JPH08507929A

JPH08507929A - プロテインキナーゼｃのオリゴヌクレオチド変調

Info

Publication number: JPH08507929A
Application number: JP7504201A
Authority: JP
Inventors: ベネット，シー・フランク; ボッグズ，ラッセル・ティー; ディーン，ニコラス・エム
Original assignee: Isis Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Ionis Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1993-07-09
Filing date: 1994-07-08
Publication date: 1996-08-27
Anticipated expiration: 2019-08-11
Also published as: AU688354B2; US6015892A; EP0714449A4; BR9406931A; AU7398194A; CA2166058A1; US5681747A; JP2001224387A; FI960089A0; KR100211424B1; FI960089A; NO960079D0; EP0714449A1; NO960079L; HU9600050D0; HU219017B; JP2001224386A; JP3349502B2; JP2001231579A; JP3349501B2

Abstract

(57)【要約】プロテインキナーゼＣに関連する疾患の処置および診断のための組成物および方法が提供される。ＰＫＣ遺伝子またはｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチドが提供される。特定のＰＫＣイソ酵素、イソ酵素の組またはｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチドが提供される。ＰＫＣ遺伝子またはｍＲＮＡと特異的にハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチドを用いてプロテインキナーゼＣの発現を変調することにより、治療的介在を受けることが可能な状態を処置する方法が開示される。プロテインキナーゼＣαおよびその特定の転写産物に関連する疾患の治療、検出および診断のための組成物および方法が提供される。ヒトプロテインキナーゼＣαの３’非翻訳領域をコードする新規な核酸配列が提供される。ＰＫＣαのためのポリヌクレオチドプローブもまた開示される。

Description

【発明の詳細な説明】プロテインキナーゼＣのオリゴヌクレオチド変調技術分野本発明はプロテインキナーゼＣの発現の変調に応答する疾病状態のための治療、診断および研究用試薬に関する。特に、本発明はプロテインキナーゼＣに関連する核酸と特異的にハイブリダイズしうるアンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。これらのオリゴヌクレオチドがプロテインキナーゼＣの発現を変調することが見いだされた。軽減および治療効果が得られた。背景技術蛋白質のリン酸化は細胞内への細胞外信号の導入において中心的な役割を果たしている。そのようなリン酸化を引き起こすキナーゼと称される酵素は成長因子、ホルモンおよび細胞の代謝、増殖および分化に関与するその他の因子の作用標的である。主たる信号伝達経路の一つに酵素プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）が含まれており、細胞増殖および分化に重大な影響を与えることが知られている。ＰＫＣは、信号伝達において放出される代謝産物であるジアシルグリセロール（ＤＡＧ）により活性化される。ホルボールエステルと称される一群の発癌促進剤が細胞性レセプターを通して細胞にそれらの多面的な効果を示す場合において、ＰＫＣが主たる、および多分唯一の細胞性レセプターであることが発見されたことからＰＫＣに関しての興味がかき立てられた（Ｇｅｓｃｈｅｒｅｔａｌ．，Ａｎｔｉ−ＣａｎｃｅｒＤｒｕｇＤｅｓｉｇｎ＿１９８９，４，９３−１０５）。腫瘍生成が可能なホルボールがＰＫＣの活性化においてＤＡＧの効果を模倣しうることは、これらの発癌促進剤がＰＫＣを通して作用し、この酵素の活性化が少なくとも部分的には腫瘍発生の原因になることを示唆している（Ｐａｒｋｅｒｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ１９８６，２３３，８５３−８６６）。実験的証拠は、ＰＫＣが結腸癌の増殖制御において一つの役割を果たしていることを示している。腸管中の特定の細菌が脂質をＤＡＧに変換し、ＰＫＣを活性化し細胞の増殖を変化させていると信じられている。このことは高い食物脂肪と結腸癌の間の相関を説明するものであろう（Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．（Ｓｕｐｐｌ．）１９９１，５１，５０８０ｓ−５０８５ｓ）。また、結腸直腸癌の患者の結腸粘膜中のＰＫＣの大部分は、癌を持たない患者のものと比較すると活性化された状態にあることが示されている（Ｓａｋａｎｏｕｅｅｔａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ１９９１，４８，８０３−８０６）。高進された腫瘍発生はまた、ヌードマウス内に接種された培養細胞中のＰＫＣの過剰発現とも相関している。ＰＫＣの突然変異形は高進された転移能を持つ非常に悪性の腫瘍細胞を誘導する。スフィンゴシンおよび関連するＰＫＣ活性の阻害剤は、インビボにおいて腫瘍細胞増殖および放射線誘発形質転換を阻害することが示されている（Ｅｎｄｏｅｔａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ１９９１，５１，１６１３− １６１８；Ｂｏｒｅｋｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ１９９１，８８，１９５３−１９５７）。多くの実験的にまたは臨床的に有用な抗癌剤はＰＫＣに対して変調効果を示す。従って、ＰＫＣの阻害剤は重要な癌の予防または治療剤であろう。ＰＫＣは通常の抗癌剤のより合理的な設計のためのもっともらしい標的であることが示唆されてきた（Ｇｅｓｃｈｅｒ，Ａ．およびＤａｌｅ，Ｉ．Ｌ．，Ａｎｔｉ−ＣａｎｃｅｒＤｒｕｇＤｅｓｉｇｎ１９８９，４，９３−１０５）。また、実験はＰＫＣが乾癬および皮膚癌のような過増殖性皮膚疾患の病理生理学において重要な役割を果たしていることを示している。乾癬は炎症、表皮の過増殖および細胞分化の減少により特徴付けられる。種々の研究はこれらの症状を引き起こす上でのＰＫＣの役割を示唆している。培養ケラチン細胞におけるＰＫＣ刺激が過増殖を起こすことを示すことができる。炎症はホルボールエステルにより誘発でき、ＰＫＣにより制御される。ＤＡＧは皮膚病性疾患にＰＫＣが関与することに関係しており、乾癬性病変において多量に生成される。ＰＫＣの阻害剤はインビトロにおいて抗増殖性および抗炎症性効果の両方を有することが示されている。シクロスポリンＡおよびアントラリンのような抗乾癬薬はＰＫＣを阻害することが示されている。ＰＫＣの阻害は乾癬の処置に対する治療法として示唆されてきた（Ｈａｇｅｍａｎｎ，Ｌ．およびＧ．Ｍａｈｒｌｅ，ＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙｏｆｔｈｅＳｋｉｎ，Ｈ．Ｍｕｋｈｔａｒ編、ＣＲＣＰｒｅｓｓ，ＢｏｃａＲａｔｏｎ，ＦＬ，１９９２，ｐ．３５７− ３６８）。ＰＫＣは単一の酵素ではなく一群の酵素である。現在のところ、少なくとも７つのＰＫＣのイソ型（イソ酵素）が同定されている：α、β、γ、δ、ε、ζ、およびη。これらのイソ酵素は組織および器官分布の異なるパターンを有し（総説としてＮｉｓｈｉｚｕｋａ，Ｎａｔｕｒｅ１９８８，３３４，６６１−６６５を参照されたい）、異なる生理学的機能を果たしているのであろう。例えば、ＰＫＣ−γは中枢神経系でのみ発現されるらしい。ＰＫＣ−αおよび−βはほとんどの組織で発現されるが、異なる細胞型においては異なる発現のパターンを有する。例えば、ＰＫＣ−αおよびＰＫＣ−βの両方ともヒト表皮に発現され、それから精製されている。ＰＫＣ−αは主として表皮の基底層のケラチン細胞中に検出されたが、ＰＫＣ−βは主として表皮の中間層およびランゲルハンス細胞中に観察される。ＰＫＣ−ηは主に皮膚および肺で観察されており、これらの組織での発現のレベルは脳におけるレベルよりも高い。このことは、脳に最も豊富に発現される傾向があるＰＫＣ群の他の構成要素とは対照的である（Ｏｓａｄａｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９０，２６５，２２４３４−２２４４０）。他のＰＫＣイソ酵素であるＰＫＣ−ζは、増殖カスケードの制御において重要な役割を果たしていると考えられている。これは、ＸｅｎｏｐｕｓＰＫＣ−ζのＡＵＧを標的とするアンチセンスＲＮＡ、ペプチド阻害剤または１５− ｍｅｒホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて、Ｘｅｎｏｐｕｓ卵母細胞においてＰＫＣ−ζのレベルを枯渇させることによって示された。これらの枯渇された卵母細胞は、インシュリンに応答する成熟に耐性であるが、プロゲステロンにより活性化される成熟経路は影響を受けなかったことが示された。ＷＯ９３／２０１０１。ここに掲げたＰＫＣイソ酵素は本発明による標的化に好適であるが、ＰＫＣの他のイソ酵素もまた本発明に包含される。現在のところ、異なるＰＫＣイソ酵素はそれらが発現される器官または組織に依存して種々の疾患過程に関与すると信じられている。例えば、乾癬病変においてはＰＫＣ−αおよびＰＫＣ−β間の比が変化しており、正常皮膚と比較してＰＫＣ−βが優先して失われている（Ｈａｇｅｍａｎｎ，Ｌ．およびＧ．Ｍａｈｒｌｅ，ＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙｏｆｔｈｅＳｋｉｎ，Ｈ．Ｍｕｋｈｔａｒ編、ＣＲＣＰｒｅｓｓ，ＢｏｃａＲａｔｏｎ，ＦＬ，１９９２，ｐ．３５７−３６８）。ある１つのイソ酵素についてさえも、単一の遺伝子から発現された多数のＲＮＡ転写産物がありうる。例えば、ＰＫＣαの場合、２つのｍＲＮＡ転写産物、すなわちロング（約８．５ｋｂ）転写産物およびショート（約４ｋｂ）転写産物が見られる。ネズミおよびウシＰＫＣα遺伝子からも多数のＰＫＣα転写産物が生成される。ロング転写産物とショート転写産物との比は、種によってさまざまであり、組織によってもさまざまであると考えられる。さらに、この比と細胞の増殖段階との間にはある関連性があるかもしれない。多数の化合物がＰＫＣ阻害剤として同定されているが（総説としてＨｉｄａｋａおよびＨａｇｉｗａｒａ，ＴｒｅｎｄｓｉｎＰｈａｒｍ．Ｓｃｉ．１９８７，８，１６２−１６４を参照されたい）、特異的にＰＫＣを阻害するものはほとんど見いだされていない。１−（５−イソキノリンスルホニル）−２−メチルピペラジン（Ｈ−７）のようなキノリンスルホンアミド誘導体はマイクロモル濃度でＰＫＣを阻害するが、それらはＰＫＣおよびｃＡＭＰ−依存性およびｃＧＭＰ−依存性プロテインキナーゼに対して類似の酵素阻害動力学を示している。ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）種のアルカロイド生成物であるスタウロスポリンおよびその類似体は、現在同定されている内で最も強力なＰＫＣのインビトロ阻害剤である。しかしながらそれらは異なるプロテインキナーゼ間では限られた選択性しか示さない（Ｇｅｓｃｈｃｒ，Ａｎｔｉ−ＣａｎｃｅｒＤｒｕｇＤｅｓｉｇｎ１９８９，４，９３−１０５）。あるセラミドおよびスフィンゴシン誘導体は、ＰＫＣ阻害活性を有し、治療用に使用される見込みを有することが示されているが、この酵素の特異的阻害剤についての長い間の要求が存在する。また、研究の道具および特定のイソ酵素と関連するかもしれない疾患の治療の両方として、特定のＰＫＣイソ酵素を阻害することが望まれている。Ｇｏｄｓｏｎら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１１９４６−１１９５０（１９９３））は、最近、サイトメガロウイルスプロモーター系発現ベクターにおけるアンチセンスＰＫＣ−α ｃＤＮＡの安定なトランスフェクションを用いて、ＰＫＣ− α蛋白質の発現が特異的に約７０％減少させることを開示した。この阻害により、ホルボールエステルＰＭＡに応答するホスホリパーゼＡ₂−介在アラキドン酸放出が欠失することが示された。同一の研究者による、オリゴデオキシヌクレオチドを用いてＰＫＣ活性を阻害しようとする試みは、オリゴヌクレオチドの分解のため最終的には成功しなかった。発明の目的本発明の主たる目的は、プロテインキナーゼＣに関連する新生物性、過増殖性、炎症性およびその他の疾患状態の治療法を提供することである。本発明の別の目的は、プロテインキナーゼＣの特定のイソ酵素に関連する疾患のための選択的治療法を提供することである。本発明のさらなる目的は、プロテインキナーゼＣの発現を変調しうるアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供することである。本発明の別の目的は、プロテインキナーゼＣの特定のイソ酵素の発現を選択的に変調しうるアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供することである。さらに別の目的は、プロテインキナーゼＣに関連する疾患の診断手段を提供することである。本発明のさらなる目的は、プロテインキナーゼＣの特定のイソ酵素に関連する疾患を区別する診断手段を提供することである。本発明のさらに別の目的は、プロテインキナーゼＣの発現の影響およびそれらに関連する疾患の研究のための研究道具を提供することである。本発明のさらに別の目的は、プロテインキナーゼＣの特定のイソ酵素の発現の影響およびそれらに関連する疾患の研究のための研究道具を提供することである。本発明の目的は、ＰＫＣαのロングｍＲＮＡ転写産物に独特の配列を含む、ヒトＰＫＣαの３’−非翻訳領域をコードする新規な核酸分子を提供することである。本発明の別の目的は、ＰＫＣαの特定のｍＲＮＡ転写産物の発現を選択的に変調しうるアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供することである。本発明のさらに別の目的は、ヒトＰＫＣの検出用のポリヌクレオチドプローブを提供することである。本発明のさらに別の目的は、ＰＫＣαの特定のｍＲＮＡ転写産物を検出するポリヌクレオチドプローブを提供することである。本発明のさらに別の目的は、ＰＫＣαの特定のｍＲＮＡ転写産物に関連する疾患を区別する診断手段を提供することである。本発明の目的は、ＰＫＣαに関連する新生物性、過増殖性、炎症性およびその他の疾患状態の治療法を提供することである。本発明の別の目的は、ＰＫＣαの特定のｍＲＮＡ転写産物に関連する疾患のための選択的治療法を提供することである。本発明のさらに別の目的は、ＰＫＣαの特定の転写産物の発現の影響およびそれらに関連する疾患の研究のための研究道具を提供することである。本発明のこれらおよびその他の目的は本明細書の記載を考察することにより明らかとなるであろう。図の簡単な説明図１（ａ）および（ｂ）は、ＰＫＣ−αとハイブリダイズしうるアンチセンスオリゴヌクレオチドの、ＰＫＣ発現に対する効果をグラフで表したものである。オリゴヌクレオチドはＰＫＣ標的領域の５’から３’に配置される。図２は、Ａ５４９細胞をオリゴヌクレオチドで処理した後のＰＫＣ−α蛋白質レベルの用量依存性減少を示す線グラフである。▼＝ＩＳＩＳ４６３２；■＝ＩＳＩＳ４６４９；●＝ＩＳＩＳ４６３６；▲＝ＩＳＩＳ４６４８。図３は、Ａ５４９細胞をオリゴヌクレオチドで処理した後のＰＫＣ−α ｍＲＮＡの減少を示す棒グラフである。斜線を付けた棒は８．５ｋｂ転写産物を表し、白抜きの棒は４．０ｋｂ転写産物を表す。図４は、デオキシギャップの長さとキメラオリゴヌクレオチドのＰＫＣに対する活性との間の関係を示す線グラフである。図５は、異なるデオキシギャップ長さを有するキメラオリゴヌクレオチド（すべて配列番号３）の用量依存曲線を示す線グラフである。図６は、配列番号３のいくつかの２’−Ｏ−メチルキメラオリゴヌクレオチドの、ＰＫＣ−α ｍＲＮＡレベルに及ぼす影響を示す棒グラフである。斜線を付けた棒は８．５ｋｂ転写産物を表し、白抜きの棒は４．０ｋｂ転写産物を表す。図７は、配列番号３のいくつかの２’−Ｏ−メチルおよび２’−Ｏ−プロピルキメラオリゴヌクレオチド（６９９６、７２７３）の、ＰＫＣ−α ｍＲＮＡレベルに及ぼす影響を示す棒グラフおよび図表である。斜線を付けた棒は８．５ｋｂ転写産物を表し、白抜きの棒は４．０ｋｂ転写産物を表す。図８は、配列番号３の別の２’−Ｏ−メチルおよび２’−Ｏ−プロピルキメラオリゴヌクレオチド（７００８、７２９４）の、ＰＫＣ−α ｍＲＮＡレベルに及ぼす影響を示す棒グラフおよび図表である。斜線を付けた棒は８．５ｋｂ転写産物を表し、白抜きの棒は４．０ｋｂ転写産物を表す。図９は、別のオリゴヌクレオチドの、ＰＫＣ−α ｍＲＮＡレベルに及ぼす影響を示す一組の棒グラフである。図９Ａは、オリゴヌクレオチド６６３２、６６５３および６６６５を示す。図９Ｂは、オリゴヌクレオチド３５２１（比較のため）、７０８２、７０８３および７０８４を示す。斜線を付けた棒は８．５ｋｂ転写産物を表し、白抜きの棒は４．０ｋｂ転写産物を表す。図１０は、ＩＳＩＳ３５２１の抗腫瘍活性を示す線グラフである。それぞれの破線は、対照オリゴヌクレオチドで処理した１匹の動物の腫瘍体積を表し、それぞれの実線は、ＩＳＩＳ３５２１で処理した１匹の動物の腫瘍体積を表す。図１１は、ヌードマウスにおけるヒトＭＤＡ−ＭＢ２３１腫瘍の成長に及ぼすオリゴヌクレオチドの影響を示す一組の線グラフである。図１１Ａは、ＩＳＩＳ３５２１について得られた結果を示し、図１１ＢはＩＳＩＳ３５２７について得られた結果を示す。それぞれの線は１匹の動物における腫瘍体積を表す。●＝対照；○＝オリゴヌクレオチド、６０ｍｇ／ｋｇ；△＝オリゴヌクレオチド、６ｍｇ／ｋｇ。図１２は、Ａ５４９細胞におけるＰＫＣ−η発現に及ぼす２０ｍｅｒホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの影響を示す棒グラフである。図１３は、ヒトＰＫＣα遺伝子の３’−非翻訳領域の一部の、先に知られている配列の３’末端に近いＢｃｌＩ部位から始まり、３’方向に伸ばしたヌクレオチド配列（配列番号１０４）である。新たに決定された配列は、ヌクレオチド５６から始まり、下線が施されている（配列番号１０５）。太字の配列は、ＰＫＣ αのロングｍＲＮＡ転写産物に独特である（配列番号１０６）。図１４は、オリゴヌクレオチド７９１１（配列番号１１７）で処理した後の細胞におけるＰＫＣａｍＲＮＡレベル（対照のパーセントとして表す）の経時変化を示す線グラフである。ショートｍＲＮＡ転写産物およびロングｍＲＮＡ転写産物の両方のレベルが示されている。ショートｍＲＮＡ転写産物のレベルは実線で示される。ロングｍＲＮＡ転写産物のレベルは破線で示される。ＩＳＩＳ７９１１（配列番号１１７）処理から１２時間後までに、両方のメッセンジャーのレベルは８０％以上減少した。発明の要約本発明に従うと、ＰＫＣをコードする遺伝子に由来するＤＮＡまたはＲＮＡと特異的にハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチドが提供される。オリゴヌクレオチドは、そのような特異的ハイブリダイゼーションを行うのに十分な同一性および数のヌクレオチド単位を含む。この相関関係は普通、「アンチセンス」と称されている。一つの好ましい態様においては、オリゴヌクレオチドは、遺伝子の翻訳開始コドンと特異的にハイブリダイズすることができ、好ましくは配列ＣＡＴを含む。別の好ましい態様においては、オリゴヌクレオチドは遺伝子の５’− 非翻訳または３’−非翻訳領域と特異的にハイブリダイズしうる。さらに別の好ましい態様においては、特定のＰＫＣイソ酵素またはＰＫＣイソ酵素の特定の組をコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡと特異的にハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチドが提供される。そのようなオリゴヌクレオチドは、便利にかつ望ましくは、薬学的に許容しうる担体中に存在させることができる。別の好ましい態様においては、オリゴヌクレオチドは、改良された標的親和性、細胞への取り込みまたは細胞性ヌクレアーゼの存在下における安定性等のいくつかの望ましい性質を与えるような、１つまたはそれ以上の化学的修飾を含む。そのような用途を有する修飾の例としては、２’−Ｏ−アルキルおよび２’−フルオロ糖修飾およびホスホロチオエート主鎖修飾が挙げられる。本発明の別の観点は、細胞または組織中のＰＫＣまたは特定のＰＫＣイソ酵素またはイソ酵素の組の発現を変調するための方法に関する。本発明の他の観点は、ＰＫＣをコードするＤＮＡまたはＲＮＡの細胞または組織における検出法、および特定のＰＫＣイソ酵素をコードするＤＮＡまたはＲＮＡの細胞または組織における特異的検出法に関する。そのような方法は、前記ＲＮＡまたはＤＮＡの作用を妨害するためまたは検出するために、前記遺伝子を含むと疑われる細胞または組織を本発明に従うオリゴヌクレオチドと接触させることを含む。本発明の別の観点は、ＰＫＣまたはそのイソ酵素の一つに関連する疾患を有すると疑われる動物の診断および治療法に関する。そのような方法は、ＰＫＣの発現を変調するため、ＰＫＣに関連する状態を処置するため、またはその診断を行うために、動物または動物からの細胞または組織または体液を本発明に従うオリゴヌクレオチドと接触させることを含む。本発明は、ヒトＰＫＣαの３’−非翻訳領域の一部をコードする核酸配列を提供する。ポリヌクレオチドプローブおよびＰＫＣαを検出する方法もまた提供される。本発明のいくつかの態様においては、ＰＫＣαの特定のｍＲＮＡ転写産物に特異的な核酸配列、ならびにこの転写産物を特異的に検出するためのポリヌクレオチドプローブおよび方法が提供される。本発明の他の態様に従えば、ＰＫＣαをコードする核酸に特異的にハイブリダイズしうるアンチセンスオリゴヌクレオチドが提供される。さらに別の態様においては、ＰＫＣαの特定のｍＲＮＡ転写産物と特異的にハイブリダイズしうるアンチセンスオリゴヌクレオチドが提供される。そのようなオリゴヌクレオチドは、便利にかつ望ましくは、薬学的に許容しうる担体中に存在させることができる。本発明のさらに別の観点においては、細胞において、ＰＫＣαまたは特定のＰＫＣα ｍＲＮＡ転写産物の発現を変調させる方法が提供される。本発明のさらに別の観点は、細胞においてＰＫＣαをコードする核酸を検出する、および細胞において特定のＰＫＣα転写産物をコードする核酸を検出する方法に関する。そのような方法は、前記核酸の効果を妨害するまたは前記核酸を検出するために、細胞を本発明に従うオリゴヌクレオチドと接触させることを含む。本発明のさらに別の態様においては、ＰＫＣαまたはその転写産物の１つの発現に関連する疾患を有する動物を治療する方法が提供される。そのような方法は、ＰＫＣαの発現を変調するため、ＰＫＣαに関連する状態を処置するため、またはその診断を行うために、動物を治療的有効量の本発明に従うオリゴヌクレオチドと接触させることを含む。発明の詳細な説明現在、アンチセンスオリゴヌクレオチドは多くのヒトの疾患の治療のための治療剤として受け入れられている。オリゴヌクレオチドはワトソン−クリック塩基対により定義されているごとく、ＤＮＡ、ｐｒｅ−ｍＲＮＡまたは成熟ｍＲＮＡの相補的配列と特異的に結合（ハイブリダイズ）して、ＤＮＡから蛋白質への遺伝的情報の流れを妨害する。標的配列に対して特異的にさせられたアンチセンスオリゴヌクレオチドの性質はまた、それらを非常に有用なものにしている。アンチセンスオリゴヌクレオチドは単量体単位の長い鎖であるため、それらは任意の標的ＲＮＡ配列に対して容易に合成することができる。多くの最近の研究は、標的蛋白質研究のための生化学的道具としてのアンチセンスオリゴヌクレオチドの有用性を述べている（Ｒｏｔｈｅｎｂｅｒｇｅｔａｌ．，Ｊ．Ｎａｔｌ．ＣａｎｃｅｒＩｎｓｔ．１９８９，８１，１５３９−１５４４；Ｚｏｎ，Ｇ．，ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＲｅｓ．１９８８，５，５３９−５４９）。オリゴヌクレオチド化学の最近の進歩、および増強された細胞取り込み、標的結合親和性およびヌクレアーゼ耐性を示すオリゴヌクレオチドの合成により、現在では治療法の新しい形態としてのアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用を考えることが可能である。例えば、ｃ−ｍｙｂを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて、急性骨髄性白血病を有する患者に由来する骨髄からの骨髄性白血病細胞が完全に排除された（ＧｅｗｉｒｔｚａｎｄＣａｌａｂｒｅｔｔａ，米国特許第５，０９８，８９０号）。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヒトにおいて、サイトメガロウイルス網膜炎感染の治療のための臨床的効力を有することが示されている。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＰＫＣに関連する状態を治療するための従来の方法で直面する問題点の理想的な解決法を提供する。それらは問題とするイソ酵素またはイソ酵素の特定の組を選択的に阻害するように、または、問題とするイソ酵素の群の全てのメンバーを阻害するように設計することができる。プロテインキナーゼＣの活性または代謝を変調する現在の薬は、それらの特異性の欠如による多くの許容できない副作用を有するか、または酵素の阻害において限られた有効性しか示さない。本発明は従来の研究者が直面した問題を、酵素を直接的に阻害するのではなく酵素の産生を変調することにより解決し、治療効果を達成する。本発明においては、オリゴヌクレオチドは直接ｍＲＮＡまたは遺伝子にハイブリダイズし、最終的に遺伝子から産生されるＰＫＣ蛋白質の量を変調する。本発明の文脈において、「ハイブリダイゼーション」とは、通常は反対側の核酸鎖のまたは１つの核酸鎖中の２つの領域の相補的塩基の間で水素結合（ワトソン−クリック塩基対形成としても知られている）して二本鎖デュープレックスを形成することを意味する。グアニンおよびシトシンは、これらの間に３つの水素結合を形成することが知られている相補的塩基の例である。アデニンおよびチミンは、これらの間に２つの水素結合を形成することが知られている相補的塩基の例である。「特異的にハイブリダイズしうる」および「実質的に相補的な」とは、特異的結合が望まれる条件下（すなわち、インビボアッセイおよび治療的処置の場合には生理学的条件、インビトロアッセイの場合にはアッセイを実施する条件）で、オリゴヌクレオチド（またはポリヌクレオチドプローブ）の、非標的配列に対する非特異的結合を回避するのに十分な程度の相補性を示す用語である。特異的にハイブリダイズしうるためには、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドプローブはその標的核酸配列と１００％相補的である必要はないことが理解されるであろう。オリゴヌクレオチドとその相補的（または「標的」）核酸との間の関係は、一般に「アンチセンス」として称される。アンチセンス攻撃のために特定の遺伝子を標的とすることが好ましい。ＰＫＣ α、β、γ、δ、ε、ζおよびηをコードする遺伝子が特にこの方法のために有用であることが発見されている。ＰＫＣ発現の阻害は、疾患の治療、特に過増殖性および炎症性疾患の治療に有用であると予期される。しかし、本発明の文脈においては、「変調」とは、ＰＫＣ発現の増加または減少（促進または阻害）のいずれかを意味する。本発明の文脈において、術語「オリゴヌクレオチド」とは、天然に存在する塩基および天然のホスホジエステル結合により連結されたペントフラノシル（糖）基から形成されたポリヌクレオチドを意味する。この術語は実際上、天然に存在する化学種または天然に存在するサブユニットまたはそれらの密接な類似体から形成された合成種を意味する。術語「オリゴヌクレオチド」はまた、天然に存在するオリゴヌクレオチドと同様に機能するが、天然に存在しない部分を有する成分を意味してもよい。従って、オリゴヌクレオチドは変更された糖部分、核塩基または糖間（主鎖）連結を有していてもよい。このような修飾されたまたは置換されたオリゴヌクレオチドは、例えば増強された細胞取り込み、増強された標的結合親和性およびヌクレアーゼの存在下における増加した安定性等の性質のため、しばしば天然形よりも好ましい。本発明において意図されるいくつかの好ましいオリゴヌクレオチドの特定の例としては、ホスホトリエステル、メチルホスホネート、短鎖アルキルまたはシクロアルキル糖間連結または短鎖複素原子または複素環糖間連結等の、糖間主鎖連結を含むものが挙げられる。最も好ましいものは、ＣＨ₂−ＮＨ−Ｏ−ＣＨ₂、ＣＨ₂−Ｎ（ＣＨ₃）−Ｏ−ＣＨ₂、ＣＨ₂−Ｏ−Ｎ（ＣＨ₃）−ＣＨ₂、ＣＨ₂−Ｎ（ＣＨ₃）−Ｎ（ＣＨ₃）−ＣＨ₂、およびＯ−Ｎ（ＣＨ₃）−ＣＨ₂−ＣＨ₂主鎖（ここでホスホジエステルはＯ−Ｐ−Ｏ−ＣＨ₂である）を有するものである。ホスホロチオエートもまた最も好ましい。モルホリノ主鎖構造を有するオリゴヌクレオチドもまた好ましい。Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ，Ｊ．Ｅ．ａｎｄＷｅｌｌｅｒ，Ｄ．Ｄ．、米国特許出願第５，０３４，５０６号。ペプチド核酸（ＰＮＡ、「蛋白質核酸」とも称される）主鎖等の別の好ましい態様においては、オリゴヌクレオチドのホスホジエステル主鎖はポリアミド主鎖に置き換えられていてもよく、ここでヌクレオシドの塩基はポリアミド主鎖のアザ窒素原子またはメチレン基に直接または間接的に結合されている（例えば、Ｐ．Ｅ．Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｍ．Ｅｇｈｏｌｍ，Ｒ．Ｈ．Ｂｅｒｇ，Ｏ．Ｂｕｃｈａｒｄｔ，Ｓｃｉｅｎｃｅ１９９１，２５４，１４９７、および米国特許出願第０８／０５４，３６３号（１９９３年４月２６日出願）を参照のこと、これらを本明細書の一部としてここに引用する）。別の好ましい態様にしたがえば、ホスホジエステル結合は、キラルでありかつ対掌体特異的である構造で置換されている。当業者は本発明の実施に使用するための別の結合を選択することが可能であろう。オリゴヌクレオチドは少なくとも一つの修飾核塩基を含む化学種を含んでいてもよい。すなわち、天然に通常見いだされるもの以外のプリンおよびピリミジンをそのように用いてもよい。同様に、本発明の本質的教義から離れない限りは、ヌクレオチドサブユニットのペントフラノシル部分上の修飾もまた有効である。そのような修飾の例は２’−Ｏ−アルキル−および２’−ハロゲン−置換ヌクレオチドである。本発明において有用である糖部分の２’位における修飾のいくつかの特定の例は、ＯＨ、ＳＨ、ＳＣＨ₃、Ｆ、ＯＣＮ、Ｏ（ＣＨ₂）_nＮＨ₂、またはＯ（ＣＨ₂）_nＣＨ₃（式中、ｎは１から約１０である）；Ｃ₁〜Ｃ₁₀低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリールまたはアラルキル；Ｃｌ；Ｂｒ；ＣＮ；ＣＦ₃；ＯＣＦ₃；Ｏ−、Ｓ−もしくはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−もしくはＮ−アルケニル；ＳＯＣＨ₃；ＳＯ₂ＣＨ₃；ＯＮＯ₂；ＮＯ₂；Ｎ₃；ＮＨ₂；ヘテロシクロアルキル；ヘテロシクロアルカリール；アミノアルキルアミノ；ポリアルキルアミノ；置換シリル；ＲＮＡ開裂基；レポーター基；インターカレーター；オリゴヌクレオチドの薬理学的性質を改良するための基；またはオリゴヌクレオチドの薬物動態学的性質を改良するための基、または類似の性質を有するその他の置換基である。１つまたはそれ以上のペントフラノシル基が、他の糖、シクロブチル等の糖模倣体または糖の代わりになる他の成分で置換されていてもよい。キメラまたは「ギャップを有する」オリゴヌクレオチドもまた、本発明の好ましい態様である。これらのオリゴヌクレオチドは、二つまたはそれ以上の化学的に異なる領域を有し、それぞれが少なくとも１つのヌクレオチドを含む。典型的には、１つまたはそれ以上の領域は、１つまたはそれ以上の有利な性質、例えば増加したヌクレアーゼ耐性、増加した細胞への取り込みまたはＲＮＡ標的への増加した結合親和性を付与する修飾されたヌクレオチドを含む。１つまたはそれ以上の非修飾または異なるように修飾された領域は、ＲＮＡｓｅＨ活性を指示する能力を保持する。キメラオリゴヌクレオチドは、本出願の出願人に譲渡されているＰＣＴ出願ＵＳ９２／１１３３９に開示されており、この内容をすべて本明細書の一部としてここに引用する。現在のところ好ましいキメラオリゴヌクレオチドの例は、２’−デオキシヌクレオチドの「デオキシギャップ」を有する２’− Ｏ−メチルまたは２’−Ｏ−プロピルオリゴヌクレオチドである。通常は、このデオキシギャップ領域は２つの２’−アルキル領域の間に位置している。これらの好ましい態様においては、糖間（主鎖）連結は、均一なホスホロチオエートまたはホスホロチオエート連結とホスホジエステル連結のある種の組み合わせでありうる。すべてのそのようなオリゴヌクレオチドは、天然のオリゴヌクレオチド（または、天然のラインに沿って合成されたオリゴヌクレオチド）と機能的に交換可能であるが、天然の構造とは一つまたはそれ以上の相違を有するものとして記述するのが最適であろう。すべてのそのようなオリゴヌクレオチドは、ＰＫＣＲＮＡとハイブリダイズするのに有効に機能する限り、本発明に包含される。本発明に従うオリゴヌクレオチドは、好ましくは約５から約５０ヌクレオチド単位を含む。約８から３０のヌクレオチド単位を含むオリゴヌクレオチドがより好ましく、約１２から２５のヌクレオチド単位を有するものがさらにより好ましい。理解されるように、ヌクレオチド単位とは、ホスホジエステルまたは主鎖構造を形成する他の結合を介して隣接するヌクレオチド単位に適切に結合されている塩基−糖の組み合わせ（または類似の構造の組み合わせ）である。本発明に従って使用されるオリゴヌクレオチドは、固相合成のよく知られた技術により都合よくかつ日常的に作製することができる。そのような合成のための装置はＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓを含むいくつかの販売元から市販されている。そのような合成のために他の手段を用いてもよい；オリゴヌクレオチドの実際の合成は機械的に仕事を処理する人の能力の範囲内である。ホスホロチオエートまたはアルキル化誘導体等の他のオリゴヌクレオチドを合成するために類似の技術を使用することもよく知られている。他の修飾および置換オリゴマーは、同様にして合成することができる本発明に従うと、当業者は、メッセンジャーＲＮＡは、３文字遺伝コードを用いて蛋白質をコードしている情報を含むコーディング領域のみならず、５’−非翻訳領域、３’−非翻訳領域、５’キャップ領域およびイントロン／エクソン結合部リボヌクレオチドとして当業者に知られている領域を形成する付随するリボヌクレオチドをも含むことを理解するであろう。従って、これらの付随するリボヌクレオチドならびにコーディングリボヌクレオチドの全体または一部を標的とするオリゴヌクレオチドを本発明に従って形成することができる。好ましい態様においては、オリゴヌクレオチドは転写開始部位、翻訳開始部位、５’キャップ領域、イントロン／エクソン結合部、コーディング配列または５’−もしくは３ ’−非翻訳領域中の配列と特異的にハイブリダイズすることができる。本発明のオリゴヌクレオチドは、ＰＫＣ遺伝子またはＰＫＣ遺伝子に由来するメッセンジャーＲＮＡにハイブリダイズしうるように設計さる。そのようなハイブリダイゼーションが達成された場合、メッセンジャーＲＮＡの正常な役割を妨害し、細胞におけるその機能の変調が生ずる。妨害されるべきメッセンジャーＲＮＡの機能には、蛋白質翻訳部位へのＲＮＡのトランスロケーション、ＲＮＡから蛋白質への実際の翻訳、一つまたはそれ以上のｍＲＮＡ種を得るためのＲＮＡのスプライシング、および多分ＲＮＡに携わっているであろう独立した触媒活性のような全ての生体機能が含まれる。ＲＮＡ機能へのそのような妨害の全体の効果はＰＫＣ遺伝子発現の変調である。本発明のオリゴヌクレオチドは、診断薬、治療薬、予防薬および研究用試薬およびキットとして使用することができる。本発明のオリゴヌクレオチドはＰＫＣ遺伝子およびそのｍＲＮＡにハイブリダイズするため、この事実を利用してサンドイッチおよびその他のアッセイを容易に組み立てることができる。さらに、本発明のオリゴヌクレオチドはＰＫＣｍＲＮＡの特定のイソ酵素にハイブリダイズするため、特定のＰＫＣイソ酵素についての細胞および組織のスクリーニングのためのアッセイが工夫できる。そのようなアッセイは種々のＰＫＣ形に関連する疾患の診断に利用することができる。ＰＫＣ遺伝子に対するオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを検出する手段の準備は日常的に達成される。そのような準備には、酵素のコンジュゲート、放射性標識または別の適した検出系が含まれる。ＰＫＣの存在または不在を検出するためのキットもまた製造されるであろう。治療または予防処置のために、オリゴヌクレオチドが本発明に従って投与される。オリゴヌクレオチドは医薬組成物中に処方され、それにはオリゴヌクレオチドに加えて、担体、粘稠化剤、希釈剤、緩衝剤、保存剤、表面活性化剤などが含まれているであろう。医薬組成物は、オリゴヌクレオチドに加えて、一つまたはそれ以上の活性成分、例えば抗菌薬、抗炎症薬、麻酔薬を含んでいてもよい。医薬組成物は、局所または全身の処置が望まれているか、および処置されるべき領域に依存して多くの方法で投与することができる。投与は局所的に（点眼、膣内、直腸内、鼻孔内を含む）、経口で、吸入により、または非経口で（例えば、静脈内点滴または皮下、腹腔内または筋肉内注射）実施されるであろう。局所投与のための処方には軟膏、ローション剤、クリーム剤、ゲル剤、滴剤、座剤、スプレー剤、水剤および散剤が含まれるであろう。通常の医薬担体、水性、粉末もしくは油性基剤、粘稠化剤等が必要かまたは望ましいであろう。コーティングしたコンドームもまた有用であろう。経口投与のための処方には、散剤、顆粒剤、水または非水性媒質中の懸濁化剤または液剤、カプセル剤、サッシェ剤、または錠剤が含まれる。粘稠化剤、芳香剤、希釈剤、乳化剤、分散補助剤または結合剤が望まれるであろう。非経口投与のための処方には、緩衝液、希釈剤およびその他の適切な添加剤を含んでいてもよい無菌水溶液が含まれる。投与量は処置されるべき状態の重度および応答性に依存するが、通常は、数日から数カ月の処置過程で、治癒が達成されるかまたは疾患状態の軽減が達成されるまで、一日当たり一回またはそれ以上の投与量であろう。当業者は最適の投与量、投与法および反復率を容易に決定することができる。本発明はまた、ヒトＰＫＣαの３’−非翻訳領域をコードする配列を有する核酸分子を提供する（図１３）。この配列は、ヒトＡ５４９細胞から調製されたｃＤＮＡクローンから決定され、先に公表されたＰＫＣα配列（Ｆｉｎｋｅｎｚｅｌｌｅｒｅｔａｌ．，Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１８：２１８３（１９９０）；Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｘ５２４７９）の３’−最末端と重なるクローンから始まり、３’方向に伸びている。１０８０ヌクレオチドの後に達するポリアデニル化部位（図１３中のヌクレオチド１１３６）は、ＰＫＣαのショート（４ｋｂ）ｍＲＮＡ転写産物の３’末端として同定された。３’方向の追加の６７６ヌクレオチドの配列が決定され、この配列はＰＫＣαのロング（８ｋｂ）ｍＲＮＡ転写産物に独特である。本発明の核酸分子は、好ましくはデオキシリボ核酸からなり、本発明のいくつかの観点においては二本鎖である。また、本発明に従えば、該核酸分子が単離される。本明細書で用いられる「単離された」との用語は、実質的に均一であるように精製されまたは合成された分子を意味する。この用語は、ある種の不純物が組成物中に存在する可能性を排除するものではなく、関連性のない核酸配列が存在しないことを意味する。本発明に従えば、ヒトＰＫＣα遺伝子の３’−非翻訳領域の一部に特異的にハイブリダイズしうるポリヌクレオチドプローブが提供される。ＰＫＣαのロングｍＲＮＡ転写産物の一部に特異的にハイブリダイズしうるポリヌクレオチドプローブもまた提供される。このようなプローブを診断または研究目的に使用して、ＰＫＣαの発現を検出しまたは定量化することができる。プローブを用いて、ＰＫＣαのロング転写産物を特異的に検出しまたは定量化することができる。該ポリヌクレオチドプローブは、約５から約５０ヌクレオチド単位の長さの範囲でありうる。本発明のより好ましい態様においては、プローブは約８から約３０ヌクレオチド単位の長さである。理想的には、該プローブは、約１２から約２５ヌクレオチド単位の範囲の長さである。本発明のポリヌクレオチドプローブは理想的には５０ヌクレオチド長さを越えないため、該プローブは標的配列の一部にのみ特異的にハイブリダイズすることが認識されるであろう。当業者は、標的化されるべきＰＫＣα配列の部分を同定することができる。最も適切には、標的配列は独特であるように選択され、このことにより、プローブの標的以外へのハイブリダイゼーションに起因するバックグラウンドノイズが減少する。例えば、アデニンヌクレオチド単位の反復配列は、多くの遺伝子に生ずる共通配列であるため、当業者はそのような配列を選択しないであろう。実施する者は、有用なプローブを同定し設計するために、Ｇｅｎｂａｎｋ等の配列受託機関において見いだされる配列の探索および比較を行うことを選択するであろう。そのような方法は、独特の配列を同定するために慣用的に用いられている。これらの独特の配列は、プローブとして用いる場合、ＰＫＣαの発現の制御に決定的である必要はない。以下の実施例は本発明の例示であり、本発明を制限することを意図したものではない。実施例１オリゴヌクレオチド合成非修飾ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、ヨウ素により酸化する標準ホスホロアミダイトの化学を使用する自動化ＤＮＡシンセサイザー（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓモデル３８０Ｂ）で合成した。β−シアノエチルジイソプロピル−ホスホロアミダイトはＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ，ＣＡ）から購入した。ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドについては、ホスファイト結合の段階的チオ化のために、標準酸化ボトルを３Ｈ −１，２−ベンゾジチオール−３−オン１，１，−ジオキシドの０．２Ｍアセトニトリル溶液に置き換えた。チオ化サイクル待ち時間は６８秒に増加し、続いてキャッピング工程を実施した。２’−Ｏ−メチルホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、標準的ホスホルアミダイトを２’−Ｏ−メチル β−シアノエチルジイソプロピルホスホルアミダイト（Ｃｈｅｍｇｅｎｅｓ，Ｎｅｅｄｈａｍ，ＭＡ）に置き換え、テトラゾールおよび塩基のパルス放出の後の待ち時間を３６０秒に増加して、上述の方法にしたがって合成した。同様に、２’−Ｏ−プロピルホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、この方法をわずかに変更して製造することができる。オリゴヌクレオチドは、制御細孔ガラスカラム（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）から切断し、５５℃で１８時間濃水酸化アンモニウム中で脱保護した後、２．５容量のエタノールおよび０．５ＭＮａＣｌから二回沈澱させることにより精製した。分析ゲル電気泳動は、２０％アクリルアミド、８Ｍ尿素、４５ｍＭトリス−ホウ酸緩衝液、ｐＨ７．０で実施した。試験したオリゴヌクレオチドは表１に示されている。配列データは、Ｆｉｎｋｅｒｎｚｅｌｌｅｒｅｔａｌ．，Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１９９０，１８，２１８３；Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｘ５２４７９により発表されたｃＤＮＡ配列からのものである。オリゴヌクレオチドの下に与えられている配列番号はｃＤＮＡで配列決定されるべき第一の残基（ＡＴＧ開始コドンの上流の２８番目の残基）に対して相対的なものである。実施例２細胞培養およびホルボールエステルおよびＰＫＣ−αを標的とするオリゴヌクレオチドによる処理ＰＫＣ蛋白質半減期は６．７時間から２４時間まで変動することが報告されている（Ｙｏｕｎｇｅｔａｌ．，Ｂｉｏｃｈeｍ．Ｊ．１９８７，２４４，７７５−７７９；Ｂａｌｌｅｓｔｅｒｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９８５，２６０，１５１９４−１５１９９）。これらの長い半減期のため長いインキュベーション時間が必要とされ、アンチセンスオリゴヌクレオチドをスクリーニングする場合、ＰＫＣ−αの定常状態を阻害することは実際的ではない。したがって、ＰＫＣの細胞内レベルを可逆的に低くするホルボールエステルの能力を利用した。細胞をホルボールエステルで処理すると、最初にキナーゼ活性の活性化、続いてＰＫＣのダウンレギュレーションが起こる。ＰＫＣ−αについては、このダウンレギュレーションは、キナーゼの合成速度は明らかに変化せずに蛋白質分解の速度が増加した直接の結果であることが示されている。ヒト肺癌腫（Ａ５４９）細胞において、Ｋｒｕｇｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９８７，２６２，１１８５２−１１８５６の方法の変法を用いたホルボールエステル１２，１３−ジブチレート（ＰＤＢｕ）の処理は、ＰＫＣ −α ｍＲＮＡレベルに影響を与えずにＰＫＣ−αの細胞レベルを低下させ、この効果は可逆的であることが決定された。ＰＫＣ−αを標的とするオリゴヌクレオチドの効力をスクリーニングするアッセイの基本は、最初にＰＤＢｕで長期間処理することによりＰＫＣ−α蛋白質レベルを低下させ、細胞をよく洗浄することによりＰＤＢｕを除去し（これにより細胞は新規のＰＫＣ−α蛋白質を合成することができる）、新ＰＫＣ−α蛋白質の再合成を阻害するために細胞をオリゴヌクレオチドとともにインキュベートすることである。方法：Ａ５４９細胞（ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，ＢｅｔｈｅｓｄａＭＤから入手した）を、６−ウェルプレート（ＦａｌｃｏｎＬａｂｗａｒｅ，ＬｉｎｃｏｌｎＰａｒｋ，ＮＪ）上、１ｇグルコース／リットルおよび１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ，ＩｒｖｉｎｅＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＳａｎｔａＡｎａ，ＣＡ）を含むダルベッコ改良イーグル培地（ＤＭＥ）中でコンフルエントになるまで増殖させた。細胞を５００ｎＭのＰＤＢｕ（ＳｉｇｍａＣｈｅｍ．Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で１２−１６時間（終夜）処理した。次に、細胞をＤＭＥで３７℃ で３回洗浄し、２０μｌのＤＯＴＭＡ（Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ試薬，ＢＲＬ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）を含む１ｍｌのＤＭＡを加えた。オリゴヌクレオチドを１μＭの濃度となるよう添加し、細胞を３７℃でさらに４時間インキュベートした。細胞を０．１ｍｇ／ｍｌＢＳＡを含む３ｍｌのＤＭＥで１回洗浄し、０．１ｍｇ／ｍｌＢＳＡを含む２ｍｌのＤＭＥをさらに加えた。オリゴヌクレオチド（１μＭ）を加えて細胞を３７℃で２４時間インキュベートした。細胞をリン酸緩衝化塩溶液（ＰＢＳ）中で３回洗浄し、細胞蛋白質を１２０μ ｌの試料緩衝液（６０ｍＭトリスｐＨ６．８，２％ＳＤＳ，１０％グリセロール，１０ｍＭジチオスレイトール）中に抽出して５分間煮沸した。ＰＫＣ−α 蛋白質の細胞内レベルはイムノブロッティングにより決定した。実施例３ＰＫＣ発現のイムノブロットアッセイ細胞抽出物を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥミニゲル上で電気泳動した。分離した蛋白質を電気泳動的移動によりＩｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ膜（ＭＩｌｌｉｐｏｒｅ，ＢｅｄｆｏｒｄＭＡ）に移し、膜を５％脱脂ミルクを含むＴＢＳ（トリス−ＨＣｌｐＨ７．４，１５０ｍＭＮａＣｌ）中、６０分間ブロックした。次に、膜を、０．２％脱脂ミルクを含むＴＢＳで０．２μｇ／ｍｌに希釈した、ＰＫＣ −αに対するモノクローナル抗体（ＵＢＩ，ＬａｋｅＰｌａｃｉｄＮＹ）とともに４℃で１６時間インキュベートした。続いて０．２％脱脂ミルクを加えたＴＢＳ中で３回洗浄した。次に膜を¹²⁵Ｉ−標識ヤギ抗マウス二次抗体（ＩＣＮＲａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）とともに１時間インキュベートした。次に膜を０．２％脱脂ミルクを加えたＴＢＳ中でよく洗浄した。バンドを可視化しホスファーイメージャー（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｙｎａｍｉｃｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を使用して定量した。ＰＫＣ−αは８０ｋＤの分子量を有する単一バンドとして現れる。各々のオリゴヌクレオチドは３回試験し（３重に）、実験の結果はオリゴヌクレオチドで処理されていない細胞と比較して、存在する蛋白質のパーセントに対して標準化されている（図１ａおよび１ｂ）。５つの最も有効なオリゴヌクレオチドは、ＡＵＧ開始コドンおよびそれからわずかに上流および下流の領域を標的としている（オリゴ１、３、１７、７、６）。次に最も有効なオリゴヌクレオチドはＲＮＡの３’非翻訳領域を標的としている（オリゴ２、５、１４）。実施例４ＰＫＣの他のイソ酵素ヒトＰＫＣ−αを標的とするオリゴヌクレオチドについて得られた結果は、最も有効な標的配列は翻訳開始コドンを囲む配列および３’−非翻訳領域であることを示した。これらの配列はまた、ＰＫＣの他のイソ酵素に対するオリゴヌクレオチドについても有効な標的であると考えられる。ＰＫＣの有効な阻害剤であろうアンチセンスオリゴヌクレオチドが以下に同定されている。これらのオリゴヌクレオチドは実施例１のごとく合成し、入手可能な場合には適当な抗体を用いて実施例２および３のごとくスクリーニングすることができる。または、ＴＰＡ− 応答性エンハンサーまたは適当なプロモーターの影響下、所望のＰＫＣのイソ酵素とルシフェラーゼを一時的に同時発現するレポーター遺伝子アッセイ系を確立することができる。次に、常法を用いてルシフェラーゼ活性を測定することによりＰＫＣ発現をアッセイする。すなわち、Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ，Ｍ．Ｅ．，ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｂｒｅｎｔ，Ｒ．Ｅ．Ｋｉｎｇｓｔｏｎ，Ｄ．Ｄ．Ｍｏｏｒｅ，Ｊ．Ａ．Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．Ｇ．ＳｅｉｄｍａｎおよびＫ．Ｓｔｒａｈｌ編），ＪｏｈｎＷｉｌｅｙａｎｄＳｏｎｓ，ＮＹ（１９８７）により記載されているごとく、界面活性剤トリトンＸ−１００による溶解により細胞からルシフェラーゼを抽出する。ＤｙｎａｔｅｃｈＭＬ１０００発光計を用いて、ルシフェリン（Ｓｉｇｍａ）添加による６２５μＭまでのピーク発光の測定を行う。ＰＫＣ−β、タイプＩおよびＩＩ配列データは、Ｋｕｂｏｅｔａｌ．，ＦＥＢＳＬｅｔｔ．１９８７，２２３，１３８−１４２，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｘ０６３１８，Ｍ２７５４５，Ｘ０７１０９からのものである。配列はｃＤＮＡで配列決定された最初の５’塩基から番号付けられている。ＰＫＣ−βタイプＩおよびＩＩは単一の遺伝子産物の異なるｍＲＮＡスプライシングの結果である。このため同一のアミノ末端を有する蛋白質が生じている（ｍＲＮＡの５’末端）；しかしながら、カルボキシ末端に配列の相違が存在する（ｍＲＮＡの３’末端）。下記のオリゴヌクレオチド（翻訳開始コドンを標的とする）はＰＫＣ−βタイプＩおよびＩＩ両方の発現を変調することが期待される：下記のアンチセンスオリゴヌクレオチドはＰＫＣ−βタイプＩの３’非翻訳領域を標的とする：下記のアンチセンスオリゴヌクレオチドはＰＫＣ−βタイプＩＩの３’非翻訳領域を標的とする：ＰＫＣ−γ：配列データは、Ｃｏｕｓｓｅｎｓｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ１９８６，２３３，８５９−８６６，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｍ１３９７７からのものである。配列はｃＤＮＡ中で配列決定された最初の５’塩基から番号付けられている。完全な配列は入手不可能であった：オープンリーディングフレームの３’最末端および３’非翻訳領域が欠如している。その結果、これらの領域は現在のところアンチセンス標的としては入手不可能である。ＰＫＣ−η：ＰＫＣ−ηのための配列データはＢａｃｈｅｒおよびその協同研究者［Ｂａｃｈｅｒｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１９９１，１１，１２６ −１３３］，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｍ５５２８４からのものである。彼らはそのイソ酵素をＰＫＣ−Ｌと名付けている；しかしながら、その配列はマウスＰＫＣ−ηのものとほとんど同一であり、一貫性を保つためここでは後者の命名法が用いられた。配列はｃＤＮＡ中で配列決定された最初の５’塩基から番号付けられている。実施例５ＰＫＣ−α蛋白質合成に対するホスホロチオエート／２’−Ｏ−メチルオリゴヌクレオチドの効果の用量応答性：一連のホスホロチオエート（配列ＩＤ番号：１、２、３および５を有する完全２’−Ｏ−メチル化オリゴヌクレオチド）を合成した。ＰＫＣ−α合成をダウンレギュレーションするため、Ａ５４９細胞を５００ｎＭのＰＤＢｕで１８時間処理し、洗浄してＰＤＢｕを除去した後、オリゴヌクレオチドおよびＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥ陽イオン性リポソームで処理した。４時間後に培地を置き換え、さらに２０時間放置して細胞を回復させた。蛋白質を抽出し、実施例３に記載したように、イムノブロッティングによりＰＫＣ−α蛋白質レベルを決定した。結果はホスファーイメージャー（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｙｎａｍｉｃｓ，ＳｕｎｎｙｖａｌｅＣＡ）で定量化し、図２に対照（食塩水処理）のパーセントとして示されている。ＩＳＩＳ４６４９（配列ＩＤ番号：３；四角）は５００ｎＭでＰＫＣ −α蛋白質レベルを８５−９０％減少させ、約２６０ｎＭのＩＣ５０を有していた。実施例６ＰＫＣ−α ｍＲＮＡレベルに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの効果：Ａ５４９細胞を、陽イオン性脂質ＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥ存在下、５００ｎＭのホスホロチオエートオリゴヌクレオチドで４時間処理し、洗浄後さらに２０時間放置して回復させた。全ＲＮＡを抽出し、２０μｇを各々１．２％ゲルで分離してナイロン膜に移した。これらのブロットは、³²Ｐ放射性標識ＰＫＣ−α ｃＤＮＡプローブで探査したのちこれを取り出し、等量のＲＮＡが充填されたことを確認するため放射性標識Ｇ３ＰＤＨプローブで再探査した。各々のオリゴヌクレオチド（３５２０、３５２１、３５２２および３５２７）を用いて二重に試験した。二つの主要なＰＫＣ−α転写産物（８．５ｋｂおよび４．０ｋｂ）を調べ、ホスファーイメージャー（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｙｎａｍｉｃｓ，ＳｕｎｎｙｖａｌｅＣＡ）で定量化した。結果は図３に示されている。オリゴヌクレオチド３５２１（配列ＩＤ番号：２）、３５２２（配列ＩＤ番号：３）および３５２７（配列ＩＤ番号：５）は、ＰＫＣ−α ｍＲＮＡレベルの５０％より大きな減少を与えた。オリゴヌクレオチド３５２１および３５２７は小さい方の転写産物の約８０％の減少および大きい方の転写産物の９０％を超える減少を与えた。実施例７キメラ（デオキシギャップ）２’−Ｏ−メチルオリゴヌクレオチド：オリゴヌクレオチド３５２１（配列ＩＤ番号：２）、３５２２（配列ＩＤ番号：３）および３５２７（配列ＩＤ番号：５）をさらなる研究および修飾のために選択した。これらの配列を有するオリゴヌクレオチドを、２’−Ｏ−メチル化領域が隣接し、中心に種々の長さのデオキシギャップを有する均一なホスホロチオエートキメラオリゴヌクレオチドとして合成した。これらのオリゴヌクレオチド（５００ｎＭ濃度）のＰＫＣ−α ｍＲＮＡレベルに及ぼす影響をノーザンブロット分析により試験した。結果は図４に示されている。８ヌクレオチドまたはそれ以上のデオキシギャップは全ての場合においてＰＫＣ−α ｍＲＮＡレベル（両方の転写産物とも）の最大の減少を与えた。配列ＩＤ番号：３を有するオリゴヌクレオチドは４ヌクレオチドのデオキシギャップ長で約８３％ＰＫＣ−α ｍＲＮＡを減少させ、６またはそれ以上のデオキシギャップ長でＰＫＣ−α ｍＲＮＡをほとんど完全に消滅させた。これらのオリゴヌクレオチドの用量応答曲線が図５に示されている。４または５のヌクレオチドデオキシギャップを有する２’−Ｏ−メチルキメラオリゴヌクレオチドは、２００−２５０ｎＭのＰＫＣ−α ｍＲＮＡ減少に対するＩＣ５０（ＰＫＣ−α ｍＲＮＡレベルの５０％減少を与えるのに必要なオリゴヌクレオチド濃度）を有し、完全デオキシオリゴヌクレオチド（すべてを通してホスホロチオエート）も同様であった。８−ヌクレオチドデオキシギャップを有する２ ’−Ｏ−メチルキメラオリゴヌクレオチドは約８５ｎＭのＩＣ５０を有していた。このキメラオリゴヌクレオチド（配列ＩＤ番号：３）のいくつかの変異体についてＰＫＣ−α ｍＲＮＡレベルを下げる能力を比較した。これらのオリゴヌクレオチドは表７に示されている。これらのオリゴヌクレオチドのＰＫＣ−α ｍＲＮＡレベルに及ぼす影響は図６に示されている。オリゴヌクレオチド７００８、３５２２および５３５２がＰＫＣ−α ｍＲＮＡの減少を示し、５３５２が最も活性であった。配列ＩＤ番号：３を有する一連の２’−Ｏ−プロピルキメラオリゴヌクレオチドを合成した。これらのオリゴヌクレオチドは表８に示されている。これらの２’−Ｏ−プロピルキメラオリゴヌクレオチドを２’−Ｏ−メチルキメラオリゴヌクレオチドと比較した。オリゴヌクレオチド７２７３および７２９４はその２’−Ｏ−メチル対応物よりもＰＫＣ−α ｍＲＮＡレベルを低下させることにおいてより活性であった。このことは図７および８に示されている。実施例８ＰＫＣ−α ｍＲＮＡを減少させるその他のオリゴヌクレオチド：ヒトＰＫＣ−α ３’非翻訳領域を標的とする別のホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを設計し合成した。これらの配列は表９に示されている。図９に示したように、オリゴヌクレオチド６６３２、６６５３、７０８２および７０８３は最も強くＰＫＣ−α ｍＲＮＡレベルを減少させた。実施例９ヒトＡ５４９肺腫瘍細胞の培養ヒト肺癌腫細胞株Ａ５４９はＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＢｅｔｈｅｓｄａＭＤ）から入手した。細胞は１ｇｍグルコース／リットルおよび１０％ウシ胎児血清（ＩｒｖｉｎｅＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＩｒｖｉｎｅＣＡ）を含むダルベッコ改良イーグル培地（ＩｒｖｉｎｅＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で増殖させた。細胞はマウスに導入するため、トリプシン処理し、洗浄して同一の培地に再懸濁した。実施例１０ヌードマウスにおけるヒトＡ５４９腫瘍細胞の増殖に対するＩＳＩＳ３５２１の効果：２００μｌのＡ５４９細胞（５ｘ１０⁶細胞）をヌードマウスの内腿の皮下に移植した。配列ＩＤ番号：２を有するホスホロチオエートオリゴヌクレオチドＩＳＩＳ３５２１を、腫瘍細胞接種後１週間目から始めて週に２度４週間投与した。オリゴヌクレオチドは、陽イオン性脂質（ＤＭＲＩＥ／ＤＯＰＥ）で処方し、腫瘍の付近に皮下で投与した。オリゴヌクレオチド用量は５ｍｇ／ｋｇであった（６０ｍｇ／ｋｇの陽イオン性脂質とともに）。腫瘍サイズは週毎に記録した。図１０に示したように、３匹のマウス中２匹で腫瘍の増殖はほぼ完全に阻止され、３匹目のマウスでも対照に比べて減少していた。このＩＳＩＳ３５２１による腫瘍増殖の阻害は統計的に有意である。対照オリゴヌクレオチド（ＩＳＩＳ１０８２）はＰＫＣｍＲＮＡ標的と有意な配列相同性を有しない２１−ｍｅｒのホスホロチオエートオリゴヌクレオチドである。その腫瘍がすでに検出可能なサイズに達しているマウスへのオリゴヌクレオチドの投与は、続く腫瘍増殖に対して識別可能な効果を示さなかった。実施例１１ヌードマウスにおけるヒトＭＤＡ−ＭＢ２３１腫瘍の増殖に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの効果：ＭＤＡ−ＭＢ２３１ヒト乳癌腫細胞はＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＢｅｔｈｅｓｄａＭＤ）から入手した。連続的に移植されたＭＤＡ−ＭＢ２３１腫瘍をヌードマウスの皮下に確立した。２週間後から、オリゴヌクレオチド３５２１および３５２７（配列ＩＤ番号：５を有するホスホロチオエートオリゴヌクレオチド）の食塩水溶液を６０ｍｇ／ｋｇおよび６ｍｇ／ｋｇの用量で１４日間毎日静脈内投与した。対照オリゴヌクレオチドＩＳＩＳ１０８２もこれらの用量で投与し、対照食塩水も同様に投与した。腫瘍増殖速度をオリゴヌクレオチド投与の２週間にわたってモニターした。図１１に示したように、両方のＰＫＣ−αオリゴヌクレオチド（３５２１および３５２７）は、６０ｍｇ／ｋｇおよび６ｍｇ／ｋｇの用量で腫瘍細胞増殖を有意に阻害した。対照オリゴヌクレオチド（ＩＳＩＳ１０８２）もまた腫瘍増殖をいくらか減少させたが、この効果は高用量においてもアンチセンスオリゴヌクレオチドより効果が少なく、低用量ではほとんど効果がなかった。６ｍｇ／ｋｇおよび０．６ｍｇ／ｋｇの同一のオリゴヌクレオチドを用いてより低い用量での研究を行った。ＩＳＩＳ３５２１は０．６ｍｇ／ｋｇで腫瘍増殖を有意に減少させた。ＩＳＩＳ３５２７もこの濃度で腫瘍増殖を阻害したが、この結果は統計的に有意ではなかった。実施例１２マウスにおけるマウスルイス肺癌腫増殖に対するオリゴヌクレオチドの効果：連続的に移植されたマウスルイス肺癌腫をマウスで確立した。オリゴヌクレオチド３５２１および３５２７を６ｍｇ／ｋｇおよび０．６ｍｇ／ｋｇの用量で１４日にわたり毎日静脈内に投与した。オリゴヌクレオチド投与の２週間の間、腫瘍増殖速度をモニターした。予想されたごとく、ヒトＰＫＣ配列を標的とするこれらのオリゴヌクレオチドは、マウス由来腫瘍に対しては有意な効果を有していなかった。実施例１３ヘアレスマウスにおける内在性ＰＫＣ−α発現に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドＩＳＩＳ４１８９の効果：正常動物における内在性ＰＫＣ−α ｍＲＮＡレベルに対するオリゴヌクレオチド効果を調べるためには、マウスＰＫＣ−αに相補的なオリゴヌクレオチドを用いる必要があった。ＩＳＩＳ４１８９はマウスＰＫＣ−αのＡＵＧコドンを標的とする２０−ｍｅｒホスホロチオエートオリゴヌクレオチドである。この領域はヒトＰＫＣ配列と相同性がなく、このオリゴヌクレオチドはヒト細胞におけるＰＫＣ−αの発現に何の影響も与えない。ＩＳＩＳ４１８９はＣ１２７マウス乳上皮細胞におけるｍＲＮＡ減少に対し２００ｎＭのＩＣ５０を有している。食塩水溶液中のＩＳＩＳ４１８９を、１、１０または１００ｍｇ／ｋｇ体重の濃度でヘアレスマウスの腹腔に投与した。７日間にわたり毎日投与した。肝臓、腎臓、脾臓、肺および皮膚からの組織をとり、ＰＫＣ−α ｍＲＮＡおよび蛋白質レベルを決定した。また、肝臓、腎臓および肺の標本について、組織病理学的調査を行った。ＩＳＩＳ４１８９は、１００ｍｇ／ｋｇでマウス肝臓における内在性ＰＫＣ−α ｍＲＮＡレベルを対照（食塩水）の１０−１５％まで阻害した。実施例１４ヒトＰＫＣ−ηと相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドのスクリーニング：ヒトＰＫＣ−ηと相補的な一連の２０−ｍｅｒホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを合成した。これらのオリゴヌクレオチドを、５００ｎＭの濃度で、ノーザンブロットアッセイを使用し、ヒトＡ５４９細胞でのＰＫＣ−η ｍＲＮＡレベルを減少させる能力についてスクリーニングした。オリゴヌクレオチド配列は表１０に示されており、結果は図１２に示されている。オリゴヌクレオチド６４３２、６４４３、６４３１、６４４２、６４３５、６４３４、６４４５、６５５３、６５８１および６６０３はＰＫＣ−η ｍＲＮＡレベルを５０％以上減少させた。最も強力なオリゴヌクレオチドはＩＳＩＳ６５８１（３’非翻訳領域を標的とする）およびＩＳＩＳ６４４５（コーディング領域を標的とする）であり、このアッセイにおいてＰＫＣｍＲＮＡをほとんど完全に失わせた。実施例１５ヒトＰＫＣ−ζと相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドのスクリーニング：ヒトＰＫＣ−ζと相補的な一連の２０−ｍｅｒホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを実施例１に記載したように合成した。標的配列源はＧｅｎｂａｎｋＨＳＰＫＣＺ座、受託番号Ｚ１５１０８（Ｈｕｇ，Ｈ．）であった。これらのオリゴヌクレオチドを、５００ｎＭの濃度で、ノーザンブロットアッセイを使用して実質的に実施例６に記載されているごとく、ヒトＡ５４９細胞でのＰＫＣ−ζ ｍＲＮＡレベルを減少させる能力についてスクリーニングした。オリゴヌクレオチド配列およびスクリーニングの結果は表１１に示されている。この実験において、オリゴヌクレオチド９００７、９００８、９０１１、９０１２、９０１３、９０１５、９０１７、９０１８、９０２０、９０２１、９０２２、９０２３、９０２４、９０２５、９０２８および９０２９がｍＲＮＡレベルの少なくとも５０％の阻害を示し、現在のところ好適である。実施例１６ヒトＰＫＣ−εと相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドのスクリーニング：ヒトＰＫＣ−εと相補的な一連の２０−ｍｅｒホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを実施例１に記載したように合成した。標的配列源はＧｅｎｂａｎｋＨＳＰＫＣＥ座、受託番号Ｘ６５２９３（Ｂｕｒｎｓら）であった。これらのオリゴヌクレオチドを、５００ｎＭの濃度で、ノーザンブロットアッセイを使用して実質的に実施例６に記載されているごとく、ヒトＡ５４９細胞でのＰＫＣ−ε ｍＲＮＡレベルを減少させる能力についてスクリーニングした。オリゴヌクレオチド配列およびスクリーニングの結果は表１２に示されている。この実験において、オリゴヌクレオチド７９４２、７９４４、７９４５、７９４６および７９４８がｍＲＮＡレベルの少なくとも４０％の阻害を示し、現在のところ好適である。実施例１７ヒトＰＫＣαの３’非翻訳領域のＤＮＡシークエンシングＡ５４９細胞（ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，ＢｅｔｈｅｓｄａＭＤから入手）を６−ウェルプレート（ＦａｌｃｏｎＬａｂｗａｒｅ，ＬｉｎｃｏｌｎＰａｒｋ，ＮＪ）を用い、１ｇグルコース／リットルおよび１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ，ＩｒｖｉｎｅＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＳａｎｔａＡｎａ，ＣＡ）を含むダルベッコ改良イーグル培地（ＤＭＥ）中でコンフルエントになるまで増殖させた。細胞を集め、常法を用いて全ＲＮＡを単離した。Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．およびＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓ（１９８９）．ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ａｌａｂｏｒａｔｏｒｙｍａｎｕａｌ．ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，７章。ｃＤＮＡはＦｒｏｈｍａｎらの３’ＲＡＣＥ技術を用いてＲＮＡから作製し［Ｆｒｏｈｍａｎ，Ｍ．Ａ．，Ｄｕｓｈ，Ｍ．Ｋ．およびＧ．Ｒ．Ｍａｒｔｉｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：８９９８−９００２］、３’ＲＡＣＥキットはＧｉｂｃｏ／ＢＲＬ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）から入手した。ｃＤＮＡの第一の鎖の作製にはオリゴｄＴプライマーを使用した。続くポリ（Ａ）テイルの部位からの増幅には、キットで提供されたオリゴヌクレオチドまたは同一のオリゴヌクレオチド（ＩＳＩＳ５５８６；配した。既知の配列の内部からの増幅にはＩＳＩＳ６２８８を使用した（配列ＩＤで生じたＤＮＡをゲルで精製し、ＳａｌＩおよびＢｃｌＩで消化した後、常法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）を用いてＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ）内へクローン化した。クローン化ＤＮＡを、ＵＳＢからのＳｅｑｕｅｎａｓｅキットを用いて配列決定した。既知の配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ｘ５２４７９）の３’末端に近いＢｃｌＩ部位から最もしばしば得られているポリアデニル化の部位までの得られた新規配列はヌクレオチド５６−１１３６として図１３に示されている。この部位はショート（４ｋｂ）ＰＫＣαメッセンジャーの３’末端であると考えられる。この配列を伸長し、それによりロングＰＫＣαメッセンジャー（８．５ｋｂ）に特異的な配列を得るため、インバースＰＣＲ技術を用いた。Ｏｃｈｍａｎ，Ｈ．，Ｇｅｒｂｅｒ，Ａ．Ｓ．およびＤ．Ｌ．Ｈａｒｔｌ（１９８８）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ１２０：６２１−６２３。この技術を、組のプライマーおよび制限酵素を用いて３回実施した。各々の回で約２００塩基の新しい配列が生じた；全体の新規配列（配列ＩＤ番号：１０４）は図１３にボールド体（ヌクレオチド１１３７−１８１２）で示されている。この配列は、以前に報告されたＰＫＣα ｃＤＮＡ配列の末端近くのＢｃｌＩ部位（ＴＧＡＴＣＡ）から始まって３’の方向に伸びるかたちで示されている。Ｆｉｎｋｅｎｚｅｌｌｅｒら、Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１８：２１８３（１９９０）；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ｘ５２４７９。ヌクレオチド５６から始まる新しく決定された配列には下線が付けてある（配列ＩＤ番号：１０５）。ショート（４ｋｂ）ｍＲＮＡ転写産物の３’末端と考えられるポリアデニル化の最も共通な部位はヌクレオチド１１３６である。この部位から下流の配列（従ってロングメッセンジャーに独特である）はボールド体で示されている（配列ＩＤ番号：１０６）。実施例１８ＰＫＣαの３’ＵＴＲ中の新規配列を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド実施例１７に記載したようにして得られた新規配列に相補的である一連のホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドを設計し合成した。これらのオリゴヌクレオチドを、処置開始２４時間後でのＡ５４９細胞におけるＰＫＣａＲＮＡの減少または除去を起こさせる能力に基づいてスクリーニングした。Ａ５４９細胞を陽イオン性脂質ＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥ存在下、５００ｎＭのホスホロチオエートオリゴヌクレオチドで４時間処理し、洗浄後さらに２０時間放置して回復させた。全ＲＮＡを抽出し、２０μｇを各々１．２％ゲルで分離してナイロン膜に移した。これらのブロットは、³²Ｐ放射性標識ＰＫＣ−α ｃＤＮＡプローブで探査したのちこれを取り出し、等量のＲＮＡが充填されたことを確認するため放射性標識Ｇ３ＰＤＨプローブで再探査した。二つの主要なＰＫＣ−α転写産物（８．５ｋｂおよび４．０ｋｂ）を調べ、ホスファーイメージャー（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｙｎａｍｉｃｓ，ＳｕｎｎｙｖａｌｅＣＡ）で定量化した。オリゴヌクレオチドおよびその活性は表１３に示されている。ＩＳＩＳ７９１１（配列ＩＤ番号：１１７）はこの予備的な実験において、ＰＫＣα ｍＲＮＡレベル（ロングおよびショートメッセンジャーの両方）を対照と比較して５０％減少させた。従ってこのオリゴヌクレオチドは好適である。より詳細な分析により、ＩＳＩＳ７９１１は処置の最初の６時間の間にロング（８．５ｋｂ）メッセンジャーの量を選択的に減少させ、処置後３時間の時点では４倍の選択性で減少させることが示された。ＩＳＩＳ７９１１処置の１２時間後には、両方のメッセンジャーレベルは８０％を超えて減少していた。経時変化のデータは図１４に示されている。【配列表】配列番号: 1: （i）配列の特性: （A）配列の長さ: 20 （B）型: 核酸（C）鎖の数: 一本鎖（D）トポロジー: 直線状（iv）アンチセンス: yes （xi）配列: SEQ ID NO: 1: 配列番号: 2: （i）配列の特性: （A）配列の長さ: 20 （B）型: 核酸（C）鎖の数: 一本鎖（D）トポロジー: 直線状（iv）アンチセンス: yes （xi）配列: SEQ ID NO: 2: 配列番号: 3: （i）配列の特性: （A）配列の長さ: 20 （B）型: 核酸（C）鎖の数: 一本鎖（D）トポロジー: 直線状（iv）アンチセンス: yes （xi）配列: SEQ ID NO: 3: 配列番号: 4: （i）配列の特性: （A）配列の長さ: 20 （B）型: 核酸（C）鎖の数: 一本鎖（D）トポロジー: 直線状（iv）アンチセンス: yes （xi）配列: SEQ ID NO: 4: 配列番号: 5: （i）配列の特性: （A）配列の長さ: 20 （B）型: 核酸（C）鎖の数: 一本鎖（D）トポロジー: 直線状（iv）アンチセンス: yes （xi）配列: SEQ ID NO: 5: 配列番号: 6: （i）配列の特性: （A）配列の長さ: 20 （B）型: 核酸（C）鎖の数: 一本鎖（D）トポロジー: 直線状（iv）アンチセンス: yes （xi）配列: SEQ ID NO: 6: 配列番号: 7: （i）配列の特性: （A）配列の長さ: 20 （B）型: 核酸（C）鎖の数: 一本鎖（D）トポロジー: 直線状（iv）アンチセンス: yes （xi）配列: SEQ ID NO: 7: 配列番号: 8: （i）配列の特性: （A）配列の長さ: 20 （B）型: 核酸（C）鎖の数: 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【手続補正書】【提出日】１９９６年２月２日【補正内容】請求の範囲１．ＰＫＣ遺伝子またはＰＫＣｍＲＮＡと特異的にハイブリダイズしうる、５から５０のヌクレオチド単位を含むオリゴヌクレオチド。２．ＰＫＣ遺伝子の翻訳開始部位、５’非翻訳領域、コーディング領域または３’非翻訳領域に特異的にハイブリダイズしうる、請求項第１項記載のオリゴヌクレオチド。３．オリゴヌクレオチドのヌクレオチド単位の間の少なくとも１つの糖間連結がホスホロチオエートである、請求項１記載のオリゴヌクレオチド。４．少なくとも１つのヌクレオチドが糖の２’位における修飾を含む、請求項１記載のオリゴヌクレオチド。５．キメラオリゴヌクレオチドである、請求項１記載のオリゴヌクレオチド。６．前記遺伝子またはｍＲＮＡが少なくとも１つのＰＫＣイソ酵素をコードし、前記イソ酵素が、ＰＫＣ−α、ＰＫＣ−β、ＰＫＣ−γ、ＰＫＣ−η、ＰＫＣ −ζまたはＰＫＣ−εである、請求項１記載のオリゴヌクレオチド。７．配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、５２、５３、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６７、６８、６９、７１、７３、７４、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８４、８５、９５、９７、９８、９９または１０１を含む、請求項６記載のオリゴヌクレオチド。８．細胞においてＰＫＣの発現を変調する方法であって、細胞を、５から５０のヌクレオチド単位を含むオリゴヌクレオチドと接触させることを含み、前記オリゴヌクレオチドはＰＫＣ遺伝子またはＰＫＣｍＲＮＡと特異的にハイブリダイズしうることを特徴とする方法。９．前記オリゴヌクレオチドが、ＰＫＣ遺伝子の翻訳開始部位、５’非翻訳領域、コーディング領域または３’非翻訳領域に特異的にハイブリダイズしうる、請求項第８項記載の方法。１０．オリゴヌクレオチドのヌクレオチド単位の間の少なくとも１つの糖間連結がホスホロチオエート部分である、請求項８記載の方法。１１．オリゴヌクレオチドの少なくとも１つのヌクレオチドが糖の２’位における修飾を含む、請求項８記載の方法。１２．オリゴヌクレオチドがキメラオリゴヌクレオチドである、請求項８記載の方法。１３．前記遺伝子またはｍＲＮＡが少なくとも１つのＰＫＣイソ酵素をコードし、前記イソ酵素が、ＰＫＣ−α、ＰＫＣ−β、ＰＫＣ−γ、ＰＫＣ−η、ＰＫＣ−ζまたはＰＫＣ−εである、請求項８記載の方法。１４．前記オリゴヌクレオチドが、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、５２、５３、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６７、６８、６９、７１、７３、７４、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８４、８５、９５、９７、９８、９９または１０１を含む、請求項１３記載の方法。１５．試料中のＰＫＣ遺伝子またはＰＫＣｍＲＮＡの存在を検出する方法であって、試料を、前記遺伝子またはｍＲＮＡと特異的にハイブリダイズしうる、５から５０のヌクレオチド単位を含むオリゴヌクレオチドと接触させ、そしてハイブリダイゼーションを検出することを含む方法。１６．オリゴヌクレオチドのヌクレオチド単位の間の少なくとも１つの糖間連結がホスホロチオエートである、請求項１５記載の方法。１７．オリゴヌクレオチドの少なくとも１つのヌクレオチドが糖の２’位における修飾を含む、請求項１５記載の方法。１８．前記遺伝子またはｍＲＮＡが少なくとも１つのＰＫＣイソ酵素をコードし、前記イソ酵素が、ＰＫＣ−α、ＰＫＣ−β、ＰＫＣ−γ、ＰＫＣ−η、ＰＫＣ−ζまたはＰＫＣ−εである、請求項１５記載の方法。１９．前記オリゴヌクレオチドが、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、５２、５３、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６７、６８、６９、７１、７３、７４、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８４、８５、９５、９７、９８、９９または１０１を含む、請求項１８記載の方法。２０．ＰＫＣの発現に関連する状態を治療する方法であって、ヒトを除く哺乳動物またはその細胞に、治療的有効量の、ＰＫＣ遺伝子またはＰＫＣｍＲＮＡと特異的にハイブリダイズしうる５から５０のヌクレオチド単位を含むオリゴヌクレオチドを投与することを含む方法。２１．前記状態が、過増殖性疾患である、請求項２０記載の方法。２２．前記オリゴヌクレオチドが、ＰＫＣ遺伝子またはｍＲＮＡの翻訳開始部位、５’非翻訳領域、コーディング領域または３’非翻訳領域に特異的にハイブリダイズしうる、請求項２０記載の方法。２３．オリゴヌクレオチドのヌクレオチド単位の間の少なくとも１つの糖間連結がホスホロチオエートである、請求項２０記載の方法。２４．オリゴヌクレオチドの少なくとも１つのヌクレオチドが糖の２’位における修飾を含む、請求項２０記載の方法。２５．オリゴヌクレオチドがキメラオリゴヌクレオチドである、請求項２０記載の方法。２６．前記遺伝子またはｍＲＮＡが少なくとも１つのＰＫＣイソ酵素をコードし、前記イソ酵素が、ＰＫＣ−α、ＰＫＣ−β、ＰＫＣ−γ、ＰＫＣ−η、ＰＫＣ−ζまたはＰＫＣ−εである、請求項２０記載の方法。２７．前記オリゴヌクレオチドが、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、５２、５３、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６７、６８、６９、７１、７３、７４、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８４、８５、９５、９７、９８、９９または１０１を含む、請求項２６記載の方法。２８．ＰＫＣに関連する状態を治療する方法であって、ヒトを除く哺乳動物の細胞に、治療的有効量の、配列番号２、３または５を有するオリゴヌクレオチドを投与することを含む方法。２９．ＰＫＣに関連する状態を診断する方法であって、ＰＫＣに関連する状態を有すると疑われる哺乳動物からの試料を、ＰＫＣ遺伝子またはｍＲＮＡと特異的にハイブリダイズしうる、５から５０のヌクレオチド単位を有するオリゴヌクレオチドと接触させ、そしてハイブリダイゼーションを検出することを含む方法。３０．前記状態が、過増殖性疾患である、請求項２９記載の方法。３１．オリゴヌクレオチドのヌクレオチド単位の間の少なくとも１つの糖間連結がホスホロチオエートである、請求項２９記載の方法。３２．オリゴヌクレオチドの少なくとも１つのヌクレオチドが糖の２’位における修飾を含む、請求項２９記載の方法。３３．オリゴヌクレオチドがキメラオリゴヌクレオチドである、請求項２９記載の方法。３４．前記遺伝子またはｍＲＮＡが少なくとも１つのＰＫＣイソ酵素をコードし、前記イソ酵素が、ＰＫＣ−α、ＰＫＣ−β、ＰＫＣ−γ、ＰＫＣ−η、ＰＫＣ−ζまたはＰＫＣ−εである、請求項２９記載の方法。３５．前記オリゴヌクレオチドが、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、５２、５３、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６７、６８、６９、７１、７３、７４、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８４、８５、９５、９７、９８、９９または１０１を含む、請求項３４記載の方法。３６．配列番号１０５に記載の配列と実質的に相同の配列を含む単離された核酸分子。３７．前記核酸分子が二本鎖である、請求項３６記載の核酸分子。３８．配列番号１０５に記載の配列と実質的に相補的な配列を含む単離された核酸分子。３９．５から５０ヌクレオチドの長さを有し、配列番号１０５に記載される配列の一部と特異的にハイブリダイズしうるヌクレオチド配列を含む、アンチセンスオリゴヌクレオチド。４０．請求項３６または３８に記載の核酸分子の一部と特異的にハイブリダイズしうるヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチドプローブ。４１．５から５０ヌクレオチドの長さを有し、ヒトＰＫＣαのロングｍＲＮＡ転写産物と特異的にハイブリダイズすることができ、ヒトＰＫＣαのショートｍＲＮＡ転写産物とは特異的にハイブリダイズすることができないヌクレオチド配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチド。４２．配列番号１０６に記載の配列の一部と特異的にハイブリダイズしうるヌクレオチド配列を含む、請求項４１記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。４３．配列番号１１５に記載の配列を含む、請求項４２記載のオリゴヌクレオチド。４４．ヒトＰＫＣαのロングｍＲＮＡ転写産物と特異的にハイブリダイズしうるヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチドプローブ。４５．配列番号１１５に記載の配列を含む、請求項４４記載のポリヌクレオチドプローブ。４６．試料中の、ヒトＰＫＣαをコードする遺伝子を検出する方法であって、試料を、プローブとＰＫＣαをコードする前記遺伝子との間にポリヌクレオチドデュープレックスが形成される条件下に請求項４０記載のポリヌクレオチドプローブと接触させ、そしてポリヌクレオチドデュープレックスの存在または不在を検出し、このことにより、ポリヌクレオチドデュープレックスの存在が前記試料中におけるヒトＰＫＣαをコードする前記遺伝子の存在の指標となる、ことを特徴とする方法。４７．試料中の、ヒトＰＫＣαのロングｍＲＮＡ転写産物を検出する方法であって、試料を、プローブとヒトＰＫＣαのロングｍＲＮＡ転写産物との間にポリヌクレオチドデュープレックスが形成される条件下に請求項４４記載のポリヌクレオチドプローブと接触させ、ポリヌクレオチドデュープレックスの存在または不在を検出し、このことにより、ポリヌクレオチドデュープレックスの存在が前記試料中におけるヒトＰＫＣαの前記ロングｍＲＮＡ転写産物の存在の指標となる、ことを特徴とする方法。４８．ＰＫＣα遺伝子を含む細胞においてＰＫＣαの発現を変調させる方法であって、細胞を、５から５０ヌクレオチドの長さを有するアンチセンスオリゴヌクレオチドと接触させることを含み、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号１０５に記載の配列の一部と特異的にハイブリダイズしうるヌクレオチド配列を含むことを特徴とする方法。４９．ＰＫＣα遺伝子を含む細胞においてＰＫＣαのロングｍＲＮＡ転写産物の発現を特異的に変調させる方法であって、細胞を、５から５０ヌクレオチドの長さを有するアンチセンスオリゴヌクレオチドと接触させることを含み、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号１０６に記載の配列の一部と特異的にハイブリダイズしうるヌクレオチド配列を含むことを特徴とする方法。５０．ＰＫＣαに関連する状態を有するヒトを除く動物を治療する方法であって、前記動物を、治療的有効量の、５から５０ヌクレオチドの長さを有するアンチセンスオリゴヌクレオチドと接触させることを含み、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号１０５に記載の配列の一部と特異的にハイブリダイズしうるヌクレオチド配列を含むことを特徴とする方法。５１．ＰＫＣαの発現に関連する状態を有するヒトを除く動物を治療する方法であって、前記動物を、治療的有効量の、５から５０ヌクレオチドの長さを有するアンチセンスオリゴヌクレオチドと接触させることを含み、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号１０６に記載の配列の一部と特異的にハイブリダイスしうるヌクレオチド配列を含むことを特徴とする方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ボッグズ，ラッセル・ティーアメリカ合衆国カリフォルニア州92007, カーディフ―バイ―ザ―シー，オックスフォード・アベニュー 2317 (72)発明者ディーン，ニコラス・エムアメリカ合衆国カリフォルニア州92007, カーディフ，ニューキャッスル・アベニュー 2319

Claims

【特許請求の範囲】１．ＰＫＣ遺伝子またはＰＫＣｍＲＮＡと特異的にハイブリダイズしうる、５から５０のヌクレオチド単位を含むオリゴヌクレオチド。２．ＰＫＣ遺伝子の翻訳開始部位、５’非翻訳領域、コーディング領域または３’非翻訳領域に特異的にハイブリダイズしうる、請求項第１項記載のオリゴヌクレオチド。３．オリゴヌクレオチドのヌクレオチド単位の間の少なくとも１つの糖間連結がホスホロチオエートである、請求項１記載のオリゴヌクレオチド。４．少なくとも１つのヌクレオチドが糖の２’位における修飾を含む、請求項１記載のオリゴヌクレオチド。５．修飾が２’−Ｏ−アルキルまたは２’−フルオロ修飾である、請求項４記載のオリゴヌクレオチド。６．修飾が２’−Ｏ−メチルまたは２’−プロピル修飾である、請求項４記載のオリゴヌクレオチド。７．キメラオリゴヌクレオチドである、請求項１記載のオリゴヌクレオチド。８．前記遺伝子またはｍＲＮＡが少なくとも１つのＰＫＣイソ酵素をコードする、請求項１記載のオリゴヌクレオチド。９．前記イソ酵素が、ＰＫＣ−α、ＰＫＣ−β、ＰＫＣ−γ、ＰＫＣ−η、ＰＫＣ−ζまたはＰＫＣ−εである、請求項８記載のオリゴヌクレオチド。１０．前記遺伝子またはｍＲＮＡがＰＫＣ−αをコードする、請求項９記載のオリゴヌクレオチド。１１．配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、５２または５３を含む、請求項１０記載のオリゴヌクレオチド。１２．前記遺伝子またはｍＲＮＡがＰＫＣ−βをコードする、請求項９記載のオリゴヌクレオチド。１３．配列番号２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３または３４を含む、請求項１２記載のオリゴヌクレオチド。１４．前記遺伝子またはｍＲＮＡがＰＫＣ−γをコードする、請求項９記載のオリゴヌクレオチド。１５．配列番号３５、３６、３７、３８または３９を含む、請求項１４記載のオリゴヌクレオチド。１６．前記遺伝子またはｍＲＮＡがＰＫＣ−ηをコードする、請求項９記載のオリゴヌクレオチド。１７．配列番号４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１または６２を含む、請求項１６記載のオリゴヌクレオチド。１８．請求項１記載のオリゴヌクレオチドおよび薬学的に許容しうる担体または希釈剤を含む医薬組成物。１９．配列番号２を有するキメラオリゴヌクレオチド。２０．オリゴヌクレオチドのヌクレオチド単位の間の少なくとも１つの糖間連結がホスホロチオエートである、請求項１９記載のオリゴヌクレオチド。２１．少なくとも１つのヌクレオチド単位が糖の２’位における修飾を含む、請求項１９記載のオリゴヌクレオチド。２２．修飾が２’−Ｏ−アルキルまたは２’−フルオロ修飾である、請求項２１記載のオリゴヌクレオチド。２３．修飾が２’−Ｏ−メチルまたは２’−プロピル修飾である、請求項２２記載のオリゴヌクレオチド。２４．請求項１９記載のオリゴヌクレオチドおよび薬学的に許容しうる担体または希釈剤を含む医薬組成物。２５．配列番号３を有するキメラオリゴヌクレオチド。２６．オリゴヌクレオチドのヌクレオチド単位の間の少なくとも１つの糖間連結がホスホロチオエートである、請求項２５記載のオリゴヌクレオチド。２７．少なくとも１つのヌクレオチドが糖の２’位における修飾を含む、請求項２５記載のオリゴヌクレオチド。２８．修飾が２’−Ｏ−アルキルまたは２’−フルオロ修飾である、請求項２７記載のオリゴヌクレオチド。２９．修飾が２’−Ｏ−メチルまたは２’−プロピル修飾である、請求項２８記載のオリゴヌクレオチド。３０．請求項２５記載のオリゴヌクレオチドおよび薬学的に許容しうる担体または希釈剤を含む医薬組成物。３１．配列番号５を有するキメラオリゴヌクレオチド。３２．オリゴヌクレオチドのヌクレオチド単位の間の少なくとも１つの糖間連結がホスホロチオエートである、請求項３１記載のオリゴヌクレオチド。３３．少なくとも１つのヌクレオチド単位が糖の２’位における修飾を含む、請求項３１記載のオリゴヌクレオチド。３４．修飾が２’−Ｏ−アルキルまたは２’−フルオロ修飾である、請求項３３記載のオリゴヌクレオチド。３５．修飾が２’−Ｏ−メチルまたは２’−プロピル修飾である、請求項３４記載のオリゴヌクレオチド。３６．請求項３１記載のオリゴヌクレオチドおよび薬学的に許容しうる担体または希釈剤を含む医薬組成物。３７．細胞においてＰＫＣの発現を変調する方法であって、細胞を、５から５０のヌクレオチド単位を含むオリゴヌクレオチドと接触させることを含み、前記オリゴヌクレオチドはＰＫＣ遺伝子またはＰＫＣｍＲＮＡと特異的にハイブリダイズしうることを特徴とする方法。３８．前記オリゴヌクレオチドが、ＰＫＣ遺伝子の翻訳開始部位、５’非翻訳領域、コーディング領域または３’非翻訳領域に特異的にハイブリダイズしうる、請求項第３７項記載の方法。３９．オリゴヌクレオチドのヌクレオチド単位の間の少なくとも１つの糖間連結がホスホロチオエート部分である、請求項３７記載の方法。４０．オリゴヌクレオチドの少なくとも１つのヌクレオチドが糖の２’位における修飾を含む、請求項３７記載の方法。４１．修飾が２’−Ｏ−アルキルまたは２’−フルオロ修飾である、請求項４０記載の方法。４２．修飾が２’−Ｏ−メチルまたは２’−プロピル修飾である、請求項４１記載の方法。４３．オリゴヌクレオチドがキメラオリゴヌクレオチドである、請求項３７記載の方法。４４．前記遺伝子またはｍＲＮＡが少なくとも１つのＰＫＣイソ酵素をコードする、請求項３７記載の方法。４５．前記遺伝子またはｍＲＮＡが、ＰＫＣ−α、ＰＫＣ−β、ＰＫＣ−γ、ＰＫＣ−η、ＰＫＣ−ζまたはＰＫＣ−εをコードする、請求項４４記載の方法。４６．前記遺伝子またはｍＲＮＡがＰＫＣ−αをコードする、請求項４５記載の方法。４７．前記オリゴヌクレオチドが、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、５２または５３を含む、請求項４６記載の方法。４８．前記遺伝子またはｍＲＮＡがＰＫＣ−βをコードする、請求項４５記載の方法。４９．前記オリゴヌクレオチドが、配列番号２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３または３４を含む、請求項４８記載の方法。５０．前記遺伝子またはｍＲＮＡがＰＫＣ−γをコードする、請求項４５記載の方法。５１．前記オリゴヌクレオチドが、配列番号３５、３６、３７、３８または３９を含む、請求項５０記載の方法。５２．前記遺伝子またはｍＲＮＡがＰＫＣ−ηをコードする、請求項４５記載の方法。５３．前記オリゴヌクレオチドが。配列番号４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１または６２を含む、請求項５２記載の方法。５４．ＰＫＣの発現を変調する方法であって、細胞を配列番号２を有するキメラオリゴヌクレオチドと接触させることを含む方法。５５．ＰＫＣの発現を変調する方法であって、細胞を配列番号３を有するキメラオリゴヌクレオチドと接触させることを含む方法。５６．ＰＫＣの発現を変調する方法であって、細胞を配列番号５を有するキメラオリゴヌクレオチドと接触させることを含む方法。５７．試料中のＰＫＣ遺伝子またはＰＫＣｍＲＮＡの存在を検出する方法であって、試料を、前記遺伝子またはｍＲＮＡと特異的にハイブリダイズしうる、５から５０のヌクレオチド単位を含むオリゴヌクレオチドと接触させ、そしてハイブリダイゼーションを検出することを含む方法。５８．オリゴヌクレオチドのヌクレオチド単位の間の少なくとも１つの糖間連結がホスホロチオエートである、請求項５７記載の方法。５９．オリゴヌクレオチドの少なくとも１つのヌクレオチドが糖の２’位における修飾を含む、請求項５７記載の方法。６０．前記遺伝子またはｍＲＮＡが少なくとも１つのＰＫＣイソ酵素をコードする、請求項５７記載の方法。６１．前記遺伝子またはｍＲＮＡが、ＰＫＣ−α、ＰＫＣ−β、ＰＫＣ−γ、ＰＫＣ−η、ＰＫＣ−ζまたはＰＫＣ−εをコードする、請求項６０記載の方法。６２．前記遺伝子またはｍＲＮＡがＰＫＣ−αをコードする、請求項６１記載の方法。６３．前記オリゴヌクレオチドが、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、５２または５３を含む、請求項６２記載の方法。６４．前記遺伝子またはｍＲＮＡがＰＫＣ−βをコードする、請求項６１記載の方法。６５．前記オリゴヌクレオチドが、配列番号２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３または３４を含む、請求項６４記載の方法。６６．前記遺伝子またはｍＲＮＡがＰＫＣ−γをコードする、請求項６１記載の方法。６７．前記オリゴヌクレオチドが、配列番号３５、３６、３７、３８または３９を含む、請求項６６記載の方法。６８．前記遺伝子またはｍＲＮＡがＰＫＣ−ηをコードする、請求項６１記載の方法。６９．前記オリゴヌクレオチドが、配列番号４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１または６２を含む、請求項６８記載の方法。７０．ＰＫＣの発現に関連する状態を治療する方法であって、哺乳動物またはその細胞に、治療的有効量の、ＰＫＣ遺伝子またはＰＫＣｍＲＮＡと特異的にハイブリダイズしうる５から５０のヌクレオチド単位を含むオリゴヌクレオチドを投与することを含む方法。７１．前記状態が、過増殖性疾患である、請求項７０記載の方法。７２．前記過増殖性疾患が乾癬である、請求項７１記載の方法。７３．前記過増殖性疾患が結腸癌である、請求項７１記載の方法。７４．前記過増殖性疾患が肺癌である、請求項７１記載の方法。７５．前記過増殖性疾患が乳癌である、請求項７１記載の方法。７６．前記過増殖性疾患が皮膚癌である、請求項７１記載の方法。７７．前記オリゴヌクレオチドが、ＰＫＣ遺伝子またはｍＲＮＡの翻訳開始部位、５’非翻訳領域、コーディング領域または３’非翻訳領域に特異的にハイブリダイズしうる、請求項７０記載の方法。７８．オリゴヌクレオチドのヌクレオチド単位の間の少なくとも１つの糖間連結がホスホロチオエートである、請求項７０記載の方法。７９．オリゴヌクレオチドの少なくとも１つのヌクレオチドが糖の２’位における修飾を含む、請求項７０記載の方法。８０．修飾が２’−Ｏ−アルキルまたは２’−フルオロ修飾である、請求項７９記載の方法。８１．修飾が２’−Ｏ−メチルまたは２’−プロピル修飾である、請求項８０記載の方法。８２．オリゴヌクレオチドがキメラオリゴヌクレオチドである、請求項７０記載の方法。８３．前記オリゴヌクレオチドが薬学的に許容しうる担体または希釈剤中に存在する、請求項７０記載の方法。８４．前記担体または希釈剤がカチオン性脂質を含む、請求項８３記載の方法。８５．前記遺伝子またはｍＲＮＡが少なくとも１つのＰＫＣイソ酵素をコードする、請求項７０記載の方法。８６．前記遺伝子またはｍＲＮＡが、ＰＫＣ−α、ＰＫＣ−β、ＰＫＣ−γ、ＰＫＣ−η、ＰＫＣ−ζまたはＰＫＣ−εをコードする、請求項８５記載の方法。８７．前記遺伝子またはｍＲＮＡがＰＫＣ−αをコードする、請求項８６記載の方法。８８．前記オリゴヌクレオチドが、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、５２または５３を含む、請求項８７記載の方法。８９．前記遺伝子またはｍＲＮＡがＰＫＣ−βをコードする、請求項８５記載の方法。９０．前記オリゴヌクレオチドが、配列番号２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３または３４を含む、請求項８９記載の方法。９１．前記遺伝子またはｍＲＮＡがＰＫＣ−γをコードする、請求項８５記載の方法。９２．前記オリゴヌクレオチドが、配列番号３５、３６、３７、３８または３９を含む、請求項９１記載の方法。９３．前記遺伝子またはｍＲＮＡがＰＫＣ−ηをコードする、請求項８５記載の方法。９４．前記オリゴヌクレオチドが。配列番号４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１または６２を含む、請求項９３記載の方法。９５．ＰＫＣに関連する状態を治療する方法であって、哺乳動物細胞に、治療的有効量の、配列番号２、３または５を有するオリゴヌクレオチドを投与することを含む方法。９６．ＰＫＣに関連する状態を診断する方法であって、ＰＫＣに関連する状態を有すると疑われる哺乳動物からの試料を、ＰＫＣ遺伝子またはｍＲＮＡと特異的にハイブリダイズしうる、５から５０のヌクレオチド単位を有するオリゴヌクレオチドと接触させ、そしてハイブリダイゼーションを検出することを含む方法。９７．前記状態が、過増殖性疾患である、請求項９６記載の方法。９８．前記過増殖性疾患が、乾癬、結腸癌、肺癌、乳癌または皮膚癌である、請求項９７記載の方法。９９．オリゴヌクレオチドのヌクレオチド単位の間の少なくとも１つの糖間連結がホスホロチオエートである、請求項９６記載の方法。１００．オリゴヌクレオチドの少なくとも１つのヌクレオチドが糖の２’位における修飾を含む、請求項９６記載の方法。１０１．オリゴヌクレオチドがキメラオリゴヌクレオチドである、請求項９６記載の方法。１０２．前記遺伝子またはｍＲＮＡが少なくとも１つのＰＫＣイソ酵素をコードする、請求項９６記載の方法。１０３．前記遺伝子またはｍＲＮＡが、ＰＫＣ−α、ＰＫＣ−β、ＰＫＣ−γ 、ＰＫＣ−η、ＰＫＣ−ζまたはＰＫＣ−εをコードする、請求項１０２記載の方法。１０４．前記遺伝子またはｍＲＮＡがＰＫＣ−αをコードする、請求項１０３記載の方法。１０５．前記オリゴヌクレオチドが、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、５２または５３を含む、請求項１０４記載の方法。１０６．前記遺伝子またはｍＲＮＡがＰＫＣ−βをコードする、請求項１０３記載の方法。１０７．前記オリゴヌクレオチドが、配列番号２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３または３４を含む、請求項１０６記載の方法。１０８．前記遺伝子またはｍＲＮＡがＰＫＣ−γをコードする、請求項１０３記載の方法。１０９．前記オリゴヌクレオチドが、配列番号３５、３６、３７、３８または３９を含む、請求項１０８記載の方法。１１０．前記遺伝子またはｍＲＮＡがＰＫＣ−ηをコードする、請求項１０３記載の方法。１１１．前記オリゴヌクレオチドが。配列番号４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１または６２を含む、請求項１１０記載の方法。１１２．前記イソ酵素がＰＫＣ−ζである、請求項９記載のオリゴヌクレオチド。１１３．配列番号６３、６４、６７、６８、６９、７１、７３、７４、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８４または８５を含む、請求項１１２記載のオリゴヌクレオチド。１１４．前記イソ酵素がＰＫＣ−εである、請求項９記載のオリゴヌクレオチド。１１５．配列番号９５、９７、９８、９９または１０１を含む、請求項１１４記載のオリゴヌクレオチド。１１６．前記遺伝子またはｍＲＮＡがＰＫＣ−ζをコードする、請求項４５記載の方法。１１７．配列番号６３、６４、６７、６８、６９、７１、７３、７４、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８４または８５を含む、請求項１１６記載の方法。１１８．前記遺伝子またはｍＲＮＡがＰＫＣ−εをコードする、請求項４５記載の方法。１１９．配列番号９５、９７、９８、９９または１０１を含む、請求項１１８記載の方法。１２０．前記遺伝子またはｍＲＮＡがＰＫＣ−ζをコードする、請求項６１記載の方法。１２１．配列番号６３、６４、６７、６８、６９、７１、７３、７４、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８４または８５を含む、請求項１２０記載の方法。１２２．前記遺伝子またはｍＲＮＡがＰＫＣ−εをコードする、請求項６１記載の方法。１２３．配列番号９５、９７、９８、９９または１０１を含む、請求項１２２記載の方法。１２４．前記遺伝子またはｍＲＮＡがＰＫＣ−ζをコードする、請求項８６記載の方法。１２５．配列番号６３、６４、６７、６８、６９、７１、７３、７４、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８４または８５を含む、請求項１２４記載の方法。１２６．前記遺伝子またはｍＲＮＡがＰＫＣ−εをコードする、請求項８６記載の方法。１２７．配列番号９５、９７、９８、９９または１０１を含む、請求項１２６記載の方法。１２８．前記遺伝子またはｍＲＮＡがＰＫＣ−ζをコードする、請求項１０３記載の方法。１２９．配列番号６３、６４、６７、６８、６９、７１、７３、７４、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８４または８５を含む、請求項１２８記載の方法。１３０．前記遺伝子またはｍＲＮＡがＰＫＣ−εをコードする、請求項１０３記載の方法。１３１．配列番号９５、９７、９８、９９または１０１を含む、請求項１３０記載の方法。１３２．配列番号１０５に記載の配列と実質的に相同の配列を含む単離された核酸分子。１３３．前記核酸分子がデオキシリボ核酸サブユニットからなる、請求項１３２記載の核酸分子。１３４．前記核酸分子が二本鎖である、請求項１３３記載の核酸分子。１３５．配列番号１０５に記載の配列と実質的に相補的な配列を含む単離された核酸分子。１３６．５から５０ヌクレオチドの長さを有し、配列番号１０５に記載される配列の一部と特異的にハイブリダイズしうるヌクレオチド配列を含む、アンチセンスオリゴヌクレオチド。１３７．請求項１３６に記載のオリゴヌクレオチドおよび薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物。１３８．請求項１３２記載の核酸分子の一部と特異的にハイブリダイズしうるヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチドプローブ。１３９．請求項１３５記載の核酸分子の一部と特異的にハイブリダイズしうるヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチドプローブ。１４０．５から５０ヌクレオチドの長さを有し、ヒトＰＫＣαのロングｍＲＮＡ転写産物と特異的にハイブリダイズすることができ、ヒトＰＫＣαのショート転写産物とは特異的にハイブリダイズすることができないヌクレオチド配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチド。１４１．配列番号１０６に記載の配列の一部と特異的にハイブリダイズしうるヌクレオチド配列を含む、請求項１４０記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。１４２．配列番号１１５に記載の配列を含む、請求項１４１記載のオリゴヌクレオチド。１４３．請求項１３９に記載のオリゴヌクレオチドおよび薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物。１４４．ヒトＰＫＣαのロングｍＲＮＡ転写体と特異的にハイブリダイズしうるヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチドプローブ。１４５．配列番号１１５に記載の配列の一部と特異的にハイブリダイズしうるヌクレオチド配列を含む、請求項１４４記載のポリヌクレオチドプローブ。１４６．配列番号１１５に記載の配列を含む、請求項１４５記載のポリヌクレオチドプローブ。１４７．試料中の、ヒトＰＫＣαをコードする遺伝子を検出する方法であって、試料を、プローブとＰＫＣαをコードする前記遺伝子との間にポリヌクレオチドデュープレックスが形成される条件下に請求項１３８または１３９に記載のポリヌクレオチドプローブと接触させ、そしてポリヌクレオチドデュープレックスの存在または不在を検出し、このことにより、ポリヌクレオチドデュープレックスの存在が前記試料中におけるヒトＰＫＣαをコードする前記遺伝子の存在の指標となる、ことを特徴とする方法。１４８．試料中の、ヒトＰＫＣαのロングｍＲＮＡ転写産物を検出する方法であって、試料を、プローブとヒトＰＫＣαのロングｍＲＮＡ転写産物との間にポリヌクレオチドデュープレックスが形成される条件下に請求項１４４記載のポリヌクレオチドプローブと接触させ、ポリヌクレオチドデュープレックスの存在または不在を検出し、このことにより、ポリヌクレオチドデュープレックスの存在が前記試料中におけるヒトＰＫＣαのロングｍＲＮＡ転写産物の存在の指標となる、ことを特徴とする方法。１４９．ＰＫＣα遺伝子を含む細胞においてＰＫＣαの発現を変調させる方法であって、細胞を、５から５０ヌクレオチドの長さを有するアンチセンスオリゴヌクレオチドと接触させることを含み、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号１０５に記載の配列の一部と特異的にハイブリダイズしうるヌクレオチド配列を含むことを特徴とする方法。１５０．ＰＫＣα遺伝子を含む細胞においてＰＫＣαのロングｍＲＮＡ転写産物の発現を特異的に変調させる方法であって、細胞を、５から５０ヌクレオチドの長さを有するアンチセンスオリゴヌクレオチドと接触させることを含み、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号１０６に記載の配列の一部と特異的にハイブリダイズしうるヌクレオチド配列を含むことを特徴とする方法。１５１．ＰＫＣαに関連する状態を有する動物を治療する方法であって、前記動物を、治療的有効量の、５から５０ヌクレオチドの長さを有するアンチセンスオリゴヌクレオチドと接触させることを含み、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号１０５に記載の配列の一部と特異的にハイブリダイズしうるヌクレオチド配列を含むことを特徴とする方法。１５２．ＰＫＣαの発現に関連する状態を有する動物を治療する方法であって、前記動物を、治療的有効量の、５から５０ヌクレオチドの長さを有するアンチセンスオリゴヌクレオチドと接触させることを含み、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号１０６に記載の配列の一部と特異的にハイブリダイズしうるヌクレオチド配列を含むことを特徴とする方法。