i ich farmakologicznie dopuszczalne sole mogą być użyte w celu aktywacji aktywności fibrynolitycznej jako wygodny środek przyspieszający fibrynolizę. Szczególnie specyficzne DS, posiadające lepkość wewnętrzną rzędu 0,8-2,0 dl/g, uzyskane z grzebienia koguta, o ADi-OS rzędu 2-7% w ich dwucukrach lub średniej masie cząsteczkowej rzędu 0,8-2,0 dl/g, uzyskane z grzebienia koguta, o ADi-OS rzędu 2-7% w ich dwucukrach lub średniej masie cząsteczkowej rzędu 25000-100000; najkorzystniej 3000050000 określone filtracją na żelu opisaną niżej, zwłaszcza te, które posiadają bardzo niską zawartość heparyny lub siarczanu heparanu lub ich farmakologicznie dopuszczalne sole przejawiają znaczny wpływ. DS posiadające lepkość wewnętrzną ponad 2,0 dl/g lub o średniej masie cząsteczkowej ponad 100000 wykazują podwyższoną lepkość i nie są polecane ze względu na zakłócanie przepływu krwi.

W szczególności, wspomniane specyficzne DS lub ich farmakologicznie dopuszczalne sole utrzymują stężenia efektywne we krwi przez czas dłuższy w porównaniu z innymi DS lub ich farmakologicznie dopuszczalnymi solami i wykazują zapobieganie rozszerzania się i zahamowanie powstawania zakrzepu lub pobudzają trombolizę po wprowadzeniu do żywego organizmu. Stąd, zapewniają doskonały wpływ na zespół wykrzepiania wewnątrznaczyniowego (DIC), uraz wielonarządowy z towarzyszącymi licznymi zakrzepami oraz zakrzepowe zapalenie żył głębokich itp. Ten wpływ może być obserwowany nie tylko w wymienionych uprzednio chorobach, ale również we wszystkich typach zakrzepów i używany do ich leczenia i zapobiegania, w tętnicach, kapilarach i żyłach. Ponadto, specyficzne DS lub ich farmakologicznie dopuszczalne sole, będące przedmiotem niniejszego wynalazku, mogą być używane do zapobieżenia krzepnięciu krwi w krążeniu pozaustrojowym jak np. hemodializa u pacjentów z chorobami nerek.

Heparyna (określana jako Hep) lub siarczan heparanu (określany jako HS) zanieczyszczające DS, mogą być usunięte, co daje w wyniku DS wolny od Hep lub HS (określany jako DS-H(-)). Dożylna, podskórna lub domięśniowa iniekcja powstałego DS-H(-), powoduje rzadsze występowanie reakcji niepożądanych, jak krwawienia u pacjentów ze skłonnością do krwawień. Szczególnie podawanie preparatu pacjentom ze skłonnością do krwawień z powodu zmniejszenia liczby płytek lub ilości czynników krzepnięcia, powoduje zmniejszenie częstości wystąpienia reakcji niepożądanych jak krwawienia i jest szczególnie bezpieczne.

Figura 1 przedstawia zmiany stężenia we krwi szczurów soli sodowych siarczanów dermatanu uzyskanych z grzebienia koguta (patrz przykład 1, RCDS) i wołowego jelita cienkiego (patrz przykład 2, BIDS) (patrz przykład 1).

o przedstawia podawanie BIDS, o przedstawia podawanie RCDS, A przedstawia podawanie BIDS-H(-), □ przedstawia podawanie RCDS-H(-) i x przedstawia nakładanie się o, o, A i □.

Figura 2 przedstawia wielkość pobudzenia przez BIDS aktywacji plazminogenu przez jednołańcuchowy tkankowy aktywator plazminogenu (sc-tPA).

Figura 3 pokazuje wielkość pobudzenia przez BIDS aktywacji plazminogenu przez dwułańcuchowy tkankowy aktywator plazminogenu (tc-tPA).

Figura 4 przedstawia wielkość pobudzenia przez RCDS aktywacji plazminogenu przez sc-tPA.

Figura 5 przedstawia wielkość pobudzenia przez RCDS aktywacji plazminogenu przez tc-tPA.

177 218

Figura 6 przedstawia wpływ pobudzający lizę skrzepu ludzkiego osocza, wywierany przez BIDS.

Figury wykraczające poza wynalazek podano w celach poznawczych.

Niżej podane przykłady ilustrują wynalazek.

Przy kład 1.

(1) Przygotowanie DS z grzebieni kogucich.

Jeden kilogram grzebieni kogucich rozdrobniono, gotowano w gorącej wodzie i trawiono w temperaturze 50°C przez 12 godzin używając 5 g pronazy (Pronase™, Kaken Pharmaceutical co., Ltd.). Strawioną mieszaninę filtrowano przez ziemię okrzemkową, a przesącz doprowadzono do pH 5,8-6,3 i trawiono w temperaturze 50°C przez 3 godziny używając 1000 TRU hialuronidazy otrzymanej z bakterii Streptomyces (Seikagaku Corp.). Do strawionej mieszaniny dodano NaCl do 0,65 M i nałożono na kolumnę z anionowej żywicy jonowymiennej 3 x 20 cm (Diaion®™ HPA-10, Mitsubishi Kasei Corp.) zbuforowaną roztworem 0,5 M NaCl. Kolumnę przemywano kolejno roztworami 0,5 1 0,65 M NaCl i 0,3 1 1,1 M NaCl, a następnie eluowano roztworem 1,8 M NaCl. Eluowane frakcje zbierano i osuszano pod zmniejszonym ciśnieniem. Połączone stężone frakcje dializowano przez noc wobec wody destylowanej. Pozostały dializat zagęszczono do 10 ml i zmieszano z 5 M NaOH, tak by powstał roztwór 0,5 M NaOH. Zasadowy roztwór inkubowano przez 90 minut w 37°C, schłodzono i zobojętniono kwasem octowym lodowatym. Zobojętniony roztwór zmieszano z dwukrotną objętością etanolu. Powstały strąt przemywano kolejno etanolem 70%, czystym etanolem i eterem i suszono w obecności pięciotlenku fosforu pod zmniejszonym ciśnieniem.

g wysuszonego strątu pozostawiono w 125 ml wody przez noc, po czym niewielką ilość nie rozpuszczonego strątu usunięto przez odwirowanie w 10°C przy 1000 rpm przez 15 minut. Nadsącz rozcieńczono 125 ml 10% wodnego roztworu octanu sodu, zmieszano z etanolem do stężenia końcowego 45% i pozostawiono w 4°C przez 20 godzin. Odwirowane strąty przemywano kolejno etanolem 90%, czystym etanolem i eterem i suszono w obecności pięciotlenku fosforu pod zmniejszonym ciśnieniem, co dało czystą sól sodową DS (określaną jako RCDS).

Izolacja i oczyszczanie siarczanów dermatanu z grzebieni kogucich może być wykonane nie tylko opisaną powyżej metodą ale również sposobami wyjawionymi w Japanese Examined Patent Application Nos. 9042 (1985) i 21241 (1986).

(2) Usuwanie heparyny (Hep) i siarczanu heparanu (HS) z DS.

Niewielką ilość Hep i HS zanieczyszczającą DS można usunąć jedną z poniższych metod.

1) Metoda oparta na chromatografii jonowymiennej.

Pięćdziesiąt gramów RCDS uzyskanego przez uprzednią metodę (1) nałożono na żywicę jonowymienną Diaion®™ HPA11 (Mitsubishi Kasei Corp.) zbuforowaną uprzednio 1,1 M NaCl, w kolumnie 4,5 x 27 cm, przemytą 8 1 roztworu 1,5 M NaCl. Spulowany eluat stężono przy użyciu wyparki obrotowej, dializowano i precypitowano dodaniem etanolu do stężenia 42% lub liofilizowano w celu uzyskania standardowego RCDS (RCDS-H(-) wolnego od Hep iHS).

2) Metoda rozkładu kwasem azotowym.

