HU205771B

HU205771B - Process for producing irreversible peptide ligands for bombesin receptors and process for producing pharmaceutical compositions comprising such peptides as active ingredient

Info

Publication number: HU205771B
Application number: HU894456A
Authority: HU
Inventors: Castiglione Roberto De; Mauro Galantino; Fabio Corradi; Luigia Gozzini; Marina Ciomei; Isabella Molinari
Original assignee: Erba Carlo Spa
Priority date: 1988-07-21
Filing date: 1989-07-19
Publication date: 1992-06-29
Also published as: PT91215A; DK71990D0; DE68909584D1; DK71990A; HUT54711A; WO1990001037A1; FI901369A0; NZ229957A; JPH03500414A; HU894456D0; PT91215B; EP0380623B1; AU619573B2; GR1000608B; GR890100414A; EP0380623A1; AU3878889A; CA1331074C; ES2017028A6; IL90997A0

Description

A találmány tárgya eljárás új, biológiailag aktív peptidek ésgyógyászatílag elfogadható sóik, valamint hatóanyagként e vegyületeket tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására.

Aleírásban apeptid-kémia területén szokásosan alkalmazott szimbólumokat és rövidítéseket használjuk Dásd Eur. J. Biochem. 138, 9 - 37 (1984)]. így a hárombetűs aminosav-szimhólumok L-konfigurációjú optikailag aktív aminosavakat jelentenek. AD-amínosavakat kisbetűkkel jelöljük: például ala jelentése DAla. Az egyéb használt rövidítéseK.

Aa aminosav

AeOEt etil-acetát

AcOH ecetsav

BzLbenzil

PBSbombezín

Boc terc-butoxi-karbonil

BuOHbutil-alkohoI

CCD ellenáramú megoszlás

DCCNjN’-diciklohexil-karbodiimid

DMAP4-(dimetil-amino)-piridín

DMF dimetil-formamid

Dnp 2,4-dinitro-fenil

ECCetil-klór-karbonát

EtyO dietil-éter h-GRF (vagyp-GRF) humán (vagy sertés) gasztrint felszabadító peptid

HCl/AcOHszárazsósavvízmentes ecetsavban

HOBt 1-hidroxi-benzotriazol i.c.v.intracerebroventrikuláris MeOHmetil-alkohol o.p. olvadáspont mMe!m-bisz(2-kIór-etil)-amino-L-fenílalanin

n.v. nem vizsgált

NMMN-metil-morfolin pMelp-bísz(2-kíór-etil)-ammo-L-fenilalanin

HPLCnagynyomású folyadékkromatográf ia

OSuN-hidroxí-szukcínimídil

TFA trifluor-ecetsav

THF tetrahídrofurán

TLCvékonyréteg-kromatográfia

Tos p-zoluolszulfonil

TsOHp-toluoIszulfonsav

Zbenzil-oxí-karbonil

A találmány közelebbről bombezin-antagonista aktivitással rendelkező peptidek előállítására vonatkozik, amelyekagyógyászatban a GRF-családba tartozó peptidektől függő humán daganatok kezelésére használhatók

Korábban előállított már bombezin-antagonista hatású peptideket, de azok a vegyületek csak kismértékű affinitást mutattak BBS-receptorokhoz [ACowan,UPS,91-3(1988)].

A találmány szerinti eljárás az (I) általános képletű peptidek -a képletben

A jelentése hidrogénatom, terc-butoxi-karbonilcsoport vagy acetilcsoport és

B és C közül az egyik pMel vagy mMel maradékot jelent, mígamásik jelentése közvetlen kötés, Leu-Gly, GIn-E-Leu-Gly vagy Ε-Gly maradék, ahol

E jelentése Arg(A), vagyLys(A), és

D jelentése közvetlen kötés, vagy Ans vagy Thr maradék,

X jelentése Gly vagy alamaradék,

Y jelentése közvetlen kötés, vagy His(Rj), Phe vagy phe maradék,

T jelentése közvetlen kötés vagy Leu maradék,

W jelentése hidroxilcsoport, aminocsoport, pentüamino-csoport vagy Met-R₂, Leu-R₂, He-R₂ vagy Nle-R₂ maradék,

Rj jelentése hidrogénatom vagy 2,4-dinitro-fenílcsoport,és

R₂ jelentése aminocsoport és sóik előállítására vonatkozik.

Az (I) általános képletű peptidek sói gyógyászatilag elfogadható savakkal képzett sók lehetnek. A fenti sókat különféle szervetlen és szerves savakkal, például kénsawal, foszforsavval, sósavval, hídrogén-bromiddal, hidrogén-jodíddal, salétromsavval, szulfaminsavval, citromsawal, borostyánkősawal, borkősavval, fahéjsawal, ecetsawal, trífluor-ecetsawal, benzoesavval, szalcilsawal, glűkonsawal, aszkorbinsawal vagy hasonló savakkal képezhetjük

A bombezin egy tetradekapeptid, amelynek képlete: Glp-Gln-Arg-leu-Gly-Asn-Gln-Trp-Ala-Val-GlyHis-Leu-Met-NH₂, és amelyet eredetileg béka bőréből izoláltak A biológiai aktivitásért a molekula Cterminális része felelős. A BBS(6-14) nonapeptid ugyanolyan aktivitású, mint az alapvegyület A bombezin humán megfelelője egy 27 aminosavból álló peptid, amely mint gasztrint felszabadító hormon (hGRP) ismert. A bombezin és a vele rokon peptidek számos biológiai aktivitással rendelkeznek [LHWalsh „Brain Peptídes”, D.T. Kríeger, MJ. Brownstein és LB. Martin (szerkesztők), Wiley ihterscience Puhl., 941-960. oldal(1983)], többek közotthumán kis sejtes tüdő-karcinómán autokrin növekedést serkentő hatást fejtenek ki [F. Cuttítta és munkatársai, Cancer Survey, 4,707-727 (1985)], autokrin és/vagy parakrin stimuláló hatást fejtenek ki humán prosztatarák-sejtek proliferációjára (M. Bologna és munkatársai, Cancer, közlés alatt), és modulálják azEGF-receptorokat |T. Zachary és E. Rozengurt, Cancer Surveys, 4,729765(1985)].

így várható, hogy egy bombezin-antagonista hatású vegyület - a természetes ligandummal a receptorhelyekért folytatott versengés következtében - gátolni vagy módosítani fogja az abnormális sjet-proliferácíóhoz vezető események kaszkádjának beindulását.

