HU219017B - Protein kináz-C expressziójának szabályozására szolgáló oligonukleotidok és azok alkalmazása - Google Patents

Protein kináz-C expressziójának szabályozására szolgáló oligonukleotidok és azok alkalmazása Download PDF

Info

Publication number
HU219017B
HU219017B HU9600050A HU9600050A HU219017B HU 219017 B HU219017 B HU 219017B HU 9600050 A HU9600050 A HU 9600050A HU 9600050 A HU9600050 A HU 9600050A HU 219017 B HU219017 B HU 219017B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
sequence
oligonucleotide
pkc
antisense
oligonucleotides
Prior art date
Application number
HU9600050A
Other languages
English (en)
Other versions
HU9600050D0 (en
HUT75834A (en
Inventor
C. Frank Bennett
Russell T. Boggs
Nicholas M. Dean
Original Assignee
Isis Pharmaceuticals Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US08/089,996 external-priority patent/US5703054A/en
Application filed by Isis Pharmaceuticals Inc. filed Critical Isis Pharmaceuticals Inc.
Publication of HU9600050D0 publication Critical patent/HU9600050D0/hu
Publication of HUT75834A publication Critical patent/HUT75834A/hu
Publication of HU219017B publication Critical patent/HU219017B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1137—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/7056—Lectin superfamily, e.g. CD23, CD72
    • C07K14/70564—Selectins, e.g. CD62
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/11—Protein-serine/threonine kinases (2.7.11)
    • C12Y207/11013—Protein kinase C (2.7.11.13)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/321—2'-O-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/322—2'-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
    • C12N2310/341—Gapmers, i.e. of the type ===---===
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
    • C12N2310/346—Spatial arrangement of the modifications having a combination of backbone and sugar modifications
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/352—Nature of the modification linked to the nucleic acid via a carbon atom
    • C12N2310/3521—Methyl
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/352—Nature of the modification linked to the nucleic acid via a carbon atom
    • C12N2310/3527—Other alkyl chain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/353—Nature of the modification linked to the nucleic acid via an atom other than carbon
    • C12N2310/3533—Halogen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

A találmány protein-kináz-C-vel (PKC-vel), ?-PKC-vel, valamint annakspecifikus transzkriptumaival kapcsolatos betegségek kezelésére ésdiagnosztizálására alkalmazható készítményekre, valamint azokelőállítására szolgáló eljárásokra vonatkozik. A találmány tárgykörébetartoznak a PKC-génnel vagy PKC-RNS-sel, egy meghatározott PKC-izozimmel, -izozimek csoportjával vagy mRNS-traszkriptummal specifikushibridizálódásra képes oligonukleotidok, valamint a humán ?-PKC 3’-végi nem transzlálódó régióját kódoló új nukleinsavszekvenciák és az?-PKC kimutatására alkalmas polinukleotidpróbák. ŕ

