FI100719B - Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisten, muunnettujen bombesiini- j a litoriinipeptidianalogien valmistamiseksi - Google Patents

Description

100719

Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisten, muunnettujen bombesiini- ja litoriinipeptidianalogien valmistamiseksi

Keksinnön tausta 5 Tämä keksintö koskee menetelmää terapeuttisesti käyttökelpoisten peptidien valmistamiseksi. Peptidejä voidaan käyttää esimerkiksi syövän hoidossa.

Amfibinen peptidi bombesiini, pGlu-Gln-Arg-Leu-Gly-Asn-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2 [Anastasi et ai., 10 Experientia 27 (1971) 166 - 167], muistuttaa läheisesti imettäväisten gastriinia vapauttavia peptidejä (GRP), esim. sianGRP:tä, H2N-Ala-Pro-Val-Ser-Val-Gly-Gly-Gly-Thr-Val-Leu-Ala-Lys-Met-Tyr-Pro-Arg-Gly-Asn-His-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2 [McDonald et ai., Biochem. Biophys. 15 Res. Commun. 90 (1979) 227 - 233] ja ihmisen GRP:tä, H2N-Val-Pro-Leu-Pro-Ala-Gly-Gly-Gly-Thr-Val-Leu-Thr-Lys-Met-Tyr-Pro-Arg-Gly-Asn-His-Trp-Ala-Vai-Gly-His-Leu-Met-NH2. Bombesiinin on havaittu olevan autokriininen tai parakrii-ninen mitoottinen tekijä monille ihmisen syöpäsolulinjoil-20 le mukaan lukien pienisoluinen keuhkosyöpä (SCLC) (Haveman et ai., toim., Recent Results in Cancer Research - Peptide Hormones in Lung Cancer, Springer-Verlag, New York, 1986).

_ Monien näistä syövistä tiedetään erittävän GRP:tä tai bom- .··. besiiniä muistuttavia peptidihormoneja. Niinpä bombesiinin • · 25 antagonisteja on ehdotettu näiden syöpien hoitamiseksi • · · *Γ I käytettäviksi aineiksi.

• * » ·..* Cuttitta et ai. osoittivat, että bombesiiniä vas- • · t ’·* ’ taan muodostettu spesifinen monoklonaalinen vasta-aine • · • * · ·.*.* inhiboi in vivo ihmisen pienisoluisen keuhkosyöpäsolulin- 30 jän kasvua istutettuna karvattomiin hiiriin [Cuttitta et I*.· ai., Cancer Survey 4 (1985) 707 - 727]. 3T3 -hiiren fibro- blasteissa, jotka vastaavat bombesiinin mitoottiseen vai-' . kutukseen, Zachary ja Rozengurt havaitsivat, että subs- . tanssi-P-antagonisti (spantidi) toimi bombesiiniantagonis- 35 tina [Zachary et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 82 2 100719 (1985) 7616 - 7620]. Heinz-Erian et ai. korvasivat bombe-siinissä asemassa 12 olevan His:n D-Phe:llä ja havaitsivat bombesiiniantagonistivaikutuksen marsun haiman dispergoi-duissa happoa erittävissä rauhasissa [Heinz-Erian et ai., 5 Am. J. of Physiol. 252 (1987) G439 - G442]. Rivier raportoi työstä, joka kohdistui bombesiinin biologisesti aktiivisen, C-terminaalisen dekapeptidin konformatiivisen vapauden rajoittamiseen muodostamalla molekyylinsisäisiä disulfidisiltoja; Rivier mainitsi kuitenkin, ettei näin 10 modifioiduilla bombesiinianalogeilla toistaiseksi esiinny mitään antagonistivaikutus [Rivier et ai., "Competitive Antagonists of Peptide Hormones" abstraktikirjassa Abstract of the International Symposium on Bombesin-Like Peptides in Health and Disease, Rooma (lokakuu 1987)].

15 Lyhenteet (harvinaiset): pGlu = H2C--CH-CO- (pyroglutamaatti);

H,i NH

20 \/

C

il o

Nle = 25 H,N-CH-CIIH (norleusiini) ... | O (CH2)3-CH3 • · • · · • · · *** * Pal = 3-pyridyylialaniini • · · *·^· 30 Nai = naftyylialaniini • · · *·* ' Keksinnön yhteenveto • · *.*.* Yleisesti keksintö koskee menetelmää lineaarisen (s.o. ei-rengasrakenteisen) peptidin valmistamiseksi, joka on luonnossa esiintyvän, biologisesti aktiivisen bombesii- :*·*: 35 nin analogi, jossa bombesiinissä on aktiivinen kohta ja ‘ . sitoutumiskohta, joka vastaa bombesiinin sitoutumisesta • « kohdesolun reseptoriin, jossa analogissa on ei-peptidisi-dos peptidisidoksen sijasta aktiivisen kohdan aminohapon I · 100719 3 ja viereisen aminohapon välissä ja joka analogi pystyy sitoutumaan reseptoriin, jolloin analogi pystyy toimimaan luonnossa esiintyvän bombesiinin kompetetiivisena inhibiittorina sitoutumalla reseptoriin, ja ei-peptidisidoksen 5 ansiosta sillä ei esiinny luonnossa esiintyvän bombesiinin in vivo -aktiivisuutta. [Ei-peptidisidosten kemiaa käsitellään yksityiskohtaisesti artikkelissa Coy et ai., Tetrahedron 44 (1988) 835 - 841, joka on liitetty tähän viitteeksi.] 10 Edullisesti luonnossa esiintyvälle bombesiinille on ominaista, että yksi tai useampi bombesiinin aminotermi-naalisen puolen aminohapoista sitoutuu vetysidoksella yhteen tai useampaan bombesiinin karboksiterminaalisen puolen aminohappoon ja lineaarisen peptidin ei-peptidisidos 15 vähentää näiden vetysidosten muodostumista, jolloin biologinen aktiivisuus tuhoutuu. Uskotaan, että useat keksinnön mukaisesti valmistetuista lineaarisista peptideistä ovat bombesiinianalogeja, jonka bombesiinin biologinen aktiivisuus riippuu ainakin osittain niiden kyvystä muodostaa 20 tertiaarisia "hiusneula"-konfiguraatioita, joissa molekyylin aminoterminaalisen ("vasemman") puolen aminohapot sitoutuvat vetysidoksella molekyylin karboksiterminaalisen ("oikean") puolen aminohappoihin, ja että lisätty pseudo-peptidisidos häiritsee näiden vetysidosten muodostumista 25 ja estää hiusneulakonfiguraation, josta aktiivisuus riip- • · · *" '. puu, muodostumisen. Voidaan odottaa, että vetysidosten I I · *;>t* muodostuskyvyn menetys vaikuttaa molekyylin biologiseen • i · *·* * aktiivisuuteen joko transannulaarisen sitoutumisen suoman V.· rakenteellisen stabiiliuden menetyksen kautta tai runkora- 30 kenteen kyvyttömyyden muodostaa vetysidoksia reseptoriin : kautta. Lisäksi molekyylin lisääntynyt joustavuus pelkis- tyneen sidoksen ympärillä verrattuna normaalin peptidin amidisidoksen jäykkyyteen saattaa muuttaa molekyylin kon-, formatoivista kokonaisuutta ja siten sen biologista aktii- 35 visuutta.

100719 4

Yllä esitetyn perusteella on ilmeistä, että lineaariset peptidit, joissa pseudopeptidisidoksen muodostamista voidaan käyttää antagonistiaktiivisuuden luomiseen tai lisäämiseen, ovat sellaisia peptidejä, joissa aktiivisuus 5 liittyy kohtaan aminohappoketjun sisässä. Pseudopeptidisidos voidaan muodostaa reseptoriin sitoutumiseen osallistuvalle alueelle tai sitoutumiseen osallistumattomalle alueelle; on osoitettu [Nagain et ai.. Peptides 8 (1987) 1023 - 28], ettei sitoutumisalueelle muodostettu pseudo-10 peptidisidos estä sitoutumista. Yleisesti käyttökelpoisia peptidiryhmiä, joissa tämä modifikaatio voidaan tehdä, ovat sellaiset peptidit, joissa ainakin yksi aktiiviseen kohtaan kuuluva aminohappo sijaitsee molekyylin karboksi-terminaalisella puolella: ei-peptidisidos muodostetaan 15 tämän aminohapon ja sen viereisen aminohapon välille.

