HU206136B - Process for producing macrolide compounds and pharmaceutical compositions comprising such compounds as active ingredient - Google Patents

Description

(57) KIVONAT

A találmány tárgya eljárás az (1) általános képletű új, antibiotikus hatású vegyületek és sóik előállítására ahol az (1) képletben

R jelentése α-L-oleandrozil vagy 4’-(a-L-oleandrozil)-a-L-oleandrozil csoport,

R¹ metil-, etil- vagy izopropilcsoportot jelent;

X jelentése -CHj- vagy E-konfigurációjú >C=NOR⁷ csoport - ahol

R⁷ jelentése 1-4 szénatomos alkilcsoport

R⁴ jelentése hidroxil- vagy 1-4 szénatomos alkoxicsoport oly módon, hogy egy (2) általános képletű vegyűletet a Streptomyces avermitilis ATCC 31272 és/vagy 31780 deponálási számú mikroorganizmus törzsek, ezek mutánsai és/vagy variánsai, és/vagy az ezekből kinyerhető enzimek jelenlétében inkubálunk, majd kívánt esetben R⁴ helyén 1-4 szénatomos alkoxicsoportot tartalmazó (1) általános képletű vegyület előállítása +g egy kapott R⁴ helyén hidroxilcsoportot tartalmazó vegyűletet étereznek, és/vagy kívánt esetben sót képeznek.

A leírás terjedelme: 14 oldal (ezen belül 3 lap ábra)

HU 206 136 Β

A találmány tárgya új eljárás új makrolid vegyületek, valamint ilyen vegyűleteket hatóanyagként tartalmazó készítmények előállítására.

Közelebbről, a jelen találmány egyik tárgya eljárás az (1) általános képletű vegyületek és sóik előállítására.

Az (1) képletben

R jelentése α-L-oleandrozil vagy 4’-(cx-L-oleandroziI)-ct-L-oloeandroziI csoport,

R¹ jelentése metil-, etil- vagy előnyösen izopropilcsoport

X jelentése -CH₂- vagy E konfigurációjú >C=NOR⁷ csoport - ahol R⁷ jelentése 1-4 szénatomos alkilcsoport

R⁴ jelentése hidroxil- vagy 1-4 szénatomos alkoxicsoport.

Az R⁷ csoport 1-4 szénatomos alkilcsoportként, metil-, etil-, η-propil-, izopropil-, η-butil-, izobutil- vagy terc-butil-csoport lehet, előnyösen metilcsoport.

Az (1) általános képletű vegyületekben R¹ előnyösen izopropilcsoportot jelent.

Az (1) általános képletű vegyületek fontos alcsoportját alkotják azok a származékok, amelyekben X >C=NOCH₃ csoportot jelent.

Az (1) általános képletű vegyületeknek egy másik fontos alcsoportját alkotják azok a származékok, amelyekben R⁴ jelentése hidroxil- vagy metoxicsoport.

Hatásosság szempontjából figyelemre méltók azok a találmány szerinti vegyületek, amelyekben:

R jelentése 4’-(a-L-oleandrozil)-a-L-oleandrozilcsoport,

R¹ izopropilcsoportot,

X ONOCHi csoportot és R⁴ hidroxilcsoportot jelent vagy

R jelentése 4’-(a-L-oleandrozil)-a-L-oleandrozilcsoport, R¹ izopropilcsoportot, X -CH₂-csoportot és R⁴ hidroxilcsoportot jelent.

A találmány szerinti vegyületek antibiotikus hatással rendelkeznek: így például anthelmintikus hatásuk van, és hatásosak például fonálférgek, különösen belső és külső paraziták ellen. A találmány szerinti vegyületek továbbá közbenső termékekként alkalmazhatók más, aktív vegyületek előállítása során.

A találmány szerinti vegyületek antibiotikus hatása kimutatható például szabadon élő fonálférgek - például Caernorhabditis elegáns - elleni hatásukkal in vitro kísérletekben (lásd a 197046 lajstromszámú magyar szabadalmi leírásban ismertetett vizsgálati módszer).

A külső és belső paraziták (ektoparaziták és endoparaziták) mind az embereket, mind számos állatot fertőznek, és különösen elterjedtek a tenyésztett állatok, például sertés, juh, szarvasmarha, kecske és baromfifajták (például csirkék és pulykák), lovak, nyulak, szárnyasvadak, továbbá a kalitkába zárt madarak és háziállatok - például kutyák, macskák, tengerimalacok és hörcsögök - között. Az állatállomány parazitás fertőzése - amely vérszegénységhez, alultápláltsághoz és súlyveszteséghez vezet - világszerte nagy gazdasági károkat okoz.

Ezeket az állatokat és/vagy embereket fertőző endoparazitákra példaként az alábbi nemzetségeket nevezzük meg:

Ancylostoma, Ascaridia, Ascaris, Aspicularis, Brugia, Bunostomum, Capillaria, Chabertia, Cooperia, Dictyocaulus, Dirofilaria, Dracunculus, Enterobius, Haemonchus, Heterakis, Loa, Necator, Nematodirus, Nematospiroides (Heligomoroides), Nippostrongylus, Oesophagostomum, Onchocerca, Ostertagia, Oxyuris, Parascaris, Stomgylus, Strongyloides, Syphacia, Toxascaris, Toxocara, Trichonema, Trichostrongylus, Trichinella, Trichuris, Triodontophorus, Uncinaria és Wuchereria.

Az állatokat és/vagy embereket fertőző endoparazitákra példaképpen megemelítjük az ízeltlábú külső parazitákat, így a szúrórovarokat, amilyen a dongó, bolha, tetű, atkák; valamint a szívórovarokat, kullancsokat és egyéb, a Dipterák rendjébe tartozó kártevőket.

Az állatokat és/vagy embereket fertőző ilyen ektoparazitákra példaként megemlítjük a következőket:

Ambylomma, Boophilus, Chorioptes, Culliphore, Demodex, Damalinia, Dermatobia, Gastrophilus, Haematobia, Haematopinus, Haemophysalis, Hyaloma, Hypoderma, Ixodes, Linignathus, Lucilia, Melophagus, Oestrus, Otobius, Otodectes, Psorergates, Psoroptes, Rhipicephalus, Sarcoptes, Stomoxys és Tabanus.

Az (1) általános képletű vegyületek felhasználhatók továbbá rovarok, atkák és fonálférgek leküzdésére a mezőgazdaságban, kertészetben, erdőgazdaságban, a közegészségügy területein és raktározott termékekben. A találmány szerinti vegyületekkel a talaj és a termények kártevői (beleértve a gabonaneműek - például búza, árpa, kukorica és rizs kártevőit), továbbá a növényi eredetű termékek (például szója), gyümölcsök (például alma, szőlő és citrusfélék) és gyökértermések (például cukorrépa, burgonya) kártevői célszerűen kezelhetők. A találmány szerinti vegyületek különösen hatásosak az alábbi gyümölcsatkák és levéltetvek ellen: Aphis fabae, Aulacorthum circumflexum, Myzus persieae, Nephotettix cincticeps, Nilparvata lugens, Panonychus ulmi, Phorodon humuli, Phyllocoptruta oleivora, Tetranychus urticae; továbbá a Trialeuroides nemzetséghez tartozó kártevők; fonálférgek, így az Aphelencoides, Globodera, Heterodera, Meoidogyne és a Panagrellus nemzetséghez tartozó férgek; a Heliothis, Plutella és Sodoptera nemzetséghez tartozó lepkeszárnyúak; az Anthonomus grandis és Sitophilus granarius fajtájú zsizsikfélék; különféle lisztkártevők, így például a Tribolium castaneum; legyek, például a házilégy (Musca domestica); hangyák; levélpusztító kártevők; Pear psylla, Thrips tabaci; csótányfélék, így a Blatella germanica és Periplaneta americana; valamint szúnyogfélék, például az Aedes aegypti.

A találmány révén tehát lehetővé válik az (1) általános képletű vegyületek előállítása és antibiotikumokként való alkalmazása. A találmány szerinti vegyületek elsősorban endoparaziíák, ektoparaziták és/vagy gombák által előidézett fertőzések kezelésére alkalmazhatók mind embereken, mind állatokon; felhasználhatók továbbá a mezőgazdaságban, kertészetben és erdőgazdaságban peszticidekként rovarok, különösen atkák és fonálférgek leküz2

HU 206 136 Β désére. A találmány szerinti vegyületek továbbá általánosan is alkalmazhatók peszticidekként más körülmények között, kártevők leküzdésére vagy irtására, például raktárakban, lakóépületekben, nyilvános helyeken vagy a kártevők tartózkodási helyén. A találmány szerinti vegyületeket általában a gazdaállatokon (állatokon, embereken, növényeken vagy más vegetációkban), vagy a kártevőkön, vagy a kártevők tartózkodási helyén alkalmazhatjuk (juttathatjuk ki).

Adagolás céljára a találmány szerinti vegyületeket bármilyen célszerű módon formulázhatjuk (készítménnyé alakíthatjuk), amely az ember- vagy állatgyógyászati alkalmazásra megfelelő; a találmány azoknak a gyógyászati készítményeknek az előállítására is vonatkozik, amelyek hatóanyagként egy találmány szerinti vegyületet gyógyászati szempontból elfogadható vivő- hígító- és más segédanyagokkal összekeverve tartalmaznak, és ember- vagy állatgyógyászati felhasználásra alkalmasak.

E készítményeket a szokásos módon egy vagy több vivő- és segédanyag alkalmazásával állíthatjuk elő. A találmány szerinti vegyűletekből parenterálisan (beleértve az emlőn át történő adagolást), orálisan, rektálisan (végbélen át), topikusan alkalmazható, továbbá beültetéssel (implantációval), szemben végzett adagolással, orron át történő adagolással vagy a vizeleti-genitális csatornában alkalmazható gyógyszerfoimákat állíthatunk elő.

Az (1) általános képletű vegyületeket az ember- és állatgyógyászatban történő alkalmazás céljára a 2166436 számú nagy-britanniai szabadalmi leírásban ismertetett általános módszerek segítségével alakíthatjuk készítményekké.

A találmány szerinti vegyületeket mind az ember-, mind az állatgyógyászatban célszerűen 1-2000 pg/testtömegkg (az alábbiakban röviden gg/kg, előnyösen 50-1000 gg/kg napi dózisban adagolhatjuk; e mennyiség adagolását több részre elosztva, például naponta 1-4 alkalommal végezhetjük.

Állatgyógyászatban kívánatos lehet a hatóanyagot tartalmazó fermentlevet teljes egészében alkalmazni. Célszerű lehet továbbá a szárított fermentlé alkalmazása (a micéliummal együtt) vagy a fermentlétől elkülönített micélium alkalmazása, vagy még előnyösebben a permetezéssel, fagyasztással vagy forgódobban szárított, pasztörizált fermentlé felhasználása. Kívánt esetben a fermentlevet vagy a micéliumot a szokásos közömbös vivőanyagokkal, töltőanyagokkal vagy hígítószerekkel készítményekké alakíthatjuk.

A találmány szerinti antibiotikus hatású vegyületeket más hatóanyagokkal kombinálva is alkalmazhatjuk: e célra különösen más, antibiotikus hatású vegyületek alkalmasak. Ez az eset állhat fenn például akkor, ha a teljes fermentlevet alkalmazzuk a találmány szerinti vegyületek előzetes elkülönítése nélkül.

A találmány szerinti vegyületek előállítását az alábbiakban ismertetjük, és ennek során R¹, R⁴, X jelentése ugyanaz, mint amelyet fentebb az (1) általános képlet esetére megadtunk, ha erre vonatkozóan külön megjegyzést nem teszünk.

A találmány tárgya tehát eljárás az (1) általános képletű vegyületek és sóik előállítására - ahol az (1) általános képletben

R jelentése α-L-oleandrozil- vagy 4’-(a-L-oleandrozil)-ct-L-oleandrozil csoport,

R¹ metil-, etil- vagy izopropilcsoport

X jelentése -CH₂- vagy E konfigurációjú > C=NOR⁷-csoport - ahol

R⁷ jelentése 1-4 szénatomos alkilcsoport R⁴ jelentése hidroxil- vagy 1-4 szénatomos alkoxicsoport- oly módon, hogy egy (2) általános képletű vegyületet a Streptomyces avermitilis ATCC 31272 és/vagy 31780 deponálási számú mikroorganizmus törzsek, ezek mutánsai és/vagy variánsai és/vagy az ezekből kinyerhető enzimek jelenlétében inkubálunk, majd kívánt esetben R⁴ helyén 1-4 szénatomos alkoxicsoportot tartalmazó (1) általános képletű vegyületek előállításán egy kapott, R⁴ helyén hidrogénatomot tartalmazó vegyületet éterezünk.

A találmány szerinti eljárásban célszerűen alkalmazható mikroorganizmusokat és azok kivonatait előzetes, kis léptékű vizsgálatokkal azonosíthatjuk, azon képességük kimutatása céljából, hogy a (2) általános képletű vegyületeket (1) általános képletű vegyületekké képesek-e átalakítani. Az (1) általános képletű vegyületek képződését a reakcióelegy megfelelő kromatográfiás elemzésével [például túlnyomás folyadékkromatográfiával (HPLC)] igazolhatjuk.

A találmány szerinti eljárásban igen célszerűen alkalmazhatók például a Streptomyces avermitilis ATCC 31272 és Streptomyces avermitilis ATCC 31780 valamint ezek mutánsai.

A fentebb felsorolt törzsek mutánsai keletkezhetnek spontán módon, vagy több módszerrel előállíthatók, amelyeket a 2166436 számú nagy-britanniai szabadalmi leírásban ismertettek.

A találmány szerinti eljárás egyik előnyös kiviteli módja szerint egy (2) általános képletű vegyületet úgy alakítunk (1) általános' képletű vegyületté, hogy a (2) általános képletű vegyületet például valamilyen oldószerben oldva tápláljuk a fentebb említett mikroorganizmust tartalmazó fermentációs közegbe asszimilálható szén- és nitrogénforrás, valamint ásványi sók jelenlétében. Asszimilálható szén- és nitrogénforrásként, valamint ásványi anyagok forrásaként egyszerű vagy összetett tápanyagokat alkalmazhatunk. Szénforrásként általában glükóz, maltóz, keményítő, glicerin, melasz, dextrin, laktóz, szaccharóz, fruktóz, karbonsavak, aminosavak, gliceridek, alkoholok, alkánok és növényi olajok alkalmazhatók. A szénforrást a fermentációs közegre vonatkoztatva általában 0,5-10 tömeg% mennyiségben alkalmazzuk.

Nitrogénforrásként általában szójababliszt, kukoricáié, desztilláló berendezésekből származó oldható anyagok, élesztőkivonat, gyapotmagliszt, peptonok, őrölt mogyoróliszt, malátakivonat, melasz, kazein, aminosavkeverékek, ammónia (gázalakban vagy oldatban), ammóniumsók és nitrátok alkalmazhatók; használhatunk továbbá karbamidot vagy más amidokat is.

HU 206 136 Β

A nitrogénforrást a fermentációs közegre vonatkoztatva általában 0,1-10 tömeg% mennyiségben alkalmazzuk.

Ásványi sókként általában olyan sókat alkalmazunk, amelyek a nátrium-, kálium-, ammónium-, vas-, magnézium-, cink-, nikkel-, kobalt-, mangán-, vanádium-, króm-, kalcium-, réz-, molibdén-, bór-, foszfát-, szulfát-, klorid- és karbonátion-szükségletet képesek biztosítani.

A fermentációs közeg hatásának meggátlására habzásgátló szert alkalmazhatunk, amelyet a kívánt időközökben adunk a közeghez.

Az adagolás során a (2) általános képletű vegyület oldására alkalmazhatók: valamilyen vízzel elegyedő szerves oldószer (például valamilyen alkohol, így metanol vagy izopropanol, valamilyen diói, így 1,2-propándiol vagy 1,3-butándiol); valamilyen keton, például aceton vagy valamilyen nitril (például acetonitril); valamilyen éter (például tetrahidrofurán vagy dioxán); szubsztituált savamid (például dimetil-formamid); vagy' valamilyen dialkil-szulfoxid (például dimetilszulfoxid). A (2) általános képletű vegyület oldatát adagolhatjuk a tenyésztés kezdetén vagy általánosabban akkor, ha a mikroorganizmus szaporodása már folyamatban van, például a tenyésztés kezdete után 2-4 nappal.

A mikroorganizmus tenyésztését általában 2050 °C, előnyösen 25-40 °C hőmérsékleten, kívánt esetben levegőztetés és keverés közben, például rázással vagy keveréssel végezzük. Eljárhatunk úgy, hogy a közeget előbb a spóraképző mikroorganizmus szuszpenziójának csekély mennyiségével oltjuk be, abból a célból, hogy a késedelmet elkerüljük, a mikroorganizmusból vegetatív inokulumot állíthatunk elő úgy, hogy a tenyésztőközeg kis mennyiségét a mikroorganizmus spóraalakjával oltjuk, és az így kapott vegetatív inokulumot visszük át a fermentációs közegbe; vagy még előnyösebben egy vagy több inokulumot tovább hagyunk szaporodni, mielőtt a fermentációs közegbe átvisszük. A fermentációt általában 4,0-9,5, előnyösen 5,5-8,5 pH-értéken végezzük.

A (2) általános képletű vegyületeknek a tenyésztéshez való hozzáadása után - amit általánban enyhe keveréssel végzünk - folytatjuk a tenyésztést a kívánt termék mennyiségének növelése céljából. A termék jelenlétét a fermentlében úgy állapíthatjuk meg, hogy a fermentlé kivonatát HPLC útján, valamint UV spektroszkópiával 238 nm hullámhossz mellett vizsgáljuk.

A termék (termékek) elkülönítését és elválasztását a teljes fermentléből a szokásos elkülönítési és elválasztási módszerekkel végezhetjük, amelyeket a 2166436 és 2176182 számú nagy-britanniai szabadalmi leírásokban közöltek.

A találmány szerinti eljárás egy másik előnyös kiviteli módja szerint egy (2) általános képletű vegyületet úgy alakíthatunk (1) általános képletű vegyületté, hogy a (2) általános képletű vegyületet alkalmas oldószerben (például egy, a fentiekben meghatározott, vízzel elegyedő szerves oldószerben) egyesítjük és inkubáljuk egy találmány szerinti enzimkészítménnyel és egy megfelelő cukorral, kívánt esetben pufferoldatban, például 0-60 °C, előnyösen 20-40 °C, például körülbelül 28 °C hőmérsékleten. E reakciót általában 3,5-8,5 például 5,5-7,5 közötti pH-intervallumban játszatjuk le. Ha a reakció teljessé vált, azaz ha a (2) általános képletű vegyület találmány szerinti vegyületté való konverziója leállt - ezt úgy állapítjuk meg, hogy a reakcióelegyből készített kivonatokat HPLC és 238 nm hullámhosszon végzett UV spektroszkópia útján megvizsgáljuk - akkor a terméket a szokásos izolálási és elkülönítési módszerekkel nyerjük ki, amelyeket a 2166 436 és 2176182 számú nagy-britanniai szabadalmi leírásokban ismertettek.

A találmány szerinti eljárásban alkalmazható enzimet, például olyan mikroorganizmus tenyészetéből állíthatjuk elő, amely a tápközegben termeli az enzimet. Az e célra alkalmas tápközeget és az enzim előállítására alkalmazott fermentációs körülményeket a már előzőleg, az (1) általános képletű vegyületek (2) általános képletű vegyületekből mikroorganizmus jelenlétében történő előállítása során leírtaknak megfelelően választjuk meg. Az az időpont, amidőn a kívánt enzimaktivitás a maximumát eléri, természetesen változik az alkalmazott mikroorganizmusnak megfelelően, ezért a tenyésztés optimális idejét kívánatos egymástól függetlenül minden egyes alkalmazott törzs esetére meghatározni.

Az alkalmazott mikroorganizmusok esetében, ahol az enzim extracelluláris, az enzim forrásaként a folyékony tenyésztőközeget vagy az ép sejtek eltávolítása után kapott szűrletet alkalmazhatjuk. Ha az enzim sejthez kötött, akkor abból a szokásos módszerekkel például hangrezgések segítségével, üveggyöngyökkel együtt őrölve, homogenizálással, lítikus enzimekkel vagy detergensekkel kezelve a sejteknek megfelelő pufferoldatban való szuszpendálása után felszabadítható. Az így kapott készítmény - akár a sejttörmelékkel együtt, akár annak eltávolítása után - enzimforrásként alkalmazható. Előnyösen azonban úgy járunk el, hogy az enzimet a szokásos módszerekkel tovább tisztítjuk. E célra előnyösen alkalmazható szakaszos vagy oszlopkromatográfia, ioncserélő cellulózok vagy affinitást képviselő adszorbensek, vagy más adszorbensek, például hidroxil-apatit alkalmazásával. Ezenfelül az enzimet töményíthetjük, molekulaszitákkal, ultraszuréssel vagy kisózással tovább tisztíthatjuk. A tisztítási eljárások során általában kívánatos a pH értékét 3 és 11 között tartani.

Az enzimet immobilizált alakban is alkalmazhatjuk: például megfelelő mátrix alkalmazásával oldhatatlanná tehetjük, illetve a mátrixhoz köthetjük: például eljárhatunk úgy, hogy az enzimkivonatot egy egyébként közömbös (inért), szervetlen vagy szerves polimerhez kapcsoljuk, vagy valamilyen rostba foglaljuk, vagy valamilyen membránhoz vagy polimerhez, például poliakrilamid-gélhez kötjük; vagy ion cserélő gyantán adszorbeáljuk; valamilyen megfelelő reagenssel, például glutáraldehiddel térhálósítjuk; vagy burokkal fedjük, például gyöngy formává alakítjuk. Az immobilizált enzimek előnyösen alkalmazhatók mind a szakaszos eljá4

HU 206 136 Β rásokban, amelyek elvégzése után az enzimet ismét felhasználjuk, mind folyamatos üzemű eljárásokban, aminek során a szubsztrátumok az immobilizált enzimet tartalmazó oszlopon haladnak át.

A fermentációs eljárás egy különösen előnyös kiviteli módja szerint egy (1) általános képletű vegyület amelyben R⁴ hidroxilcsoportot jelent - célszerűen úgy állítunk elő, hogy egy megfelelő (2) általános képletű vegyületet alkalmas közegben, a konverzió végrehajtására alkalmas Streptomyces avermitilis törzs jelenlétében fermentálunk.

A (2) általános képletű vegyületeket úgy állíthatjuk elő, hogy egy (3) általános képletű vegyületet redukálunk, majd az adott esetben jelen lévő védőcsoportot (védőcsoportokat) eltávolítjuk.

E redukciót megfelelő redukálószer - például valamilyen bórhidrid, így alkálifém-[tetrahidrido-borát], például nátrium-[tetrahidrido-borát] vagy lítium-[tetrahidrido-borát] vagy lítium-[alkoxi-hidrido-aluminát] típusú vegyület, például lítium-[tributoxi-hidrido-aluminát] - segítségével végezzük.

A komplex bórhidriddel a redukciót oldószer, például valamilyen alkanol - így izopropanol vagy izobutanol -jelenlétében, célszerűen -30 °C és 80 °C közötti hőmérsékleten, például 0 °C-on végezzük. A komplex lítium-alkoxi-alumínium-hidrides redukciót éter-típusú oldószer jelenlétében, például tetrahidrofuránban vagy dioxánban, célszerűen -78 °C és 0 °C közötti hőmérséklettartományban, például -78 °C-on hajtjuk végre.

A (3) általános képletű közbenső termékek úgy állíthatók elő, hogy egy (4) általános képletű vegyületet amelyben R⁴ jelentése ugyanaz, mint az (1) általános képletben, azonban hidroxilcsoporttól eltérő - oxidálunk, majd az adott esetben jelen lévő védőcsoportot (védőcsoportokat) eltávolítjuk.

Ezt az oxidációs reakciót véghez vihetjük valamilyen dialkil-szulfoxiddal, például dimetil-szulfoxiddal valamilyen aktiválószer, például N,N’-diciklohexilkarbodiimid vagy valamilyen savhalogenid, például oxalil-klorid jelenlétében. E reakciót célszerűen alkalmas oldószerben, például halogénezett szénhidrogénben, így diklór-metánban -80 °C és 50 °C közötti hőmérséklettartományban játszatjuk le.

A (4) általános képletű közbenső termékeket az (5) általános képletű vegyületek oxidációjával állíthatjuk elő. E célra oxidálószerként például szelén-dioxidot alkalmazhatunk, előnyösen valamilyen aktíválószer, így valamilyen peroxid, például terc-butil-hidroperoxid jelenlétében. E reakciót célszerűen közömbös oldószer jelenlétében játszatjuk le, e célra alkalmas oldószerek: halogénezett szénhidrogének, például a diklór-metán, észterek, például az etil-acetát; vagy éterek, így a tetrahidrofurán. A reakciót 0 °C és 50 °C közötti hőmérséklettartományban, előnyösen szobahőmérsékleten hajtjuk végre.

A (4) általános képletű vegyületeket úgy is előállíthatjuk, hogy egy (5) általános képletű vegyületet egy fentebb említett oxidálószerrel hangyasavban 20100 °C közötti hőmérsékleten, például 60 °C-on kezelünk, majd az így kapott (6) általános képletű vegyületet savas körülmények között - például sósavval hídról izálva jutunk a (4) általános képletű vegyülethez.

Azokat a (6) általános képletű vegyületeket, amelyekben X >C=NOR⁷ általános képletű csoportot jelent, ahol R⁷ jelentése a fentiekben meghatározott, kívánt esetben úgy is előállíthatjuk, hogy egy megfelelő (6) általános képletű vegyületet - ahol X >C=O csoportot jelent - H₂NOR⁷ általános képletű reagenssel hozunk kölcsönhatásba.

Ezt az oximképző reakciót célszerűen -20 °C és 100 °C közötti hőmérsékleten, például -10 és 50 °C közötti hőmérséklettartományban végezzük. A H₂NOR⁷ általános képletű reagenst célszerűen valamilyen sója, például savaddíciós sója, így a hidrokloridja alakjában alkalmazzuk. Amennyiben sót alkalmazunk, akkor a reakciót savmegkötő szer jelenlétében játszatjuk le.

E reakcióhoz oldószerként alkalmazhatók: alkoholok, például metanol vagy etanol; amidok, például N,N-dimetil-formamid, Ν,Ν-dimetil-acetamid vagy hexametil-foszforsav-triamid; gyűrűs éterek, például tetrahidrofurán vagy dioxán; nyílt szénláncú éterek, így a dimetoxi-etán vagy a dietil-éter; nitrilek, például acetonitril; szulfonok, például szulfolán; szénhidrogének, például halogénezett szénhidrogének, így a diklór-metán; valamint két vagy több fenti oldószer keveréke. Társoldószerként vizet is alkalmazhatunk.

Ha vizet tartalmazó közegben dolgozunk, akkor a reakcióelegyet célszerűen megfelelő savval, bázissal vagy pufferoldattal pufferolhatjuk. E célra alkalmas savak például az ásványi savak, így a sósav és a kénsav, valamint karbonsavak, például az ecetsav. Megfelelő bázisok például az alkálifémek karbonátjai és hidrogén-karbonátjai, például a nátrium-hidrogén-karbonát; hidroxidok, például a nátrium-hidroxid; valamint karbonsavak alkálifémsói, így a nátrium-acetát. Pufferként célszerűen alkalmazhatunk ecetsavban oldott nátrium-acetátot.

Egy további találmány szerinti eljárás értelmében olyan (1) általános képletű vegyületeket, amelyekben R⁴ 1-4 szénatomos alkoxicsoportot jelent, úgy állíthatunk elő, hogy egy 5-hidroxi-vegyületet éterezünk. E reakciókat a 2176182 számú nagy-britanniai szabadalmi leírásban ismertetett általános módszerek alkalmazásával hajtjuk végre.

Az (1) általános képletű savak sóit a szokásos módszerekkel állíthatjuk elő például úgy, hogy a savat valamilyen bázissal keverjük, vagy a sav valamelyik sóját ioncserével egy másik sójává alakítjuk át.

A találmány szerinti eljárást az alábbi, nem korlátozó jellegű kiviteli példákban részletesen ismertetjük. E példákban azt az (5) általános képletű vegyületet, amelyben R* izopropilcsoportot, X (a) általános képletű csoportot jelent - amelyben R² jelentése hidroxilcsoport és R³ jelentése hidrogénatom - és R⁴ hidroxilcsoportot jelent, „A faktornak” nevezzük, és a találmány szerinti vegyületeket erre az A faktorra vonatkoztatva neveztük el. A hőmérséklet-értékeket Celsiusfokokban adtuk meg.

HU 206 136 Β

Az 1. számú közbenső termék:

13(R)-Hidroxi-23-dezoxi-(A faktor)-5-acetát előállítása 4,79 g 23-dezoxi-(A faktor)-5-acetátot (amely a 2176182 számú nagy-britanniai szabadalmi leírás 112. példája szerint állítható elő) keverés közben 416 mg szelén-dioxid és 5 ml 3 mólos diklór-metános terc-butil-hidroperoxid oldat 30 ml diklór-metánnal készült elegyéhez adunk, majd a reakcióelegyet 30 órán át szobahőmérsékleten keverjük, utána 200 ml etil-acetáttal hígítjuk, előbb vízzel, majd NaCl-oldattal mossuk, és vízmentes nátrium-szulfáton szárítjuk. Az oldószer lepárlása után kapott maradékot 250 g Merck 9385 jelű szilikagélből készült oszlopon tisztítjuk. Eluálószerként etil-acetát és petroléter 1:4 aránytól 1:2 arányig terjedő gradiensét alkalmazzuk, s így halványsárga, habszerű termékként 560 mg cím szerinti vegyületet kapunk.

v_[rax (CHBr₃) 3600, 3460 (OH), 1732 (OAc), 1712 (CO₂R) és 993 cm-¹ (C-O) ’H-NMR-színkép (CDC1₃, β ppm), 0,69 (3H, t, J 5

Hz), 2,15 (3H, s), 3,32 (1H, m), 3,72 (1H, d, J

Hz), 4,05 (1H, d, J 5 Hz), 5,52 (2H, m).

A 2. számú közbenső termék:

13-Oxo-23-dezoxi-(A faktor)-5-acetát előállítása 92 μΐ dimetil-szulfoxid és 1 ml diklór-metán oldatát 2 perc alatt -50 °C hőmérsékleten, nitrogén atmoszférában 57 μ! oxalil-klorid 2 ml diklór-metánnal készült oldatához csepegtetjük, majd 5 perc múlva 213 mg 1. számú közbenső tennék 3 ml diklór-metánnal készült oldatát csepegtetjük hozzá 2 perc alatt -50 °C hőmérsékleten. A reakcióelegyet 30 percig -50 °C és -45 °C közötti hőmérsékleten tartjuk, majd 453 μΐ trietil-amint adunk hozzá. 5 perc múlva a hűtőfürdőt eltávolítjuk, és a reakcióelegyet 30 perc alatt szobahőmérsékletre hagyjuk felmelegedni, majd 50 ml diklór-metán és 50 ml víz között megoszlatjuk. Elkülönítés után a vizes fázist 25 ml diklór-metánnal extraháljuk, és az egyesített szerves fázist előbb 75 ml 2 mólos sósavoldattal, utána 75 ml telített nátrium-hidrogén-karbonát oldattal, végül 75 ml NaCl-oldattal mossuk, és vízmentes nátrium-szulfáton szárítjuk. Az oldószer lepárlása után kapott maradékot 35 g Merck 9385 jelű szilikagélen „flash” kromatográfiának vetjük alá. Eluálószerként etil-acetát és petroléter 1:2 arányú elegyét használva fehér, habszerű termék alakjában 132 mg cím szerinti vegyületet kapunk, [a^= +256° (c-0,6 kloroformban).

Ή-NMR-színkép (CDC1₃, β ppm): 1,76 (3H, s), 1,82 (3H, s), 2,16 (3H, s), 3,40 (2H, m), 5,09 (1H, d, J 9

Hz), 5,52 (2H, m), 6,26 (1H, t, J 8 Hz).

A 3. számú közbenső termék:

13(S)-Hidroxi-23-dezoxi-(A faktor)-5-acetát előállítása

431 mg 2. számú közbenső termék és 15 ml etanol oldatához 0 °C-on 3,63 ml 0,2 mólos etanolos nátrium-[tetrahidrido-borát] oldatot csepegtetünk, a reakcióelegyet 30 percig 0 °C-on állni hagyjuk, majd etilacetáttal hígítjuk, 2 mólos sósav oldattal, utána telített nátrium-hidrogén-karbonát oldattal, majd NaCl-oldattal mossuk, és vízmentes nátrium-szulfáton szárítjuk. Az oldószer lepárlása után kapott maradékot 40 g Merck 9385 jelű szilikagélen „flash” kromatográfiának vetjük alá, eluálószerként etil-acetát és petroléter 1:3 arányú elegyét alkalmazzuk. így fehér, habszerű termék alakjában 368 mg cím szerinti vegyületet kapunk.

’H-NMR-színkép (CDC1₃, β ppm): 0,69 (3H, d, J 5 Hz), 0,92 (3H, d, J 6 Hz), 1,04 (3H, d, J 6 Hz), 1,17 (3H, d, J 6 Hz), 3,31 (1H, m), 4,00 (1H, s), 4,04 (1H, d, 5 Hz), 5,52 (2H, m).

A 4. számú közbenső termék: 13(S)-Hidroxi-23-dezoxi-(A faktor) előállítása mg 3. számú közbenső termék és 1 ml metanol oldatához 0 °C-on keverés közben 87 μΐ 1 mólos vizes nátrium-hidroxid oldatot adunk, a reakcióelegyet 90 percig 0 °C-on tartjuk, majd 25 ml etil-acetáttal, utána NaCl-oldattal mossuk, és vízmentes nátrium-szulfáton szárítjuk. Az oldószer lepárlása után kapott maradékot 10 g Merck 9385 jelű szilikagélen „flash” kromatográfiával tisztítjuk. Eluálószerként etil-acetát és petroléter 1:2 arányú elegyét alkalmazzuk. így fehér, habszerű termékként 31 mg cím szerinti vegyületet kapunk.

v_max (CHBr₃) 3540, 3460 (OH), 1704 cm-’ (CO₂R);

’H-NMR-színkép (CDC1₃, β ppm): 0,69 (3H, d, J 5 Hz), 0,95 (3H, d, J 6 Hz), 1,06 (3H, d, J 6 Hz), 1,18 (3H, d, J 6 Hz), 3,26 (1H, m), 3,96 (1H, d, J 5 Hz), 4,01 (2H, s), 4,29(1H, t,J5Hz).

Az 5. számú közbenső termék: 13(R)-(Formil-oxi)-23-oxo-(A faktor)-5-acetát előállítása 120 mg szelén-dioxid 1 ml hangyasavval készített szuszpenziójához 60 °C hőmérsékleten keverés közben 420 mg 23-oxo-(A fakor)-5-acetát (lásd a 2176182 számú nagy-britanniai szabadalmi leírás 18. példáját) 3 ml hangyasavval készült oldatát adjuk, a reakcióelegyet 6 percig 60 °C-on keverjük, majd 150 ml vízbe öntjük, és négyszer extraháljuk 50-50 ml dietil-éterrel. A szerves fázist vízmentes magnéziumszulfáton szárítjuk, és az oldószer lepárlása után kapott barna, szilárd maradékot nyomás alatt 100 g Merck Kieselgel 60 szilikagélből készített oszlopon (az adszorbens 230-400 mesh finomságú ) (azaz 230-400 lyukat tartalmaz 25,4 mm hosszon) tisztítjuk. Eluálószerként diklór-metán és etil-acetát 16:1 arányú elegyét alkalmazva krémszínű hab alakjában 103 mg cím szerinti vegyületet kapunk.

v_max (CHBr₃) 3480 (OH) és 1714 cm-' (észter és keton);

’H-NMR-színkép (CDCI₃, βρρπι): 0,86 (d, 6 Hz, 3H) 0,97 (d, 6 Hz, 3H), 1,07 (d, 6 Hz, 3H), 1,76 (s, 3H), 3,32 (m, 1H), 2,16 (s, 3H), 4,06 (d, 6 Hz, 1H), 5,02 (d, 10 Hz, 1H), 5,53 (m, 2H), 8,08 (s, 1H).

A 6. számú közbenső termék: 13(R)-(Formil-oxi)-23(E)-metoxi-imino)-(A faktor)5-acetát előállítása

HU 206 136 Β mg 5. számú közbenső termék és 8 ml metanol oldatához 29 mg metoxi-amin-hidroklorid és 33 mg nátrium-acetát 0,7 ml vízzel készült oldatát adjuk. A reakcióelegyet szobahőmérsékleten 3 órán át keverjük, majd 40 ml dietil-éterbe öntjük, és vízzel mossuk. A szerves fázist vízmentes magnézium-szulfáton szárítjuk, és az oldószert lepároljuk. így krémszínű hab alakjában 79 mg cím szerinti vegyületet kapunk. ‘H-NMR-színkép (CDC1₃, β ppm): 0,91 (d, 6 Hz, 3H),

0,97 (d, 6 Hz, 3H), 1,02 (d, 6 Hz, 3H), 1,07 (d, 6 Hz,

3H), 1,76 (s, 3H), 2,16 (s, 3H), m, 3,28 (d, 15 Hz,

IH), 1,91 (d, 15 Hz, IH), 3,32 (m, IH), 3,83 (s, 3H),

4,06 (d, 6 Hz, IH), 5,04 (d, 10 Hz, IH), 5,54 (m,

2H), 8,09 (s, IH).

A 7. számú közbenső termék:

13(R)-Hidroxi-23 (E)-(metoxi-imino)-(A faktor)-5acetát előállítása mg 6. számú közbenső termék és 5 ml metanol oldatához 0,1 ml 2 n sósavat adunk, az elegyet szobahőmérsékleten 4 órán át állni hagyjuk, majd 60 ml diklór-metánba öntjük, és előbb telített nátrium-hidrogén-karbonát oldattal, majd vízzel mossuk. A szerves fázist vízmentes magnézium-szulfáton szántjuk, utána az oldószert eltávolítjuk, és a habszerű maradékot közepes nyomás alatt 30 g 230-400 mesh finomságú (azaz 25,4 mm hosszon 230-400 lyukat tartalmazó) Merck Kieselgel 60 szilikagélen kromatografáljuk. Eluálószerként diklór-metán és etil-acetát 4:1 arányú elegyét alkalmazva fehér habszerű termék alakjában 39 mg cím szerinti vegyületet kapunk, [α²Δ = +126° (c=0,22 dildór-metánban). ‘H-NMR-színkép (CDC1₃, β ppm): 0,92 (d, 6 Hz, 3H),

0,96 (d, 6 Hz, 3H), 1,05 (d, 6 Hz, 3H), 1,12 (d, 6 Hz,

3H), 1,77 (s, 3H), 2,17 (s, 3H), 3,29 (d, 15 Hz, IH),

1,91 (d, 15 Hz, IH), 3,32 (m, IH) 3,70 (dd, 10,2 Hz,

IH), 3,83 (s, 3H), 4,04 (d, 6 Hz, IH), 5,54 (m, 2H).

A 8. számú közbenső termék:

13-Oxo-23(E)-(metoxi-imino)-(A faktor)-5-acetát előállítása

0,24 ml oxalil-klorid és 3,6 ml frissen desztillált diklór-metán oldatához nitrogéngáz alatt keverés közben -60 °C hőmérsékleten 0,4 ml dimetil-szulfoxid 3,6 ml frissen desztillált diklór-metánnal készült oldatát adjuk. Az oldatot -65 °C-ra hűtjük, majd 5 perc múlva 770 mg 7. számú közbenső termék és 6 ml diklór-metán oldatát adjuk hozzá. A hűtőfürdőt -60 °C-ra hagyjuk felmelegedni, és a reakcióelegyet további 30 percig -60 °C és -50 °C hőmérsékleten keverjük. Ekkor

1,5 ml trietil-amint teszünk hozzá, és utána szobahőmérsékletre hagyjuk felmelegedni, majd 100 ml diklórmetánba öntjük, és az oldószert vákuumban eltávolítjuk. A maradékhoz 60 ml dietil-étert adunk, és a trietilamin-sót leszűrjük. Az étert vákuumban eltávolítva habszerű terméket kapunk, amelyet közepes nyomás alatt 180 g 230-400 mesh finomságú (azaz 25,4 mm hosszúságú 230-400 lyukat tartalmazó) Merck Kieselgel 60 szilikagélen kromatografálunk. Eluálószerként diklór-metán és etil-acetát 14:1 arányú elegyét alkalmazva 450 mg drapp színű cím szerinti vegyületet kapunk.

‘H-NMR-színkép (CDC1₃, β ppm): 0,92 (d, 6 Hz, 3H),

0,96 (d, 6 Hz, 3H), 1,01 (d, 6 Hz, 3H), 1,18 (d, 6 Hz,

3H), 1,76 (s, 3H), 1,80 (s, 3H), 2,16 (s, 3H), 3,31 (d,

Hz, IH), 1,93 (d, 15 Hz, IH), 3,39 (m, IH) 3,84 (s, 3H), 4,08 (d, 6 Hz, IH), 5,54 (m, 2H), 6,22 (t, 9

Hz, IH).

A 9. számú közbenső termék:

13(S)-Hidroxi-23(E)-(metoxi-imino)-(A faktor)-5acetát előállítása

620 mg 8. számú közbenső termék és 25 ml etanol oldatához 0 °C-on keverés közben 4,9 ml 0,2 mólos etanolos nátrium-[tetrahídrido-borát] oldatot adunk, a reakcióelegyet 0 °C-on 30 percig keverjük, majd 400 ml etil-acetátba öntjük, és 2 n sósavval, utána telített nátrium-hidrogén-karbonát oldattal, vízzel és végül NaCl-oldattal mossuk. Szárítás után a szerves fázisból az oldószert eltávolítjuk, és a drapp habszerű anyagot közepes nyomás alatt 180 g 230-400 mesh (azaz 25,4 mm hosszúságú 230-400 lyukat tartalmazó) finomságú Merck Kieselgel 60 szilikagélből készült oszlopon kromatografáljuk. Eluálószerként diklór-metán és etil-acetát 10:1 arányú elegyét alkalmazva fehér, habszerű termék alakjában 502 mg cím szerinti vegyületet kapunk.

‘H-NMR-színkép (CDC1₃, β ppm): 0,92 (d, 6 Hz,

3H), 0,97 (d, 6 Hz, 3H), 1,05 (d, 6 Hz, 3H), 1,16 (d, 6 Hz, 3H), 1,76 (s, 3H), 2,16 (s, 3H), 3,29 (d,

Hz, IH), 1,91 (d, 15 Hz, IH), 3,32 (m, IH),

3,84 (s, 3H), 4,00 (széles s, IH), 4,06 (d, 6 Hz,

IH), 5,53 (m, 2H).

A10. számú közbenső termék:

13(S)-Hidroxi-23(E)-(metoxi-imino)-(A faktor) előállítása

291 mg 9. számú közbenső termék és 7 ml metanol oldatához keverés közben 0 °C hőmérsékleten 17 g nátrium-hidroxid 0,6 ml vízzel készült oldatát csepegtetjük, utána a reakcióelegyet 0 °C-on 2 órán át keverjük, majd 75 ml diklór-metánba öntjük, és utána kétszer mossuk 2 n sósavoldattal, majd vízzel és végül NaCl-oldattal. A szerves fázist vízmentes magnéziumszulfáton szárítjuk, és az oldószert lepároljuk. A krémszínű maradékot közepes nyomás alatt 80 g 230400 mesh finomságú (azaz 25,4 mm hosszúságú 230400 lyukat tartalmazó) Merck Kieselgel 60 szilikagélből készült oszlopon kromatografáljuk. Az eluálást diklór-metán és etil-acetát 4:1 arányú elegyével végezve fehér, habszerű termék alakjában jutunk a cím szerinti vegyülethez 228 mg hozammal.

Ή-NMR-szinkép (CDC1₃, β ppm): 0,91 (d, 6 Hz, 3H),

0,96 (d, 6 Hz, 3H), 1,05 (d, 6 Hz, 3H), 1,17 (d, 6 Hz,

3H), 1,88 (s, 3H), 3,29 (d, 15 Hz, IH), 1,92 (d, 15

Hz, IH), 3,27 (m, IH), 3,83 (s, 3H), 3,96 (d, 6 Hz,

IH), 4,00 (széles s, IH), 4,28 (t, 6 Hz, IH).

1. példa

250 ml-es rázólombikban lévő 25 ml „A közeget”

HU 206 136 Β

Streptomyces avermitilis ATCC 31272 törzzsel oltunk.

Az A közeg összetétele az alábbi:

g/liter

D-Glükóz 2,5

Maláta-dexíróz MD300E 25,0

Arka-szója50 125

Melasz 1,5

Kálium-dihidrogén-foszfát 0,125

Kalcium-karbonát 1,25

3-(4-Morfolinil)-propánszulfonsav 21,0

Desztillált víz amennyi szükséges

Autoklávozás előtt a pH értékét kénsavval 6,5-re állítjuk.

A lombikok tartalmát 28 °C hőmérsékleten percenként 250 fordulatszámú rázóasztalon 2 napig inkubáljuk, majd az így kapott 2 napos tenyészet 5 ml térfogatú részletét 50 ml-es rázólombikba helyezzük, és 50 pl 20 mg/ml koncentrációjú metanolos 13(S)-hidroxi-23(E)-(metoxi-imino)-(A faktor) oldatot adunk hozzá. A lombikot 28 °C-on rázóasztalon percenként 250 fordulatszámmal 5 napig inkubáljuk, majd azonos térfogatú metanolt adunk hozzá. Ezután a lombikot tartalmával együtt 1 órán át rázatjuk, utána a sejteket centrifugálással eltávolítjuk, és a felülúszó részt vákuumban 5 ml-re bepároljuk.

A minta 180 pl térfogatú részleteit 100 mm: 4,6 mm méretű Spherisorb 5S ODS-2 oszlopon frakcionáljuk, miközben 238 nm hullámhosszon detektálunk. Eluálószerként 3 ml/perc állandó áramlási sebességgel 1:1 arányú acetonitril-víz elegy („A” oldószer) és 65:35 arányú acetonitril-víz elegy („B” oldószer) keverékéből állandó grandiens oldószerrendszert alkalmazunk. Az eluálást 80% A oldószerből és 20% B oldószerből álló keverékkel kezdjük, és 10 perc múlva 100% B oldószert alkalmazunk. Minden egyes befecskendezésből összegyűjtjük az UV-abszoipciós csúcsokat, amelyek retenciós idejének a változatlan szubsztrátuméhoz viszonyított aránya 2,13 és 3,45 között van; egyesítjük azokat a csúcsokat, amelyek retenciós aránya azonos, és az utóbbiakat bepároljuk. így az alábbi vegyületekhez jutunk:

- (a) olyan (1) általános képletű vegyülethez, amelyben R jelentése 4’-(a-L-oleandrozil)-a-L-oleandrozilcsoport; R¹ izopropilcsoportot, X >C=NDCH₃ csoportot és R⁴ hidroxilcsoportot jelent; (retenciós aránya 2,13), jellemzője:

tömegszínkép (elektronütköztetéses) m/z: 907, 795, 764, 620, 618, 566, 476, 408, 376 és 145 (negatív Cl, NH₃); m/z 943 (M~), 925, 907 (pozitív Cl, NH₃); m/z (M⁺NH₄)⁺, 944 (MH)⁺; és

- (b) olyan (1) általános képletű vegyülethez amelyben: R jelentése 4’-(a-L-oleandrozil)-a-L-oleandrozilcsoport; R¹ izopropilcsoportot, X >C=NOCH₃ csoportot és R⁴ metoxicsoportot jelent (retenciós aránya 3,45), jellemzője:

tömegszínkép (elektronütköztetéses) m/z: 827, 814, 795, 764, 670, 651, 376, 275, 264, 263, 257, 145, 127, 113, 95 és 87 (negatív Cl, NH₃) m/z 957 (M~), 907 (M-H₂O-CH₃OH) (pozitív Cl, nH₃) m/z 975 (M⁺NH₄)⁺, 958 (MH)⁺.

2. példa

2x25 ml A közeget 250 ml-es rázólombikokban közvetlenül oltunk Streptomyces avermitilis ATCC 31780 törzzsel, majd a tenyésztést 28 °C-on rázóasztalon, percenként 250 fordulatszámmal 2 napon át végezzük,

E lombikok tartalmával 1,25 ml propilénglikol 2000-t tartalmazó 2,5 liter A közeget oltunk egy 3,5 liter térfogatú fermentorban. A tenyészetet 28 °C-on tartjuk, 250 fordulat/perc sebességgel keverjük, és 1,25 liter/perc sebeségű levegőárammal levegőztetjük. 2 nap múlva 25 ml metanolban oldott 234 mg 13(S)-hidroxi23-dezoxi-(A faktor)-t, majd 25 ml vízben oldott 30 mg szinefungint adunk hozzá, utána a keverés sebességét 500 fordulat/percre és a levegőztetés sebességét 2,5 liter/percre növeljük.

Négy nap múlva a fermentációs folyadékot centrifugáljuk, a felülúszót dekantáljuk, a sejteket 0,5 liter vízzel mossuk és ismét centrifugáljuk. A vizes mosófolyadékot a felülúszóhoz adjuk, s négyszer extraháljuk 250-250 ml etil-acetáttal. Az etil-acetátos kivonatokat egyesítjük, és vákuumban bepároljuk. így olajszerű maradékot kapunk. A sejteket metanollal extraháljuk, a metanolos kivonatokat egyesítjük, és négyszer mossuk 100 ml hexánnal, miközben minden alkalommal 100 ml vizet adunk hozzá; majd a vizes réteget háromszor extraháljuk 200 ml diklór-metánnal, és az egyesített diklór-metános fázist vákuumban bepároljuk. így olajszerű terméket kapunk. A felülúszó rész extrakciójáből kapott olajszerű terméket 25 ml acetonitrillel extraháljuk, az így kapott oldatot a sejtek extrakciójáből származó olajszerű termékhez adjuk és szűrjük. A szűrletet 26x2 cm méretű Sephadex LH20 oszlopra öntjük (acetonitrilben), és 50 ml előfrakció után 10 ml térfogatú frakciókat gyűjtjük. A

2-18. frakciókat egyesítjük, vákuumban bepároljuk, és az olajszerű maradékot 15 ml acetonitril és 1 ml víz elegyében oldva Spherisorb 5S ODS-2 oszlopon (méretre 25x2 cm) 7:3 arányú acetonitril-víz oldószereleggyel 25 ml/perc állandó áramlási sebességgel preparatív kromatográfiának vetjük alá. A detektálást 238 nm hullámhosszon végezzük. Az 1 ml-es befecskendezésekből származó, 43 és 46 perc között eluált frakciókat egyesítjük, egyenlő térfogatú vízzel hígítjuk, visszaszivattyúzzuk az oszlop tetejére, és acetonitrillel eluáljuk. Az acetonitrilt vákuumban lepárolva olajszerű terméket kapunk, amelyet 2 ml metanolban oldunk és 100 ml Sephadex LH20-ból (metanolban) készített oszlopon vezetünk át.

A v_nm 244 nm hullámhosszal jellemzett frakciókat egyesítjük, és vákuumban bepároljuk. Az olajszerű maradékot 4 ml acetonitrilben oldjuk, és frakcionáljuk (15 ml) egy 25x2 cm méretű Sephadex LH20 oszlopon. Az 5-10. frakciókat egyesítjük, vákuumban bepároljuk, a maradékhoz ciklohexánt és acetont adunk és liofilizáljuk. így olyan (1) általános képletű vegyülethez jutunk, amelyben R 4’-(a-L-oleandrozil)-a-L-oleandrozil-csoportot, R' izopropilcsoportot, X >CH₂ csoportot és R⁴ hidroxilcsoportot jelent. A termék színtelen, szilárd anyag, hozama 19,3 mg.

λ (metanol) 231,3 inf. (E¹,202), 240 inf. (E* 256),

HU 206 136 Β

244,6 (E',278), 250 nm inf. (Ej 206), (CHBr₃) 3570, 3550,1705,1040,980 cm¹.

¹³C-NMR-színkép (CDC1₃, β ppm, 125 MHz): 173,8,

139,5, 137,9, 137,8, 136,4, 134,6, 131,5 124,5

120,3, 118,4, 117,9, 98,4, 97,5, 94,5, 82,4, 81,5,

80.4, 80,2, 79,2, 79,0, 78,1, 76,0, 68,5, 68,3, 68,0,

67,6, 67,1, 56,3, 56,2, 45,6, 40,8, 39,6, 36,8, 35,5,

34.4, 34,1, 31,5, 27,5, 26,5, 22,8, 22,6, 20,1, 19,8,

18,2,17,6,17,5,15,0 és 10,9.

^lH-NMR-színkép (β ppm, 500 MHz): 3,78 (IH, dq,

10,6), 3,82 (IH, dq, 10,6), 3,18 (IH, t, 9), 3,22 (IH, t, 9) és 3,42 (6H, s).

Tömegszinkép (elektronütköztetéses): 900 (M⁺) 882, 756,738,612,594,576, 484,333,315,261,249, 221,179,145.

3. példa

Streptomyces avermitilis ATCC 31272 törzset az 1. példában leírt módon 13(S)-hidroxi-23-dezoxi-(A faktor)-ral inkubálunk

Az így kapott mintát 180 μΐ részletekben 100 mmx4,6 mm méretű Spherisorb 5S ODS-2 oszlopon frakcionálunk, a detektálást 238 nm hullámhoszszon végezzük, és eluálószerként acetonitril és víz 65:35 arányú elegyét alkalmazzuk, amelyet ecetsavval 4,2 pH-ra állítottunk. Minden egyes befecskendezésből összegyűjtjük azokat az UV-abszorpciós csúcsokat, amelyek retenciós aránya a változatlan szubsztrátumhoz viszonyítva 1,87; az azonos retenciós aránnyal rendelkező csúcsokat egyesítjük, és vákuumban bepároljuk. így olyan (1) általános képletű vegyülethez jutunk, amelyben: R α-L-oleandrozil-csoportot, R¹ izopropilcsoportot, X >CH₂ csoportot és R⁴ hidroxilcsoportot jelent. A tennék retenciós aránya 1,87.

Tömegszínkép (elektronütköztetéses) m/z: 756 (M⁺), 738,720,594,576,333,315,261,249,221,179, 151 és 145 (negatív Cl, NH₃) m/z 756 (M“).

Az alábbiakban példákat adunk meg a találmány szerinti vegyületeket tartalmazó készítmények előállítására. A „hatóanyag” találmány szerinti vegyületet jelent.

Példák többféle dózist tartalmazó parenterális injekciók előállítására

/. példa
	Tömeg/térf.% Koncentráció-
Hatóanyag	2,0	tartomány1' 0,1-6,0 tömeg/tér
Benzil-alkohol	1,0	f.%
Polysorbate 80	10,0
4-hidroxi-metil- dioxolán	50,0

Injekciós célra alkalmas víz, amennyi 100,0-hoz szükséges.

A hatóanyagot Polysorbate 80 és glicerin-formái elegyében oldjuk, hozzátesszük a benzil-alkoholt, és az így kapott keveréket injekciós célra alkalmas vízzel a kívánt térfogatig töltjük. A terméket a szokásos módon, például steril szűréssel vagy autoklávozással sterilizáljuk, és aszeptikus körülmények között kiszereljük.

1) Itt és a továbbiakban: A hatóanyag, illetve a segédanyagok azon tartománya, amely még megfelelő a készítményben.

2. példa	Tömeg/térf.% Koncentráció-
Hatóanyag	4,0	tartományi 0,1-7,5 tömeg/tér
Benzil-alkohol	2,0	f.%
Gliceril-triacetát	30,0
Propilénglikol,	amennyi 100,0-hoz szükséges.

A hatóanyagot a benzil-alkohol és a gliceril-triacetát elegyében oldjuk, majd propilénglikollal a kívánt térfogatra töltjük. A terméket a szokásos módon - például steril szűréssel - sterilizáljuk, és aszeptikus körülmények között kiszereljük.

3. példa % Koncentrációtartomány

Hatóanyag 2,0 tömeg/térf.0,1-7,5 tömeg/tér

Etanol 36,0 térfAérf.

Nemionos nedvesítőszer (például

Synperonic PE

L44**) 10,0 tömeg/térf.

Propilénglikol, amennyi 100,0-hoz szükséges

A hatóanyagot a nedvesítőszert tartalmazó etanolban oldjuk, és propilénglikollal a kívánt térfogatig töltjük. Az így kapott terméket a szokásos módon - például steril szűréssel - sterilizáljuk, és aszeptikus körülmények között kiszereljük.

*Az ICI cég védjegyzett terméke

4. példa

Hatóanyag tő:

% Koncentrációtartományi

2,0 tömeg/térf.0,1-3,0 tömeg/tér f.%

Nemionos nedvest tőszer (például Synperonic PE F 68*)

Benzil-alkohol Miglyol 840**

2,0 tömeg/térf.

1,0 tömeg/térf.

16,0 térfAérf.

Injekciós célra alkalmas víz, amennyi szükséges 100,0hoz.

A hatóanyagot Miglyol 840-ben oldjuk. A nemionos nedvesítőszert és a benzil-alkoholt a víz legnagyobb részében oldjuk. Az olajos oldatot a vizes oldathoz adva emulziót készítünk, amelyet a szokásos módon homogenizálunk, majd a kívánt térfogatra töltjük. Az előállítást és a kiszerelést szeptikus körülmények között végezzük.

* Az ICI cég védjegyzett terméke

A Dynamit Nobel eég védjegyzett terméke

HU 206 136 Β

Aeroszol-permet előállítása

	Tömeg%	Koncentráció- tartomány”
Hatóanyag	0,1	0,01-2,0 tömeg%
Triklór-etán	29,9
Triklór-fluor-metán	35,0
Diklór-difluor-metán	35,0

A hatóanyagot a íriklór-etánnal összekeverjük, és az aeroszol-tartályba töltjük. A tartály fejrészét hajtógázzal öblítjük, és a szelepet a megfelelő helyzetbe hozzuk, majd a szelepen át betöltjük a kívánt tömegű folyékony hajtógázt. A tartályt működtető szerkezettel és fedőrésszel látjuk el.

Tabletta előállítása

Előállítási módszer: nedves granulálás mg

Hatóanyag 250,0

Magnézium-sztearát 4,5

Kukoricakeményítö 22,5

Nátrium-keményítő-glikolát 9,0

Nátríum-lauril-szulfát 4,5

Mikrokristályos cellulóz, amennyi szükséges 450 mg tömegű tablettamaghoz.

A hatóanyaghoz elegendő mennyiségű 10%-os keményítőpasztát adunk, hogy megfelelő, nedves granulálható masszát kapjunk, A granulálás elvégzése után a terméket tálcán vagy fluidágyas szárítóberendezésben szárítjuk. Az így kapott terméket szitáljuk, hozzáadjuk a többi komponenst és tabletákká préseljük.

Kívánt esetben a tablettákat fílmbevonattal láthatjuk el (hidroxi-propil)-metil-ceilulóz vagy más, hasonló filmképző anyag segítségével, vizes vagy nem vizes oldószerrendszer alkalmazásával. A filmképző oldathoz plaszticizálószert (lágyítószert) és megfelelő színezőszert is adhatunk.

Tabletta előállítása állatgyógyászati célra kis állatok, illetve háziállatok számára

Előállítási módszer: száraz granulálás mg

Hatóanyag 50,0

Magnézium-sztearát 7,5

Mikrokristályos cellulóz, amennyi szükséges 75,0 tömegű tablettamaghoz.

A hatóanyagot összekeverjük a magnézium-sztearáttal és a mikrokristályos cellulózzal. A keveréket tömbökké tömöritjük, és a tömböket forgó granuláló berendezésen átvezetve aprítjuk. így szabadon áramló szemcséket kapunk, amelyeket tablettákká préselünk.

Az így kapott tablettamagvakat kívánt esetben a fentiekben leírt filmbevonattal láthatjuk el.