Description

A találmány tárgyát protein-kináz-C expressziójának szabályozására szolgáló oligonukleotidok, ezek felhasználásával protein-kináz-C-gén vagy protein-kináz-CmRNS detektálására szolgáló eljárások és próbák, a protein-kináz-C-vel kapcsolatos állapotok diagnosztizálására szolgáló módszerek, valamint protein-kináz-C és annak mRNS-transzkriptuma expressziójának módosítására alkalmazható és így a protein-kináz-C-vel kapcsolatos állapotok kezelésére szolgáló gyógyszerkészítmények képezik.
A proteinek foszforilezése kulcsfontosságú szerepet játszik az extracelluláris jeleknek a sejtbe történő közvetítésében. Az ilyen, kinázoknak nevezett, foszforilezést eredményező enzimek, növekedési faktorok, hormonok és egyéb, a sejt anyagcseréjében, proliferációjában és differenciálódásában szerepet játszó anyagok hatásának célpontját képezik. Az egyik fő szignáltranszdukciós reakcióút alapját a protein-kináz-C (PKC)-enzim képezi, amely döntő szerepet játszik a sejtproliferációban és -differenciálódásban. A PKC-t diacil-glicerin-származékok (DAG-ok) aktiválják, melyek a szignáltranszdukció során felszabaduló anyagcseretermékek.
A PKC iránti érdeklődést fokozták azok az eredmények, melyek szerint a PKC a fő és talán az egyetlen sejtreceptor, melyen keresztül a forbol-észtereknek nevezett tumorkeltő anyagok a sejtekre pleiotróf (osztódást kiváltó) hatásukat kifejtik [Gescher és munkatársai, Anti Cancer Drug Design 4, 93-105 (1989)]. A tumor kiváltására képes forbolok utánozzák a DAG PKC-aktiváló hatását, ami arra utal, hogy ezek a tumorkeltő anyagok PKC-n keresztül hatnak, és ennek az enzimnek az aktiválása legalább részben felelős az általuk kiváltott tumor keletkezéséért [Parker és munkatársai, Science, 233, 853-866 (1986)].
Kísérletek bizonyítják, hogy a PKC szerepet játszik a vastagbéltumor növekedésének szabályozásában. Feltevések szerint a béltraktusban meghatározott baktériumok alakítják a lipideket DAG-okká, azok aktiválják a PKC-t és befolyásolják a sejtszaporodást. Ez megmagyarázhatja azt a tényt, hogy összefüggés mutatható ki a magas lipidtartalmú étrend és a vastagbéltumor keletkezése között [Weinstein, Cancer Rés. (Suppl.) 51, 5080s-5085s (1991)]. Ugyancsak kimutatták, hogy vastagbél-végbél karcinómában szenvedő betegek vastagbél-nyálkahártyájában a PKC nagyobb hányada van aktivált állapotban, mint karcinómában nem szenvedő betegekben [Sakanoue és munkatársai, Int. J. Cancer, 48, 803-806 (1991)].
Összefüggés mutatható ki meztelen egérnek beoltott tenyésztett sejtek fokozott tumorkeltő képessége és a sejtekben a PKC túlzott mennyiségben történő expressziója között is. A PKC mutáns formája nagymértékben rosszindulatú, fokozott áttétképző tulajdonsággal rendelkező tumorsejtek keletkezéséhez vezet.
A szfingozinról és hasonló PKC-aktivitást gátló anyagokról igazolták, hogy azok in vivő gátolják a tumorsejtek szaporodását és besugárzással kiváltott tumoros transzformálódását [Endo és munkatársai, Cancer Research, 51, 1613-1618 (1991); Borek és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci., 88, 1953-1957 (1991)]. Számos kísérleti és klinikai felhasználásra alkalmas tumorellenes hatóanyag hatását a PKC-n keresztül váltja ki. A PKC-gátlók tehát fontos tumormegelőző vagy -terápiás anyagok lehetnek. Várhatóan a PKC a szokásos tumorellenes hatóanyagok sokkal ésszerűbb tervezésének célpontját képezheti [Gescher A. és Dalé I. L., Anti-Cancer Drug Design, 4, 93-105 (1989)].
Kísérletek utalnak arra is, hogy a PKC fontos szerepet játszik hiperproliferatív bőrbetegségek, például a psoriasis és bőrkarcinóma kórélettanában. A psoriasist gyulladás, az epidermisz hiperproliferációja és a sejtek csökkent differenciálódása jellemzi. Különböző vizsgálatok arra utalnak, hogy a tünetek keletkezésében szerepet játszik a PKC. Tenyésztett keratocitákban kimutatták, hogy a PCK stimulációja hiperproliferációt okoz. Forbol-észterekkel gyulladás váltható ki, és azt a PKC befolyásolja. A bőrbetegségekben a PKC DAG-ok közvetítésével játszik szerepet, és psoriasisos laesiókban fokozott mértékben képződik.
A PKC-gátlókról kimutatták, hogy in vitro mind antiproliferatív, mind gyulladásgátló hatást kifejtenek. Több psoriasisban alkalmazott hatóanyagról, például a ciklosporin-A-róí és antralinról igazolták, hogy gátolja a PKC-t. A PKC gátlása alkalmazható lehet a psoriasis terápiájában [Hegemann L. és G. Mahrle: Pharmacology of the Skin, H. Mukhtar szerk., 357-368, CRC Press, Boca Raton, FL (1992)].
A PKC nem egyetlen enzim, hanem egy enzimcsalád. Jelenleg legalább hét PKC-izoformot (izozimet) azonosítottak, ezek az alábbiak: α, β, γ, δ, ε, ζ és η. Ezek az izoformok eltérő szöveti és szervi lokalizációs mintát mutatnak [lásd az alábbi összefoglalót: Nishizuka, Natúré, 334, 661-665 (1988)] és eltérő élettani funkciót tölthetnek be. A γ-PKC például úgy tűnik, csak a központi idegrendszerben expresszálódik. Az aPKC és a β-PKC a legtöbb szövetben expresszálódik, azonban különböző sejttípusokban eltérő expressziós mintát mutat. Az α-PKC-t és a β-PKC-t például a humán epidermisz expresszálja, és abból tisztították. Míg az α-PKC-t főleg az epidermidisz bazális rétegeinek keratocitáiból mutatták ki, a β-PKC főként az epidermidisz középső rétegeiben és a Langerhanssejtekben található. Az η-PKC-t elsősorban a bőrben és a tüdőben mutatták ki, és expressziós szintje ezekben a szövetekben sokkal magasabb, mint az agyban. Ez eltér a PKC-család egyéb tagjainak viselkedésétől, melyek legnagyobb mennyiségben az agyban expresszálódnak [Osada és munkatársai, J. Bioi. Chem., 265, 22 434-22 440 (1990)]. Egy másik PKC-izozim, a ζPKC feltehetően a proliferatív kaszkádfolyamatok szabályozásában tölt be lényeges szerepet. Ezt oly módon mutatták ki, hogy a Xenopus oocitákban a ζ-PKC szintjének csökkentésére célzottan a Xenopus ζ-PKC AUGkodonjával szemben irányuló antiszensz-RNS-t, peptidgátlókat vagy egy 15 nukleotidból álló foszforotioát antiszensz oligonukleotidot alkalmaztak. Ezek a „kimerített” oociták rezisztensnek bizonyultak az inzulin hatására létrejövő éréssel szemben, míg a progeszteron által aktivált érési folyamat változatlan maradt [WO
HU 219 017 Β
93/20201 számon közrebocsátott nemzetközi szabadalmi bejelentés]. Bár a jelen találmány előnyös megoldása szerint célzottan a fentiekben felsorolt izozimeket módosítjuk, a találmány kiterjed a PKC egyéb izozimjeire is.
A különböző PKC-izozimek feltehetően különböző betegségek kialakulásában játszanak szerepet, attól függően, hogy mely szervekben vagy szövetekben expresszálódnak. psoriasisos léziókban például megváltozik az α-PKC és a β-PKC közti arány, elsősorban a βPKC mennyisége kisebb, mint a normális bőrben [Hegemann L. és G. Mahrle: Pharmacology of the Skin, H. Mukhtar szerkesztésében, 357-368, CRC Press, Boca Raton, FL (1992)].
Még egy adott izozim esetében is egyetlen génről több RNS-transzkriptum expresszálódhat. Az a-PKC esetében például két RNS-transzkriptum mutatható ki: egy hosszú (körülbelül 8,5 kb) és egy rövid (körülbelül 4 kb) transzkriptum. Az egér- és a szarvasmarha-aPKC-génről szintén több a-PKC-transzkriptum termelődik. A hosszú és rövid transzkriptumok aránya fajok közt eltérő, és valószínűleg a szövetek között is különböző. Összefüggés lehet továbbá a fenti arány és a sejtek proliferatív állapota között is.
Bár számos PKC-gátló vegyületet azonosítottak [lásd, Hidaka és Hagiwara, Trends in Pharm. Sci. 8, 162 (1987); összefoglaló], közülük kevés gátolja specifikusan a PKC-t. Míg a kinolin-szulfonamid-származékok, mint például az l-(5-izokinolin-szulfonil)-2-metil-piperazin (H-7) a PKC-t mikromól/1 koncentrációban gátolják, az enzimgátlás kinetikája a PKC esetében és a CAMP-függő, valamint cGMP-függő protein-kinázok esetében is hasonló. Jelenleg a staurosporin, egy Streptomyces-faj által termelt alkaloida, valamint annak analógjai a PKC leghatásosabb ismert in vitro gátlói. Ezek azonban különböző protein-kinázok esetében csak korlátozott szelektivitást mutatnak [Gescher: Anti-Cancer Drug Design 4, 93 (1989)]. Kimutatták egyes ceramidokról, valamint szfingozinszármazékokról, hogy PKC-gátló hatással rendelkeznek és esetleg terápiás célra alkalmazhatók lehetnek, azonban továbbra is fennáll a korábbi igény az enzimeket specifikusan gátló anyagok iránt.
Fennáll az igény továbbá specifikus PKC-izozimek gátlására, mind kutatási eszközként, mind egy adott izozimmel kapcsolatos betegség kezelésére. Godson és munkatársai, [J. Bioi. Chem. 268, 11 946 (1993)] nemrég írták le antiszensz α-PKC-cDNS stabil transzfektálását egy citomegalovírus-promoter alapú expressziós vektorba, így az α-PKC-protein expressziójának körülbelül 70%-os specifikus csökkenését érték el. Kimutatták, hogy a gátlás következtében megszűnt a PMA forbol-észter által kiváltott, foszfolipáz-A2 által közvetített arachidonsavkibocsátás. Ugyanazon kutatók végül az oligonukleotidok lebomlásának következtében sikertelenül próbálkoztak a PKC-aktivitás oligodezoxinukleotidok alkalmazásával történő gátlásával.
Baxter és munkatársai [Biochem, 31, 10 950(1992)] a protein-kináz-C-α kódolórégiójára irányuló oligonukleotidot ismertetnek.
Coussens és munkatársai [Science, 233, 859 (1986)] a protein-kináz-C-α, -β és -γ teljes cDNS-szekvenciáját ismertetik.
Farese és munkatársai [Antisense Rés. Dev., 1, 35 (1991)] a protein-kináz-C-α és -β AUG-kodonjára irányuló, míg Marier és munkatársai [Exper. Cell Rés., 205, 52 (1993)] a protein-kináz-C-α AUG-kodonjára irányuló oligonukleotidokat ismertetnek.
A találmány szerinti megoldás lehetővé teszi tumoros, hiperproliferatív, gyulladásos és egyéb protein-kináz-C-vel kapcsolatos betegségek kezelését, továbbá protein-kináz-C meghatározott izozimjeivel kapcsolatos betegségek szelektív terápiáját.
A találmány tárgyát képezik tehát protein-kináz-C expressziójának szabályozására képes antiszensz oligonukleotidok, ezenkívül a protein-kináz-C meghatározott izozimjei expressziójának szelektív szabályozására képes antiszensz oligonukleotidok.
A találmány tárgyát képezik továbbá proteinkináz-C-vel kapcsolatos betegségek diagnózisára alkalmazható eljárások.
A találmány tárgyát képezik továbbá a protein-kináz-C meghatározott izozimjeivel kapcsolatos betegségek differenciáldiagnózisára alkalmazható eljárások.
Ezenkívül a találmány szerinti megoldás lehetővé teszi a protein-kináz-C expressziója hatásainak és a vele kapcsolatos betegségeknek a tanulmányozását és az ilyen célú kutatásokat.
A találmány szerinti megoldás lehetővé teszi továbbá meghatározott protein-kináz-C-izozimek expressziója hatásainak és a velük kapcsolatos betegségeknek a tanulmányozását és az ilyen célú kutatásokat.
A találmány tárgyát képezik humán a-PKC 3’irányú, nem transzlálódó régióját, ezen belül az a-PKC hosszú mRNS-molekulájára egyedileg jellemző szekvenciákat kódoló új nukleinsavmolekulák.
A találmány tárgyát képezik továbbá az α-PKC meghatározott mRNS-transzkriptumai expressziójának szelektív szabályozására képes antiszensz oligonukleotidok.
A találmány tárgyát képezik ezenkívül humán PKC kimutatására alkalmazható polinukleotidpróbák.
A találmány tárgyát képezik továbbá meghatározott α-PKC-mRNS-transzkriptumok kimutatására alkalmazható polinukleotidpróbák.
A találmány tárgyát képezik ezenkívül meghatározott α-PKC-mRNS-transzkriptumokkal kapcsolatos betegségek differenciáldiagnózisára alkalmazható eljárások.
A találmány tárgyát képezik tumoros, hiperproliferatív, gyulladásos és egyéb α-PKC-vel kapcsolatos betegségállapotok kezelésére alkalmazható gyógyszerkészítmények.
A találmány tárgyát képezik továbbá meghatározott α-PKC-mRNS-transzkriptumokkal kapcsolatos betegségek szelektív terápiájára szolgáló gyógyszerkészítmények.
A találmány tárgyát képezik továbbá meghatározott α-PKC-izozimek expressziója hatásainak és a velük kapcsolatos betegségeknek a tanulmányozására alkalmazható kutatási eszközök.
HU 219 017 Β
Az alábbiakban röviden ismertetjük a leírásokhoz csatolt ábrákat.
Az la. és lb. ábra α-PKC-vel hibridizálódó antiszensz oligonukleotidok PKC-expresszióra kifejtett hatását szemlélteti grafikusan. Az oligonukleotidokat a célzott PKC-régiók szerint, 5’-3’-irányban tüntettük fel.
A 2. ábra az α-PKC-protein szintjének dózisfiiggő csökkenését mutatja A549-sejtek oligonukleotidkezelését követően vonalgrafikus ábrázolással. ♦=ISIS-4632; B=ISIS-4649; ·=Ι8Ι8-4636; ♦=ISIS-4648.
A 3. ábra az α-PKC mRNS-szintjének dózisfiiggő csökkenését mutatja A549-sejtek oligonukleotidkezelését követően oszlopgrafikus ábrázolással. A satírozott oszlopok a 8,5 kb hosszúságú transzkriptumot, az üres oszlopok a 4,0 kb hosszúságú transzkriptumot képviselik.
A 4. ábra a dezoxirés hosszúsága és a kiméra oligonukleotidok PKC-vel szembeni aktivitása közti összefüggést mutatja.
Az 5. ábra vonalgrafikonon ábrázolja a különböző méretű dezoxiréssel rendelkező kiméra oligonukleotidok (valamennyi, a 3. azonosító számú szekvencia szerinti oligonukleotid) dózisválasz-görbéjét.
A 6. ábra több különböző, a 3. azonosító számú szekvencia szerinti 2’-O-metil kiméra oligonukleotidnak az α-PKC-mRNS-szintre kifejtett hatását szemlélteti oszlopgrafikonon. A satírozott oszlopok a 8,5 kb hosszúságú transzkriptumot, az üres oszlopok a 4,0 kb hosszúságú transzkriptumot képviselik.
A 7. ábra több különböző, a 3. azonosító számú szekvencia szerinti 2’-O-metil és 2’-O-propil kiméra oligonukleotidnak (6996. és 7273. oligonukleotidoknak) az α-PKC-mRNS-szintre kifejtett hatását szemlélteti oszlopdiagramon. A satírozott oszlopok a 8,5 kb hosszúságú transzkriptumot, az üres oszlopok a 4,0 kb hosszúságú transzkriptumot képviselik.
A 8. ábra további 3. azonosító számú szekvencia szerinti 2’-O-metil és 2’-O-propil kiméra oligonukleotidoknak (7008. és 7294. oligonukieotidoknak) az aPKC-mRNS-szintre kifejtett hatását szemlélteti oszlopdiagramon. A satírozott oszlopok a 8,5 kb hosszúságú transzkriptumot, az üres oszlopok a 4,0 kb hosszúságú transzkriptumot képviselik.
A 9. ábra további oligonukieotidoknak az a-PKCmRNS-szintre kifejtett hatását szemlélteti oszlopgrafikonokon. A 9a. ábra a 6632., 6653. és 6665. oligonukleotidokat mutatja. A 9b. ábra (összehasonlításképp) a 3521. oligonukleotidot, valamint a 7082., 7083. és 7084. oligonukleotidokat mutatja. A satírozott oszlopok a 8,5 kb hosszúságú transzkriptumot, az üres oszlopok a 4,0 kb hosszúságú transzkriptumot képviselik.
A 10. ábra az ISIS—3521. jelű anyag antitumor-aktivitását szemlélteti vonalgrafikonon. Mindegyik szaggatott vonal egy kontrolloligonukleotiddal kezelt állatból származó tumor térfogatát mutatja. Mindegyik folyamatos vonal egy ISIS—3521. jelű oligonukleotiddal kezelt állatból származó tumor térfogatát mutatja.
All. ábra az oligonukieotidoknak a humán tumorok „meztelen egérben” történő növekedésére kifejtett hatását grafikonokon ábrázolja. A 11a. ábra az ISIS—3521. jelű oligonukleotiddal MDA-MB231 tumorok esetén kapott tumortömeg-eredményeket mutatja; a 11b. ábra az ISIS—3521. jelű oligonukleotiddal MDA-MB231 tumorok esetén kapott tumortérfogateredményeket mutatja; a 11c. ábra az ISIS—3521. jelű oligonukleotiddal Calu-1 tumorok esetén kapott tumortömeg-eredményeket mutatja; a lld. ábra az ISIS-3521. jelű oligonukleotiddal és analógjaival U-87 tumorok esetén kapott tumortérfogat-eredményeket mutatja.
A 12. ábra 20 nukleotidból álló foszforotioát-oligonukleotidok η-PKC-expresszióra kifejtett hatását mutatja A549-sejtekben.
A 13. ábra a humán α-PKC-gén 3’-irányú, nem transzlálódó szekvenciája egy részének nukleotidszekvenciáját (a 104. azonosító számú szekvenciát) mutatja a korábban ismert szekvencia 3’-végéhez közel eső Rc/I-hellyel kezdődően, 3’-irányban folytatódva. Az újonnan meghatározott szekvenciák az 56. nukleotiddal kezdődnek, azokat aláhúzással jelöltük (105. azonosító számú szekvencia). A vastag betűvel jelölt szekvenciák az α-PKC hosszú mRNS-transzkriptumára jellemző egyedi szekvenciák (106. azonosító számú szekvencia).
A 14. ábra a sejtekben az α-PKC mRNS-szintjének időgörbéjét mutatja vonalgrafikon segítségével a 7911. oligonukleotiddal (117. számú szekvencia) történő kezelést követően (a kontroll százalékában kifejezve). Mind a hosszú, mind a rövid mRNS-transzkriptum szintjét jelöltük. A rövid mRNS-transzkriptum szintjét folyamatos vonallal jelöltük. A hosszú mRNS-transzkriptum szintjét pontozott vonallal jelöltük. Az ISIS-7911. jelű oligonukleotiddal (117. számú szekvencia) történő kezelést követően 12 órával mindkét transzkriptum szintje több mint 80%-kal csökkent.
Az alábbiakban összefoglaljuk a találmány szerinti megoldást.
A találmány tárgyát PKC-t kódoló gén eredetű DNS-sel vagy RNS-sel specifikusan hibridizálódó oligonukleotidok képezik. A találmány szerinti oligonukleotid - azonosságát és számát tekintve - elegendő nukleotidegységet tartalmaz ahhoz, hogy az említett specifikus hibridizálódás létrejöjjön. Ezt a viszonyt általánosságban „antiszensz” viszonynak nevezzük. A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint az oligonukleotidok specifikusan a gén transzlációs kezdőkodonjával hibridizálódnak, és előnyösen CAT-szekvenciát tartalmaznak. A találmány egy másik előnyös megvalósítási módja szerint az oligonukleotidok a gén 5’végi nem transzlálódó vagy 3’-végi nem transzlálódó régiójával hibridizálódnak specifikusan. A találmány egy további előnyös megvalósítási módja szerint az oligonukleotidok egy meghatározott PKC-izozim-csoportot kódoló DNS-sel vagy mRNS-sel hibridizálódnak specifikusan. Ezek az oligonukleotidok szokásosan és előnyösen egy gyógyszergyártásban szokásos hordozóanyagban vannak jelen.
A találmány további előnyös megvalósítási módjai szerint az oligonukleotidok egy vagy több kémiai módosítást tartalmaznak, melyek az oligonukleotidnak vala4
HU 219 017 Β milyen kívánt tulajdonságot, például a célzott nukleinsavhoz való fokozott affinitást, jobb sejtfelvételt vagy sejtnukleázok jelenlétében nagyobb stabilitást kölcsönöznek. A fenti célra alkalmazható módosítások a 2’Ο-alkil-, 2’-fluor-cukor-módosítások és a foszforotioátváz-módosítások.
A találmány tárgyát képezik továbbá a sejtekben vagy szövetekben PKC vagy egy adott PKC-izozim vagy -izozim-csoport expressziójának szabályozására szolgáló eljárások. A találmány tárgyát képezik továbbá sejtekben vagy szövetekben PKC-t kódoló DNS és RNS kimutatására szolgáló eljárások, valamint a sejtekben vagy szövetekben meghatározott PKC-izozimek specifikus kimutatására szolgáló eljárások. Az ilyen eljárásokban az említett gént feltételezetten tartalmazó sejteket vagy szöveteket érintkeztetünk a találmány szerinti oligonukleotidokkal, abból a célból, hogy az említett DNS vagy RNS hatásait gátoljuk vagy az említett DNS-t vagy RNS-t kimutassuk.
A találmány tárgyát képezik ezenkívül feltételezhetően PKC-val vagy annak egy izozimjével kapcsolatos betegségben szenvedő állatok diagnózisára és terápiájára alkalmazható eljárások. Az ilyen eljárásokban az állatokat vagy az állatból származó sejteket, vagy szöveteket, vagy testnedveket érintkeztetünk a találmány szerinti oligonukleotidokkal, abból a célból, hogy a PKC expresszióját szabályozzuk, a PKC-vel kapcsolatos állapotokat kezeljük vagy azokat diagnosztizáljuk.
A találmány tárgyát képezik humán α-PKC 3’-végi, nem transzlálódó régiójának részeit kódoló nukleinsavszekvenciák. A találmány tárgyát képezik továbbá aPKC kimutatására szolgáló próbák és eljárások. A találmány egyik megvalósítási módja szerint az a-PKC meghatározott mRNS-transzkriptumára specifikus nukleinsavszekvenciák, valamint ezen transzkriptumok specifikus kimutatására alkalmas polinukleotidpróbák és eljárások is a találmány tárgyát képezik.
A találmány egy másik megvalósítási módja szerint α-PKC-t kódoló nukleinsavval specifikusan hibridizálódó antiszensz oligonukleotidokat állítunk elő. A találmány egy további megvalósítási módja szerint az aPKC meghatározott mRNS-transzkriptumával specifikusan hibridizálódó antiszensz oligonukleotidokat állítunk elő. Ezek az oligonukleotidok szokásosan és előnyösen egy gyógyszergyártásban szokásos hordozóanyagban vannak jelen.
A találmány további megvalósítási módja szerint a találmány tárgyát a sejtekben az α-PKC vagy az aPKC meghatározott mRNS-transzkriptuma expressziójának szabályozására szolgáló eljárások képezik. A találmány tárgyát képezik továbbá a sejtekben az aPKC-t kódoló nukleinsavak kimutatására, valamint sejtekben az α-PKC meghatározott transzkriptumainak specifikus kimutatására szolgáló eljárások.
Az ilyen eljárásokban a sejteket a találmány szerinti oligonukleotidokkal érintkeztetjük, abból a célból, hogy az említett nukleinsavak hatásait gátoljuk vagy az említett nukleinsavakat kimutassuk.
A találmány további megvalósítási módja szerint a találmány tárgyát α-PKC-nek vagy az α-PKC egy transzkriptumának expressziójával kapcsolatos betegségben szenvedő állatok kezelésére alkalmazható gyógyszerkészítmények képezik.
Az eljárásokban az állatot a találmány szerinti oligonukleotid terápiásán hatékony dózisával érintkeztetjük, abból a célból, hogy az α-PKC expresszióját szabályozzuk, az α-PKC-vel kapcsolatos állapotokat kezeljük vagy azokat diagnosztizáljuk.
Az alábbiakban részletesen ismertetjük a találmány szerinti megoldást.
Az antiszensz oligonukleotidokat számos humán betegség kezelésében ígéretes terápiás hatóanyagoknak tartjuk. Az oligonukleotidok a Watson-Crick szerinti bázispárképzéssel specifikusan kötődnek (hibridizálódnak) a DNS, pre-RNS (elő-RNS) vagy érett mRNS komplementer szekvenciáival, ezáltal meggátolják a genetikai információnak a DNS-ből a proteinek irányába történő áramlását. Az antiszensz oligonukleotidoknak azon tulajdonságai, melyek meghatározzák a célzott szekvenciához való specificitást, egyszerre rendkívül változatossá is teszik őket. Mivel az antiszensz oligonukleotidok monomer egységekből felépülő hosszú láncok, azok bármely célzott RNS-szekvencia esetében könnyen előállíthatok. Napjainkban számos közlemény támasztja alá az antiszensz oligonukleotidok biokémiai eszközként való alkalmazhatóságát célzott proteinek tanulmányozására [Rothenberg és munkatársai, J. Natl. Cancer Inst. 81, 1539 (1989); Zon G., Pharmaceutical Rés. 5, 539 (1988)]. Az oligonukleotidkémia területén, valamint a sejtek által nagyobb mértékben felvett, a célzott molekulához nagyobb kötőaffinitással és nukleázrezisztenciával rendelkező oligonukleotidok szintézise területén elért újabb eredmények figyelembevételével lehetségessé vált az antiszensz oligonukleotidoknak terápiás hatású szerek új formájaként való alkalmazása. Például akut mielogén leukémiában szenvedő beteg csontvelőjéből származó mieloid leukémiasejtek teljes eltávolítására c-myb ellen célzott antiszensz oligonukleotidokat alkalmaztak. [Gewirtz és Calabretta: US 5 098 890 számú szabadalmi leírás]. Egy antiszensz oligonukleotidról kimutatták, hogy az emberben alkalmazva klinikailag hatékony citomegalovírus okozta érhártya-gyulladásos fertőzés kezelésében.
A PKC-vel kapcsolatos állapotok kezelésében az antiszensz oligonukleotidok ideális megoldást kínálnak a korábbi gyakorlatban felmerült problémák megoldására. Ezek az oligonukleotidok úgy tervezhetők, hogy adott izozimet vagy izozimek adott csoportját szelektív módon gátolják vagy izozimek adott családjába tartozó valamennyi tagot gátoljanak.