Keksintö koskee menetelmää terapeuttisesti käyttökelpoisen bombesiini- tai litoriiniantagonistipeptidin valmistamiseksi, jolla on seuraava aminohappokaava:

20 R

χ 123456789 10

^"A -A -A -A -A -A -A -A -A -A -R

2 11 12 13 14

A -A -A -A -Y

; .·. 25 jossa • · · · A1 = pGlu, D tai L tai puuttuu; *:.*.* A2 = Gin, Asn, Gly, Phe, p-X-Phe (X = F, Cl, Br, OH tai • · · *;*. CH3), β-naftyylialaniini tai puuttuu; • · · - *·'·* A = Arg, D-Arg, Lys, D-Lys tai puuttuu; 30 A4 = Gin, Asn, Gly, Ala, Leu, Ile, Nle, e-aminovoihappo, ’:*·· Vai, Phe, p-X-Phe (X - F, Cl, Br, OH tai CH3), 8- • · · : : : naftyylialaniini tai puuttuu; A5 = Gin, Asn, Gly, Ala, Leu, Ile, Nle, a-aminovoihappo, . Vai, Phe, D-Phe, p-X-Phe (X = F, Cl, Br, OH tai 35 CH3), β-naftyylialaniini, D-Ala tai puuttuu; 5 100719 A6 = Gin, Asn, Gly, Ala, D-Ala, N-Ac-D-Ala, Leu, lie, Nle, α-aminovoihappo, Vai, Phe, p-X-Phe (X = F, Cl, Br, OH tal CH3), p-Glu, β-naftyylialaniini tai puuttuu; 5 A7 = Gin, Asn, Ala, Leu, lie, Nle, a - ami novo i happo, Vai, Phe, D-Phe, p-X-Phe (X = F, Cl, Br, OH tai CH3), Lys, His tai β-naftyylialaniini; A8 = Trp; A9 = Gin, Asn, Gly, Ala, Leu, lie, Nle, a-aminovoihappo, 10 Met, Vai, Phe, p-X-Phe (X = F, Cl, Br, OH tai CH3),

Trp tai β-naftyylialaniini, D tai L; A10 = Ala, Leu, Ile, Nle, α-aminovoihappo, Vai tai Thr; A11 = Gly tai Phe, D tai L; A12 = His, Phe tai p-X-Phe (X = F, Cl, Br, OH, CH3), D 15 tai L; A13 = Ala, Leu, lie, Nle, α-aminovoihappo, Val, Phe, p-X-Phe (X = F, Cl, Br, OH tai CH3) tai β-naftyylialaniini; ja

Rj R3 / 3 / 3 20 Y on A14 - N tax A14 , joissa \ \ R4 ^ R4 A14 = Ala, Leu, lie, Nle, α-aminovoihappo, Met, Val, Phe :.,, tai p-X-Phe (X = F, Cl, Br, OH tai CH3); . edellyttäen, että kukin R3, R2, R3 ja R4 toisistaan riippu- • · · : .·. 25 matta on vety, C1.12-alkyyli, C7_10-fenyylialkyyli, COE, • · · ; (jossa E3 on C1.20-alkyyli, C3_20-alkenyyli, C3_20-alkynyyli,

• M

I..* fenyyli, naftyyli tai C, 10-fenyylialkyyli) tai COOE, (jossa E2 on C1.10-alkyyli tai C7.10-fenyylialkyyli) ja R3 ja R2 ovat • · · *·*·* sitoutuneet mainitun peptidin N-terminaaliseen amino- 30 happoon, joka voi olla A1, A2, A3, A4, A5, A6 tai A7, ja • · • ’·· edelleen edellyttäen, että kun joko Rx tai R2 on COE3 tai

»M

: COOEj, toisen täytyy olla vety ja kun joko R3 tai R4 on COEt tai COOE2, toisen täytyy olla vety, ja edelleen edellyt-·, täen, että kun A1 on pGlu, Rx:n täytyy olla vety ja R2:n 35 täytyy olla se osa Glu:sta, joka muodostaa pGlu:n imiini- 100719 6 renkaan, ja jokaisessa tähteessä A7, A8, A9, A11, A12 ja A13 toisistaan riippumatta tuon tähteen ja viereisen aminohappotähteen β-aminoryhmän typpiatomin väliseen amidisidok-seen osallistuva hiiliatomi voi olla karbonyyliryhmän 5 hiili tai voi olla pelkistetty metyleeniryhmän hiileksi edellyttäen, että ainakin yhden tällaisen hiiliatomin täytyy olla pelkistetty metyleeniryhmän hiileksi (s.o. ainakin yksi kohteena olevan peptidin CONH-sidos täytyy olla korvattu ei-peptidi-, s.o. pseudopeptidi-, CH2NH-sidoksel-10 la). (Jos tässä yhteydessä ei anneta D- tai L-isomeerista määrittelyä, tarkoitetaan luonnossa esiintyvää L-isomee-riä. )

Menetelmälle on tunnusomaista, että a) kiinnitetään C-terminaalinen aminohappotähde 15 kiinteään faasiin karboksyyliryhmästään; b) kytketään C-terminaaliseen aminohappotähteeseen valittu aminohappo peptidisidoksella, jolloin valitun aminohapon funktionaalinen ryhmä, jota ei tarvita kytkentään, suojataan ennen kytkentää ja suojaus poistetaan jälkeen- 20 päin; c) kytketään kiinteään faasiin kiinnitetyn peptidin N-terminaaliseen aminohappotähteeseen toinen valittu ami-nohappo peptidisidoksella kohdassa b) kuvatulla tavalla; . d) toistetaan vaihe c), kunnes saadaan peptidi, ; .·. 25 jolla on haluttu koostumus; ja • · · V | e) pilkotaan peptidi kiinteästä faasista ja modi- • t1 *..1 fioidaan peptidiä tarvittaessa edelleen.

• ♦ ♦ ( Edullisesti tehokkaassa bombesiiniantagonistipep- • # · *·1·1 tidissä on jokaisessa tähteessä A11, A12 ja A13 toisistaan 30 riippumatta hiiliatomi, joka osallistuu tuon tähteen ja • 1·· viereisen aminohappotähteen α-aminoryhmän typpiatomin vä- • · · : li seen amidisidokseen, joka hiiliatomi voi olla karbonyy- : liryhmän hiili tai voi olla pelkistetty metyleeniryhmän . hiileksi edellyttäen, että vähintään yksi tällainen hiili- 35 atomi täytyy olla pelkistetty metyleeniryhmän hiileksi.

7 100719

Edullisimmin bombesiiniantagonistipeptidistä puuttuvat tähteet A1 - A6 ja tähteen Leu13 ja tähteen Leu14 väliseen amidisidokseen osallistuva hiiliatomi on metyleeniryhmän hiili.

5 Toisen keksinnön mukaisesti valmistettujen pepti dien ryhmän muodostavat bombesiinisukuiset antagonisti-peptidit, jotka on saatu litoriinista ja joilla on seu-raava aminohappokaava:

10 R R

j 123456789 ---- 3

J^A -A -A -A -A -A -A -A -A

R ^ R

2 4 jossa A1 on pGlu, A2 on Gin, A3 on Trp, A4 on Ala, A5 on 15 Vai, A6 on Gly tai D-Ala, A7 on His, A8 on Phe tai Leu ja A9 on Met tai Leu edellyttäen, että tähteen A8 ja viereisen aminohappotähteen o-aminoryhmän typpiatomin väliseen amidisidokseen osallistuva hiiliatomi voi olla karbonyyliryh-män hiili tai voi olla pelkistetty metyleeniryhmän hiilek-20 si.

Tämän keksinnön mukaisesti valmistetut peptidit, joissa on pseudopeptidisidossubstituutio luonnossa esiintyvän peptidin aktiivisen kohdan sisällä, ovat antagonisteja luonnossa esiintyvän bombesiinipeptidin biologiselle : .·. 25 aktiivisuudelle lukuun ottamatta havaitsemaamme yhtä poik- *·*. · keusta: bombesiinin lineaarinen analogi Bim-26027 [Val10i|r • I» [CH2NH]Leu14] on luonnossa esiintyvän bombesiinin biologisen

• · I

l , aktiivisuuden agonisti. (Ei-peptidisidosten symbolina käy- « · · *·*·* tetään tässä termiä "i|f[CH2NH]" tai "ψ".) Niinpä keksinnön 30 mukaisesti valmistettujen peptidien kolmannen ryhmän muo- • · • *·· dostavat yllä esitetyn kaavan (1) mukaiset tehokkaat bom- • · · - V : besiiniagonistit, joissa tähteen A ja viereisen aminohap- .potähteen Ct-aminoryhmän typpiatomin väliseen amidisidok-; seen osallistuva hiiliatomi voi olla karbonyyliryhmän hii- 35 li tai voi olla ei-peptidisidos edellyttäen, että ei-pep-i ’ tidisidos voi olla karbonyyliryhmän hiili, joka on pelkis- „ 100719 tetty metyleeniryhmän hiileksi, edelleen edellyttäen, että vähintään yksi tällainen hiiliatomi täytyy olla pelkistetty metyleeniryhmän hiileksi. Edullisin on bombesiiniago-nisti, jolla on kaava pGlu-Gln-Arg-Leu-Gly-Asn-Gln-Trp-5 Ala-Val-Gly-His-Leu-Leu- [Val10i|r[CH2NH]Leu14] .

Muita agonistianalogeja ovat peptidit, joissa joko pseudopeptidisidos ei sijaitse luonnossa esiintyvän peptidin aktiivisessa kohdassa tai joissa kaksi aktiivisen kohdan aminohappotähdettä on korvattu statiinilla tai AHP-10 PA:11a.