Az (I) általános képletű alkilező bombezin-analógok bombezin-antagonista hatású vegyületek, ezért olyan humán daganatok kezelésére használhatók, amelyek növekedését és kifejlődését - akár közvetlenül, akár más növekedési faktorokkal együtt -a GRPpeptidek módosítják.

Ezért a találmány szerinti eljárással előállított, alkilező analógokat a fenti betegségekkel kapcsolatos klinikai tüneteket, és a GRP-szerű peptidek hiperszekréciója következtében fellépő klinikai tünetek kezelésére használhatjuk.

HU 205 771 Β

A találmány szerinti eljárással előállított vegyületeket szokásos módon - például parenterálisan, így intravénás injekció vagy infúzió formájában, vagy intramuszkulárisan, szubkután, intracavitárisan és intranazálisan - adagolhatjuk.

A dózis a kezelendő beteg korától, testtömegétől, a beteg állapotától és az adagolás módjától függ.

Az in vitro és egerekben in vivő végzett vizsgálatok szerint a gyógyászatilag hatásos dózis humán gyógyászatban kb. 10 ng/kg - 10 mg/kg lehet, naponta 1-6 alkalommal adva.

A találmány további tárgya ennek megfelelően eljárás gyógyászati készítmények előállítására, amelyek hatóanyagként egy (I) általános képletű vegyületet vagy annak egy gyógyászatilag elfogadható sóját tartalmazzák, a szokásos, gyógyászatilag elfogadható hordozó- és/vagy egyéb segédanyagokkal kombinálva.

A fenti gyógyászati készítményeket rendszerint a gyógyszerkészítésben szokásos eljárásokkal állítjuk elő, és megfelelő készítmény formájában adagoljuk.

így például az intravénás injektálásra vagy infúzióra alkalmas oldatok hordozóanyagként steril vizet tartalmazhatnak, vagy steril, vizes izotóniás sóoldatok formájában lehetnek.

Az intramuszkulárisan adagolható injekciós oldatok vagy szuszpenziók a hatóanyagon kívül gyógyászatilag elfogadható hordozóanyagot, például steril vizet, olívaolajat, etil-oleátot, glikolokat, így propilénglikol, és kívánt esetben megfelelő mennyiségű lidokain-hidrogén-kloridot is tartalmazhatnak.

A találmány szerinti eljárással előállított gyógyászati készítmények - mint már említettük - neuroendokrin daganatok - például kis sjetes tüdő-karcinoma és prosztata karcinoma -, vagy ezekkel a betegségekkel kapcsolatos klinikai tüntetek kezelésére használhatók, oly módon, hogy az arra rászoruló betegnek a találmány szerinti eljárással előállított gyógyászati készítményt megfelelő dózisban adagoljuk.

Az (I) általános képletű peptideket a klasszikus, oldat-fázisban lefolytatott eljárásokkal állíthatjuk elő, A szintézis lényegében a védett aminosavak vagy peptid-fragmentumok megfelelő, egymást követő kondenzálásából áll. A kondenzációs lépéseket úgy hajtjuk bégre, hogy a kapott peptidekben az aminosav-maradékok a kívánt sorrendben helyezkedjenek el.

A peptid-kémiában szokásosan alkalmazott eljárásokkal kondenzálható aminosavak és peptid-fragmentumok a peptid-kötés kialakításában részt nem vevő amino- és karboxilcsoportjaikat megfelelő védőcsoportokkal blokkolt formában tartalmazzák, amelyeket azután savas vagy lúgos hidrolízissel vagy hidrogenolizissel eltávolíthatunk.

Az aminocsoportok védésére például az alábbi védőcsoportok alkalmazhatók: benzil-oxi-karbonil-, terc-butoxi-karbonil-, tritil-, formil-, trifluor-acetil-, ο-nitro-fenil-szulfenil-, 4-metoxi-benzil-oxi-karbonil-, 9-fluorenil-metoxi-karbonil-, 3,5-dimetoxia,a3-dimetit-benzil-oxi-karbonil- vagy metil-szulfonil-etoxi-karbonü-csoport.

A karboxil-védŐcsoportok például az alábbiak lehetnek:

metil-, etil-, terc-butil-, benzil-, ρ-nitro-benzil-, fluorenil-metil-, amido-, hidrazido-, terc-butoci-karbonil-hidrazido- vagy benzil-oxi-karbonil-hidrazido5 csoport.

A hidroxi-aminosavak hidroxilcsoportját és a hisztidin iminocsoportját megfelelő védőcsoportokkal védhetjük - a teljes szintézis alatt, vagy csak néhány lépés során de a fenti csoportok védetten formában is lehetnek. A hidroxilcsoport védésére például az alábbi védőcsoportok alkalmazhatók: terc-butil-, benzil-, acetilcsoport. Az imidazol iminocsoporíjának védésére megfelel például a 2,4-dinitro-fenil-, tozil-, benzilcsoport. A védó'csoportok eltávolítását a peptid15 kémia területén szokásos eljárásokkal végezhetjük.

Az egyik molekula aminocsoport jónak a másik molekula karboxilcsoportjával való kondenzálásával a peptid-kötés kialakítását aktivált sav-számrazékon például vegyes anhidriden, azidon vagy aktív észteren

- keresztül végezhetjük, vagy a szabad aminocsoportot és a szabad karboxilcsoportot közvetlenül kondenzálhatjuk, kondenzálószer - például diciklohexil-karbodiimid - jelenlétében, kívánt esetben egy racemizációt gátló szert - például N-hidroxi-szukcinimiet vagy

1 -hidroxi-benzotriazolt - és aktiválőszert - például 4(dimetil-amino)-piridint - is használhatunk. A kondenzálást oldószerben - például dimeíil-formamidban, dimetil-acetamidban, piridinben, acetonitrilben, tetrahidrofuránban vagy N-metil-2-pirrolidonbau 30 játszhatjuk le.

A reakcióhőmérséklet -30 °C és szobahőmérséklet között változhat. Areakcióidő általában 1-120 óra lehet.

Aszintézisutaí, a védőcsoportokat és akondenzálő35 szereket úgy választjuk meg, hogy á racemizáció lehetőségét elkerüljük.

Az R_f értékeket szilikagél 60 F₂₅4-.ből (Merck) kialakított, 0,25 min vastagságú, 20 cm magasságú vékonyrétegen határozzuk meg, az alábbi futtatőrend40 szereket használva:

A rendszer: etil-acetát:benzol:ecetsav:víz ·

500:500:100:50 térfogatarányú elegy (felső fázis)

B rendszer: etil-acetát:benzol:ecetsavwíz

500:500:200:75 térfogatarányú elegy (alsó fázis)

C rendszer: n-butanol:ecetsav-víz = 600:150:150 térfogatarányú elegy

D rendszer: kloróform:metanol:30%-os ammóniumhidroxid =488:338:150 térfogatarányú elegy

E rendszer: kloröform:metanol = 90:10 térfo50 gatarányú elegy

F rendszer: toluol:etil-acetát:ecetsavwíz =

100:100:20:10 térfogatarányú elegy

A vékonyréteg-kromatográfiás elemzést 18-25 ’Con végezzük, az Rf értékek ennek megfelelően ± 5% eltérést mutathatnak.