Emlőbe fecskendezhető oldat állatgyógyászati alkalmazásra

Hatóanyag	mg/dó- zis 150 mg	Tömegtarto- mány” 0,05-1,0 g
Polysorbate 60 Fehér méhviasz Arachiszolaj	3,0tömeg% >. 6,0 tömeg% / 3 g-ig 91,0tömeg%	3-15 g

Az arachiszolaj, fehér méhviasz és Polysorbate 60 keverékét keverés közben 160 °C-ra melegítjük, 2 órán át ugyanezen a hőmérsékleten tartjuk, majd keverés közben szobahőmérsékletre hűtjük. A hatóanyagot aszeptikus körülmények között a vivőanyaghoz adjuk, és nagy sebességű keverővei diszpergáljuk. A terméket kolloid malomban őröljük, majd az így kapott terméket aszeptikus körülmények között műanyagból készült, steril fecskendőkbe töltjük.

A hatóanyag lassú felszabadulását biztosító bólusz előállítása állatgyógyászati alkalmazásra

Tömeg% Tömegtartomány¹’ Hatóanyag 1,0 0,25-2 g

Kolloid szilíciumdioxid 2,0

Mikrokristályos cellulóz, amennyi szükséges 100,0hoz.

A hatóanyagot összekeverjük a kolloid szilícium-dioxiddal és a mikrokristályos cellulózzal megfelelő keverőberendezésben úgy, hogy a hatóanyag a vivőanyagban teljes egészében kielégítően eloszoljék. A terméket a lassú felszabadulást biztosító eszközbe tesszük, amely a hatóanyagot vagy állandó ütemben, vagy pulzáló módon szabadítja fel.

Folyékony orális készítmény állatgyógyászati alkal-

mazásra
Hatóanyag	Tömeg%o Koncentráció- tartomány” 0,35 0,01-2 tömeg/
Polysorbate 85	térf.% 5,0
Benzil-alkohol	3,0
Propilénglikol	30,0
Foszfátpuffer	6,05-6,5 pH-ra
Víz, amennyi szükséges	100,0-hoz.

A hatóanyagot a Polysorbate 85, benzil-alkohol és propilénglikol elegyében oldjuk, hozzáadjuk a víz egy részét és a keverék pH-értékét szükséges esetben foszfát-pufferoldattal 6,0-6,5-re állítjuk. Az elegyet vízzel a kívánt térfogatra töltjük fel, majd a terméket a folyékony készítménynek megfelelő tartóedénybe töltjük.

Pasztaszeríí orális készítmény állatgyógyászati alkalmazásra

	Tömeg%	Koncentráció- tartomány”
Hatóanyag Szaccharin-nátri-	4,0	1-20 tömeg%
umsó	2,5
Polysorbate 85 Alumínium-diszte-	3,0
arát	5,0

Frakcionált kőkuszolaj, amennyi szükséges 100,0-hoz.

Az alumíniuin-disztearátot a frakcionált kókuszolaj és Polysorbate 85 elegyében melegítéssel oldjuk, az így kapott oldatot szobahőmérsékletre hűtjük, és a szaccharin-nátriumsót az olajszerű vivőanyagban diszpergáljuk. Ezután az alapanyagban diszpergáljuk a hatóanyagot, és az így kapott terméket műanyagból készült fecskendőbe töltjük.

HU 206 136 Β

Szemcsézett készítmény előállítása a táplálékba való adagolásra, állatgyógyászati alkalmazás céljából

Tömeg% Koncentrációtartomány¹⁵

Hatóanyag 2,5 0,05-5 tömeg%

Kalcium-szulfát-hemihidrát, amennyi 100,0-hoz szükséges.

A hatóanyagot összekeverjük a kalcium-szulfáttal, majd nedves granulálási eljárással szemcséket állítunk elő, amelyeket tálcán vagy fluidágyas szárítóberendezésben szárítunk. Az így kapott terméket megfelelő tartóedénybe töltjük.

Lemosószer előállítása állatgyógyászati alkalmazásra

	Tömeg%	Koncentráció- tartomány0
Hatóanyag	2,0	0,1-30%
Dimetil-szulfoxid	10,0
Metil-izobutil-ke-
ton	30,0

Propilénglikol (és pigment), amennyi 100,0-hoz szükséges.

A hatóanyagot a dimetil-szulfoxid és metil-izobutilketon elegyében oldjuk, hozzáadjuk a pigmentet, és az elegyet propilénglikollal a kívánt térfogatra töltjük, majd az így kapott lemosószert megfelelő tartóedénybe helyezzük.

Emulziós koncentrátum előállítása
Hatóanyag	50 g
Anionos emulgeálószer (például Phenyl sulphonate CALX)	40g
Nemionos emulgeálószer (például Synperonic NP 13*)	60 g

Aromás oldószer (például Solvesso 100), amennyi 1 literhez szükséges. A komponenseket összekeverjük, és oldódásig keverjük.

*Az ICI cég védjegyzett terméke

Szemcsék előállítása (a) Hatóanyag 50 g

Fagyanta 40 g

0,25-0,85 mm-es gipszszemcsék (például Agsorb

100A), amennyi 1 kg-hoz szükséges (b) Hatóanyag 50 g

Synperonic NP13* 40 g

Gipszszemcsék (0,15-0,85 mm-es szemcsék), amennyi 1 kg-hoz szükséges.

Valamennyi komponenst illékony oldószerben - például diklór-metánban - oldjuk, és keverőberendezésben a szemcsékhez adjuk, majd az oldószert szárítással eltávolítjuk.

*Az ICI cég védjegyzett terméke.

Claims (7)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Eljárás az (1) általános képletű vegyületek és sóik előállítására - ahol az (1) képletben R jelentése α-L-oleandrozil-vagy 4’-(a-L-oleandrozil)-a-L-oleandrozil csoport,

   R¹ metil-, etil- vagy izopropilcsoportot jelent;

   X jelentése -CH₂- vagy E konfigurációjú >C=NOR⁷ csoport - ahol R⁷ jelentése 1—4 szénatomos alkilcsoport R⁴ jelentése hidroxil- vagy 1-4 szénatomos alkoxicsoport- , azzal jellemezve, hogy egy (2) általános képletű vegyületet Sptreptomyces avermitilis ATCC 31272 és/vagy 31780 deponálási számú mikroorganizmus törzsek, ezek mutánsai és/vagy variánsai és/vagy az ezekből kinyerhető enzimek jelenlétében inkubálunk, majd kívánt esetben R⁴ helyén 1-4 szénatomos alkoxicsoportot tartalmazó (1) általános képletű vegyületek előállítására egy kapott, R⁴ helyén hidroxilcsoportot tartalmazó vegyűletet éterezünk, és/vagy kívánt esetben sót képezünk.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás olyan (1) általános képletű vegyületek előállítására, ahol R¹ izopropilcsoportot jelent, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiinduló anyagokat alkalmazzuk.
3. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás olyan (1) általános képletű vegyületek előállítására, ahol R jelentése 4’-(aL-oleandrozil)-a-L-oleandrozil-csoport, azzal jellemezve, hogy kiinduló anyagokat alkalmazzuk.
4. 4. Az 1. igénypont szerinti eljárás olyan (1) általános képletű vegyületek előállítására, ahol X jelentése -CH₂- vagy E-konfigurációjú >C-NOCH₃ csoport; R⁴ jelentése hidroxil- vagy metoxicsoport, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiinduló anyagokat alkalmazzuk.
5. 5. Az 1. igénypont szerinti eljárás olyan (1) általános képletű vegyület előállítására, ahol R jelentése a-L-oleandrozil-a-L-oleandrozil-csoport; R¹ jelentése izopropilcsoport, X jelentése E konfigurációjú >C-NOCH3 csoport; R⁴ jelentése hidroxilcsoport; valamint olyan (1) általános képletű vegyület előállítására, ahol R jelentése 4’-(a-L-oleandrozil)-L-oleandrozil-csoport; R¹ jelentése izopropilcsoport; X jelentése-CH2 csoport; R⁴ jelentése hidroxilcsoport, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiinduló anyagokat alkalmazzuk.
6. 6. Eljárás gyógyászati készítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy' legalább egy, az 1. igénypont szerint előállított (1) általános képletű vegyületnek - ahol az (1) általános képletben R, R¹, R⁴ és X jelentése az 1. igénypontban meghatározott - vagy gyógyászati szempontból elfogadható sójának hatásos mennyiségét a gyógyszergyártásban szokásos hordozó- és vivőanyagokkal összekeverve gyógyászati készítménnyé alakítjuk.
7. 7. A 6. igénypont szerinti eljárás állatgyógyászati készítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy legalább egy, az 1. igénypont szerint előállított (1) általános képletű vegyületnek - ahol az (1) általános képletben R, R¹, R⁴ és X jelentése az 1. igénypontban meghatározott - vagy állatgyógyászati szempontból elfogadható sójának hatásos mennyiségét az állatgyógyszerek gyártásában szokásos hordozó- és vivőanyagokkal összekeverve állatgyógyászati készítménnyé alakítjuk.

   HU 206 136 Β

   Int. Cl.⁵: C 12P 19/62