(Statiinin kemiallinen rakenne on seuraava CH3, / CH3

CH

CH_ OH

15

NH-CH-CH—CH2-C02H

ja statiiniamidin rakenne on seuraava CH3N/CH3

20 <fH

CH2 oh NH^-CH - CH-CH2-CONK2 ;' ,, ja AHPPA:n kaava on seuraava: (3S,4S)-4-amino-3-hydroksi-5-fenyylipentaanihappo.) • · · : .·. 25 Niinpä neljännen keksinnön mukaisesti valmistettujen pep-

Ml · /, ; tidien ryhmän muodostavat tehokkaat bombesiiniagonistit, • ·· !..* jotka ovat luonnossa esiintyvän, biologisesti aktiivisen * . bombesiinin analogeja, jossa bombesiinissä on asemat A , A10, A11, A12, A13 ja A14 sisältävä aktiivinen kohta ja sitou-30 tumiskohta, joka vastaa bombesiinin sitoutumisesta kohde- * · : '·* solun reseptoriin, ja analogissa on joko (a) ei-peptidi-

• M

ί,ϊ : sidos bombesiinin aktiivisen kohdan ulkopuolella tai (b) vähintään yksi statiini- tai AHPPA-tähde aktiivisen kohdan ; kahden luonnossa esiintyvän aminohappon paikalla ja edel- 35 leen peptidi voi sisältää statiinin tai AHPPA:n, kun kaik- t · 9 100719 ki aminohappotähteiden väliset sidokset ovat peptidisidok-sia ja edelleen kun aminohappotähde on statiini tai AHPPA, kaavassa sen oikealla puolella oleva aminohappo puuttuu, jolloin analogi pystyy sitoutumaan reseptoriin ja statii-5 nin tai AHPPA:n ansiosta sillä on lisääntynyt biologinen aktiivisuus in vivo verrattuna luonnossa esiintyvään bom-besiiniin. Edullisin tässä ryhmässä on bombesiiniagonisti, jolla on aminohappokaava pGlu-Gln-Arg-Leu-Gly-Asn-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-[Sta13,Des Met14].

10 Keksinnön mukaisesti valmistetut bombesiinianta- gonistit ja -agonistit sopivat kaikenmuotoisten syöpien hoitoon, joissa syövissä bombesiinisukuiset aineet toimivat autokriinisinä tai parakriinisinä mitoottisina tekijöinä, erityisesti haimasyövässä ja pienisoluisessa keuh- 15 kosyövässä.

Kaavassa (1), kun Rx, R2, R3 tai R4 on aromaattinen, lipofiilinen ryhmä, in vivo aktiivisuus voi kestää kauan ja keksinnön mukaisesti valmistettujen yhdisteiden annostusta kohdekudokseen (esim. keuhkoihin) voidaan helpottaa.

20 Muut keksinnön piirteet ja edut käyvät ilmi seuraa- vasta sen edullisten suoritusmuotojen kuvauksesta sekä patenttivaatimuksista.

,, Edullisten suoritusmuotojen kuvaus

Kuvaamme ensin lyhyesti taulukon.

25 Taulukko • · ·.: : Taulukko I esittää pseudopeptidianalogien kaavat ja • j 125 S.*·: tulokset [ I]-GRP:n sitoutumisen aivokuoren ja 3T3-fib- : roblasti- tai hiiren fibroblasti-bombesiinireseptoreihin in vitro inhiboinnista sekä bombesiinin stimuloiman [3H]- • · 30 tymisiinin sisäänotosta viljellyillä 3T3-soluilla.

;·. Kuvaamme nyt keksinnön edullisten suoritusmuotojen • ·· *·;·. rakenteen, synteesin ja käytön.

• * ·

Rakenne • Keksinnön mukaisesti valmistetuissa peptideissä on • 35 kaikissa ei-peptidisidos vähintään yhdessä osoitetussa 100719 10 asemassa statiini- tai AHPPA-substituoituja analogeja, kuten sta13-des Met14-bombesiiniä, lukuun ottamatta. Ei-pep-tidisidoksella tarkoitetaan, että kahden tähteen väliseen sidokseen osallistuva hiiliatomi on pelkistetty karbonyy-5 liryhmän hiilestä metyleeniryhmän hiileksi. Peptidisidok-sen pelkistysmenetelmä, jolla tämä ei-peptidisidos saadaan, on kuvattu julkaisussa Coy et ai., US-patenttihake-musjulkaisu sarjanro 879 348, joka on siirretty samalle siirron saajalle kuin tämä hakemus ja joka on liitetty tä-10 hän viitteeksi. Mikä tahansa tai kaikki aminohapot bombe-siiniantagonistien asemissa 1-6 voidaan poistaa peptideistä, ja peptidit ovat kuitenkin aktiivisia antagonisteina tai agonisteina.

Keksinnön mukaisesti valmistetut peptidit voidaan 15 antaa käyttöön farmaseuttisesti hyväksyttävinä suoloina.

Esimerkkejä edullisista suoloista ovat terapeuttisesti hyväksyttävien orgaanisten happojen, esim. etikkahapon, maitohapon, maleiinihapon, sitruunahapon, omenahapon, askor-biinihapon, meripihkahapon, bentsoehapon, salisyylihapon, 20 metaanisulfonihapon, tolueenisulfonihapon tai pamoiiniha- pon, samoin kuin polymeeristen happojen, kuten tanniiniha-pon tai karboksimetyyliselluloosan, kanssa muodostetut .. suolat sekä epäorgaanisten happojen, esim. kloorivetyha- \ ' pon, rikkihapon tai fosforihapon kanssa muodostetut suo- *...1 25 lat.

• · : Bombesiiniantagonistien synteesi • · ·.1·· Seuraavassa esitetään bombesiiniantagonistien pGlu- ϊ#ί : Gln-Arg-Leu-Gly-Asn-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leui|r[CH2NH]Leu- :Y: nh2 synteesi. Muut bombesiiniantagonistit ja -agonistit • · 30 voidaan valmistaa tekemällä sopivat modifikaatiot seuraa- ;·. vaan synteesimenetelmään. Ensimmäinen vaihe on välituot- • ♦· teen pGlu-Gln-Arg( tosyyli )-Leu-Gly-Asn-Gln-Trp-Ala-Val- • · ·

Gly-His(bentsyylioksikarbonyyli )-Leui|r[CH2NH]Leu-bents- hydryyliamiinihartsin valmistus seuraavasti.

100719 11

Bentshydryyliamiini-polystyreenihartsi (Vega Biochemicals, Inc.) (0,97 g, 0,5 mmol) kloridi-ionimuodossa viedään Beckman 990B -peptidisyntetisaattorin reaktioas-tiaan, joka peptidisyntetisaattori on ohjelmoitu suorit-5 tamaan seuraava reaktiosykli: (a) metyleenikloridi, (b) 33-%:inen trifluorietikkahappo (TFA) metyleenikloridissa (2 kertaa 1 ja 25 min kumpikin), (c) metyleenikloridi, (d) etanoli, (e) metyleenikloridi ja (f) 10-%:inen trietyyli-amiini kloroformissa.

10 Neutraloitua hartsia sekoitetaan a-t-butoksikarbo- nyyli(BocJleusiinin ja di-isopropyylikarbodi-imidin (1,5 -mmol molempia) kanssa metyleenikloridissa yhden tunnin ajan, ja sitten saatu aminohappohartsi kierrätetään vaiheiden (a) - (f) läpi yllä mainitussa pesuohjelmassa. Boc- 15 leusiinialdehydi (1,25 mmol), joka on valmistettu käyttäen Fehrentzin ja Castron, Synthesis (1983) s. 676, kuvaamaa menetelmää, liuotetaan 5 ml:aan kuivaa dimetyyliformamidia (DMF) ja lisätään hartsi-TFA-suola-suspensioon, minkä jälkeen lisätään 100 mg (2 mmol) natriumsyaaniboorihydridiä 20 (Sasaki ja Coy, Peptides 8 (1987) 119 - 121; Coy et ai., yllä). Kun hartsiseosta on sekoitettu yksi tunti, se havaitaan negatiiviseksi ninhydriinireaktiossa (1 min), mikä osoittaa vapaan aminoryhmän täydellistä derivatisoitumis- : ta.

• · 25 Sitten seuraavat aminohapot (1,5 mmol) kytketään • · ;.* · peräkkäin di-isopropyylikarbodi-imidin (1,5 mmol) läsnä • · ;/·· ollessa, ja saatu aminohappohartsi kierrätetään pesu/suo- jaryhmien poistovaiheiden (a) - (f) läpi käyttäen samaa menetelmää kuin yllä: Boc-His( bentsyylioksikarbonyyli), • · 30 Boc-Gly, Boc-Val, Boc-Ala, Boc-Trp, Boc-Gln (kytkentä ek- ;·, viValentin määrän hydroksibentsotriatsolia läsnä ollessa), • · · *...t Boc-Asn (kytkentä yhden ekvivalentin hydroksibentsotriat- • · · solia läsnä ollessa), Boc-Gly (kytkentä 6 mol/1 ylimääränä ; p-nitrofenyyliesteriä), Boc-Leu, Boc-Arg(tosyyli), Boc-Gln • : 35 (kytkentä 6 mol/1 ylimääränä p-nitrofenyyliesteriä) ja 100719 12 pGlu. Sitten valmis hartsi pestään metanolilla ja kuivataan ilmassa.

Yllä kuvattua hartsia (1,6 g, 0,5 mmol) sekoitetaan anisolin (5 ml) ja vedettömän fluorivedyn (35 ml) kanssa 5 0 °C:ssa, ja seosta sekoitetaan 45 minuuttia. Ylimäärä fluorivetyä haihdutetaan nopeasti kuivalla typpivirralla, ja vapaa peptidi saostetaan ja pestään eetterillä. Puhdis-tamaton peptidi liuotetaan pienimpään mahdolliseen määrään 2 mol/1 etikkahappoa ja eluoidaan Sephadex G-25 -pylväässä 10 (2,5 x 100 mm) (Pharmacia Fine Chemicals, Inc.). Sitten UV-absorption ja ohutlevykromatografiän (TLC) perusteella pääkomponentin sisältävät fraktiot yhdistetään, haihdutetaan pieneen tilavuuteen ja viedään oktadekyylisilaanipii-dioksidipylvääseen (2,5 x 50 cm) (Whatman LRP-1, 15-20 15 pm:n mesh-koko).