A nagynyomású folyadékkromatográfiás eljárást Hewlett-Packard 1084B készülékkel végezzük, amely 210 nm-en működő UV-detektorral van ellátva. A peptideket 4 x250 mm-es LiehrosorbRP 185 ji oszlo50 pon választjuk szét. A használt oldószer-rendszerek az

HU 205771 Β alábbiak

A) 0,02 mól/I KH₂P0₄ (pH 3,5-re állítva 3%-os

H₃PO₄-vaI):acetonxtril=9:l térfogatarányú elegy

B) 0,02 mól/1 KH₂PO₄ (pH 3,5-re állítva 3%-os

H₃PO₄-val):acetonitril=3:7 térfogatarányú elegy.

Az eluálást a B elegy 60-90% lineáris gradiensével végezzük, 20 perc alatt (A rendszer), vagy a B elegy 30-70% lineáris gradiensével 15 perc alatt (B rendszer), majd 15 percen keresztül izokratikusan, 1 ml/perc átfolyási sebesség mellett.

Apeptideketretenciós idejükkel (R_t) jellemezzük.

Az aminosav-analizist savas hidrolizátumokban (110 ’C-on 22 órán keresztül 6 n sósavoldattal + 0,1% fenollal; vagy 100 ’C-on 16 órán keresztül 3 n merkapto-etánszulfonsawal; mindkét esetben nitrogénatmoszférában) végezzük. Csak a természetes aminosav-maradékokat határozzuk meg. A normális hidrolízis körülmények közötti részleges bomlás miatt a Trp-t csak szulfonsavas hidrolizátumokban határozzuk meg.

A találmány szerinti eljárással előállított vegyületekbiológiai hatását az alábbiak szerint vizsgáljuk.

Az (I) általános képletű vegyületek bombezin-receptorokhoz való affinitását Swiss 3T3 egér fibroblasztokon határozzuk meg {Ϊ. Zachary és E. Rozengurt, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82,7616-7620 (1981)]. Az eredményeket az 1. táblázatban ismertetjük.

A mitogenezisre kifejtett hatást szérummentes közegben fenntartott, nyugalomban levő és összefüggő Swiss 3T3 sejteken határozzuk meg [A.N. Corps és munkatársai, Biochem. J., 231, 781-785 (1985)]. Az első kísérletsorozatban az analógokat vagy egyedül, vagy bombezinnel együtt adjuk a tenyészethez. A második kísérletsorozatban a sejteket előkezeljük az alkilező peptidekkel, majd a sejteket mossuk, 37 ’C-on 24 órán keresztül állni hagyjuk, és ezután reagáltatjuk a bombezinnel. A DNS-szintézist mindkét esetben a [³HJ-timidinbeépüIésseI értékeljük ki (2. táblázat).

A hombezín és analógja mitogén hatását szintén meghatározzuk, a protein-tirozin-kináz aktivitásaként, amely abombezín-receptor komplexszel kapcsolódó 115000móltömegű proteint (p 115-öt) f oszf orilezi. [D.CirilIo és munkatársai, Mól. Véli. Bioi. 6,46414649 (1986)]. Az eredményeket a 3. táblázatban foglaljuk össze.

Ezenkívül SCLC sejtvonalat (például NCI-H345öt, NCI-N592-t, NCI-H128-at), valamint prosztatakarcinoma sejtvonalakat (például DU145-öt és PC3at) 0,1-50 nmól/1 koncentrációtartományban a találmány szerinti peptidekkel kezelve, jelentős csökkenés figyelhető meg a sejtekszaporodásában.

Csupasz egerekbe transzplantált humán SCLC és prosztata-karcinoma sejtvonalak szaporodása is jelentősen csökken, ha az egereknek parenterálisan 10 ng/kg - 10 mg/kg testtömeg dózisban találmány szerinti eljárással előállított peptidet adunk.

A perifériális és centrális hatásokat patkányon vizsgáljuk, in vitro, a húgyhólyag összehúzódásával [M. Broccardo és munkatársai, Br. J. Pharmac. 55, 221-227 (1975)] és in vivő, i.c.v. adagolás esetén, a tisztálkodási viselkedés megfigyelésével [A. Cowan és munkatársai, Life Sciences, 37, 135-145 (1985)], bombezin jelenlétében, és anélkül.

1. példa

Boc-pMel-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-OH (IH vegyület) előállítása

1. lépés: Boc-pMel-OH ([vegyület

0,684g (1,85 mmól) H-pMel-OEt.Hcl-t [F.Bergel és LA. Stock, J.Chem. Soc. 2409-2417 (1954)] és 0,485g (2,2 mmól) (Boc)₂O-t 40 ml vízben és 8 ml terc-butanolban oldunk. Az oldat pH-ját 1 n nátrium-hidroxidoldattal 10-re állítjuk, 15 percen keresztül keverjük, majd hozzáadunk 40 ml vizet és 110 ml metanolt, és a pH-t 1 n nátrium-hidroxid-oldattal 13,5-re állítjuk. A reakcióelegyet szobahőmérsékleten 1 órán keresztül keverjük, majd pH-ját 1 n sósavoldattal 8,5-re állítjuk, és vákuumban koncentráljuk. A vizes oldatot négyszer 30 ml n-hexánnal mossuk, majd -5 ’C-ra hűtjük, 1 nsósavoldattaIpH2-resavanyítjukkeverés közben, és négyszer 30 ml lehűtött etil-acetáttal extraháljuk. A szerves fázisokat összegyűjtjük, telített nátrium-ldorid-oldattal semlegesre mossuk, vízmentes nátrium-szulfát felett szárítjuk, szűrjük, és vákuumban bepároljuk. A maradékot diklór-metán és ecetsav 99:1 térfogatarányú elegyében oldjuk és szilikagélen, gyorskromatográfiás eljárással tisztítjuk, az eluálást is a fenti oldószereleggyel végezzük.

0,7 g (77,8%) cím szerinti I vegyületet kapunk, olaj formájában, Rj_A=0,70.

