HU205388B

HU205388B - Process for genetic transformation of plants

Info

Publication number: HU205388B
Application number: HU861955A
Authority: HU
Inventors: Nigel Harry Grimsley; Barbara Hohn; Thomas Hohn
Original assignee: Ciba Geigy Ag
Priority date: 1985-05-13
Filing date: 1986-05-12
Publication date: 1992-04-28
Also published as: AU595527B2; AR243235A1; IL78761A; CA1341290C; GB8611356D0; GB2174995A; IL78761A0; ATE88504T1; GB2174995B; ZA863485B; JP3057204B2; HUT41939A; EP0201904B1; BR8602126A; DD279503A5; DE3688301D1; AU5735686A; EP0201904A1; JPS61260886A

Description

A találmány tárgya új eljárás vírus DNS bevitelére növényi anyagba; a találmány kiterjed az új eljárással előállítható növényekre is.

Már számos esetben sikerült kiválasztott DNS-fragmenseket a vírus-DNS-be beépíteni és ezután a vírus 5 segítségével egy másik szervezetbe bevinni. Bár természetes körülmények között a legtöbb növényi vírust olyan rovarok terjesztik, amelyek a táplálékfelvétel során fertőzött és egészséges növényeket is fogyasztanak és így új növényi infekciókat okoznak, célzott és szisz- 10 tematikus infekcióátvitelhez ez a mód túl költséges és túlságosan nehezen ellenőrizhető. így például egy ilyen módszerhez ellenőrzött körülmények között tenyésztett rovarpopulációkra lenne szükség. Ezenkívül - különösen nagy mennyiségű növényi anyag esetén - igen 15 nehéz lenne tervszerű vírusinfekciót létrehozni. A levelek mechanikus inokulációja vírusokkal, amit a géntechnológiában alkalmaznak, csak korlátozottan használható, mert a klónozott vírus-DNS egyes esetekben fertőzőképes, számos más esetben viszont nem az. Bár 20 bizonyos vírusgenomfajták klónozhatok baktériumokban és így tanulmányozhatók is - mint például az egyfonalas DNS-t tartalmaző vírusok, amelyeket kettős hélixű DNS-klőnozásával nyernek [Mullineaux, P. M. et al.: EMBO J., 3, No. 13,3063-3068 (1984)] -mégis 25 számos, baktériumban klónozott vírust nem lehet újra bevinni a növényekbe vagy növényi anyag infekcionálására használni. Emiatt azonban az alapvető vizsgálatokban, továbbá az ilyen vírusok kiválasztott idegen DNS hordozójaként való felhasználásában kizárt az 30 olyan módszerek alkalmazása, mint az in vitro mutagenezis vagy a rekombináns DNS-technológia. Ilyesfajta problémák a találmány szerinti új eljárás alkalmazásánál nem merülnek fel.

A leírásban a következő definíciókat használjuk: 35

Transzfer mikroorganizmus:

T-DNS-határszekvencia (bordér sequence):

Cargo-DNS:

Növényi sejtkultúrák:

Teljesen transzformáit növény:

olyan mikroorganizmus, amely DNS-ének egy részét át tudja vinni a növényi anyagba (például az Agrobacteriumtumefaciens); 40 olyan DNS-szekvencia, amely egy vagy több másolatban mikrobiológiai funkciók segítségével létrehozza a DNS-átvitelt a 45 növényi anyagba; egy DNS-vektorba mesterségesen beépített DNS;

növényi részek, például 50 protoplaszt, sejtkultúrában levő sejtek, növényi szövet sejtjei, pollen, pollentömlő, petesejt, embriózsák, zigóta és embrió tenyészetei 55 különböző fejlődési stádiumokban;

olyan növény, amelyben minden sejt genomja a kívánt módon transzformált. 60

A találmány tárgya általánosán alkalmazható új eljárás vírus-DNS bevitelére növényi anyagba, különösen teljes növénybe vagy sejtkultúra sejtjeibe. Az eljárás értelmében úgy járunk el, hogy

a) növényi vírus DNS-t vagy ekvivalensét fertőzött növényi anyagból izolálunk és alkalmas baktériumok vektoraiba klónozzuk;

b) bakteriális plazmidot (BaP) építünk fel, amely egy Ti- vagy Ri-plazmidon alapul, olyan növényi vírusgenomot vagy vírosgenomrészt viszünk be az említett plazmidba, amely genomok vagy genomrészek egy vagy több T-DNS-határszekvencia szomszédságában találhatók, és a genomok vagy genomrészek, valamint a T-DNS-végszekvencíák közötti távolságot úgy választjuk meg, hogy a vírus eredetű DNS átvitelét, valamint az adott esetben abba beépített cargo-DNS bevitelét a növényi anyagba biztosítjuk;

c) vektorrendszer létrehozásához a BaP plazmidot egy Agrobacterium nemzetséghez tartozó transzfer mikroorganizmusba transzformáljuk, míg a replikont a transzfer mikroorganizmusba iktatjuk;

d) az így nyert vektorrendszerrel a növényi anyagot inficiáljuk.