Peptidi eluoidaan käyttäen lineaarista 0 - 30 % asetonitriiligradienttia 0,l-%:isessa trifluorietikkahapon vesiliuoksessa. Fraktiot tutkitaan TLCtllä ja analyyttisellä korkeapainenestekromatografiällä (HPLC) ja yhdiste-20 tään, jolloin saadaan paras mahdollinen puhtaus. Liuoksen toistettu kylmäkuivaus vedestä tuottaa 60 mg tuotetta valkoisena, höytyväisenä jauheena.

.. Tuote havaitaan homogeeniseksi HPLC:n ja TLC: n

• I

:(ii avulla. Happohydrolysaatin aminohappoanalyysi varmistaa 25 peptidin koostumuksen. Leui|;[CH2NH]Leu-sidoksen läsnäolo • · · ϊ osoitetaan pommittamalla nopeilla atomeilla massaspektro- • · ·.*·· metrisesti.

• J ‘ pGlu-Gln-Arg-Leu-Gly-Asn-Gln-Trp-Alai|r[CH2NH]Val-Gly-

His-Leu-Met-NH2 ja pGlu-Gln-Arg-Leu-Gly-Asn-Gln-Trp-Ala-30 Val-Gly-His-Leui|i[CH2NH]Met-NH2 valmistetaan samanlaisin ;·. saannoin analogisella tavalla sopivasti modifioiden yllä olevaa menetelmää.

Statiini- ja AHPPA-tähde voidaan sijoittaa peptidin • · minkä tahansa kahden aminohapon paikalle, jolloin peptidi • 35 ei sisällä pseudopeptidisidoksia. Esimerkiksi sta13-des- : Met14-bombesiini valmistettiin analogisella tavalla kytke- 100719 13 mällä ensin statiini hartsiin ja etenemällä sitten Boc-His(bentsyylioksikarbonyylin) lisäyksellä. Statiini tai Boc-statiini voidaan syntetisoida käyttäen Rich et ai.'n, J. Organic Chem. 43 (1978) 3624, ja Rich et ai.'n, J. Med.

5 Chem. 23 (1980) 27, mukaista menetelmää, ja AHPPA voidaan syntetisoida käyttäen Hui et al.'n, J. Med. Chem. 30 (1987) 1287, mukaista menetelmää.

Sta13-Des-Met14-bombesiinin synteesi

Peptidin pGlu-Gln-Arg-Leu-Gly-Asn-Gln-Trp-Ala-Val-10 Gly-His-Sta-NH2 kiinteä faasi -synteesi suoritettiin käyttäen seuraavia menetelmiä, joissa a-t-butoksikarbonyyli-statiini [joka oli valmistettu käyttäen Rich et ai.'n, J. Org. Chem. 43 (1978) 3624, mukaista menetelmää] kytketään ensin metyylibentshydryyliamiini-polystyreenihartsiin.

15 Asetyloinnin jälkeen valmistetaan välituote pGlu-Gln-Arg-(tosyyli )-Leu-Gly-Asn-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(bentsyyliok-sikarbonyyli)-Sta-metyylibentshydryyliamiinihartsi. Tässä valmistuksessa käytetty synteesimenetelmä kuvataan seuraa-vassa yksityiskohtaisesti: 20 1. α-t-butoksikarbonyylistatiinin yhdistäminen me- tyylibentshydryyliamiinihartsiin.

Metyylibentshydryyliamiini-polystyreenihartsi(Vega .. Biochemicals, Inc.) (1,0 g, 0,73 mmol) kloridi-ionimuodos- sa viedään Vega 250C Coupler -peptidisyntetisaattorin [···' 25 reaktioastiaan. Syntetisaattori oli ohjelmoitu suoritta- • · · ··· · maan seuraavat reaktiot: (a) metyleenikloridi, (b) 10- • · ·. ·: %:inen trietyyliamiini kloroformissa, (c) metyleenikloridi • · · · ja (d) dimetyyliformamidi.

• ·

Neutraloitua hartsia sekoitetaan 18 tunnin ajan 30 aikaisemmin muodostetun aktiivisen esterin kanssa, joka oli tehty a-t-butoksikarbonyylistatiinista (1,46 mmol), di-isorpopyylikarbodi-imidistä (2 mmol) ja hydroksibentso-• triatsolihydraatista (1,46 mmol) dimetyyliformamidissa ' ’ 0 °C:ssa yhden tunnin ajan. Saatu aminohappohartsi pestään 35 syntetisaattorissa dimetyyliformamidilla ja sitten mety- 14 100719 leenikloridilla. Tässä vaiheessa hartsiseoksessa havaittiin Kaiserin ninhydriinitestiä (5 min) käyttäen 84-%:inen statiinin inkorporoitumistaso hartsiin.

Asetylointi suoritettiin sekoittamalla aminohappo-5 hartsia 15 minuuttia N-asetyyli-imidatsolin (5 mmol) mety-leenikloridissa kanssa. Derivatisoituminen 94 - 99 %:n tasolle hartsin vapaita aminoryhmiä osoitettiin Kaiserin ninhydriinitestillä (5 min). Boc-statiinihartsi pestään sitten metyleenikloridilla.

10 2. Jäljellä olevien aminohappojen kytkentä.

Peptidisyntetisaattori ohjelmoidaan suorittamaan seuraava reaktiosykli: (a) metyleenikloridi, (b) 33-%:inen trifluorietikkahappo (TFA) metyleenikloridissa (2 kertaa 5 ja 25 min kukin), (c) metyleenikloridi, (d) isopropyylial-15 koholi; (e) 10-%:inen trietyyliamiini kloroformissa ja (f) metyleenikloridi.

Sitten seuraavat aminohapot (2,19 mmol) kytketään peräkkäin di-isopropyylikarbodi-imidillä (4 mmol) yksin tai di-isopropyylikarbodi-imidillä (4 mmol) sekä hydrok-20 sibentsotriatsolihydraatilla (1,47 tai 0,74 mmol), ja saatu peptidihartsi pestään syntetisaattorissa dimetyylifor-mamidilla ja sitten metyleenikloridilla, minkä jälkeen se kierrätetään pesu- ja suojahmien poistovaiheiden (a) - (f) läpi yllä kuvatussa menetelmässä.

e··· 25 Boc-His(bentsyylioksikarbonyyli) (kytkentä kahden • · · ί·ί ί ekvivalentin hydroksibentsotriatsolia läsnä ollessa), Boc- • ·

Gly, Boc-Val, Boc-Ala, Boc-Trp, Boc-Gln ja Boc-Asn (kyt- • · · V ' kentä aikaisemmin muodostettuina hydroksibentsotriatsolin aktiivisina estereinä, jotka valmistettiin 0 °C:ssa yhden 30 tunnin reaktiolla yhden ekvivalentin hydroksibentsotriat-|’.e> solihydraattia kanssa); Boc-Gly, Boc-Leu, Boc-Arg(tosyy- li), Boc-Gln ja pGlu (kytkentä myöskin aikaisemmin muodostettuina aktiivisina hydroksibentsotriatsolin estereinä, ‘ ' jotka valmistettiin 0 °C:ssa yhden tunnin reaktiolla yhden • · 35 ekvivalentin hydroksibentsotriatsolihydraattia kanssa).

4 I

100719 15

Sitten valmis peptidihartsi pestään metanolilla ja kuivataan ilmassa.

Yllä kuvattua peptidihartsia (1,60 g, 0,73 mmol) sekoitetaan anisolin (2,5 ml), ditioerytreitolin (50 mg) 5 ja vedettömän fluorivedyn (30 ml) kanssa 0 °C:ssa yhden tunnin ajan. Ylimäärä vetyfluoridia haihdutetaan nopeasti kuivalla typpivirralla, ja vapaa peptidi saostetaan ja pestään eetterillä. Puhdistamaton peptidi liuotetaan 100 ml:aan 1 mol/1 etikkahappoa, minkä jälkeen liuos haihdute-10 taan alennetussa paineessa. Puhdistamaton peptidi liuotetaan pienimpään mahdolliseen tilavuuden metanoli/ vesi-seosta 1/1 ja trituroidaan kymmenen tilavuuden etyyliasetaattia kanssa.

Trituroitu peptidi viedään oktadekyylisilaanipii-15 dioksidipylvääseen (9,4 mm:n sisähalkaisija x 50 cm; Whatman Partisil 10 ODC-2 M 9). Peptidi eluoidaan lineaarisella 20 - 80 % gradientilla 0,1 % trifluorietikkahappo/ase-tonitriili-seosta 20/80 0,l-%:isessa trifluorietikkahapon vesiliuoksessa. Fraktiot tutkitaan TLCrllä ja analyytti-20 sellä korkeapainenestekromatografiällä (HPLC) ja yhdistetään, jolloin saadaan paras mahdollinen puhtaus. Liuoksen kylmäkuivaus vedestä tuottaa 77 mg tuotetta valkoisena, höytyväisenä jauheena.

Muut yhdisteet voidaan valmistaa yllä kuvatulla • < • · .·*· 25 tavalla ja testata agonisti- tai antagonistitehokkuuden • · · ··· | suhteen seuraavassa testiohjelmassa.