2. lépés: Boc-pMel-Gly-Trp-Ala-Val-Gly-OBzl (H vegyület)

0,6 g (1,48 mmól) Boc-pMel-OH-t (1 vegyület) 10 ml vízmentes THF-ban oldunk. Az oldatot -20 ’C-ra hűtjük, és egymás után hozzáadunk 0,16 ml (1,48 mmól) NMM-t és 0,15 ml (1,48 mmól) ECC-t Az elegyet a fenti hőmérsékleten 2 percen keresztül keverjük, majd 1,02 g (1,48 mmól) H-GIn-Trp-AIa-Val-GlyOBzIJIcl (saját 8808768.9 számú nagy-britanniai szabadalmi leírásunk) és 0,16 ml (1,48 mmól) NMM 10 ml vízmentes DMF-dalkészült, hideg oldatátadjuk hozzá. A reakcióelegyet -10 és -15 ’C közötti hőmérsékleten 2 órán keresztül keverjük, majd szűrjük és vákuumban bepároljuk.

A maradékot 20 ml DMS-ban oldjuk és cseppenként hozzáadjuk40 ml 10%-os citromsavoldat 5 ’C-os oldatához. Az elegyet 10 ’C alatti hőmérsékleten 1 órán keresztül keverjük, majd szűrjük és vízzel semlegesre mossuk.

1,4 g (91,5%) cím szerinti Π vegyületet kapunk, R^ =0,48.

3. lépés: Boc-pMel-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-OH (ΠΙ vegyület)

1,2 g (1,16 mmól) Boc-pMel-Gln-Trp-Ala-Val-GlyOBzl (Π) 24 ml vízmentes THF-nal készült oldatához 0,44 g 10% fémet tartalmazó szénhordozós palládiumkatalizátort és 1,2 ml hangyasavból, 3,3 ml NMM-hóI és 100 ml metanolból készült, előmelegített oldatából 24 ml-t adunk. A reakcióelegyet 40 ’C-on 15 percen keresztül keverjük, majd szobahőmérsékletre hűtjük,

HU 205771 Β szűrjük, és vákuumban bepároljuk. A maradékot FMD-ban oldjuk és etil-acetáttal kicsapjuk. 1,1 g nyersterméket kapunk.

. A kapott terméket ellenáramú megoszlásos módszerrel tisztítjuk, víz, DMF, n-butanol és etil-acetát 40:3:20:80 térfogatarányú elegyéből álló oldószerrendszerben. A tennéket tartalmazó frakciókat összegyűjtjük és vákuumban bepároljuk. A maradékot DMF-dal, metanollal és etil-acetáttal eldörzsöljük.

0,680 g (63%) cím szerinti ΠΙ vegyületet kapunk,

RfP«0,54;

Rt^=8,4;

Aminosav arányok: Glu 0,93 (1), Gly P,99 (1), Alá

0,99(1), Val 1 (TrpéspMeln.v.).

2. példa

Boc-pMel-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Dnp)Leu-Met-NH ₂ (IV vegyület) előállítása 0,330 g (0,35 mmól) Boc-pMel-Gln-Trp-Ala-ValGly-OH (ΓΠ) 3 ml vízmentes THF-nal készült oldatához 0,053 g (0,39 mmól) vízmentes HOBt-t, 0,081 g (0,39 mmól) DCC-t, 0,235 g (0,39 mmól) H-His(Dnp)Leu-Met-NH₂.HCl-ot [F. Angelucci és R. de Castiglione, Experientia, 507-508 (1975)] és 0,043 ml (0,39 mmól) NMM-t adunk egymás után. A reakcióelegyet 0 ’C-on 1 órán keresztül és szobahőmérsékleten 30 órán keresztül keverjük, majd szűrjük és vákuumban bepároljuk.

A maradékot 3 ml vízmentes DMF-ban oldjuk, és ’C alatti hőmérsékleten, cseppenként 6 g nátriumkloridot és 3 g cítromsavat tartalmazó 30 ml vizes oldathoz adjuk. Az elegyet 10 ’C alatti hőmérsékleten 1 órán keresztül keverjük, majd a szuszpenziót szűrjük és a terméket semlegesre mossuk.

A kapott nyersterméket kétszer 10 ml vízmentes

DMF-bóí bepároljuk, majd 3 ml vízmentes DMF-ban oldjuk és 10 ’C alatti hőmérsékleten, cseppenként 1,5 g nátriüm-hidrogén-karbonátot és 6 g nátrium-kloridot tartalmazó 30 ml vizes oldathoz adjuk. Az elegyet 1 órán keresztül keverjük, majd szűrjük és vízzel semlegesbe mossuk. - : / 0,5.g (95,6%) cím szerinti IV vegyületet kapunk. Rfj-j»Ö,84;

RtA=21,2;

Aminosav arányok: Trp 0,97 (1), Glu 1,00 (1), Gly 1,

Alá 1,00 (1), Val 1,00 (1), Met 1,10 (1), Leu 1,04 (1) (pMel és His (Dnp) n.v.).

3.. példa ..

H^M^GliFTrpbílM-Gly-Hís(Dnp)-Leu

-MetpNH ₂JJCl(V vegyület) előállítása 0,10 g (0,067 mmól) Boc-pMel-Gln-Trp-Ala-ValGly-His-(Dnp)-Leu-Met-NH₂-t (IV) 0,2 ml 2-merkapto-etanoltés0,l ml anizolt tartalmazó, 1 ml 1,33 n HCl/AcOH oldattal reagáltatunk. A reakicóelegyet szobahőmérsékleten 30 percen keresztül keverjük, ^áj<^y^umbanijbepároljuk. A maradékot dietiléterrel éldÖrzSÖIjufe' '^J'

0,08J)g röS.jő^círű.szerinti V vegyületet kapunk. R_fC=0,57;

RtA=9,3;

Aminosav arányok: Glu 0,99 (1), Gly 0,98 (1), Alá 1,04 (1), Val 1,10 (1), Met 0,82 (1), Leu 0,81 (1) (Trp, pMel és Hls(Dnp) n.v.).

4. példa

Boc-pMel-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met -NH ₂ (VI vegyület előállítása

0,4 g(0,27 mmól)Boc-pMel-Gln-Trp-Ala-Val-GlyHis(Dnp)-Leu-Met-NH₂-t (IV) 400 ml vízmentes DMF-ben oldunk, majd hozzáadunk 5,36 ml 0,1 mól/l koncentrációjú kálium-dihidrogén-foszfát-oldatot (amelynek pH-ját 1 n kálium-hidroxid-oldattal 8,1-re állítottuk), és 20 ml 2-merkaptO-etanolt. A rewakcióelegyet szobahőmérsékleten 2 órán keresztül keverjük, majd vákuumban koncentráljuk. A maradékot ellenáramú megoszlásos eljárással tisztítjuk, oldószerrendszerként víz, n-butanol és ecetsav 40:35:1 térfogatarányú elegyét használva. A tiszta terméket tartalmazó frakciókat összegyűjtjük és vákuumban bepároljuk.

0,35 g (100%) cím szerinti VI vegyületet lapunk.

R_fC=0,63; Rfj)=0,82;

RtA = 14,2;

Aminosav arányok: Glu í, Gly 1,00 (1), Alá 1,04 (1), Val 1,04 (1), Met 0,94 (1), Leu 1,02 (1), His 0,95 (1), Trp 0,88(1) (pMel n.v.).

5. példa

H-pMel-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-MetNH ₂,2HC1 (VH vegyület) előállítása

0,1 g (0,075 mmól) BOc-pMel-Gln-Trp-Ala-ValGly-His-Leu-Met-NH2“ből (VI) a védőcsoportot a 3. példában leírtak szerint eltávolítjuk.

0,089 g (91%) cím szerinti VH vegyületet kapunk.

R_fC=0,45;

R_tB=ll,3;

Aminosav arányok: Glu 1,06 (1), Gly 1,00 (1), Alá 0,99 (1), Val 1, Met0,94(1), Leu 0,96 (1),His 0,94 (1) (Trp és pMel n.v.)

6. példa

Boc-pMel-Trp-Ala-Val-Gly-phe-Leu-Met-NH ₂(VHI vegyület) előállítása

0,15 g (0,16 mmól) Boc-pMel-Gln-Trp-Ala-ValGly-OH-t (ΙΠ) 12 ml vízmentes DMF-ban oldunk, és hozzáadunk 0,023 g )0,169 mmól) vízmentes HOBt-t. A 0 ’C-ra hűtött oldathoz egymás után 0,041 g (0,177 mmól) DCC-t, 0,085 g (0,192 mmól)H-phe-Leu-MetNH₂.HCl-t (saját 8808768.9 számú nagy-britanniai szabadalmi leírásunk 1. példa 14. lépése) és 0,022 ml (0,192 mmól) NMM-t adunk. A reakcióelegyet 0 ’Con 15 percen keresztül keverjük, majd hozzáadunk 0,002 g (0,016 mmól) DMAP-t. A reakcióelegyet 0 ’Con 1 órán keresztül, és szobahőmérsékleten egy éjszakán keresztül keverjük, majd szűrjük és vákuumban bepároljuk. A maradékot 3 ml vízmentes DMF-ban oldjuk és cseppenként, 10 ’C alatti hőmérsékleten 3 g cítromsavat és 6 g nátrium-kloridot tartalmazó 30 ml vizes oldathoz adjuk. Az elegyet 1 órán keresztül ke5 f?J 205771 Β verjük, majd a szilárd anyagot szűrjük és vízzel semlegesre mossuk. A terméket ezután 10 ml vízme ι es DMF-ban oldjuk és vákuumban bepároljuk. A maradékot dietil-éterrel eldörzsőljük.

0,190 g (88,8%) cím szerinti VHI nyersterméket kapunk. Az anyag egy részétfordított fázisú fél-preparatív HPLC eljárással tisztítjuk, 0,05%-os TFA (A) és 0,05% TFA/acetonitril = 3/7 (B) oldószerrendszer 70% - 90% B lineáris gradiensével eluálunk.

Rf(j“O,85;

RtA’18,4;

Aminosav arányok: Glu 0,90 (1), Gly 1,14 (1), Ala

I, 02 (1) Val 0,99 (1), Met 0,94 (1), Leu 1,08 (1), phe 0,96 (1), Trp0,96 (1) (pMel n.v.).

7. példa

Boc-mMel-Gln-T>p-Ala-Val-Gly-OH (IX vegyület) előállítása

A cím szerinti vegyületet az 1. példában leírtakszerint eljárva állítjuk eló', Boc-mMel-OH-bóI kiindulva, amelyet H-mMel-OH-ból [H.F. Gram és munkatársai,

J. Med. Chem.6,85-87 (1963)] állítunk elő.

Rfl}»0,56;

RfA~8,5;

Aminosav arányok: Glu 0,93 (1), Gly 0,95 (1), Ala 0,95 (1), Val (1) (Trp és mMel n.v.).

8. példa

Boc-mMel-Leu-Gly-Thr-Gln-Trp-Ala-Val-Gly -Leit-Met-NH ₂ (XIV vegyület) előállítása

1. lépés:Boc-Leu-Gly-OBzI(X vegyület)

2,33 ml (20,7mmól) NMM-t és 2,91 ml (20,7 mmól) izobutü-klór-karbonátot adunk egymás után 4,8 g (20,7 mmól) Boc-Leu-OH 70 ml vízmenetes THF-nal készült, -25 ’C-ra hűtött oldatához. A reakcióetegyet kb. -12 ’C-on 3 percen keresztül keverjük, majd hozzáadjuk 6,98 g (20,7 mmól) H-GIy-OBzI.TsOH és

2,33 ml (20,7 mmól) NMM 50 ml vízmentes DMF-dal készült oldatát. Areakcióelegyet kb. -12 ’C-on 45 percen keresztül, majd 0 ’C-on 90 percen keresztül keverjük, majd szűrjük és vákuumban bepároljuk. A maradékot etil-acetátban oldjuk és egymás u tán 10%-os vizes citromsavoldattal, nátrium-klorid-oldattal, 5%-os nátrium-hídrogén-karbonát-oldattal és ismét nátrium-klorid-oldattal mossuk. A szerves fázist vízmentes nátrium-szulfát felett szárítjuk és az oldószert vákuumban eltávolítjuk.

7,8 g (100%) cím szerinti X vegyületet kapunk, olaj formájában.

Rfp-0,83;

RtA-13,6.

2. lépés: H-Leu-Gly-OBzl.HCl (XI vegyület)

7,4 g (19,6 mmól) Boc-Leu-Gly-OBzI (X) védőcsoportját a 3. példában leírtak szerint eltávolítjuk. Az olajos maradékot petroléterrel néhányszor eldörzsöljük.

3,94 g (63,8%) cím szerinti XI vegyületet kapunk.

RfC“0,59.

3. lépés: Boc-mMel-Leu-Gly-OBzl (XH vegyület)

5,7 g (12,51 mmól) Boc-mMel-OH-t és 3,94 g (12,51 mmól) H-Leu-Gly-OBzlJICl-ot (XI) az 1. példa 2. lépésében leírtak szerint kondenzálunk. A maradékot AcOEt-ban oldjuk és egymás után többször mossuk 10%-os citromsavoldattal, nátrium-klorid-oldattal, 5%-os nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal és ismét nátrium-klorid-oldattal. A szerves fázist vízmentes nátrium-szulfát felett szárítjuk és az oldószert vákuumban eltávolítjuk. Amaradékot szilikagélen, gyorskromatográfiás eljárással tisztítjuk, az eluálást etilacetát és dietil-éter 1:7 térfogatarányú elegyével végezzük,

6,25 g (75%) cím szerinti XH vegyületet kapunk, ahb formájában.

RfP=0,80.

4. lépés: Boc-mMel-Leu-Gly-OH(XIIIvegyület)

6,0 g (9,0 mmól) Boc-mMel-Leu-Gly-OBzl-t (ΧΠ) az 1. példa 3. lépésében leírtak szerint kezelünk. Amaradékot etil-acetát, dietil-éter és petroléter elegyével eldörzsöljük.

4,3g(83%)címszerintiXIIIvegyületetkapunk. .

RfP=0,43.

5. lépés: Boc-mMel-Leu-Gly-Thr-Gln-Trp-Ala-ValGIy-Leu-Met-NH₂ (XIV vegyület)

0,092g (0,16 mmól) Boc-mMel-Leu-Gly-OH-t (XIΠ) és 0,105 g (0,16 mmól) H-Thr-GItt-Trp-Ala-ValGly-Leu-Met-NH₂JBCCl-ot (8808768.9 számú nagybritanniai szabadalmi leírásunk 4. példája) a 2. példában leírtak szerint kondenzálunk. Az oldószer elpárologtatása után a maradékot 10 ml DMF-ban oldjuk, cseppenként 100 ml 10%-os citromsavoldathoz adjuk, 15 percen keresztül keverjük, majd szűrjük és semlegesre mossuk.

A nyerstrméket 30 ml DMF-ban oldjuk és vákuumban bepároljuk. A maradékot DMF/MeOHZAcOEt/Et₂O eleggyel eldörzsöljük.

0,17 g (72,7%) cím szerinti XIV nyersterméket kapunk. A termék egy részét fél-preparatív HPLC eljárással tisztítjuk, a 6. példábanleírtak szerint.

R_fC=0,84;

RtA=16,5;

Aminosav arányok Thr 0,94 (1), Glu 1,06 (1), Gly

2,12 (2), Ala 0,94 (1), Val 0,94 (1), Met 1,00 (l),Léú2, Trp 0,87 (1) (mMel n.v.).

A fentiek szerint eljárva állítjuk elő a következő peptideket is.

XV H-pMel-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-phe-Leu-Met -NH₂.HCL

Rjo=0,72; R^=9,6

XVI Boc-mMel-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Dnp)-L eu-Met-NH₂

Rf_D= 0,86; R_u - 21,5; AA arány: Glu 1, Gly 0,99 (1), Ala 1,03 (1), Val 0,99 (1), Met 1,03 (1), Leu 1,04 (1), Trp 1,05 (1) (mMel ésHis(Dnp) n.v.)

XVII H-mMei-GIn-Trp-Ala-Val-Gly-His(Dnp)-Leu -Met-NH₂HC1

R_fC - 0,74; R^ - 9,4; AA arány: Glu 0,99 (1), Gly 1,04 (1), Ala 1,02 (1), Val 1, Met 0,96 (l),Ieu,0,96(1) (His(Dnp) Trp és mMel n.v.) \ *

XVIIIBoc-mMel-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-LeuMet-NH₂.CF₃COOH '' '·“

HU 205771 Β

Rf_C - 0,55; Rja = 14,4; AA arány: Glu 1, Gly 0,99 (1), Alá 0,99 (1), Val 1,06 (1), Met 1,05 (1), Leu 0,97 (1), His 0,90 (1), Trp 1,03 (1) (mMel n.v.)

XIX H-mMel-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met -NH₂.2HC1 « 0,44; Rj_B =. 11,3; AA arány: Glu 1,00(1), Gly 1,00(1),Alá 1,05(1),Val 1,Met 0,91 (1), Leu 0,89(1), His 0,99 (1) (mMel és Trp n,v.)

XX Boc-mMel-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-Leu-MetNH₂

Rf_C=0,74; = 15,4; AA arány. Glu 1,03 (1), Gly

l.Ala 1,04(1), Val 0,96(1), Met 0,93(1), Leu 1,02(1), Trp 0,94 (1) (mMel n.v,)

XXI H-mMel-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-Leu-Met-NH₂. HC1

Rfc⁼RtA - 5,7

ΧΧΠ H-mMel-Leu-Gly-Thr-Gln-Trp-Ala-Val-Gly -Leu-NH₂JIC1

Rfc—0,52; Rja=6,6

XXX\Boc-pMel-Gln-Trp-Ala-VaI-Gly-Leu-Met-NH₂

Rf_C - 0,86; R_u - 15,3; AA arány: Glu 1,02 (1), Gly 1,07 (l),Ala 1,10 (1), Val l,Met 0,92 (l),Leu 0,98 (1) (TrpéspMeln.v.)

XXXVI H-pMel-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-Leu-MetNH₂.HC1

Rf_C = 0,57; Rjb = 16,8; AA arány: Glu 1,08 (1), Gly 1,01 (1), Alá 0,98 (1), Val 1, Met 0,90 (1), Leu 0,94 (1) (TrpéspMeln.v.)

XXXVH Boc-Ly(Boc)-Gly-pMel-Gln-Trp-Ala-Val -Gly-Leu-Met-NH₂

Rf_C -0,73^» 18,7; AA arány: Glu 1,07 (1), Gly 2,02 (2),Alá 1,18(1), Val 1,Met 0,88 (1), Leu 0,95(1), Lys 1,08 (1) (Trp és pMel n.v.)

XXXVHIH-Lys-Gly-pMel-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-L eu-Met-NH₂.2CF₃COOH

Rfg » 0,71; R_tB = 15,4; AA arány: Glu 0,99 (1), Gly 2,02 (2),Alá 1,00(1),Val 1, Met 0,88 (1), Leu 0,91 (1), Lys 1,15 (1), Trp 0,91 (1) (pMel n.v.)

XXXIX Ac-Lys(Boc)-Gly-pMel-Gln-Trp-Ala-Val -Gly-Leu-Met-NH₂

R_fC=0,77;R_tA=ll,9;

AA arány: Glu 1,05 (1), Gly 1,97 (2), Alá 0,98 (1), Val l.Met 0,89 (l),Leu 0,92 (l),Lys 0,92 (1), Trp 0,88 (l)(pMeln.v.)

XL Ac-Lys-Gly-pMel-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-Leu

-Met-NH₂.CF₃COOH

Rf-θ « 0,78; ΐζ_Β ~ 16,2; AA arány Glu 1, Gly 2,11 (2), Alá 0,99 (1), Val 0,89 (1), Met 0,91 (1), Leu 0,92 (l),Lys 1,10 (1) (Trp és pMel n.v.)

XLI Boc-mMel-Leu-Gly-Thr-Gln-Trp-Ala-Val-Hi s(Dnp)-Leu-NH(CH₂)₄CH₃

Rf_C = 0,88; R^» 24,2; AA arány Thr 1,04 (l),Glu 0,96(1), Gly 2, Alá 1,03 (l), Val 0,95(1), Leu 1,92(2), (His(Dnp), Trp és pMel n.v.)

XLII H-mMel-Leu-Gly-Thr-Gln-Trp-Ala-Val-His (Dnp)-Leu-NH(CH₂)₄CH₃JIC1

Rf_C = 0,50; R^ -18,7; AA arány Thr 0,92 (1), Glu 0,97 (1), Gly 2,04 (2), Alá 1,04 (1), Val 1, Leu 1,88 (2) (His(Dnp), Trp és pMel n.V.)

XLIHBoc-pMel-Gln-Arg-Leu-Gly-Asn-Gln-Trp-A la-Val-ala-Leu-Nle-NH₂.CF₃COOH

R^-lS/l

XLV Boc-pMel-Leu-Gly-Thr-Glu-Trp-Ala-Val-Gl y-His(Dnp)-Leu-NH-(CH₂)₄CH₃

R_fC=0,83; R^=26,41; AA arány Thr 1,02 (1), Glu 1, Gly 2,04 (2) Alá 0,99 (1), Val 0,95 (1), Leu 1,91 (2), CHis(Dnp), Trp és pMel n.v.)

1. táblázat: Bombezin alkilező analógok kötődési affinitása Swiss 3T3 egér fibroblásztokon

Vegyület	ID_5o (nmól/1)
m	12000 ±400
IX	8200 ± 680
vn	60 ± 20
V	680 ± 150
XIX	95 ±8
xvn	148 ±27
VI	48 ±2
IV	1170 ±400
XVHI	40 ± 12
XVI	390 ± 160
XX	60,1 ± 3,3
XIV	445 ± 60
Összehasonlító peptidek;
BBS	12,6 ± 3,8
sptantid	11000
[pro²]spantid	14000
[Leu¹³ Ψ(εΗ₂-ΝΉ)ίβυ^Ι43ΒΒ5	214 ± 30

2. táblázat: [H³]-Timidin beépülése Swiss 3T3 egér fibroblasztokba

Vegyület Alapértékhez viszonyí- %-os gátlás 25 nmól/1 BBS tott növekedési arány jelenlétében

A B

	5 na ól/l	50 nmól/1	500nmól/l	5000 nmól/1	500 nmól/1	5000 nmól/1	500 nmól/1	5000 nmól/1
m	-	-	1,2	1,3	0	64 ± 10	27 ± 14	39 ±7
rx	-	-	1	1	0	57 ± 13	17 ±4	22 ±3
vn	2,1	4,7	4,3	4,8	6 ±2	17 ±4	57 ±14	61 ±9
V	i	1	1,4	1,8	26 ± 8	44 ± 12	87 ± 9	83 ±6
XIX	1	4,1	4,3	4,4	19 ±7	9±5	54 ± 1	62 ± 6

í i

HU 205771 Β

2. táblázat:(folyt.) [H³]-Timidin beépülése Swiss 3T3 egér fibroblasztokba

Vegyület	Alapértékhez viszonyított növekedési arány	%-os gátlás 25 nmól/1 BBS jelenlétében
	5nmól/l
50nmól/I	500nmóI/l	5000 nmól/1	500 nmól/1	A 5000 nmól/1	B
500 nmól/1	5000 nmól/1
XVH	1	2,9	4,2	3,9	6±3	20 + 7	58 ± 13	62 ±1
VI	4,1	8,0	7,0	6,6	3 ±2	20 ±3	21 ±3	34 ±5
IV	I	1	1,7	2,3	59 ± 3	67 ±3	81	73
XVIH	5,4	7,0	7,3	5,4	4±2	3 ± 1	3 ±2	14 ±3
XVI	1,2	1,6	3,1	3,9	17 ±2	41 ±1	47 ±10	37 ±7
VIH	-	1,1	1,2	1,2	28+6	37 ±4	56 ±3	77 + 11
XX	-	1,0	1,5	1,2	39 ± 1	68 ±8	0	35 ±3
XIV	-	1,2	1,3	1,2	6±2	14 ±2	0	32 ±8

Összehasonlító peptidek:

BBS 3,0 +1
(Leu¹³>P(CH₉-NH)Leu¹⁴)BBS 1,0	1,0	29 + 10 56 ± 4	0	0

A-analógokatBBS-nel kombinálva adjuk

B-sejteket az analógokkal előkezeljük, mossuk, 37 °C-on 24 órán át állni hagyjuk, majd BBS-nel kezeljük

3. táblázat: Bombezin-receptorral kapcsolódó p 115 protein foszforilezése

Vegyület	Legkisebb hatásos dózis (nmól/1)
Hl	10000
VH	1
V	100
X3X	4
XVH	4
VI	1
IV	50
xvm	10
XVI	40
XX	500
XIV	1000
Összehasonlító peptidek: BBS	3
spantid	10000

A fenti táblázatok eredményeiből látható, hogy amikor az alkilező részt egy agonista szerkezetbe visszük be (VI, VH, XVDI, XIX vegyüíetek), a kapott alkilező analógok önmagukban adagolva növelik a timidinbeépülést, és BB-nel együtt adagolva gyenge antagonista hatást fejtenek ki, viszont jelentős antagonista hatást mutatnak, ha a BBS beadagolása előtt 24 órával adagoljuk ezeket a vegyületeket.

Ha az alkilező részt olyan BBS analógokba visszük be, amelyek per se inaktívak (IV, V, VIH, XIV, XVI, XVH és XX vegyüíetek), a kapott alkilező vegyüíetek nem növelik a tímidin beépülését, és rendszerint egyformán erős antagonista hatást fejtenek ki, akár BBSnel együtt, akár a BBS beadagolása után 24 órával adjuk őket a kezelt sej lekhez.

Claims

SZABADALMIIGÉNYPONTOK

1. Eljárás az (I) általánosképletűpeptidek-aképletben

A jelentése hidrogénatom, terc-butoxi-karbonil30 csoportvagy acetilcsoport és

B és C közül az egyik pMel vagy mMel maradékot jelent, míg a másik jelentése közvetlen kötés, Leu-GIy, Gln-E-Leu-Gly vagy Ε-Gly maradék, ahol

E jelentése Arg(A), vagyLys(A), és D jelentése közvetlen kötés, vagy Ans vagy Thr maradék,

XjelentéseGlyvagyalamaradék,

Y jelentése közvetlen kötés, vagy His(Rj), Phe vagy phe maradék,

T jelentése közvetlen kötés vagy Leu maradék,

W jelentése hidroxilcsoport, aminocsoport, pentilamino-csoport vagy Met-R₂, Leu-R₂, Ile-R₂ vagy NleR₂ maradék,

Rj jelentése hidrogénatom vagy 2,4-dinitro-fenil45 csoport, és

R₂ jelentése aminocsoport és gyógyászatilag elfogadható sóik előállítására, azzal jellemezve, hogy aminosavakat és/vagy aminsoavszármazékokat és/vagy a fenti aminosavakat vagy azok

50 származékait tartalmazó peptid-fragmentumokat a kívánt szekvenciában kondenzáljuk, mimellett a peptídkötés kialakítására a terminális karboxilcsoportot vagy terminális aminocsoportot aktiváljuk, és a többi funkciós csoportot védjük, és kívánt esetben eltávolítjuk a

55 kapott pepiidből a védőcsoporto(ka)t, és/vagy kívánt esetben a kapott peptidet gyógyászatilag elfogadható sóvá alakítjuk. (Elsőbbsége: 1989.03.28.)
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás Boc-pMel-GIn-Trp-Ala-Val-Gly-OH,

60 Boc-mMel-GIn-Trp-Ala-Val-Gly-OH,

HU 205771 Β

Boc-Lys(Boc)-Gly-pMel-Ghi-Trp-Ala-Val-GlyLeu-Met-NH₂,

H-Lys-Gly-pMel-Gln-Trp-AJa-Val-Gly-Leu-Met

-nh₂,

Ac-Lys(Boc-Gly-pMel-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-Leu

-Met-NH₂,

Ac-Lys-Gly-pMel-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-Leu-Me t-NH₂,

Boc-pMel-Gln-Arg-Leu-Gly-Asn-Gln-Trp-Ala-V al-ala-Leu-Nle-NH₂ előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási vegyületeket használjuk. (Elsőbbsége: 1989.0328.)
3. Eljárás az (I) általános képletű peptidek - a képletben

A jelentése hidrogénatom vagy lerc-butoxi-karbonil-csoportés

B és C közül az egyik pMel vagy mMel maradékot jelent, míg a másik jelentése közvetlen kötés vagy LeuGly.és

D jelentése közvetlen kötés, vagy Asn vagy Thr parádék,

X jelentése Gly vagy ala maradék,

Y jelentése közvetlen kötés, vagy His(Rj), Phe vagy phe maradék,

T jelentése közvetlen kötés vagy Leu maradék,

W jelentése aminocsoport, pentil-amíno-csoport vagy

Met-R₂, Leu-R₂, Ile-R₂ vagy Nle-R₂ maradék,

Rj jelentése hidrogénatom vagy 2,4-dinitro-fenil-’ csoport.és

R₂ jelentése aminocsoport és gyógyászatilag elfogadható sóik előállítására, azzal jellemezve, hogy aminosavakat és/vagy aminosavszármazékokat és/vagy a fenti aminosavakat vagy azok származékait tartalmazó peptid-fragmentumokat a kívánt szekvenciában kondenzáljuk, mimeliett a peptidkötés kialakítására a terminális karboxücsoportot vagy terminális aminocsoportot aktiváljuk, és a többi funkciós csoportot védjük, és kívánt esetben eltávolítjuk a kapott pepiidből a védőcsoporto(ka)t, és/vagy kívánt esetben a kapott peptidet gyógyászatüag elfogadható sóvá alakítjuk. (Elsőbbsége: 1988.07.21.)
4. A 3. igénypont szerinti eljárás

Boc-pMel-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Dnp)-LeuMet-NH₂

H-pMel-GIn-Trp-Ala-Val-Gly-His(Dnp)-Leu-Met

-NH₂,

Boc-pMel-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-MetNH₂,

H-pMel-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH₂,

Boc-pMel-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-phe-Leu-MetNH₂,

Boc-mMel-Leu-Gly-Thr-Gln-Trp-Ala-Val-GlyLeu-Met-NH₂,

H-pMel-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-phe-Leu-Met-NH₂,

Boc-mMel-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Dnp)-LeuMet-NH₂,

H-mMel-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Dnp)-LeuMet-NH₂ .

Boc-mMel-Gln-Trp-Ala-Val-Qly-His-Leu-MetNH₂,

H-mMel-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH₂,

Boc-mMel-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-Leu-Met-NH2«

H-mMel-Ghr-Trp-Ala-Val-Gly-Leu-Met-NH₂,

H-mMel-Leu-Gly-Thr-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-Leu

-NH₂,

Boe-pMel-Gln-Trp-Ala-Vql-Gly-Leu-Met-NH₂,

H-pMel-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-Leu-Met-NH₂,

Boc-mMel-Leu-Gly-Thr-GIn-Trp-Ala-Val-Hís (Dnp)-Leu-NH(CH₂)₄CH₃vagy

H-mMel-Leu-Gly-Thr-Gln-Trp-Ala-Val-His(Dnp)

-Leu-NH(CH2)₄CH₃ előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási vegyületeket használjuk. (Elsőbbsége: 1988.07.21.)
5. Eljárás gyógyászati készítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy egy, az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárással előállított (I) általános képletű vegyületet-a képletben

A, B, C, D, X, Y, Tés W jelentése az 1. igénypontban megadott vagy annak gyógyászatilag elfogadható sóját a gyógyszerkészítésben szokásosan használt hordozóés/vagy egyéb segédanyagokkal összekeverjük és gyógyászati készítménnyé alakítjuk. (Elsőbbsége: 1989.03.28.)
6. Eljárás gyógyászati készítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy egy, a 3. vagy 4. igénypont szerinti eljárással előállított <J) általános képletű vegyületet-a képletben

A, B, C, D, X, Y, T és W jelentése a 3. igénypontban megadott vagy annak gyógyászatilag elfogadható sóját a gyógyszerkészítésben szokásosan használt hordozóés/vagy egyéb segédanyagokkal összekeverjük és gyógyászati készítménnyé alakítjuk. (Elsőbbsége: 1988.07.21.)