A protein-kináz-C aktivitásának szabályozására jelenleg alkalmazott szerek számos, a specificitás hiányának következtében elfogadhatatlan mellékhatással rendelkeznek vagy csak korlátozott enzimgátló hatást mutatnak. A találmány szerint megoldás áthidalja a szakemberek korábbi problémáját azáltal, hogy a terápiás hatást az enzim aktivitásának közvetlen gátlása helyett az enzim termelődésének szabályozásával kívánja elérni. A találmány szerinti oligonukleotidokat úgy tervezzük, hogy azok mRNS-sel vagy a génnel közvetlenül
HU 219 017 Β hibridizálódjanak, végső soron módosítsák a gén által termelt PKC-protein mennyiségét. A leírásban „hibridizáció” alatt, rendszerint a szemben levő nukleinsavszálakban vagy egy nukleinsavszál két különböző régiójában található komplementer bázisok közötti hidrogénkötések létrejöttét értjük, melyet Watson-Crick-bázispárképződésnek is nevezünk és mely révén kettős szálú duplex jön létre. Komplementer bázispárok például a guanin és a citozin, melyek között közismerten három hidrogénkötés jön létre. Komplementer bázispárok például az adenin és timidin, melyek között ismereteink szerint két hidrogénkötés jön létre. A leírásban „specifikus módon hibridizálódó” és „lényegében komplementer” kifejezés arra utal, hogy elegendő számú komplementer bázis van jelen ahhoz, hogy a specifikus kötődés létrejöttéhez szükséges feltételek mellett, azaz in vivő vizsgálatok és terápiás kezelések esetében fiziológiás feltételek mellett vagy in vitro vizsgálatok esetében a vizsgálathoz alkalmazott feltételek mellett megakadályozza az oligonukleotidnak (vagy polinukleotidpróbának) nem célzott szekvenciákhoz történő nem specifikus kötődését. Nyilvánvaló, hogy egy oligonuklentid- vagy polinukleotidpróbának a specifikus hibridizálódáshoz nem kell 100%-ban komplementernek lennie a célzott nukleinsavszekvenciával.
Egy oligonukleotid és annak komplementer (vagy „célzott”) nukleinsavszála közti kapcsolatot általánosságban „antiszensznek” nevezzük.
Az antiszensz típusú támadáshoz előnyös meghatározott géneket megcélozni. Kimutatták, hogy a fenti megközelítés szempontjából az α-, β-, γ-, δ-, ε-, ζ- és η-PKC-t kódoló gének alkalmazása különösen előnyös. A PKC-expresszió gátlása várhatóan alkalmazható betegségek kezelésére, különösen hiperproliferatív és gyulladásos rendellenességek kezelésére. A leírásban „módosítás” alatt a PKC-expresszió növekedését vagy csökkentését értjük (stimulációt vagy gátlást).
A leírásban „oligonukleotid” alatt természetben előforduló nukleobázisokból és natív foszfodiészter-kötésekkel összekapcsolódott pentofúranozil- (cukor-) csoportokból képződött polinukleinsavat értünk. A fenti kifejezés egyaránt vonatkozik a természetben előforduló fajtákra és a természetben előforduló alegységekből vagy azokkal közeli rokonságot mutató homológokból képződött szintetikus úton előállított fajtára.
Az „oligonukleotid” kifejezés vonatkozhat olyan csoportokra is, melyek a természetben előforduló oligonukleotidokhoz hasonlóan működnek, de a természetben elő nem forduló részt is tartalmaznak. Az oligonukleotidok tartalmazhatnak tehát módosított cukorcsoportokat, nukleobázisokat vagy cukrok közötti („váz-”) kötéseket. Az ilyen módosított vagy helyettesítést tartalmazó oligonukleotidok gyakran előnyösebbek a natív formáknál, olyan tulajdonságok következtében, mint például a sejtek általi fokozott felvétel, a célzott nukleinsavval történő nagyobb affinitású kötődés és nukleázok jelenlétében nagyobb stabilitás.
A találmány szerinti előnyös oligonukleotidok a vázban a cukrok között például foszfotriészter-, metilfoszfonát-kötéseket, a cukrok között rövid láncú alkilvagy cikloalkilkötéseket vagy a cukrok között rövid láncú heteroatom vagy heterociklusos kötéseket tartalmazó oligonukleotidok. A legelőnyösebbek a következő vázzal rendelkező oligonukleotidok: CH2-NH-O-CH2,
CH2-N(CH3)-O-CH2, CH2-O-N(CH3)-CH2,
CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2 és O-N(CH3)-CH2-CH2 (ahol a foszfodiészter O-P-O-CH2). Szintén előnyösek a foszforotioátok. Ugyancsak előnyösek a morfolinováz-szerkezettel rendelkező oligonukleotidok (Summerton J. E. és Weller D. D., US 5 034 506 számú szabadalmi leírás). A találmány egy másik előnyös megvalósítási módja szerint peptidnukleinsav (PNA - egyesek által „proteinnukleinsavként” említett) váz alkalmazása esetén az oligonukleotid foszfodiésztervázát poliamidvázzal helyettesíthetjük, melyben a nukleozidbázisok közvetlenül vagy közvetett módon a poliamidvázban található aza-nitrogénatomokhoz vagy metiléncsoportokhoz kapcsolódnak. [Lásd például: P. E. Nielsen, M. Egholm, R. H. Berg, O. Buchardt: Science, 254, 1497 (1991); valamint US-5 539 082 számú szabadalmi leírás; benyújtás dátuma: 1993. április 26.; mely teljes teqedelmében a kitanítás részét képezi.] A találmány további előnyös megvalósítási módjai szerint, a foszfodiészter-kötések királis és enantiomerspecifikus struktúrákkal vannak helyettesítve. A gyakorlatban járatos személy egyéb kötéseket is választhat a találmány gyakorlati megvalósítására.
Olyan típusú oligonukleotidokat is alkalmazhatunk, amelyek legalább egy módosított nukleobázist tartalmaznak. Tehát a természetben normális körülmények között elő nem forduló purin- és pirimidinbázisok is alkalmazhatók. Hasonlóképp, amennyiben a találmány tárgyától nem távolodunk el, a nukleotid-alegység pentoíuranozilrészét is módosíthatjuk. Ilyen módosítások például a 2’-O-alkil- és 2’-halogénszubsztituált nukleotidok. A találmány értelmében alkalmazható, a cukorcsoport 2'-pozíciójában létrehozott módosítások például az alábbiak: OH, SH, SCH3, F, OCN, O(CH2)nNH2 vagy O(CH2)nCH3, ahol n 1-től körülbelül 10-ig terjed; Ci~C10 rövid szénláncú alkilcsoportok, szubsztituált rövid szénláncú alkilcsoportok vagy alkaril- vagy aralkilcsoportok; Cl; Br; CN; CF3; OCF3; O, S vagy N-alkil-csoport; O, S vagy N-alkenil-csoport; SOCH3; ONO2; NO2, N3; NH2; heterociklusos alkil-; heterociklusos alkaril-; amino-alkil-amino-; polialkil-amino-; szubsztituált szilil-; egy RNS-hasító csoport; egy hírvivő csoport; egy interkalátor; egy, az oligonukleotid farmakokinetikai sajátságait javító csoport vagy egy, az oligonukleotid farmakodinamikus sajátságait javító csoport, valamint más hasonló tulajdonságokkal rendelkező szubsztituensek. Egy vagy több pentofúranozilcsoportot helyettesíthetünk más cukrokkal, cukorszerű anyaggal, mint például ciklobutillal vagy egyéb, a cukor helyét elfoglaló csoporttal.
A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint kiméra vagy megszakított („gapped”) oligonukleotidokat állítunk elő. Ezek az oligonukleotidok két vagy több vegyileg eltérő régiót tartalmaznak, melyek mindegyike legalább egy nukleotidot tartalmaz. Tipikus esetben egy vagy több régió olyan módosított nukleotidokat
HU 219 017 Β tartalmaz, melyek az oligonukleotidnak egy vagy több előnyös tulajdonságot kölcsönöznek, például fokozott nukleázrezisztenciát, fokozott sejtfelvételt vagy a célzott RNS-hez való fokozott kötőaffinitást. Egy vagy több nem módosított vagy eltérő módon módosított régió megtartja ribonukleáz-H-hasítást irányító képességét. Kiméra oligonukleotidokat ír le a PCT/US92/11339 számú nemzetközi szabadalmi bejelentés. Előnyös kiméra oligonukleotidok például a 2’-dezoxinukleotid-régióban egy „dezoxihiány”-régióval rendelkező 2’-O-metil- vagy 2’O-propil-oligonukleotidok. Ez a dezoxihiány rendszerint a két 2’-alkilrégió között található. A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint az intemukleotid(váz)kötések lehetnek egyformán foszforotioát-kötések vagy lehet foszfodiészter- és foszforotioátkötések valamilyen kombinációja.
Valamennyi ilyen oligonukleotid a legjobban úgy jellemezhető, hogy funkcionálisan felcserélhetők természetes oligonukleotidokkal (vagy természetes szálak mentén szintetikus úton előállított oligonukleotidokkal), azonban a természetes struktúrához képest egy vagy több eltérést tartalmaznak. A találmány tárgyát képezi valamennyi ilyen oligonukleotid, amennyiben azok a PKC-RNS-sel hatékonyan hibridizálódni képesek.
A találmány szerinti oligonukleotidok előnyösen körülbelül 5-50 nukleotidegységet tartalmaznak. Előnyösebb, ha az oligonukleotidok körülbelül 8-30 nukleotidegységet tartalmaznak, és még előnyösebb, ha az oligonukleotidok körülbelül 12-25 nukleotidegységet tartalmaznak. Nyilvánvaló, hogy egy nukleotidegység bázis-cukor (vagy analóg struktúrák) kombinációjából áll, melyek a szomszédos nukleotidegységekkel foszfodiészter-kötéseken vagy más kötéseken át kapcsolódnak és így vázszerkezetet képeznek.
A találmány szerinti megoldásban alkalmazott oligonukleotidokat könnyen és rutinszerűen előállíthatjuk a gyakorlatban jól ismert szilárdfázisúszintézis-technikával. Az ilyen szintézisre alkalmazható felszerelés több forgalmazótól, például az „Applied Biosystems” cégtől beszerezhető. A szintézisre bármely egyéb eljárás is alkalmazható; az oligonukleotidok aktuális szintézise a szakember leleményétől függ. Ismert, hogy hasonló technikák alkalmazásával egyéb oligonukleotidok, például foszforotioátok vagy alkilezett származékok is előállíthatok. Egyéb módosított és szubsztituált oligomerek hasonló módon szintetizálhatok.
A gyakorlatban járatos személy számára nyilvánvaló, hogy a hírvivő RNS nem csak a kódolórégiót tartalmazza, amely hárombetűs genetikai kód segítségével egy protein kódolásához szükséges információkat hordoz, hanem további ribonukleotidokat is tartalmaz, melyek a szakember számára 5’-irányú nem transzlálódó régióként, 3’-irányú nem transzlálódó régióként, az 5’„cap” (sapka)-régióként és intron/exon kapcsoló ribonukleotidokként ismertek. A találmány szerint tehát előállíthatunk olyan oligonukleotidokat, amelyek teljesen vagy részben a fenti kapcsolódó ribonukleotidok ellen vagy a kódoló ribonukleotidok ellen irányulnak. A találmány előnyös megvalósítási módjai szerint az oligonukleotid a transzkripciós kezdőhellyel, a transzlációs kezdőhellyel, az 5’-„cap”-régióval, egy intron/exon kapcsolórégióval, kódolószekvenciákkal vagy az 5’ vagy 3’ nem transzlálódó régióban található szekvenciákkal képes specifikusan hibridizálódni.
A találmány szerinti oligonukleotidokat úgy tervezzük, hogy azok a PKC-génnel vagy a PKC-gén eredetű hírvivő RNS-sel hibridizálódjanak. Az ilyen hibridizáció, amennyiben létrejött, gátolja a hírvivő RNS normális szerepének betöltését, így annak működését módosítja a sejtben. A hírvivő RNS gátolható funkciói közé tartozik valamennyi életfontosságú működés, például az RNS-nek a proteintranszláció helyére történő jutása, a proteinnek az mRNS alapján történő aktuális transzlációja, az mRNS hasítása („splicing”), melynek révén egy vagy több mRNS-fajta jön létre, és feltehetően olyan katalitikus aktivitások, melyekben az RNS szerepet játszhat. Az RNS-működés fenti gátlása végső soron a PKC-gén expressziójának szabályozásában nyilvánul meg.
A találmány szerinti oligonukleotidok alkalmazhatók diagnosztikai, terápiás, profilaktikus célra, valamint kutatási célú reagensekben és reagenskészletekben. Mivel a találmány szerinti oligonukleotidok a PKC-génnel és annak mRNS-ével hibridizálódnak, könnyen kidolgozhatok a fenti tényt kiaknázó szendvics- és más vizsgálati eljárások. Ezenkívül - mivel a találmány szerinti oligonukleotidok specifikusan a PKC mRNS adott izozimjeivel hibridizálódnak - tervezhetünk ilyen vizsgálati eljárásokat meghatározott PKC-izozimek kimutatására sejtekben vagy szövetekben. Ilyen vizsgálati eljárások alkalmazhatók különböző PKC-formákkal kapcsolatos betegségek diagnózisára. Az oligonukleotidok PKC-génnel történt hibridizációjának kimutatására szolgáló eljárások rutinszerűen végezhetők. Ilyen eljárások alkalmazhatnak enzimkonjugátumokat, radioaktív jelölést vagy bármely más alkalmas kimutatási rendszert. Előállíthatok PKC jelenlétének vagy hiányának kimutatására alkalmazható reagenskészletek is.
Terápiás vagy profilaktikus kezelés céljára az oligonukleotidokat a találmány szerint adagolhatjuk. Az oligonukleotidokat olyan gyógyászati készítményben formulálhatjuk, mely az oligonukleotidon kívül tartalmazhat hordozóanyagokat, sűrítőanyagokat, hígítóanyagokat, puffereket, tartósítószereket, felületaktív anyagokat és hasonlókat. A gyógyászati készítmény az oligonukleotidon kívül tartalmazhat továbbá egy vagy több aktív összetevőt, mint például antimikrobiális szert, gyulladásgátlót, anesztetikumot és hasonlókat.
A gyógyászati készítményt, attól függően, hogy helyi vagy szisztémás kezelést kívánunk végezni, valamint a kezelendő területtől függően több módon adagolhatjuk. Az adagolást végezhetjük helyileg (például szembe, hüvelybe, végbélbe, orrba), szájon át, inhalációval vagy parenterálisan, például intravénás infúzióval vagy bőr alá, hasüregbe vagy izomba történő injektálással.
Helyi kezelés céljából alkalmazható készítmények lehetnek kenőcsök, lemosószerek, krémek, gélek, cseppek, hintőporok, sprayk, folyadékok és porok. Szükség esetén vagy előnyösen a készítményhez gyógyászatilag
HU 219 017 Β elfogadható hordozóanyagok, vizes, por- vagy olajalapanyagok, sűrítőanyagok és hasonlók adhatók. Alkalmazhatók bevonattal ellátott kondomok is.
Szájon át történő adagolásra alkalmazható készítmények lehetnek porok, granulátumok, vízben vagy nem vizes közegben készített szuszpenziók vagy oldatok, kapszulák, zacskócskák vagy tabletták. Kívánt esetben sűrítőanyagokat, ízesítőszereket, hígítóanyagokat, emulgeálószereket, diszpergálószereket és kötőanyagokat is adhatunk a készítményhez.
Parenterális adagolásra szánt készítmények tartalmazhatnak steril vizes oldatokat, melyek tartalmazhatnak puffereket, hígítóanyagokat és egyéb alkalmas adalékanyagokat is.
Az adagolás a kezelendő állapot súlyosságától és válaszkészségétől függ, de általában naponta egy vagy több dózisból áll, és a kezelés időtartama néhány naptól néhány hónapig tart, illetve amíg a gyógyulás be nem következik vagy amíg a betegségállapot javulását el nem éljük. A gyakorlatban járatos személyek képesek az optimális adagolásnak, az adagolás módjának és az ismétlés gyakoriságának meghatározására.
A találmány tárgyát képezi továbbá a humán aPKC 3’-irányú nem transzlálódó doménjét kódoló nukleinsavszekvenciával rendelkező nukleinsavmolekula (13. ábra).
Ezt a szekvenciát humán A549-sejtekből előállított cDNS-klónok alapján határoztuk meg, kezdve egy, a korábban közölt α-PKC-szekvencia 3’-legvégét átfedő klónnal [Finkenzeller és munkatársai, Nucl. Acids Rés. 18, 2183 (1990); Genbank-nyilvántartási szám: X52479] és 3’-irányban kiterjesztve azt. Az α-PKC rövid (4 kb) mRNS-transzkriptuma 3’-végeként az 1080. nukleotid után kezdődő (a 13. ábrán 1136. nukleotidnál kezdődő) poliadenilezési helyet azonosítottuk. A 3’irányban további 676 nukleotidtól álló szekvenciát határoztunk meg, mely szekvencia egyedileg jellemző az aPKC hosszú (8 kb) mRNS-transzkriptumára. A találmány szerinti nukleinsavmolekula előnyösen dezoxiribonukleinsavakat tartalmaz, és a találmány egyes megvalósítási módjaiban kettős szálú lehet. A találmány szerinti nukleinsav izolált nukleinsav. A leírásban „izolált” kifejezés alatt olyan molekulákat értünk, melyeket oly módon tisztítottunk vagy szintetizáltunk, hogy azok lényegében homogének legyenek. A fenti kifejezés nem zárja ki azt a lehetőséget, hogy a készítményben bizonyos szennyeződés jelen lehet, de a kifejezés a nem odatartozó nukleinsavszekvenciák hiányára vonatkozik. A találmány tárgyát a humán α-PKC-gén 3’-végi nem transzlálódó részével specifikusan hibridizálódó polinukleotidpróbák képezik. A találmány tárgyát képezik továbbá az α-PKC hosszú mRNS-transzkriptumainak egy részével specifikusan hibridizálódó polinukleotidpróbák. Ilyen próbák alkalmazhatók diagnosztikus és kutatási célokra, az α-PKC-expresszió kimutatására vagy mennyiségének meghatározására. A próbák alkalmazhatók a hosszú α-PKC-transzkriptum specifikus kimutatására vagy mennyiségének meghatározására. Az említett polinukleotidpróbák körülbelül 5-50 nukleotidegység hosszúságúak lehetnek. A találmány egy még előnyösebb megvalósítási módja szerint a próbák hosszúsága körülbelül 8-30 nukleotidegység. A próbák hosszúsága legelőnyösebben körülbelül 12-25 nukleotidegység. Nyilvánvaló, hogy mivel a találmány szerinti polinukleotidpróbák hosszúsága ideális esetben nem haladja meg az 50 nukleotidot, az említett próbák a célzott szekvenciának csak egy részével képesek specifikusan hibridizálódni. Az α-PKC-génen belül a célzott szekvenciát a gyakorlatban járatos személy határozhatja meg. Legalkalmasabb olyan célzott szekvencia kiválasztása, amely egyedi, ezáltal csökken a próbának a célzott szekvencián kívüli szekvenciákkal történő hibridizálódásából adódó „háttérzaj”. A gyakorlatban járatos személy például nem valószínű, hogy adenin nukleotidegységekből álló ismétlődő szekvenciát választana, mivel ez számos génben előforduló gyakori szekvencia. A szakember alkalmas próbák azonosítása és tervezése céljából keresést és szekvenciabankokban, például a Genbankban található szekvenciák alapján szekvenciaösszehasonlítást végezhet. A fenti eljárásokat gyakran alkalmazzák egyedi szekvenciák azonosítására. Ezek az egyedi szekvenciák, amennyiben próbaként alkalmazzák őket, nem szükségszerűen lényegesek az a-PKC expressziójának szabályozása szempontjából.
A találmány szerinti megoldást az alábbi példákkal szemléltetjük, a korlátozás szándéka nélkül.
1. példa
Oligonukleotidszintézis
Módosítatlan DNS-oligonukleotidot szintetizáltunk egy automatizált DNS-szintetizáló készülékkel (Applied Biosystems, 380B modell) szokásos foszforamiditmódszerrel, jóddal történő oxidálással. A β-ciano-etildiizopropil-foszforamiditokat az Applied Biosystems cégtől szereztük be (Foster City, CA). A foszforotioátoligonukleotidok előállításához, a foszfitkötések lépcsőzetes tiációja céljából a szokásos oxidációs palackot acetonitrilben készített 3H-l,2-benzoditiol-3-on-l,l-dioxidoldatra cseréltük. A tiációs ciklusban a várakozási lépést 68 másodpercre növeltük, ezt a „capping”-lépés követte.
2’-O-metil-foszforotioát-oligonukleotidokat a fenti eljárás szerint állítottunk elő, azzal az eltéréssel, hogy a 2’-O-metil^-ciano-etil-diizopropil-foszforamiditokat (Chemgenes, Needham, MA) szokásos foszforamiditekkel helyettesítettük, valamint a tertazol és a bázisok impulzusszerű bejuttatását követően a várakozási lépést 360 másodpercre növeltük. Hasonlóképp 2’-O-propilfoszforotioát-oligonukleotidokat a fenti eljárás kismértékű módosításával állíthatunk elő.
A szabályos pórusnagysággal rendelkező üvegoszlopról (Applied Biosystems) történő lehasítást és koncentrált ammónium-hidroxiddal 55 °C-on 18 óráig végzett védőcsoport-eltávolítást követően az oligonukleotidokat oly módon tisztítottuk, hogy azokat 0,5 mol/1 NaCl-ból 2,5 térfogat etanollal kétszer kicsaptuk. Ezután 20% akrilamidot, 8 mol/1 karbamidot, 45 nmol/1 Tris-borát puffért (pH 7,0) tartalmazó gélen analitikai gélelektroforézist végeztünk.
A vizsgált oligonukleotidokat az 1. táblázatban soroljuk fel.
HU 219 017 Β
A szekvenciaadatok a Finkenzeller és munkatársai, által közölt cDNS-szekvenciából származtak [Nucl. Acids Rés. 18, 2183 (1990); Genbank-nyilvántartási szám: X52479]. Az oligonukleotidok alatt található szekvenciaszámozás a cDNS szekvenálásakor kapott első nukleotidhoz viszonyított számozás, amely az ATG kezdőkodontól 5’-irányban található 28. nukleotidnak felel meg.
1. táblázat
Humán α-PKC-val szemben célzottan előállított oligonukleotidok
A szekvencia száma Szekvencia Célszekvencia ISIS#
1. CCC CAA CCA CCT CTT GCT CC 19 1 5’ nem transzlálódó 3520
2. GTT CTC GCT GGT GAG TTT CA 2063 2044 3’ nem transzlálódó 3521
3. AAA ACG TCA GCC ATG GTC CC 41 22 transzlációs kezdőkodon 3522
4. GGA TTC ACT TCC ACT GCG GG 2109 2090 3’ nem transzlálódó 3526
5. GAG ACC CTG AAC AGT TGA TC 2211 2192 3’ nem transzlálódó 3527
6. CCC GGG AAA ACG TCA GCC AT 47 28 transzlációs kezdőkodon 3674
7. CTG CCT CAG CGC CCC TTT GC 110 91 belső (Cl) dómén 3682
8. AGT CGG TGC AGT GGC TGG AG 193 174 belső (Cl) dómén 3686
9. GCA GAG GCT GGG GAC ATT GA 480 461 belső (Cl) dómén 3687
10. GGG CTG GGG AGG TGT TTG TT 2080 2061 3’ nem transzlálódó 3695
11. CAC TGC GGG GAG GGC TGG GG 2098 2079 3’ nem transzlálódó 3875
12. AGC CGT GGC CTT AAA ATT TT 2137 2118 3’ nem transzlálódó 3878
13. ATT TTC AGG CCT CCA TAT GG 2168 2149 3’ nem transzlálódó 3879
14. AAG AGA GAG ACC CTG AAC AG 2217 2198 3’ nem transzlálódó 3884
15. GAT AAT GTT CTT GGT TGT AA 2235 2216 3’ nem transzlálódó 3885
16. ATG GGG TGC ACA AAC TGG GG 2027 2008 belső (C3) dómén 3886
17. GTC AGC CAT GGT CCC CCC CC 36 17 transzlációs kezdőkodon 3890
18. CGC CGT GGA GTC GTT GCC CG 63 44 belső (VI) dómén 3891
19. TCA AAT GGA GGC TGC CCG GC 1643 1624 belső (C3) dómén 3892
20. TGG AAT CAG ACA CAA GCC GT 2151 2132 3’ nem transzlálódó 3947
HU 219 017 Β
2. példa
Sejttenyészet és forbol-észterekkel, valamint a-PKC-vel szemben előállított célzott oligonukleotidokkal végzett kezelés A PKC-proteinek felezési ideje a közlemények szerint 6,7 óra és több mint 24 óra között változik [Young és munkatársai, Biochem. J. 244, 775-779 (1987); Ballester és munkatársai, J. Bioi. Chem. 260, 15 194-15 199 (1985)]. Ezek a hosszú felezési idők az állandó α-PKC-gátló szintekkel történő antiszensz oligonukleotidokkal végzett vizsgálatokat nehézkessé teszik azok hosszú inkubációs időigénye miatt. Mi ezért a forbol-észterek azon képességét használtuk ki, hogy a sejten belüli PKC-szintet reverzibilis módon képesek csökkenteni. A sejteknek forbol-észterekkel történő kezelése a kinázaktivitást kezdetben fokozza, majd a PKC-szintet negatív módon szabályozza. Az a-PKC esetében ez a negatív szabályozás a kináz fokozott mértékű proteolízisének közvetlen következménye, miközben a szintézis mértéke látszólag változatlan.
Megállapítottuk, hogy humán tüdőkarcinóma (A549)-sejtekben 12,13-dibutirát-forbol-észterekkel (PDBu), Krug és munkatársai módosított eljárásával végzett kezelés [Krug és munkatársai, J. Bioi. Chem. 262, 11 852-11 856 (1987)] az α-PKC szintjét a sejtekben az α-PKC mRNS-szintre kifejtett hatás nélkül csökkentette, és a fenti hatás reverzibilis volt. Az oligonukleotidok azon képességének vizsgálata, hogy aPKC-szintre célzottan hatnak, azon alapul, hogy először PDBu-val végzett krónikus kezeléssel csökkentjük az α-PKC-protein-szintet, a sejtek alapos mosásával eltávolítjuk a PDBu-t, (ezáltal lehetővé tesszük a sejtekben friss α-PKC-protein szintézisét), majd a sejteket olyan oligonukleotidokkal inkubáljuk, melyekkel az α-PKC-protein újbóli szintézisét gátolni kívánjuk.
A következő eljárást alkalmaztuk: A549-sejteket (American Type Culture Collection, Bethesda MD) 6 rekeszú lemezeken (Falcon Labware, Lincoln Park, NJ) 1 g/1 glükózt és 10% boíjúszérumot (FCS, Irvine Scientific, Santa Ana, CA) tartalmazó Dulbecco-féle módosított Eagle-tápfolyadékban (DME) egybefüggő tenyészet kialakulásáig tenyésztettünk.
A sejteket 12-16 órán át (egy éjszakán át) 500 nmol/1 PDBu-val kezeltük (Sigma Chem. Co., St. Louis, MO). Ezt követően a sejteket DME-ben, 37 °C-on, háromszor mostuk, majd 1 ml térfogatú, 20 μΐ DOTMA-t (Lipofectin reagens, BRL, Bethesda, MD) tartalmazó DMA-t adtunk hozzájuk. A sejtekhez 1 nmol/1 koncentrációig oligonukleotidokat adtunk, és azokat további 4 órán át, 37 °C-on inkubáltuk.