Rozkład wykonano sposobem Shively i Conrad (Biochemistry, 15, 3932-3942, 1976). Mieszaninę 400 ml roztworu 0,124 g/ml azotanu baru i 400 ml roztworu 1 N H2SO4 przygotowaną w temperaturze -10°C, odwirowano przy 3000 rpm przez 2 minuty uzyskując 500 ml nadsączu. 500 ml 0,1 mg/ml RCDS zmieszano z 500 ml nadsączu i pozostawiono przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Mieszaninę zobojętniono roztworem Na2CO3. Procesy wykonane po kondensacji przeprowadzono jak w sposobie 1) w celu uzyskania standardowego RCDS (DCDS-H(-) wolnego od Hep i HS).

Przykład 2. Przygotowanie DS ze śluzówki wołowego jelita cienkiego.

Dziesięć kilogramów wołowych jelit cienkich pocięto na kawałki, po czym usunięto zawartość i tłuszcz, a następnie wyizolowano śluzówkę. Śluzówkę zmieszano z NaOH, dopełniono do 3 1 roztworem 2,5 M NaOH i ekstrahowano w 37°C przez 2 godziny. Ekstrakt zobojętniono, przefiltrowano przez ziemię okrzemkową dializowano i odwirowano w celu uzyskania nadsączu. Nadsącz zmieszano z równą objętością etanolu i 5 g octanu sodu w celu

177 218 uzyskania precypitatu. Zebrany precypitat rozpuszczono w 0,65 M roztworze NaCl a następnie w sposób podobny do opisanego w przykładzie 1, nałożono na kolumnę z żywicy jonowymiennej. Kolumnę przemywano kolejno roztworami 0,65 M i 1,1 M NaCl i eluowano roztworem 1,5 M NaCl. Połączone eluowane frakcje dializowano wobec wody destylowanej po czym zmieszano dializat z octanem wapnia i kwasem octowym do stężenia końcowego, odpowiednio, 5% i 0,5 M. Do roztworu dodano etanol i zebrano frakcje precypitujące przy stężeniach 15-30% obj/obj. Zebrane frakcje poddano konwersji do soli sodowej przy użyciu żywicy jonowymiennej, przemyto i wysuszono w sposób podobny do opisanego w przykładzie 1 w celu uzyskania soli sodowej DS (określanej jako BIDS).

Hep i HS usunięto z BIDS w sposób podobny jak w przykładzie 1 (2) 2) w celu uzyskania BIDS-H(-).

Porównanie charakterystycznych właściwości siarczanów dermatanu przeprowadzono z użyciem siarczanu dermatanu ze świńskiej śluzówki jelita (Celsius Lab. Inc. i dostarczanej przez Cosmobio Co. Ltd.) i ze świńskiej skóry (Sekagaku Corp.).

Przykład 3. Porównanie własności fizykochemicznych różnych siarczanów dermatanu z różnych źródeł.

(1) Oznaczenie średniej masy cząsteczkowej.

Średnią masę cząsteczkową DS oznaczono w oparciu o metodę Arai i in., (Biochim. Biophys. Acta 1117, 60-70, 1992). Wykonano filtrowanie na żelu ciekłofazową chromatografią wysokiej rozdzielczości (HPLC) używając glikozaminoglikanów o znanej masie cząsteczkowej jako próbki odniesienia i oznaczono średnią masę cząsteczkową eluowanych frakcji. Przygotowano serię kolumn, składającą się z TSKgelG4000PWXL, g3000PWXL i g2500PWXL (TOSOH Corp.) o średnicy wewnętrznej 7,8 mm i długości 300 mm, eluowaną roztworem 0,2 M NaCl o przepływie 0,6 ml/min. i wykrywano refraktometrią różnicową.

(2) Analiza składu dwucukrów.

Określenie położenia reszty kwasu siarkowego wykonano zgodnie z New Biochemical Experiments 3, Saccharide II, str. 49-62 (1991) (wydane przez Tokyo Kagaku Dozin Co., Ltd.). DS trawiono chondroitynazą ABC, a uzyskany dwucukier posiadający nienasycone wiązanie (dwucukier nienasycony) badano HPLC i porównywano ze wspomnianym powyżej nienasyconym dwucukrem traktowanym chondro-6-sulfatazą. Warunki trawienia chondroitynazą ABC, desulfatacji przy użyciu chondro-6-sulfatazy i analizę HPLC opisano poniżej.

a) Trawienie chondroitynazą ABC.

Zgodnie z procedurą Yoshidy (Anal. Biochem., 77, 327-332 (1989)) do 20 ml wodnego roztworu zawierającego 10 mg/ml DS, 20 ml 0,4 M buforu TRIS (pH 8,0), 20 ml 0,4 M octanu sodu i 20 ml 0,1% albuminy surowicy wołowej dodano 120 ml wody, a następnie 20 ml 5 U/ml chondroitynazy ABC i inkubowano w 37°C przez 2 godziny.

b) Trawienie chondro-6-sulfatazą.

Do 100 ml opisanego powyżej produktu trawienia chondroitynazą. ABC, dodano 20 ml 5 U/ml chondro-6-sulfatazy rozpuszczonej w 20 mM buforze Tris-kwas octowy i inkubowano w 37°C przez 2 godziny.

c) Analiza HPLC.

Pięćdziesiąt mikrolitrów roztworu trawionego chondroitynazą ABC lub następnie trawionego chondro-6-sulfatazą analizowano w aparacie HPLC (Hitachi Ltd.). Używano kolumny jonowymiennej (YMC-Pack PA-120-S5, 2,6 mm wewnętrznej średnicy i wysokości 250 mm) po czym mierzono absorbancję przy długości fali 232 nm. Elucję wykonano przy przepływie 1,5 ml/minutę w gradiencie 800 mM wodorofosforanu sodu od 0% do 100°% w ciągu godziny. Zidentyfikowano piki eluowanych nienasyconych dwucukrów posiadających resztę kwasu siarkowego w różnych położeniach.

(3) Oznaczanie lepkości wewnętrznej.

Oznaczenie lepkości wewnętrznej przeprowadzono zgodnie z Japanese Pharmacopea XII przy użyciu automatycznego wiskometru (Rigosha Co., Ltd., typ VMC-052). Jako rozpuszczalnika użyto roztworu 0,2 M NaCl, jak również w celu oznaczenia czasu przepływu w wiskometrze Ubbelohde. Oznaczenie lepkości wykonano w temperaturze 30±0,1°C w oparciu o trzy kolejne czasy przepływu o różnicy w granicach 0,1 sekundy, które posłużyły do wyliczę8

177 218 nia lepkości wewnętrznej. Czasy przepływu zaokrąglono do 0,01 sekundy i wyliczono wartości lepkości wewnętrznej na podstawie poniższego wzoru:

η red = (t_s /to - 1)/ C w którym ts = czas przepływu dla roztworu; to = czas przepływu rozpuszczalnika i C = stężenie próbki (wag./wag.%).

Zredukowaną lepkość (η red = (ts /to - 1)/ C) naniesiono na oś pionową w odniesieniu do stężenia na osi poziomej i lepkość wewnętrzną uzyskano z przecięcia osi pionowej przez ekstrapolację linii prostej do stężenia 0.

(4) Wyniki. _r

Tabela 1 podsumowuje wyniki eksperymentów (1)-(3). Średnia masa cząsteczkowa DS uzyskanego z grzebienia koguciego wynosiła 38000, z lepkością wewnętrzną 1,21. W przeciwieństwie do powyższego, inne trzy DS miały zupełnie inne własności fizykochemiczne i posiadały średnią masę cząsteczkową 14000-16000 i lepkość wewnętrzną równą 0,44-0,68, co wskazuje na znaczące różnice pomiędzy DS uzyskanym z grzebienia i uzyskanymi z innych źródeł. Średnia masa cząsteczkowa DS uzyskanych z wołowego i świńskiego jelita wynosiła, odpowiednio, 16000 i 18500 oznaczone metodą wynalazców, jak to pokazano w tabeli 1, mimo danych z literatury określających je, odpowiednio, na 25000 (Thromb. Res., 71, 417-422, 1993) i 35000 (Blood, 74, 1577-1582,1989).