Vaihe 1 ··· *.* * 3T3-peptidin stimuloima [3H]-tymidiinin sisäänot- V.· tomääritys 30 Soluviljelmä. Swiss 3T3-solujen (American Culture ·*·.. Collection nro CCL 92) kantaviljelmiä kasvatetaan Dulbec- co's Modified Eagles Medium (DMEM) -väliaineessa, jota on • # täydennetty 10 % vasikan sikiön seerumilla, kostutetussa 10 % C02/90 % ilma-atmosfäärissä 37 °C:ssa. Kokeita varten 35 solut jaetaan 24-kuoppaisille yhdistelmälevyille ja käyte- 100719 16 tään neljän päivän kuluttua viimeisestä väliaineen vaihdosta. Solut otetaan talteen solusyklin Gl/GO-vaiheessa vaihtamalla seerumia sisältämättömään DMEM-väliaineeseen 24 tuntia ennen tymidiinin sisäänottomääritystä.

5 DNA-synteesin määritys. Solut pestään kahdesti 1 ml:n määrillä DMEM (-seerumi) -väliainetta, minkä jälkeen niitä inkuboidaan liuoksessa, joka sisältää DMEM (seerumi) -väliainetta. 0,5 pmol/l [metyyli-3H]-tymidiiniä (20 Ci/mmol, New England Nuclear), bombesiiniä (1 nmol/1) 10 ja neljä pitoisuutta testiyhdisteitä (1, 10, 100 ja 1 000 nmol/1) 0,5 ml:n lopputilavuudessa. 28 tunnin 37 -°C:ssa kuluttua [metyyli-3H]-tymidiinin sisäänotto happoon liukenemattomiin pooleihin määritetään seuraavalla tavalla. Solut pestään kahdesti jääkylmällä 0,9-%:isella NaCl:-15 11a (1 ml:n annokset) ja happoon liukeneva radioaktiivi suus poistetaan 30 minuutin inkuboinnilla (4 °C) 5 % tri-kloorietikkahapon (TCA) kanssa. Sitten viljelmät pestään kerran (1 ml) 95-%:isella etanolilla ja tehdään liukoisiksi 30 minuutin inkuboinnilla (1 ml) 0,1 mol/1 NaOH:n kans-20 sa. Liukoiseksi tehty materiaali siirretään pulloihin, jotka sisältävät 15 ml ScintA-liuosta (Packard), ja radioaktiivisuus määritetään nestetuikespektrometrisesti.

Vaihe 2

Pienisoluinen keuhkosyöpä (SCLC) - Bombesiinin sti-25 muloima [3H]-tymidiinin sisäänottomääritys • · ♦ · Soluviljelmä. Ihmissolun syöpäsolulinjan (NCI-H69) • tl *. *! viljelmiä (saatu American Type Culture Collection -talle- • · · * tuslaitoksesta) pidetään yllä RPMI 1640 -väliaineessa, • · V.i jota on täydennetty 10 % vasikan sikiön seerumilla, 10 % 30 C02/90 % ilma-atmosfäärissä 37 °C:ssa. 24 tuntia ennen mää- ·*·,, ritystä solut pestään seerumia sisältämättömällä väliai- neella ja viedään 24-kuoppaisille yhdistelmälevyille.

* , DNA-synteesin määritys. Bombesiiniä (1 nmol/1), 0,5 pmol/l [metyyli-3H]-tymidiiniä (20 Ci/mmol, New England ' * 35 Nuclear) ja neljä pitoisuutta testiyhdisteitä (1, 10, 100 • ·.. ja 1 000 nmol/1) lisätään viljelmiin, jolloin saadaan 0,5 17 100719 ml:n lopputilavuus. 28 tunnin inkuboinnin 37 °C:ssa kuluttua solut kerätään GF/B-lasikuitusuodattimille, ja DNA saostetaan jääkylmällä TCA:lla. [3H]-tymidiinin sisäänotto happoon liukenemattomiin DNA-fraktioihin määritetään nes-5 tetuikespektrometrisesti.

Vaihe 3

Peptidin indusoima haimatulehdus Näissä kokeissa käytetään Spraque-Dawley-urosrottia (250 g). Testiyhdiste tai 0,9-%:inen NaCl annetaan ihon 10 alle 15 minuuttia ennen bombesiini-injektiota. Bombesiini- injektiot annetaan ihon alle annoksena 10 pg/kg ja, verinäytteet otetaan 1,5, 3 ja 6 tunnin kuluttua. Plasman amylaasipitoisuus määritetään Pantrak-amylaasitestillä.

Vaihe 4 125 15 [ I]-gastriinia vapauttavan peptidin (GRP) sitou tumisen bombesiinireseptoreihin inhibointi in vitro

Eri kudoksista (rotan aivot, rotan haima, rotan aivolisäkkeen etuosa, SCLC, 3T3-solut) peräisin olevat kalvot valmistetaan homogenoimalla 50 mmol/1 Tris-HCl-pusku-20 riin, joka sisältää 0,1 % naudan seerumin albumiinia ja 0,1 mg/ml basitrasiinia ja sentrifugoimalla sen jälkeen kahdesti (39 000 x g, 15 min, 4 °C) suspendoiden välillä ;·. tuoreeseen puskuriin. Määritystä varten pieniä määriä : '· 125 ... (0,8 ml) inkuboidaan 0,5 nmol/1 [ I]-GRP:n (2 000 Ci/- • · .*** 25 mmol, Amersham Corp. ) ja eri pitoisuuksien testiyhdisteitä • · · ··· | kanssa 0,5 ml:n lopputilavuudessa. 30 minuutin 4 °C:ssa « · ♦ *. ”· inkuboinnin jälkeen sitoutumisreaktio pysäytetään suodat- • · · V : tamalla nopeasti Whatman GF/C-suodattimien läpi, joita oli · ϊ.ϊ.ϊ ennalta liuotettu 0,3-%:isessa polyetyleeni-imiinin vesi- 30 liuoksessa epäspesifisen sitoutumisen vähentämiseksi. Suo-dattimet ja putket pestään kolmesti 4 ml:n määrällä jää-kylmää puskuria, ja suodattimiin kiinnittynyt radioaktii- • . visuus mitataan gammaspektrometrisesti. Spesifinen sitou- : 125 tuminen määritetään sitoutuneena [ I]-GRP:n kokonaisak- 35 tiivisuutena vähennettynä 1 000 nmol/1 bombesiinin läsnä • ·.. ollessa sitoutuneella aktiivisuudella.

ie 100719

Vaihe 5

Gastriinin vapautumisen inhibitio

Nukutettujen rottien mahat perfusoidaan fysiologisella suolaliuoksella, ja liuos kerätään 15 minuutin ajan-5 jaksojen kuluessa mahaportin kanyylin kautta, kun taas testipeptidi infusoidaan reisivaltimon kautta 0 - 150 minuutin ajanjakson kuluessa.

Testipeptidien koetulokset

Monia bombesiinianalogeja, jotka kaikki sisälsivät 10 ei-peptidisidoksen, syntetisoitiin ja testattiin yhdellä tai useammalla yllä kuvattujen vaiheiden 1-5 määritysmenetelmällä; vaiheiden 1, 2 ja 4 koetulokset on annettu tähän liitetyssä taulukossa 1 (bombesiinianalogit on merkitty symbolilla "BN"). Aivojen ja 3T3-GRP:n reseptori-15 sekä tymidiinin sisäänoton tulokset on ilmaistu IC50:nä (nmol/1). Taulukossa annetaan myös tulokset kolmen muun luonnossa esiintyvän peptidin analogeille, jotka sisältävät ei-peptidisidoksia, nimittäin substanssi P:n (jolla on osa kivun tuntemisessa), neuromediini C:n, jonka C-termi-20 naaliset seitsemän aminohappoa ovat samanlaiset kuin bom-besiinin, ja litoriinin, jonka kahdeksan C-terminaalista aminohappoa ovat identtisiä bombesiinin kanssa lukuun ot-tamatta Phera Leu:n sijasta bombesiinin asemassa A13, ana- • 4 1 ]... logeille.

25 Taulukossa 1 ei-peptidisidoksen asema on osoitettu » · · ·1· | symbolilla ψ, s.o. ψ on aina esitetty ennen sitä aminohap- • · · *· " poa, joka tuossa peptidissä on sitoutunut siihen nähden N- t · · V 1 terminaaliseen aminohappoon ei-peptidisidoksella. Kun ami- • · ί.ί.: nohappoa ei ole spesifioitu "rakenne"-sarakkeessa, kuten 30 BIM-26034, ei-peptidisidos liittää ne kaksi peptidiä, joi- ·1·.. ta yläviitteissä annetut numerot edustavat (esim. BIM- .1j1; 26034:n aminohappojen 7 ja 8 välillä, joka analogi muuten • . on identtinen luonnossa esiintyvän bombesiinin kanssa).