Ez az eljárás biztosítja, hogy a plazmid-DNS-nek a növényi anyagba való beépülését elősegítő mikrobiológiai funkciók indukálása után a beépített vírus-DNS az adott esetben jelen levő cargo-DNS-t is beleértve beépüljün a növényi anyagba. Az így kapott transzformált növényi anyag teljesen transzformált növényekké reagálható.

A találmány szerinti eljárás lényegében a következő lépésekből áll:

a) vírus-DNS-nek vagy ekvivalensének (részletezése az alábbiakban) izolálása infíciált növényi anyagból, például valamilyen Brassica-fajtából, és ennek a DNSnek a klónozása egy megfelelő baktérium - például az Escherichia coli - vektoraiban;

b) egy olyan plazmid-jelölése a továbbiakban BaP - létrehozása, amely egynél több olyan vírusgenomot vagy virusgenomrészt tartalmaz, amelyek egy vagy több T-DNS-határszekvencia szomszédságában helyezkednek el; a vírus DNS és a T-DNS-határszekvencia vagy -határszekvenciák távolságát úgy választjuk meg, hogy a vírus DNS az adott esetben beleépített cargo-DNS-sel együtt átmenjen a növényi anyagba;

c) egy vektorrendszer létrehozása a BaP plazmidnak egy transzfer mikroorganizmusba (például Agrobacterium tumefaciens vagy Agrobacterium rhízogenes) való bevitelével;

d) a növényi anyag infekciója a c) lépésben ismertetett vektorrendszerrel.

A találmány tárgyát képezi a vektorrendszerek például a fenti c) lépésben leírt vektorrendszer - alkalmazása, valamint a találmány körébe tartoznak új vektorrendszerek - például az Agrobacterium tumefaciens A136 (pTiBo542, pEAP18: Ca305) törzs baktériumai és az Agrobacterium tumefaciens A136 (pTiBo542, pEAl) törzs baktériumai - is.

A Ti- vagy Ri-plazmidot tartalmazó mikroorganizmus alatt különösen baktériumokat, előnyösen talaj2

HU 205 388 Β baktériumokat és legelőnyösebben Agrobacteriumfajtához tartozó baktériumokat értünk.

Vírus-DNS és ekvivalensei alatt a következő, szisztemikus fertőzés létrehozására képes DNS-típusokat értjük:

- természetes vírus-DNS (például karfiolmozaik-vírus),

- egyfonalas DNS-t tartalmazó vírusok kettős hélixú

DNS formái (például geminivírusok),

- vírus- vagy viroid RNS cDNS másolata (például dohánymozaik-vírusból vagy Cadang-Cadang viroidból),

- vírusok minden letális vagy életképes mutánsa,

- virális replikációs és/vagy expressziós szignálok által meghatározott klónozott DNS,

- vírus DNS még fertőzőképes részei,

- az eddig felsorolt DNS-típusok ekvivalensei tandemformában,

- az eddig felsorolt DNS-típusok ekvivalensei beépített cargo-DNS-sel.

Növényi anyagként alkalmazhatunk teljes növényt és növényi részeket is. Növényi részek például a különböző fejlődési stádiumban lévő protoplasztok, sejtkultúrák sejtjei, a növényi szövet sejtjei, pollen, pollentömlő, petésejt, embriózsák, vagy zigóta. Előnyösen teljes növényt vagy sejtkultúrák sejtjeit alkalmazzuk.

A találmány szerinti eljárással igen sok növényi vírus infekciója megvalósítható; a nyitvatermők és a zárvatermők közül (a dísznövényeket is beleértve) az utóbbiak alkalmazása előnyösebb.

A zárvatermők közül a lombos fák és bokrok mellett különösen jelentősek a Solanaceae, Cruciferae, Malvaceae, Compositae, Liliaceae, Vitaceae, Chenopodiaceae, Rutaceae, Cucurbitaceae, Bromiliaceae, Rubiaceae, Theaceae, Musaceae vagy Gramineae növénycsaládba és a Leguminosae növényrendbe - ezen belül mindenekelőtt a Papilionaceae növénycsaládba - tartozó növények. Különösen előnyösek a Solanaceae, Cruciferae és Gramineae növénycsaládba tartozó növények.

Különösen ki kell emelni a nagy terméshozamú kultúrnövényeket, például a kukoricát, rizst, búzát, árpát, rozst, zabot és kölest.

