JPS61260886A - ウイルスｄｎａの植物材料への導入方法、該方法に使用するバクテリア及び該方法により感染した植物 - Google Patents

ウイルスｄｎａの植物材料への導入方法、該方法に使用するバクテリア及び該方法により感染した植物

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JPS61260886A
JPS61260886A JP61109363A JP10936386A JPS61260886A JP S61260886 A JPS61260886 A JP S61260886A JP 61109363 A JP61109363 A JP 61109363A JP 10936386 A JP10936386 A JP 10936386A JP S61260886 A JPS61260886 A JP S61260886A
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
    • C12N15/8205—Agrobacterium mediated transformation

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明はウィルスＤＮＡを植物細胞へ挿入するための新
規な方法及び該方法により得られる生成物に関する。
（従来の技術） 選択されたＤＮＡ断片をウィルスＤＮＡに導入し、その
後、それらを他の有機体にウィルスと共に導入すること
が多くの場合に可能であることは既に証明されている。
はとんどの植物ウィルスは、感染及び非感染植物を摂食
する昆虫により、自然の環境下で伝播され、これにより
植物の新たな感染がおこされるが、この経路はウィルス
の選択的且つ計画的な伝播を行なうには不便であシ、困
難である。従って、例えば、制御された条件下でその様
な方法を実施するためには、特別に繁殖させた昆虫の集
団が必要とされる。さらに、特に植物材料が大量である
場合には、制御されたウィルス感染を達成するのが非常
に困難であろう。ウィルスを葉に機械的に感染させる方
法は、遺伝子工学で用いられる方法であるが、クローン
化したウィルスＤＮＡはある種の植物には感染しても、
その他の多くの植物にはまだ感染することができないこ
とから応用範囲の限られた方法であるにすぎない。
ウィルスゲノムの種々の型、例えば２本＠　ＤＮＡをク
ローン化して得られる１本鎖Ｄ　Ｎ　Ａ　（Ｍｕ　−夏
１ｉｎｅａｕｘ　ｒ　Ｐ、Ｍ、　ｅｔ　ａｌ、、　１９
８４　）をバクテリア中でクローン化して研究すること
ができるが、バクテリア中でクローン化したウィルスの
多くは植物に再び導入しまたは植物を感染させる為に使
用することができない。従って、生体外で行なう突然変
異訪発及び組換えＤＮＡ技術の様な方法は、基礎研究並
びに選択された外来性ＤＮＡの担体としてのウィルスの
様な開発のためには用いることができない。下記に示す
本発明の方法を用いる場合にはこの様な問題は生じない
。
本発明の範囲内では各単語は下記に示すように定義され
るものとする。
トランスファー微生物：そのＤＮＡの一部を植物材料中
に伝達するこ とのできる微生物〔例 えばアグロバクテリウ ム　テユメ７アシエン ｘ　（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕ−ｍｅｆａｃ
ｉｅｎｓ　）　） Ｔ−レプリコン　　　：このレプリコン自体または同じ
微生物中の他 のレプリコンに存在す る遺伝子によって全部 または一部を植物細胞 中に輸送することがで きるレプリコン（例：ア グロバクテリウムテユ メファ７エンスのＴｉ −プラスミド） Ｔ−ＤＮＡ境界配列：１個もしくはそれ以上のコピーに
おいて、微生物 の機能によって植物Ｋ ＤＮＡを伝達することが できるＤＮＡ配列 カルゴＤＮＡ　　　　：ＤＮＡベクターに人為的に組み
込まれたＤＮＡ 植物細胞培養　　　二プロトプラスト、細胞培養、植物