' Tabela 1

Właściwości fizykochemiczne różnych siarczanów dermatanu

Siarczan dermatanu	Jelito wołowe	Jelito świńskie	Skóra świńska	Grzebień koguci
Średnia masa cząsteczkowa	16000	18500	14000	38000
Lepkość wewnętrzna	0,68	0,58	0,44	1,21
Skład dwucukrowy (%) ADi-0S	0,69	0,69	0,34	4,97
ADi-6S	2,52	4,85	0,85	4,41
ADi-4S	87,22	83,83	90,22	82,91
ADi-diS_D	0,16	0,61	0,22	0,92
ADi-diS_B	7,65	6,31	8,38	6,13
ADi-diSe	1,58	3,59	0,00	0,65
ADi-triS	0,18	0,24	0,00	0,00

Skróty oznaczające skład dwucukrowy pokazano w tabeli 2.

177 218

	R1	R2	R3
ADi-0S	H	H	H
ADi-6S	SO3·	H	H
ADi-4S	H	SO3'	H
ADi-diS_D	SO₃’	H	so_3-
ADi-diSa	SO₃’	SO3'	H
ADi-diSa	H	SOj'	SO₃-
ADi-triS	SO₃'	SO₃'	SO/

Niniejszy wynalazek może być wyjaśniony szczegółowo przez następujące praktyczne przykłady.

Przykład 4. Oznaczanie Hep i HS w DS.

1) Sposób. Oznaczanie Hep i HS w DS może być wykonane przy pomocy następujących trzech sposobów.

a) Sposób oparty na trawieniu enzymami.

Następujące trzy enzymy trawią wyłącznie Hep i HS, ale nie trawią DS (New Biochemical Experiments, 3, Saccharide II, str. 244-249, 1991, wydane przez Tokyo Kagaku Dozin Co., Ltd.), stąd właściwości tych użyto do oznaczeń. Do 500 pg DS uzyskanego w przykładzie 1 lub 2, dodano trzy enzymy: 20 mU heparytynazy I, 20 mU heparytynazy II i 50 mU heparytynazy IV, rozpuszczonych w 10 pl 20 mMl buforu tris-HCl, 10 mM CaCl? (pH 7,0) i inkubowano w 37°C przez 2 godziny. Mieszaniny reakcyjne analizowano HPLC w tych samych warunkach co używane do oznaczania średniej masy cząsteczkowej w celu wykrycia i oznaczenia powstałych nienasyconych dwucukrów przy użyciu dyfraktometru dyferencyjnej.

b) Oznaczenie aktywności hamującej aktywnego czynnika X wraz z aktywnością pobudzającą antytrombinę III wywieraną przez Hep i HS.

Hep lub HS posiada aktywność hamującą przeciwko aktywnej formie czynnika X (Xa) (określaną dalej jako aktywność anty-Xa), jednego z czynników krzepnięcia, przez aktywację antytrombiny III, podczas gdy DS nie posiada takiej aktywności (Tollfsen, w Heparin, str. 257-273, wyd. David A. Lane i Ulf Lindahl, Edward Arnold, London 1989). Wykorzystując tę właściwość, oznaczano aktywność anty-Xa przy użyciu różnych stężeń Hep w celu znalezienia zakresu wykazującego aktywność hamującą zależną od dawki Hep. Została znaleziona minimalna dawka Hep potrzebna do maksymalnego zahamowania, w której stopień zahamowania oznaczono jako 100%, zaś stopień zahamowania samej antytrombiny III pod nieobecność Hep uznana została za 0%. Zależność wykreślono w celu określenia krzywej kalibracyjnej. Podobne oznaczenie przeprowadzono dla próbek DS będących przedmiotem niniejszego wynalazku i określono ilości Hep i HS przez porównanie uzyskanej aktywności anty-Xa z krzywą kalibracyjną.

Przeprowadzono następującą procedurę: 0,3 ml 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 150 ml NaCl, buforu 10 mM CaCl₂, 0,1 ml 1U/ml antytrombiny III (wołowej, Sigma) i 0,1 ml Hep (0,03-2 p/ml, jelito wołowe, Syntex) lub 0,1 ml próbki DS (50-100 pg/ml) wykonanego jako wolny od Hep i HS, jak to opisano uprzednio, zmieszano w 4°C, a następnie mieszaninę in10

177 218 kubowano w 37°C przez 2 minuty. Następnie, do mieszaniny dodano 0,1 ml Xa (7,1 nkat/ml, wołowy, Chromogenie AB Co., Ltd. dostarczany przez Seikagaku Corp.) i inkubowano w37°C. Po 5 minutach dodano 0,1 ml 100 mM syntetycznego substratu (Boc-Ile-Glu-GlyArg-MCA, kod 3094V, Peptide Research Inst.) inkubując w 37°C przez 3 minuty, po czym reakcję przerwano przez dodanie 0,3 ml 30% kwasu octowego. Na koniec, do mieszaniny dodano 1 ml roztworu zawierającego 7 objętości uprzednio wspomnianego 50 mM buforu i 3 objętości 30% kwasu octowego przygotowując próbki do oznaczenia. Oznaczenie wykonano przy pomocy fluorofotometru (Japan Spectroscopic Co., Ltd., FP-777) przy długości fali wzbudzającej równej 350 nm i długości fali fluorescencyjnej równej 444 nm.

Potwierdzono, że aktywność anty-Xa samej antytrombiny III była praktycznie żadna pod nieobecność Hep lub HS w warunkach w jakich wykonywano oznaczenie. Stopień zahamowania obliczono przy użyciu poniższego równania:

A — B stopień zahamowania = 100 - AfZ^ ^x X 1θ(%)

A: oznaczona wartość próbki zawierającej Hep lub DS,

B: wartość uzyskana w obecności bufora zamiast antytrombiny III, Hep lub DS i Xa w wyżej opisanej procedurze,

C: wartość uzyskana w obecności bufora zamiast antytrombiny III Xa w wyżej opisanej procedurze.

c) Oznaczenie aktywności hamującej w stosunku do aktywnej formy czynnika II, wywieranej przez Hep lub HS poprzez aktywację działania antytrombiny III.

Hep lub HS posiada aktywność hamującą przeciwko aktywnej formie czynnika krzepnięcia II (IIa), jednego z czynników krzepnięcia, wywieraną przez aktywację antytrombiny III, tzn. działanie przeciwtrombinowe (określane dalej jako działanie anty-IIa), podczas gdy DS nie posiada takiej aktywności (Tollfsen, w Heparin, str. 257-273, wyd. David A. Lane i Ulf Lindahl, Edward Arnold, London 1989). Aktywność anty-IIa oznaczono w różnych stężeniach Hep wykorzystując wspomnianą powyżej własność do określenia zakresu zależności od dawki pomiędzy aktywnością hamującą a dawką Hep. Znaleziono minimalną dawkę Hep dla maksymalnego zahamowania, gdzie stopień zahamowania przyjęto jako 100%, zaś stopień zahamowania przy użyciu tylko antytrombiny III pod nieobecność Hep przyjęto jako 0%. Zależność wykreślono w celu określenia krzywej wzorcowej. Podobne oznaczenie przeprowadzono dla próbki DS będącej przedmiotem niniejszego wynalazku, zaś ilość Hep i HS oznaczono przez porównanie uzyskanej aktywności anty-IIa z krzywą wzorcową.