Célkultúrák például a Solanum, Nicotiana, Gossypium (gyapot), Brassica (repce), Béta, Pisum, Phaseolus, Glycine, Helianthus, Allium, Triticum (búza), Hordeum (árpa), Avena (zab), Setaria, Sorghum (köles), Oryza (rizs), Zea (kukorica), Cydonia, Pyrus, Malus, Rubus, Fragaria, Prunus, Arachis, Secale, Panicum, Saccharum, Coffea, Camellia, Musa, Ananas, Vitis, Citrus vagy Persea (avocado) nemzetségbe tartozó növények.

Az infekciós eljárást elsősorban úgy hajtjuk végre, hogy a korábbiakban ismertetett transzfermikroorganizmust protoplaszttal hozzuk érintkezésbe vagy sérülést hozunk létre a teljes növényen vagy egy szövetdarabon és ezen keresztül inficiálunk.

A találmány szerinti eljárás az előbbiekben leírt vektonrendszer alkalmazásával számos előnyt biztosít az eddig alkalmazott eljárásokhoz képest. Ilyen előnyök például:

- vírusinfekciót hozhatunk létre olyan vírusokkal, amelyekkel korábban nem lehetett mesterségesen inficiálni (például a kukorica csíkosodását okozó Maize-streak vírus) a természetes tényezők, mint például rovarok kiiktatásával;

- lehetséges a vírus-DNS átalakítása egy baktériumrendszerben, például E. coliban;

- kiszélesíthető a vírusok gazdaterülete;

- az inokulálás leegyszerűsíthető a DNS-tisztítás elhagyása és az inokuláláshoz szükséges inokulummennyiség előteljes csökkenése révén;

- a bakteriálisán kódolt funkciók ellenőrzése révén a T-DNS, beleértve a kiválasztott vírus-DNS-t is, beépíthető a gazdaszervezet genomjába.

Mivel egy baktériumokkal végrehajtott transzformálás után a teljes növény regenerálható egyetlen sejtből, a vírus-DNS bevihető egy növény valamennyi sejtjének sejtmagban elhelyezkedő genomjába. Az ilyen integrált vírusgenomok

- szexuális úton átvihetők az utódokba;

- meggátolhatják a más típusú újabb vírusinfekciót;

- adott esetben mintaként szolgálhatnak további, adott esetben kiválasztott cargo-DNS-t is tartalamzó vírusmásolatokhoz, amelyek transzkripció, reverz transzkripció, homológ rekombináció vagy a genetikus anyag más módszerekkel való átalakítása révén válnak el az integrált másolattól;

- ezen felül a növényi anyagot - amely sejtmag-DNSébe beépített vírusgenomrészeket tartalmaz - másodinfekciónak („szuperinfekciónak”) is alávethetjük, és így

a) jobb vírusvektorokat fejleszthetünk ki, mivel a vírusgének expressziója a sejtmag DNS-ből esetleg megteremti annak lehetőségét, hogy a másodinfekcióban ható vírus vírus-DNS-ét idegen DNS-sel helyettesítsük;

b) jobban megérthetjük a gazdaszervezet-parazita viszonyt és ezzel jelentős mértékben hozzájárulhatunk a növények jobb megvédéséhez.

A találmány szerinti eljárás a növényvédelemben is alkalmazható a növények vírusfertőzések elleni „immunizálására” egy transzfer mikroorganizmus alkalmazásával a leírt módon; ebben az esetben a növényt legyengített, nem vagy csak enyhén patogén vírussal transzformáljuk.

Az ismertetett eljárás során a vírusgenomba beépített cargo-DNS is átmegy a növényi anyagba és abban továbbterjed. A vírusok és így az általuk bevitt idegen gének szétterjedése a növényben különösen akkor rendkívül előnyös, ha a növényt aszexuálisan akarjuk szaporítani vagy a káros behatások ellen direkt módon és a legrövidebb idő alatt akarjuk megvédeni (például rezisztenciát okozó gén bevitele a növénybe).

A találmány szerinti eljárás különösen kiválóan alkalmazható kiválasztott géneknek a növényi anyagba, például kifejlett növényekbe való bevitelére és a növényben való szétterjesztésére.

A DNS átvitelét a növényi anyagba valamilyen rendszer, például az An és munkatársai által ismertetett bináris vektoreendszer [An, G. et al.: EMBO J. 4, No.

HU 205388 Β

2, 277-284, (1985)] alkalmazásával végezhetjük. Ez a vektorrendszer javítható úgy, hogy például a növénybe átviendő DNS-homológ rekombinációját kiváltó szekvenciákat építünk bele.

A rekombináns DNS-mődszerek gyakorlati megvalósításánál, ha a szövegben nem utalunk a megvalósítás módjára konkrétan, általában a Maniatis és mtsai [Maniatis, T., Fritsch, E. F., Sambrook, J.: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Habor, USA (1982)] leírt általános előiratokat használtuk.

