JP3349502B2 - プロテインキナーゼＣ−ζのオリゴヌクレオチド変調 - Google Patents

プロテインキナーゼＣ−ζのオリゴヌクレオチド変調

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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明はプロテインキナーゼ
Ｃの発現の変調に応答する疾病状態のための治療、診断
および研究用試薬に関する。特に、本発明はプロテイン
キナーゼＣに関連する核酸と特異的にハイブリダイズし
うるアンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。これら
のオリゴヌクレオチドがプロテインキナーゼＣの発現を
変調することが見いだされた。軽減および治療効果が得
られた。
【０００２】
【従来技術】蛋白質のリン酸化は細胞内への細胞外信号
の導入において中心的な役割を果たしている。そのよう
なリン酸化を引き起こすキナーゼと称される酵素は成長
因子、ホルモンおよび細胞の代謝、増殖および分化に関
与するその他の因子の作用標的である。主たる信号伝達
経路の一つに酵素プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）が含
まれており、細胞増殖および分化に重大な影響を与える
ことが知られている。ＰＫＣは、信号伝達において放出
される代謝産物であるジアシルグリセロール（ＤＡＧ）
により活性化される。
【０００３】ホルボールエステルと称される一群の発癌
促進剤が細胞性レセプターを通して細胞にそれらの多面
的な効果を示す場合において、ＰＫＣが主たる、および
多分唯一の細胞性レセプターであることが発見されたこ
とからＰＫＣに関しての興味がかき立てられた（Ｇｅｓ
ｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉ−ＣａｎｃｅｒＤ
ｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ １９８９，４，９３−１０
５）。腫瘍生成が可能なホルボールがＰＫＣの活性化に
おいてＤＡＧの効果を模倣しうることは、これらの発癌
促進剤がＰＫＣを通して作用し、この酵素の活性化が少
なくとも部分的には腫瘍発生の原因になることを示唆し
ている（Ｐａｒｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ
１９８６，２３３，８５３−８６６）。
【０００４】実験的証拠は、ＰＫＣが結腸癌の増殖制御
において一つの役割を果たしていることを示している。
腸管中の特定の細菌が脂質をＤＡＧに変換し、ＰＫＣを
活性化し細胞の増殖を変化させていると信じられてい
る。このことは高い食物脂肪と結腸癌の間の相関を説明
するものであろう（Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ，Ｃａｎｃｅｒ
Ｒｅｓ．（Ｓｕｐｐｌ．） １９９１， ５１，５０８
０ｓ−５０８５ｓ）。また、結腸直腸癌の患者の結腸粘
膜中のＰＫＣの大部分は、癌を持たない患者のものと比
較すると活性化された状態にあることが示されている
（Ｓａｋａｎｏｕｅ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａ
ｎｃｅｒ １９９１，４８，８０３−８０６）。
【０００５】高進された腫瘍発生はまた、ヌードマウス
内に接種された培養細胞中のＰＫＣの過剰発現とも相関
している。ＰＫＣの突然変異形は高進された転移能を持
つ非常に悪性の腫瘍細胞を誘導する。
【０００６】スフィンゴシンおよび関連するＰＫＣ活性
の阻害剤は、インビボにおいて腫瘍細胞増殖および放射
線誘発形質転換を阻害することが示されている（Ｅｎｄ
ｏｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ １
９９１，５１，１６１３−１６１８；Ｂｏｒｅｋ ｅｔ
ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ１９
９１，８８，１９５３−１９５７）。多くの実験的にま
たは臨床的に有用な抗癌剤はＰＫＣに対して変調効果を
示す。従って、ＰＫＣの阻害剤は重要な癌の予防または
治療剤であろう。ＰＫＣは通常の抗癌剤のより合理的な
設計のためのもっともらしい標的であることが示唆され
てきた（Ｇｅｓｃｈｅｒ，Ａ．および Ｄａｌｅ，Ｉ．
Ｌ．，Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇ
ｎ１９８９，４，９３−１０５）。
【０００７】また、実験はＰＫＣが乾癬および皮膚癌の
ような過増殖性皮膚疾患の病理生理学において重要な役
割を果たしていることを示している。乾癬は炎症、表皮
の過増殖および細胞分化の減少により特徴付けられる。
種々の研究はこれらの症状を引き起こす上でのＰＫＣの
役割を示唆している。培養ケラチン細胞におけるＰＫＣ
刺激が過増殖を起こすことを示すことができる。炎症は
ホルボールエステルにより誘発でき、ＰＫＣにより制御
される。ＤＡＧは皮膚病性疾患にＰＫＣが関与すること
に関係しており、乾癬性病変において多量に生成され
る。
【０００８】ＰＫＣの阻害剤はインビトロにおいて抗増
殖性および抗炎症性効果の両方を有することが示されて
いる。シクロスポリンＡおよびアントラリンのような抗
乾癬薬はＰＫＣを阻害することが示されている。ＰＫＣ
の阻害は乾癬の処置に対する治療法として示唆されてき
た（Ｈａｇｅｍａｎｎ，Ｌ．およびＧ．Ｍａｈｒｌｅ，
Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｋｉｎ，
Ｈ．Ｍｕｋｈｔａｒ編、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ
Ｒａｔｏｎ，ＦＬ，１９９２，ｐ．３５７−３６
８）。
【０００９】ＰＫＣは単一の酵素ではなく一群の酵素で
ある。現在のところ、少なくとも７つのＰＫＣのイソ型
（イソ酵素）が同定されている：α、β、γ、δ、ε、
ζ、およびη。これらのイソ酵素は組織および器官分布
の異なるパターンを有し（総説としてＮｉｓｈｉｚｕｋ
ａ，Ｎａｔｕｒｅ １９８８，３３４，６６１−６６５
を参照されたい）、異なる生理学的機能を果たしている
のであろう。例えば、ＰＫＣ−γは中枢神経系でのみ発
現されるらしい。ＰＫＣ−αおよび−βはほとんどの組
織で発現されるが、異なる細胞型においては異なる発現
のパターンを有する。例えば、ＰＫＣ−αおよびＰＫＣ
−βの両方ともヒト表皮に発現され、それから精製され
ている。ＰＫＣ−αは主として表皮の基底層のケラチン
細胞中に検出されたが、ＰＫＣ−βは主として表皮の中
間層およびランゲルハンス細胞中に観察される。ＰＫＣ
−ηは主に皮膚および肺で観察されており、これらの組
織での発現のレベルは脳におけるレベルよりも高い。こ
のことは、脳に最も豊富に発現される傾向があるＰＫＣ
群の他の構成要素とは対照的である（Ｏｓａｄａｅｔ
ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． １９９０，２６
５，２２４３４−２２４４０）。他のＰＫＣイソ酵素で
あるＰＫＣ−ζは、増殖カスケードの制御において重要
な役割を果たしていると考えられている。これは、Ｘｅ
ｎｏｐｕｓＰＫＣ−ζのＡＵＧを標的とするアンチセン
スＲＮＡ、ペプチド阻害剤または１５−ｍｅｒホスホロ
チオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて、
Ｘｅｎｏｐｕｓ卵母細胞においてＰＫＣ−ζのレベルを
枯渇させることによって示された。これらの枯渇された
卵母細胞は、インシュリンに応答する成熟に耐性である
が、プロゲステロンにより活性化される成熟経路は影響
を受けなかったことが示された。ＷＯ９３／２０１０
１。ここに掲げたＰＫＣイソ酵素は本発明による標的化
に好適であるが、ＰＫＣの他のイソ酵素もまた本発明に
包含される。
【００１０】現在のところ、異なるＰＫＣイソ酵素はそ
れらが発現される器官または組織に依存して種々の疾患
過程に関与すると信じられている。例えば、乾癬病変に
おいてはＰＫＣ−αおよびＰＫＣ−β間の比が変化して
おり、正常皮膚と比較してＰＫＣ−βが優先して失われ
ている（Ｈａｇｅｍａｎｎ，Ｌ．およびＧ．Ｍａｈｒｌ
ｅ，Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｋｉ
ｎ，Ｈ．Ｍｕｋｈｔａｒ編、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏ
ｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ，１９９２，ｐ．３５７−３６
８）。
【００１１】ある１つのイソ酵素についてさえも、単一
の遺伝子から発現された多数のＲＮＡ転写産物がありう
る。例えば、ＰＫＣαの場合、２つのｍＲＮＡ転写産
物、すなわちロング（約８．５ｋｂ）転写産物およびシ
ョート（約４ｋｂ）転写産物が見られる。ネズミおよび
ウシＰＫＣα遺伝子からも多数のＰＫＣα転写産物が生
成される。ロング転写産物とショート転写産物との比
は、種によってさまざまであり、組織によってもさまざ
まであると考えられる。さらに、この比と細胞の増殖段
階との間にはある関連性があるかもしれない。
【００１２】多数の化合物がＰＫＣ阻害剤として同定さ
れているが（総説としてＨｉｄａｋａおよびＨａｇｉｗ
ａｒａ，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．
１９８７，８，１６２−１６４を参照されたい）、特異
的にＰＫＣを阻害するものはほとんど見いだされていな
い。１−（５−イソキノリンスルホニル）−２−メチル
ピペラジン（Ｈ−７）のようなキノリン スルホンアミ
ド誘導体はマイクロモル濃度でＰＫＣを阻害するが、そ
れらはＰＫＣおよびｃＡＭＰ−依存性およびｃＧＭＰ−
依存性プロテインキナーゼに対して類似の酵素阻害動力
学を示している。ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏ
ｍｙｃｅｓ）種のアルカロイド生成物であるスタウロス
ポリンおよびその類似体は、現在同定されている内で最
も強力なＰＫＣのインビトロ阻害剤である。しかしなが
らそれらは異なるプロテインキナーゼ間では限られた選
択性しか示さない（Ｇｅｓｃｈｃｒ，Ａｎｔｉ−Ｃａｎ
ｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ １９８９，４，９
３−１０５）。あるセラミドおよびスフィンゴシン誘導
体は、ＰＫＣ阻害活性を有し、治療用に使用される見込
みを有することが示されているが、この酵素の特異的阻
害剤についての長い間の要求が存在する。
【００１３】また、研究の道具および特定のイソ酵素と
関連するかもしれない疾患の治療の両方として、特定の
ＰＫＣイソ酵素を阻害することが望まれている。Ｇｏｄ
ｓｏｎら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１１９４
６−１１９５０（１９９３））は、最近、サイトメガロ
ウイルスプロモーター系発現ベクターにおけるアンチセ
ンスＰＫＣ−α ｃＤＮＡの安定なトランスフェクショ
ンを用いて、ＰＫＣ−α蛋白質の発現が特異的に約７０
％減少させることを開示した。この阻害により、ホルボ
ールエステルＰＭＡに応答するホスホリパーゼＡ2−介
在アラキドン酸放出が欠失することが示された。同一の
研究者による、オリゴデオキシヌクレオチドを用いてＰ
ＫＣ活性を阻害しようとする試みは、オリゴヌクレオチ
ドの分解のため最終的には成功しなかった。
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】本発明の主たる目的
は、プロテインキナーゼＣに関連する新生物性、過増殖
性、炎症性およびその他の疾患状態の治療法を提供する
ことである。
【００１５】本発明の別の目的は、プロテインキナーゼ
Ｃの特定のイソ酵素に関連する疾患のための選択的治療
法を提供することである。本発明のさらなる目的は、プ
ロテインキナーゼＣの発現を変調しうるアンチセンスオ
リゴヌクレオチドを提供することである。
【００１６】本発明の別の目的は、プロテインキナーゼ
Ｃの特定のイソ酵素の発現を選択的に変調しうるアンチ
センスオリゴヌクレオチドを提供することである。さら
に別の目的は、プロテインキナーゼＣに関連する疾患の
診断手段を提供することである。
【００１７】本発明のさらなる目的は、プロテインキナ
ーゼＣの特定のイソ酵素に関連する疾患を区別する診断
手段を提供することである。本発明のさらに別の目的
は、プロテインキナーゼＣの発現の影響およびそれらに
関連する疾患の研究のための研究道具を提供することで
ある。
【００１８】本発明のさらに別の目的は、プロテインキ
ナーゼＣの特定のイソ酵素の発現の影響およびそれらに
関連する疾患の研究のための研究道具を提供することで
ある。 本発明の目的は、ＰＫＣαのロングｍＲＮＡ転
写産物に独特の配列を含む、ヒトＰＫＣαの３’−非翻
訳領域をコードする新規な核酸分子を提供することであ
る。
【００１９】本発明の別の目的は、ＰＫＣαの特定のｍ
ＲＮＡ転写産物の発現を選択的に変調しうるアンチセン
スオリゴヌクレオチドを提供することである。本発明の
さらに別の目的は、ヒトＰＫＣの検出用のポリヌクレオ
チドプローブを提供することである。
【００２０】本発明のさらに別の目的は、ＰＫＣαの特
定のｍＲＮＡ転写産物を検出するポリヌクレオチドプロ
ーブを提供することである。本発明のさらに別の目的
は、ＰＫＣαの特定のｍＲＮＡ転写産物に関連する疾患
を区別する診断手段を提供することである。
【００２１】本発明の目的は、ＰＫＣαに関連する新生
物性、過増殖性、炎症性およびその他の疾患状態の治療
法を提供することである。本発明の別の目的は、ＰＫＣ
αの特定のｍＲＮＡ転写産物に関連する疾患のための選
択的治療法を提供することである。
【００２２】本発明のさらに別の目的は、ＰＫＣαの特
定の転写産物の発現の影響およびそれらに関連する疾患
の研究のための研究道具を提供することである。本発明
のこれらおよびその他の目的は本明細書の記載を考察す
ることにより明らかとなるであろう。
【００２３】
【課題を解決するための手段】本発明に従うと、ＰＫＣ
をコードする遺伝子に由来するＤＮＡまたはＲＮＡと特
異的にハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチドが提供
される。オリゴヌクレオチドは、そのような特異的ハイ
ブリダイゼーションを行うのに十分な同一性および数の
ヌクレオチド単位を含む。この相関関係は普通、「アン
チセンス」と称されている。一つの好ましい態様におい
ては、オリゴヌクレオチドは、遺伝子の翻訳開始コドン
と特異的にハイブリダイズすることができ、好ましくは
配列ＣＡＴを含む。別の好ましい態様においては、オリ
ゴヌクレオチドは遺伝子の５’−非翻訳または３’−非
翻訳領域と特異的にハイブリダイズしうる。さらに別の
好ましい態様においては、特定のＰＫＣイソ酵素または
ＰＫＣイソ酵素の特定の組をコードするＤＮＡまたはｍ
ＲＮＡと特異的にハイブリダイズしうるオリゴヌクレオ
チドが提供される。そのようなオリゴヌクレオチドは、
便利にかつ望ましくは、薬学的に許容しうる担体中に存
在させることができる。
【００２４】別の好ましい態様においては、オリゴヌク
レオチドは、改良された標的親和性、細胞への取り込み
または細胞性ヌクレアーゼの存在下における安定性等の
いくつかの望ましい性質を与えるような、１つまたはそ
れ以上の化学的修飾を含む。そのような用途を有する修
飾の例としては、２’−Ｏ−アルキルおよび２’−フル
オロ糖修飾およびホスホロチオエート主鎖修飾が挙げら
れる。
【００２５】本発明の別の観点は、細胞または組織中の
ＰＫＣまたは特定のＰＫＣイソ酵素またはイソ酵素の組
の発現を変調するための方法に関する。本発明の他の観
点は、ＰＫＣをコードするＤＮＡまたはＲＮＡの細胞ま
たは組織における検出法、および特定のＰＫＣイソ酵素
をコ−ドするＤＮＡまたはＲＮＡの細胞または組織にお
ける特異的検出法に関する。そのような方法は、前記Ｒ
ＮＡまたはＤＮＡの作用を妨害するためまたは検出する
ために、前記遺伝子を含むと疑われる細胞または組織を
本発明に従うオリゴヌクレオチドと接触させることを含
む。
【００２６】本発明の別の観点は、ＰＫＣまたはそのイ
ソ酵素の一つに関連する疾患を有すると疑われる動物の
診断および治療法に関する。そのような方法は、ＰＫＣ
の発現を変調するため、ＰＫＣに関連する状態を処置す
るため、またはその診断を行うために、動物または動物
からの細胞または組織または体液を本発明に従うオリゴ
ヌクレオチドと接触させることを含む。
【００２７】本発明は、ヒトＰＫＣαの３’−非翻訳領
域の一部をコードする核酸配列を提供する。ポリヌクレ
オチドプローブおよびＰＫＣαを検出する方法もまた提
供される。本発明のいくつかの態様においては、ＰＫＣ
αの特定のｍＲＮＡ転写産物に特異的な核酸配列、なら
びにこの転写産物を特異的に検出するためのポリヌクレ
オチドプローブおよび方法が提供される。
【００２８】本発明の他の態様に従えば、ＰＫＣαをコ
ードする核酸に特異的にハイブリダイズしうるアンチセ
ンスオリゴヌクレオチドが提供される。さらに別の態様
においては、ＰＫＣαの特定のｍＲＮＡ転写産物と特異
的にハイブリダイズしうるアンチセンスオリゴヌクレオ
チドが提供される。そのようなオリゴヌクレオチドは、
便利にかつ望ましくは、薬学的に許容しうる担体中に存
在させることができる。
【００２９】本発明のさらに別の観点においては、細胞
において、ＰＫＣαまたは特定のＰＫＣα ｍＲＮＡ転
写産物の発現を変調させる方法が提供される。本発明の
さらに別の観点は、細胞においてＰＫＣαをコードする
核酸を検出する、および細胞において特定のＰＫＣα転
写産物をコードする核酸を検出する方法に関する。その
ような方法は、前記核酸の効果を妨害するまたは前記核
酸を検出するために、細胞を本発明に従うオリゴヌクレ
オチドと接触させることを含む。
【００３０】本発明のさらに別の態様においては、ＰＫ
Ｃαまたはその転写産物の１つの発現に関連する疾患を
有する動物を治療する方法が提供される。そのような方
法は、ＰＫＣαの発現を変調するため、ＰＫＣαに関連
する状態を処置するため、またはその診断を行うため
に、動物を治療的有効量の本発明に従うオリゴヌクレオ
チドと接触させることを含む。
【００３１】
【発明の実施の形態】現在、アンチセンスオリゴヌクレ
オチドは多くのヒトの疾患の治療のための治療剤として
受け入れられている。オリゴヌクレオチドはワトソン−
クリック塩基対により定義されているごとく、ＤＮＡ、
ｐｒｅ−ｍＲＮＡまたは成熟ｍＲＮＡの相補的配列と特
異的に結合（ハイブリダイズ）して、ＤＮＡから蛋白質
への遺伝的情報の流れを妨害する。標的配列に対して特
異的にさせられたアンチセンスオリゴヌクレオチドの性
質はまた、それらを非常に有用なものにしている。アン
チセンスオリゴヌクレオチドは単量体単位の長い鎖であ
るため、それらは任意の標的ＲＮＡ配列に対して容易に
合成することができる。多くの最近の研究は、標的蛋白
質研究のための生化学的道具としてのアンチセンスオリ
ゴヌクレオチドの有用性を述べている（Ｒｏｔｈｅｎｂ
ｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ
Ｉｎｓｔ． １９８９，８１，１５３９−１５４４；Ｚ
ｏｎ，Ｇ．， Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅ
ｓ． １９８８，５，５３９−５４９）。オリゴヌクレ
オチド化学の最近の進歩、および増強された細胞取り込
み、標的結合親和性およびヌクレアーゼ耐性を示すオリ
ゴヌクレオチドの合成により、現在では治療法の新しい
形態としてのアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用を
考えることが可能である。例えば、ｃ−ｍｙｂを標的と
するアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて、急性骨
髄性白血病を有する患者に由来する骨髄からの骨髄性白
血病細胞が完全に排除された（Ｇｅｗｉｒｔｚ ａｎｄ
Ｃａｌａｂｒｅｔｔａ，米国特許第５，０９８，８９
０号）。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヒトにお
いて、サイトメガロウイルス網膜炎感染の治療のための
臨床的効力を有することが示されている。
【００３２】アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＰＫ
Ｃに関連する状態を治療するための従来の方法で直面す
る問題点の理想的な解決法を提供する。それらは問題と
するイソ酵素またはイソ酵素の特定の組を選択的に阻害
するように、または、問題とするイソ酵素の群の全ての
メンバーを阻害するように設計することができる。
【００３３】プロテインキナーゼＣの活性または代謝を
変調する現在の薬は、それらの特異性の欠如による多く
の許容できない副作用を有するか、または酵素の阻害に
おいて限られた有効性しか示さない。本発明は従来の研
究者が直面した問題を、酵素を直接的に阻害するのでは
なく酵素の産生を変調することにより解決し、治療効果
を達成する。本発明においては、オリゴヌクレオチドは
直接ｍＲＮＡまたは遺伝子にハイブリダイズし、最終的
に遺伝子から産生されるＰＫＣ蛋白質の量を変調する。
本発明の文脈において、「ハイブリダイゼーション」と
は、通常は反対側の核酸鎖のまたは１つの核酸鎖中の２
つの領域の相補的塩基の間で水素結合（ワトソン−クリ
ック塩基対形成としても知られている）して二本鎖デュ
ープレックスを形成することを意味する。グアニンおよ
びシトシンは、これらの間に３つの水素結合を形成する
ことが知られている相補的塩基の例である。アデニンお
よびチミンは、これらの間に２つの水素結合を形成する
ことが知られている相補的塩基の例である。「特異的に
ハイブリダイズしうる」および「実質的に相補的な」と
は、特異的結合が望まれる条件下（すなわち、インビボ
アッセイおよび治療的処置の場合には生理学的条件、イ
ンビトロアッセイの場合にはアッセイを実施する条件）
で、オリゴヌクレオチド（またはポリヌクレオチドプロ
ーブ）の、非標的配列に対する非特異的結合を回避する
のに十分な程度の相補性を示す用語である。特異的にハ
イブリダイズしうるためには、オリゴヌクレオチドまた
はポリヌクレオチドプローブはその標的核酸配列と１０
０％相補的である必要はないことが理解されるであろ
う。
【００３４】オリゴヌクレオチドとその相補的（または
「標的」）核酸との間の関係は、一般に「アンチセン
ス」として称される。アンチセンス攻撃のために特定の
遺伝子を標的とすることが好ましい。ＰＫＣα、β、
γ、δ、ε、ζおよびηをコードする遺伝子が特にこの
方法のために有用であることが発見されている。ＰＫＣ
発現の阻害は、疾患の治療、特に過増殖性および炎症性
疾患の治療に有用であると予期される。しかし、本発明
の文脈においては、「変調」とは、ＰＫＣ発現の増加ま
たは減少（促進または阻害）のいずれかを意味する。
【００３５】本発明の文脈において、術語「オリゴヌク
レオチド」とは、天然に存在する塩基および天然のホス
ホジエステル結合により連結されたペントフラノシル
（糖）基から形成されたポリヌクレオチドを意味する。
この術語は実際上、天然に存在する化学種または天然に
存在するサブユニットまたはそれらの密接な類似体から
形成された合成種を意味する。
【００３６】術語「オリゴヌクレオチド」はまた、天然
に存在するオリゴヌクレオチドと同様に機能するが、天
然に存在しない部分を有する成分を意味してもよい。従
って、オリゴヌクレオチドは変更された糖部分、核塩基
または糖間（主鎖）連結を有していてもよい。このよう
な修飾されたまたは置換されたオリゴヌクレオチドは、
例えば増強された細胞取り込み、増強された標的結合親
和性およびヌクレアーゼの存在下における増加した安定
性等の性質のため、しばしば天然形よりも好ましい。
【００３７】本発明において意図されるいくつかの好ま
しいオリゴヌクレオチドの特定の例としては、ホスホト
リエステル、メチルホスホネート、短鎖アルキルまたは
シクロアルキル糖間連結または短鎖複素原子または複素
環糖間連結等の、糖間主鎖連結を含むものが挙げられ
る。最も好ましいものは、ＣＨ2−ＮＨ−Ｏ−ＣＨ2、Ｃ
Ｈ2−Ｎ（ＣＨ3）−Ｏ−ＣＨ2、ＣＨ2−Ｏ−Ｎ（Ｃ
Ｈ3）−ＣＨ2、ＣＨ2−Ｎ（ＣＨ3）−Ｎ（ＣＨ3）−Ｃ
Ｈ2、およびＯ−Ｎ（ＣＨ3）−ＣＨ2−ＣＨ2主鎖（ここ
でホスホジエステルはＯ−Ｐ−Ｏ−ＣＨ2である）を有
するものである。ホスホロチオエートもまた最も好まし
い。モルホリノ主鎖構造を有するオリゴヌクレオチドも
また好ましい。Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ，Ｊ．Ｅ． ａｎｄ
Ｗｅｌｌｅｒ，Ｄ．Ｄ．、米国特許出願第５，０３
４，５０６号。ペプチド核酸（ＰＮＡ、「蛋白質核酸」
とも称される）主鎖等の別の好ましい態様においては、
オリゴヌクレオチドのホスホジエステル主鎖はポリアミ
ド主鎖に置き換えられていてもよく、ここでヌクレオシ
ドの塩基はポリアミド主鎖のアザ窒素原子またはメチレ
ン基に直接または間接的に結合されている（例えば、
Ｐ．Ｅ．Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｍ．Ｅｇｈｏｌｍ，Ｒ．Ｈ．
Ｂｅｒｇ，Ｏ．Ｂｕｃｈａｒｄｔ，Ｓｃｉｅｎｃｅ １
９９１，２５４，１４９７、および米国特許出願第０８
／０５４，３６３号（１９９３年４月２６日出願）を参
照のこと、これらを本明細書の一部としてここに引用す
る）。別の好ましい態様にしたがえば、ホスホジエステ
ル結合は、キラルでありかつ対掌体特異的である構造で
置換されている。当業者は本発明の実施に使用するため
の別の結合を選択することが可能であろう。
【００３８】オリゴヌクレオチドは少なくとも一つの修
飾核塩基を含む化学種を含んでいてもよい。すなわち、
天然に通常見いだされるもの以外のプリンおよびピリミ
ジンをそのように用いてもよい。同様に、本発明の本質
的教義から離れない限りは、ヌクレオチドサブユニット
のペントフラノシル部分上の修飾もまた有効である。そ
のような修飾の例は２’−Ｏ−アルキル−および２’−
ハロゲン−置換ヌクレオチドである。本発明において有
用である糖部分の２’位における修飾のいくつかの特定
の例は、ＯＨ、ＳＨ、ＳＣＨ3、Ｆ、ＯＣＮ、Ｏ（Ｃ
Ｈ2）nＮＨ2、またはＯ（ＣＨ2）nＣＨ3（式中、ｎは１
から約１０である）；Ｃ1〜Ｃ10低級アルキル、置換低
級アルキル、アルカリールまたはアラルキル；Ｃｌ；Ｂ
ｒ；ＣＮ；ＣＦ3；ＯＣＦ3；Ｏ−、Ｓ−もしくはＮ−ア
ルキル；Ｏ−、Ｓ−もしくはＮ−アルケニル；ＳＯＣＨ
3；ＳＯ2ＣＨ3；ＯＮＯ2；ＮＯ2；Ｎ3；ＮＨ2；ヘテロ
シクロアルキル；ヘテロシクロアルカリール；アミノア
ルキルアミノ；ポリアルキルアミノ；置換シリル；ＲＮ
Ａ開裂基；レポーター基；インターカレーター；オリゴ
ヌクレオチドの薬理学的性質を改良するための基；また
はオリゴヌクレオチドの薬物動態学的性質を改良するた
めの基、または類似の性質を有するその他の置換基であ
る。１つまたはそれ以上のペントフラノシル基が、他の
糖、シクロブチル等の糖模倣体または糖の代わりになる
他の成分で置換されていてもよい。
【００３９】キメラまたは「ギャップを有する」オリゴ
ヌクレオチドもまた、本発明の好ましい態様である。こ
れらのオリゴヌクレオチドは、二つまたはそれ以上の化
学的に異なる領域を有し、それぞれが少なくとも１つの
ヌクレオチドを含む。典型的には、１つまたはそれ以上
の領域は、１つまたはそれ以上の有利な性質、例えば増
加したヌクレアーゼ耐性、増加した細胞への取り込みま
たはＲＮＡ標的への増加した結合親和性を付与する修飾
されたヌクレオチドを含む。１つまたはそれ以上の非修
飾または異なるように修飾された領域は、ＲＮＡｓｅＨ
活性を指示する能力を保持する。キメラオリゴヌクレオ
チドは、本出願の出願人に譲渡されているＰＣＴ出願Ｕ
Ｓ９２／１１３３９に開示されており、この内容をすべ
て本明細書の一部としてここに引用する。現在のところ
好ましいキメラオリゴヌクレオチドの例は、２’−デオ
キシヌクレオチドの「デオキシギャップ」を有する２’
−Ｏ−メチルまたは２’−Ｏ−プロピルオリゴヌクレオ
チドである。通常は、このデオキシギャップ領域は２つ
の２’−アルキル領域の間に位置している。これらの好
ましい態様においては、糖間（主鎖）連結は、均一なホ
スホロチオエートまたはホスホロチオエート連結とホス
ホジエステル連結のある種の組み合わせでありうる。
【００４０】すべてのそのようなオリゴヌクレオチド
は、天然のオリゴヌクレオチド（または、天然のライン
に沿って合成されたオリゴヌクレオチド）と機能的に交
換可能であるが、天然の構造とは一つまたはそれ以上の
相違を有するものとして記述するのが最適であろう。す
べてのそのようなオリゴヌクレオチドは、ＰＫＣ ＲＮ
Ａとハイブリダイズするのに有効に機能する限り、本発
明に包含される。
【００４１】本発明に従うオリゴヌクレオチドは、好ま
しくは約５から約５０ヌクレオチド単位を含む。約８か
ら３０のヌクレオチド単位を含むオリゴヌクレオチドが
より好ましく、約１２から２５のヌクレオチド単位を有
するものがさらにより好ましい。理解されるように、ヌ
クレオチド単位とは、ホスホジエステルまたは主鎖構造
を形成する他の結合を介して隣接するヌクレオチド単位
に適切に結合されている塩基−糖の組み合わせ（または
類似の構造の組み合わせ）である。
【００４２】本発明に従って使用されるオリゴヌクレオ
チドは、固相合成のよく知られた技術により都合よくか
つ日常的に作製することができる。そのような合成のた
めの装置はＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓを含
むいくつかの販売元から市販されている。そのような合
成のために他の手段を用いてもよい；オリゴヌクレオチ
ドの実際の合成は機械的に仕事を処理する人の能力の範
囲内である。ホスホロチオエートまたはアルキル化誘導
体等の他のオリゴヌクレオチドを合成するために類似の
技術を使用することもよく知られている。他の修飾およ
び置換オリゴマーは、同様にして合成することができ
る。
【００４３】本発明に従うと、当業者は、メッセンジャ
ーＲＮＡは、３文字遺伝コードを用いて蛋白質をコード
している情報を含むコーディング領域のみならず、５’
−非翻訳領域、３’−非翻訳領域、５’キャップ領域お
よびイントロン／エクソン結合部リボヌクレオチドとし
て当業者に知られている領域を形成する付随するリボヌ
クレオチドをも含むことを理解するであろう。従って、
これらの付随するリボヌクレオチドならびにコーディン
グリボヌクレオチドの全体または一部を標的とするオリ
ゴヌクレオチドを本発明に従って形成することができ
る。好ましい態様においては、オリゴヌクレオチドは転
写開始部位、翻訳開始部位、５’キャップ領域、イント
ロン／エクソン結合部、コーディング配列または５’−
もしくは３’−非翻訳領域中の配列と特異的にハイブリ
ダイズすることができる。
【００４４】本発明のオリゴヌクレオチドは、ＰＫＣ遺
伝子またはＰＫＣ遺伝子に由来するメッセンジャーＲＮ
Ａにハイブリダイズしうるように設計さる。そのような
ハイブリダイゼーションが達成された場合、メッセンジ
ャーＲＮＡの正常な役割を妨害し、細胞におけるその機
能の変調が生ずる。妨害されるべきメッセンジャーＲＮ
Ａの機能には、蛋白質翻訳部位へのＲＮＡのトランスロ
ケーション、ＲＮＡから蛋白質への実際の翻訳、一つま
たはそれ以上のｍＲＮＡ種を得るためのＲＮＡのスプラ
イシング、および多分ＲＮＡに携わっているであろう独
立した触媒活性のような全ての生体機能が含まれる。Ｒ
ＮＡ機能へのそのような妨害の全体の効果はＰＫＣ遺伝
子発現の変調である。
【００４５】本発明のオリゴヌクレオチドは、診断薬、
治療薬、予防薬および研究用試薬およびキットとして使
用することができる。本発明のオリゴヌクレオチドはＰ
ＫＣ遺伝子およびそのｍＲＮＡにハイブリダイズするた
め、この事実を利用してサンドイッチおよびその他のア
ッセイを容易に組み立てることができる。さらに、本発
明のオリゴヌクレオチドはＰＫＣ ｍＲＮＡの特定のイ
ソ酵素にハイブリダイズするため、特定のＰＫＣイソ酵
素についての細胞および組織のスクリーニングのための
アッセイが工夫できる。そのようなアッセイは種々のＰ
ＫＣ形に関連する疾患の診断に利用することができる。
ＰＫＣ遺伝子に対するオリゴヌクレオチドのハイブリダ
イゼーションを検出する手段の準備は日常的に達成され
る。そのような準備には、酵素のコンジュゲート、放射
性標識または別の適した検出系が含まれる。ＰＫＣの存
在または不在を検出するためのキットもまた製造される
であろう。
【００４６】治療または予防処置のために、オリゴヌク
レオチドが本発明に従って投与される。オリゴヌクレオ
チドは医薬組成物中に処方され、それにはオリゴヌクレ
オチドに加えて、担体、粘稠化剤、希釈剤、緩衝剤、保
存剤、表面活性化剤などが含まれているであろう。医薬
組成物は、オリゴヌクレオチドに加えて、一つまたはそ
れ以上の活性成分、例えば抗菌薬、抗炎症薬、麻酔薬を
含んでいてもよい。
【００４７】医薬組成物は、局所または全身の処置が望
まれているか、および処置されるべき領域に依存して多
くの方法で投与することができる。投与は局所的に（点
眼、膣内、直腸内、鼻孔内を含む）、経口で、吸入によ
り、または非経口で（例えば、静脈内点滴または皮下、
腹腔内または筋肉内注射）実施されるであろう。
【００４８】局所投与のための処方には軟膏、ローショ
ン剤、クリーム剤、ゲル剤、滴剤、座剤、スプレー剤、
水剤および散剤が含まれるであろう。通常の医薬担体、
水性、粉末もしくは油性基剤、粘稠化剤等が必要かまた
は望ましいであろう。コーティングしたコンドームもま
た有用であろう。
【００４９】経口投与のための処方には、散剤、顆粒
剤、水または非水性媒質中の懸濁化剤または液剤、カプ
セル剤、サッシェ剤、または錠剤が含まれる。粘稠化
剤、芳香剤、希釈剤、乳化剤、分散補助剤または結合剤
が望まれるであろう。
【００５０】非経口投与のための処方には、緩衝液、希
釈剤およびその他の適切な添加剤を含んでいてもよい無
菌水溶液が含まれる。投与量は処置されるべき状態の重
度および応答性に依存するが、通常は、数日から数カ月
の処置過程で、治癒が達成されるかまたは疾患状態の軽
減が達成されるまで、一日当たり一回またはそれ以上の
投与量であろう。当業者は最適の投与量、投与法および
反復率を容易に決定することができる。
【００５１】本発明はまた、ヒトＰＫＣαの３’−非翻
訳領域をコードする配列を有する核酸分子を提供する
（図１３）。この配列は、ヒトＡ５４９細胞から調製さ
れたｃＤＮＡクローンから決定され、先に公表されたＰ
ＫＣα配列（Ｆｉｎｋｅｎｚｅｌｌｅｒ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８：２１８３
（１９９０）；Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｘ５２４７９）
の３’−最末端と重なるクローンから始まり、３’方向
に伸びている。１０８０ヌクレオチドの後に達するポリ
アデニル化部位（図１３中のヌクレオチド１１３６）
は、ＰＫＣαのショート（４ｋｂ）ｍＲＮＡ転写産物の
３’末端として同定された。３’方向の追加の６７６ヌ
クレオチドの配列が決定され、この配列はＰＫＣαのロ
ング（８ｋｂ）ｍＲＮＡ転写産物に独特である。本発明
の核酸分子は、好ましくはデオキシリボ核酸からなり、
本発明のいくつかの観点においては二本鎖である。ま
た、本発明に従えば、該核酸分子が単離される。本明細
書で用いられる「単離された」との用語は、実質的に均
一であるように精製されまたは合成された分子を意味す
る。この用語は、ある種の不純物が組成物中に存在する
可能性を排除するものではなく、関連性のない核酸配列
が存在しないことを意味する。
【００５２】本発明に従えば、ヒトＰＫＣα遺伝子の
３’−非翻訳領域の一部に特異的にハイブリダイズしう
るポリヌクレオチドプローブが提供される。ＰＫＣαの
ロングｍＲＮＡ転写産物の一部に特異的にハイブリダイ
ズしうるポリヌクレオチドプローブもまた提供される。
このようなプローブを診断または研究目的に使用して、
ＰＫＣαの発現を検出しまたは定量化することができ
る。プローブを用いて、ＰＫＣαのロング転写産物を特
異的に検出しまたは定量化することができる。該ポリヌ
クレオチドプローブは、約５から約５０ヌクレオチド単
位の長さの範囲でありうる。本発明のより好ましい態様
においては、プローブは約８から約３０ヌクレオチド単
位の長さである。理想的には、該プローブは、約１２か
ら約２５ヌクレオチド単位の範囲の長さである。本発明
のポリヌクレオチドプローブは理想的には５０ヌクレオ
チド長さを越えないため、該プローブは標的配列の一部
にのみ特異的にハイブリダイズすることが認識されるで
あろう。当業者は、標的化されるべきＰＫＣα配列の部
分を同定することができる。最も適切には、標的配列は
独特であるように選択され、このことにより、プローブ
の標的以外へのハイブリダイゼーションに起因するバッ
クグラウンドノイズが減少する。例えば、アデニンヌク
レオチド単位の反復配列は、多くの遺伝子に生ずる共通
配列であるため、当業者はそのような配列を選択しない
であろう。実施する者は、有用なプローブを同定し設計
するために、Ｇｅｎｂａｎｋ等の配列受託機関において
見いだされる配列の探索および比較を行うことを選択す
るであろう。そのような方法は、独特の配列を同定する
ために慣用的に用いられている。これらの独特の配列
は、プローブとして用いる場合、ＰＫＣαの発現の制御
に決定的である必要はない。
【００５３】以下の実施例は本発明の例示であり、本発
明を制限することを意図したものではない。
【００５４】
【実施例】実施例１ オリゴヌクレオチド合成 非修飾ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、ヨウ素により酸化
する標準ホスホロアミダイトの化学を使用する自動化Ｄ
ＮＡシンセサイザー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔ
ｅｍｓ モデル３８０Ｂ）で合成した。β−シアノエチ
ルジイソプロピル−ホスホロアミダイトはＡｐｐｌｉｅ
ｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，
ＣＡ）から購入した。ホスホロチオエート オリゴヌク
レオチドについては、ホスファイト結合の段階的チオ化
のために、標準酸化ボトルを３Ｈ−１，２−ベンゾジチ
オール−３−オン １，１，−ジオキシドの０．２Ｍア
セトニトリル溶液に置き換えた。チオ化サイクル待ち時
間は６８秒に増加し、続いてキャッピング工程を実施し
た。
【００５５】２’−Ｏ−メチルホスホロチオエートオリ
ゴヌクレオチドは、標準的ホスホルアミダイトを２’−
Ｏ−メチル β−シアノエチルジイソプロピルホスホル
アミダイト（Ｃｈｅｍｇｅｎｅｓ，Ｎｅｅｄｈａｍ，Ｍ
Ａ）に置き換え、テトラゾールおよび塩基のパルス放出
の後の待ち時間を３６０秒に増加して、上述の方法にし
たがって合成した。同様に、２’−Ｏ−プロピルホスホ
ロチオエートオリゴヌクレオチドは、この方法をわずか
に変更して製造することができる。
【００５６】オリゴヌクレオチドは、制御細孔ガラスカ
ラム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）から切
断し、５５℃で１８時間濃水酸化アンモニウム中で脱保
護した後、２．５容量のエタノールおよび０．５Ｍ Ｎ
ａＣｌから二回沈澱させることにより精製した。分析ゲ
ル電気泳動は、２０％アクリルアミド、８Ｍ尿素、４５
ｍＭトリス−ホウ酸緩衝液、 ｐＨ７．０で実施した。
【００５７】試験したオリゴヌクレオチドは表１に示さ
れている。配列データは、Ｆｉｎｋｅｒｎｚｅｌｌｅｒ
ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １
９９０，１８，２１８３；Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｘ５
２４７９ により発表されたｃＤＮＡ配列からのもので
ある。オリゴヌクレオチドの下に与えられている配列番
号はｃＤＮＡで配列決定されるべき第一の残基（ＡＴＧ
開始コドンの上流の２８番目の残基）に対して相対的な
ものである。
【００５８】
【表１】
【００５９】実施例２ 細胞培養およびホルボールエス
テルおよびＰＫＣ−αを標的とするオ リゴヌクレオチド
による処理 ＰＫＣ蛋白質半減期は６．７時間から２４時間まで変動
することが報告されている（Ｙｏｕｎｇ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ． １９８７，２４４，７７
５−７７９；Ｂａｌｌｅｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． １９８５，２６０，１５１９
４−１５１９９）。これらの長い半減期のため長いイン
キュベーション時間が必要とされ、アンチセンスオリゴ
ヌクレオチドをスクリーニングする場合、ＰＫＣ−αの
定常状態を阻害することは実際的ではない。したがっ
て、ＰＫＣの細胞内レベルを可逆的に低くするホルボー
ルエステルの能力を利用した。細胞をホルボールエステ
ルで処理すると、最初にキナーゼ活性の活性化、続いて
ＰＫＣのダウンレギュレーションが起こる。ＰＫＣ−α
については、このダウンレギュレーションは、キナーゼ
の合成速度は明らかに変化せずに蛋白質分解の速度が増
加した直接の結果であることが示されている。
【００６０】ヒト肺癌腫（Ａ５４９）細胞において、Ｋ
ｒｕｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． １
９８７，２６２，１１８５２−１１８５６ の方法の変
法を用いたホルボールエステル １２，１３−ジブチレ
ート（ＰＤＢｕ）の処理は、ＰＫＣ−α ｍＲＮＡレベ
ルに影響を与えずにＰＫＣ−αの細胞レベルを低下さ
せ、この効果は可逆的であることが決定された。ＰＫＣ
−αを標的とするオリゴヌクレオチドの効力をスクリー
ニングするアッセイの基本は、最初にＰＤＢｕで長期間
処理することによりＰＫＣ−α蛋白質レベルを低下さ
せ、細胞をよく洗浄することによりＰＤＢｕを除去し
（これにより細胞は新規のＰＫＣ−α蛋白質を合成する
ことができる）、新ＰＫＣ−α蛋白質の再合成を阻害す
るために細胞をオリゴヌクレオチドとともにインキュベ
ートすることである。 方法：Ａ５４９細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃ
ｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｂｅｔｈｅｓｄ
ａ ＭＤから入手した）を、６−ウェルプレート（Ｆａ
ｌｃｏｎ Ｌａｂｗａｒｅ，Ｌｉｎｃｏｌｎ Ｐａｒ
ｋ，ＮＪ）上、１ｇグルコース／リットルおよび１０％
ウシ胎児血清（ＦＣＳ，Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉ
ｆｉｃ，Ｓａｎｔａ Ａｎａ，ＣＡ）を含むダルベッコ
改良イーグル培地（ＤＭＥ）中でコンフルエントになる
まで増殖させた。
【００６１】細胞を５００ｎＭのＰＤＢｕ（Ｓｉｇｍａ
Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で１２
−１６時間（終夜）処理した。次に、細胞をＤＭＥで３
７℃で３回洗浄し、２０μｌのＤＯＴＭＡ（Ｌｉｐｏｆ
ｅｃｔｉｎ試薬，ＢＲＬ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）を
含む１ｍｌのＤＭＡを加えた。オリゴヌクレオチドを１
μＭの濃度となるよう添加し、細胞を３７℃でさらに４
時間インキュベートした。
【００６２】細胞を０．１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡを含む３
ｍｌのＤＭＥで１回洗浄し、０．１ｍｇ／ｍｌＢＳＡを
含む２ｍｌのＤＭＥをさらに加えた。オリゴヌクレオチ
ド（１ μＭ）を加えて細胞を３７℃で２４時間インキ
ュベートした。
【００６３】細胞をリン酸緩衝化塩溶液（ＰＢＳ）中で
３回洗浄し、細胞蛋白質を１２０μｌの試料緩衝液（６
０ｍＭ トリス ｐＨ６．８，２％ＳＤＳ，１０％グリ
セロール，１０ｍＭジチオスレイトール）中に抽出して
５分間煮沸した。ＰＫＣ−α蛋白質の細胞内レベルはイ
ムノブロッティングにより決定した。
【００６４】実施例３ ＰＫＣ発現のイムノブロットア
ッセイ 細胞抽出物を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥミニゲル上で電気
泳動した。分離した蛋白質を電気泳動的移動によりＩｍ
ｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ膜（ＭＩｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆ
ｏｒｄ ＭＡ）に移し、膜を５％脱脂ミルクを含むＴＢ
Ｓ（トリス−ＨＣｌ ｐＨ７．４，１５０ｍＭ Ｎａ
Ｃｌ）中、６０分間ブロックした。次に、膜を、０．２
％脱脂ミルクを含むＴＢＳで ０．２μｇ／ｍｌに希釈
した、ＰＫＣ−αに対するモノクローナル抗体（ＵＢ
Ｉ，Ｌａｋｅ Ｐｌａｃｉｄ ＮＹ）とともに４℃で１
６時間インキュベートした。続いて０．２％脱脂ミルク
を加えたＴＢＳ中で３回洗浄した。次に膜を125Ｉ−標
識ヤギ抗マウス二次抗体（ＩＣＮ Ｒａｄｉｏｃｈｅｍ
ｉｃａｌｓ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）とともに１時間イン
キュベートした。次に膜を０．２％脱脂ミルクを加えた
ＴＢＳ中でよく洗浄した。バンドを可視化しホスファー
イメージャー（ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃ
ｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を使用して定量した。
ＰＫＣ−αは８０ｋＤの分子量を有する単一バンドとし
て現れる。
【００６５】各々のオリゴヌクレオチドは３回試験し
（３重に）、実験の結果はオリゴヌクレオチドで処理さ
れていない細胞と比較して、存在する蛋白質のパーセン
トに対して標準化されている（図１ａおよび１ｂ）。５
つの最も有効なオリゴヌクレオチドは、ＡＵＧ開始コド
ンおよびそれからわずかに上流および下流の領域を標的
としている（オリゴ１、３、１７、７、６）。次に最も
有効なオリゴヌクレオチドはＲＮＡの３’非翻訳領域を
標的としている（オリゴ２、５、１４）。
【００６６】実施例４ ＰＫＣの他のイソ酵素 ヒトＰＫＣ−αを標的とするオリゴヌクレオチドについ
て得られた結果は、最も有効な標的配列は翻訳開始コド
ンを囲む配列および３’−非翻訳領域であることを示し
た。これらの配列はまた、ＰＫＣの他のイソ酵素に対す
るオリゴヌクレオチドについても有効な標的であると考
えられる。ＰＫＣの有効な阻害剤であろうアンチセンス
オリゴヌクレオチドが以下に同定されている。これらの
オリゴヌクレオチドは実施例１のごとく合成し、入手可
能な場合には適当な抗体を用いて実施例２および３のご
とくスクリーニングすることができる。または、ＴＰＡ
−応答性エンハンサーまたは適当なプロモーターの影響
下、所望のＰＫＣのイソ酵素とルシフェラーゼを一時的
に同時発現するレポーター遺伝子アッセイ系を確立する
ことができる。次に、常法を用いてルシフェラーゼ活性
を測定することによりＰＫＣ発現をアッセイする。すな
わち、Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ，Ｍ．Ｅ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ
Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂ
ｉｏｌｏｇｙ，（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｂｒｅ
ｎｔ，Ｒ．Ｅ．Ｋｉｎｇｓｔｏｎ，Ｄ．Ｄ．Ｍｏｏｒ
ｅ，Ｊ．Ａ．Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．Ｇ．Ｓｅｉｄｍａｎおよ
びＫ．Ｓｔｒａｈｌ編），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎ
ｄ Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９８７）により記載されている
ごとく、界面活性剤トリトンＸ−１００による溶解によ
り細胞からルシフェラーゼを抽出する。Ｄｙｎａｔｅｃ
ｈ ＭＬ１０００ 発光計を用いて、ルシフェリン（Ｓ
ｉｇｍａ）添加による６２５μＭまでのピーク発光の測
定を行う。ＰＫＣ−β、タイプＩおよびＩＩ 配列データは、Ｋｕｂｏ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌ
ｅｔｔ． １９８７，２２３，１３８−１４２，Ｇｅｎ
ｂａｎｋ受託番号Ｘ０６３１８，Ｍ２７５４５，Ｘ０７
１０９ からのものである。配列はｃＤＮＡで配列決定
された最初の５’塩基から番号付けられている。ＰＫＣ
−βタイプＩおよびＩＩは単一の遺伝子産物の異なるｍ
ＲＮＡスプライシングの結果である。このため同一のア
ミノ末端を有する蛋白質が生じている（ｍＲＮＡの５’
末端）；しかしながら、カルボキシ末端に配列の相違が
存在する（ｍＲＮＡの３’末端）。下記のオリゴヌクレ
オチド（翻訳開始コドンを標的とする）はＰＫＣ−βタ
イプＩおよびＩＩ両方の発現を変調することが期待され
る：
【００６７】
【表２】
【００６８】下記のアンチセンスオリゴヌクレオチドは
ＰＫＣ−βタイプＩの３’非翻訳領域を標的とする：
【００６９】
【表３】
【００７０】下記のアンチセンスオリゴヌクレオチドは
ＰＫＣ−βタイプＩＩの３’非翻訳領域を標的とする：
【００７１】
【表４】
【００７２】ＰＫＣ−γ：配列データは、Ｃｏｕｓｓｅ
ｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８６，２３
３，８５９−８６６，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｍ１３９
７７ からのものである。配列はｃＤＮＡ中で配列決定
された最初の５’塩基から番号付けられている。完全な
配列は入手不可能であった：オープンリーディングフレ
ームの３’最末端および３’非翻訳領域が欠如してい
る。その結果、これらの領域は現在のところアンチセン
ス標的としては入手不可能である。
【００７３】
【表５】
【００７４】ＰＫＣ−η：ＰＫＣ−ηのための配列デー
タはＢａｃｈｅｒおよびその協同研究者［Ｂａｃｈｅｒ
ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ． １９
９１，１１，１２６−１３３］，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番
号Ｍ５５２８４ からのものである。彼らはそのイソ酵
素をＰＫＣ−Ｌと名付けている；しかしながら、その配
列はマウスＰＫＣ−ηのものとほとんど同一であり、一
貫性を保つためここでは後者の命名法が用いられた。配
列はｃＤＮＡ中で配列決定された最初の５’塩基から番
号付けられている。
【００７５】
【表６】
【００７６】実施例５ ＰＫＣ−α蛋白質合成に対する
ホスホロチオエート／２’−Ｏ−メチルオリゴヌクレオ
チドの効果の用量応答性：一連のホスホロチオエート
（配列ＩＤ番号：１、２、３および５を有する完全２’
−Ｏ−メチル化オリゴヌクレオチド）を合成した。ＰＫ
Ｃ−α合成をダウンレギュレーションするため、Ａ５４
９細胞を５００ｎＭのＰＤＢｕで１８時間処理し、洗浄
してＰＤＢｕを除去した後、オリゴヌクレオチドおよび
ＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥ陽イオン性リポソームで処理し
た。４時間後に培地を置き換え、さらに２０時間放置し
て細胞を回復させた。蛋白質を抽出し、実施例３に記載
したように、イムノブロッティングによりＰＫＣ−α蛋
白質レベルを決定した。結果はホスファーイメージャー
（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｓｕｎｎｙ
ｖａｌｅ ＣＡ）で定量化し、図２に対照（食塩水処
理）のパーセントとして示されている。ＩＳＩＳ４６４
９（配列ＩＤ番号：３；四角）は５００ｎＭでＰＫＣ−
α蛋白質レベルを８５−９０％減少させ、約２６０ｎＭ
のＩＣ５０を有していた。
【００７７】実施例６ ＰＫＣ−α ｍＲＮＡレベルに
対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの効果：Ａ５４
９細胞を、陽イオン性脂質ＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥ存在
下、５００ｎＭのホスホロチオエートオリゴヌクレオチ
ドで４時間処理し、洗浄後さらに２０時間放置して回復
させた。全ＲＮＡを抽出し、２０μｇを各々１．２％ゲ
ルで分離してナイロン膜に移した。これらのブロット
は、32Ｐ放射性標識ＰＫＣ−α ｃＤＮＡプローブで探
査したのちこれを取り出し、等量のＲＮＡが充填された
ことを確認するため放射性標識Ｇ３ＰＤＨプローブで再
探査した。各々のオリゴヌクレオチド（３５２０、３５
２１、３５２２および３５２７）を用いて二重に試験し
た。二つの主要なＰＫＣ−α転写産物（８．５ｋｂおよ
び４．０ｋｂ）を調べ、ホスファーイメージャー（Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌ
ｅ ＣＡ）で定量化した。結果は図３に示されている。
オリゴヌクレオチド３５２１（配列ＩＤ番号：２）、３
５２２（配列ＩＤ番号：３）および３５２７（配列ＩＤ
番号：５）は、ＰＫＣ−α ｍＲＮＡレベルの５０％よ
り大きな減少を与えた。オリゴヌクレオチド３５２１お
よび３５２７は小さい方の転写産物の約８０％の減少お
よび大きい方の転写産物の９０％を超える減少を与え
た。
【００７８】実施例７ キメラ（デオキシギャップ）
２’−Ｏ−メチル オリゴヌクレオチド：オリゴヌクレ
オチド３５２１（配列ＩＤ番号：２）、３５２２（配列
ＩＤ番号：３）および３５２７（配列ＩＤ番号：５）を
さらなる研究および修飾のために選択した。これらの配
列を有するオリゴヌクレオチドを、２’−Ｏ−メチル化
領域が隣接し、中心に種々の長さのデオキシギャップを
有する均一なホスホロチオエートキメラオリゴヌクレオ
チドとして合成した。これらのオリゴヌクレオチド（５
００ｎＭ濃度）のＰＫＣ−α ｍＲＮＡレベルに及ぼす
影響をノーザンブロット分析により試験した。結果は図
４に示されている。８ヌクレオチドまたはそれ以上のデ
オキシギャップは全ての場合においてＰＫＣ−α ｍＲ
ＮＡレベル（両方の転写産物とも）の最大の減少を与え
た。配列ＩＤ番号：３を有するオリゴヌクレオチドは４
ヌクレオチドのデオキシギャップ長で約８３％ＰＫＣ−
α ｍＲＮＡを減少させ、６またはそれ以上のデオキシ
ギャップ長でＰＫＣ−α ｍＲＮＡをほとんど完全に消
滅させた。
【００７９】これらのオリゴヌクレオチドの用量応答曲
線が図５に示されている。４または５のヌクレオチドデ
オキシギャップを有する２’−Ｏ−メチル キメラオリ
ゴヌクレオチドは、２００−２５０ｎＭのＰＫＣ−α
ｍＲＮＡ減少に対するＩＣ５０（ＰＫＣ−α ｍＲＮＡ
レベルの５０％減少を与えるのに必要なオリゴヌクレオ
チド濃度）を有し、完全デオキシオリゴヌクレオチド
（すべてを通してホスホロチオエート）も同様であっ
た。８ーヌクレオチドデオキシギャップを有する２’−
Ｏ−メチル キメラオリゴヌクレオチドは約８５ｎＭの
ＩＣ５０を有していた。
【００８０】このキメラオリゴヌクレオチド（配列ＩＤ
番号：３）のいくつかの変異体についてＰＫＣ−α ｍ
ＲＮＡレベルを下げる能力を比較した。これらのオリゴ
ヌクレオチドは表７に示されている。
【００８１】
【表７】
【００８２】これらのオリゴヌクレオチドのＰＫＣ−α
ｍＲＮＡレベルに及ぼす影響は図６に示されている。
オリゴヌクレオチド７００８、３５２２および５３５２
がＰＫＣ−α ｍＲＮＡの減少を示し、５３５２が最も
活性であった。
【００８３】配列ＩＤ番号：３を有する一連の２’−Ｏ
−プロピルキメラオリゴヌクレオチドを合成した。これ
らのオリゴヌクレオチドは表８に示されている。
【００８４】
【表８】
【００８５】これらの２’−Ｏ−プロピルキメラオリゴ
ヌクレオチドを２’−Ｏ−メチルキメラオリゴヌクレオ
チドと比較した。オリゴヌクレオチド７２７３および７
２９４はその２’−Ｏ−メチル対応物よりもＰＫＣ−α
ｍＲＮＡレベルを低下させることにおいてより活性で
あった。このことは図７および８に示されている。
【００８６】実施例８ ＰＫＣ−α ｍＲＮＡを減少さ
せるその他のオリゴヌクレオチド：ヒトＰＫＣ−α
３’非翻訳領域を標的とする別のホスホロチオエートオ
リゴヌクレオチドを設計し合成した。これらの配列は表
９に示されている。
【００８７】
【表９】
【００８８】図９に示したように、オリゴヌクレオチド
６６３２、６６５３、７０８２および７０８３は最も強
くＰＫＣ−α ｍＲＮＡレベルを減少させた。
【００８９】実施例９ ヒトＡ５４９肺腫瘍細胞の培養 ヒト肺癌腫細胞株Ａ５４９はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐ
ｅ ＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｂｅｔｈｅ
ｓｄａ ＭＤ）から入手した。細胞は１ｇｍグルコース
／リットルおよび１０％ウシ胎児血清（Ｉｒｖｉｎｅ
Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｒｖｉｎｅ ＣＡ）を含むダ
ルベッコ改良イーグル培地（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎ
ｔｉｆｉｃ）で増殖させた。細胞はマウスに導入するた
め、トリプシン処理し、洗浄して同一の培地に再懸濁し
た。
【００９０】実施例１０ ヌードマウスにおけるヒトＡ
５４９腫瘍細胞の増殖に対するＩＳＩＳ３５２１の効
果：２００μｌのＡ５４９細胞（５ｘ１０6細胞）をヌ
ードマウスの内腿の皮下に移植した。配列ＩＤ番号：２
を有するホスホロチオエートオリゴヌクレオチドＩＳＩ
Ｓ３５２１を、腫瘍細胞接種後１週間目から始めて週に
２度４週間投与した。オリゴヌクレオチドは、陽イオン
性脂質（ＤＭＲＩＥ／ＤＯＰＥ）で処方し、腫瘍の付近
に皮下で投与した。オリゴヌクレオチド用量は５ｍｇ／
ｋｇであった（６０ｍｇ／ｋｇの陽イオン性脂質ととも
に）。腫瘍サイズは週毎に記録した。
【００９１】図１０に示したように、３匹のマウス中２
匹で腫瘍の増殖はほぼ完全に阻止され、３匹目のマウス
でも対照に比べて減少していた。このＩＳＩＳ３５２１
による腫瘍増殖の阻害は統計的に有意である。対照オリ
ゴヌクレオチド（ＩＳＩＳ１０８２）はＰＫＣ ｍＲＮ
Ａ標的と有意な配列相同性を有しない２１−ｍｅｒのホ
スホロチオエートオリゴヌクレオチドである。
【００９２】その腫瘍がすでに検出可能なサイズに達し
ているマウスへのオリゴヌクレオチドの投与は、続く腫
瘍増殖に対して識別可能な効果を示さなかった。
【００９３】実施例１１ ヌードマウスにおけるヒトＭ
ＤＡ−ＭＢ２３１腫瘍の増殖に対するアンチセンスオリ
ゴヌクレオチドの効果：ＭＤＡ−ＭＢ２３１ヒト乳癌腫
細胞はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ
Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ ＭＤ）から
入手した。連続的に移植されたＭＤＡ−ＭＢ２３１腫瘍
をヌードマウスの皮下に確立した。２週間後から、オリ
ゴヌクレオチド３５２１および３５２７（配列ＩＤ番
号：５を有するホスホロチオエートオリゴヌクレオチ
ド）の食塩水溶液を６０ｍｇ／ｋｇおよび６ｍｇ／ｋｇ
の用量で１４日間毎日静脈内投与した。対照オリゴヌク
レオチドＩＳＩＳ１０８２もこれらの用量で投与し、対
照食塩水も同様に投与した。腫瘍増殖速度をオリゴヌク
レオチド投与の２週間にわたってモニターした。図１１
に示したように、両方のＰＫＣ−αオリゴヌクレオチド
（３５２１および３５２７）は、６０ｍｇ／ｋｇおよび
６ｍｇ／ｋｇの用量で腫瘍細胞増殖を有意に阻害した。
対照オリゴヌクレオチド（ＩＳＩＳ１０８２）もまた腫
瘍増殖をいくらか減少させたが、この効果は高用量にお
いてもアンチセンスオリゴヌクレオチドより効果が少な
く、低用量ではほとんど効果がなかった。６ｍｇ／ｋｇ
および０．６ｍｇ／ｋｇの同一のオリゴヌクレオチドを
用いてより低い用量での研究を行った。ＩＳＩＳ３５２
１は０．６ｍｇ／ｋｇで腫瘍増殖を有意に減少させた。
ＩＳＩＳ３５２７もこの濃度で腫瘍増殖を阻害したが、
この結果は統計的に有意ではなかった。
【００９４】実施例１２ マウスにおけるマウスルイス
肺癌腫増殖に対するオリゴヌクレオチドの効果：連続的
に移植されたマウスルイス肺癌腫をマウスで確立した。
オリゴヌクレオチド３５２１および３５２７を６ｍｇ／
ｋｇおよび０．６ｍｇ／ｋｇの用量で１４日にわたり毎
日静脈内に投与した。オリゴヌクレオチド投与の２週間
の間、腫瘍増殖速度をモニターした。予想されたごと
く、ヒトＰＫＣ配列を標的とするこれらのオリゴヌクレ
オチドは、マウス由来腫瘍に対しては有意な効果を有し
ていなかった。
【００９５】実施例１３ ヘアレスマウスにおける内在
性ＰＫＣ−α発現に対するアンチセンスオリゴヌクレオ
チドＩＳＩＳ４１８９の効果：正常動物における内在性
ＰＫＣ−α ｍＲＮＡレベルに対するオリゴヌクレオチ
ド効果を調べるためには、マウスＰＫＣ−αに相補的な
オリゴヌクレオチドを用いる必要があった。ＩＳＩＳ４
１８９はマウスＰＫＣ−αのＡＵＧコドンを標的とする
２０−ｍｅｒホスホロチオエートオリゴヌクレオチドで
ある。この領域はヒトＰＫＣ配列と相同性がなく、この
オリゴヌクレオチドはヒト細胞におけるＰＫＣ−αの発
現に何の影響も与えない。ＩＳＩＳ４１８９はＣ１２７
マウス乳上皮細胞におけるｍＲＮＡ減少に対し２００ｎ
ＭのＩＣ５０を有している。食塩水溶液中のＩＳＩＳ４
１８９を、１、１０または１００ｍｇ／ｋｇ体重の濃度
でヘアレスマウスの腹腔に投与した。７日間にわたり毎
日投与した。肝臓、腎臓、脾臓、肺および皮膚からの組
織をとり、ＰＫＣ−α ｍＲＮＡおよび蛋白質レベルを
決定した。また、肝臓、腎臓および肺の標本について、
組織病理学的調査を行った。ＩＳＩＳ４１８９は、１０
０ｍｇ／ｋｇでマウス肝臓における内在性ＰＫＣ−α
ｍＲＮＡレベルを対照（食塩水）の１０−１５％まで阻
害した。
【００９６】実施例１４ ヒトＰＫＣ−ηと相補的なア
ンチセンスオリゴヌクレオチドのスクリーニング：ヒト
ＰＫＣ−ηと相補的な一連の２０−ｍｅｒホスホロチオ
エートオリゴヌクレオチドを合成した。これらのオリゴ
ヌクレオチドを、５００ｎＭの濃度で、ノーザンブロッ
トアッセイを使用し、ヒトＡ５４９細胞でのＰＫＣ−η
ｍＲＮＡレベルを減少させる能力についてスクリーニ
ングした。オリゴヌクレオチド配列は表１０に示されて
おり、結果は図１２に示されている。
【００９７】
【表１０】
【００９８】オリゴヌクレオチド６４３２、６４４３、
６４３１、６４４２、６４３５、６４３４、６４４５、
６５５３、６５８１および６６０３はＰＫＣ−η ｍＲ
ＮＡレベルを５０％以上減少させた。最も強力なオリゴ
ヌクレオチドはＩＳＩＳ６５８１（３’非翻訳領域を標
的とする）およびＩＳＩＳ６４４５（コーディング領域
を標的とする）であり、このアッセイにおいてＰＫＣ
ｍＲＮＡをほとんど完全に失わせた。
【００９９】実施例１５ ヒトＰＫＣ−ζと相補的なア
ンチセンスオリゴヌクレオチドのスクリーニング：ヒト
ＰＫＣ−ζと相補的な一連の２０−ｍｅｒホスホロチオ
エートオリゴヌクレオチドを実施例１に記載したように
合成した。標的配列源はＧｅｎｂａｎｋＨＳＰＫＣＺ
座、受託番号Ｚ１５１０８（Ｈｕｇ，Ｈ．）であった。
これらのオリゴヌクレオチドを、５００ｎＭの濃度で、
ノーザンブロットアッセイを使用して実質的に実施例６
に記載されているごとく、ヒトＡ５４９細胞でのＰＫＣ
−ζｍＲＮＡレベルを減少させる能力についてスクリー
ニングした。オリゴヌクレオチド配列およびスクリーニ
ングの結果は表１１に示されている。
【０１００】
【表１１】
【０１０１】この実験において、オリゴヌクレオチド９
００７、９００８、９０１１、９０１２、９０１３、９
０１５、９０１７、９０１８、９０２０、９０２１、９
０２２、９０２３、９０２４、９０２５、９０２８およ
び９０２９がｍＲＮＡレベルの少なくとも５０％の阻害
を示し、現在のところ好適である。
【０１０２】実施例１６ ヒトＰＫＣ−εと相補的なア
ンチセンスオリゴヌクレオチドのスクリーニング：ヒト
ＰＫＣ−εと相補的な一連の２０−ｍｅｒホスホロチオ
エートオリゴヌクレオチドを実施例１に記載したように
合成した。標的配列源はＧｅｎｂａｎｋＨＳＰＫＣＥ
座、受託番号Ｘ６５２９３（Ｂｕｒｎｓら）であった。
これらのオリゴヌクレオチドを、５００ｎＭの濃度で、
ノーザンブロットアッセイを使用して実質的に実施例６
に記載されているごとく、ヒトＡ５４９細胞でのＰＫＣ
−εｍＲＮＡレベルを減少させる能力についてスクリー
ニングした。オリゴヌクレオチド配列およびスクリーニ
ングの結果は表１２に示されている。
【０１０３】
【表１２】
【０１０４】この実験において、オリゴヌクレオチド７
９４２、７９４４、７９４５、７９４６および７９４８
がｍＲＮＡレベルの少なくとも４０％の阻害を示し、現
在のところ好適である。
【０１０５】実施例１７ ヒトＰＫＣαの３’非翻訳領
域のＤＮＡシークエンシング Ａ５４９細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔ
ｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｍ
Ｄから入手）を６ーウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ Ｌ
ａｂｗａｒｅ，Ｌｉｎｃｏｌｎ Ｐａｒｋ，ＮＪ）を用
い、１ｇグルコース／リットルおよび１０％ウシ胎児血
清（ＦＣＳ，Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｓ
ａｎｔａ Ａｎａ，ＣＡ）を含むダルベッコ改良イーグ
ル培地（ＤＭＥ）中でコンフルエントになるまで増殖さ
せた。細胞を集め、常法を用いて全ＲＮＡを単離した。
Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．および
Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ（１９８９）．Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎ
ｕａｌ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ ＨａｒｂｏｒＬａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏ
ｒ，Ｎ．Ｙ．，７章。
【０１０６】ｃＤＮＡはＦｒｏｈｍａｎらの３’ＲＡＣ
Ｅ技術を用いてＲＮＡから作製し［Ｆｒｏｈｍａｎ，
Ｍ．Ａ．，Ｄｕｓｈ，Ｍ．Ｋ．およびＧ．Ｒ．Ｍａｒｔ
ｉｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：８９９８−９００２］、３’Ｒ
ＡＣＥキットはＧｉｂｃｏ／ＢＲＬ（Ｂｅｔｈｅｓｄ
ａ，ＭＤ）から入手した。ｃＤＮＡの第一の鎖の作製に
はオリゴｄＴプライマーを使用した。続くポリ（Ａ）テ
イルの部位からの増幅には、キットで提供されたオリゴ
ヌクレオチドまたは同一のオリゴヌクレオチド（ＩＳＩ
Ｓ ５５８６；配列ＩＤ番号：１０７：5'-GGCCACGCGTC
GACTAGTACTTTTTTTTTTTTTTTTT-3'）を使用した。既知の
配列の内部からの増幅にはＩＳＩＳ６２８８を使用した
（配列ＩＤ番号：１０８：5'-GGGGTAGAATGCGGCGGCAGTAT
GAAACTCACCAGCG-3'）。ＰＣＲ反応で生じたＤＮＡをゲ
ルで精製し、ＳａｌＩおよびＢｃｌＩで消化した後、常
法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）を用いてＢｌｕｅ
ｓｃｒｉｐｔプラスミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ
Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）内へクローン化した。クローン化
ＤＮＡを、ＵＳＢからのＳｅｑｕｅｎａｓｅキットを用
いて配列決定した。
【０１０７】既知の配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ｘ５
２４７９）の３’末端に近いＢｃｌＩ部位から最もしば
しば得られているポリアデニル化の部位までの得られた
新規配列はヌクレオチド５６ー１１３６として図１３に
示されている。この部位はショート（４ｋｂ）ＰＫＣα
メッセンジャーの３’末端であると考えられる。
【０１０８】この配列を伸長し、それによりロングＰＫ
Ｃαメッセンジャー（８．５ｋｂ）に特異的な配列を得
るため、インバースＰＣＲ技術を用いた。Ｏｃｈｍａ
ｎ，Ｈ．，Ｇｅｒｂｅｒ，Ａ．Ｓ．およびＤ．Ｌ．Ｈａ
ｒｔｌ（１９８８）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １２０：６２１
−６２３。この技術を、組のプライマーおよび制限酵素
を用いて３回実施した。各々の回で約２００塩基の新し
い配列が生じた；全体の新規配列（配列ＩＤ番号：１０
４）は図１３にボールド体（ヌクレオチド１１３７−１
８１２）で示されている。この配列は、以前に報告され
たＰＫＣα ｃＤＮＡ配列の末端近くのＢｃｌＩ部位
（ＴＧＡＴＣＡ）から始まって３’の方向に伸びるかた
ちで示されている。Ｆｉｎｋｅｎｚｅｌｌｅｒら、Ｎｕ
ｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８：２１８３（１９９
０）；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ｘ５２４７９。ヌクレオ
チド５６から始まる新しく決定された配列には下線が付
けてある（配列ＩＤ番号：１０５）。ショート（４ｋ
ｂ）ｍＲＮＡ転写産物の３’末端と考えられるポリアデ
ニル化の最も共通な部位はヌクレオチド１１３６であ
る。この部位から下流の配列（従ってロングメッセンジ
ャーに独特である）はボールド体で示されている（配列
ＩＤ番号：１０６）。
【０１０９】実施例１８ ＰＫＣαの３’ＵＴＲ中の新
規配列を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド 実施例１７に記載したようにして得られた新規配列に相
補的である一連のホスホロチオエートアンチセンスオリ
ゴヌクレオチドを設計し合成した。これらのオリゴヌク
レオチドを、処置開始２４時間後でのＡ５４９細胞にお
けるＰＫＣαＲＮＡの減少または除去を起こさせる能力
に基づいてスクリーニングした。Ａ５４９細胞を陽イオ
ン性脂質ＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥ存在下、５００ｎＭのホ
スホロチオエートオリゴヌクレオチドで４時間処理し、
洗浄後さらに２０時間放置して回復させた。全ＲＮＡを
抽出し、２０μｇを各々１．２％ゲルで分離してナイロ
ン膜に移した。これらのブロットは、32Ｐ放射性標識Ｐ
ＫＣ−α ｃＤＮＡプローブで探査したのちこれを取り
出し、等量のＲＮＡが充填されたことを確認するため放
射性標識Ｇ３ＰＤＨプローブで再探査した。二つの主要
なＰＫＣ−α転写産物（８．５ｋｂおよび４．０ｋｂ）
を調べ、ホスファーイメージャー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ ＣＡ）で定
量化した。オリゴヌクレオチドおよびその活性は表１３
に示されている。
【０１１０】
【表１３】
【０１１１】ＩＳＩＳ７９１１（配列ＩＤ番号：１１
７）はこの予備的な実験において、ＰＫＣα ｍＲＮＡ
レベル（ロングおよびショートメッセンジャーの両方）
を対照と比較して５０％減少させた。従ってこのオリゴ
ヌクレオチドは好適である。より詳細な分析により、Ｉ
ＳＩＳ７９１１は処置の最初の６時間の間にロング
（８．５ｋｂ）メッセンジャーの量を選択的に減少さ
せ、処置後３時間の時点では４倍の選択性で減少させる
ことが示された。ＩＳＩＳ７９１１処置の１２時間後に
は、両方のメッセンジャーレベルは８０％を超えて減少
していた。経時変化のデータは図１４に示されている。
【０１１２】
【配列表】
配列番号: 1: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 20 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 1: CCCCAACCAC CTCTTGCTCC 20 配列番号: 2: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 20 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 2: GTTCTCGCTG GTGAGTTTCA 20 配列番号: 3: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 20 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 3: AAAACGTCAG CCATGGTCCC 20 配列番号: 4: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 20 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 4: GGATTCACTT CCACTGCGGG 20 配列番号: 5: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 20 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 5: GAGACCCTGA ACAGTTGATC 20 配列番号: 6: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 20 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 6: CCCGGGAAAA CGTCAGCCAT 20 配列番号: 7: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 20 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 7: CTGCCTCAGC GCCCCTTTGC 20 配列番号: 8: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 20 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 8: AGTCGGTGCA GTGGCTGGAG 20 配列番号: 9: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 20 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 9: GCAGAGGCTG GGGACATTGA 20 配列番号: 10: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 20 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 10: GGGCTGGGGA GGTGTTTGTT 20 配列番号: 11: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 20 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 11: CACTGCGGGG AGGGCTGGGG 20 配列番号: 12: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 20 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 12: AGCCGTGGCC TTAAAATTTT 20 配列番号: 13: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 20 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 13: ATTTTCAGGC CTCCATATGG 20 配列番号: 14: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 20 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 14: AAGAGAGAGA CCCTGAACAG 20 配列番号: 15: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 20 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 15: GATAATGTTC TTGGTTGTAA 20 配列番号: 16: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 20 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 16: ATGGGGTGCA CAAACTGGGG 20 配列番号: 17: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 20 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 17: GTCAGCCATG GTCCCCCCCC 20 配列番号: 18: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 20 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 18: CGCCGTGGAG TCGTTGCCCG 20 配列番号: 19: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 20 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 19: TCAAATGGAG GCTGCCCGGC 20 配列番号: 20: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 20 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 20: TGGAATCAGA CACAAGCCGT 20 配列番号: 21: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 20 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 21: CATCTTGCGC GCGGGGAGCC 20 配列番号: 22: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 20 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 22: TGCGCGCGGG GAGCCGGAGC 20 配列番号: 23: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 20 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 23: CGAGAGGTGC CGGCCCCGGG 20 配列番号: 24: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 20 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 24: CTCTCCTCGC CCTCCGTCGG 20 配列番号: 25: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 20 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 25: TGGAGTTTGC ATTCACCTAC 20 配列番号: 26: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 20 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 26: AAAGGCCTCT AAGACAAGCT 20 配列番号: 27: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 20 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 27: GCCAGCATGT GCACCGTGAA 20 配列番号: 28: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 20 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 28: ACACCCCAGG CTCAACGATG 20 配列番号: 29: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 20 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 29: CCGAAGCTTA CTCACAATTT 20 配列番号: 30: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 20 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 30: ACTTAGCTCT TGACTTCGGG 20 配列番号: 31: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 20 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 31: ATGCTGCGGA AAATAAATTG 20 配列番号: 32: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 20 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 32: ATTTTATTTT GAGCATGTTC 20 配列番号: 33: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 20(B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 33: TTTGGGGATG AGGGTGAGCA 20 配列番号: 34: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 20 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 34: CCCATTCCCA CAGGCCTGAG 20 配列番号: 35: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 20 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 35: CGGAGCGCGC CAGGCAGGGA 20 配列番号: 36: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 20 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 36: CCTTTTCCCA GACCAGCCAT 20 配列番号: 37: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 20 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 37: GGCCCCAGAA ACGTAGCAGG 20 配列番号: 38: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 20 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 38: GGATCCTGCC TTTCTTGGGG 20 配列番号: 39: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 20 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 39: CAGCCATGGC CCCAGAAACG 20 配列番号: 40: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 20 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 40: CGACATGCCG GCGCCGCTGC 20 配列番号: 41: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 20 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 41: CAGACGACAT GCCGGCGCCG 20 配列番号: 42: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 20 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 42: GCCTGCTTCG CAGCGGGAGA 20 配列番号: 43: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 20 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 43: ACAGGTGCAG GAGTCGAGGC 20 配列番号: 44: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 20 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 44: GTCCCGTCTC AGGCCAGCCC 20 配列番号: 45: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 20 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 45: CCTCACCGAT GCGGACCCTC 20 配列番号: 46: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 20 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 46: ATTGAACTTC ATGGTGCCAG 20 配列番号: 47: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 20 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 47: TCTCACTCCC CATAAGGCTA 20 配列番号: 48: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 20 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 48: TTCCTTTGGG TTCTCGTGCC 20 配列番号: 49: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 20 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 49: TTCCATCCTT CGACAGAGTT 20 配列番号: 50: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 20 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 50: AGGCTGATGC TGGGAAGGTC 20 配列番号: 51: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 20 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 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TTGGGGGTGG GGGGAGGCCT CAAAATACCG ACTGCGTCCA 300 TTCTCTGCCT CCATGGAAAC AGCCCCTAGA ATCTGAAAGG CCGGGATAAA CCTAATCACT 360 GTTCCCAAAC ATTGACAAAT CCTAACCCAA CCATGGTCCA GCAGTTACCA GTTTAAACAA 420 AAAAAACCTC AGATGAGTGT TGGGTGAATC TGTCATCTGG TACCCTCCTT GGTTGATAAC 480 TGTCTTGATA CTTTTCATTC TTTGTAAGAG GCCAAATCGT CTAAGGACGT TGCTGAACAA 540 GCGTGTGAAA TCATTTCAGA TCAAGGATAA GCCAGTGTGT ACATATGTTC ATTTTAATCT 600 CTGGGAGATT ATTTTTCCAT CCAGGGTGCC ATCAGTAATC ATGCCACTAC TCACCAGTGT 660 TGTTCGCCAA CACCCACCCC CACACACACC AACATTTTGC TGCCTACCTT GTTATCCTTC 720 TCAAGAAGCT GAAGTGTACG CCCTCTCCCC TTTTGTGCTT ATTTATTTAA TAGGCTGCAG 780 TGTCGCTTAT GAAAGTACGA TGTACAGTAA CTTAATGGAA GTGCTGACTC TAGCATCAGC 840 CTCTACCGAT TGATTTTCCT CCCTTCTCTA GCCCTGGATG TCCACTTAGG GATAAAAAGA 900 ATATGGTTTT GGTTCCCATT TCTAGTTCAC GTTGAATGAC AGGCCTGGAG CTGTAGAATC 960 AGGAAACCCG GATGCCTAAC AGCTCAAAGA TGTTTTGTTA ATAGAAGGAT TTTAATACGT1020 TTTGCAAATG CATCATGCAA TGAATTTTGC ATGTTTATAA TAAACCTTAA TAACAAGTGA1080 ATAGAAGGAT TTTAATACGT TTTGCAAATG CATCATGCAA TGAATTTTGC ATGTTTATAA1140 TAAACCTTAA TAACAAGTGA ATCTATATTA TTGATATAAT CGTATCAAGT ATAAAGAGAG1200 TATTATAATA ATTTTATAAG ACACAATTGT GCTCTATTTG TGCAGGTTCT TGTTTCTAAT1260 CCTCTTTTCT AATTAAGTTT TAGCTGAATC CCTTGCTTCT GTGCTTTCCC TCCCTGCACA1320 TGGGCACTGT ATCAGATAGA TTACTTTTTA AATGTAGATA AAATTTCAAA AATGAATGGC1380 TAGTTTACGT GATAGATTAG GCTCTTACTA CATATGTGTG TGTATATATA TGTATTTGAT1440 TCTACCTGCA AACAAATTTT TATTGGTGAG GACTATTTTT GAGCTGACAC TCCCTCTTAG1500 TTTCTTCATG TCACCTTTCG TCCTGGTTCC TCCGCCACTC TTCCTCTTGG GGACAACAGG1560 AAGTGTCTGA TTCCAGTCTG GCCTAGTACG TTGGTACACA CGTGGCATTG CGCAGCACCT1620 GGGCTGACCT TTGTGTGTAG CGTGTGTGTG TGTTTCCTTC TTCCCTTCAG CCTGTGACTG1680 TTGCTGACTC CAGGGGTGGG AGGGATGGGG AGACTCCCCT CTTGCTGTGT GTACTGGACA1740 CGCAGGAAGC ATGCTGA 1757 配列番号:106: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 676 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 二本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (ii) 配列の種類: DNA (genomic) (xi) 配列: SEQ ID NO:106: TAGAAGGATT TTAATACGTT TTGCAAATGC ATCATGCAAT GAATTTTGCA TGTTTATAAT 60 AAACCTTAAT AACAAGTGAA TCTATATTAT TGATATAATC GTATCAAGTA TAAAGAGAGT 120 ATTATAATAA TTTTATAAGA CACAATTGTG CTCTATTTGT GCAGGTTCTT GTTTCTAATC 180 CTCTTTTCTA ATTAAGTTTT AGCTGAATCC CTTGCTTCTG TGCTTTCCCT CCCTGCACAT 240 GGGCACTGTA TCAGATAGAT TACTTTTTAA ATGTAGATAA AATTTCAAAA ATGAATGGCT 300 AGTTTACGTG ATAGATTAGG CTCTTACTAC ATATGTGTGT GTATATATAT GTATTTGATT 360 CTACCTGCAA ACAAATTTTT ATTGGTGAGG ACTATTTTTG AGCTGACACT CCCTCTTAGT 420 TTCTTCATGT CACCTTTCGT CCTGGTTCCT CCGCCACTCT TCCTCTTGGG GACAACAGGA 480 AGTGTCTGAT TCCAGTCTGG CCTAGTACGT TGGTACACAC GTGGCATTGC GCAGCACCTG 540 GGCTGACCTT TGTGTGTAGC GTGTGTGTGT GTTTCCTTCT TCCCTTCAGC CTGTGACTGT 600 TGCTGACTCC AGGGGTGGGA GGGATGGGGA GACTCCCCTC TTGCTGTGTG TACTGGACAC 660 GCAGGAAGCA TGCTGA 676 配列番号: 107: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 37 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: no (xi) 配列: SEQ ID NO:107: GGCCACGCGT CGACTAGTAC TTTTTTTTTT TTTTTTT 37 配列番号: 108: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 37 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: no (xi) 配列: SEQ ID NO: 108: GGGGTAGAAT GCGGCGGCAG TATGAAACTC ACCAGCG 37 配列番号: 109: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 20 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 109: CAGTGCCCAT GTGCAGGGAG 20 配列番号: 110: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 20 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 110: AGAACCTGCA CAAATAGAGC 20 配列番号: 111: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 20 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 111: AGAAACAAGA ACCTGCACAA 20 配列番号: 112: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 20 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 112: GCAAGGGATT CAGCTAAAAC 20 配列番号: 113: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 20 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 113: AGGGAGGGAA AGCACAGAAG 20 配列番号: 114: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 20 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 114: TCAGCTCAAA AATAGTCCTC 20 配列番号: 115: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 20 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 115: CGAAAGGTGA CATGAAGAAA 20 配列番号: 116: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 20 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 116: GGCGGAGGAA CCAGGACGAA 20 配列番号: 117: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 20 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 117: GCAATGCCAC GTGTGTACCA 20 配列番号: 118: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 20 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 118: TGCAAAACGT ATTAAAATCC 20 配列番号: 119: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 20 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 119: TTATAAACAT GCAAAATTCA 20
【図面の簡単な説明】
【図１】図１（ａ）は、ＰＫＣ−αとハイブリダイズし
うるアンチセンスオリゴヌクレオチドの、ＰＫＣ発現に
対する効果をグラフで表したものである。オリゴヌクレ
オチドはＰＫＣ標的領域の５’から３’に配置される。
【図２】図１（ｂ）は、ＰＫＣ−αとハイブリダイズし
うるアンチセンスオリゴヌクレオチドの、ＰＫＣ発現に
対する効果をグラフで表したものである。オリゴヌクレ
オチドはＰＫＣ標的領域の５’から３’に配置される。
【図３】図２は、Ａ５４９細胞をオリゴヌクレオチドで
処理した後のＰＫＣ−α蛋白質レベルの用量依存性減少
を示す線グラフである。▼＝ＩＳＩＳ ４６３２；（黒
四角）＝ＩＳＩＳ ４６４９；●＝ＩＳＩＳ ４６３
６；▲＝ＩＳＩＳ ４６４８。
【外１】
【図４】図３は、Ａ５４９細胞をオリゴヌクレオチドで
処理した後のＰＫＣ−α ｍＲＮＡの減少を示す棒グラ
フである。斜線を付けた棒は８．５ｋｂ転写産物を表
し、白抜きの棒は４．０ｋｂ転写産物を表す。
【図５】図４は、デオキシギャップの長さとキメラオリ
ゴヌクレオチドのＰＫＣに対する活性との間の関係を示
す線グラフである。
【図６】図５は、異なるデオキシギャップ長さを有する
キメラオリゴヌクレオチド（すべて配列番号３）の用量
依存曲線を示す線グラフである。
【図７】図６は、配列番号３のいくつかの２’−Ｏ−メ
チルキメラオリゴヌクレオチドの、ＰＫＣ−α ｍＲＮ
Ａレベルに及ぼす影響を示す棒グラフである。斜線を付
けた棒は８．５ｋｂ転写産物を表し、白抜きの棒は４．
０ｋｂ転写産物を表す。
【図８】図７は、配列番号３のいくつかの２’−Ｏ−メ
チルおよび２’−Ｏ−プロピルキメラオリゴヌクレオチ
ド（６９９６、７２７３）の、ＰＫＣ−α ｍＲＮＡレ
ベルに及ぼす影響を示す棒グラフおよび図表である。斜
線を付けた棒は８．５ｋｂ転写産物を表し、白抜きの棒
は４．０ｋｂ転写産物を表す。
【図９】図８は、配列番号３の別の２’−Ｏ−メチルお
よび２’−Ｏ−プロピルキメラオリゴヌクレオチド（７
００８、７２９４）の、ＰＫＣ−α ｍＲＮＡレベルに
及ぼす影響を示す棒グラフおよび図表である。斜線を付
けた棒は８．５ｋｂ転写産物を表し、白抜きの棒は４．
０ｋｂ転写産物を表す。
【図１０】図９は、別のオリゴヌクレオチドの、ＰＫＣ
−α ｍＲＮＡレベルに及ぼす影響を示す一組の棒グラ
フである。図９Ａは、オリゴヌクレオチド６６３２、６
６５３および６６６５を示す。斜線を付けた棒は８．５
ｋｂ転写産物を表し、白抜きの棒は４．０ｋｂ転写産物
を表す。
【図１１】図９は、別のオリゴヌクレオチドの、ＰＫＣ
−α ｍＲＮＡレベルに及ぼす影響を示す一組の棒グラ
フである。図９Ｂは、オリゴヌクレオチド３５２１（比
較のため）、７０８２、７０８３および７０８４を示
す。斜線を付けた棒は８．５ｋｂ転写産物を表し、白抜
きの棒は４．０ｋｂ転写産物を表す。
【図１２】図１０は、ＩＳＩＳ３５２１の抗腫瘍活性を
示す線グラフである。それぞれの破線は、対照オリゴヌ
クレオチドで処理した１匹の動物の腫瘍体積を表し、そ
れぞれの実線は、ＩＳＩＳ３５２１で処理した１匹の動
物の腫瘍体積を表す。
【図１３】図１１は、ヌードマウスにおけるヒトＭＤＡ
−ＭＢ２３１腫瘍の成長に及ぼすオリゴヌクレオチドの
影響を示す一組の線グラフである。図１１Ａは、ＩＳＩ
Ｓ３５２１について得られた結果を示す。それぞれの線
は１匹の動物における腫瘍体積を表す。●＝対照；〇＝
オリゴヌクレオチド、６０ｍｇ／ｋｇ；△＝オリゴヌク
レオチド、６ｍｇ／ｋｇ。
【図１４】図１１は、ヌードマウスにおけるヒトＭＤＡ
−ＭＢ２３１腫瘍の成長に及ぼすオリゴヌクレオチドの
影響を示す一組の線グラフである。図１１ＢはＩＳＩＳ
３５２７について得られた結果を示す。それぞれの線は
１匹の動物における腫瘍体積を表す。●＝対照；〇＝オ
リゴヌクレオチド、６０ｍｇ／ｋｇ；△＝オリゴヌクレ
オチド、６ｍｇ／ｋｇ。
【図１５】図１２は、Ａ５４９細胞におけるＰＫＣ−η
発現に及ぼす２０ｍｅｒホスホロチオエートオリゴヌク
レオチドの影響を示す棒グラフである。
【図１６】図１３は、ヒトＰＫＣα遺伝子の３’−非翻
訳領域の一部の、先に知られている配列の３’末端に近
いＢｃｌＩ部位から始まり、３’方向に伸ばしたヌクレ
オチド配列（配列番号１０４）である。新たに決定され
た配列は、ヌクレオチド５６から始まり、下線が施され
ている（配列番号１０５）。太字の配列は、ＰＫＣαの
ロングｍＲＮＡ転写産物に独特である（配列番号１０
６）。
【図１７】図１４は、オリゴヌクレオチド７９１１（配
列番号１１７）で処理した後の細胞におけるＰＫＣα
ｍＲＮＡレベル（対照のパーセントとして表す）の経時
変化を示す線グラフである。ショートｍＲＮＡ転写産物
およびロングｍＲＮＡ転写産物の両方のレベルが示され
ている。ショートｍＲＮＡ転写産物のレベルは実線で示
される。ロングｍＲＮＡ転写産物のレベルは破線で示さ
れる。ＩＳＩＳ７９１１（配列番号１１７）処理から１
２時間後までに、両方のメッセンジャーのレベルは８０
％以上減少した。
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｐ 43/00 １１１ Ｃ０７Ｈ 21/00 Ｃ０７Ｈ 21/00 Ｃ１２Ｑ 1/48 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/48 1/68 Ａ 1/68 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/50 Ｚ 33/50 33/53 Ｍ 33/53 33/566 33/566 33/573 Ａ 33/573 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ // Ｃ１２Ｎ 5/10 5/00 Ｂ (72)発明者 ボッグズ，ラッセル・ティー アメリカ合衆国カリフォルニア州92007, カーディフ−バイ−ザ−シー，オックス フォード・アベニュー 2317 (72)発明者 ディーン，ニコラス・エム アメリカ合衆国カリフォルニア州92007, カーディフ，ニューキャッスル・アベニ ュー 2319 (56)参考文献 国際公開93−20101（ＷＯ，Ａ１) Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏ ｌ．216，Ｎｏ．２，ｐｐ．597−606 （Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ 1993) Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃ ｈ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ, Ｖｏｌ．１，Ｎｏ．１，ｐｐ．35−42 （1991) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 C12Q 1/68 ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (12)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 配列番号６３、配列番号６４、配列番号
    ６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７１、配
    列番号７３、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７
    ７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列
    番号８１、配列番号８４または配列番号８５に規定され
    る配列を含む、５０までのヌクレオチド単位の長さを有
    するオリゴヌクレオチド。
  2. 【請求項２】 オリゴヌクレオチドのヌクレオチド単位
    間の糖間結合の少なくとも１つがホスホロチオエートで
    ある、請求項１記載のオリゴヌクレオチド。
  3. 【請求項３】 ヌクレオチドの少なくとも１つが糖の
    ２’位に修飾を含む、請求項１記載のオリゴヌクレオチ
    ド。
  4. 【請求項４】 キメラオリゴヌクレオチドである、請求
    項１記載のオリゴヌクレオチド。
  5. 【請求項５】 細胞または組織中の蛋白質キナーゼＣ−
    ζの発現を調節する方法であって、細胞または組織を、
    請求項１のオリゴヌクレオチドと接触させることを含む
    方法。
  6. 【請求項６】 試料中の蛋白質キナーゼＣ−ζをコード
    する核酸分子の存在を検出する方法であって、試料を、
    請求項１のオリゴヌクレオチドと接触させ、そしてハイ
    ブリダイゼーションを検出することを含む方法。
  7. 【請求項７】 蛋白質キナーゼＣ−ζの発現に関連する
    状態を治療する方法であって、ヒトを除く動物を有効量
    の請求項１のオリゴヌクレオチドと接触させることを含
    む方法。
  8. 【請求項８】 該状態が過増殖性状態である、請求項７
    の方法。
  9. 【請求項９】 蛋白質キナーゼＣ−ζに関連する状態を
    診断する方法であって、該状態を有すると疑われるヒト
    を除く動物からの細胞、組織または体液を、in vitro
    またはex vivoで、請求項１のオリゴヌクレオチドと接
    触させ、そしてハイブリダイゼーションを検出すること
    を含む方法。
  10. 【請求項１０】 該状態が過増殖性状態である、請求項
    ９の方法。
  11. 【請求項１１】 ある状態に関連する蛋白質キナーゼＣ
    −ζの存在をスクリーニングする方法であって、該状態
    を有すると疑われる動物からの細胞、組織または体液
    を、in vitro またはex vivoで、請求項１のオリゴヌク
    レオチドと接触させ、そしてハイブリダイゼーションを
    検出することを含む方法。
  12. 【請求項１２】 該状態が過増殖性状態である、請求項
    １１の方法。
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