Przeprowadzono następującą procedurę: 0,35 ml 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 150 mM NaCl, 10 mM CaClj, bufor 0,1% albuminy surowicy wołowej i 0,1 ml antytrombiny III (1U/ml wołowa, Sigma) i Hep (0,3-20 pg/ml, jelito wołowe, Syntex) lub DS (50-100 (ig/ml) przygotowanego jako wolny od Hep lub HS jak to opisano wcześniej, zmieszano w temperaturze 4°C, a następnie inkubowano przez 2 minuty w 37°C. Następnie, do mieszaniny dodano 0,05 ml IIa (50 mU/ml, wołowa, Boehringer) i inkubowano mieszaninę w 37°C. Po 5 minutach do mieszaniny dodano 0,1 ml 70 mM syntetycznego substratu Boc-Val-Pro-Arg-MCA (kod 3093V, Peptide Research Inst.) i inkubowano przez 3 minuty w 37°C. Reakcję przerwano przez dodanie 0,3 ml 30% kwasu octowego. Na koniec, do mieszaniny dodano 1 ml roztworu zawierającego 7 objętości uprzednio wspomnianego 50 mM buforu i 3 objętości 30% kwasu octowego przygotowując próbki do oznaczenia. Oznaczenie wykonano przy pomocy fluorofotometru (Japan Spectroscopic Co., Ltd., FP-777) przy długości fali wzbudzającej równej 350 nm i długości fali fluorescencyjnej równej 444 nm. Potwierdzono, że aktywność anty-IIa samej antytrombiny III była praktycznie żadna pod nieobecność Hep lub HS w warunkach w jakich wykonywano oznaczenie. Stopień zahamowania obliczono przy użyciu poniższego równania:

st — B ztopień zahamowanóa = 100 — ę x 000(%)

A: oznaczona wartość próbki zawierającej Hep lub DS,

B: wartość uzyskana w obecności bufora zamiast antytrombiny III, Hep lub DS i IIa w wyżej opisanej procedurze,

C: wartość uzyskana w obecności bufora zamiast antytrombiny III w wyżej opisanej procedurze.

2) Wyniki.

Wyniki uzyskane z użyciem opisanych powyżej trzech metod przedstawione są w tabeli 3. Tabela 3

	Metoda a)	Metoda ó)	Metoda c)
BIDS-H (-)	0,000%	0,013%	0,000%
BIDS-H (-)*	0,000%	0,023%	0,003%
DIDS	0,810%	0,300%	ND
RCDS	0,260%	0,160%	ND

ND: nie wykryto, * próbka woHadd Hep HSS przygotowaaa hhromatografiąjonowymiennąopisaną w przykłddzie 1 (2 ) )).

Przykład 5. Badano na szczurach różnice w czasie trwania stężeń we krwi RCDS, BIDS, RCDS-H (-) i BIDS-H (-) po podaniu.

(1) Materiały i metody.

Użyto samców szczura szczepu Sprague-Dawley (SD) w wieku 6,5-7,5 tygodni (Charles Rivef Japka, Inc.). Jako próbek badanych użyto RCDs, BIDS, RCDS-H (-) i BIDS-H (-). Szczury znieczulono eterem i podano im po 10 mg/kg każdej z próbek do żyły ogonowej. Krew pobierano z żyły głównej dolnej w 5 i 120 minut po podaniu, w znieczuleniu eterem, do probówek zawierających 1 objętość 3,2% kwasu cytrynowego na 9 objętości krwi. Osocze wyizolowano phded odwirowanie i nzaaczonn ilość DS w osoczu w oparciu o New Biochemical Experiments 3, Saccharide II, str. 49-62 (1991), wydane przez Tnbyo Kagaku Dozin Co., Ltd., w następujący sposób: osocze wysalano przez kolumnę PD-10®™ (Pharmacia Binchemicals Inc.), linfiliznwαao, trawiono chondroitynazą ABC, ultrafiltrowann przez błonę przepuszczającą cząstki do masy cząsteczkowej 5000 Da i powstały przesącz aaαliznwαao HPLC.

(2) Wyniki.

Wyniki wyrażono jako względny odsetek pozostałości (%) DS w stosunku do podanego w czasie 0 (zero) i pokazano os figurze 1. Odsetki pozostałości RCDS-H i RCDS-H (-) były około dwukrotnie wyższe w porównaniu z BIDS i BIDS-H (-) po 5 minutach po podaniu. RCDS i RCDS-H (-) wykazywały odsetki pozostałości rzędu około 10% po 120 minutach po podaniu, podczas gdy BIDS był trudno wykrywalny. RCDS-H (-) wykazywał nieco wyższy odsetek pozostałości niż RCDS w 5 i 120 minut po podaniu.

Przykład 6. Badano pr·deciwzakrdepowy wpływ Dsw modelu zakrzepmy żyły głównej dolnej szczura.

(1) Materiały.

Użyto 6,5-7,5 tygodniowych samców szczura Sprsgue-Dswley (SD) (Charles River Japso, Inc.). Jako DS użyto RCDS i BIDS.

(2) Metody.

Przygotowanie doświadczalnego modelu zakrzepłcy.

Szczurzy model zakrzepicy phzyontowaao w oparciu o metodę Reyersa i in., (Thromb. Res., 18, 669-674 (1980)). Pokrótce, Nabóot-Daioiponn Phahmkceutical Co., Ltd.) i podwiązano żyłę główną dolną tuż poniżej lewej żyły nerkowej przy użyciu szwu chirurgicznego (nr 7, średnica 0,48-0,56 mm; Shin-ei Co., Ltd.). Badane próbki RCDS i BIDS podano do żyły ngoonwej w dawce 1, 3 i 10 mg/kg na minutę przed podwiązaniem. Grupie kontrolnej

177 218 podano roztwór fizjologiczny soli. Szczury poddano laparotomii w znieczuleniu eterowym w 3 godziny po podwiązaniu, zaś żyły nacięto w celu wydobycia zakrzepów. Pozostawiono je przez noc w temperaturze 37°C po czym mierzono ich suchą masę. Uzyskane dane analizowano metodą Newmana-Keulsa.

Wyniki.

Wyniki pokazano w tabeli 4. Względna sucha masa zakrzepów obu grup DS, którym podano 1 mg/kg w porównaniu z grupą kontrolną wykazywała 60% stopień zahamowania. Jednakże masa zakrzepów grupy otrzymującej RCDS, w stosunku do grupy kontrolnej, zmniejszała się 2,4% i 0,0% w dawkach 3 i 10 mg/kg i więcej, podczas gdy w grupie BIDS zmniejszała się tylko 34,1% i 2,4% w porównaniu z grupą kontrolną, co wskazywało na użyteczność rcdS.

Tabela 4

Test przeciwzakrzepowy u szczurów, model zakrzepicy żyfy głównej dolnej

Próbka badana	Dawka (mg/kg)	Średnia sucha masa zakrzepu (mg)	Względny odsetek pozostałości (%)
Roztwór soli	-	41±0,7	100,0
	1	2,5±0,9	61,0
RCDS	3	0,1±0,1**	2,4
	10	0,0±0,0**	0,0
	1	2,6±0,6	63,4
BIDS	3	1,4±0,8*	34,1
	10	0,1±0,1**	2,4

* , p < 0,05, ** ; p < 0,01, w porównaniu z grupą kontrolną.

W grupie kontrolnej znajdowało się 14, zaś w obu grupach DS znajdowało się po 6 szczurów.

Przykład 7. Badano wpływ DS na trombogenezę i trombolizę w modelu zakrzepicy żyły głównej dolnej u szczurów.

(1) Materiały.

Używano 6,5-7,5 tygodniowych samców szczurów Sprague-Dawley (SD) (Charles River Japan, Inc.). Jako dS użyto RCDS i BIDS.

(2) Metody.

1) Przygotowanie modelu eksperymentalnej zakrzepicy.

Szczurzy model zakrzepicy przygotowano przez podwiązanie żyły głównej dolnej w sposób podobny do opisanego w przykładzie 6. Próbki badane podawano do żyły ogonowej w dawkach 3, 10 i 30 mg/kg w objętości 0,5 ml/kg. Grupa kontrolna otrzymała roztwór fizjologiczny soli. W grupie kontrolnej 6 godzin po podwiązaniu i w grupach badanych w 2 godziny po podaniu (8 godzin po podwiązaniu) szczury poddano laparotomii w znieczuleniu eterowym i pobrano krew. Następnie żyły nacięto, zakrzepy pobrano i pozostawiono w 37°C przez noc w celu określenia ich suchej masy. Otrzymane dane analizowano statystycznie metodą Newmana-Keulsa.