A sejteket 3 ml, 0,1 mg/ml BSA-t tartalmazó DMEben egyszer mostuk, majd további 2 ml, 0,1 mg/ml BSA-t tartalmazó DME-t adtunk hozzájuk. A sejtekhez oligonukleotidokat adtunk (1 mol/1), majd azokat 37 °C-on, 24 óráig inkubáltuk.
A sejteket foszfátpufferes fiziológiás sóoldatban (PBS) háromszor mostuk, majd a sejtproteineket 120 pl mintapufferben (60 mmol/1 Tris, pH: 6,8; 2% SDS, 10% glicerin, 10 mmol/1 ditiotreitol) extraháltuk, és percig forraltuk. Az α-PKC-protein sejten belüli szintjét immunlenyomat-technikával határoztuk meg.
3. példa
Az O.-PKC expressziójának vizsgálata immunlenyomat-technikával
A sejtextraktumokat 10%-os SDS-PAGE minigéleken elektroforetizáltuk. A szétválasztott proteineket elektroforetikus módszerrel Immobilon membránokra vittük át (Millipore, Bedford MA), és a membránokat 60 percig, 5% fölözött tejport tartalmazó TBS-ben (Tris-HCl, pH: 7,4; 150 mmol/1 NaCl) blokkoltuk. Ezt követően a membránokat 16 órán át, 4 °C-on, a-PKC ellen termelt, 0,2% fölözött tejport tartalmazó TBS-ben 0,2 pg/ml koncentrációig hígított monoklonális ellenanyaggal inkubáltuk (UBI, Laké Piacid NY). Ezt három mosás követte, melyet 0,2% fölözött tejport tartalmazó TBS-ben végeztünk. A membránokat ezután egy órán át, 125I-jelölt, kecskében termelt antiegér második ellenanyaggal inkubáltuk (ICN Radiochemicals, Irvin CA). A membránokat 0,2% fölözött tejport tartalmazó TBS-ben alaposan mostuk. A csíkokat láthatóvá tettük és Phosphorimager készülékkel (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA) mennyiségi meghatározást végeztünk. Az a-PKC 80 kD molekulatömeggel rendelkező egyetlen csíkként jelent meg.
Valamennyi oligonukleotidot három alkalommal, triplikátumban vizsgáltunk, a kísérleti eredményeket a jelen levő protein százalékában kifejezett értékére normalizáltuk, és oligonukleotidokkal nem kezelt sejtekkel hasonlítottuk össze (la. és lb. ábra). Az öt leghatásosabbnak bizonyult oligonukleotid az AUGkezdőkodonnal, valamint attól kismértékben 5’- és 3’irányban található régiókkal hibridizálódott célzottan (1., 3., 17., 7. és 6. számú szekvenciák). A sorban következő leghatásosabb oligonukleotidok az RNS 3’-végi nem transzlálódó régiójával hibridizálódtak célzottan (2., 5. és 14. oligonukleotidok).
4. példa
Egyéb PKC-izozimek
A humán α-PKC-hoz célzottan kötődő oligonukleotidokkal kapott eredmények azt mutatták, hogy a leghatásosabb célzott szekvenciák a transzlációs kezdókodont környező és a 3’-végi nem transzlálódó régióban található szekvenciák. Várható, hogy ezek a szekvenciák hatásos célpontjait képezik más PKC-izozimekkel szemben előállított oligonukleotidoknak is. Az alábbiakban a PKC-t várhatóan hatékonyan gátló antiszensz oligonukleotidok azonosítását ismertetjük. Ezeket az oligonukleotidokat az 1. példában leírtak szerint állítjuk elő és azokat a 2. és 3. példában leírtak szerint vizsgáljuk megfelelő ellenanyagok felhasználásával, amennyiben azok rendelkezésre állnak. Más eljárás szerint egy hírvivógén-vizsgálati rendszert állíthatunk össze, a kívánt PKC-izozimet, valamint luciferázt a TPA-érzékeny enhanszer (erősítő) vagy más megfelelő promoter szabályozása alatt együttesen expresszálva. Ezt követően a PKC-expressziót szokásos eljárások alkalmazásával, a luciferázaktivitás mérésével vizsgálhatjuk. A luciferázt
HU 219 017 Β a sejtekből Triton X-100 detergenssel végzett lízissel extrahálhatjuk Greenberg Μ. E. eljárása szerint [„Current Protocols in Molecular Biology” (szerkesztők F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J. A. Smith, J. G. Seidman és K. Strahl), „John Wiley and Sons” N. Y. (1987)]. A lumineszcencia csúcsát egy Dynatech ML1000 luminométerrel határoztuk meg 625 pmol/l luciferin (Sigma) hozzáadását követően.
I. és II. típusú $-PKC
A szekvenciaadatok Kubo és munkatársaitól származnak [FEBSLett. 223, 138-142 (1987); Genbank nyilvántartási számok: X06318, M27545, X07109]. A szekvenciákat a cDNS-en szekvenált 5’-végi első bázistól kezdve számoztuk. Az I. és II. típusú β-PKC-típusok egyetlen géntermék eltérő mRNS-hasításának eredményeképp jönnek létre. Ez (az mRNS 5 ’-végének megfelelően) azonos aminoteiminális véggel rendelkező proteineket eredményez; azonban szekvenciaeltérést találunk a karboxiterminális végen (az mRNS 3’-végének megfelelően). A transzlációs kezdőkodonnal szemben célzottan előállí10 tott alábbi oligonukleotidok várhatóan mind az I., mind a II. típusú α-PKC-típusok expresszióját szabályozzák.
2. táblázat
I. és II. β-PKC-típusokkal szemben célzottan előállított oligonukleotidok
A szekvencia száma Szekvencia Célszekvencia
21. CAT CTT GCG CGC GGG GAG CC 139 120 transzlációs kezdőhely
22. TGC GCG CGG GGA GCC GGA GC 134 115 transzlációs kezdőhely
23. CGA GAG GTG CCG GCC CCG GG 13 94 transzlációs kezdőhely
24. CTC TCC TCG CCC TCG CTC GG 183 164 transzlációs kezdőhely
Az alábbi antiszensz oligonukieotidokat az I. típusú β-PKC 3’-végi nem transzlálódó régiójával szemben állítottuk elő.
3. táblázat
Az I. típusú β-PKC-vel szemben célzottan előállított oligonukleotidok
A szekvencia száma Szekvencia Célszekvencia
25. TGG AGT TTG CAT TAC CCT AC 2168 2149 3’-végi nem transzlálódó régió
26. AAA GGC CTC TAA GAC AAG CT 2285 2266 3’-végi nem transzlálódó régió
27. GCC AGC ATG TGC ACC GTG AA 2250 2231 3’-végi nem transzlálódó régió
28. ACA CCC CAG GCT CAA CGA TG 2186 2167 3’-végi nem transzlálódó régió
29. CCG AAG CTT ACT CAC AAT TT 2569 2550 3’-végi nem transzlálódó régió
Az alábbi antiszensz oligonukieotidokat a II. típusú PKC 3’-végi nem transzlálódó régiójával szemben állítottuk elő. 50
4. táblázat
AII. típusú β-PKC-vel szemben célzottan előállított oligonukleotidok
A szekvencia száma Szekvencia Célszekvencia
30. ACT TAG CTC TTG ACT TCG GG 2160 2141 3’-végi nem transzlálódó régió
31. ATG CTG CGG AAA ATA AAT TG 2420 2401 3’-végi nem transzlálódó régió
HU 219 017 Β
4. táblázat (folytatás)
A szekvencia száma Szekvencia Célszekvencia
32. ATT TTA TTT TGA GCA TGT TC 2663 2644 3’-végi nem transzlálódó régió
33. TTT GGG GAT GAG GGT GAG CA 2843 2824 3’-végi nem transzlálódó régió
34. CCC ATT CCC ACA GGC CTG AG 3137 3118 3’-végi nem transzlálódó régió
γ-PKC
A szekvenciaadatok Coussenstól és munkatársaitól származnak [Science 233, 859-866 (1986); Genbanknyilvántartási szám: M13977]. A szekvenciákat a cDNS-en szekvenált 5’-végi első bázistól kezdve számoztuk. A teljes szekvencia nem áll rendelkezésre: a nyílt olvasási fázis 3’-irányú legvége és a 3’-végi nem transzlálódó régió hiányzik. Következésképp ezen ré15 giókkal szemben jelenleg nem állítható elő célzottan antiszensz oligonukleotid.
5. táblázat
A γ-PKC-val szemben célzottan előállított oligonukleotidok
A szekvencia száma Szekvencia Célszekvencia
35. CGG AGC GCG CCA GGC AGG GA 51 32 5’-végi nem transzlálódó régió
36. CCT TTT CCC AGA CCA GCC AT 215 196 transzlációs kezdóhely
37. GGC CCC AGA AAC GTA GCA GG 195 176 a kezdőkodontól 5’-irányban található szekvencia
38. GGA TCC TGC CTT TCT TGG GG 170 151 5’-végi nem transzlálódó régió
39. CAG CCA TGG CCC CAG AAA CG 202 183 transzlációs kezdőhely
η-PKC
Az η-PKC-re vonatkozó adatok Bachertól és munkatársaitól származnak [Bacher és munkatársai: Mól. Cell. Bioi. 11, 126-133 (1991); Genbank-nyilvántartási szám: M55284], Ők az általuk vizsgált izozimet η35
PKC-nek nevezik; azonban a szekvencia csaknem azonos az egér η-PKC-szekvenciájával, így a leírásban az egységesség kedvéért az utóbbi elnevezést használjuk. A szekvenciákat a cDNS-en szekvenált 5’-végi első bázistól kezdve számoztuk.
6. táblázat
Az η-PKC-val szemben célzottan előállított oligonukleotidok
A szekvencia száma Szekvencia Célszekvencia
40. CGA CAT GCC GGC GCC GCT GC 172 153 transzlációs kezdőhely
41. CAG ACG ACA TGC CGG CGC CG 176 157 transzlációs kezdőhely
42. GCC TGC TTC GCA GCG GGA GA 138 119 transzlációs kezdőhely
43. ACA GGT GCA GGA GTC GAG GC 86 67 transzlációs kezdőhely
44. GTC CCG TCT CAG GCC AGC CC 111 92 transzlációs kezdőhely
45. CCT CAC CGA TGC GGA CCC TC 221 202 transzlációs kezdőhely
46. ATT GAA CTT CAT GGT GCC AG 193 174 transzlációs kezdőhely
HU 219 017 Β
6. táblázat (folytatás)
A szekvencia száma Szekvencia Célszekvencia
47. TCT CAC TCC CCA TAA GGC TA 2046 2027 3’-végi nem transzlálódó régió
48. TTC CTT TGG GTT CTC GTG CC 2067 2048 3’-végi nem transzlálódó régió
49. TTC CAT CCT TCG ACA GAG TT 2353 2336 3’-végi nem transzlálódó régió
50. AGG CTG ATG CTG GGA AGG TC 2300 2281 3’-végi nem transzlálódó régió
51. GTT CTA AGG CTG ATG CTG GG 2306 2287 3’-végi nem transzlálódó régió
5. példa
A foszforotioát/2 ’-O-metil oligonukleotidok dózisfüggő hatása az a.-PKC-prötéin szintézisére Teljes egészében 2’-0-metil-foszforotioát-oligonukleotidokból álló sorozatot állítottunk elő, melyek az 20
1., 2., 3. és 5. azonosító számú szekvenciával rendelkeztek. A549-sejteket 18 órán át, 500 nmol/1 PDBu-val kezeltünk, hogy az α-PKC szintézisét gátoljuk, a sejteket a PDBu eltávolítása céljából mostuk, majd oligonukleotiddal és DOTMA/DOPE kationos liposzómákkal kezel- 25 tűk. Négy óra elteltével a tápfolyadékot lecseréltük, és a sejteket további 20 órán át hagytuk regenerálódni.
A proteint extraháltuk és az α-PKC -protein-szintet a 3. példában leírtak szerint immunlenyomat-technikával meghatároztuk. Az eredményeket „Phosphorimager” 30 (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA) készülékkel mennyiségileg is meghatároztuk, és a 2. ábrán, a kontroll (fiziológiás sóoldattal végzett kezelés) százalékában kifejezve szemléltettük. Az ISIS-4649 (3, számú szekvencia; négyzetek) 500 nmol/1 koncentrációban az 35 α-PKC-protein-szintet 85-90%-kal csökkentette, és körülbelül 260 nmol/1 IC50-értékkel (50%-os gátlást létrehozó koncentrációval) rendelkezett.
6. példa 40
Antiszensz oligonukleotidok hatása az a-PKCmRNS-szintre
A549-sejteket foszforotioát-oligonukleotidokkal kezeltünk 500 nmol/1 koncentrációban alkalmazva, 4 órán át, kationos DOTMA/DOPE lipidek jelenlétében, majd mosást végeztünk, és a sejteket további 20 órán át hagytuk regenerálódni. A sejtekből össz-RNS-t extraháltunk, mindegyik mintából 20 pg mennyiséget 1,2%-os géleken szétválasztottunk és nejlonmembránokra vittünk át. A fenti lenyomatokat 35P-jelölt radioaktív aPKC-cDNS-próbával vizsgáltuk, majd a próbát eltávolítottuk, és az egyforma RNS-tartalom bizonyítása céljából radioaktívan jelölt G3PDH-próbával a membránokat ismételten vizsgáltuk. Mindegyik oligonukleotidot (3520., 3521., 3522. és 3527.) duplikátumban alkalmaztuk. A két fő a-PKC-transzkriptumot (8,5 kb és 4 kb) vizsgáltuk, és azok mennyiségét Phosphorimager készülékkel (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA) meghatároztuk. Az eredményeket a 3. ábra mutatja.
A 3521. jelzésű (2. azonosító számú szekvencia), a
3522. jelzésű (3. azonosító számú szekvencia) és 3527. jelzésű (5. azonosító számú szekvencia) oligonukleotid több mint 50%-kal csökkentette az α-PKC mRNS szintjét. A 3521. és 3527. oligonukleotidok körülbelül 80%kal csökkentették a kisebbik transzkriptum és több mint 90%-kal a nagyobb transzkriptum mennyiségét.
7. példa
Kiméra (dezoxihiánnyal rendelkező) 2 ’-O-metil oligonukleotidok
A 3521. (a 2. azonosító számú szekvencia szerinti), a 3522. (a 3. azonosító számú szekvencia szerinti) és 3527. (az 5. azonosító számú szekvencia szerinti) oligonukleotidokat választottuk további vizsgálat és módosítás céljára. A fenti szekvenciákat tartalmazó oligonukleotidokat középen különböző hosszúságú, 2’-O-metilált szekvenciákkal határolt dezoxihiánnyal rendelkező, egységesen foszforotioát kiméra oligonukleotidokként szintetizáltuk. A fenti oligonukleotidokat (500 nmol/1 koncentrációban) az α-PKC-mRNS-szintre kifejtett hatásra nézve vizsgáltuk Northem-lenyomat-analízissel. Az eredményeket a 4. ábra mutatja. Nyolc vagy több nukleotidból álló, dezoxihiánnyal rendelkező oligonukleotidok valamennyi esetben maximálisan csökkentették az α-PKC mRNS-szintjét (mindkét transzkriptumát). A 3. azonosító számú szekvencia szerinti oligonukleotid négy nukleotidból álló dezoxihiány esetén az a-PKC mRNS-szintjét körülbelül 83%-kal csökkentette, és hat vagy több nukleotidból álló dezoxirés esetén az aPKC-mRNS csaknem teljesen eltűnt.
Az 5. ábra a fenti oligonukleotidokkal kapott dózisválaszgörbéket mutatja. A négy-hat nukleotidból álló, dezoxihiánnyal rendelkező 2’-O-metil kiméra oligonukleotidok α-PKC-mRNS-csökkentő IC50-értéke (az az oligonukleotidkoncentráció, amely az α-PKC mRNSszintjét 50%-kal csökkenti), 200-250 nmol/1, amely megegyezik a dezoxihiányt nem tartalmazó (végig foszforotioát) oligonukleotidokéval. A nyolc nukleotidból álló, dezoxihiánnyal rendelkező 2’-O-metil kiméra oligonukleotidok IC50-értéke körülbelül 85 nmol/1.
A fenti kiméra oligonukleotid (a 3. azonosító számú szekvencia szerinti oligonukleotid) néhány változatának α-PKC-mRNS-csökkentő képességét összehasonlítottuk. Az oligonukleotidokat a 7. táblázatban soroltuk fel.
HU 219 017 Β
7. táblázat
Kiméra 2’-O-metil/dezoxi P=S oligonukleotidok vastag betű=2’-O-metil; s=P=S kötés; o=P=O kötés
OLIGO# Szekvencia Szekvencia száma
3522. AsAsAsAsCsGsTsCsAsGsCsCsAsTsGsGsTsCsCsC 3.
5352. AsAsAsAsCsGsTsCsAsGsCsCsAsTsGsGsTsCsCsC 3.
6996. AoAoAoAoCoGsTsCsAsGsCsCsAsTsGoGoToCoCoC 3.
7008. AsAoAoAoCoGsTsCsAsGsCsCsAsTsGoGoToCoCsC 3.
7024. AsAoAoAoCoGsToCsAoGsCoCsAsTsGoGoToCoCsC 3.
A fenti oligonukleotidok α-PKC-mRNS-szintre kifejtett hatását a 6. ábra mutatja. A 7008., 3522. és 5352. oligonukleotidok csökkentették az a-PKC-mRNSszintet, közülük az 5352. oligonukleotid bizonyult a lég- 20 hatásosabbnak.
2’-O-propil kiméra oligonukleotidokból álló sorozatot állítottunk elő, melyek a 3. azonosító számú szekvenciával rendelkeztek. Ezeket az oligonukleotidokat a
8. táblázat mutatja.
8. táblázat
Kiméra 2’-0-propil/dezoxi P=S oligonukleotidok vastag betű=2’-O-propil; s=P=S kötés; o=P=O kötés
OLIGO# Szekvencia Szekvencia száma
7199. AsAsAsAsCsGsTsCsAsGsCsCsAsTsGsGsTsCsCsC 3.
7273. AoAoAoAoCoGsTsCsAsGsCsCsAsTsGoGoToCoCoC 3.
7294. AsAoAoAoCoGsTsCsAsGsCsCsAsTsGoGoToCoCsC 3.
7295. AsAoAoAoCoGsToCsAoGsCoCsAaTsGoGoToCoCsC 3.
A fenti 2’-O-propil kiméra oligonukleotidokat összehasonlítottuk a 2’-O-metil kiméra oligonukleotidokkal.
A 7273. és 7294. oligonukleotidok az a-PKC-mRNSszintre kifejtett hatást tekintve sokkal aktívabbak vol- 40 tak, mint 2’-O-metil megfelelőik. Ezt a tényt a 7. és 8. ábra szemlélteti.
8. példa
Az a-PKC-mRNS-szintet csökkentő további oligonukleotidok
A humán α-PKC 3’-végi nem transzlálódó régiójával szemben további foszforotioát-oligonukleotidokat terveztünk és szintetizáltunk. Ezeket a szekvenciákat a
9. táblázatban soroltuk fel.
9. táblázat
Az α-PKC 3’-végi nem transzlálódó régiójával (3’-UTR) szemben előállított kiméra 2’-O-propil/dezoxi P=S oligonukleotidok vastag betű=2’-O-propil; s=P=S kötés; o=P=O kötés.
OLIGO# Szekvencia Szekvencia száma
6632. TsTsCs TsCsGs CsTsGs GsTsGs AsGsTs TsTsC 52.
6653. TsTsCs TsCsGs CsTsGs GsTsGs AsGsTs TsTsC 52.
6665. ToToCo TsCsGs CsTsGs GsTsGs AsGsTo ToToC 52.
7082. TsCsTs CsGsCs TsGsGs TsGsAs GsTsTs TsC 53.
7083. TsCsTs CsGsCs TsGsGs TsGsAs GsTsTs TsC 53.
7084. ToCoTo CsGsCs TsGsGs TsGsAs GsToTo ToC 53.
HU 219 017 Β
Amint azt a 9. ábra mutatja, a 6632., 6653., 7082. és 7083. oligonukleotidok bizonyultak a legaktívabbnak az α-PKC-mRNS-szintet csökkentő hatást tekintve.
9. példa
A549jelzésű tüdötumorsejtek tenyésztése
Az A549 humán tüdőkarcinóma-sejtvonalat az American Type Culture Collection (Bethesda, MD) gyűjteményből szereztük be. A sejteket 1 g/1 glükózt és 10% boqúszérumot (FCS, Irvine Scientific) tartalmazó Dulbecco-féle módosított Eagle-tápfolyadékban (Irvine Scientific, Irvine CA) tenyésztettük. A sejteket tripszinnel kezeltük, mostuk és egereknek történő beadás céljára a fentivel megegyező tápfolyadékban szuszpendáltuk.
10. példa
Az ISIS-3521. oligonukleotid hatása humán
A549 tumorsejtek növekedésére meztelen egerekben
200 pl A549-sejtet (5 χ 106 sejtet) ültettünk be meztelen egereknek, a bőr alá, a csípő belső oldalára. Az egereknek négy héten át, hetente két alkalommal a 2. azonosító számú szekvenciával rendelkező, ISIS-3521. jelzésű foszforotioát-oligonukleotidot adagoltuk, az adagolás a tumorsejtek beültetését követően egy héttel kezdődött. Az oligonukleotidokat kationos lipidekben (DMRIE/DOPE) formuláltuk, és bőr alá adtuk be a tumor közelébe. Az oligonukleotid adagja 5 mg/kg volt, melyet 60 mg/kg kationos lipiddel adagoltunk. A tumor méretét hetente feljegyeztük.
Amint azt a 10. ábra mutatja, három egérből kettőben a tumor növekedése csaknem teljesen gátlódon, míg a harmadikban csökkent a kontrolihoz viszonyítva. Az ISIS-3521. oligonukleotid alkalmazásával a tumornövekedés fenti gátlása statisztikailag szignifikáns volt. A kontrolloligonukleotid (ISIS-1082) egy 21 nukleotidtól álló foszforotioát-oligonukleotid volt, amely nem mutatott lényeges szekvenciahomológiát a célzott PKC-mRNS-sel. Olyan egerekben, melyekben a tumor növekedése már kimutatható méretet ért el, az oligonukleotid adagolása nem járt észrevehető hatással a további tumomövekedésre.
11. példa
Antiszensz oligonukleotidok hatása humán
MDA-MB231, Calu-1 és U-87 tumorsejtek növekedésére egerekben
Az MDA-MB231 jelzésű humán emlőkarcinómasejteket az American Type Culture Collection (Bethesda, MD) intézettől szereztük be. Az ISIS-3521. jelű oligonukleotid antitumoraktivitását MDA-MB231. jelű humán emlőkarcinómatumor-fragmensek (körülbelül 40 mg) alkalmazásával vizsgáltuk, amelyeket meztelen egerekbe szubkután beültettünk. Az egereknek 14 napig naponta konyhasóoldatot, 6 mg/kg ISIS-3521. jelű oligonukleotidot, illetve 25 mg/kg ISIS-3521. jelű oligonukleotidot adagoltunk intravénásán. A tumor tömegét különböző időközönként megmértük. Amint a 11a. ábra mutatja, az ISIS-3521. jelű nukleotid szignifikánsan csökkentette a tumor tömegét a konyhasóoldathoz viszonyítva.
Az ISIS-3521. jelű oligonukleotid antitumoraktivitását MDA-MB231. jelű humán emlőkarcinómatumor-fragmensek (körülbelül 40 mg) alkalmazásával vizsgáltuk, amelyeket meztelen egerekbe szubkután beültettünk. Az egereknek konyhasóoldatot, 20 mg/kg ISIS-4559. jelű oligonukleotidot (kevert kontroll), illetve 20 mg/kg ISIS-3521. jelű oligonukleotidot adagoltunk intravénásán. A tumor térfogatát különböző időközönként megmértük. Amint a 11b. ábra mutatja, az ISIS-3521. jelű nukleotid szignifikánsan csökkentette a tumor térfogatát a kontrollokhoz viszonyítva.
Az ISIS-3521. jelű oligonukleotid antitumoraktivitását Calu-1 jelű tüdőkarcinómatumor-fragmensek (körülbelül 40 mg) alkalmazásával is vizsgáltuk, amelyeket meztelen egerekbe ültettünk. Az egereknek konyhasóoldatot, 6 mg/kg ISIS-3521. jelű oligonukleotidot, illetve 25 mg/kg ISIS-3521. jelű oligonukleotidot adagoltunk intravénásán. A tumor tömegét különböző időközönként megmértük. Amint a 11c. ábra mutatja, az ISIS-3521. jelű nukleotid szignifikánsan csökkentette a tumor tömegét a konyhasóoldathoz viszonyítva.
Az U-87 humán glioblasztoma-sejtvonalat az American Type Culture Collection (Rockville, MD) intézettől szereztük be, és 10 térfogat%, hőkezeléssel inaktivált borjúembrió-szérummal kiegészített Iscove DMEM tápközegen tartottuk fenn. Az ISIS-3521. jelű oligonukleotid, az ISIS-12723. jelű oligonukleotid [GoToToCoToCsGsCsTsGsGsTsGs AsGoToToToCoA, amely a 2. szekvenciának felel meg, ahol a vastagon szedett nukleotidok egy 2’-0-metoxi-etil-csoportot tartalmaznak, és a váz vagy foszfodiészter (o), vagy foszforotioát (s)], az ISIS-14193. jelű oligonukleotid [GsTsT sCsT sCsGsCsT sGsGsT sGs AsGsTsT sTsCs A, amely a 2. szekvenciának felel meg, ahol a vastagon szedett nukleotidok egy 2’-O-metoxi-etil-csoportot tartalmaznak, és a váz foszforotioát (s)], valamint az ISIS-14864. jelű oligonukleotid [AsGsCsGsCsGsCsGsAsTsGsAsAsTsT, ahol a vastagon szedett nukleotidok egy 2’-O-metoxi-etil-csoportot tartalmaznak, és a váz foszforotioát (s)] antitumoraktivitását U-87 jelű glioblasztoma-tumorfragmensek (1 mm) alkalmazásával vizsgáltuk, amelyeket nude-egerekbe ültettünk. Az egereknek 28 napig naponta konyhasóoldatot, 2 mg/kg ISIS-3521. jelű oligonukleotidot, 2 mg/kg ISIS-12723. jelű oligonukleotidot, 2 mg/kg ISIS—14193. jelű oligonukleotidot, illetve 2 mg/kg ISIS-14864. jelű oligonukleotidot adagoltunk intraperitoneálisan. A tumor térfogatát különböző időközönként megmértük. Amint a lld. ábra mutatja, az ISIS-3521. jelű nukleotid szignifikánsan csökkentette a tumor térfogatát a konyhasóoldathoz viszonyítva.
12. példa
Az ISIS-4189. antiszensz oligonukleotid hatása az endogén a-PKC-expresszióra meztelen egerekben Abból a célból, hogy normális állatokban az oligonukleotidoknak az endogén PKC-mRNS-szintre kifejtett hatását tanulmányozni tudjuk, egy, az egér-a-PKC15
HU 219 017 Β vei komplementer oligonukleotidot kellett alkalmaznunk. Az ISIS—4189. egy 20 nukleotidból álló foszforotioát-oligonukleotid, amelyet célzottan az egér-a-PKC AUG-kodonjával szemben állítottunk elő. Ez a régió nem mutat homológiát a humán PKC-szekvenciával, és 5 az oligonukleotidnak humán sejtekben nincs hatása az α-PKC expressziójára. Az ISIS-4189. oligonukleotidnak Cl27 jelzésű egéremlő epiteliális sejtekben meghatározott mRNS-csökkentő IC50-értéke 200 nmol/1. Az ISIS-4189. oligonukleotidot fiziológiás sóoldatban szőrtelen egereknek adagoltuk intraperitoneálisan, 1,
10, valamint 100 mg/testtömeg-kg koncentrációban.
Az injektálást hét napon át, naponta végeztük. Szövetmintát vettünk a májból, veséből, lépből, tüdőből, valamint a bőrből, és azokban meghatároztuk az a- 15 PKC-mRNS-szintet, valamint a proteinszintet. A máj-, vese- és tüdőminták esetében szövettani vizsgálatot is végeztünk. Az ISIS-4189. oligonukleotid 100 mg/kg dózisban alkalmazva az egér májában a kontrolihoz (fiziológiás sóoldattal kezelt egérhez) képest 10-15%-ra csökkentette az endogén a-PKC-mRNS-szintet.
13. példa
Humán r\-PKC-vel komplementer antiszensz oligonukleotidok vizsgálata A η-PKC-vel komplementer, egyenként 20 nukleo10 tidot tartalmazó foszforotioát-oligonukleotidokból álló sorozatot állítottunk elő. Northem-lenyomat-technika alkalmazásával humán A549-sejtekben, 500 nmol/1 koncentráció mellett vizsgáltuk a fenti oligonukleotidoknak az η-PKC-mRNS-szintet csökkentő képességét. Az oligonukleotidok szekvenciáját a 12. táblázatban soroltuk fel, az eredményeket a 12. ábrán összegeztük.
10. táblázat
Humán η-PKG mRNS-sel szemben célzottan előállított oligonukleotidok
ISIS# Szekvencia Cclszckvencia Szekvencia száma
6431. CGA CAT GCC GGC GCC GCT GC AUG 40.
6442. CAG ACG ACA TGC CGG CGC CG AUG 41.
6443. GCC TGC TTC GCA GCG GGA GA 5’-UTR 42.
6432. ACA GGT GCA GGA GTC GAG GC 5’-UTR 43.
6433. GTC CCG TCT CAG GCC AGC CC 5’-UTR 44.
6435. CCT CAC CGA TGC GGA CCC TC kódoló 45.
6441. ATT GAA CTT CAT GGT GCC AG kódoló 46.
6581. TCT CAC TCC CCA TAA GGC TA 5’-UTR 47.
6580. TTC CTT TGG GTT CTC GTG CC 5’-UTR 48.
6436. AAC TCG AGG TGG CCG CCG TC kódoló 54.
6434. CGC CTT CGC ATA GCC CTT TG kódoló 55.
6444. GGA AGG GGT GAT TGC GGG CC kódoló 56.
6445. AAC ACG CCC ATT GCC CAC CA kódoló 57.
6446. GTC TCA AGA TGG CGT GCT CG kódoló 58.
6553. GCG ATG GTT CAG CTG GGC CC kódoló 59.
6605. GCC CTC TCT CTC ACT CCC CA 3’-UTR 60.
6579. CTG GGA AGG TCC GAT AGA GG 3’-UTR 61.
6603. AAG GCT GAT GCT GGG AAG GT 3’-UTR 62.