A könnyebb áttekinthetőség érdekében szükségesnek tartjuk, hogy a példákban említett reakciók során alkalmazott reakciókörülmények általános, részletes leírását, ill. a fent említett irodalmi hivatkozásoktól való esetleges eltéréseket a példák anyagától elválasztva, az elkövetkezőkben adjuk meg:

a) Hasítás restrikciós endonukleázok segítségével

A reakció során általánosságban 50-500 pg DNS-t alkalmazunk az enzimelőállító cég (New England Biolabs, Beverly, M. A. U.S.A) által javasolt pufferoldatban oldva. A DNS minden pg-jára számítva 2-5 egység restrikciós endonukleázt adagolunk az elegyhez, és azt a gyártó előírásai szerinti hőmérsékleten 1-3 óra időtartamig inkubáljuk. A reakció leállítására az elegyet 10 perc időtartamra 65 °C-ra hevítjük, vagy az elegyet fenollal extraháljuk, és a DNS-t alkohol adagolásával kicsapjuk.

b) A DNS polimerizációs kezelése, tompa végű

DNS-fragmens előállítása céljából

Az enzimelőállító cég (New England Biolabs, Beverly, M. A. U.S.A.) előírása szerinti pufferoldathoz miénként 50-500 pg DNS-fragmentumot adunk. Areakciőelegy a négy dezoxi-nukleotid-trifoszfátot 02 mM koncentrációban tartalmazza. Areakciőt 30 percig 15 °C hőmérsékleten hagyjuk végbemenni, majd az elegy 10 perces 65 °C-ra való hevítésével állítjuk le. Ha a DNS-ftagmentumot olyan enzimmel való emésztéssel nyertük, amely 5’ túlnyúló véget eredményez (pl. EcoRI, BamHI), enzimként a DNS-polimeráz nagy fragmentumát (Klenow fragment) alkalmazzuk, ha pedig a DNS-fragmens az enzimes emésztés után 3’ túlnyúló véget tartalmaz (PstI vagy SacI enzimekkel történő fragmentálás), polimerázként T4 DNS-polimerázt alkalmazunk.

c) A DNS-fragmentumok agarózgél-elektroforézise, ill. tisztítása

Az agarőzgél-elektroforézist horizontális elrendezésű kamrában, trisz-borát pufferben végezzük, Maniatis és mtsai [Maniatis, T., Fritsch, E. F., Sambrook, J.: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, USA (1982)] leírás alapján. A DNS-fragmentumokat 0,5 pg/ml etidium-bromiddal színezzük, amelyet vagy az elektroforézis során alkalmazott elektródvagy tankpufferbe adagolunk, vagy az elválasztás után alkalmazzuk a színezést. A DNS-t hosszúhullámú UV-fény alatt tesszük láthatóvá. Amennyiben a

DNS-fragmentumokat a gélből utólagosan ki akarjuk vonni, speciális alacsony hőmérsékleten gélesedő agarózt alkalmazunk (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, USA). Ez esetben az elektroforézis elvégzése után a kívánt fragmenst kivágjuk, műanyag csövecskébe visszük, 15 percre 65 °C-ra hevítjük, háromszor extraháljuk fenollal, majd a DNS-t kétszer etanollal kicsapjuk. Az agarózgélből való DNS-fragmentum kinyerésére alternatív eljárásként használhatjuk még a Geneclean Kit (Bio 101 Inc., La Jolla, CA, USA) felhasználásával való eljárást is.

d) Szintetikus llnketfragmensek beépítése a

DNS-szakaszok végére

Olyan esetben, amikor a DNS-moIekulafragmensek végén egy újabb restrikciós hasítási helyet akarunk kialakítani, a DNS-t először a b) pontban említett módon kezeljük, hogy tompa végű fragmenseket nyerjünk. Az így nyert DNS-preparátumból 0,1-1 pg mennyiséghez 10 pg foszforilezett linker DNS-t (New England Biolabs) adunk, 20-30 pl, a gyártó által javasolt puffer, valamint 2 pl T4 DNS-ligáz (New England Biolabs) és 1 mM ATP jelenlétében. A reakciót éjszakán át hagyjuk végbemenni, 15 °C hőmérsékleten, majd a reakció leállítására az elegyet 10 perc időtartamra 65 °C-ra hevítjük. Ezután a reakcióelegyet 100 pl, az alkalmazandó restrikciós enzimhez megfelelő pufferoldattal hígítjuk, majd 50-200 egységnyi enzimet adagolunk hozzá. Az emésztést 2-6 órán át végezzük, szobahőmérsékleten, azután a fragmenst a c) pontban ismertetett agarózgél-elektroforézises tisztításnak vetjük alá. A keletkezett fragmens kizárólag olyan végeket tartalmaz, amelyek a restrikciós enzimek hatására jöttek létre, és amelyek általában kellően reakcióképesek ahhoz, hogy hasonlóan ragadós véggel ellátott DNS-fragmentumokkal összekapcsolódjanak.

e) Az 5’ terminális foszfátcsoport eltávolítása

A plazmidklónozási lépések során a vektorplazmid foszfatázos kezelése a recirkularizálódás megakadályozása miatt lényeges. A megfelelő restrikciós endonukleázzal történő hasítás után a készítményhez 1 egység borjúgyomor alkalikus foszfatázt (BoehringerMannheim, Mannheim) adagolunk, a keveréket 1 órán át 37 °C-on inkubáljuk, végül kétszer fenollal extraháljuk, és a DNS-t etanollal kicsapjuk.

f) A DNS-fragmensek kapcsolása

Komplementer ragadós végekkel rendelkező DNSfragmentumok kapcsolásánál mindkét fragmensből 100-100 pg mennyiséget adagolunk 0,2 egység T4 DNS-ligáz (New England Biolabs, Beverly, M. A. U.S.A.) jelenlétében 20-40 pl, a gyártó által javasolt összetételű pufferbe. A keveréket 15 °C-on 1-15 órán keresztül inkubáljuk. Tompa végekkel rendelkező DNS-fragmensek ligálásánál hasonlóan járunk el, azzal a különbséggel, hogy az enzim mennyiségét 2-4 egységre növeljük.

HU 205 388 Β

g) A DNS transzformálása E. coliba

A transzformáláshoz a legtöbb esetben a HB 101 E. coli törzset használtuk. A transzformálást a Maniatis és mtsai [Maniatis, T., Fritsch, E. F., Sambrook, J.: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, USA (1982)] által leírt kalcium-kloridos módszerrel végeztük.

h) AzE. coli szkrínelése

A transzformálást követően a képződött telepek szkrínelését a Maniatis és mtsai [Maniatis, T., Fritsch, E. F., Sambrook, J.: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, USA (1982)] által leírt módszerrel végeztük.

i) A plazmid DNS nagybani izolálása

A plazmidok nagybani izolálását a Maniatis és mtsai [Maniatis, T., Fritsch, E. F., Sambrook, J.: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, USA (1982)] által leírt módszenei végeztük.

A következő példában - amelyben vírusként karfiolmozaik-vírust, klónozó baktériumként E. colit és transzportáló baktériumként Agrobacterium tumefacienst használunk - közelebbről szemléltetjük egy megfelelő vektorrendszer felépítését és alkalmazását. A példában leírt eljárás analóg módon megvalósítható Agrobacterium rhizogenes-szel is.

1,3-karfiolmozaikvírus-genomokat tartalmazó pCA305 bakteriális vektor előállítása

a) A pHC79 plazmid [Hohn, B. et al.: Gene, 11,

291-298, (1980)] EcoRI-hasítóhely és Clal-hasítóhely közötti kis fragmensét a pMON 30 plazmidból [a pMON120 egyik előfutára; Fraley, R. T. et al.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 4803-4807, (1983)] származó és a spectinomycin/streptomycin rezisztenciát kódoló EcoRI-Clal-fragmenssel helyettesítjük. A pHC79 és pMON30 plazmidot (egyenként 0,2-1,0 pg) először is 18 pl össztérfogatig vízzel összekeverjük. Ezt követően 2,0 pl tízszeresére töményített trisz-HCl-puffert [100 M NaCl, 50 mM trisz-Cl (pH 7,5); 10 mM MgCl₂, 1 mM ditiotreitol] adunk hozzá. 1-5 egység megfelelő restrikciós enzim (EcoRI és Clal) hozzáadása után a teljes anyagmennyiséget átkeverjük és 2-3 óra hosszat 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk.

Az emésztés befejezéséhez a következő összetételű „stop”-oldatot adunk hozzá:

M karbamid

50% szacharóz

50MEDTA

0,1% brőm-fenolkék pH 7,0.

A következőkben az emésztés eredményeként kapott fragmentumokat gélelektroforézissel nagyság szerint szétválasztjuk. Az agarózgél-elektroforézist horizontális készülékkel végezzük, ilyet ír le Maniatis és mtársai a 150-163. oldalon. Az alkalmazott puffer az ott ismertetett trisz-acetát-puffer. A DNS-fragmenst 0,5 pg/ml etidium-bromiddal színezzük, mely akár gél-akár tankpufferként van jelen az elektroforézis alatt vagy az elektroforézis után adjuk hozzá. A DNS-t hosszúhullámú ultraibolya fénnyel való megvilágítással láthatóvá tesszük. Ha a fragmenseket a géltől el kell választani, előnyösen ehhez agarózt használunk, mely alacsony hőmérsékleten gélesedik és például a Sigma Chemicaltól, St. Louis, Missouri, szerezhető be.

Az elektroforézis után a kívánt fragmentumot kivágjuk, plasztik csövecskébe visszük, kb. 15 percig 65 ’C-on melegítjük, háromszor fenollal extraháljuk és kétszer etanollal kicsapjuk. Ez az eljárás a Maniatis és mtsai (1982) 170. oldalán leírtakhoz képest kismértékben van modifikálva.

Alternatív megoldásként a DNS-t az agarózból Geneclean kitek segítségével (Bio 101 Inc., La Jolla, CA, USA) is izolálhatjuk.

Az előzőekben leírt módon izolált DNS-fragmenseket (a pHC79 plazmid nagy EcoRI/Clal fragmense, továbbá a spectinomycin/steptomycin hordozó EcoRI/Clal fragmens) kb. 100 pg koncentrációban 20-40 pl kb. 0,2 egység T4 DNS-ligázt (New England Biolabs) tartalmazó reakcióelegyben az előállító által ajánlott pufferben inkubálunk. Az inkubációt 1-20 óra hosszat 15 ’C hőmérsékleten végezzük. Az ebből a ligázreakcióból származó plazmidot pVl 18-ként jelöljük.

Az így kapott pV118 plazmidban az Sáli és BstEH hasítóhelyek közötti 2,5 kilobázis területet a karfiolmozaik-vírus S-ből [Hohn, T. et al., Current topics of microbiology, 96, 193-236, Springer Verlag Berlin, (1982)] az Sáli és BstEII hasítóhelyek közül kivágott 3,3-kilobázisos fragmenssel helyettesítjük.

A plazmid pV118-at először a fentiekben leírt módon Sall-gyel és BstEII-vel emésztjük. Ennél figyelni kell arra, hogy az itt alkalmazott BstEII restrikciós enzim előnyösen közepes ionerősségű pufferben [50 mM NaCl; 10 mM trisz-Cl (pH 7,5); 10 mM MgCl₂,1 mM ditiotreitol] kerül alkalmazásra. Az inkubálási hőmérséklet 60 ’C. A restrikciós enzim szimultán alkalmazása nem lehetséges. Az emésztés előnyösen azzal az enzimmel kezdődik, amely kisebb ionerősségnél inkubálódik, azaz ebben az esetben BstEHvel.

Az emésztés és a fragmenseknek gélelektroforézissel való szétválasztása után a nagy fragmenseket a gélből izoláljuk és egy ezt követő ligázreakcióban a fent leírt körülmények között a kicsi, 3,3 kilobázisos, a karfiolmozaik-vírus Sall/BstEII enzimekkel végzett emésztése után kapott karfiolmozaik-vírus „S” fragmensekkel összekapcsoljuk.

Az így kapott pCa 292 plazmidba a megmaradt Sáli hasítőhelyre egy teljes karfiolmozaik-vírus-CM-4184genomot [Howarth, A. H. et al.: Virology, 112, 678685 (1981)] ATCC PV 302, ATCC 45032 építünk be. Ezt úgy érjük el, hogy úgy a pCa 292 plazmidot és a karfiolmozaik-vírus CM 4184 törzset Sáli enzimmel a megadott körülmények között emésztjük és ezt követően ligálási reakcióban egymással összekapcsoljuk.

így a pCa 305 plazmidot kapjuk, amely a karfiolmozaik-vírus 1,3 genomjait tandemszerű elrendezésben tartalmazza (1. ábra).

HU 205 388 Β

b) Annak bizonyítására, hogy a fertőzóképes klónozott vírus DNS átvitelé'a fogadó növénybe nem az Agrobacterium sejtek lízise révén történik, a pGVllOő plazmidot (Leemans, J. et al.: Gene, 19, 361-364 (1982)], amelynek széles a gazdaterülete, az EcoRI enzimmel hasítjuk és a lineáris plazmidot a pCA305 egyedi Sphl hasítóhelyére beleépítjük. Az így kapott pEAl plazmidot Agrobacterium tumefaciensbe visszük be és az ott önálló osztódásba kezd.

Az 1. és 2. ábra jelöléseinek jelentése Ap®: ampicillin-rezisztencia

Sp®/Sm®: spectinomycin/streptomycinrezisztencia őri: replikációs origó bőm: mobilizációs origó

BstEII, Sphl, Sáli: RE-felismerőhely

I-VIL a karfiolmozaik-vírus nyílt leolvasási keret kb: kilobázis

A pCa305 és a pEAl plazmidok bevitele

Agrobacterium tumefaciensbe pCa305 és pEAl transzformálása E. coli GJ23-ba

A pCa305 és pEAl plazmidok E. coli GJ23-ba (pGJ28, R64 drdll) [van Haute et al. (1983)] való transzformálása kalcium-kloridos rendszer segítségével történik.

100 ml teljes tápközeget ©-médium) E. coli egy éjszakán át tenyésztett kultúrájával mint gazdasejtekkel beoltunk. A baktériumok az optimális 0,2-0,5 sűrűségig növekszenek (= 5·10⁷ ml), az optimális sűrűség meghatározása 650 pm hullámhossznál történik. A sejteket ezt követőén 5-10 percig ülepítjük (3000-4000 g-vel).

A baktériumpelletet 1/10 térfogat MgCh-dal újra szuszpendáljuk, és ismét ülepítjük. Az ülepített baktériumokat 1/20 térfogat CaCh-dal ismét szuszpendáljuk és 1,5-8 órán át jégfürdőn tartjuk. Ezután a baktériumszuszpenzióból 0,4 ml-t a DNS-plazmiddal elegyítünk és további 30 percig jégfürdőn tartjuk. A baktériumokat ezután rövid hősokkal kezeljük (2 perc 42 °C-on) és 5 ml folyékony teljes tápközeg hozzáadása után 30 percig 37 °C-on tovább tenyésztjük. A baktériumokat újra ülepítjük és 1 ml folyékony teljes közegben koncentráljuk. Ebből a koncentrátumból 0,1-0,1 ml mennyiségeket olyan L-agarra szélesztjük, amely ampicillinnel (100 gg/ml), streptomycinnel (100 pg/ml) és spectinomycinnel (50 pg/ml a pCa305 szelektálására), illetve kanamycinnel (50 pg/ml a pEAl szelektálására) dúsított.

Konjugált transzfer

Az E. coli GJ23 törzs lehetővé teszi a bom-hellyel rendelkező plazmidok Agrobacterium tumefaciensbe való konjugált átvitelét. Befogadó baktériumként két különböző Agrobacterium törzset alkalmazunk, amelyek egyaránt az Agrobacterium tumefaciens A 136-ból származnak és a vad típusú pTiBo542 Ti-plazmidot [Hood, Ε. E. et al. (1984)] tartalmazzák.

A donor és recipiens kultúrák tenyészeteit éjszakán át növesztjük és mindegyik tenyészetből 0,25 ml-t keverünk egymással. A baktériumokat 0,22 pm Millipore gyártmányú szűrőre koncentráljuk, mely egy LB-közegre van fektetve. A konjugációs anyagot éjszakán át 28 °C hőmérsékleten inkubáljuk. A szűrőt ezután LBközegben újra szuszpendáljuk. A nem konjugálódott rész szelekciójára e szuszpenzió alkalmas hígításait a szelektív közegre szélesztjük. {A konjugációs eljárás irodalma: Haute etal. [Embo J 2(3): 421-417,1983].}

Agrobacterium tumefaciens A136 (pHBo542,

PEAP18:pCa305)

a) ApCa305 plazmid befogadó baktériumaként Agrobacterium. tumefaciens A 136 (pTiBo542. pEAP18) törzset [Jásd Sciaky et al. (Plasmid 1:238-253,1978)] alkalmazunk. A pEAP18 egy bináris vektor, amelyet pCA472 plazmidból [An, G. et al.: EMBO J., 4, No. 2, 277-284, (1985)] konstruálunk. Az említett plazmidot először közepes ionerősségű pufferben [50 mM NaCl, 10 mM trisz-Cl (pH 7,5), 10 mM MgCl₂,1 mM ditíotreitol] 37 °C hőmérsékleten BamHI restrikciós enzimmel a fent leírtak szerint inkubáljuk. Ezt követően EcoRI-gyel való emésztés történik, nagy sókoncentrátum mellett. A pGA472 plazmid EcoRI-BamHI 6,7 kb-s fragmensét a pHC79 plazmid [Hohn, B. et al.: Gene, 11, 291-298 (1981)] 2,6 kilobázisos EcoRIBglII fragmensével helyettesítjük, mely a T-DNS-végszekvenciák között egy területet tartalmaz a pCa305 plazmid homológ rekombinációjára. {A BglIH-mal kis ionerősségű pufferben [10 mM trisz-Cl (pH 7,5);

mM MgCl₂,1 mM ditiotreitol], 37 ’C-os hőmérsékleten végezzük az emésztést}

Mivel a pCa305 plazmid az Agrobacterium tumefaciensben nem replikálódik, az exkonjugánsoknak a rifampicinre, spectinomycinre és treptomycinre végzett szelekciója egy új Agrobacterium törzset, az Agrobacterium tumefaciens A136 (pTiBo542, pEAP18::pCa305)-ot eredményez, amelyben a pCa305 plazmidot a pEAP18 bináris vektorba homológ rekombináció révén integráltuk. [Leemans, J. et al.: Génét, 1, 149-164, (1981)].

b) ApEAl plazmid befogadó baktériumaként Agrobacterium tumefaciens A136 (pTiBo542) törzset alkalmazunk. A pEAl plazmid megkötése, amely az Agrobacterium tumefaciensben önállóan replikálódik, az Agrobacterium tumefaciens A 136 (pTiBo542, pEAl) új törzset eredményezi. Az exkonjugánsokat a rifampicinre (szelektív az Agrobacterium tumefaciensre), a kanamycinre, a spectinomycinre és a streptomycinre szelektáljuk.

Az a) és b) pontban leírtak szerint kapott törzsek plazmidjait DNS-izolálással és hasítási térkép készítésével vizsgáljuk meg.

ApCa305 vagypEAl plazmidot tartalmazó

Agrobacterium törzsek átvitele Brassica rapa növényfajta egyedeire

Agrobacterium tumefaciens A 136 (pTiBo542, pEAP18::pCa305) vagy Agrobacterium tumefaciens A 136 (pTiBo542, pEAl) törzsbe tartozó Agrobacteriumokat40óra hosszat tenyésztünk YEB-közegben

HU 205 388 Β (1 liter víz, amely 5 g Bacto-Rinderextraktot, 5 g peptont, 5 g szukrózt, 1 g Bacto-Hefeextraktot és 2 mM magnézium-szulfátot tartalmaz), amely a plazmid szelektálására alkalmas spectinomycin és/vagy streptomycin antibiotikumokat tartalmaz. Az Agrobacteriumokat ezután centrifugálással és a korábban alkalmazott YEB-mennyiség térfogatának 1/100-ában való újra szuszpendálással dúsítjuk. Ebből a szuszpenzióból a levelek inokulálására 10 μΐ-t, a levélnyél inokulálására 20 μΐ-t használunk. Az inokulálást 3 hetes Brassica rapa c. v. Just Right növényeken végezzük, amelyeken vagy növényként 2 levélen sérülést hozunk létre kovafölddel bedörzsölve, vagy a növény talajfelszínhez közeli részén fogvájóval lyukat fúrunk a levélnyeleken. A sérüléseket azután az Agrobacterium szuszpenzió fent megadott mennyiségével kezeljük.

Eredmények

Míg az Agrobacterium tumefaciens A 136 (pTiBo542, pEAl) kontrolltörzzsel végzett inokulálás nem vezet vírusfertőzéshez, a vizsgált Agrobacterium tumefaciens A 136 (pTiBo542, pEAP18::pCa305) törzs szisztémikus karfiolmozaikvírus-infekciót okoz, általában körülbelül 3 hét alatt. Mivel mindkét törzs azonos elrendezésben tartalmaz 1,3 karfiolmozaikvírus-genomokat, az eltérő fertőzőképességből arra lehet következtetni,' hogy a vizsgált törzs esetében a növények infekciója a plazmidból származó, a T-DNS-végszekvenciák között elhelyezkedő vírus hatásának következménye, amelynek átvitelét a növényekre bakteriálisán kódolt funkciók segítik elő, és a növények infekciója nem az Agrobacterium sejtek DNS-felszabadulással járó lízisének következménye.

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Eljárás növényi vírus eredetű DNS bevitelére növényi anyagba, azzal jellemezve, hogy

a) növényi vírus-DNS-t vagy ekvivalensét fertőzött növényi anyagból izolálunk és baktériumvektorba klónozzuk;

b) bakteriális plazmidot (BaP) építünk fel úgy, hogy az a) lépés szerint izolált és klónozott növényi vírusDNS-t vagy ekvivalensét egy vagy több T-DNS-határszekvencia szomszédságába inszertáljuk;

c) vektorrendszert hozunk létre oly módon, hogy a BaP plazmidot és önálló replikációra képes Ti- vagy Ri-plazmidrészt egy Agrobacterium nemzetséghez tartozó transzfer mikroorganizmusba transzformáljuk;

d) a c) lépés szerint létrehozott, vektorrendszert tartalmazó transzfer mikroorganizmussal növényi anyagot infíciálunk.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy növényi vírus-DNS-ként természetes vírus-DNS-t izolálunk.
3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy növényi vírus-DNS-ként karfiolmozaik-vírusDNS-t izolálunk.
4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy növényi vírus-DNS-ként egyfonalas DNS-t tartalmazó vírusok DNS-ének kétfonalas formáját klónozzuk.
5. A 2-4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a növényi vírus-DNS tandem formáját klónozzuk.
6. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy növényi anyagként teljes növényeket vagy növényi részeket inficiálunk.
7. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy növényi anyagként teljes növényeket vagy növényi sejtkultúra-sejteket infíciálunk.
8. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a d) lépésben teljes növényen vagy növényi részeken, illetve szöveteken sérülést hozunk létre és azt az Agrobacterium nemzetséghez tartozó transzfer mikroorganizmussal inficiáljuk.
9. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy növényi vírus-DNS-ként olyan növényi vírust klónozunk, amely legyengített, nem patogén vagy csak gyengén patogén vírusból származik.