Taulukosta 1 voidaan nähdä, että edullinen ei-pep- I · 35 tidisidoksen paikka bombesiinianalogeissa on 13 - 14-ase- 100719 19 ma; kaksi aktiivisinta analogia (josta on osoituksena alhainen GRP-reseptorin IC50-arvo) ovat BIM-26027 ja BIM-26028. BIM-26027 aiheuttaa kuitenkin syöpäsolujen lisääntymistä (ks. taulukko 1, tymidiinin sisäänotto) ja on si-5 ten agonisti eikä antagonisti. Yleisesti yhdisteet, joissa ei-peptidisidos on missä muussa asemassa tahansa kuin peptidin aktiivisessa kohdassa, ovat pikemminkin agonisteja kuin antagonisteja. Taulukko 1 osoittaa myös, että kun statiini korvaa bombesiinin A13- ja A14-tähteet, syntynyt 10 bombesiinianalogi BIM-26096 aiheuttaa syöpäsolujen lisääntymistä ja on siten agonisti. Bombesiinin superagonistit saattavat olla käyttökelpoisia syövän hoidossa, kuten Alexander et ai.. Cancer Research 48 (1988) 1439 - 1441 ja Alexander et ai., Pancreas 3 (1988) 297 - 302, jotka jul-15 kaisut on liitetty tähän viitteiksi, ovat ehdottaneet. Alexander et ai. osoittavat, että pitkäaikainen bombesii-nihoito inhiboi hiiriin, joilta oli poistettu kateenkorva, istutetun ihmisen maitotiehyeen adenokarsinooman kasvua. Nämä tulokset olivat hämmästyttäviä, sillä bombesiini sti-20 muloi normaalin haimakudoksen kasvua. Sekä stimuloivan että inhiboivan aktiivisuuden osoittaminen viittaa siihen, että bombesiini toimii eri lailla normaalissa ja neoplas-tisessa haimakudoksessa.

« <i Nämä havainnot saivat meidät tutkimaan BIM-26096;n, • I *

• I

25 bombesiinianalogin, jolla on bombesiininkaltainen agonis-

• · I

| tiaktiivisuus, vaikutusta haiman kasvainsolulinjan (AR42J) • · ·

*· kasvuun in vitro. Näissä kokeissa AR42J-soluja (ATCC CRL

·*· *.* * 1492) viljeltiin 24-kuoppaiselle viljelylevylle Dulbecco's • · ·.·.· Modified Eagle's Medium -väliaineessa, joka sisälsi 10 % 30 vasikan sikiön seerumia ja eri pitoisuuksia (0,1 - 100 nmol/1) BIM-26096-analogia. 36 tunnin inkuboinnin jälkeen :’j*: solut poistettiin kuopista trypsiini/EDTA-liuoksella, ja ‘ . solujen lukumäärä laskettiin käyttäen Coulter Counter ] -solulaskinta. Tulokset on esitetty alla: « • < * » 20 100719 Käsittely Solujen lukumäärä (% kontrollista)

Kontrolli 100 BIM-26096 (0,1 nmol/1) 78 BIM-26096 (1,0 nmol/1) 73 5 BIM-26096 (10 nmol/1) 56 BIM-26096 (100 nmol/1) 52 Nämä tulokset osoittavat, että bombesiiniagonis-tilla BIM-26096 on in vitro antiproliferatiivista aktii-10 visuutta AR42J-rotan haimakasvainta vastaan.

Lopuksi taulukko 1 osoittaa myös, että sidoksen paikka, vaikkakin se on tärkeä, ei ole ainoa tekijä, joka vaikuttaa antagonistiaktiivisuuteen ja että myös amino-happosubstituutioilla joissakin asemassa on vaikutusta; 15 tästä on esimerkkinä BIM-26030, jossa on Gly asemassa 11 ja jolla ei ole antagonistiaktiivisuutta. Taulukko 1 antaa myös negatiivisia tuloksia spantidi-([D-Arg', 7 9 D-Trp ' , Leu"], substanssi P- ja bombesiinianalogeille. Niinpä tässä annettujen ei-peptidisidoksen sijoitusoh-20 jeita tulisi käyttää yhdessä yllä kuvattujen rutiinimääritysten kanssa sopivien antagonistien ja agonistien valikoimiseksi .

Yllä esitetyssä vaihe 5:n määrityksessä, jonka tuloksia ei ole annettu taulukossa 1, analogin BIM-26028 , * · · *···. 25 osoitettiin olevan bombesiinin stimuloiman mahahapon eri- • · .**1 tyksen potentti inhibiittori.

• · ·

**· * Taulukossa 1 luetellut spantidi- ja substanssi P

• · · '·"· ("SP") -johdannaiset eivät kuulu keksinnön mukaisesti ♦ · · *·* * valmistettavien yhdisteiden suojapiiriin. Niillä tehtyjen « · ·.*.* 30 määritysten tulokset annetaan taulukossa 1 vain vertailu- tarkoituksessa. Taulukossa 1 esitetään vain yksi alytesii-nijohdannainen, nimittäin yhdiste BIM-26103. Alytesiini : (kuten GRP, litoriini, Neuromedin B ja Neuromedin C) on '. rakenteeltaan samanlainen kuin bombesiini ("BN"), ts. äly- . 35 tesiinijohdannaisen kantayhdiste on bombesiini. Bombesii- • · 21 100719 nin rakenne on esitetty taulukon 1 lopussa. Alytesiinin rakenne on [Gly2,Thr6]bombesiini eli alysetiini eroaa bom-besiinista vain asemien 2 ja 6 suhteen.

Taulukossa 1 luetelluista yhdisteistä vaatimusten 5 suojapiiriin eivät kuulu peptidit BIM-26056, BIM-26064, BIM-26070, BIM-26079, BIM-26080, BIM-26081, BIM-26082, BIM-26083, BIM-26084, BIM-26085, BIM-26088, BIM-26089, BIM-26090, BIM-26091, spantidi eikä bombesiini. Lisäksi peptidi BIM-26063 = BIM-26028, BIM-26072 = BIM-26073 = 10 BIM-26057, BIM-26074 = BIM-26067, BIM-26083 = BIM-26080, BIM-26084 = BIM-26081 ja BIM-26085 = BIM-26082.

Käyttö

Keksinnön mukaisesti valmistettuja peptidejä voidaan antaa imettäväiselle, erityisesti ihmiselle, jollakin 15 tavanomaisella tavalla (esim. suun kautta, ruoansulatuskanavan ulkopuolisesta, ihon läpi tai limakalvon läpi) pidennetyn vapautumisen antavana formulaationa käyttäen biologisesti hajoavaa, elimistöön sopivaa polymeeriä tai kohdeannostelua (esim. syöpää estävän bombesiinin tapauk-20 sessa keuhkoihin) käyttäen misellejä, geelejä ja liposome- ja·

Keksinnön mukaisesti valmistetut bombesiinianta- gonistit ja -agonistit sopivat kaikenmuotoisten syöpien hoitoon, joissa syövissä bombesiininsukuiset aineet toimi- .···. 25 vat autokriinisinä tai parakriinisinä mitoottisina ainei- • · na, erityisesti pienisoluisen keuhkosyövän hoitoon. Pepti- • · · *1* | dejä voidaan käyttää myös mahahapon erityksen inhiboimi- **..· seen, eksokriinisen haiman adenokarsinooman oireenmukai- • · · *·* * seen helpotukseen ja/tai hoitoon sekä ruokahalun palautta- W 30 miseen kakektisilla potilailla. Peptidit voidaan antaa ihmispotilaalle annoksena 0,5 pg/kg/päivä - 5 mg/kg/päivä.

• · ; *·· Joissakin syövän muodoissa, esim. pienisoluisessa keuhko- : : syövässä, edullinen annos parantavassa hoidossa on 250 : mg/potilas/päivä.

• · * 100719 22

Taulukko 1

Koodi Rakenne Aivojen 3T3-solu- Tymidiinin GRP-re- jen GRP- sisäänotto septori reseptori IC50 5 IC50 IC50 (nmol/1) (nmol/1) (nmol/1) BIM-26025 CH1i12tCCH2NH]leu,43BN >1000 10 8IH-26026 [A1a9ttCH2NH3l«U143BN >1000 1574 BIM-26027 CVä110tCCH2NH3LiUl4]8N 0,48 2,3 agonisti

EC50-0,07nM

BIM-26028 tLau131CCH2NH3LeuU]BN 13 14,7 15 BIM-26030 tGlyntCCH2NH3LlU143BN >1000 BIH-26034 [G1n7tCCHJIH]3BN >10001 BIM-26036 COes-pGlo^Gln2, 20 Ala%CCH2NH3Ph1123BM >1000 BIM-26046 tGlyUttCH2NH3D-Ph·12, leu143BN >1000 25 BIM-26048 [D-Ph#12ttCh2NH]LlU13,

Uu1438N >1000 « « • · • · · : BIM-26056 CUu10tCCH2NH3 *. ^·υ ^NH-3 substanssi B >1000 • · · 1 V ! 30 :V: BIM-26057 CCys9,\|rUu13,Cys,43BN >1000 • · 9 • · 9 9 9 · · · · « • 1 100719 23

Koodi Rakenne Aivojen 3T3-solu- Tymidiinin GRP-re- jen GRP- sisäänotto septori reseptori IC50 IC50 IC50 (nmol/1) (nmol/1) (nmol/1) 5 BIM-26Q61 CD-pGlU,D-AU8,Llu7t|i CCH2NH]Hlt81BN >1000 1Q 8IM-26062 CPh·1 ^CCHjNHjLeu143BN >1000 437 BIM-26063 tdes-G1ii7,Ltti13 ^CCH2NHHeu14]BN >1000 BIM-26064 (ψΙβυ^,ΝΙ·113 spantidi >1000 15 BIM-26067 Cdes-Gln7,L«u13ψ [CH2NH33BN >1000 BIM-26068 . CLeu13H>tCH,NH3 20 Ph.'‘)BN 2,9 70

BIM-26070 [0-TrpVcH2NM

Nle11] spantidi >1000 25 81M-26071 CTyr4,LiU13«j; .···. CCH2NH3-Met14]BN 34 16 104 • · · • · : 8IM-26072 CCys9,LtU13CCH2NHl

Cyj14]BN >1000 :T: 30 :X: BIH-26073 CCyi9,»|rUu,3[CH2NH]

Cys143BN >1000 100719 24

Koodi Rakenne _. . , _ .....

Aivojen 3T3-solu- Tymidiinin GRP-re- jen GRP- sisäänotto septöri reseptori IC50 IC50 IC50 (nmol/1) (nmol/1) (nmol/1) 5 βΙΗ-26074 COtJ-QIn^Uu^HiCCH.NH] • Ltu^lSN >10qq ΘΙΜ-26075 CO-Ph·11 W^tCHjjNH] iO Lcu^lBN >)000 8IM-2607 6 tO-Phf11 ,Uu13i|»tCH2NH]]

LeuUöN >1000 15 BIM-26077 tD-AU5,Uu,3vtCH2NHJ]

Leg14®N 517 186 1001 BIM-26078 CD-Ala11 ,LtU1\tCH2NHl t Leu143BN >1000 70 20 7 BIM-26079 CPh*>CCH2NH},Llun] spantidi >1000

BIM-26080 CÖliApCCHjNHjNll^J

.. 25 spantidi >1000 • O BIM-26081 CO-Trp^CCH2NH3 · -N1 ·3 31 spantidi >1000 • · • · · • · · :T: 30 BtM-26082 CPIltfycHjNHl-Nl·"] spantidi >1000 • · :·. BIM-26083 CGLnScCHjNHl-HI·11! '... spantidi >1000 25 100719

Koodi Rakenne Aivojen 3T3-Solu- Tymidiinin GRP-re- jen GRP- sisäänotto septori reseptori IC50 IC50 IC50 (nmol/1) 5 (nmol/1) (nmol/1) 8IM-26Q84 CD-Trp^CCH^Hl-Hl·11 spantidi >1000 10 8IM-26085 CPhe^CCHjNHi-NI·111 spantidi >1000 8IM-26086 CD-Ph112,Llu»l»tCH2NH1

Uu143BN >1000 15 α ia B1M-26088 CGly^MrtCHgNHlLeu1 ^ spantidi >1000 8IM-26089 tGln6vCCH2NJOLlU11 2q spantidi >10$>0

BIM-26090 C?he7^CCHaNH3Ltun J

substanssi P >1000 25 8IM-26091 CPhe8\lrtCH2NH],Leu11l substanssi P >1000 • · · • · • · • ·

BtM-26092 CLfU^tfiCHjNHJJ neuromediini C 242 466 26 100719

Koodi Rakenne Aivojen 3T3-solu- Tymidiinin GRP-re- jen GRP- sisäänotto septori reseptori IC50 IC50 IC50 (nmol/1) (nmol/1) (nmol/1) 5 BIM-26094 CD-A1A5,U,Uu131»CCH2NH3

LlU14]BN 1813 574

BIH-26095 C0-A1a6,llU9v|>tCH2NHJ

10 LIU10] litoriini 2623 1209 BIM-26096 [Sta13,D« Mlt143BN 33 agonisti

EC50-3nM

15 BtH-26097 CAc-ly17,leu13^CCH2KH]] BN?ej4 1000 >1000 BIM-26098 , Uyt7«l«U13t|»tCH2NH]1 bnW4 1000 20 BIM-26099 [Leu134»[CH2NH],Mlt3BN 73 78 BIM-26100 tPhl8HrCCH2NH]LlU9] litoriini 74 22 25 BIM-26101 Liu8i|»CCH2NH]Liu9 ]. litoriini 17^9 257 ΘΙΜ-26102 df^^.Ltu’.Thr^tPh·13 ψίΟΗ,ΝΗΐΒΝ 184 >100° • · • · · I..' 8IM-26103 LlU13t|iCCH9NH3Mlt14NH2 >1°°° >100° : : : 30 1 • # A-lytensiini • · · • · ♦ • · · « ♦ • · · 27 100719

Ktfodi Rakenne Aivojen 3T3-solu~ Tymidiinin GRP-re- jen GRP- sisäänotto septori reseptori IC50 IC50 IC50 (nmol/1) (nmol/1) (nmol/1) 5 0IH-261O4 0·5ί*6,Ηυ7,Ιίϋί3ψ • cch2hhibn >1000 spantidi tO» Arj* ,D-Trp^ * ®, L·!!11 ] 3303 2171 10 substanssi bombesiini pGlu-G1n-Arg-Liu-G1y-Asn- 15 0,17 G\n-Trp-Ala-Val-G1y-H\s-

Leu-Mit-NH2 15 • · · • · • · • · · • · • · · • · * • · · · • · • · · • · · • · • · · 11« • · · • · • · · • · · • · « · • ·

Claims (6)

100719

1. Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen bom-besiini- tai litoriiniantagonistipeptidin valmistamiseksi, 5 jolla on seuraava aminohappokaava: R x 123456789 10 ^ A -A -A -A -A -A -A -A -A -A -R ^ 10 2 11 12 13 14 A -A -A -A -Y jossa A1 = pGlu, D tai L tai puuttuu;

15 A2 = Gin, Asn, Gly, Phe, p-X-Phe (X = F, Cl, Br, OH tai CH3), β-naftyylialaniini tai puuttuu; A3 = Arg, D-Arg, Lys, D-Lys tai puuttuu; A4 = Gin, Asn, Gly, Ala, Leu, Ile, Nle, e-aminovoihappo, Vai, Phe, p-X-Phe (X = F, Cl, Br, OH tai CH3), β-20 naftyylialaniini tai puuttuu; A5 = Gin, Asn, Gly, Ala, Leu, Ile, Nle, a-aminovoihappo, Vai, Phe, D-Phe, p-X-Phe (X = F, Cl, Br, OH tai CH3), β-naftyylialaniini, D-Ala tai puuttuu; A6 = Gin, Asn, Gly, Ala, D-Ala, N-Ac-D-Ala, Leu, Ile, • 25 Nle, α-aminovoihappo. Vai, Phe, p-X-Phe (X = F, Cl, t · · Br, OH tai CH3), p-Glu, β-naftyylialaniini tai • · :.· : puuttuu; A7 = Gin, Asn, Ala, Leu, Ile, Nle, α-aminovoihappo. Vai, Phe, D-Phe, p-X-Phe (X = F, Cl, Br, OH tai CH3),

30 Lys, His tai β-naftyylialaniini; A8 = Trp; :·. A9 = Gin, Asn, Gly, Ala, Leu, Ile, Nle, a-aminovoihappo, |... Met, Vai, Phe, p-X-Phe (X = F, Cl, Br, OH tai CH3), Trp tai β-naftyylialaniini, D tai L; • · 35 A10 = Ala, Leu, Ile, Nle, α-aminovoihappo. Vai tai Thr; 100719 A11 = Gly tai Phe, D tai L; A12 = His, Phe tai p-X-Phe (X = F, Cl, Br, OH, CH3), D tai L; A13 = Ala, Leu, lie, Nle, α-aminovoihappo, Val, Phe, p-X-5 Phe (X = F, Cl, Br, OH tai CH3) tai β-naftyyliala- niini; ja Y on A14 - tai A14 , joissa R4