A 6432., 6443., 6431., 6442., 6435., 6434., 6445., 6553., 6581. és 6603. oligonukleotidok az η-PKCmRNS-szintet több mint 50%-kal csökkentették. A leghatékonyabbnak az ISIS—6581. (a 3’-végi nem transz- 55 lálódó régióval szemben célzottan előállított) és az ISIS-6445. (a kódolórégió egy részével szemben célzottan előállított) oligonukleotidok bizonyultak, melyek a fenti vizsgálati eljárásban a PKC-mRNS csaknem teljes eltűnését eredményezték.
11. példa
Humán ζ-PKC-vel komplementer antiszensz oligonukleotidok vizsgálata Az 1. példában leírtak szerint a ζ-PKC-ol komplementer, egyenként 20 nukleotidot tartalmazó foszforotioát-oligonukleotidokból álló sorozatot állítottunk elő. A célzott szekvencia forrása a Z15108 nyilvántartási számú HSPKCZ-Genbank lokusz volt (Húg, H.). Lé60 nyegében a 6. példában leírtak szerint, Northem-lenyo16
HU 219 017 Β mat-technikával humán A549-sejtekben, 500 nmol/1 pességét. Az oligonukleotidok szekvenciáját és a vizskoncentráció alkalmazásával vizsgáltuk a fenti oligo- gálatok eredményét a 11. táblázat mutatja, nukleotidoknak a ζ-PKC-mRNS-szintet csökkentő ké11. táblázat
Az mRNS-expresszió gátlása humán A549-sejtekben humán ζ-PKC-vel komplementer antiszensz oligonukleotidok alkalmazásával
Oligo# Szekvencia Célzott régió Gátlási % Szekvencia száma
9007. CGCCGCTCCCTTCCATCTTG AUG 70 63.
9008. CCCCGTAATGCGCCTTGAGG kódoló 68 64.
9009. CTGTCCACCCACTTGAGGGT kódoló 19 65.
9010. GCTTCCTCCATCTTCTGGCT kódoló 35 66.
9011. CGGTACAGCTTCCTCCATCT kódoló 58 67.
9012. TTGGAAGAGGTGGCCGTTGG kódoló 80 68.
9013. CCTGTTAAAGCGCTTGGCTT kódoló 71 69.
9014. TGCAGGTCAGCGGGACGAGG kódoló 41 70.
9015. GCTCTTGGGAAGGCATGACA kódoló 59 71.
9016. TTCTTCAACCGCACCAGGAG kódoló 0 72.
9017. TTCTTCAACCGCACCAGGAG kódoló 73 73.
9018. CTCTGCCTCTGCATGTGGAA kódoló 63 74.
9019. TCCTTGCACATGCCGTAGTC kódoló 31 75.
9020. TCCACGCTGAACCCGTACTC kódoló 80 76.
9021. GGAGCGCCCGGCCATCATCT kódoló 81 77.
9022. GGGCTCGCTGGTGAACTGTG kódoló 83 78.
9023. GACGCACGCGGCCTCACACC stop 82 79.
9024. GGGTCAATCACGCGTGTCCA 3’-UTR 70 80.
9025. TCGGAGCCGTGCCCAGCCTG 3’-UTR 82 81.
9026. CGGGCCAGGTGTGAGGGACT 3’-UTR 40 82.
9027. CCGCGACGCAGGCACAGCAG 3’-UTR 38 83.
9028. TGGAAACCGCATGACAGCCC 3’-UTR 54 84.
9029. GGTCAGTGCATCGAGTTCTG 3’-UTR 79 85.
Ebben a kísérletben a találmány szerinti előnyös
9007., 9008., 9011., 9012., 9013., 9015., 9017., 9018.
9020., 9021., 9022., 9023., 9024., 9025., 9028. és 9029. oligonukleotidok legalább 50%-kal csökkentették az mRNS-szintet.
15. példa
Humán z-PKC-vel komplementer antiszensz oligonukleotidok vizsgálata
Az 1. példában leírtak szerint, az ε-PKC-vel komplementer, egyenként 20 nukleotidot tartalmazó foszforotioát-oligonukleotidokból álló sorozatot állítottunk elő. A célzott szekvencia forrása az X65293 nyilvántartási számú HSPK.CE Genbank-lokusz volt (Bums és munkatársai). Lényegében a 6. példában leírtak szerint, Northem-lenyomat-technikával, humán A549-sejtekben 500 nmol/1 koncentráció alkalmazásával vizsgáltuk a fenti oligonukleotidoknak az ε-PKC-mRNSszintet csökkentő képességét. Az oligonukleotidok szekvenciáját és a vizsgálatok eredményét a 12. táblázat mutatja.
HU 219 017 Β
12. táblázat
Az mRNS-expresszió gátlása humán A549-sejtekben humán ε-PKC-vel komplementer antiszensz oligonukleotidok alkalmazásával
Oligo# Szekvencia Célzott régió Gátlás, % Szekvencia száma
7933. ACTACCATGGTCGGGGCGGG AUG 0 86.
7934. GTCCCACCGCATGGCGCAGC kódoló 0 87.
7935. GTTTGGCCGATGCGCGAGTC kódoló 0 88.
7936. TGCAGTTGGCCACGAAGTCG kódoló 0 89.
8032. GTGGGGCATGTTGACGCTGA kódoló 0 90.
8031. CCAGAGCAGGGACCCACAGT kódoló 0 91.
7939. TCTCCTCGGTTGTCAAATGA kódoló 0 92.
7940. CGGTGCTCCTCTCCTCGGTT kódoló 0 93.
7941. AGCCAAAATCCTCTTCTCTG kódoló 0 94.
7942. CATGAGGGCCGATGTGACCT kódoló 62 95.
7943. ATCCCTTCCTTGCACATCCC kódoló 4 96.
7944. CCCCAGGGCCCACCAGTCCA kódoló 42 97.
7945. AGCACCCCCAGGGCCCACCA kódoló 56 98.
7946. CGTACATCAGCACCCCCAGG kódoló 55 99.
7947. CCAGCCATCATCTCGTACAT kódoló 15 100.
7948. TGCCACACAGCCCAGGCGCA kódoló 55 101.
7949. TCAGGGCATCAGGTCTTCAC stop 0 102.
7950. CTCTCAGGGCATCAGGTCTT stop 0 103.
Ebben a kísérletben a találmány szerinti előnyös
7942., 7944., 7945., 7946. és 7948. oligonukleotidok legalább 40%-kal csökkentették az mRNS-szintet.
16. példa
A humán a-PKC 3 '-végi nem transzlálódó régiójának DNS-szekvenálása
A549-sejteket (American Type Culture Collection, Bethesda MD) 6 rekeszű lemezeken (Falcon Labware, Lincoln Park, NJ) 1 g/1 glükózt és 10% boíjúszérumot (FCS, Irvine Scientific, Santa Ana, CA) tartalmazó Dulbecco-féle módosított Eagle-tápfolyadékban (DME) egybefüggő tenyészet kialakulásáig tenyésztettünk. A sejteket összegyűjtöttük, és azokból szokásos eljárások alkalmazásával [Sambrook J., Fritsch E. és T. Maniatis: „Molecular Cloning: A Laboratory Manual”; „Cold Spring Harbor Laboratory”, Cold Spring Harbor, N. Y., 7. fejezet, (1989)] össz-RNS-t izoláltunk.
A Frohman és munkatársai szerinti 3’-RACEtechnika [Frohman M. A., Dush Μ. K. és G. R. Martin, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 85, 8998-9002 (1988)], valamint a 3’-RACE-reagenskészlet (Gibco/BRL, Bethesda, MD) alkalmazásával az RNS-ről cDNS-t állítottunk elő. Az első cDNS-szál előállításához egy oligodT láncindító oligonukleotidot használtunk. A poli(A)farok helyétől történő további amplifikációs lépésekben egy, a reagenskészlethez mellékelt oligonukleotidot vagy egy azzal megegyező oligonukleotidot (ISIS—5586.107. azonosító számú szekvencia: 5’-GGCCACGCGTCGACTAGTACTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’) alkalmaztunk. Az ismert szekvencia belső részéről történő amplifikációhoz az ISIS-6288. oligonukleotidot használtuk (108. azonosító számú szekvencia : 5 ’-GGGGTAGAATGCGGCGGCAGTATGAAACTCACCAGCG-3’). A PCR-reakcióban kapott DNSt gélen tisztítottuk, Sáli és Bell enzimekkel emésztettük, majd szokásos eljárásokkal [Sambrook és munkatársai (1989)] Bluescript-plazmidba klónoztuk (Stratagene, LaJolla, CA). A klónozott DNS-t „Sequenase Kit” (USB) felhasználásával szekvenáltuk.
A kapott szekvenciát, amely a korábban ismert szekvencia 3’-vége közelében található Bell hasítási helytől (Genbank, nyilvántartási szám: X52479) a legáltalánosabban kapott poliadenilezést helyig tartó szekvencia, a
13. ábrán az 56-1136. nukleotidok mutatják. Ez a hely feltehetően a rövid (4 kb) a-PKC-transzkriptum 3’végének felel meg.
Hogy a fenti szekvencia folytatását, ezáltal a hosszú (8,5 kb) α-PKC-transzkriptumra specifikus szekvenciákat megkapjuk, Inverse-PCR-technikát alkalmaztunk [Ochman H., Gerber A. S. és Hartl D. L, Genetics 120, 621-623 (1988)]. A fenti eljárást három alkalommal, három láncindító oligonukleotidkombináció, valamint restrikciós enzimek felhasználásával végeztük. Mindegyik lépés körülbelül 200 bázisnak megfelelő új szekvenciát eredményezett; a teljes új szekvenciát (104. számú szekvencia) a 13. ábrán vastag betűvel jelöltük (1137-1812. nukleotidok). Ez a szekvencia a korábban közölt α-PKC-cDNS-szekvencia végének közelében található Bell hasítási hellyel (TGATCA) kezdődik és 3’18
HU 219 017 Β irányban folytatását képezi az előzőnek [Finkenzeller és munkatársai, Nucl. Acids Rés. 18,2183 (1990); Genbank-nyilvántartási szám: X52479]. Az újonnan meghatározott szekvenciák az 56. nukleotiddal kezdődnek, és azokat aláhúzással jelöltük (105. azonosító számú szekvencia). A legáltalánosabb poliadenilezést hely, mely feltehetően megfelel a rövid (4 kb) mRNS-transzkriptum 3’-végének, az 1136. nukleotidnál található. Ettől a helytől 3’-irányban található, tehát a hosszú transzkriptumra egyedileg jellemző szekvenciákat vastag betűvel jelöltük (106. azonosító számú szekvencia).
17. példa
Az O.-PKC 3 '-végi nem transzlálódó régiójában (UTR) található újonnan meghatározott szekvenciákkal szemben célzottan előállított antiszensz oligonukleotidok
A 16. példa szerint meghatározott új szekvenciákkal komplementer, foszforotioát antiszensz oligonukleotidokból álló sorozatot terveztünk és állítottunk elő. 20
A548-sejtekben vizsgáltuk a kezelés kezdetétől számított 24 óra elteltével fenti oligonukleotidoknak az aPKC-RNS-szintet csökkentő vagy kiküszöbölő hatását. Az A549-sejteket foszforotioát-oligonukleotidokkal ke5 zeltünk 500 mol/1 koncentrációban alkalmazva, 4 órán át, kationos DOTMA/DOPE lipidek jelenlétében, majd mosást végeztünk, és a sejteket további 20 órán át hagytuk regenerálódni. A sejtekből össz-RNS-t extraháltunk, mindegyik mintából 20 pg mennyiséget 1,2%-os 10 géleken szétválasztottunk, és nejlonmembránokra vittünk át. A fenti lenyomatokat 32P-jelölt radioaktív aPKC-cDNS-próbával vizsgáltuk, majd a próbát eltávolítottuk, és az egyforma RNS-tartalom bizonyítása céljából a membránokat radioaktívan jelölt G3PDH-próbá15 val ismételten vizsgáltuk. A két fő a-PKC-transzkriptumot (8,5 kb és 4 kb) vizsgáltuk, és azok mennyiségét Phosphorlmager készülékkel (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA) meghatároztuk. Az oligonukleotidokat és azok aktivitását a 13. táblázat mutatja.
13. táblázat
Az α-PKC-mRNS (mind a hosszú, mind a rövid transzkript) gátlása foszforotioát antiszensz oligonukleotidokkal (500 nmol/1 koncentrációban alkalmazva); az eredményeket a kontroll-mRNS-szint százalékában adtuk meg
ISIS# Szekvencia Aktivitás (%) Célzott régió Szekvencia száma
7416. CAGTGCCCATGTGCAGGGAG 100 α-PKC hosszú mRNS 109.
7417. AGAACCTGCACAAATAGAGC 100 a-PKC hosszú mRNS 110.
7418. AGAAACAAGAACCTGCACAA 100 a-PKC hosszú mRNS 111.
7419. GCAAGGGATTCAGCTAAAAC 100 a-pKC hosszú mRNS 112.
7420. AGGGAGGGAAAGCACAGAAG 100 a-pKC hosszú mRNS 113.
7902. AGGGAGGGAAAGCACAGAAG 90 a-PKC hosszú mRNS 113.
7907. TCAGCTCAAAAATAGTCCTC 85 a-PKC hosszú mRNS 114.
7908. CGAAAGGTGACATGAAGAAA 100 a-PKC hosszú mRNS 115.
7909. GGCGGAGGAACCAGGACGAA 90 a-pKC hosszú mRNS 116.
7911. GCAATGCCACGTGTGTACCA 50 a-PKC hosszú mRNS 117.
7912. TGCAAAACGTATTAAAATCC 100 a-pKC rövid mRNS 118.
7913. TTATAAACATGCAAAATTCA 100 a-PKC rövid mRNS 119.
Az ISIS—7911. (117. azonosító számú szekvencia) ebben az előzetes vizsgálatban (mind a hosszú, mind a rövid) α-PKC-mRNS-szintet a kontrolihoz viszonyítva 50 50%-kal csökkentette. A fenti oligonukleotid tehát a találmány szerint előnyös oligonukleotid. További vizsgálatok azt mutatták, hogy az ISIS-7911. a kezelés első hat órájában szelektív módon csökkentette a hosszú (8,5 kb) transzkriptum mennyiségét, a kezelést köve- 55 tőén 3 órával a szelektivitás háromszoros különbséget eredményezett. Az ISIS-7911. oligonukleotiddal végzett kezelést követően 12 órával mindkét transzkriptum szintje több mint 80%-kal csökkent. Az adatokat a
14. ábrán időgörbén ábrázoltuk. 60
SZEKVENCIALISTA (1) ÁLTALÁNOS INFORMÁCIÓ:
(i) BEJELENTŐ: ISIS PHARMACEUTICALS, INC.
(ii) A TALÁLMÁNY CÍME: Protein-kináz-C expressziójának szabályozása oligonukleotidok alkalmazásával (iii) A SZEKVENCIÁK SZÁMA .119 (iv) LEVELEZÉSI CÍM:
(v) KOMPUTERREL OLVASHATÓ FORMA:
(vi) AKTUÁLIS BEJELENTÉSI ADATOK:
(viii) KÉPVISELŐ:
(ix) TELEKOMMUNIKÁCIÓS ADATOK:
HU 219 017 Β (2) INFORMÁCIÓK AZ 1. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:
(A) HOSSZ: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (iv) Antiszensz: igen (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 1. szekvencia CCCCAACCAC CTCTTGCTCC 20 (2) INFORMÁCIÓK A 2. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZ: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (iv) Antiszensz: igen (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 2. szekvencia GTTCTCGCTG GTGAGTTTCA 20 (2) INFORMÁCIÓK A 3. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZ: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (iv) Antiszensz: igen (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 3. szekvencia AAAACGTCAG CCATGGTCCC 20 (2) INFORMÁCIÓK A 4. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZ: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (iv) Antiszensz: igen (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 4. szekvencia GGATTCACTT CCACTGCGGG 20 (2) INFORMÁCIÓK AZ 5. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZ: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (iv) Antiszensz: igen (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 5. szekvencia GAGACCCTGA ACAGTTGATC 20 (2) INFORMÁCIÓK A 6. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZ: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (iv) Antiszensz: igen (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 6. szekvencia CCCGGGAAAA CGTCAGCCAT 20 (2) INFORMÁCIÓK A 7. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZ: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (iv) Antiszensz: igen (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 7. szekvencia CTGCCTCAGC GCCCCTTTGC 20 (2) INFORMÁCIÓK A 8. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZ: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (iv) Antiszensz: igen (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 8. szekvencia AGTCGGTGCA GTGGCTGGAG 20 (2) INFORMÁCIÓK A 9. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZ: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (iv) Antiszensz: igen (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 9. szekvencia GCAGAGGCTG GGGACATTGA 20 (2) INFORMÁCIÓK A 10. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZ: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (iv) Antiszensz: igen (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 10. szekvencia GGGCTGGGGA GGTGTTTGTT 20 (2) INFORMÁCIÓK A 11. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZ: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (iv) Antiszensz: igen (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 11. szekvencia CACTGCGGGG AGGGCTGGGG 20 (2) INFORMÁCIÓK A 12. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZ: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (iv) Antiszensz: igen (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 12. szekvencia AGCCGTGGCC TTAAAATTTT 20 (2) INFORMÁCIÓK A 13. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZ: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (iv) Antiszensz: igen (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 13. szekvencia ATTTTCAGGC CTCCATATGG 20 (2) INFORMÁCIÓK A 14. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZ: 20
HU 219 017 Β (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (iv) Antiszensz: igen (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 14. szekvencia AAGAGAGAGA CCCTGAACAG 20 (2) INFORMÁCIÓK A 15. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZ: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (iv) Antiszensz: igen (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 15. szekvencia GATAATGTTC TTGGTTGTAA 20 (2) INFORMÁCIÓK A 16. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZ: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (iv) Antiszensz: igen (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 16. szekvencia ATGGGGTGCA CAAACTGGGG 20 (2) INFORMÁCIÓK A 17. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZ: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (iv) Antiszensz: igen (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 17. szekvencia GTCAGCCATG GTCCCCCCCC 20 (2) INFORMÁCIÓK A 18. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZ: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (iv) Antiszensz: igen (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 18. szekvencia CGCCGTGGAG TCGTTGCCCG 20 (2) INFORMÁCIÓK A 19. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:
(A) HOSSZ: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (iv) Antiszensz: igen (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 19. szekvencia TCAAATGGAG GCTGCCCGGC 20 (2) INFORMÁCIÓK A 20. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZ: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (iv) Antiszensz: igen (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 20. szekvencia TGGAATCAGA CACAAGCCGT 20 (2) INFORMÁCIÓK A 21. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZ: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (iv) Antiszensz: igen (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 21. szekvencia CATCTTGCGC GCGGGGAGCC 20 (2) INFORMÁCIÓK A 22. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZ: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (iv) Antiszensz: igen (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 22. szekvencia TGCGCGCGGG GAGCCGGAGC 20 (2) INFORMÁCIÓK A 23. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZ: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (iv) Antiszensz: igen (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 23. szekvencia CGAGAGGTGC CGGCCCCGGG 20 (2) INFORMÁCIÓK A 24. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZ: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (iv) Antiszensz: igen (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 24. szekvencia CTCTCCTCGC CCTCGCTCGG 20 (2) INFORMÁCIÓK A 25. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZ: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (iv) Antiszensz: igen (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 25. szekvencia TGGAGTTTGC ATTACCCTAC 20 (2) INFORMÁCIÓK A 26. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZ: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (iv) Antiszensz: igen (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 26. szekvencia AAAGGCCTCT AAGACAAGCT 20 (2) INFORMÁCIÓK A 27. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZ: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris
HU 219 017 Β (iv) Antiszensz: igen (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 27. szekvencia GCCAGCATGT GCACCGTGAA 20 (2) INFORMÁCIÓK A 28. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZ: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (iv) Antiszensz: igen (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 28. szekvencia ACACCCCAGG CTCAACGATG 20 (2) INFORMÁCIÓK A 29. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZ: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (iv) Antiszensz: igen (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 29. szekvencia CCGAAGCTTA CTCACAATTT 20 (2) INFORMÁCIÓK A 30. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZ: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (iv) Antiszensz: igen (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 30. szekvencia ACTTAGCTCT TGACTTCGGG 20 (2) INFORMÁCIÓK A 31. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZ: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (iv) Antiszensz: igen (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 31. szekvencia ATGCTGCGGA AAATAAATTG 20 (2) INFORMÁCIÓK A 32. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZ: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (iv) Antiszensz: igen (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 32. szekvencia ATTTTATTTT GAGCATGTTC 20 (2) INFORMÁCIÓK A 33. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZ: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (iv) Antiszensz: igen (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 33. szekvencia TTTGGGGATG AGGGTGAGCA 20 (2) INFORMÁCIÓK A 34. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZ: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (iv) Antiszensz: igen (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 34. szekvencia CCCATTCCCA CAGGCCTGAG 20 (2) INFORMÁCIÓK A 35. SZEKVENCIÁHOZ (1) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZ: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (iv) Antiszensz: igen (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 35. szekvencia CGGAGCGCGC CAGGCAGGGA 20 (2) INFORMÁCIÓK A 36. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZ: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (iv) Antiszensz: igen (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 36. szekvencia CCTTTTCCCA GACCAGCCAT 20 (2) INFORMÁCIÓK A 37. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZ: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (iv) Antiszensz: igen (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 37. szekvencia GGCCCCAGAA ACGTAGCAGG 20 (2) INFORMÁCIÓK A 38. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZ: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (iv) Antiszensz: igen (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 38. szekvencia GGATCCTGCC TTTCTTGGGG 20 (2) INFORMÁCIÓK A 39. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZ: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (iv) Antiszensz: igen (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 39. szekvencia CAGCCATGGC CCCAGAAACG 20 (2) INFORMÁCIÓK A 40. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZ: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (iv) Antiszensz: igen (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 40. szekvencia CGACATGCCG GCGCCGCTGC 20
HU 219 017 Β (2) INFORMÁCIÓK A 41. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:
(A) HOSSZ: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (iv) Antiszensz: igen (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 41. szekvencia CAGACGACAT GCCGGCGCCG 20 (2) INFORMÁCIÓK A 42. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:
(A) HOSSZ: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (iv) Antiszensz: igen (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 42. szekvencia GCCTGCTTCG CAGCGGGAGA 20 (2) INFORMÁCIÓK A 43. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZ: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (iv) Antiszensz: igen (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 43. szekvencia ACAGGTGCAG GAGTCGAGGC 20 (2) INFORMÁCIÓK A 44. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZ: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (iv) Antiszensz: igen (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 44. szekvencia GTCCCGTCTC AGGCCAGCCC 20 (2) INFORMÁCIÓK A 45. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:
(A) HOSSZ: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (iv) Antiszensz: igen (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 45. szekvencia CCTCACCGAT GCGGACCCTC 20 (2) INFORMÁCIÓK A 46. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZ: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (iv) Antiszensz: igen (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 46. szekvencia ATTGAACTTC ATGGTGCCAG 20 (2) INFORMÁCIÓK A 47. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:
(A) HOSSZ: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (iv) Antiszensz: igen (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 47. szekvencia TCTCACTCCC CATAAGGCTA 20 (2) INFORMÁCIÓK A 48. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZ: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (iv) Antiszensz: igen (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 48. szekvencia TTCCTTTGGG TTCTCGTGCC 20 (2) INFORMÁCIÓK A 49. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZ: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (iv) Antiszensz: igen (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 49. szekvencia TTCCATCCTT CGACAGAGTT 20 (2) INFORMÁCIÓK AZ 50. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZ: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (iv) Antiszensz: igen (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 50. szekvencia AGGCTGATGC TGGGAAGGTC 20 (2) INFORMÁCIÓK AZ 51. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZ: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (iv) Antiszensz: igen (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 51. szekvencia GTTCTAAGGC TGATGCTGGG 20 (2) INFORMÁCIÓK AZ 52. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZ: 18 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (iv) Antiszensz: igen (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 52. szekvencia TTCTCGCTGG TGAGTTTC 18 (2) INFORMÁCIÓK AZ 53. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZ: 17 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (iv) Antiszensz: igen (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 53. szekvencia TCTCGCTGGT GAGTTTC 17 (2) INFORMÁCIÓK AZ 54. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZ: 20
HU 219 017 Β (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (iv) Antiszensz: igen (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 54. szekvencia AACTCGAGGT GGCCGCCGTC 20 (2) INFORMÁCIÓK AZ 55. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZ: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (iv) Antiszensz: igen (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 55. szekvencia CGCCTTCGCA TAGCCCTTTG 20 (2) INFORMÁCIÓK AZ 56. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZ: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (iv) Antiszensz: igen (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 56. szekvencia GGAAGGGGTG ATTGCGGGCC 20 (2) INFORMÁCIÓK AZ 57. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:
(A) HOSSZ: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (iv) Antiszensz: igen (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 57. szekvencia AACACGCCCA TTGCCCACCA 20 (2) INFORMÁCIÓK AZ 58. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZ: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (iv) Antiszensz: igen (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 58. szekvencia GTCTCAAGAT GGCGTGCTCG 20 (2) INFORMÁCIÓK AZ 59. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZ: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (iv) Antiszensz: igen (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 59. szekvencia GCGATGGTTC AGCTGGGCCC 20 (2) INFORMÁCIÓK A 60. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZ: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (iv) Antiszensz: igen (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 60. szekvencia GCCCTCTCTC TCACTCCCCA 20 (2) INFORMÁCIÓK A 61. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZ: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (iv) Antiszensz: igen (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 61. szekvencia CTGGGAAGGT CCGATAGAGG 20 (2) INFORMÁCIÓK A 62. SZEKVENCIÁHOZ (1) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZ: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (iv) Antiszensz: igen (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 62. szekvencia AAGGCTGATG CTGGGAAGGT 20 (2) INFORMÁCIÓK A 63. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZ: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (iv) Antiszensz: igen (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 63. szekvencia CGCCGCTCCC TTCCATCTTG 20 (2) INFORMÁCIÓK A 64. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZ: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (iv) Antiszensz: igen (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 64. szekvencia CCCCGTAATG CGCCTTGAGG 20 (2) INFORMÁCIÓK A 65. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZ: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (iv) Antiszensz: igen (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 65. szekvencia CTGTCCACCC ACTTGAGGGT 20 (2) INFORMÁCIÓK A 66. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZ: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (iv) Antiszensz: igen (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 66. szekvencia GCTTCCTCCA TCTTCTGGCT 20 (2) INFORMÁCIÓK A 67. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZ: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris
HU 219 017 Β (iv) Antiszensz: igen (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 67. szekvencia CGGTACAGCT TCCTCCATCT 20 (2) INFORMÁCIÓK A 68. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZ: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (iv) Antiszensz: igen (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 68. szekvencia TTGGAAGAGG TGGCCGTTGG 20 (2) INFORMÁCIÓK A 69. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZ: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (iv) Antiszensz: igen (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 69. szekvencia CCTGTTAAAG CGCTTGGCTT 20 (2) INFORMÁCIÓK A 70. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZ: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (iv) Antiszensz: igen (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 70. szekvencia TGCAGGTCAG CGGGACGAGG 20 (2) INFORMÁCIÓK A 71. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZ: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (iv) Antiszensz: igen (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 71. szekvencia GCTCTTGGGA AGGCATGACA 20 (2) INFORMÁCIÓK A 72. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZ: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (iv) Antiszensz: igen (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 72. szekvencia TTCTTCAACC GCACCAGGAG 20 (2) INFORMÁCIÓK A 73. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZ: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (iv) Antiszensz: igen (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 73. szekvencia TTCTTCAACC GCACCAGGAG 20 (2) INFORMÁCIÓK A 74. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZ: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (iv) Antiszensz: igen (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 74. szekvencia CTCTGCCTCT GCATGTGGAA 20 (2) INFORMÁCIÓK A 75. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZ: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (iv) Antiszensz: igen (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 75. szekvencia TCCTTGCACA TGCCGTAGTC 20 (2) INFORMÁCIÓK A 76. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZ: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (iv) Antiszensz: igen (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 76. szekvencia TCCACGCTGA ACCCGTACTC 20 (2) INFORMÁCIÓK A ΊΊ. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZ: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (iv) Antiszensz: igen (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: ΊΊ. szekvencia GGAGCGCCCG GCCATCATCT 20 (2) INFORMÁCIÓK A 78. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZ: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (iv) Antiszensz: igen (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 78. szekvencia GGGCTCGCTG GTGAACTGTG 20 (2) INFORMÁCIÓK A 79. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZ: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (iv) Antiszensz: igen (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 79. szekvencia GACGCACGCG GCCTCACACC 20 (2) INFORMÁCIÓK A 80. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZ: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (iv) Antiszensz: igen (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 80. szekvencia GGGTCAATCA CGCGTGTCCA 20
HU 219 017 Β (2) INFORMÁCIÓK A 81. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:
(A) HOSSZ: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (iv) Antiszensz: igen (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 81. szekvencia TCGGAGCCGT GCCCAGCCTG 20 (2) INFORMÁCIÓK A 82. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZ: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (iv) Antiszensz: igen (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 82. szekvencia CGGGCCAGGT GTGAGGGACT 20 (2) INFORMÁCIÓK A 83. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZ: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (iv) Antiszensz: igen (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 83. szekvencia CCGCGACGCA GGCACAGCAG 20 (2) INFORMÁCIÓK A 84. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZ: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (iv) Antiszensz: igen (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 84. szekvencia TGGAAACCGC ATGACAGCCC 20 (2) INFORMÁCIÓK A 85. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZ: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (iv) Antiszensz: igen (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 85. szekvencia GGTCAGTGCA TCGAGTTCTG 20 (2) INFORMÁCIÓK A 86. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZ: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (iv) Antiszensz: igen (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 86. szekvencia ACTACCATGG TCGGGGCGGG 20 (2) INFORMÁCIÓK A 87. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:
(A) HOSSZ: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (iv) Antiszensz: igen (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 87. szekvencia GTCCCACCGC ATGGCGCAGC 20 (2) INFORMÁCIÓK A 88. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZ: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (iv) Antiszensz: igen (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 88. szekvencia GTTTGGCCGA TGCGCGAGTC 20 (2) INFORMÁCIÓK A 89. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZ: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (iv) Antiszensz: igen (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 89. szekvencia TGCAGTTGGC CACGAAGTCG 20 (2) INFORMÁCIÓK A 90. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZ: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (iv) Antiszensz: igen (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 90. szekvencia GTGGGGCATG TTGACGCTGA 20 (2) INFORMÁCIÓK A 91. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZ: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (iv) Antiszensz: igen (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 91. szekvencia CCAGAGCAGG GACCCACAGT 20 (2) INFORMÁCIÓK A 92. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZ: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (iv) Antiszensz: igen (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA : 92. szekvencia TCTCCTCGGT TGTCAAATGA 20 (2) INFORMÁCIÓK A 93. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZ: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (iv) Antiszensz: igen (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 93. szekvencia CGGTGCTCCT CTCCTCGGTT 20 (2) INFORMÁCIÓK A 94. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZ: 20
HU 219 017 Β (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (iv) Antiszensz: igen (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 94. szekvencia 5 AGCCAAAATC CTCTTCTCTG 20 (2) INFORMÁCIÓK A 95. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZ: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav 10 (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (iv) Antiszensz: igen (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 95. szekvencia CATGAGGGCC GATGTGACCT 20 15 (2) INFORMÁCIÓK A 96. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZ: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres 20 (D) TOPOLÓGIA: lineáris (iv) Antiszensz: igen (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 96. szekvencia ATCCCTTCCT TGCACATCCC 20 (2) INFORMÁCIÓK A 97. SZEKVENCIÁHOZ 25 (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZ: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris 30 (iv) Antiszensz: igen (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 97. szekvencia CCCCAGGGCC CACCAGTCCA 20 (2) INFORMÁCIÓK A 98. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK: 35 (A) HOSSZ: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (iv) Antiszensz: igen 40 (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 98. szekvencia AGCACCCCCA GGGCCCACCA 20 (2) INFORMÁCIÓK A 99. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZ: 20 45 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (iv) Antiszensz: igen (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 99. szekvencia
CGTACATCAG CACCCCCAGG 20 (2) INFORMÁCIÓK A 100. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZ: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (iv) Antiszensz: igen (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 100. szekvencia CCAGCCATCA TCTCGTACAT 20 (2) INFORMÁCIÓK A 101. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZ: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (iv) Antiszensz: igen (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 101. szekvencia TGCCACACAG CCCAGGCGCA 20 (2) INFORMÁCIÓK A 102. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZ: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (iv) Antiszensz: igen (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 102. szekvencia TCAGGGCATC AGGTCTTCAC 20 (2) INFORMÁCIÓK A 103. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZ: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (iv) Antiszensz: igen (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 103. szekvencia CTCTCAGGGC ATCAGGTCTT 20 (2) INFORMÁCIÓK A 104. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZ: 1812 BÁZISPÁR (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZÁM: KETTŐS (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) Molekula típusa: DNS (genomi) (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 104. szekvencia
TGATCAACTG TTCAGGGTCT CTCTCTTACA ACCAAGAACA TTATCTTAGT GGAAGATGGT
ACGTCATGCT CAGTGTCCAG TTTAATTCTG TAGAAGTTAC GTCTGGCTCT AGGTTAACCC
120
TTCCTAGAAA GCAAGCAGAC TGTTGCCCCA TTTTGGGTAC AATTTGATAT ACTTTCCATA
1Θ0
HU 219 017 Β
104. szekvencia (folytatás)
CCCTCCATCT 240 GTGGATTTTT CAGCATTGGA ATCCCCCAAC CAGAGATGTT AAAGTGAGCT
GTCCCAGGAA 300 ACATCTCCAC CCAAGACGTC TTTGGAATCC AAGAACAGGA AGCCAAGAGA
GTGAGCAGGG 360 AGGGATTGGG GGTGGGGGGA GGCCTCAAAA TACCGACTGC GTCCATTCTC
TGCCTCCATG 420 GAAACAGCCC CTAGAATCTG AAAGGCCGGG ATAAACCTAA TCACTGTTCC
CAAACATTGA 480 CAAATCCTAA CCCAACCATG GTCCAGCAGT TACCAGTTTA AACAAAAAAA
ACCTCAGATG 540 AGTGTTGGGT GAATCTGTCA TCTGGTACCC TCCTTGGTTG ATAACTGTCT
TGATACTTTT 600 CATTCTTTGT AAGAGGCCAA ATCGTCTAAG GACGTTGCTG AACAAGCGTG
TGAAATCATT 660 TCAGATCAAG GATAAGCCAG TGTGTACATA TGTTCATTTT AATCTCTGGG
AGATTATTTT 720 TCCATCCAGG GTGCCATCAG TAATCATGCC ACTACTCACC AGTGTTGTTC
GCCAACACCC 780 ACCCCCACAC ACACCAACAT TTTGCTGCCT ACCTTGTTAT CCTTCTCAAG
AAGCTGAAGT 840 GTACGCCCTC TCCCCTTTTG TGCTTATTTA TTTAATAGGC TGCAGTGTCG
CTTATGAAAG 900 TACGATGTAC AGTAACTTAA TGGAAGTGCT GACTCTAGCA TCAGCCTCTA
CCGATTGATT 960 TTCCTCCCTT CTCTAGCCCT GGATGTCCAC TTAGGGATAA AAAGAATATG
GTTTTGGTTC CCATTTCTAG TTCACGTTGA ATGACAGGCC TGGAGCTGTA GAATCAGGAA
1020
HU 219 017 Β
104. szekvencia (folytatás)
ACCCGGATGC CTAACAGCTC AAAGATGTTT TGTTAATAGA AGGATTTTAA TACGTTTTGC
1080
AAATGCATCA TGCAATGAAT TTTGCATGTT TATAATAAAC CTTAATAACA AGTGAATAGA
1140
AGGATTTTAA TACGTTTTGC AAATGCATCA TGCAATGAAT TTTGCATGTT TATAATAAAC
1200
CTTAATAACA AGTGAATCTA TATTATTGAT ATAATCGTAT CAAGTATAAA GAGAGTATTA
1260
TAATAATTTT ATAAGACACA ATTGTGCTCT ATTTGTGCAG GTTCTTGTTT CTAATCCTCT
1320
TTTCTAATTA AGTTTTAGCT GAATCCCTTG CTTCTGTGCT TTCCCTCCCT GCACATGGGC
1380
ACTGTATCAG ATAGATTACT TTTTAAATGT AGATAAAATT TCAAAAATGA ATGGCTAGTT
1440
TACGTGATAG ATTAGGCTCT TACTACATAT GTGTGTGTAT ATATATGTAT TTGATTCTAC
1500
CTGCAAACAA ATTTTTATTG GTGAGGACTA TTTTTGAGCT GACACTCCCT CTTAGTTTCT
1560
TCATGTCACC TTTCGTCCTG GTTCCTCCGC CACTCTTCCT CTTGGGGACA ACAGGAAGTG
1620
TCTGATTCCA GTCTGGCCTA GTACGTTGGT ACACACGTGG CATTGCGCAG CACCTGGGCT 1680
GACCTTTGTG TGTAGCGTGT GTGTGTGTTT CCTTCTTCCC TTCAGCCTGT GACTGTTGCT
1740
GACTCCAGGG GTGGGAGGGA TGGGGAGACT CCCCTCTTGC TGTGTGTACT GGACACGCAG
1800
GAAGCATGCT GA
1812
HU 219 017 Β (2) INFORMÁCIÓK A 105. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZ: 1757 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZÁM: kettős (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) Molekula típusa: DNS (genomi) (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 105. szekvencia
ATGGTACGTC ATGCTCAGTG TCCAGTTTAA TTCTGTAGAA GTTACGTCTG GCTCTAGGTT
AACCCTTCCT AGAAAGCAAG CAGACTGTTG CCCCATTTTG GGTACAATTT GATATACTTT
120
CCATACCCTC CATCTGTGGA TTTTTCAGCA TTGGAATCCC CCAACCAGAG ATGTTAAAGT
180
GAGCTGTCCC AGGAAACATC TCCACCCAAG ACGTCTTTGG AATCCAAGAA CAGGAAGCCA
240
AGAGAGTGAG CAGGGAGGGA TTGGGGGTGG GGGGAGGCCT CAAAATACCG ACTGCGTCCA
300
TTCTCTGCCT CCATGGAAAC AGCCCCTAGA ATCTGAAAGG CCGGGATAAA CCTAATCACT
360
GTTCCCAAAC ATTGACAAAT CCTAACCCAA CCATGGTCCA GCAGTTACCA GTTTAAACAA
420
AAAAAACCTC AGATGAGTGT TGGGTGAATC TGTCATCTGG TACCCTCCTT GGTTGATAAC
480
TGTCTTGATA CTTTTCATTC TTTGTAAGAG GCCAAATCGT CTAAGGACGT TGCTGAACAA
540
GCGTGTGAAA tcatttcaga tcaaggataa gccagtgtgt acatatgttc attttaatct
600 ctgggagatt atttttccat ccagggtgcc atcagtaatc atgccactac tcaccagtgt
660
TGTTCGCCAA CACCCACCCC CACACACACC AACATTTTGC TGCCTACCTT GTTATCCTTC
720
TCAAGAAGCT GAAGTGTACG CCCTCTCCCC TTTTGTGCTT ATTTATTTAA TAGGCTGCAG
780
HU 219 017 Β
105. szekvencia (folytatás)
TGTCGCTTAT GAAAGTACGA TGTACAGTAA CTTAATGGAA GTGCTGACTC TAGCATCAGC
840
CTCTACCGAT TGATTTTCCT CCCTTCTCTA GCCCTGGATG TCCACTTAGG GATAAAAAGA
900
ATATGGTTTT GGTTCCCATT TCTAGTTCAC GTTGAATGAC AGGCCTGGAG CTGTAGAATC
960
AGGAAACCCG GATGCCTAAC AGCTCAAAGA TGTTTTGTTA ATAGAAGGAT TTTAATACGT
1020
TTTGCAAATG CATCATGCAA TGAATTTTGC ATGTTTATAA TAAACCTTAA TAACAAGTGA
1080
ATAGAAGGAT TTTAATACGT TTTGCAAATG CATCATGCAA TGAATTTTGC ATGTTTATAA
1140
TAAACCTTAA TAACAAGTGA ATCTATATTA TTGATATAAT CGTATCAAGT ATAAAGAGAG
1200
TATTATAATA ATTTTATAAG ACACAATTGT GCTCTATTTG TGCAGGTTCT TGTTTCTAAT
1260
CCTCTTTTCT AATTAAGTTT TAGCTGAATC CCTTGCTTCT GTGCTTTCCC TCCCTGCACA
1320
TGGGCACTGT ATCAGATAGA TTACTTTTTA AATGTAGATA AAATTTCAAA AATGAATGGC
1380
TAGTTTACGT GATAGATTAG GCTCTTACTA CATATGTGTG TGTATATATA TGTATTTGAT 1440
TCTACCTGCA AACAAATTTT TATTGGTGAG GACTATTTTT GAGCTGACAC TCCCTCTTAG
1500
TTTCTTCATG TCACCTTTCG TCCTGGTTCC TCCGCCACTC TTCCTCTTGG GGACAACAGG
1560
AAGTGTCTGA TTCCAGTCTG GCCTAGTACG TTGGTACACA CGTGGCATTG CGCAGCACCT
1620
HU 219 017 Β
105. szekvencia (folytatás) gccctgacch: ttgtgtgtag cgtgtgtgtg tgtttccttc ttcccttcag cctgtgactg
1680
TTGCTGACTC CAGGGGTGGG AGGGATGGGG AGACTCCCCT CTTGCTGTGT GTACTGGACA
1740
CGCAGGAAGC ATGCTGA
1757 (2) INFORMÁCIÓK A 106. SZEKVENCIÁHOZ (C) SZÁLSZÁM: kettős (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZ: 676 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) Molekula típusa: DNS (genomi) (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 106. szekvencia
TAGAAGGATT TTAATACGTT TTGCAAATGC ATCATGCAAT GAATTTTGCA TGTTTATAAT
AAACCTTAAT AACAAGTGAA TCTATATTAT TGATATAATC GTATCAAGTA TAAAGAGAGT
120
ATTATAATAA TTTTATAAGA CACAATTGTG CTCTATTTGT GCAGGTTCTT GTTTCTAATC
180
CTCTTTTCTA ATTAAGTTTT AGCTGAATCC CTTGCTTCTG TGCTTTCCCT CCCTGCACAT 240
GGGCACTGTA TCAGATAGAT TACTTTTTAA ATGTAGATAA AATTTCAAAA ATGAATGGCT 300
AGTTTACGTG ATAGATTAGG CTCTTACTAC ATATGTGTGT GTATATATAT GTATTTGATT
360
CTACCTGCAA ACAAATTTTT ATTGGTGAGG ACTATTTTTG AGCTGACACT CCCTCTTAGT
420
TTCTTCATGT CACCTTTCGT CCTGGTTCCT CCGCCACTCT TCCTCTTGGG GACAACAGGA
480
AGTGTCTGAT TCCAGTCTGG CCTAGTACGT TGGTACACAC GTGGCATTGC GCAGCACCTG'
540
HU 219 017 Β
106. szekvencia (folytatás)
GGCTGACCTT TGTGTGTAGC GTGTGTGTGT GTTTCCTTCT TCCCTTCAGC CTGTGACTGT
600
TGCTGACTCC AGGGGTGGGA GGGATGGGGA GACTCCCCTC TTGCTGTGTG TACTGGACAC
660
GCAGGAAGCA TGCTGA
676 (2) INFORMÁCIÓK A 107. SZEKVENCIÁHOZ 15 (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK: (D) TOPOLÓGIA: lineáris (A) HOSSZ: 37 (iv) Antiszensz: nem (B) TÍPUS: nukleinsav (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 107. szekvencia
GGCCACGCGT CGACTAGTAC ΤΤΤΤΤΤΤΠΤ TTTTTTT 37 (2) INFORMÁCIÓK A 108. SZEKVENCIÁHOZ (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK: (D) TOPOLÓGIA: lineáris (A) HOSSZ: 37 (iv) Antiszensz: nem (B) TÍPUS: nukleinsav 25 (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 108. szekvencia
GGGGTAGAAT GCGGCGGCAG TATGAAACTC ACCAGCG (2) INFORMÁCIÓK A 109. SZEKVENCIÁHOZ (D) TOPOLÓGIA: lineáris (i) SZEKVENCIAJELLEMZOK: 30 (A) HOSSZ: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (iv) Antiszensz: igen 35 (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 109. szekvencia CAGTGCCCAT GTGCAGGGAG 20 (2) INFORMÁCIÓK A 110. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZ: 20 40 (B) TÍPUS : nukleinsav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (iv) Antiszensz: igen (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 110. szekvencia 45 AGAACCTGCA CAAATAGAGC 20 (2) INFORMÁCIÓK Alii. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZ: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav 50 (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (iv) Antiszensz: igen (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 111. szekvencia AGAAACAAGA ACCTGCACAA 20 55 (2) INFORMÁCIÓK A 112. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:
(A) HOSSZ: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres 60 (iv) Antiszensz: igen (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 112. szekvencia GCAAGGGATT CAGCTAAAAC 20 (2) INFORMÁCIÓK A 113. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZ: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (iv) Antiszensz: igen (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 113. szekvencia AGGGAGGGAA AGCACAGAAG 20 (2) INFORMÁCIÓK A 114. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZ: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (iv) Antiszensz: igen (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 114. szekvencia TCAGCTCAAA AATAGTCCTC 20 (2) INFORMÁCIÓK A 115. SZEKVENCIÁHOZ (1) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZ: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (iv) Antiszensz: igen (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 115. szekvencia CGAAAGGTGA CATGAAGAAA 20 (2) INFORMÁCIÓK A 116. SZEKVENCIÁHOZ
HU 219 017 Β (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZ: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (iv) Antiszensz: igen (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 116. szekvencia GGCGGAGGAA CCAGGACGAA 20 (2) INFORMÁCIÓK A 117. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZ: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (iv) Antiszensz: igen (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 117. szekvencia GCAATGCCAC GTGTGTACCA 20 (2) INFORMÁCIÓK A 118. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:
(A) HOSSZ: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (iv) Antiszensz: igen (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 118. szekvencia TGCAAAACGT ATTAAAATCC 20 (2) INFORMÁCIÓK A 119. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZ: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (iv) Antiszensz: igen (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 119. szekvencia TTATAAACAT GCAAAATTCA 20