組織中の細胞、 花粉、花粉管、卵細胞、 胚のり、接合体及び種々 の発達段階の胚の様な植 物単位の培養 完全に形質転換された：各細胞のゲノムが所望の細胞　
　　　　　　　方法で形質転換された植物 本発明はウィルスＤＮＡを植物材料、特に完全な植物体
または植物細胞培養細胞中にウィルスＤＮＡを導入する
ための、適用性の高い新規方法に関する。該方法は、本
質的に ａ）　ウィルスＤＮＡ、　　列えばカルゴＤＮＡを・含
んでいてもよいカリフラワーモザイクウィルス（ＣａＭ
Ｖ）を、Ｔ−レプリコン、例えばアクロバクテリウムの
Ｔｉ−プラスミドまたはＲｊ−プラスミド中の１個もし
くはそれ以上のＴ−ＤＮＡ４界配列の付近に、該ウィル
スＤＮＡと１個もしくはそれ以上のＴ−ＤＮＡ配列との
距離をウィルスＤＮＡが存在するカルゴＤＮＡと共に植
物材料中に導入されるように選択して挿入し、 ｂ）　　上記のＴ−レプリコンをトランスファー微生物
に導入し、そして ｃ）　　ｂ）に従って変性されたトランスファー微生物
を植物材料に感染させることからなる。
この方法は、プラスミドＤＮＡの植物体への導入を促進
するミクロパイアルファ／クシ１ンを誘導した後、存在
しうるあらゆるカルゴＤＮＡを含む挿入されたＤＮＡも
また導入されることが確実にされている。その様にして
得られた形質転換された植物材料は完全に形質転換され
た植物に再生される。
従って、本発明の方法は、本質的に下記の各段階からな
る。
ａ）感染した植物、例えばアブラナ属の植物のウィルス
ＤＮＡまたはその等制動（下記に示す）を単離し、その
後適当なバクテリア、例えば大腸菌のような宿主中で該
ＤＮＡをクローニングする： ｂ）　　１個もしくは七れ以上のＴ−ＤＮＡ境界配列の
付近に、該ウィルスＤＮＡと１ａ４Ｌ＜はそれ以上のＴ
−ＤＮＡ配列との距離をウィルスＤＮＡが存在するカル
ゴＤＮＡと共に植物材料中に導入されるように選択され
た位置にある１個以上のウィルスゲノムまたはその部分
を含有するグラスミド（Ｂａｐ　）を形成し、Ｃ）グラ
スミドＢａｐをトランスファー微生物（例えばアグロバ
クテリウム　テユメ７アシェンスもしくはアグロバクテ
リウム　リツォゲンス）に導入することＫよりベクター
系を形成し、 ｄ）植物材料をＣ）に従って形成されたベクター系で感
染させる。
ｃ）ＶＣ記滅したベクター系の使用法、並びにアグロバ
クテリウム　テエメファシエンス　Ａ１５６（ｐＴｉＢ
ｏ　５４２．　ｐＥＡＰ１８：：　Ｃａ　３０５　）及
びアクロバクテリウム　テエメ７アシエンスＡ１５６（
ｐＴｊＢｏ　５４２．　ｐＥＡｌ　）種ツバクチ１Ｊ７
（２）様な新規なベクター系もまた本発明の目的を構成
する。
特に適するＴ−レプリコンはバクテリアのレプリコンで
あシ、例えばアグロバクテリウムのレプリコン、好まし
く岐アグロバクテリウムのＴｉ−プラスミドまたは几ｉ
−プラスミドである。。
Ｔ−レプリコンを含む微生物は特にバクテリア、好まし
くは土壌細菌、とりわけアグロバクテリウム攬のバクテ
リアを意味するものと理解されるであろう。
ウィルスＤＮＡ及びその等制動は好ましくは下記のＤＮ
Ａタイプのものである〇 〇天然ウィルスＤＮＡ（例えばＣａＭＶ）０１本鎖ＤＮ
Ａウィルスの２本鎖ＤＮＡ型（例えばジエミニウイルス
） ０ウイルスＲＮＡまたはウィロイドＲＮＡのｃＤＮＡ　
複製権（例えばタバコモザイクウィルスまたはカダング
ーカダング（ｃａｄａｎｇ　−ｃａｄａｎｇ　）　　ウ
ィロイド Ｏウィルスの全ての致死及び生育突然変異体０ウイルス
の複製及び／または発現の影響下でクローン化されたＤ
ＮＡ ０ウイルスＤＮＡの部分 ０タンデム型である仁とを特徴とする上記ＤＮＡの等制
動 ＯカルテＤＮＡが挿入されていることを特徴とするＤＮ
Ａの等制動◎ 適する植物材料は植物体全部並びに植物の部分を包含す
る。植物の部分は例えばプロトゲラスト、細胞培養細胞
、植物ｍａ中のａｍ、花粉、花粉管、卯ａｌＪｉｉｌ　
、胚のり、接合体または種々の段階の胚である。植物体
及び細胞培養細胞が好ましい。
本発明の方法は全ての植物にウィルスを感染させるのに
適している。即ち裸子植物及び被子植物の組織単位（観
葉植物を含む）であり、後者が好ましい。
被子植物の中で特に好ましい植物は、落葉樹、潅木に加
えて下記の科の植物である：ナス科、ジェウジバナ科、
アオイ科、キク科、ユリ科、ブドウ科、アカザ科、マツ
カゼソウ科、ウリ科、アナナス科、アカネ科、ツバキ科
、バショウ科もしくはイネ科、並びにマメ科、特に蝴蝶
花亜科。好ましい植物はナス科、ジュウジバナ科及びイ
ネ科の植物である。
トウモロコシ、イネ、コムキ、オオムキ、ライムギ、オ
ートムギまたはキビのような収穫量の高い栽培植物は特
記すべきである。
目標とする作物は例えばナス属、タバコ属、綿Ｍ（綿）
、アブラナ属（アブラナ）、五菜桐、エントウ覆、イン
ゲンマメ属、ダイズ属、ヒマウリ属、ネギ桟、コムギ編
（小麦）、オオムギ属（大麦）、カラスムギ属（オート
麦）、セタリア属、モロコシ属（キビ）、イネ属（イネ
）、トウモロコシ属（トウモロコシ）、カリン属、ナシ
属、リンゴ属、イチゴ属、オランダイチゴ属、スモモ属
、ナンキンマメ属、ライムギ属、パニクム（Ｐａｎｉｃ
ｕｍ　）属、サトウキビ属、コーヒー属、ツバキ属、バ
シ鷲つ属、アナナス属、ブドウ属、種属及びアボガド属
（アボカド）の植物である。
感染方法は好ましくは、上記のトランスファー微生物を
プロトゲラストと結合するか、または植物体もしくは組
織片を傷つけ、続いてそれらを感染させることからなる
。
上記のベクター系を使用する本発明の方法を用いると従
来のベクター系を使用する方法に比べて著しい利点を得
ることができる。即ち、−人工的な手段では感染させる
ことができなかったウィルス〔例えばメイズストリーク
ライＡ／　ス（ｍａｉｚｅ　５ｔｒｅａｋ　ｖｉｒｕｓ
　）　）を感染させられるようになり、昆虫のような自
然のベクターを回避でき、 −Ｅ　ｃｏｌ　ｉのようなバクテリア系中のウィルスＤ
ＮＡの操作が可能になり、 一ウィルスの宿主の範囲が拡大し、 −ＤＮＡの精製を避けることにより接種を単純化するこ
とができ、接種に必要な接種物の量を実質的に減少する
ことができ、 −バクテリアの記号化された機能の支配下で選択された
ウィルスＤＮＡを含むＴ−ＤＮＡを宿主のゲノムに挿入
できるようになり、バクテリアで形質転換された１個の
植物細胞からの植物体全体の再生が可能となるため、植
物中の全ての細胞の核のゲノムにウィルスＤＮＡを導入
することができ、 −従って、有性的に子孫に遺伝することができ、−他の
ウィルスの感染を妨げることができ、−選択されたカル
ゴＤＮＡを含有するウィルスである複写物源が可能にな
シ、転写、逆転写、相同組換えまたは他の遺伝材料の変
質方法による複写を用いなくてもよく、 −さらに、核のＤＮＡに挿入されたウィルスゲノムの部
分を含有する植物の感染によシａ）核のＤＮＡのウィル
ス遺伝子の発現により、ウィルスＤＮＡを感染したウィ
ルスの外来性のＤＮＡに換えることができるため、よシ
優れたウィルスのベクターの発達が可能になり、そして ｂ）宿主−ベクター系のよシ深い解明と、実質的に植物
のより優れた保護を達成することができる。
本発明の方法は、また、植物を弱めた非病原性又はほん
のわずかな病原性のウィルスで変えることによって上記
したようにトランスファ微生物によるウィルスの攻撃に
対して“免疫性１植物にする植物保護に利用することも
できる。
また、本発明の方法により、ウィルスゲノムの中に挿入
したカルゴＤＮＡは、それが増殖する植物に移すことも
できる。ウィルスの植物中での増殖及びしたがってそれ
によって移された外来遺伝子の増殖もまた、植物を性と
は無関係にふやすこと又はそれらを直接及びできるだけ
短時間に悪影響から保護する（例えば耐性を与えるため
に植物に遺伝子を挿入することによシ）ことを望むとき
はいつでも特に有利である。
本発明の方法は、選んだ遺伝子を増殖させる植物、例え
ば成長した植物に入れるために特に適当である。
植物へのＤＮＡの導入は、公知のシステムの一つ、例え
ばアン、ジー、（Ａｎ、Ｇ、）　　ら、１９８５　によ
シ述ぺられたバイナリ　ペクタシステムによって行うこ
とができる。このペクタシステムは、例えば植物に導入
するＤＮＡの相同組換えのために配列を挿入することに
よシ改善することができる。
ＣａＭＹをライにスとして、大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ　
）をクローンバクテリアとして、そしてアグロバクテリ
ウム　テエメファシエ／ス　を伝達バクテリウムとして
用いる次の実施例によシ適当なベクタシスムの形成及び
使用を更に詳しく説明する。
ａ）　　Ｅ　ｃ　ｏ　ＲＩとＣ１ａ　Ｉ制限位置の間の
プラスミドｐＨ０７９（ホーン、ビー、（Ｈｏｈｎ　ｒ
　ＢＪ　　ら・１９８０’））の小域を、プラスミドｐ
ＭＯＮ　Ｓ　Ｏ（ｐＭＯＮ　１２０　　の前駆体；７ラ
レイ、アール。
イシン耐性をエンコードするＥｃｏＲＩ−Ｃ１ａＩと取
り換える。５ａｌＩとＢｓｔＥＩＩ制限位置の間の得ら
れたプラスミドの２．５　ｋｂ　　フラグメントを、５
ａｌＩ制限位置のＣａＭＶＳからＢｓｔＥＩＩ制限位置
までを切り取った１５ｋｂ　フラグメントと取り換える
　〔ホーン、　Ｂ、　（Ｈｏｈｎ　。
Ｂ、）ら、１９８２６））。次いで完全なＣａＭＶ　Ｃ
Ｍ−４１８４ゲノムを、そのようにして得たプラスミド
ｐＣａ２９２　の残りのＳａ１工制限位置に挿入し〔ホ
ワース、ニー、ジエー。
（１（ｏｗａｒｔｈ　、　　Ａ、　Ｊ、　）　、　　１
９８１　　）。
直列配列にＣａＭＶの１．５ゲノムを含有するプラスミ
ドｐｃａ３０５　　を得る（第１図）。
ｂ）受は入れ植物への伝染性クローンウィルスＤＮＡの
導入がアグロバクテリウム細胞の溶菌によって引き起こ
されないことを確立するために、広い宿主域を有するグ
ラスミドｐＧＶ１１０６　　（リーマンズ、ジ、　−（
Ｌｅｅｍａｎｓ、　Ｊ、）ら、１９８２）をＥｃｏＲｉ
　　酵素で切り、そしてｐｃａ５０５の単−ｓｐｈ　Ｉ
制限位置に導入する〇得られたグラスミドを人、テエメ
７アシエンスに挿入し、そこで独立して複製する。
図の略語 人ｐＲ：　　　　　アンピシリン耐性 Ｑｒｌ：　　　　　複製開始点 ｂｏｍ　１１　　　　　移動開始点 ＢｓｔＥＩＩ、　８ｐｈＩ、　５ａｌＩ　：制限位置ｋ
ｂ：　　　　　　キロベース ゛グラスミドｐｅａ　３０５及びｐＥＡｌのアグロバク
テリウム　テエメファシエンスへの導入プラスミドｐＣ
ａ　５０５及びｐＥＡｌ　はＥｓｃｈｅｒｉ−ｃｈｉａ
　Ｃｏ１１　ＧＪ　２３　（ｐＧＪ２８　；Ｒ６４ｄｒ
ｄｌｌ　）種のバクテリア中で各々形質転換される。こ
のＥ、　ＣＯＩ　ｉ菌によりアゲロバクチリア　テエメ
ファクエンスのｂｏｍ制限部位を有するプラスミドの接
合導入が行なわれる。受容体はアグロバクテリウムの２
つの異なった菌種であ）、両方ともアグロバクテリウム
　テ為メファシエンス　ｋ１５６起源のものであシ、原
株のＴｉ−プラスミドｐＴｉＢｏ　５ａ２　（１０）ホ
ット（Ｈｏｏｄ）　、　Ｅ、　Ｅ、　　等。
１９８４　）　　を含む。
ａ）　　Ａ、　　テエメｙアシｚｙｙ、Ａ　１５６　（
ｐＴｉＢ。
５４２、ｐＥＡＰ　１８　）　　はプラスミドｐＣａ　
５０５の受容体として使用される。ｐＥＡ、ＰＩ３は、
グラスミドｐＧＡ４７２の＆　７　ｋｂ　　ＥｃｏＲＩ
　−ＢａｍＨＩ断片（７ン（Ａｎ）　、　Ｇ、等、１９
８５）をプラスミドｐＨ０７９の２．７　ｋｂ　Ｅｃｏ
ＲＩ−Ｂｇｌ■断片（Ｈｏｈｎ　、　Ｂ、等、１９８０
）　　で置き換えることにより形成される二元性プラス
ミドであり、Ｔ−ＤＮＡ境界領域の間にプラスミドｐＣ
ａ　３０５　との相同組み換えのための領域を有する。
プラスミドｐＣａ　！ｌｏｓはＡ、テユメファシエンス
Ａ１３６　中では複製できないので、す７アンピシン、
スベクチノミシン及びストレプトマイシンに対する接合
完了体（ｅｘｃｏｎｊｕｇａｎｔｓ　）　　の選択によ
り、その中でプラスミドｐｃｉ３０５が二元性ベクター
ｐＥＡＰ１８　　ｉＣ相同組み換えにより挿入されてい
る新しい菌種であるＡ、チェメツアシエンｘＡ１３６　
（ｐＴｉＢｏ　５４２．ｐＥＡＰ１８：：ｐＣａ３０５
）を得ることができる。（１リリーマンス　　Ｌｅａｎ
ａｎｓｔ　　Ｊ、　　等、１９８１）ｂ）　　Ａ、テｘ
メフ７シエｙｘＡ１５６　（ｐＴｉＢ。
５４２）はプラスミドｐＥＡ１　　の受容体として使用
される。人、テエメファシェンス中で独立して複製され
るプラスミドｐＥＡ１の導入に！り新しい菌種のＡ、チ
ェメツ了シェンスＡ　１５６　（ｐＴｉＢｏ　５４２．
　ｐＥＡｌ　）が形成される。接合完了体としては、リ
ファンビクン（Ａ、テエメファシエンスについて選択的
）、カナマイシン、スペクチノマイシン及びストレプト
マイシンが選択される。
上記ａ）及びｂ）に記載したようにして得られた菌種の
グラスミドはＤＮＡの単離及び制限地図により試験され
る。
Ａ、テエメファシエンスＡ　Ｉ　Ｓ　６　　（ｐＴｉＢ
。
５４２、ｐＥＡＰ１８：：ｐＣａ５０５）　　菌種また
はＡ、テエメ７アクエンスｋｊ５６　（ｐＴｉＢｏ　５
４２゜ｐＥＡｌ）　　菌種のアゲロバクチリアをプラス
ミドの選択に適する抗生物質であるスペクチノマイシン
及び／またはストレプトマイシンを含有するＹＥＢ培地
〔水１１中、パクトビーフ（ｂａｃｔｏ　−ｂｅｅｆ　
）　　抽出物、ペプトン及びスクロース各々５ｐ、バク
トイ−スト（ｂａｃｔｏ　−ｙｅａｓｔ　）抽出物１１
及びＭｇＳＯ４２ｍＭ含有〕　中で４０時間培養する。
続いて遠心分離により菌の濃縮を行ないＹＥＢ培地（前
記で使用したＹＥ、Ｂの量による）に対して／１ｏｏの
体積となるように再懸濁する。３週令のブラッシカ　ラ
バＣ，Ｖ。
Ｊｕｓｔ　Ｒｉｇｈｔ　ｐ’１ａｎｔｓ　　の葉及び葉
柄にこの懸濁液１０　ｐｌ及び２０　Ｐ／　　を各々接
種する。接種は各々の植物の２枚の葉をセライ）　（ｃ
ｅｌｉｔｅ　）で傷つけることによって、または土壌表
面に近い葉柄の密集部分に殺菌したつまようじで穴を開
けることによ）行なわれる。従って、上記に示した量の
アグロバクテリウムの懸濁液は損傷した部分に接種され
る。
結果 対照用の菌種であるＡ、テエメファ７エンスＡ１５６　
（ｐＴｉＢｏ　５４２．ｐＥＡｌ　）にはウィルスは感
染しないが、試験菌種Ａ、テエメファシｘンスＡ　１３
ｏ　（ｐＴｉＢｏ　５４２．ｐＥＡＰ１８　：ｐｃａｓ
ｏｓ）　にはＣａＭＶ　Ｋよる全体的な感染が通常約３
週間後に見られた。２つの菌種は同じ配列のｔ、３ｃａ
ＭＶ　　ゲノムを含むため、試験菌種による植物の感染
がプラスミドではな（Ｔ−ＤＮＡ境界配列の間に位置す
るウィルスの結果であること、及び植物の感染がＤＮＡ
の世代を伴うアグロバクテリウム細胞の溶菌化には帰因
し得ないことは、バクテリアの暗号機能（ｂａｃ−ｔｅ
ｌｏｌａｌｌｙ　　ｃｏｄｅｄ　　ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ
　）によりウィルスの植物への導入を促進して感染度を
変えることによシ推測される。
文献 １、　ムリネアウックｘ　（Ｍｕｌ　ｌ１ｎｅａｕｘ　
）　、　Ｐ、Ｍ、　ｒＥＭＢＯＪ、ｓ、ム１３．５０６
５−５０６８．１９Ｂ４２−−ｙコブ（Ｊａｃｏｂ　）
　、　Ｆ、　’４．　Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂ
ｏｒ　Ｓｙｍｐ、　２８　、３２９　、１９６５工　ア
ン（Ａｎ）ｌＧｏ等、ＥＭＢＯＪ　、　４　、　ｘ　２
　。
２７７−２８４．１９８５ ４、　ホーｙ　（Ｈｏｈｎ　）　、　Ｂ、等ｒ　Ｇｅｎ
ｅ　１１．２９１−２９８．１９８０ ５　フラワー（Ｆｒａｌｅｙ　）　、　Ｒ，Ｔ、等、　
Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。
Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　　８０，４８０３−４８０
７゜＆　　＊−７（Ｈｏｈｎ　）　、　Ｔ、等、　Ｃｕ
ｒｒｅｎｔ　Ｔｏｐｉ　−ｃｓ　ｏｆ　Ｍｉｃｒｏｂｉ
ｏｌｏｇｙ　９６　、　（ｅｄ、　）Ｉｅｎｌｅ等）。
１９３−２５６．　８ｐｒｉｎｇｅｒ−ＶｅｒｌａｇＢ
ｅｒｌｉｎ、１９８２７、　　ハフース（Ｈｏｗａｒｔ
ｈ　）　、　Ａ、　Ｊ、等、Ｖｉｒｏ−１ｏｇｙ　１１
２，６７Ｂ−６８５，１９８１ａ　リーｖ　ｙ　ｘ　（
Ｌｅｅｍａｎｓ　）　ｔ　Ｊ、等、　Ｇｅｎｅｌ　　９
、　５６１−５６４．１９８２９　グアンホーテ（Ｖａ
ｎ　Ｈａｕｔｅ　）　、　Ｅ、等。
ＥＭＢＯＪ　、２．ム　５．　４１１−４１７．１９８
３１（Ｌ　　ホード（Ｈｏｏｄ　）　、　　Ｅ、　Ｅ−
等、　　Ｂ＋ｏ／　’ｌ’６−ｃｈｎｏｌｏｇｙ　、Ａ
ｕｇｕｓｔ　　１９８４１１、　　リー−ｒ　ｙ　ｘ　
（Ｌｅｅｍａｎｓ　）　ｒ　　Ｊ、等、　Ｇｅｎｅｔ。
１、　１４９−１６４．　　１９８１
【図面の簡単な説明】
図は本発明の一実施例で使用するプラスミドを示す図で
ある。 （ほか１名）

Claims (38)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）ａ）カルゴＤＮＡを含んでいてもよいウィルスＤ
    ＮＡを、Ｔ−レプリコン中の１個もしくはそれ以上のＴ
    −ＤＮＡ境界配列の付近に、該ウィルスＤＮＡと１個も
    しくはそれ以上のＴ−ＤＮＡ配列との距離をウィルスＤ
    ＮＡが存在するカルゴＤＮＡと共に植物材料中に導入さ
    れるように選択して挿入し、 ｂ）上記のＴ−レプリコンをトランスファー微生物に導
    入し、そして ｃ）ｂ）に従って変性されたトランスファー微生物を植
    物材料に感染させることを特徴とするウィルスＤＮＡを
    植物材料に導入する方法。
  2. （２）ａ）ウィルスＤＮＡまたはその等価物を感染した
    植物材料から単離し、適当なバクテリアのベクター中で
    該ＤＮＡをクローニングし、 ｂ）１個もしくはそれ以上のＴ−ＤＮＡ境界配列の付近
    の、該ウィルスＤＮＡと１個もしくはそれ以上のＴ−Ｄ
    ＮＡ配列との距離を、ウィルスＤＮＡが、挿入されたカ
    ルゴＤＮＡと共に植物材料中に導入されるように選択さ
    れた位置に１個以上のウィルスゲノムまたはそれらの部
    分を含むプラスミド（ＢａＰ）を形成し、 ｃ）上記プラスミド（ＢａＰ）をトランスファー微生物
    に導入することによりベクター系を形成し、 ｄ）ｃ）に従って形成されたベクター系により植物材料
    を感染させることからなる特許請求の範囲第１項記載の
    方法。
  3. （３）バクテリアのＴ−レプリコンを使用することを特
    徴とする特許請求の範囲第１項記載の方法。
  4. （４）アグロバクテリウム種のバクテリアのＴ−レプリ
    コンを使用することを特徴とする特許請求の範囲第１項
    記載の方法。
  5. （５）Ｔ−レプリコンがアグロバクテリウム種のバクテ
    リアのＴｉ−プラスミドもしくはＲｉ−プラスミドであ
    ることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の方法。
  6. （６）Ｔ−レプリコンの宿主である微生物がバクテリア
    であることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の方
    法。
  7. （７）Ｔ−レプリコンの宿主である微生物が土壌細菌で
    あることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の方法
    。
  8. （８）Ｔ−レプリコンの宿主である微生物がアグロバク
    テリウム種のバクテリアであることを特徴とする特許請
    求の範囲第１項記載の方法。
  9. （９）ウィルスＤＮＡとして天然ウィルスＤＮＡを使用
    することを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の方法
    。
  10. （１０）ウィルスＤＮＡとしてカリフラワーモザイクウ
    ィルスを使用することを特徴とする特許請求の範囲第１
    項記載の方法。
  11. （１１）ウィルスＤＮＡとして１本鎖ＤＮＡの２本鎖Ｄ
    ＮＡ型を使用することを特徴とする特許請求の範囲第１
    項記載の方法。
  12. （１２）ウィルスＤＮＡとしてジェミニウィルスのウィ
    ルスＤＮＡを使用することを特徴とする特許請求の範囲
    第１項記載の方法。
  13. （１３）ウィルスＤＮＡとしてウィルスＤＮＡ。 ｃＤＮＡ複製物を使用することを特徴とする特許請求の
    範囲第１項記載の方法。
  14. （１４）ウィルスＤＮＡとしてウイロイドＲＮＡのｃＤ
    ＮＡ複製物を使用することを特徴とする特許請求の範囲
    第１項記載の方法。
  15. （１５）ウィルスＤＮＡとしてウィルスの致死または生
    育突然変異体のウィルスＤＮＡを使用することを特徴と
    する特許請求の範囲第１項記載の方法。
  16. （１６）ウィルスＤＮＡとして、ウィルス複製シグナル
    の影響下でのクローン化ＤＮＡを使用することを特徴と
    する特許請求の範囲第１項記載の方法。
  17. （１７）ウィルスＤＮＡとして、発現シグナルの影響下
    でのクローン化ＤＮＡを使用することを特徴とする特許
    請求の範囲第１項記載の方法。
  18. （１８）ウィルスＤＮＡとして、複製及び発現シグナル
    の影響下でのクローン化ＤＮＡを使用することを特徴と
    する特許請求の範囲第１項記載の方法。
  19. （１９）ウィルスＤＮＡとして、ウィルスＤＮＡの部分
    を使用することを特徴とする特許請求の範囲第１項記載
    の方法。
  20. （２０）ウィルスＤＮＡをタンデム型で使用することを
    特徴とする特許請求の範囲第１項記載の方法。
  21. （２１）ウィルスＤＮＡまたはその等価物をタンデム型
    で使用することを特徴とする特許請求の範囲第９項ない
    し第１９項のいずれか１項に記載の方法。
  22. （２２）ウィルスＤＮＡを挿入されたカルゴＤＮＡと共
    に使用することを特徴とする特許請求の範囲第１項記載
    の方法。
  23. （２３）ウィルスＤＮＡまたはその等価物を挿入された
    カルゴＤＮＡと共に使用することを特徴とする特許請求
    の範囲第９項ないし第２０項のいずれか１項に記載の方
    法。
  24. （２４）植物材料が全植物体または植物の部分からなる
    ことを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の方法。
  25. （２５）植物材料が全植物体または植物の細胞培養物か
    らなることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の方
    法。
  26. （２６）植物材料がナス科、ジュウジバナ科、アオイ科
    、キク科、ユリ科、ブドウ科、アカザ科、マツカゼソウ
    科、ウリ科、アナナス科、アカネ科、ツバキ科、バショ
    ウ科もしくはイネ科並びにマメ科の植物またはその部分
    からなることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の
    方法。
  27. （２７）植物材料が蝴蝶花亜科の植物またはその部分か
    らなることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の方
    法。
  28. （２８）植物材料がナス科、ジュウジバナ科またはイネ
    科の植物またはその部分からなることを特徴とする特許
    請求の範囲第１項記載の方法。
  29. （２９）植物材料がトウモロコシ、稲、小麦、大麦、ラ
    イ麦、オート麦もしくはモロコシの植物体またはその部
    分からなることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載
    の方法。
  30. （３０）植物材料がナス属、タバコ属、綿属（綿）、ア
    ブラナ属（アブラナ）、■菜属、エンドウ属、インゲン
    マメ属、ダイズ属、ヒマウリ属、ネギ属、コムギ属（小
    麦）、オオムギ属（大麦）、カラスムギ属（オート麦）
    、セタリア属、モロコシ属（キビ）、イネ属（イネ）、
    トウモロコシ属（トウモロコシ）、カリン属、アン属、
    リンゴ属、イチゴ属、オランダイチゴ属、スモモ属、ナ
    ンキンマメ属、ライムギ属、パニクム（Ｐａｎｉｃｕｍ
    ）属、サトウキビ属、コーヒー属、ツバキ属、バショウ
    属、アナナス属、ブドウ属、橙属もしくはアボガド属の
    植物体またはそれらの部分であることを特徴とする特許
    請求の範囲第１項記載の方法。
  31. （３１）ウィルスＤＮＡの植物材料の挿入を、実質的に
    、そのＤＮＡを植物細胞に導入し、かつ１個もしくはそ
    れ以上のＴ−ＤＮＡ境界 配列の付近の、該ウィルスＤＮＡと１個もしくはそれ以
    上のＴ−ＤＮＡ配列との距離がウィルスＤＮＡの植物細
    胞への導入が行なわれるように選択された位置にウィル
    スＤＮＡを含むバクテリアからなるベクター系を用いて
    行ない、そして該ウィルスＤＮＡが挿入されたカルゴＤ
    ＮＡを含んでいてもよいことを特徴とする特許請求の範
    囲第１項記載の方法。
  32. （３２）プロトプラストがトランスファー微生物に結合
    されていることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載
    の方法。
  33. （３３）植物体を傷つけ、それにトランスファー微生物
    を感染させることを特徴とする特許請求の範囲第１項記
    載の方法。
  34. （３４）アグロバクテリウム　テュメファシエンスＡ１
    ５６（ｐＴｉＢｏ５４２、ｐＥＡＰ１８：：ｐＣａ５０
    ５）種のバクテリア。
  35. （３５）アグロバクテリウム　テュメファシエンスＡ１
    ３６（ｐＴｉＢｏ５４２、ｐＥＡ１）種のバクテリア。
  36. （３６）ａ）カルゴＤＮＡを含んでいてもよいウィルス
    ＤＮＡを、Ｔ−レプリコン中の１個もしくはそれ以上の
    Ｔ−ＤＮＡ境界配列の付近に、該ウィルスＤＮＡと１個
    もしくはそれ以上のＴ−ＤＮＡ配列との距離を、ウィル
    スＤＮＡが、存在するカルゴＤＮＡと共に植物材料中に
    導入されるように選択して挿入し、 ｂ）上記のＴ−レプリコンをトランスファー微生物に導
    入し、そして ｃ）ｂ）に従って変性されたトランスファー微生物を植
    物材料に感染させることを特徴とするウィルスＤＮＡを
    植物材料に導入する方法により感染させられた植物材料
    。
  37. （３７）ａ）カルゴＤＮＡを含んでいてもよいウィルス
    ＤＮＡを、Ｔ−レプリコン中の１個もしくはそれ以上の
    Ｔ−ＤＮＡ境界配列の付近に、該ウィルスＤＮＡと１個
    もしくはそれ以上のＴ−ＤＮＡ配列との距離をウィルス
    ＤＮＡが存在するカルゴＤＮＡと共に植物材料中に導入
    されるように選択して挿入し、 ｂ）上記のＴ−レプリコンをトランスファー微生物に導
    入し、そして ｃ）ｂ）に従って変性されたトランスファー微生物を植
    物材料に感染させることを特徴とするウィルスＤＮＡを
    植物材料に導入することにより感染させられた植物材料
    から複製された完全に形質転換された植物材料。
  38. （３８）ａ）カルゴＤＮＡを含んでいてもよいウィルス
    ＤＮＡを、Ｔ−レプリコン中の１個もしくはそれ以上の
    Ｔ−ＤＮＡ境界配列の付近に、該ウィルスＤＮＡと、個
    もしくはそれ以上のＴ−ＤＮＡ配列との距離をウィルス
    ＤＮＡが存在するカルゴＤＮＡと共に植物材料中に導入
    されるように選択して挿入し、 ｂ）上記のＴ−レプリコンをトランスファー微生物に導
    入することにより得られたトランスファー微生物を使用
    することにより、植物にウィルスに対する免疫を与える
    ための方法。
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