10 A14 = Ala, Leu, lie, Nle, 0-aminovoihappo, Met, Val, Phe tai p-X-Phe (X = F, Cl, Br, OH tai CH3); edellyttäen, että kukin R3, R2, R3 ja R4 toisistaan riippumatta on vety, C1_12-alkyyli, C7_10-fenyylialkyyli, COE2 (jossa E3 on C1.20-alkyyli, C3_20-alkenyyli, C3.20-alkynyyli, fenyy-15 li, naftyyli tai C7_10-fenyylialkyyli) tai COOE2 (jossa E2 on C1.10-alkyyli tai C7.10-fenyylialkyyli) ja Rx ja R2 ovat sitoutuneet mainitun peptidin N-terminaaliseen aminohappoon, joka voi olla A1, A2, A3, A4, A5, A6 tai A7, ja edelleen edellyttäen, että kun joko Rx tai R2 on COE2 tai COOE2, toi-20 sen täytyy olla vety ja kun joko R3 tai R4 on COEx tai COOE2, toisen täytyy olla vety, ja edelleen edellyttäen, että kun A1 on pGlu, Rx:n täytyy olla vety ja R2:n täytyy olla se osa Glursta, joka muodostaa pGlu:n imiinirenkaan, ja jokaisessa tähteessä A7, A8, A9, A11, A12 ja A13 toisistaan 25 riippumatta tuon tähteen ja viereisen aminohappotähteen e- • · *···1 aminoryhmän typpiatomin väliseen amidisidokseen osallistu- • · : va hiiliatomi voi olla karbonyyliryhmän hiili tai voi olla • # '·,'·· pelkistetty metyleeniryhmän hiileksi edellyttäen, että ί ainakin yhden tällaisen hiiliatomin täytyy olla pelkistet- 30 ty metyleeniryhmän hiileksi, tunnettu siitä, että • 9 a) kiinnitetään C-terminaalinen aminohappotähde kiinteään faasiin karboksyyliryhmästään; • « · , b) kytketään C-terminaaliseen aminohappotähteeseen t I I valittu aminohappo peptidisidoksella, jolloin valitun ami- · 35 nohapon funktionaalinen ryhmä, jota ei tarvita kytkentään, 100719 suojataan ennen kytkentää ja suojaus poistetaan jälkeenpäin; c) kytketään kiinteään faasiin kiinnitetyn peptidin N-terminaaliseen aminohappotähteeseen toinen valittu ami- 5 nohappo peptidisidoksella kohdassa b) kuvatulla tavalla; d) toistetaan vaihe c), kunnes saadaan peptidi, jolla on haluttu koostumus; ja e) pilkotaan peptidi kiinteästä faasista ja modifioidaan peptidiä tarvittaessa edelleen.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä tunnettu siitä, että valmistetaan bombesiinianta-gonistipeptidi, jolla on aminohappokaava; pGlu-Gln-Arg-Leu-Gly-Asn-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-15 Leuf[CH2NH]LeuNH2.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan litoriinianta-gonistipeptidi, jolla on seuraava aminohappokaava; 20 R R 2 123456789 — 3 ^ A -A -A -A -A -A -A -A -A R ^ R 2 4 25 jossa A1 merkitsee samaa kuin A6 patenttivaatimuksessa 1, III A2 merkitsee samaa kuin A7 patenttivaatimuksessa 1, A3 mer-: : : kitsee samaa kuin A8 patenttivaatimuksessa 1, A4 merkitsee samaa kuin A9 patenttivaatimuksessa 1, A5 merkitsee samaa • · kuin A10 patenttivaatimuksessa 1, A6 merkitsee samaa kuin 30 A11 patenttivaatimuksessa 1, A7 merkitsee samaa kuin A12 pa- • · · tenttivaatimuksessa 1, A8 merkitsee samaa kuin A13 patentti- .. vaatimuksessa 1 ja A9 merkitsee samaa kuin A14 patenttivaa- • · *,,, timuksessa 1, edellyttäen, että tähteen A8 ja viereisen ’·’ aminohappotähteen α-aminoryhmän typpiatomin väliseen ami- , i 35 disidokseen osallistuva hiiliatomi voi olla karbonyyliryh-• · 100719 män hiili tai voi olla pelkistetty metyleeniryhmän hiileksi.

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan litoriinianta-5 gonistipeptidi, jolla on seuraava aminohappokaava: pGlu-Gln-Arg-Leu-Gly-Asn-Gln-Trp-Ala-Valf[CH2NH] -Gly-His-Leu-Leu

5 A9 = Gin, Asn, Gly, Ala, Leu, lie, Nle, a-aminovoihappo, Met, Vai, Phe, p-X-Phe (X = F, Cl, Br, OH tai CH3), Trp tai β-naftyylialaniini, D tai L; A10 = Ala, Leu, Ile, Nle, α-aminovoihappo, Vai tai Thr; A11 = Gly tai Phe, D tai L;

10 A12 = His, Phe tai p-X-Phe (X = F, Cl, Br, OH, CH3), D tai L; A13 = Ala, Leu, lie, Nle, α-aminovoihappo, Val, Phe, p-X-Phe (X = F, Cl, Br, OH tai CH3) tai β-naftyylialaniini; ja

15 R3 / 3 Y on A14 - N , jossa \ *4 A14 = Ala, Leu, lie, Nle, α-aminovoihappo, Met, Val, Phe tai p-X-Phe (X = F, Cl, Br, OH tai CH3); 20 edellyttäen, että kukin R3, R2, R3 ja R4 toisistaan riippumatta on vety, C1_12-alkyyli, C7_10-fenyylialkyyli, COEj (jossa Ex on C1.20-alkyyli, C3_20-alkenyyli, C3_20-alkynyyli, fenyy-li, naftyyli tai C7_10-fenyylialkyyli) tai COOE2 (jossa E2 on C1.10-alkyyli tai C7.10-fenyylialkyyli) ja R3 ja R2 ovat si-·' 25 toutuneet mainitun peptidin N-terminaaliseen aminohappoon, ΦΦΦ joka voi olla A1, A2, A3, A4, A5, A6 tai A7, ja edelleen • · ·.· ; edellyttäen, että kun joko R3 tai R2 on COE3 tai COOE2, toi- sen täytyy olla vety ja kun joko R3 tai R4 on ΟΟΕχ tai COO- :T: E2, toisen täytyy olla vety, ja edelleen edellyttäen, että .V. 30 kun A1 on pGlu, R2:n täytyy olla vety ja R2:n täytyy olla se • · osa Glursta, joka muodostaa pGlu:n imiinirenkaan, ja jo- ... kaisessa tähteessä A7, A8, A9, A11, A12 ja A13 toisistaan • · * *... riippumatta tuon tähteen ja viereisen aminohappotähteen 0- aminoryhmän typpiatomin väliseen amidisidokseen osallistu-• 35 va hiiliatomi voi olla karbonyyliryhmän hiili tai voi olla 100719 pelkistetty metyleeniryhmän hiileksi edellyttäen, että ainakin yhden tällaisen hiiliatomin täytyy olla pelkistetty metyleeniryhmän hiileksi, ja joka on luonnossa esiintyvän, biologisesti aktii-5 visen nisäkkään GRP- tai sammakkoeläimen bombesiinin analogi, jossa on aktiivinen kohta, ja aktiivinen kohta sisältää asemat A9, A10, A11, A12, A13 ja A14 sekä sitoutumiskohta, joka vastaa bombesiinin sitoutumisesta kohdesolun reseptoriin, ja analogissa on joko (a) ei-peptidisidos muu-10 alla kuin aktiivisen kohdan sisällä olevissa tähteissä tai (b) vähintään yksi statiini- tai AHPPA-tähde kahden aktiivisen kohdan luonnossa esiintyvän aminohapon sijasta ja edelleen edellyttäen, että peptidi voi sisältää statiinin tai AHPPA:n, kun kaikki aminohappojen väliset sidokset 15 ovat peptidisidoksia ja edelleen edellyttäen, että kun aminohappotähde on statiini tai AHPPA, kaavassa sen oikealla puolella oleva aminohappo on poistettu, jolloin analogi pystyy sitoutumaan reseptoriin ja statiini- tai AHPPA-tähteen ansiosta sillä on lisääntynyt biologinen 20 aktiivisuus in vivo verrattuna luonnossa esiintyvään bom-besiiniin, tunnettu siitä, että a) kiinnitetään statiini- tai AHPP-tähde hartsiin; b) kiinnitetään C-terminaalinen aminohappotähde ·, kiinteään faasiin karboksyyliryhmästään; 2. c) kytketään C-terminaaliseen aminohappotähteeseen • · · • · · *" 1 valittu aminohappo peptidisidoksella, jolloin valitun ami- • · · *· 1· nohapon funktionaalinen ryhmä, jota ei tarvita kytkentään, • · ♦ V 1 suojataan ennen kytkentää ja suojaus poistetaan jälkeen- • · päin; 30 d) kytketään kiinteään faasiin kiinnitetyn peptidin N-terminaaliseen aminohappotähteeseen toinen valittu ami-:1·1; nohappo peptidisidoksella kohdassa b) kuvatulla tavalla; e) toistetaan vaihe c), kunnes saadaan peptidi, jolla on haluttu koostumus; ja ; 35 100719 f) pilkotaan peptidi kiinteästä faasista ja modifioidaan peptidiä tarvittaessa edelleen.

5. Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen bom- besiiniagonistin valmistamiseksi, jolla on seuraava aminohappokaava : R ! 123456789 10

15. A -A -A -A -A -A -A -A -A -A - r/ 2 11 12 13 14 A -A -A -A -Y 20 jossa A1 = pGlu, D tai L tai puuttuu; A2 - Gin, Asn, Gly, Phe, p-X-Phe (X = F, Cl, Br, OH tai CH3), β-naftyylialaniini tai puuttuu; A3 = Arg, D-Arg, Lys, D-Lys tai puuttuu;

25 A4 = Gin, Asn, Gly, Ala, Leu, Ile, Nle, a-aminovoihappo, Vai, Phe, p-X-Phe (X = F, Cl, Br, OH tai CH3), β- • naftyylialaniini tai puuttuu; • · · · :*·.· A5 = Gin, Asn, Gly, Ala, Leu, Ile, Nle, a-aminovoihappo, Vai, Phe, D-Phe, p-X-Phe (X = F, Cl, Br, OH tai • · ·

30 CH3), β-naftyylialaniini, D-Ala tai puuttuu; * * A6 = Gin, Asn, Gly, Ala, D-Ala, N-Ac-D-Ala, Leu, Ile, Nle, α-aminovoihappo, Vai, Phe, p-X-Phe (X = F, Cl, • ♦ • ” Br, OH tai CH3), p-Glu, β-naftyylialaniini tai ' puuttuu; * ; 35 32 100719 A7 = Gin, Asn, Ala, Leu, lie, Nle, o-ami no voi happo, Vai, Phe, D-Phe, p-X-Phe (X = F, Cl, Br, OH tai CH3), Lys, His tai β-naftyylialaniini; A8 = Trp;

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä tunnettu siitä, että valmistetaan bombesiini-5 agonistipeptidi, jolla on aminohappokaava: pGlu-Gln-Arg-Leu-Gly-Asn-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-[Sta13,Des Met14]. t I i • · t · · • · · • ·« · • · • · · • ·· • · • · · • · · • · · • · • · · • · · • · • · • · • · · 1 · · • · · • · · 100719