Claims (31)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Oligonukleotid, azzal jellemezve, hogy legfeljebb 50 nukleotidegységet tartalmaz, a protein-kináz-C-t kódoló nukleinsavhoz kötődik, és az 54., 55., 56., 57., 58.,
    59., 60., 61., 62., 63., 64., 67., 68., 69., 71., 73., 74.,
    76., ΊΊ. 78., 79., 80., 81., 84., 85., 95., 97., 98., 99. és 101. szekvenciák valamelyikét tartalmazza.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti oligonukleotid, azzal jellemezve, hogy a nukleotidegységek közötti cukorkötések legalább egyike foszforotioátkötés.
  3. 3. Az 1. igénypont szerinti oligonukleotid, azzal jellemezve, hogy a nukleotidok legalább egyike módosítást tartalmaz a cukor 2’-helyzetében.
  4. 4. Az 1. igénypont szerinti oligonukleotid, azzal jellemezve, hogy kiméra.
  5. 5. Eljárás protein-kináz-C expressziójának módosítására sejtekben, azzal jellemezve, hogy a sejteket valamely, az 1 -4. igénypontok bármelyike szerinti oligonukleotiddal hozzuk érintkezésbe.
  6. 6. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan oligonukleotidot alkalmazunk, amelyben a nukleotidegységek közötti cukorkötések legalább egyike foszforotioátkötés.
  7. 7. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan oligonukleotidot alkalmazunk, amelyben a nukleotidok legalább egyike módosítást tartalmaz a cukor 2’-helyzetében.
  8. 8. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy kiméra oligonukleotidot alkalmazunk.
  9. 9. Eljárás egy mintában egy protein-kináz-C-gén vagy protein-kináz-C-mRNS detektálására, azzal jellemezve, hogy a mintát valamely, az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti oligonukleotiddal hozzuk érintkezésbe, és detektáljuk a hibridizálást.
  10. 10. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan oligonukleotidot alkalmazunk, amelyben a nukleotidegységek közötti cukorkötések legalább egyike foszforotioátkötés.
  11. 11. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan oligonukleotidot alkalmazunk, amelyben a nukleotidok legalább egyike módosítást tartalmaz a cukor 2’-helyzetében.
  12. 12. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy kiméra oligonukleotidot alkalmazunk.
  13. 13. Eljárás a protein-kináz-C-vel kapcsolatos állapot diagnosztizálására, azzal jellemezve, hogy egy, a protein-kináz-C-vel kapcsolatos állapotban szenvedő emlőstől vett mintát valamely, az 1 -4. igénypontok bármelyike szerinti oligonukleotiddal hozzuk érintkezésbe, és detektáljuk a hibridizálást.
  14. 14. A 13. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy hiperproliferatív rendellenesség diagnosztizálását végezzük.
  15. 15. A 13. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan oligonukleotidot alkalmazunk, amelyben a nukleotidegységek közötti cukorkötések legalább egyike foszforotioátkötés.
  16. 16. A 13. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan oligonukleotidot alkalmazunk, amelyben a nukleotidok legalább egyike módosítást tartalmaz a cukor 2'-helyzetében.
  17. 17. A 13. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy kiméra oligonukleotidot alkalmazunk.
  18. 18. Izolált nukleinsavmolekula, azzal jellemezve, hogy a 105. szekvenciával lényegében véve homológ szekvenciát tartalmaz.
  19. 19. A 18. igénypont szerinti molekula, azzal jellemezve, hogy kettős szálú.
  20. 20. Izolált nukleinsavmolekula, azzal jellemezve, hogy a 105. szekvenciára lényegében véve komplementer szekvenciát tartalmaz.
  21. 21. Legfeljebb 50 nukleotidegységet tartalmazó antiszensz oligonukleotid, azzal jellemezve, hogy olyan nukleotidszekvenciát tartalmaz, amely specifikusan hibridizálódik a 105. szekvencia egy részével.
  22. 22. Polinukleotidpróba, azzal jellemezve, hogy olyan nukleotidszekvenciát tartalmaz, amely specifikusan hibridizálódik a 18. vagy 19. igénypont szerinti nukleinsavmolekula egy részével.
  23. 23. Legfeljebb 50 nukleotidegységet tartalmazó antiszensz oligonukleotid, azzal jellemezve, hogy olyan nuk34
    HU 219 017 Β leotidszekvenciát tartalmaz, amely specifikusan hibridizálódik a humán protein-kináz-C-α hosszú mRNS-transzkriptumával, és nem specifikusan hibridizálódik a humán protein-kináz-C-α rövid mRNS-transzkriptumával.
  24. 24. A 23. igénypont szerinti antiszensz oligonukleotid, azzal jellemezve, hogy olyan nukleotidszekvenciát tartalmaz, amely specifikusan hibridizálódik a 106. szekvencia egy részével.
  25. 25. A 24. igénypont szerinti oligonukleotid, azzal jellemezve, hogy a 117. szekvenciát tartalmazza.
  26. 26. Polinukleotidpróba, azzal jellemezve, hogy olyan nukleotidszekvenciát tartalmaz, amely specifikusan hibridizálódik a humán protein-kináz-C-α hosszú mRNS-transzkriptumához.
  27. 27. A 26. igénypont szerinti polinukleotidpróba, azzal jellemezve, hogy a 117. szekvenciát tartalmazza.
  28. 28. Eljárás humán protein-kináz-C-a-t kódoló gén kimutatására egy mintában, azzal jellemezve, hogy a mintát egy, a próba és a protein-kináz-C-a-t kódoló gén közötti duplex kialakulását lehetővé tevő, a 22. igénypont szerinti polinukleotidpróbával érintkeztetjük, és detektáljuk a polinukleotidduplex jelenlétét.
  29. 29. Eljárás humán protein-kináz-C-α hosszú mRNS-transzkriptumának kimutatására egy mintában, azzal jellemezve, hogy a mintát egy, a próba és a protein-kináz-C-α hosszú mRNS-transzkriptuma közötti duplex kialakulását lehetővé tevő, a 26. igénypont szerinti polinukleotidpróbával érintkeztetjük, és detektáljuk a polinukleotidduplex jelenlétét.
  30. 30. Gyógyszerkészítmény protein-kináz-C-a-sejtekben történő expressziójának módosítására, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként olyan antiszensz oligonukleotidot tartalmaz, amely legfeljebb 50 nukleotid hosszúságú és egy, a 105. szekvenciával specifikusan hibridizálódó nukleotidszekvenciát tartalmaz.
  31. 31. Gyógyszerkészítmény protein-kináz-C-α hosszú mRNS-transzkriptuma sejtekben történő expressziójának módosítására, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként olyan antiszensz oligonukleotidot tartalmaz, amely legfeljebb 50 nukleotid hosszúságú és egy, a 106. szekvenciával specifikusan hibridizálódó nukleotidszekvenciát tartalmaz.
HU9600050A 1993-07-09 1994-07-08 Protein kináz-C expressziójának szabályozására szolgáló oligonukleotidok és azok alkalmazása HU219017B (hu)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/089,996 US5703054A (en) 1992-03-16 1993-07-09 Oligonucleotide modulation of protein kinase C
US08/199,779 US5681747A (en) 1992-03-16 1994-02-22 Nucleic acid sequences encoding protein kinase C and antisense inhibition of expression thereof
PCT/US1994/007770 WO1995002069A1 (en) 1993-07-09 1994-07-08 Oligonucleotide modulation of protein kinase c