2) Przygotowanie frakcji euglobuliny.

W plastikowej probówce umieszczono 0,5 ml osocza i domieszano 9,5 ml mocno oziębionego 0,01 N buforu octanowego (pH 4,85), po czym pozostawiono w lodówce przez 1 godzinę, odwirowano przez 5 minut przy 3000 rpm w celu uzyskania frakcji euglobuliny. Precypitaty zmieszano z 0,5 ml buforu Tris-HCl (pH 7,4) do uzyskania przejrzystego roztworu.

3) Oznaczenie aktywności fibrynolitycznej.

W otworze płytki do badania fibryny umieszczono 10 ml frakcji euglobuliny i pozostawiono w inkubatorze w temperaturze 37°C przez 18 godzin, po czym mierzono obszar fibrynolizy (kwadrat średnicy). Obszar fibrynolizy jest proporcjonalny do mocy aktywności plazminy. Powstałe dane dotyczące fibrynolizy analizowano statystycznie metodą NewmanaKeulsa.

177 218 (3) Wyniki.

Wyniki pokazano w tabeli 5.

W tabeli 5 Kontrola - 6 h. przedstawia grupę poddaną laparotomii w znieczuleniu 6 godzin po podwiązaniu żyły, od której następnie pobrano krew i zakrzepy. Kontrola - 8 h. przedstawia grupę, której podano roztwór soli w 6 godzin po podwiązaniu żyły, od której następnie pobrano krew i zakrzepy po dalszych 2 godzinach.

1) Wpływ na zahamowanie trombogenezy i na trombolizę.

Zakrzepy obserwowano u obu grup, ale znaczne różnice znaleziono wśród grup pokazanych w tabeli 5. Zarówno grupa, której podano RCDS jak i BIDS wykazywała zależne od dawki zmniejszenie masy zakrzepu w porównaniu z grupą Kontrola - 8 h.. Ponadto, grupy otrzymujące 30 mg/kg BIDS jak i RCDS w dawce 10 mg/kg i więcej przedstawiały lzęjsze zakrzepy w porównaniu z grupą Kontrola - 6 h., co wskazuje nie tylko na zahamowanie trombogenezy, ale również efekt trombolityczny. Innymi słowy, RCDS przejawiał mocniejszy wpływ hamujący na trombogenezę i efekt trombolityczny w małych dawkach w porównaniu z grupą otrzymującą BIDS.

2) Wpływ na układ fibrynolityczny.

RCDS i BIDS podawano w dawkach 3, 10 i 30 mg/kg, po czym, po dwóch godzinach oznaczano aktywność plazminy w osoczu (8 godzin po podwiązaniu żył). Wyniki przedstawiono w tabeli 5. Aktywność plazminy w grupach otrzymujących RCDS w dawce 10 mg/kg lub BIDS w dawce 30 mg/kg lub więcej, była w istotny sposób wyższa w porównaniu z grupą kontrolną. Wyniki wskazują na doskonały wpływ RCDS.

Tabela 5

Próbka badana do	Dawka (mg/kg)	Sucha masa zakrzepu (% stosunku do kontroli-6h)	Aktywność fibrynolityczna FA (% stosunku do kontroli-8h)
Kontrola-6h.	-	70 ±9	nie oznaczono
Kontrola-8h.	-	100 ± 11	100 ±4
	3	73 ±9	110±5
RCDS	10	56 ± 12	165±10**
	30	54 ± 11	204±15**
	3	90± 18	108 ±6
BIDS	10	79± 16	114±5
	30	60 ±8	158 ±6**

1); Pole powierzchni dla fibrynolizy w porównaniu z Kontrolą-8h. ** ; p < 0,01.

Masę zakrzepów wyrażono jako % Kontroli-8, którą uznano jako 100%. W grupie Kontrola-8h. znajdowało się 16 szczurów, zaś w innych grupach było po 8-9 szczurów, obliczono ich wartości średnie.

Przykład 8. Test porównawczy wpływu przeciwzakrzepowego DS na szczurzy model DIC wywołanego endotoksyną.

(1) Materiały.

Używano 6,5-7,5 tygodniowych samców szczurów Sprague-Dawley (SD) (Charles River Japan, Inc.). Szczury znieczulano iniekcją dootrzewnową z Nembutalu®™ i nacinano im lewe udo. Do żyły trzewnej wprowadzano wstecznie, w odległości 4 cm od miejsca nacięcia, polietylenową kaniulę (PE-10, Imamura Co., Ltd.) i umocowywano ją. Po wyłonieniu, podawano endotoksynę (Escherichia coli 055:B8, Difco Co., Ltd.) w ciągłym wlewie, przy pomocy strzykawkowej pompy infuzyjnej (Model-22M, HARVARD) w tempie 3,75 mg/kg/h przez 4 godziny. Próbkę badaną RCDS-H (-) lub BIDŚ-H (-), podawano równocześnie z endotoksyną w sposób ciągły w ciągu 4 godzin przez kaniulę wprowadzoną do prawej żyły. Grupa kontrolna otrzymywała taką samą objętość roztworu fizjologicznego soli, równocześnie z grupą otrzymującą próbkę, przez 4 godziny.

177 218 (2) Pozycje badane w teście.

Po podaniu endotoksyny, pobrano krew oraz nerki i zbadano następujące pozycje:

1) Liczbę płytek: płytki liczono przy użyciu automatycznego hemocytometru (Celltac MEK-4500, Nippon Denko Co., Ltd.),

2) Fibrynogen: wyizolowano osocze i oznaczono przy użyciu testu do oznaczania fibrynogenu (Sunassay Fibrinogen®™, wyprodukowany przez NitTo BOSEKI Co., Ltd., dostarczany przez Sanko Junyaku Co., Ltd.).

3) Produkty degradacji fibrynogenu - fibryny (FDP): surowicę wyizolowano i oznaczono przy użyciu odczynnika lateksowego do oznaczania fDp (test FPDL®™, Teikoku Hormone Mfg. Co., Ltd.),

4) Ilość złogów fibrynowych w kłębuszkach nerkowych (% GFD): nerki utrwalono zbuforowanym roztworem 10% obojętnej formaliny, zatopiono w parafinie, skrojono i zabarwiono kwasem fosforowolframowym - hematoksyliną. Kłębuszki nerkowe obserwowano pod mikroskopem w całym polu przekroju nerki, a liczbę złogów fibryny liczono i wyrażano jako odsetek. Powstały wynik analizowano statystycznie metodąNewmana-Keulsa.

(3) Wyniki.

Wyniki pokazano w tabeli 6. Liczba płytek, fibrynogen i FDP wynosiły odpowiednio 75 x 10 * ml, 216 mg/dl i 2,5 mg/ml lub mniej, ponadto, nie stwierdzono w grupie kontrolnej % GFD. Jednakże, szczury z DIC wywołanym podaniem endotoksyny wykazywały nienormalne wartości, odpowiednio, 14 x 10⁴ ml, 35 mg/dl, 34,3 mg/ml i 61%.

Grupa otrzymująca DS-H (-) wykazywała poprawę w zakresie wszystkich parametrów, zaś grupa otrzymująca RCDS-H (-) wykazywała wyniki lepsze w zakresie wszystkich parametrów w porównaniu z grupą, otrzymującą BIDS-H (-). Szczególnie % GFD, będący przyczyną uszkodzenia nerek pozostawał na poziomie 16,1% w grupie BIDS-H (-), podczas gdy grupa RCDS-H (-) wykazywała znaczną poprawę ze zmniejszeniem do 1%, co wskazuje na przydatność RcDŚ-H (-).

Tabela 6

Test porównawczy wpływu przeciwzakrzepowego DS w szczurzym modelu DIC wywołanym endotoksyną

	Dawka (mg/kg/h)	Płytki (x 104 pl)	Fibrynogen (mg/dl)	FDP (pg/ml)	GFD (%)
Normalne	-	75± 1	21(5±5	<2,5	0,0
Kontrola (tylko LPSa)	-	14±1 1	35±3	34± 2,5	60,7±6,3*
RCDS-H (-) + LPS	5,0	22±3	120±6*	4,6 ± 0,4*	1,2±0,7*
BIDS-H (-) + LPS	5,0	18±3	107± 10*	8,6± 2,6*	16,1±5,5*

a; endotoksyną, * , w porównaniu z kontrolą, p > 0,01.

Doświadczenie przeprowadzono na 19 szczurach w grupie normalnej, 20 szczurach w grupie kontrolnej i 7 szczurach w każdej z grup otrzymujących DS, obliczając średnią wartość.

Przykład 9. Wpływ pobudzający DS na aktywację Glu-plazminogenu (naturalnego plazminogenu określanego dalej jako plazminogen) przez t-PA.

(1) Metoda.

Pięćdziesiąt mikrolitrów każdego ze stężeń DS (RCDS, BIDS) lub siarczanu chondroityny (grupa kontrolna), 25 ml 1,6 mM plazminogenu i 25 ml 20 nM jedno- lub dwułańcuchowego t-PA oraz 100 ml 0,6 mM syntetycznego substratu S-2251 (H-D-Val-L-Leu-L-Lysp-nitroanilid · 2 HCl) zmieszano i mierzono absorbancję przy długości fali 405 nm co 2 minuty w automatycznym czytniku płytek. Reakcję przeprowadzano w temperaturze 37°C w buforze zawierającym 50 mM Tris-HCl z Tween'em®™ 80.

177 218

Początkową wielkość aktywacji plazminogenu obliczono w następujący sposób: nachylenie wykresu, A405, absorbancja przy 405 nm w czasie t do kwadratu czasu (DA^/Dt²) podzielono przez 4000 (Chibber, B.A.K. i in., Biochemistry, 1985, str. 3429-3434). Wielkość pobudzenia obliczono ze stosunków DS lub siarczanu chondroityny do warunków kontrolnych, które wykonano w fazie początkowej 1 (jeden).

(2) Wyniki.

Wyniki dla BIDS pokazano na figurach 2 i 3. DS w sposób zależny od dawki pobudzał aktywację plazminogenu 1,5-4,5-krotnie w przypadku jednołańcuchowego t-PA (sc-tPA) i 1,5-3,5-krotnie w przypadku dwułańcuchowego t-PA (tc-tPA), jak to pokazano na tych figurach. W tym samym czasie grupa kontrolna, siarczan chondroityny, wykazywał słabsze pobudzenie maksimum 2,5-krotne w obecności jednołańcuchowego t-PA i maksimum 1,5krotne w obecności dwułańcuchowego t-PA w porównaniu z grupą DS. Figury 4 i 5 pokazują wyniki dla RCDS z wielkościami pobudzenia aktywacji plazminogenu 2,0-4,5-krotnie w obecności jednołańcuchowego t-PA (sc-tPA) i 2,0-4,0-krotnie w przypadku dwułańcuchowego t-PA (tc-tPA).

Przykład 10.

(1) Materiały i metody.

Badano wpływ DS na układ fibrynolityczny szczura.

9-11 tygodniowe samce szczura szczepu Wistar znieczulono Somnopentylem®™ (Kyoritsu Shoji Co., Ltd.) i podano im podskórnie w grzbiet 40 mg/kg DS (BIDS). Po 1, 6, 12 i 24 godzinach pobrano krew strzykawką, zawierającą kwas cytrynowy. Z osocza przygotowano frakcję euglobulin w sposób podobny jak w przykładzie 3 i badano aktywność fibrynolityczną metodą z użyciem płytek fibrynowych. Uzyskane dane analizowano statystycznie metodą Newmana-Keulsa.

Oznaczono ilość DS w osoczu i frakcji euglobulin (New Biochemical Experiments 3, Saccharides II, str. 175-179 (1991)). W grupie kontrolnej używano roztworu soli. Doświadczenia przeprowadzono w określonym czasie uwzględniając okołodzienny rytm aktywności krzepliwej i fibrynolitycznei szczura.

(2) Wyniki.

Uzyskane wyniki pokazane są w tabelach 7 i 8.

DS wykazywał aktywność fibrynolityczną do 12 godzin po podaniu jak to pokazuje tabela 7. Około 70-80% DS w osoczu występuje we frakcji euglobulin i wykazuje aktywność fibrynolitycznąjak to pokazano w tabeli 8. RCDS także dał podobne wyniki.

Tabela 7

Aktywność fibrynolityczną mierzona metodą płytek fibrynowych

Próbka badana	Czas po podaniu (godziny)
6	12	24
Kontrola	57,4±3,6	54,1±3,9	42,3 ± 4,6
DS	88,3± 8,4*	71,9±3,5	46,1±3,7

1: obszar rozpuszczenia fibryny (miĄ * : p < 0,01 w porównaniu z kontrolą.

Zarówno grupa kontrolna jak i grupa DS zawierała po 4-5 szczurów, obliczono wartości średnie.

177 218

Tabela 8

DS w osoczu i frakcji euglobulin (mg/ml)

Frakcja	Czas po podaniu (godziny)
1	6	12	24
Osocze	3,62 ±0,51	3,58 ±0,27	2,20 ± 0,26	0,47 ± 0,04
Euglobuliny	2,51 ±0,62	2,80 ± 0,27	1,60 ±0,16	N.D.
Kontrola	0,03 ± 0,02

N.D nie badano

Zarówno grupa kontrolna jak i grupa DS zawierała po 4-5 szczurów; obliczono wartości średnie.

Przykład 11. Badano wpływ pobudzający DS na lizę ludzkiego skrzepu osocza.

(1) Metoda.

W płytce 96 studzienkowej umieszczono i zmieszano: 40 ml różnych stężeń DS (BIDS) (stężenie końcowe 50,0-200 mg/ml), 20 ml jednołańcuchowego t-PA (stężenie końcowe 166,7 U), 40 ml trombiny (stężenie końcowe 20 U/ml) i 100 ml ludzkiego osocza. Absorbancję przy długości fali 340 nm oznaczono natychmiast po przygotowaniu, a następnie badano co 10 minut w celu znalezienia minimum absorbancji (Min.). Aktywność fibrynolityczną wyrażona jest jako stosunek DS-PLT1/2 (minuty), uzyskane przez podzielenie przez 2 sumy maksimum absorbancji (Max.) i Min., w obecności DS, do Cont-PLTl/2 grupy kontrolnej.

(2) Wyniki.

Wyniki przedstawiono w tabeli 7. DS w sposób zależny od dawki pobudzał aktywność fibrynolityczną osocza wywieraną w stosunku do skrzepu osocza jak to pokazano na figurze 6. RCDS dał podobne wyniki.

Przykład 12. Test toksyczności siarczanu dermatanu po jednorazowej dawce dożylnej podanej myszy.

(1) Materiały i metody.

Użyto pięciotygodniowych myszy szczepu Crj : CD-I płci obojga (Charles River Japan, Inc.). Przygotowano izotoniczne roztwory RCDS-H (-) i BIDS-H (-), przy użyciu sterylnej wody i sterylnego roztworu soli i podano w dawce 2000 mg/kg dożylnie drogą żyły ogonowej przy użyciu szklanej strzykawki. Zwierzęta obserwowano w kierunku objawów toksyczności przez 14 dni.

(2) Wyniki.

W żadnej z grup DS nie obserwowano śmierci nawet przy dużej dawce 2000 mg/kg, jak to pokazano w tabeli 9. Dawka letalna w używanych warunkach badania oceniana jest na ponad 2000 mg/kg.

Tabela 9

Próbka badana	Dawka (mg/kg)	Liczba myszy padłych / Liczba myszy użytych
Samce	Samice
RCDS-H (-)	2000	0/5	0/5
BIDS-H (-)	2000	0/5	0/5

Przykład 13. Preparatyka farmaceutyczna.

(1) 500-5000 mg sterylnej soli sodowej DS (RCDS lub RCDS-H (-)) uzyskanej z grzebienia koguta w sposób opisany w przykładzie 1, rozpuszczono w sterylizowanym roztworze soli lub w sterylnej wodzie destylowanej, uzyskując roztwory izotoniczne, po czym dopełniono je do 100 ml. Roztwory rozporcjowano po 10 ml do szklanych ampułek uzyskując preparaty do wstrzyknięć dożylnych, podskórnych lub domięśniowych.

177 218 (2) Dwieście pięćdziesiąt miligramów soli sodowej DS (RCDS lub RCDS-H (-)) uzyskanej z grzebienia koguta w sposób opisany w przykładzie 1 i 1000000 IU t-PA osobno zapakowano w celu uzyskania preparatu do wstrzyknięć, który może być rozpuszczony w roztworze tuz przed użyciem. Preparaty do wstrzyknięć używane są do wstrzyknięć do tętnic wieńcowych i dożylnych.

Możliwości wdrożenia przemysłowego.

Równoczesne zastosowanie siarczanów dermatanu lub ich dopuszczalnych farmakologicznie soli włączając sole sodowe i pobudzają aktywność fibrynolityczną i mogą być użyte do pobudzania trombolizy.

Ponadto, szczególne siarczany dermatanu, tzn. siarczany dermatanu posiadające lepkość wewnętrzną rzędu 0,8 dl/g lub więcej; uzyskane z grzebienia koguta, o ADi-OS rzędu 2-7% w ich dwucukrach i średniej masie cząsteczkowej rzędu 25000-100000, określone filtracją na żelu opisaną w Biochim. Biophys. Acta, 1117, 60-70 (1992) lub wyżej wspomniane siarczany dermatanu posiadające bardzo niską zawartość heparyny lub siarczanu heparanu lub ich farmakologicznie dopuszczalnych soli, utrzymują efektywne stężenia we krwi przez czas dłuższy i zapobiegają rozszerzaniu się zakrzepicy, hamują trombogenezę itp.

Stąd, środki przeciwzakrzepowe będące przedmiotem niniejszego wynalazku są użyteczne w leczeniu i zapobieganiu zawałowi mięśnia serca, zespołowi wykrzepiania wewnątrznaczyniowego (DIC), urazu wielonarządowego towarzyszącego uogólnionej zakrzepicy, zakrzepowemu zapaleniu żył głębokich itd. Ponadto, środki mogą być wskazane podczas krążenia pozaustrojowego jak sztuczna dializa u pacjentów cierpiących na niewydolność nerek itp. Ponadto, DS przejawia mniej objawów niepożądanych jak krwawienia, itp. w porównaniu z Hep. DS-H (-) uzyskany przez usunięcie Hep i HS z DS zapewnia zwiększone bezpieczeństwo wraz ze znacznie mniejszymi objawami niepożądanymi jak krwawienie, itp. Stąd powstały produkt szczególnie może być wskazany dla pacjentów ze skłonnością do krwawień lub zmniejszoną liczbą płytek i czynników krzepnięcia.

m 218

177 218

Stężenie (pg/ml)

177 218

Fig. 4

CD •r—ł c

CD

N

Ό

Z3

JD

O

CL

O xn o

-y

I”ł CD

Stężenie (pg/ml)

Fig. 5

CO •c-t c

CD

N

Ό

CJ

JD

O

CL

XJ xn o

CD

Stężenie (pg/ml)

177 218

Fig- 6

Wielkość w stosunku do grupy kontrolnej

Stężenie siarczanu dermatanu Log (gg/ml)

177 218

ODSETEK POZOSTAŁOŚCI (¾)

Fig. 1

Czas po podaniu (min.) o RCDS ° RCDS-H (-) ω BIDS δ BIDS-H (-)

X oznacza nakładanie się O <S> i

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz. Cena 4,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Siarczany dermatanu i ich sole o lepkości wewnętrznej rzędu 0,8 dl/g lub więcej, oznaczone wiskometrem Ubbelohde przy użyciu 0,2 M roztworu chlorku sodu jako rozpuszczalnika w temperaturze 30±0,1°C.
2. Siarczany dermatanu i ich sole według zastrz. 1, o lepkości wewnętrznej 0,9-2,0 dl/g.
3. Siarczany dermatanu i ich sole według zastrz. 1, znamienne tym, że uzyskane są z grzebienia koguta.
4. Siarczany dermatanu i ich sole według zastrz. 1, posiadające 2-7% ADi-OS w ich dwucukrach zrębowych oznaczone metodą enzymatyczną i chromatografię ciekłofazową wysokiej rozdzielczości.
5. Siarczany dermatanu i ich sole według zastrz. 1, posiadające masę cząsteczkową 25000-100000 oznaczone filtracją na żelu według Biochim. Biophys. Acta, 1117, 60-70 (1992).
6. Siarczany dermatanu i ich sole według zastrz. 1, gdzie siarczany dermatanu zawierają 0,15% lub mniej heparyny lub siarczanu heparanu oznaczone metodą z użyciem enzymu degradującego heparynę i siarczany heparanu i chromatografię ciekłofazową. wysokiej rozdzielczości, 0,07% lub mniej heparyny lub siarczanu heparanu oznaczone przez działanie hamujące na aktywny czynnik X w obecności antytrombiny III z użyciem heparyny uzyskanej z jelita wołowego jako substancji odniesienia; lub 0,05% lub mniej heparyny lub siarczanów heparanu oznaczone działaniem hamującym na aktywny czynnik II w obecności antytrombiny III z użyciem heparyny uzyskanej z jelita wołowego jako substancji odniesienia.
7. Środki przeciwzakrzepowe, znamienne tym, że zawierają siarczany dermatanu lub ich farmakologicznie dopuszczalne sole w dopuszczalnej farmakologicznie ilości razem z farmakologicznie dostępnymi dodatkami.
8. Środki przeciwzakrzepowe według zastrz. 7, znamienne tym, ze zawierają siarczany dermatanu lub ich farmakologicznie dopuszczalne sole pochodzące z grzebienia koguta.
9. Środki przeciwzakrzepowe według zastrz. 7, znamienne tym, ze jako składniki aktywne zawieraj;; siarczany dermatanu lub ich farmakologicznie dopuszczalne sole posiadające 2-7% ADi-OS w ich dwucukrach zrębowych oznaczone metodą enzymatyczną i chromatografią ciekiofiizową wysokiej rozdzielczości.
10. Środki przeciwzakrzepowe według zastrz. 7, znamienne tym, że zawierają siarczany dermatanu jako składniki aktywne lub ich farmakologicznie dopuszczalne sole posiadające średnią masę cząsteczkową 25000-100000 oznaczone filtracją na żelu według Biochim. Biophys. Acta, 1117, 60-70 (1992).
11. Środki przeciwzakrzepowe według zastrz. 7, znamienne tym, że jako składniki aktywne zawierają siarczany dermatanu lub ich farmakologicznie dopuszczalne sole o lepkości wewnętrznej rzędu 0,8 dl/g lub więcej, oznaczone wiskometrem Ubbelohde przy użyciu 0,2 M roztworu chlorku sodu jako rozpuszczalnika w temperaturze 30±0,1°C.
12. Środki przeciwzakrzepowe według zastrz. 11, znamienne tym, że lepkość wewnętrzna wynosi 0,9-2,0 dl/g.
13. Środki przeciwzakrzepowe według zastrz. 7, znamienne tym, że zawierają siarczany dermatanu zawierające 0,15% lub mniej heparyny lub siarczanu heparanu oznaczone metodą z użyciem enzymu degradującego heparynę i siarczany heparanu i chromatografię ciekłofazową wysokiej rozdzielczości, 0,07% lub mniej heparyny lub siarczanu heparanu oznaczone przez działanie hamujące na aktywny czynnik X w obecności antytrombiny III z użyciem heparyny uzyskanej z jelita wołowego jako substancji odniesienia; lub 0,05% lub mniej heparyny lub siarczanów heparanu oznaczone działaniem hamującym na aktywny czynnik II

177 218 w obecności antytrombiny III z użyciem heparyny uzyskanej z jelita wołowego jako substancji odniesienia.

Wynalazek dotyczy siarczanów dermatanu oraz środków przeciwzakrzepowych zawierających siarczany dermatanu jako substancję czynną, zapobiegających tworzeniu się skrzepów i pobudzający ich lizę.

Zakrzepica jest chorobą spowodowaną krzepnięciem krwi w zdrowych naczyniach krwionośnych, z powodu zburzenia równowagi pomiędzy płytkami, krzepnięciem i układem fibrynolitycznym, który zasadniczo powinien utrzymywać płynność krwi w naczyniach krwionośnych. Zakrzepy w tętnicach wieńcowych mogą powodować zawał mięśnia sercowego, zaś w naczyniach żylnych kończyn dolnych mogą spowodować zakrzepowe zapalenie żył głębokich. Nieprawidłowa aktywacja układu krzepnięcia z powodu ciężkich chorób zakaźnych lub nowotworów prowadzi do zakrzepów w układowych naczyniach kapilarnych i w wyniku powoduje zespół wykrzepiania wewnątrznaczyniowego (określany jako DIC). DIC wywołany przez ciężkie zakażenia powoduje często uszkodzenia wielu narządów i daje złe rokowania. Wypracowano wiele środków zaradczych w celu leczenia zakrzepicy, która wykazuje krańcowo różne objawy w zależności od umiejscowienia. Do leczenia zawału serca i zakrzepowego zapalenia żył głębokich używa się urokinazy, aktywatora plazminogenu tkankowego (określanego jako t-PA) czy heparyny, która znajduje również zastosowanie w DIC. Jednakże, wadą urokinazy jest słabe powinowactwo do fibryny, zaś t-PA jest drogi i posiada bardzo krótki okres półtrwania. Na dodatek, przezskórna śródnaczyniowa rekanalizacja tętnic wieńcowych i leczenie reperfuzją, przez bezpośrednie podanie dożylne t-PA powoduje nawrót zakrzepicy. Heparyna stwarza problemy wymagając ściśle określonego stężenia, w celu zapewnienia pożądanego efektu i wywarcia efektu terapeutycznego. Ponadto, lek ten powoduje poważne niepożądane efekty w postaci krwawień, stąd w celu zwalczenia wspomnianych niepożądanych objawów opracowano syntetyczne leki o aktywności anty-proteolitycznej. Jednakże, nie uzyskano wystarczających efektów zapobiegających niepożądanym objawom i stąd problemy, jak np. krańcowo krótki okres półtrwania, pozostały nierozwiązane.

Opisano aktywność przeciwzakrzepową siarczanów dermatanu wywieraną przez kofaktor II heparyny oraz ich aktywność fibrynolityczną przez opisane uwalnianie t-PA (Abbadini, M. i in., Blood, 1987, 70, 1858-1860), jednakże są doniesienia o braku wpływu siarczanów dermatanu na ilość t-PA i aktywność fibrynolityczną (Tripodi, A. i in., Thromb. Res., 1991, 62, 663-672) stąd ostateczny wpływ na układ fibrynolityczny pozostaje niejasny.

Siarczany dermatanu, używane w wielu doświadczeniach lub jako lek poddawany badaniu, uzyskiwane są z jelit lub skóry świńskiej lub wołowej (Fareed, J. i in., Recent Advances in Blood Coagulation, 1993, 6, 169-187). Nieznana jest aktywność siarczanów dermatanu uzyskanych z innych źródeł.

Wynalazcy, będący autorami niniejszego wynalazku, badali wpływ siarczanów dermatanu na układ fibrynolityczny i stwierdzili, że aktywność trombolityczna jest wzmocniona w jego obecności w porównaniu z jego nieobecnością. Dodatkowo stwierdzili, ze skumulowana aktywność przeciwzakrzepowa siarczanu dermatanu wprowadzonego do żywego organizmu w połączeniu z zarówno aktywnością przeciwkrzepliwą jak i fibrynolityczną jest szczególnie znacząca dla specyficznych siarczanów dermatanu o lepkości wewnętrznej rzędu 0,8 dl/g lub więcej; specyficznych siarczanów dermatanu uzyskanych z grzebienia koguta, specyficznych siarczanów dermatanu posiadających ADi-OS rzędu 2-7% w ich dwucukrach zrębowych lub specyficznych siarczanów dermatanu posiadających średnią masę cząsteczkową rzędu 25000-100000 określone metodą opisaną niżej i dodatkowo szczególnie siarczany dermatanu posiadające bardzo niską zawartość heparyny i siarczanu heparanu w opisanych wyżej siarczanach dermatanu.

Niniejszy wynalazek dotyczy antykoagulantów zawierających jako aktywny składnik siarczany dermatanu omówionej wyżej.

177 218

Struktura podstawowa siarczanów dermatanu oparta jest na powtarzającym się dwucukrze, zbudowanym z siarczanu N-acetylo-D-galaktozaminy i kwasu L-iduronowego, zawierającym niewielką ilość kwasu D-glukuronowego i posiadającym różną zawartość kwasu siarkowego i D-glukuronowego oraz różne miejsca wiążące kwas siarkowy itd., zaleznie od źródła, gatunku zwierzęcia i narządu itp.

Siarczany dermatanu mogą być wytwarzane z surowych materiałów pochodzących od ssaków itd., jak wołowa i świńska śluzówka jelita czy skóra lub z grzebieni kogucich.

Wynalazcy stwierdzili, że specyficzne siarczany dermatanu o lepkości wewnętrznej rzędu 0,8 dl/g lub więcej; najkorzystniej 0,9-2,0 dl/g, uzyskane z grzebienia koguta, o ADi-OS rzędu 2-7%; najkorzystniej 3-6%, w ich dwucukrach i średniej masie cząsteczkowej rzędu 25000-100000; najkorzystniej 30000-50000 określone filtracją na żelu opisaną w Biochim. Biophys. Acta, 1117, 60-70 (1992), szczególnie te, które posiadają bardzo niską zawartość heparyny lub siarczanu heparanu lub ich farmakologicznie dopuszczalne sole, wprowadzone do żywego organizmu mogą pozostawać przez czas dłuższy w krwi w porównaniu z innymi siarczanami dermatanu i wykazują efekt farmakologiczny uogólnionej aktywności przeciwzakrzepowej nie tylko z aktywnością fibrynolityczną ale również z aktywnością przeciwkrzepliwąi realizują niniejszy wynalazek.

Tak więc, przedmiotem wynalazku są siarczany dermatanu i ich sole o lepkości wewnętrznej rzędu 0,8 dl/g lub więcej, oznaczone wiskometrem Ubbelohde przy użyciu 0,2 M roztworu chlorku sodu jako rozpuszczalnika w temperaturze 30±0,1°C, korzystnie o lepkości wewnętrznej 0,9-2,0 dl/g.

Korzystnie siarczany dermatanu uzyskuje się z grzebienia koguta.

Siarczany dermatanu i ich sole posiadają 2-7% ADi-OS w ich dwucukrach zrębowych oznaczone metodą enzymatyczną i chromatografię ciekłofazową wysokiej rozdzielczości, masę cząsteczkową. 25000-100000 oznaczoną filtracją na żelu według Biochim. Biophys. Acta, 1117, 60-70 (1992), przy czym siarczany dermatanu zawierają 0,15% lub mniej heparyny lub siarczanu heparanu oznaczone metodą z użyciem enzymu degradującego heparynę i siarczany heparanu i chromatografię ciekłofazową wysokiej rozdzielczości, 0,07% lub mniej heparyny lub siarczanu heparanu oznaczone przez działanie hamujące na aktywny czynnik X w obecności antytrombiny III z użyciem heparyny uzyskanej z jelita wołowego jako substancji odniesienia; lub 0,05% lub mniej heparyny lub siarczanów heparanu oznaczone działaniem hamującym na aktywny czynnik II w obecności antytrombiny III z użyciem heparyny uzyskanej z jelita wołowego jako substancji odniesienia.