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HU9600050D0 HU9600050D0 (en) 1996-03-28
HUT75834A HUT75834A (en) 1997-05-28
HU219017B true HU219017B (hu) 2001-01-29

Family

ID=26781147

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9600050A HU219017B (hu) 1993-07-09 1994-07-08 Protein kináz-C expressziójának szabályozására szolgáló oligonukleotidok és azok alkalmazása

Country Status (12)

Country Link
US (2) US5681747A (hu)
EP (1) EP0714449A4 (hu)
JP (4) JP3553068B2 (hu)
KR (1) KR100211424B1 (hu)
AU (1) AU688354B2 (hu)
BR (1) BR9406931A (hu)
CA (1) CA2166058A1 (hu)
FI (1) FI960089A (hu)
HU (1) HU219017B (hu)
NO (1) NO960079L (hu)
NZ (1) NZ269653A (hu)
WO (1) WO1995002069A1 (hu)

Families Citing this family (47)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6369209B1 (en) 1999-05-03 2002-04-09 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides having A-DNA form and B-DNA form conformational geometry
US7119184B2 (en) * 1991-08-12 2006-10-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides having A-DNA form and B-DNA form conformational geometry
US8153602B1 (en) 1991-11-19 2012-04-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. Composition and methods for the pulmonary delivery of nucleic acids
US6117847A (en) * 1992-03-16 2000-09-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides for enhanced modulation of protein kinase C expression
US5681747A (en) * 1992-03-16 1997-10-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acid sequences encoding protein kinase C and antisense inhibition of expression thereof
US5948898A (en) * 1992-03-16 1999-09-07 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methoxyethoxy oligonucleotides for modulation of protein kinase C expression
AU5359496A (en) * 1995-03-06 1996-09-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Improved process for the synthesis of 2'-o-substituted pyrimidines and oligomeric compounds therefrom
EP0831854A4 (en) * 1995-06-06 2001-01-24 Isis Pharmaceuticals Inc OLIGONUCLEOTIDS WITH PHOSPHOROTHIOATE BINDINGS OF HIGH CHIRAL PURITY
US6147056A (en) * 1995-06-06 2000-11-14 Trustees Of Boston University Use of locally applied DNA fragments
US5652356A (en) * 1995-08-17 1997-07-29 Hybridon, Inc. Inverted chimeric and hybrid oligonucleotides
US6624293B1 (en) 1995-08-17 2003-09-23 Hybridon, Inc. Modified protein kinase A-specific oligonucleotides and methods of their use
US7074768B2 (en) 1995-08-17 2006-07-11 Idera Pharmaceuticals, Inc. Modified protein kinase A-specific oligonucleotides and methods of their use
GB9519109D0 (en) * 1995-09-19 1995-11-22 Ciba Geigy Ag Compositions
GB9604669D0 (en) 1996-03-05 1996-05-01 Ciba Geigy Ag Chemical compounds
US5744460A (en) * 1996-03-07 1998-04-28 Novartis Corporation Combination for treatment of proliferative diseases
US7223849B1 (en) 1996-07-01 2007-05-29 Genesense Technologies Inc. Oligonucleotides from the untranslated regions of housekeeping genes and methods of using same to modulate cell growth
EP0917569B1 (en) * 1996-08-02 2005-11-09 GeneSense Technologies Inc. Antitumor antisense sequences directed against r1 and r2 components of ribonucleotide reductase
US6593305B1 (en) 1996-08-02 2003-07-15 Genesense Technologies Inc. Antitumor antisense sequences directed against R1 and R2 components of ribonucleotide reductase
GB9618376D0 (en) 1996-09-04 1996-10-16 Ciba Geigy Ag Pharmaceutical compositions
AU738352B2 (en) * 1997-04-30 2001-09-13 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides for enhanced bioavailability
US6312941B1 (en) 1997-11-26 2001-11-06 The Regents Of The University Of Michigan Compositions and methods for identifying signaling pathway agonists and antagonists
US5968732A (en) * 1997-12-31 1999-10-19 Akzo Nobel, N.V. Isothermal transcription based assay for the detection and genotyping of dengue virus
US6815187B1 (en) * 1998-02-04 2004-11-09 Beth Israel Deaconess Medical Center Stimulation of angiogenesis via syndecan-4 cytoplasmic domain signaling pathway
AU753270B2 (en) 1998-05-21 2002-10-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for topical delivery of oligonucleotides
US6867294B1 (en) * 1998-07-14 2005-03-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Gapped oligomers having site specific chiral phosphorothioate internucleoside linkages
US6277967B1 (en) 1998-07-14 2001-08-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Carbohydrate or 2′-modified oligonucleotides having alternating internucleoside linkages
US6242589B1 (en) 1998-07-14 2001-06-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Phosphorothioate oligonucleotides having modified internucleoside linkages
AU5524899A (en) * 1998-08-31 2000-03-21 Astrazeneca Uk Limited Human deltex-like gene zdx
US6077709A (en) 1998-09-29 2000-06-20 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense modulation of Survivin expression
US6121000A (en) * 1999-02-11 2000-09-19 Genesense Technologies, Inc. Antitumor antisense sequences directed against R1 and R2 components of ribonucleotide reductase
CN1273478C (zh) * 1999-02-12 2006-09-06 三共株式会社 新型核苷及低聚核苷酸类似物
GB9905218D0 (en) * 1999-03-09 1999-04-28 Univ Glasgow Neurodegenerative disorder related gene
JP4151751B2 (ja) * 1999-07-22 2008-09-17 第一三共株式会社 新規ビシクロヌクレオシド類縁体
US6190869B1 (en) 1999-10-26 2001-02-20 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense inhibition of protein kinase C-theta expression
CA2400028A1 (en) * 2000-02-14 2001-08-23 Arthur P. Bollon Libraries of optimum subsequence regions of mrna and genomic dna for control of gene expression
US6367925B1 (en) 2000-02-28 2002-04-09 Microfab Technologies, Inc. Flat-sided fluid dispensing device
WO2002087417A2 (en) * 2001-04-27 2002-11-07 Cold Spring Harbor Laboratory Alleviation of the memory deficits and memory components of psychiatric dysfunctions by altering atypical pkm activity
US6957148B2 (en) 2001-05-21 2005-10-18 The Board Of Regents, University Of Texas System Next-nearest-neighbor sequence determinants of antisense DNA
US7060498B1 (en) * 2001-11-28 2006-06-13 Genta Salus Llc Polycationic water soluble copolymer and method for transferring polyanionic macromolecules across biological barriers
AU2004209579B2 (en) 2003-02-10 2010-03-04 Lorus Therapeutics Inc. Antisense oligonucleotides directed to ribonucleotide reductase R2 and uses thereof in the treatment of cancer
US7638482B2 (en) * 2003-05-08 2009-12-29 Wyeth Protein kinase C zeta as a drug target for arthritis and other inflammatory diseases
FR2864539B1 (fr) 2003-12-30 2012-10-26 Lvmh Rech Oligonucleotide et son utilisation pour moduler l'expression de la proteine-kinase c isoforme beta-1 comme agent de depigmentation cutanee
EP1737957A1 (en) * 2004-04-22 2007-01-03 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem UNIVERSAL TARGET SEQUENCES FOR siRNA GENE SILENCING
US7482158B2 (en) * 2004-07-01 2009-01-27 Mathison Brian H Composite polynucleic acid therapeutics
WO2011041584A2 (en) 2009-09-30 2011-04-07 President And Fellows Of Harvard College Methods for modulation of autophagy through the modulation of autophagy-enhancing gene products
TW201207118A (en) * 2010-07-29 2012-02-16 Bigtec Private Ltd Probes and primers for detection of dengue
JP6453245B2 (ja) * 2014-01-17 2019-01-16 株式会社 西崎創薬研究所 Ｇｌｕｔ４エンドサイトーシス抑制剤

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5034506A (en) * 1985-03-15 1991-07-23 Anti-Gene Development Group Uncharged morpholino-based polymers having achiral intersubunit linkages
US5194428A (en) * 1986-05-23 1993-03-16 Worcester Foundation For Experimental Biology Inhibition of influenza virus replication by oligonucleotide phosphorothioates
US4806463A (en) * 1986-05-23 1989-02-21 Worcester Foundation For Experimental Biology Inhibition of HTLV-III by exogenous oligonucleotides
US5276019A (en) * 1987-03-25 1994-01-04 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products
US5004810A (en) * 1988-09-30 1991-04-02 Schering Corporation Antiviral oligomers
US5098890A (en) * 1988-11-07 1992-03-24 Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education Antisence oligonucleotides to c-myb proto-oncogene and uses thereof
US5087617A (en) * 1989-02-15 1992-02-11 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for treatment of cancer using oligonucleotides
WO1993013121A1 (en) * 1991-12-24 1993-07-08 Isis Pharmaceuticals, Inc. Gapped 2' modified oligonucleotides
US5620963A (en) * 1991-10-15 1997-04-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides for modulating protein kinase C having phosphorothioate linkages of high chiral purity
US5166195A (en) * 1990-05-11 1992-11-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense inhibitors of the human immunodeficiency virus phosphorothioate oligonucleotides
US5135917A (en) * 1990-07-12 1992-08-04 Nova Pharmaceutical Corporation Interleukin receptor expression inhibiting antisense oligonucleotides
US5681747A (en) * 1992-03-16 1997-10-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acid sequences encoding protein kinase C and antisense inhibition of expression thereof
DE69331467T2 (de) * 1992-03-16 2002-11-07 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonukleotide modulation von protein kinase c
EP0592634A1 (en) * 1992-04-06 1994-04-20 Glaxo, S.A. Inhibitor of protein kinase c
FR2706484B1 (fr) * 1993-06-11 1995-09-01 Inst Nat Sante Rech Med Polypeptide mutant de la protéine kinase C, séquences d'acides nucléiques codant pour ledit polypeptide et leurs utilisations.
WO1995003833A1 (en) * 1993-07-29 1995-02-09 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligomers for modulating protein kinase c

Also Published As

Publication number Publication date
EP0714449A1 (en) 1996-06-05
NZ269653A (en) 1997-12-19
US6015892A (en) 2000-01-18
JP3553068B2 (ja) 2004-08-11
US5681747A (en) 1997-10-28
HU9600050D0 (en) 1996-03-28
NO960079L (no) 1996-02-29
JP3349500B2 (ja) 2002-11-25
EP0714449A4 (en) 1998-12-02
JP2001231579A (ja) 2001-08-28
BR9406931A (pt) 1996-09-10
AU7398194A (en) 1995-02-06
KR100211424B1 (ko) 1999-08-02
NO960079D0 (no) 1996-01-08
WO1995002069A1 (en) 1995-01-19
CA2166058A1 (en) 1995-01-19
FI960089A (fi) 1996-03-07
AU688354B2 (en) 1998-03-12
JP3349501B2 (ja) 2002-11-25
JP2001224387A (ja) 2001-08-21
FI960089A0 (fi) 1996-01-08
JP2001224386A (ja) 2001-08-21
HUT75834A (en) 1997-05-28
JP3349502B2 (ja) 2002-11-25
JPH08507929A (ja) 1996-08-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU219017B (hu) Protein kináz-C expressziójának szabályozására szolgáló oligonukleotidok és azok alkalmazása
KR0157487B1 (ko) 단백질 키나아제 c의 올리고뉴클레오티드 조절
US6599742B2 (en) Antisense oligonucleotide inhibition of human serine/threonine protein phosphatase gene expression
EP0882061B1 (en) Sugar-modified gapped oligonucleotides
JP3231779B2 (ja) ｒａｆ遺伝子発現のアンチセンスオリゴヌクレオチド調節
US5948898A (en) Methoxyethoxy oligonucleotides for modulation of protein kinase C expression
US5885970A (en) Antisense oligonucleotides against human protein kinase C
US5882927A (en) Oligonucleotide inhibition of protein kinase C
US5959096A (en) Antisense oligonucleotides against human protein kinase C
US5856099A (en) Antisense compositions and methods for modulating type I interleukin-1 receptor expression
US5916807A (en) Antisense oligonucleotides against human protein kinase C
HUT73335A (en) Antisense oligonucleotides and methods for inhibition of the human ras genes, methods for inhibition of tumour-cells proliferation and methods for detection of activated ras-genes
US5922686A (en) Oligonucleotide modulation of protein kinase C
US6153599A (en) Methoxyethoxy oligonucleotides for modulation of protein kinase C expression
AU710972B2 (en) Oligonucleotide modulation of protein kinase C
AU713740B2 (en) Oligonucleotide modulation of protein kinase C

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees