HU205129B - Process for producing lysoganglioside derivatives, as well as pharmaceutical compositions comprising such derivatives as active ingredient - Google Patents

Description

Találmányunk tárgya eljárás új h'zogangliozidok, valamint az ezeket a vegyületeket hatóanyagként tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására. Közelebbről, olyan N-acil-lizogangliozid-származékokrőI van szó, amelyeknek az acilcsoportja egy vagy több poláris csoporttal helyettesített alifás savból származik.

A lizogangliozidok olyan származékok, amelyeket gangliozidokból lehet előállítani a ceramidcsoport dezacilezésével, amely után csak a szfingozinrész marad vissza. A gangliozidok általában különböző vegyietekből álló elegyek. Ezeknek a vegyületeknek a szerkezete egységesen megadható az (I) általános képlettel, amely szerint a vegyületek molekuláiban vagy egy, kémiailag általában minden egyes gangliozidra jól definiált oligoszacharidrész, egy szialinrész - amelyet egy vagy több szialinsav alkot - és egy ceramidrész. Az utóbbi részeket általában különböző szialinsavak elegye, valamint különböző ceramidmaradékok alkotják.

A szialinsavak a (Π) képletű neuraminsavnak az acilezett származékai. A (Π) képletben levő aminocsoport ecetsavval vagy glikolsawal van acilezve és a hidroxilcsoportokat észterezni lehet ezekkel a savakkal. A ceramidcsoport a (IH) vagy (TV) képlettel megadott N-acil-szfíngozinnak felel meg. A (Hl) és (IV) képletben n-6-18 és az acílcsoport egy 16-22 szénatomos telített vagy telítetlen zsírsavból vagy az annak megfelelőhidroxi-karbonsavból származik.

Amint már említettük, a gangliozidokban a szialinés ceramidmaradékok a megadott képletű csoportok elegyei. Ez igaz még az irodalomban szereplő, tisztított gangliozidokra is. A gangliozidokban jelen levő szialinsavak száma általában 1 és 5 között van. A szialinmaradékok az oligoszacharidhoz ketozidos kötéssel kapcsolódnak, amelyet a 2-es helyzetben levő hidroxilcsoport hoz létre az oligoszacharid egyik hidroxilcsoportjával.

Abban az esetben, ha néhány szialinsav kapcsolódik össze, a kapcsolatot olyan ketozidos kötések biztosítják közöttük, amelyek két szialinsavmolekula 2-es, illetve

8-as helyzetben levő hidroxilcsoportjai között jönnek létre. A gangliozidok szialinsavjai és a korábban ismertetett módon tisztított gangliozidok szialinsavjai különböző, kémiailag egységes savaknak az elegyei; például N-acetil-neuraminsavnak és N-glikolil-neuraminsavnak az elegyei. Ezekben az elegyekben az elsőnek említett sav játszik domináns szerepet. Jelen lehetnek ezekben az elegyekben az említett savaknak az O-acilszármazékai, például a 8-O-acil-származékai.

Az oligoszacharidok legfeljebb 5 monoszacharidból vagy ezeknek a monoszacharidoknak valamilyen, acilamido-csoporttal helyettesített származékából épülnek fel; főleg hexózokból és azok előbb említett típusú származékaiból. Az oligoszacharidban azonban mindig jelen van legalább egy glükóz- vagy galaktóz-molekularész, amely cukroknak a leggyakrabban előforduló acil-amino-száimazéka az N-acetil-glükóz-amin és az N-acetil-galaktóz-amin.

Az előbbiek szerint definiált lizogangliozidokat a ceramid nitrogénatomján végrehajtott enzimatikus dezacilezéssel lehet előállítani. Kémiai dezacilezés esetén - például lúgos hidrolizálás esetén - más acil-aminocsoportok vagy észterezett hidroxilcsoportok dezacileződnek, így - elsősorban - a neuraminsav nitrogénatomján levő acílcsoport vagy azok az acilcsoportok, amelyek - rendszerint kisebb mértékben - adott esetben jelen vannak ezeknek a savaknak a hidroxilcsoportjaihoz kapcsolódva.

Amint az előzőekben említettük, a gangliozidokban a neuraminsav nitrogénatomjához kapcsolódó acilcsoportok ecetsavból és - adott esetben - sokkal kisebb mértékben - glikolsavből származnak. Szelektív reacilezéssel - például a szfingozin-amino-csoport átmeneti megvédését követően - az enzimatikus dezacilezéssel előállított lizogangliozidokhoz hasonló típusú termékek készíthetők, amelyek csak annyiban térnek el az enzimatikus dezacilezéssel előállítható termékektől, hogy csak a neuraminsav nitrogénatomján található acetilcsoport és - esetleg - abban, hogy a neuraminsav hidroxilcsoportjai nincsenek helyettesítve acilcsoportokkal. A dezacilezett származékoknak ez a csoportja kiindulási anyagul is szolgál új N-acil-lizogangliozidoknak az előállításához.

Bejelentésünkben a „lizogangliozidok” kifejezést használjuk mind az enzimatikus dezacilezéssel, mind az előzőekben ismertetett módon, kémiai dezacilezéssel előállítható vegyületek megjelölésére.

A gangliozidok tehát elsősorban az oligoszacharidrészt képező hexózmaradékok száma és fajtája, valamint az oligoszacharidrészhez kapcsolódó szialinsavmaradékok száma tekintetében különböznek egymástól. A legfontosabb gangliozidokban az oligoszacharidrészt legfeljebb négy hexózmaradék, mégpedig N-acetil-glükóz-amin- vagy N-acetil-galaktóz-amin mellett legalább egy glükóz- vagy galaktózmaradék képezi. Ilyen gangliozidok természetes anyagokból, főleg a gerincesek központi és perifériális idegrendszerének szöveteiből állíthatók elő. Ezeket a gangliozidokat közelebbről például a Glycolipid Methodology, Lloyd A. Witting kiadó, American Oil Chemists Society, Champaign IU, 1976, 187-214. oldalain a „Gangliosides of the Nervous System” (Az idegrendszer gangliozidjai) c. cikk ismerteti. A cikk I. táblázatában ismertetett gangliozidok, mint a GM₂, GM₃, GM^, GMi-GlcNAC, GD₂, GDu-GalNAC, Gq, GTi és GT_C mellett elsősorban a GMi, GDi„ GDi_b és GTn, emelendőkki, amelyek szerkezetét az alábbi képletek szemléltetik, amelyekben Glc glükóz-, Gál galaktóz-, GalNAC N-acetil-galaktóz-amin- és NANA n-acetil- neuraminosav-maradékot jelent.

GMi

Gál (1-+3) GalNAC (1-+4) Gál (1-+4) Glc (1-+1) ceramid

T

NANA

HU

GDla

Gal (l-»3) GalNAC (l->4) Gal (l->4) Glc (1-»1) ceramid

3

T ΐ

2

NANA NANA

GDib

Gal (l->3) GalNAC (l->4) Gal (l-»4) Glc (1->1) ceramid ΐ

NANA

GTib

Gal (1—>3) GalNAC (1—>4) Gal (l->4) Glc (1-»1) ceramid

3 t ΐ

2

NANA NANA

T 2

NANA

A természetes forrásokban, mint az emlős állati agyvelő- és perifériális idegi szövetekben és egyéb állati szervekben ezek a gangliozidok különböző gangliozidelegyek alakjában vannak jelen; ezekből az elegyekből az egyes gangliozidok, mint a jelen találmány szempontjából elsősorban fontos GMi gangliozid, amelynek kémiái szerkezetét az (V) képlet szemlélteti, ismert módon - például a leírásunkban idézett irodalomban ismertetett módszerekkel - elkülöníthetők, de gyakorlati célokra félhasználhatók a gangliozidok az állati szövetekből kinyerhető gangliozidelegyek, például az agy velőből kivonható GMi, GDu, GDib és GTib gangliozidokat tartalmazó elegyek alakjában is. így a jelen találmány szerint a GMi gangliozid vagy az említett gangliozidelegyek ceramidreszbeli acil-amino-csoportjának dezacilezése útján nyert lizogangliozidokból állítunk elő új N-acilezett származékokat.

A találmány tárgya tehát eljárás a lizo-GMl-gangliozid és gangliozidelegyek olyan új N-acil-származékainak az előállítására, amelyekben a ceramidrész aminocsoportjához kapcsolódó acilcsoport poláris szubsztituensként a

- klór-, bróm- vagy fluoratom,

- hidroxilcsoport,

- 1-7 szénatomos alkoxicsoport,

- karboxilcsoport,

- cianocsoport,

- adott esetben 1-4 szénatomos alkilcsoporttal éterezett merkaptocsoport,

- adott esetben 1-7 szénatomos alkilcsoporttal monovagy diszubsztituált aminocsoport, —SO3H szulfocsoport

129 B 2 szubsztituensek közül eggyel vagy többel helyettesített 2-20 szénatomos alkil-karbonil-csoport, vagy karboxilesoporttal helyettesített 3-7 szénatomos alkenil-karbonil-csoport lehet, valamint a szialinsavrész karboxilcsoportján képezett 1-7 szénatomos alkil-észtereik, 1-7 szénatomos alkil-amidjaik; a szialinsav aminocsoportján acetilezett vagy a gangliozid hidroxilcsoportjain 2-7 szénatomos alkanoilcsoporttal peracilezett származékaik, továbbá belső észtereik és sóik előállítására is.

A találmány körébe tartozik továbbá a fenti meghatározásnak megfelelő új gangliozidszármazékokat és gyógyászati szempontból elfogadható sóikat tartalmazó gyógyászati készítmények előállítása is.

A találmány szerint előállítható új N-acil-származékok a természetes gangliozidok félszintetikus analógjai, amelyek abban különböznek a természetes gangliozidoktól, hogy molekulájukban a szfingozinrészben egyetlen, jól definiált N-acilcsoport van, és ez az acilcsoport olyan savakból származik, amelyek lényegesen eltérnek azoktól a savaktól, amelyekből a természetes gangliozidokban jelen lévő acilcsoportok származnak. A természetes gangliozidok körében ugyan találtak már olyanokat, amelyek hidrolízistermékei között hidroxilcsoportokkal helyettesített hosszabb láncú alifás savak is előfordultak, de ilyen, a szfingozinrészben hidroxilcsoporttal helyettesített alkanoilcsoporttal Nacilezett gangliozidot eddig még soha nem különítettek el és nem is írtak le. így tehát a találmány szerinti eljárás termékei teljesen új, eddig le nem írt termékek.

Ezeket az új vegyületeket a találmány értelmében úgy állítjuk elő, hogy lizo-GMi-gangliozidot vagy lizoGMrgangliozid mellett más lizogangliozidokat is tartalmazó lizogangliozidelegyet- adott esetben az acilezőszerben lévő funkciós csoportok átmeneti megvédése után - a ceramidrész nitrogénatomján a fentebb felsorolt poláris csoportok közül eggyel vagy többel helyettesített 2-20 szénatomos alkánsavval vagy karbóxilcsoporttal helyettesített 3-7 szénatomos alkénsavval vagy reakcióképes származékával acilezünk; és kívánt esetben a kapott termék karboxilcsoportját 1-7 szériatomos alkilcsoporttal képezett észterré vagy 1-7 szénatomos alkilcsoportot tartalmazó alkil-amiddá ala- kítjuk, vagy hidroxilcsoportjait 2-7 szénatomos alkanoilesoporttal észterezzük; vagy e csoportok bevonásával belső észtert képezünk; és/vagy kívánt esetben a kapott termékből sót képezünk.

Ismeretes, hogy a gangliozidok fontos szerepet játszanak az idegrendszerben. Nemrégen kimutatták, hogy gangliozidokat eredményesen lehet használni a központi idegrendszert, valamint a perifériás idegrendszert érintő betegségek gyógyítására [Acta Psychiat. Scand., 55. 102. (1977); Eur. Medicophys., 13, 1. (1977); Ric. Sci. Educ. Perm. Suppl. 9. 115 (1978); Adv. Exp. Med. Bioi., 71. 275 (1976); Electromyogr. Clin. Neurophysiol., 19. 353 (1979); Minerva Medica, 69. 3277 (1978); Minerva Stomat., 27. 177 (1978); Med. dél Lavoro, 68. 296 (1977); Brain Rés. 197. 236 (1980)].

Úgy tűnik, hogy abban van a gangliozidok gyógyhatása, hogy stimulálják ezek a vegyületek az idegsejte3

HU 205 129 Β két és aktiválják a nervus stimuli ingerületvezetésében szerepet játszó membránenzimeket, így a (Na⁺, K⁺) ATPase [BrainRes., 197.236 (1980); J. of Neurochem. 37. 350 (1981)]. A gangliozidok által serkentett idegműködés elősegíti az érintett idegsejt funkcionális gyógyulását.

Más vizsgálatokat is végeztek, hogy találjanak olyan vegyületeket, amelyek az idegrendszer megbetegedéseinek gyógyításában hatásosabbak, mint a gangliozidok. Ezek a vizsgálatok vezettek például arra a felismerésre, hogy a gangliozidok belső észterei - amelyekben a szacharidrész egy vagy több hidroxilcsoportja észterezve van a szialinsavas rész egy vagy több karboxilcsoportjával intramolekuláris reakció eredményeként, ugyanennyi laktongyúru létrejöttével, mint amennyi csoport észtereződött - aktívabbak, mint maguk a gangliozidok az idegműködés serkentésében és az idegingerület vezetésében szerepet játszó membránenzimek aktiválásában. Ilyen enzim—a 4 476 119 sz., a 4 593 091 sz. és a 4 716 223 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírások szerint - például a (Na⁺, K⁺) ATPase enzim.

A megfigyelések szerint serkentik az idegműködést és javítják az ingerületvezetést a gangliozidok „külső” észterei is; vagyis azok az észterek, amelyek úgy jönnek létre, hogy a szialinsavaknak a karboxilcsoportjai reagálnak különböző alifás, aralifás - aliciklusos vagy heterociklusos - alkoholok hidroxilcsoportjaival.

A gangliozid-amidok is rendelkeznek hasonló tulajdonságokkal, csakúgy, mint az egyszerű gangliozidoknak az amidjai és az észterei peracilezés után. Mindezek a származékok - amelyek a 4 713 374 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban kerültek ismertetésre - szintén kiindulási anyagoknak tekinthetők az új N-acil-származékoknak a találmányunk szerinti előállítása esetén.

A találmányunk szerinti eljárással előállított új gangliozidszármazékok hatásaik alapján értékesek gyógyászati szempontból; pontosabban megfogalmazva inhibitálják az aktiválódását a protein-kináz C-nek, amely bizonyos körülmények között nemkívánatos és negatív szerepet játszhat a normális neurotranszmiszsziós funkciók kiegyensúlyozatlanná tételével.

Az aktiválódást az ingerlő hatást kiváltó aminosavak - így a glutaminsav és/vagy az aszparaginsav például koncentrációjának a megnövekedése váltja ki. Ezeknek a savaknak - ilyen, normálistól eltérő körülmények között - direkt toxikus hatásuk van az idegsejtekre.

A találmányunk szerinti eljárással előállítható vegyületeknek az az egyik nagy előnye, hogy képesek megakadályozni, illetve leküzdeni az előbb említett idegmérgezést, és ez megkülönbözteti őket maguktól a gangliozidoktól vagy a szfingozidtől - vagyis a többi protein-kináz C inhibitoroktól.

Hangsúlyozni kell, hogy a találmányunk szerinti eljárással előállítható vegyületek — a kalcium-antagonistákkal és a glutamát-receptor-antagonistákkal (elsősorban az NMDA-val) ellentétben - csak a normálistól eltérő körülmények között fejtik ki a hatásukat és limitálják ennek következtében a neurotoxicitást, valamint fenntartják a neuronális plaszticitást, amelynek következményeként könnyebben helyreállnak a károsodott fiziológiai funkciók. Az új N-acil-Iizogangliozidoknak az előbb említett farmakológiai tulajdonságait a következő kísérletekkel szemléltetjük, amelyeket N-diklőracetil-lizo-GMi-gyel és N-monoklór-acetil-lizo-GMigyel hajtottunk végre:

N-acil-lizogangliozidok védőhatása az ingerlő hatást kiváltó aminosavak neurotoxikus hatásaival szemben

Patkányok kéregállománybeli, valamint agyvelőállománybeli neuronjainak primer tenyészeteiben az ingerlő hatást kiváltó aminosavak (EAA) szabályozzák a protein-kináz C (PKC) aktiválódását és transzlokáciőját és sejtelhalást váltanak ki. Főleg glutamát-hozzáadással lehet előidézni ezekben a sejtkultúrákban károsodást, amelyet valószínűleg a glutamát által indukált Ca²⁺-hatás vált ki, amelyet transzlokáció, majd PKCaktiválódás követ.

Vaccarino és munkatársai [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84.8707-8711 (1987)], Hannun Y. A. és munkatársai [J. Bioi. Chem., 261 12 604-12 609 (1986)], Merrill A. H. és munkatársai [J. Bioi. Chem., 261.12 610-12 615 (1986)], Wilson E. és munkatársai [J. Bioi. Chem., 261. 12 616-12 623 (1986)], valamint Hannun Y. A. és munkatársai [Science, 235. 670-673 (1987)] beszámoltak arról, hogy amennyiben az agy velő szemcsés sejtjeit (más néven: granulasejtjeit) gangliozidok hatásának tesszük ki (triszialozil-N-tetraglikozil-ceramid-GTib vagy monoszialozil-N-tetraglikozil-ceramidGMi hatásának), gátolttá válik a PKC- nak a glutamát által kiváltott transzlokációja és aktiválódása. Ezek a gangliozidok megakadályozzák a glutamát hatását nagy afiinitású felismerési helyükkel és (3H)PDBu-kötésükkel. Ezen túlmenően ezek a gangliozidok védelmet nyújtanak a glutamát által kiváltott sejtkárosodás ellen.

Azokat a vizsgálatokat, amelyek során az új N-diklór-acetil-lizo-GMi és N-monoklór-acetil-Iizo-GMi gangliozidszármazékokat összehasonlítottuk GMi és GTjb gangliozidfrakcíókkal, a továbbiakban ismertetjük. Főleg azt vizsgáltuk, hogy milyen hatást fejtenek ki a találmányunk szerinti eljárással előállított származékok a glutamát által kiváltott neurotoxicitásra in vitro és in vivő körülmények között, továbbá a PKCtranszlokációra az agyvelőben levő szemcsés sejtek primer kultúrájában.

Az alkalmazott anyagok és módszerek ismertetése

In vitro vizsgálatok

1. a) Nyolcnapos Sprague Dawley patkányok (Zivic Miller) [Gallo V. és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79. 7919-7923 (1982)] agy velőjéből származó szemcsés sejtekből álló primer tenyészetek.

Ezek a tenyészetek 90%-nál nagyobb mennyiségben tartalmaznak szemcsés sejteket, 5%-nál kisebb menynyiségben tartalmaznak GABAergic neuronokat és 5%-nál kisebb mennyiségben tartalmaznak gliális sejteket [Vaccarino F. M. és munkatársai: J, Neurosci. 7.

HU 205 129 Β

65-76 (1987)]. A sejteket akkor használtuk fel kísérleti célokra, amikor a tenyészet 8-9 napos volt.

1. b) A tenyészethez adott anyagok (módszer és paraméterek)

Amikor a tenyészet 8-9 napos volt a következő anyagokat adtuk hozzá 7-100 pM mennyiségben:

- N-diklór-acetil-lizo-GMi

- N-monoklór-acetil-lizo-GMi

- N-monoklór-acetil-lizo-GTib

- N-monoklór-acetil-lizo-GMi.

Pontosabban a szemcsés sejtekből álló egysejtrétegeket preinkubáltuk ezekkel a vegyületekkel Locke-oldatban (1 ml) 120 percen keresztül (vagy 0 és 120 perc között változó időtartamon át) 37 °C-on. A gangliozidokat és származékaikat előzetesen feloldottuk, majd amennyiben szükséges volt - felhígítottuk metanol és víz 95:5 térfogatarányú elegyével.

Az oldatból kivett részeket nitrogénáramban megszárítottuk, majd annyi Locke-oldatot adtunk a maradékhoz, hogy elérjük a megfelelő végkoncentrációt.

1. c) Glutamáttal kiváltott neurotoxicitás

A glutamát neurotoxikus hatását különböző kísérleti körülmények között értékeltük ki:

- Vizsgáltuk, hogy az anyagok inkubációs idejének (0-120 perc) a glutamát hatásának való kitétel előtt milyen szerepe van: intakt sejteket preinkubáltunk N-diklór-acetil-lizo-GMi-gyel, N-monoklór-acetillizo-GMi-gyel (7 μΜ), valamint GTib-vel (60 pM) 37 °C-on. Miután a vegyület feleslegét eltávolítottuk mosással, a sejteket 50 pM glutamáttal inkubáltuk magnéziumionok távollétében 15 percig szobahőmérsékleten, majd a sejteket háromszor mostuk és áthelyeztük őket a tápközegbe. 24 óra elteltével kiértékeltük hisztokémiai módszerrel a sejtek túlélését. Éne a kiértékelésre használtuk adott esetben a jódfluoreszcein-diacetátos megfestést is: az élő sejtek zöld színben fluoreszkálnak, a halott sejtek vörösek lesznek ennek a módszernek az alkalmazásánál.

- Vizsgáltuk, hogy milyen befolyásoló szerepe van annak az időintervallumnak, amely a gangliozidszármazékokkal, illetve magukkal a gangliozidokkal végrehajtott előkezelés és a glutamát hatásának való kitétel között van: intakt szemcsés sejteket preinkubáltunk 2 órán keresztül 37 °C-on N-diklór-acetil-lizo-GMi-gyel (7 pM) és GMi-gyel (100 pM). A vegyület feleslegét mosással távolítottuk el, majd kitettük a sejteket 50 pM glutamát hatásának magnéziumionok távollétében 15 percen keresztül különböző időtartamok (1,2,4,6,12,18,24 és 48 óra) eltelte után.

- Vizsgáltuk, hogy milyen következményei vannak annak, ha glutamáttal és gangliozidokkal együttes kezelést - szimultán kezelést hajtunk végre: intakt szemcsés sejteket kezeltünk 15 és 35 percen keresztül 50 pM glutamáttal és N-diklór-acetil-lizoGMi-gyel (7 pM), GTib-vel, valamint GMrgyel (100 pM) - vagyis különböző gangliozidokkal. Az első kísérlettípusnál - amikor is az együttes kezelést percen át alkalmaztuk - a vegyület feleslegét eltávolítottuk mosással, majd a már ismertetett módon kiértékeltük a sejttúlélést. A második kísérlettípusnál - vagyis abban az esetben, amikor az együttes kezelést 30 percen át alkalmaztuk - a kezelést további 35 percen át folytattuk gangliozidokkal.

- N-diklór-acetil-lizo-GMi hatása a glutamát hatásának való kitétel megszakítását követően: szemcsés sejteket tettünk ki megszakításokkal glutamát hatásának, majd N-diklór-acetil-lizo-GMi-es (7 μΜ) kezelést alkalmazunk 20 percen keresztül magnéziumionok távollétében. A vegyület feleslegét mosással távolítottuk el.

- Vizsgáltuk, hogy milyen hatása van a sejtanoxiát követően (nitrogénkamrában) az N-diklór-acetillizo-GMrnek a glutamát által indukált endogén neurotoxicitás elleni védelemre. A sejtek életképességét kolorimetriásan értékeltük ki 24 óra elteltével (az MTT csak az első sejteket színezi meg).

1. d) Glutamát által kiváltott PKC-transzlokációja: a (3H)-forbol-észter megkötésének kiértékelése intakt sejteken. A (3H)-forbol-észter megkötésére kifejtett hatásokat két különböző típusú kísérleti feltételrendszer mellett értékeltük ki:

- 15 perces együttes kezelés 50 pM glutamáttal, gangliozidokkal, valamint N-diklór-acetil-lizoGMi-(7 pM), GTib-, továbbá GMi-származékokkal.

-30 perces együttes kezelés 50 pM glutamáttal és Ndiklór-acetil-lizo-GMi-gyel (7 pM), GT^-vel és GMi-gyel (100 pM), amelyet további 35 perces gangliozidok hatásának való kitétel követ. Az együttes kezelés után a sejteket mostuk és magnéziumionok jelenlétében kiértékeltük a (³H)-PDBu-megkötődést. Szemcsés sejteket tenyésztettünk 35 mm átmérőjű korongokon, majd mostuk és inkubáltuk őket Locke-oldattal, amely 4-B-(³H)-forbol-12-t, 13dibutirát-(³H)-P(Bto)2-t - 12,5 Ci/mmól (1 Ci=37 GBq; New England Nuclear) tartalmazott 0,1%-os, zsírsavmentes marhaalbumin-szérumban (Sigma Chemical Co.). Minthogy az előkísérletek azt mutatták, hogy az egyensúly bekövetkezik 10 percen belül, a sejteket 15 percig inkubáltuk (³H)-P(Bto)2-vel 22 °C-on. Egy órán túl a megkötődés konstans értéket vesz fel. Az inkubálást követően a sejteket hideg Locke-oldattal mostuk háromszor, majd 0,1 M nátrium-hidroxiddal szuszpendáltuk őket. A szuszpenzióból kipipettáztunk mintát a fehérje meghatározására [Lowry, Ο. H. és munkatársai: J. Bioi. Chem., 193, 256-275 (1951)]. A nemspecifikus megkötődést 2 pM forbol-12-tetradekanoát-13-acetát (PTA) jelenlétében értékeltük ki.

2. a) Sejttenyészetek

Egér korai fejlődési stádiumában levő idegsejtjeit (N₂A) - 180, szelvény - elhelyeztük egy edényben, 10 000 sejt/edény koncentrációban (COSTAR-24). A következő nap a közeget 350 pl DMEM+P/G+10% FCSsel helyettesítettük.

HU 205 129 Β

2. b) Különböző vegyületeket adtunk a tenyészethez kloroform és metanol 2:1 térfogatarányú elegyében feloldva, nitrogénáramban szárítva és DMEM+P/G+10% FCS-ben ismételten szuszpendálva. A neuriták számát 24 órával később értékeltük ki.

In vivő vizsgálatok

Mintegy 13 g tömegű, 7 napos patkányoknak i.c.v. injektálással beadtunk 25 nmől NMDA-t. Ilyen körülmények között az excitotoxin az injekciózott félteke 28%-os súlycsökkenését idézte elő és az állatok 53,6%-a elhullott

A patkányokba az NMDA-injekció beadása előtt 1 órával, illetve közvetlenül az injekció beadása után állandó körülményekközött beinjektáltunk200 pmól/állat dózisban N-diklór-acetil-lizo-GMi-et és N-monoklór-acetil-Iizo-GMi-et A vegyületeket PBS-ben oldottuk fel. Az N-diklőr-acetil-lizo-GMi-et, valamint az N-monoklóracetil-lizo-GMi-et magnézium-szulfáttal, valamint az NMDA-receptomak egy nemversengő agonistájával, az MK-80l-gyel összehasonlítva vizsgáltuk [G. McDonald és munkatársai: Eur. J. Pharmacol. 140.153-157 (1987)] , továbbá kinurénsavval összehasonlítva [P. Andine: Neuro-science Letters, 90.208-212 (1988)], amely képes az agykárosodás mérséklésére. Az állatok elhullás! arányát 5 nappal az NMDA-injektálás után állapítottuk meg.

A kísérletek eredményeit az alábbiakban foglaljuk össze:

- abban az esetben, ha kétórás előkezelést hajtottunk végre N-diklór-acetil-Iizo-GMi-gyel (LIGA 20) és GTib-vel, csaknem teljes mértékben sikerült megakadályozni a glutamát által kiváltott neurotoxicitást (1. ábra). Ezzel kapcsolatban megjegyezzük, hogy míg az N-diklór-acetil-lizo-GMi (7 pM) esetében a védőhatás már mindössze 5 perces előinkubálás után is nyilvánvaló, addig GT_lb esetében (60 μΜ) ez a hatás - bár az előzőnél kisebb mértékben - csak az inkubálás után 60 perccel jelentkezik szignifikánsan. Érdemes azt is megjegyezni, hogy az N-diklór-acetil-lizo-GMi a GTib-nél már nyolcszor kisebb koncentrációban kifejti a maximális hatását, (7 pM a 60 pM-Ial szemben);

- amíg az N-diklőr-acetil-lizo-GMi-nek a glutamát által kiváltott neurotoxicitással szembeni védőhatása a közeg eltávolítását követően még legalább 24 óra hosszat tart, addig a GT_íb védőhatása csak 4 óra hosszat tapasztalható (2. ábra) és a GMi-é legfeljebb 1 óra hosszat (GMi<GTib<N-diklór-acetil-lizo-GMi);

- abban az esetben, ha glutamáttal és N-diklór-acetil-lizo-GMi-gyel 15 perces együttes kezelést hajtottunk végre, hatásos védelmet tapasztaltunk a sejteknél a glutamát neurotoxikus hatásával szemben; ugyanakkor GTib-vel és GMi-gyel végzett kezelés esetén nem volt védőhatás (3. ábra). Ezzel párhuzamosan, az Ndiklór-acetil-Iizo-GMi-gyel és glutamáttal való együttes kezelés gátolja a PKC-nak a glutamát által kiváltott transzlokációját, 30 perc után maximális aktivitással (4. ábra); ehhez hasonlóan hatásos a 35 perces együttes kezelés (5. ábra), majd az ezt követően gangliozidokkal meghosszabbított inkubálás mind a neurotoxikus hatást, mind aPKC-transzlokáció gátlását illetően. Az ilyen kísérleti körülmények között az N-diklór-acetil-lizo-GMi-re kapott eredmények öszszahasonlíthatók a GM_rre és a GTi_b-re kapott eredményekkel. Fontos megjegyezni, hogy az N-diklóracetil-lizo-GMi-nek a hatását még mindig nagyobbnak lehet tekinteni, mint a GMi-ét vagy a GTib-ét, minthogy a hatása sokkal kisebb dózisok esetén már jelentkezik (7 pM a 100 pM-lal szemben);

- az N-diklór-acetil-lizo-GMi-gyel végrehajtott 20 perces utókezelés ugyancsak hatásos a megszakításokkal adagolt glutamát által kiváltott neurotoxicitással szemben (6. ábra);

- anoxiás körülmények között az N-diklór-acetil-lizoGMi és az N-monoklór-acetil-lizo-GMi ©IGA 21) védőhatást fejt ki a glutamát által kiváltott endogén neurotoxicitással szemben (7. ábra); az N-monoklóracetil-lizo-GMi farmakológiai szempontból összehasonlítható az N-diklór-acetil-lizo-GMi-gyel (védőhatás a 10 pM-os tartományban).

Az in vivő vizsgálatok során az N-diklór-acetil-lizoGMi és az N-monoklór-acetil-lizo-GMi megvédte a kísérleti állatokat az elhullástól az NMDA i.c.v. injekciót követően, amely egyébként az ischaemia - vagyis a helyi vértelenség - által kiváltott károsodáshoz hasonlót okoz.

Az N-diklór-acetil-lizo-GMi és az N-monoklór-acetil-lizo-GMi hatása összemérhető a magnéziumionok vagy a kinurénsav által kifejtett hatással (3. táblázat).

1.táblázat

Neuritogén aktivitás N2A sejtekben

	A neuritos sejtek morfológiája (24 h), %	3HTdr. (48 h) (n-3)	MTT (48 h) (n-3)
Kontroll	<5	40 271+3584 (n-6)	0,284±0,01 (n-6)
Kontroll+DMSO	<5	n.a.	n.a.
GMiblO^M	70-80	40 834+1885	0,259+0,007
LIGA 211·10-*Μ	80-90	14256±1594	0,158+0,01
5·10'5Μ	80-90	36016+5030	0,243±0,008
Ő’IO^M	<5	43 035±487	0,324+0,01
LIGA 22 MO^M	<5	n.a.	n.a.

LIGA 21=N-monoklőr-acetil-lizo-GMi n.a.-nincs adat

LIGA22=N’-monoklőr-acetil-lizo-GMi

HU 205 129 Β

2. táblázat

N2-anoxia:

(Szemcsés sejtek) (1) A tenyészeteket a megadott módon előkezeltük, majd mostuk és anoxiás körülmények közé helyeztük (N2-kamrába), azután visszatértünk az eredeti közeghez: 24 óra elteltével MTT-vel reagáltattuk ókét. Magnéziumionok távollétében rendszerint anoxia állt be.

Előkezelt:

Kontroll (+Mg²⁺)

GMi (100 μΜ, 60 perc) N-diklór-acetil-lizo-GMi (5 μΜ, 10 perc) N-monoklór-acetil-lizo-GMi (5 μΜ, 10 perc)

MIT O.D. (570-630)

0,245+0,007 (100%) 0,160+0,010 (110%) 0,163±0,012 (112%) 0,152±0,013 (105%)

3. táblázat

NMDA által előidézett neurotoxicitás újszülött patkányoknál

Kezelés	Dózis nM/állat mg/kg	Mortalitás (elhullt/kezelt)	Relatív mortalitás, a kezelt állatok %-ában
Sós i.c.v.+PBS se	—		1/32	3,1
NMDA i.c.v.+PBS se	-		22/41	53,6
NMDA+AGF2 se	200	25	3/17	17,6
NMDA+AGF2 se	100	25	0/9	0
NMDA+AGF2 se	15	1,85	0/8	0
NMDA i.c.v.+LIGA 20 se	200	28	1/8	12,5
NMDA i.c.v.+LIGA 21 se	200	21	0/8	0
NMDAi.c.v.+MK 801 i.p.	75	2	6/16	37

A 7 napos, 13 grammos állatokat a táblázatban megadott dózisokkal kezeltük 1 órával az NMDA (25 nM i.c.v.) befecskendezése előtt, majd közvetlenül a befecskendezés után. A mortalitást 5 nappal a kezelés után állapítottuk meg.

LIGA 20= N-diklór-acetil-lizo-GMi LIGA 21= N-monoklór-acetil-lizo-GMi

Toxikus potenciál

1. Hemolízis nyúlvérben (a vörös vérsejtek felbomlása a hemoglobin feloldódásával)

Módszer:

100 μ1 vegyületet oldott állapotban inkubálunk 1 ml friss nyúlvérben (500 USP egység nátrium-heparin/12 ml vér) öt percen át, szobahőmérsékleten. Centrifugálás után (3000 fordulat/perc, 3 perc) a hígított plazmát spektrofotometriás módszerrel megelemeztük (545 nm-es hullámhosszúságon). A hemolitikus aktivitást a szfingozin által kiváltott hemolízis százalékos mennyiségével fejeztük ki.

Eredmények:

Az N-acil-lizo-származékok nem váltanak ki hemolízist nyúlvérben 1 mM-nál kisebb koncentrációban.

2. Neurotoxicitás

A GMi N-acil-lizo-származékainak a neurotoxicitását agyi szemcsés sejtek primer tenyészetében vizsgáltuk. Az FDA-PI-festést a vegyűletekkel végrehajtott kétórás inkubálást követően, 24 óra elteltével hajtottuk végre.

Eredmények:

A vizsgált N-acil-lizo-származékok neurotoxicitást váltanak ki olyan koncentrációkban, amelyek legalább kétszer nagyobbak az „aktív” koncentrációknál. Az előzőekben ismertetett farmakológiai tulajdonságok következtében a találmányunk szerinti eljárással előállítható N-acil-lizogangliozid-származékokat fel lehet használni gyógyszer-hatóanyagként a következő betegségek gyógyítására:

- cerebrális ischaemia;

- metabolikus encefalopathiák, például hypoglykaemia és hipoxia;

- mérgezéses eredetű encefalopathiák;

- trauma;

- elöregedés;

- epilepszia;

- neurodegeneratív betegségek, például Parkinson-kór és Huntington- féle vitustánc; és

- mentális rendellenességek.

HU 205 129 B

A találmányunk szerinti eljárással előállított N-acillizogangliozidoknak az összes származékát-így észtereiket, belső észtereiket, amidjaikat és peracilátjaikatugyanolyan módon lehet előállítani, ahogy a szakirodalomban leírva található a gangliozidok megfelelő származékaira. A találmányunk tárgyához tartozik ezen származékok elegyeinek az előállítása is, például olyan elegyeké, amelyek N-acil-lizogangliozidokból állíthatók elő a találmányunk szerinti eljárás alkalmazásával.

A találmányunk szerinti eljárással előállított, szabad karboxilcsoportokat tartalmazó N-acil-lizogangliozidszármazékokból lehet készíteni fémsókat vagy szerves bázisokkal alkotott sókat, amelyeknek előállítása ugyancsak a találmányunk tárgyához tartozik. Lehet fémsókat vagy szerves bázisokkal alkotott sókat készíteni más, találmányunk szerinti eljárással előállított származékokból is, amennyiben rendelkeznek ezek a származékok szabad savcsoportokkal, mint például a kétbázisú savaknak az észterei vagy a peracilezett amidjai.

A fémekkel vagy szerves bázisokkal képezett sók közül külön ki kell emelni azokat, amelyek alkalmazhatók a gyógyászatban, így az alkálifémsókat és az alkáliföldfémsókat, például a káliumsókat, a nátriumsókat, az ammőniumsőkat, a kalciumsókat és a magnéziumsókat; az alumíniumsókat, valamint a szerves bázisokkal képzett sókat. Ilyen szerves bázisok a következők: alifás vagy aromás vagy heterociklusos primer, szekunder vagy tercier aminok, például a metil-amin, az etil-amin, a propil-amin, a piperidin, a morfolin, az efedrin, a furfuril-amin, a kolin, az etilén-diamin és az amino-etanol.

A találmányunk vonatkozik olyan gangliozidszármazékok savaddíciós sóinak az előállítására is, amely származékok szabad aminocsoportot tartalmaznak.

Azok közül a savak közül, amelyekkel savaddíciós sókat lehet képezni a találmányunk szerinti eljárással előállított gangliozidszármazékokból, ki kell emelni a hidrogénsavakat, így a sósavat, a hidrogén-bromidot, a foszforsavat, a kénsavat, a kis szénatomszámú karbonsavakat, amelyek legfeljebb 7 szénatomot tartalmaznak, így a hangyasavat, az ecetsavat, a propionsavat, a borostyánkősavat és amaleinsavat.

Azokkal a savakkal és bázisokkal képezett sókat is, amelyek gyógyászati szempontból nem használhatók, de alkalmazhatók a találmány szerinti eljárással előállított gangliozidszármazékoknak a tisztítására, a találmányunk keretébe tartozó vegyületeknek tekintjük. (Ilyen, tisztítási célra felhasználható sók például a pikrátok.)

Tekintettel arra, hogy szoros kapcsolat van a szabad formájú származékok és a só formában megjelenő származékok között, nem teszünk különösebb különbséget leírásunkban az említett két forma között, hacsak nem tapasztalható ennek a megállapításnak az ellenkezője, illetve abban az esetben, ha ki van zárva sóképzés lehetősége.

Az új lizogangliozid-származékokat ismert módszerekkel lehet előállítani. Megfelelő enzimekkel a szfingozin-nitrogén-atomon szelektíven lehet dezacilezni gangliozidokat, és ilyen módon közvetlenül lehet olyan lizogangliozidokat előállítani, amelyeknek a többi acilcsoportja érintetlenül marad; elsősorban azok az acilcsoportok, amelyek a neuraminsav nitrogénatomján vannak. Ezeket a vegyületeket ismert módon acilezve ezt követően elő lehet állítani az N-acil-lizogangliozidokat. Egy másik megoldás szerint a gangliozidok kémiai úton is dezacilezhetők, és ilyen módon elő lehet állítani a nitrogénatomon dezacilezett lizogangliozidokat, vagyis olyan vegyületeket, amelyekben a szfíngozin-amino-csoport és a neuraminsav aminocsoportja dezacilezve van, és amelyeknek a hidroxilcsoportjai észterezettek lehetnek. Ezeket a vegyületeket ismert módon lehet acilezni, és ilyen módon eló lehet állítani N-dezacetü-N-acil-lizogangliozidokat, amelyeket azután a neuraminsav aminocsoportján lehet acetilezni.

Ennek a megoldásnak az egyik eljárásváltozata szerint közbenső művelettel átmenetileg meg lehet védeni a szfingozin-amino-csoportot, amit meg lehet tenni például foszfatidil-kolinnal való hidrofób kölcsönhatás útján vagy védőcsoporttal végrehajtott acilezéssel, amelyet a neuraminsav nitrogénjének acetilezése és adott esetben a szfingozin-nitrogén-atom védőcsoportjának eltávolítása követ, majd végül a szfíngozin-nitrogén N-acilezése következik. Mindezeket a műveleteket végre lehet hajtani a már ismertetett gangliozidelegyek felhasználásával is.

Abban az esetben, ha szükséges, az N-acil-gangliozidokban funkcionálisan konvertálni lehet a szialinsavaknak a karboxilcsoportjait vagy a hidroxilcsoportjait. A karboxilcsoportokat például át lehet alakítani észtercsoprotokká vagy amidocsOportokká; a hidroxilcsoportokat pedig savakkal észterezett csoportokká (peracilezés). Másrészről lehetséges ezelőtt a funkcionális konvertálás előtt, azzal egyidejűleg, illetve azt követően konvertálni - akár funkcionálisan, akár nem - a ceramidmaradéknak az acilcsoportjában jelen levő poláris csoportokat; például észterezni lehet a hidroxilcsoportokat, alkilezni lehet az aminocsoportokat vagy reagáltatni lehet a karbonilcsoportokat O-alkil-hidroxilaminnal. Át is lehet alakítani az előállított vegyületeket sóikká.

A találmányunk szerinti eljárás során tehát - adott esetben az acilezőszerben levő szabad funkcionális csoportok átmeneti megvédését követően - acilezzük a lizogangliozidokat vagy az N-dezacilezett lizogangliozidokat vagy ezeknek a vegyületeknek az elegyét 2-20 szénatomos alkánkarbonsavval, amely helyettsítve van eggyel vagy többel az alábbi atomok, illetve poláris csoportok közül:

- klór-, bróm- vagy fluoratom,

- hidroxilcsoport,

- 1-7 szénatomos alkoxiesoport,

- karboxilcsoport,

- cianocsoport,

- adott esetben 1-4 szénatomos alkilcsoporttal észterezett merkaptocsoport,

- adott esetben 1-7 szénatomos alkilcsoporttal monovagy diszubsztituált aminocsoport, —SO₃H szulfocsoport.

HU 205 129 Β

A leírt eljárás szerinti N-acilezést végre lehet hajtani hagyományos módon, például úgy, hogy a kiindulási vegyületeket reagáltatjuk valamilyen acilezőszerrel, elsősorban annak a savnak valamilyen funkcionális származékával, amely savnak a maradékát kell beépíteni a molekulába. így a sav funkcionális származékaként lehet használni valamilyen halogenidet vagy anhidridet. Az acilezést célszerű tercier bázis - így piridin vagy kollidin - jelenlétében végezni. Az acilezést vízmentes körülmények között szobahőmérsékleten vagy melegítés mellett, illetve a Schotten- Baumann-féle módszer szerint lehet végrehajtani vizes közegben, valamilyen szervetlen bázis jelenlétében. Bizonyos esetekben az észtereket és a savakat reaktív, funkcionális származékokként is lehet alkalmazni.

Az acilezéshez lehet alkalmazni olyan módszereket is, amelyek a peptidkémiában ismert aktivált karboxiszármazékok felhasználásán alapulnak; például fel lehet használni vegyes anhidrideket, illetve karbodiimidekből vagy izoxazolsókból előállítható származékokat.

A számos előállítási eljárás közül a legmegfelelőbbek a következők:

1. Lizogangliozid-származék reagáltatása a sav azidjával.

2. Lizogangliozid-származék reagáltatása a savból Ν,Ν’-karbodiiriiidazollal előállítható acil-imidazollal.

3. A lizogangliozid-származék reagáltatása a sav vegyes anhidridjével és trifluor-ecetsavval.

4. A lizogangliozid-származék reagáltatása a sav kloridjával.

5. A lizogangliozid-származék reagáltatása a savval valamilyen karbodiimid - például diciklohexil-karbodiimid - és adott esetben más vegyület, például 1-hidroxi-benztriazol - jelenlétében.

6. A lizogangliozid-származék reagáltatása a savval melegítés közben.

7. A lizogangliozid-származék reagáltatása a sav metil-észterével magasabb hőmérsékleten.

8. A lizogangliozid-származék reagáltatása a savnak egy fenol-észterével, például p-nitro-fenollal képzett észterével.

9. A lizogangliozid-származék reagáltatása egy olyan észterrel, amelyet a sav sójának és l-metil-2klór-piridin-jodidnak a szubsztitúciós reakciójával állítottunk elő. (Az l-metil-2-klór-piridinium-jodid helyett fel lehet használni más, hasonló vegyületeket is.)

Abban a speciális esetben, ha szabad hidroxilcsoportot, merkaptocsoportot, karboxilcsoportot, primer vagy szekunder aminocsoportot tartalmazó savak felhasználásával állítunk elő vegyületeket, ezeket a szabad csoportokat célszerű megvédeni az acilezési reakció során; célszerűen azoknak a megvédési megoldásoknak az alkalmazásával, amelyeket a peptidkémiában használnak. A védőcsoportoknak természetesen könnyen eltávolíthatóknak kell lenniük a reakció befejeződése után. A védőcsoport lehet ftaloilcsoport vagy benziloxi-karbonil-csoport, amelyeket előnyösen aminocsoportok megvédésére lehet használni. így például abban az esetben, ha gamma-amino-vajsav-származékokat állítunk elő, első lépésként ennek a savnak egy olyan származékát állítjuk elő, amelyben az aminocsoport egy ftaloilcsoporthoz kapcsolódik, majd a lizogangliozid-származék acilezését követően a ftaloilcsoportot hidrazinolízis útján eltávolítjuk. A benzil-oxi-karbonilcsoportot hidrogenolízissel távolíthatjuk el. Ez a csoport szolgálhat a hidroxilcsoportok megvédésére is. A karboxilcsoportot meg lehet védeni észterezéssel, amelyhez például a peptidkémiában is alkalmazott alkoholokat lehet felhasználni.

A kiindulási vegyületként szolgáló lizogangliozidokat- amint erre már utaltunk - elő lehet állítani gangliozidok enzimes dezacilezésével, amely a nitrogénatomon következik be, egy ceramid-dezaciláznak nevezett enzim felhasználásával. Ezt a módszert például a következő szakirodalmi helyen ismertették: J. Biochem. 103.1 (1988).

Azok az N-dezacetil-lizogangliozidok, amelyeket ugyancsak fel lehet használni kiindulási anyagokként, lúgos hidrolizáló szerekkel állíthatók elő gangliozidokból: például tetraalkil-ammónium-hidroxiddal, káliumhidroxiddal és más hidroxidokkal [Biochemistry, 24. 525 (1985); J. Bioi. Chem., 255. 7657 (1980); Bioi. Chem. Hoppé Seyler, 367. 241 (1986); Carbohydr. Rés. 179. 393 (1988); Bioch. Bioph. Rés. Comm. 147. 127(1987)].

Az egyik leírt eljárásváltozatban kiindulási anyagként szereplő N-dezacetil-lizogangliozdok kiindulási anyagként szolgálhatnak egy másik változat kiindulási anyagainak az előállításához; vagyis lizogángliozidok előállításához. Amint ez a 8. ábrán látható, ezt az átalakítást végre lehet hajtani az ábra (3) és (4) megoldásai szerint. A 3. módszer a) és b) reakciói, valamint a 4. módszer a), b) és c) reakciói már ismertek. A már ismert módszerek szerinti eljárásokkal kapott új lizogangliozidokból elő lehet állítani a karboxilszármazékokat vagy a hidroxilszármazékokat, hacsak nem alkalmazunk olyan megoldásokat, amelyek során megváltozhat a bázikus gangliozidszerkezet; például nem alkalmazunk nagyon savas anyagokat vagy olyan szereket, amelyek csak nagyon lúgos vagy nagyon savas közegben fejtik ki a hatásukat, illetve nem alkalmazunk olyan módszereket, amelyek mellett a szacharidrész hidroxilcsoportjai nem kívánt módon alkileződnek.

Az N-acil-gangliozidok karboxilcsoportjainak az észterezését vagy amidálását el lehet például úgy végezni, ahogy a 4 713 374 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban gangliozidokra vonatkozóan ismertették. A találmányunk szerint előállított vegyületekből belső észtereket ugyanolyan módon lehet készíteni, ahogy gangliozidok belső észterei állíthatók elő a 4 593 091 sz. amerikai egyesült államokbeli és a 0 072 722 sz. európai szabadalmi leírás szerint. Ezek közé a belső észterek közé nemcsak azok a vegyületek tartoznak, amelyeket a szialinsav karboxilcsoportjainak a szacharid-hidroxil-csoportokkal való laktonképzésével kapunk, hanem például azok is, amelyeknek a laktongyűrűi a szialinsav karboxilcsoportjái és a szialinsav hidroxilcsoportjai között alakulnak ki, amely utóbbiak viszont a szacharidrészhez kapcsolódnak.

HU 205 129 Β

Más laktonszerkezetek xs lehetségesek. Az ezekben a szabadalmi leírásokban a belső észterek előállítására leírt eljárások közé tartozik az a megoldás, amely szerint a gangliozidokat vízmentes szerves oldószerben, vízmentes körülmények között kezelik laktonképző szerrel. A megfelelő szerves oldószerek közé tartozik a dimetil-szulfoxid, a dimetil-formamid, a szulfolán, a tetrahidrofurán, a dimetoxi-etán, a piridin vagy a felsorolt oldószereknek valamilyen elegye. A megfelelő laktonképző szerek közé tartoznak a szerves oldószerekben oldható karbodiimidek- így a diciklohexil-karbodiimid, a benzil-izopropil-karbodiimid, a benzil-etilkarbodiimid — a 2-kIór-l-metil-piridin-sők, az etoxiacetilén és a Woodward-reagens, az N-etil-5-fenil-izoxazol-3 ’-szulfonát

Régebbi megoldások közé tartozik a gangliozidok reagáltatása ecetsavval vagy triklór-ecetsavval vagy vízben, illetve vizes közegben oldódó karbodiimiddel.

Mindezeket a megoldásokat lehet alkalmazni az új N-acil-lizogangliozid-szánnazékok belső észtereinek az előállítására.

A karboxilcsoportok „külső” észterezéséhez, vagyis a korábban már felsorolt alkoholokkal végrehajtott észterezéshez reagáltathatjuk az N-acil-lizogangliozidokat a kívánt alkohollal például valamilyen ioncserélő jelenlétében — például olyan gyanta jelenlétében, mint a Dowex-50. Ebben az esetben a hozam korlátozott, aminek az az oka, hogy egyidejűleg belső észterek is keletkeznek és hogy elég hosszú a reakcióidő.

Egy másik észterezési eljárás abból áll, hogy az alkoholt gyanta - például 100-200 mesh szemcsenagyságú, H-formájú Dowex-50W*8 gyanta - felett vezetik át, majd az oldott állapotú eluátumot ugyanabban az alkoholban kezelik a megfelelő diazo-alkánnal.

Az észterek előállítására megfelelő előállítási eljárás az is, hogy a Iizogangliozid-származék fémsóját éterezőszerrel kezelik. Ennél az eljárásnál alkálifémsókat, alkáliföldfémsókat vagy bármilyen más fémsókat alkalmaznak. Eterezőszerként alkalmazni lehet minden, a szakirodalomban erre a célra ismertetett anyagot, főként különböző szervetlen savak vagy szerves szulfonsavak észtereit, halogén-szénhidrogéneket, például metil-jodidot vagy etil-jodidot-vagy semleges szulfátokat vagy karbonsavakat, szulfitokat, karbonátokat, szilikátokat, foszfátokat vagy szénhidrogén-szulfonátokat, például benzolszulfonátot vagy p-toluolszulfonátot. A reagáltatást meg lehet valósítani valamilyen megfelelő oldószerben, például alkoholban - célszerű olyan alkoholban, amely megfelel a beviendő alkilcsoportoknak -, de nem poláros oldószerekben is, például ketonokban, éterekben - így dioxánban vagy dimetilszulfoxidban.

Az észterezésnek egy különösen jó eredménnyel megvalósítható megoldása szerint a Iizogangliozidszármazék valamilyen belső észterét a kívánt alkoholnak és az annak megfelelő alkoholátnak az elegyével kezelik. A reakciót le lehet játszatni az alkohol forráspontjának megfelelő hőmérsékleten, de lejátszódik a reakció alacsonyabb hőmérsékleteken is, csak ebben az esetben hosszabb lehet a reakcióidő.

A találmányunk szerinti eljárással előállított lizogangliozid-származékoknak az amídjait ismert módon, elsősorban a következő eljárásokkal lehet előállítani:

a) N-acil-lizogangliozid-származékok belső észtereinek és ammóniának vagy aminoknak a reagáltatásával;

b) az N-acil-lizogangliozid-származékok karboxilésztereinek, valamint ammóniának vagy aminoknak a reagáltatásával;

c) N-acil-lizogangliozid-származékok aktivált karboxilcsoportjainak és ammóniának vagy aminoknak a reagáltatásával.

Az a) reakciót le lehet játszatni közvetlen reagáltatással oldószerben vagy oldószer alkalmazása nélkül, oly módon, hogy a gangliozidnak a belső észterét ammóniával vagy egy olyan aminnal reagáltatjuk, amelynek az amidját elő kívánjuk állítani. A reakciót egészen alacsony hőmérsékleten is végre lehet hajtani, például -5-10 °C-on, célszerű azonban szobahőmérsékleten vagy annál magasabb hőmérsékleten - például 30 “C és 120 °C közötti hőmérsékleten - reagáltatni a kiindulási anyagokat Oldószerként lehet alkalmazni ketonokat, aromás szénhidrogéneket dimetil- foimamidot, dimetil-szulfoxidot, dioxánt, tetrahidrofuránt.

A b) reakciót célszerűen ugyanolyan körülmények között játszatjuk le, mint az a) reakciót

A c) módszer szerinti reakcióhoz a peptidkémiából ismeretes módszereket kell alkalmazni a karboxilcsoport aktivitásához, de mellőzni kell azokat a módszereket amelyek túl savas vagy túl lúgos körülményeket igényelnek, minthogy ezeknek a módszereknek az alkalmazásakor fennáll a gangliozidmolekula szétesésének a veszélye. Abban az esetben, ha kiindulási anyagként alkalmazott gangliozidok például nátriumső formájában állnak rendelkezésre, a sőt először tanácsos Dowex típusú ioncserélővel vagy egyéb savas ioncserélővel kezelni. Lehet például alkalmazni a kondenzálásos módszert kabodiimidek jelenlétében - például diciklohexil-karbodiimid, jelenlétében -, továbbá 1hidroxil-benzotriazol vagy N,N’-karbonil-diimidazol jelenlétében.

A szacharidrész vagy a szialinsavas rész és adott esetben a ceramidmaradék hidroxilcsoportjainak az acilezését ismert módon végre lehet hajtani, például az acilezéshez felhasználni szándékozott savak halogenidjének vagy anhidridjének a felhasználásával. Az acilezést célszerű valamilyen tercier bázisnak - így piridinnek vagy kollidinnek - a jelenlétében végrehajtani. így peracilezett származékokat lehet készíteni.

A találmányunk szerinti eljárás alkalmazásakor arra is van lehetőség, hogy acilezést követően - tehát az N-dezacetil-lizogangHozidok acilezése után - ismét kialakítsuk a neuramínsavrészben az acetil-amino-csoportot. Ezt az acetilezési műveletet is végre lehet hajtani ismert eljárással. Ebben az esetben viszonylag enyhe körülményeket alkalmazunk az N-acilezéshez. Ilyen módszerek alkalmazása mellett a neuraminsav hidroxilcsoportja változatlan marad. Ennek a csoportnak az acetilezését végre lehet hajtani a szfingozin-nitrogénatomon végzett acilezést követően erélyes körülmények mellett, például ecetsavanhidrid alkalmazásával.

HU 205 129 Β

A találmányunk szerinti eljárásnak megfelelően az ezzel a megoldással előállított vegyületekben amennyiben szükséges - az N-acilcsoporton levő funkciós csoportokat át lehet alakítani egymásba. Például lehetőség van arra, hogy a hidroxilcsoportokat szelektíven acilezzük, miközben a további hidroxilcsoport - így a szialinsavas rész hidroxilcsoportjai érintetlenek maradnak, amennyiben enyhe körülményeket (reagensek, reakcióparaméterek) alkalmazunk.

Találmányunk tárgyát képezi az az eljárás is, amellyel olyan gyógyászati készítményeket lehet előállítani, amelyek hatóanyagként egyet vagy többet tartalmaznak a találmányunk szerinti eljárással előállítható új N-acil-lizogangliozidokból, főként azokból, amelyeket a korábbiakban felsoroltunk.

Ezeket a gyógyászati készítményeket elő lehet állítani orális, rektális, parenterális, lokális vagy transzdermális felhasználásra egyaránt. így a készítmények lehetnek szilárdak vagy félig szilárdak - például pirulák, tabletták, zselatinkapszulák, kúpok vagy lágy zselatinkapszulák.

Parenterális kezelésre az intramuszkuláris, szubkután vagy transzdermális adagolásra szánt kiszerelési formákat lehet használni, illetve azokat, amelyek alkalmasak infúzióra vagy intravénás injektálásra. Az ilyen készítmények ezért lehetnek a hatóanyagok oldatai vagy a hatóanyagoknak a liofilizálással készített porai, összekeverve egy vagy több gyógyászati szempontból elfogadható kötőanyaggal vagy hígítóanyaggal, amelyek megfelelnek az adott felhasználási célokra, és amelyeknek az ozmolaritása kompatibilis a fiziológiai folyadékokkal. Helyi alkalmazásra alkalmazni lehet permeteket - például orrpermeteket -, krémeket vagy kenőcsöket vagy speciálisan elkészített tapadó flastromokát bőrön keresztüli hatás elérésére.

A találmányunk szerinti eljárással előállítható gyógyászati készítményeket felhasználhatják mind az emberek, mind az állatok. Ezek a készítmények célszerűen 0,01-10 t% hatóanyagot tartalmaznak abban az esetben, ha oldatokról, permetekről, kenőcsökről vagy krémekről van szó, és 1-1001% - célszerűen 5-501% - hatóanyagot tartalmaznak abban az esetben, ha szilárd kiszerelési formákról van szó.

Az adagolandó dózisok nagysága attól függ, hogy ki szedi a készítményt, milyen hatást kívánunk elérni, valamint milyen módon alkalmazzuk a készítményt. Abban az esetben, ha injektálással - akár bőr alá, akár izomba való befecskendezéssel -, bőrön keresztül vagy szájon keresztül alkalmazzuk az új N-acil-lizogangliozidokat a dózis 0,05—5 mg hatóanyag/test kg.

A következő 3-16., valamint 18-41. példákkal bemutatjuk az új származékok előállítására szolgáló, találmányunk szerinti eljárást, a 42-43. példák pedig a gyógyszerkészítmények előállítására szolgáló, találmányunk szerinti eljárást ismertetik. Az 1., 2. és 17. példákban leírjuk néhány, a találmányunk szerinti eljárás megvalósításához szükséges kiindulási anyagnak az előállítását.

1. példa

N-Dezacetil-lizo-GMi előállítása g GMi-et feloldottunk 200 ml 3 normál káliumhidroxid-oldatban, majd 72 órán át hidrolizáltuk a GMi-et 90 °C-on. Az oldatot ezután lehűtöttük, majd a pH-ját 6,5-re állítottuk be sósavval. Az oldatöt ezt követően állni hagytuk 18 óra hosszat 4 °C-on, majd szűréssel eltávolítottuk a kicsapódott zsírsavakat. Az anyagot víz felhasználásával dializáltuk, 500 ml-re bepároltuk, majd kicsaptuk 5 liter diacetonban.

Az anyagot szárítottuk, majd nagy felbontású szilikagél-kromatográfiás elválasztást alkalmaztunk. Eluálószerként kloroform, metanol és 5 normál ammóniaoldat 55:45:10 térfogatarányú elegyét használtuk. A terméket tartalmazó frakciókat szárítottuk, majd ismét feloldottuk őket vízben. Az oldatot - miután 0,01 normál nátrium-hidroxid-oldattal 10-es értékre beállítottuk a pH-ját - dializáltuk, 100 mg/ml koncentrációjúra betöményítettük, majd a terméket ötszörös térfogatú acetonban kicsaptuk. így 5,7 g N-dezacetil-lizo-GMi-et kaptunk, amely az elméleti mennyiségnek a 70%-a.

Ezután szilikagél-kromatográfiás módszerrel amelynek során oldószerként kloroform, metanol és 5 normál ammóniaoldat 55:45:10 térfogatarányú elegyét használtuk fel - kimutattuk, hogy a keletkezett termék egységes vegyület (Rf-0,05; GMj-0,35).

2. példa

Lizo-GMi előállítása g (6,37 mM) GMi-et feloldottunk 200 ml 3 normál kálium-hidroxid-oldatban, majd 72 órán keresztül 90 °C-on hidrolizáltuk a GMi-et.

Ezt követően az oldatot lehűtöttük, majd a pH-ját 6fies értékre állítottuk be sósav alkalmazásával. Az oldatot ezt követően állni hagytuk 18 órán keresztül 4 °C-on, majd szűréssel eltávolítottuk a kicsapódott zsírsavakat. Az oldatot víz felhasználásával dializáltuk, 500 ml-re betöményítettük, majd kicsaptuk 51 acetonban.

Az N-dezacetil-lizogangliozidokat, valamint az Nacetil-gangliozidokat (20%) tartalmazó terméket vákuumban szárítottuk, majd ismét feloldottuk 100 ml dimetil-formamidban. Az oldathoz lassan hozzáadtunk 20 ml tetrahidrofuránban feloldva 2,15 g (6,37 mM) 9-fluorenil-metil-karbonil-N-hidroxi-szukcinimidet, majd az oldatot szobahőmérsékleten tartottuk 1 óra hosszat, hogy a reakció lejátszódjék. Végül a reakciőelegyhez 3 ml (31,85 mM) ecetsavanhidridet és 0,9 ml (63,7 mM) trietil-amint adtunk. 30 perccel később 12,5 ml piperidint adagoltunk be, hogy eltávolítsuk a védőcsoportot. A reakciót 18 órán keresztül szobahőmérsékleten játszattuk le, majd 2 liter acetonban kicsaptuk és szárítottuk ezután a terméket. Az így kapott anyagot feloldottuk 1 mólos nátrium-karbonát-oldatban és 60 °C-on tartottuk egy óra hosszat. Az oldatot ezt követően dializáltuk, betöményítettük 100 mg/ml koncentrációra, majd ötszörös mennyiségű acetonnal kicsaptuk a terméket, amely 70%-ban lizo-GMi és 30%-ban N-dezacetil-lizo-GMi, átengedtük egy S. Sepharose-oszlopon (H⁺ formájú), amelyet metanollal hoztunk egyensúlyi állapotba. Metanollal, majd

HU 205 129 Β mM ammónium-klorid metanolos oldatával eluálva kaptuk meg a Iizo-GMi-et.

A terméket tartalmazó frakciókat megszárítottuk, majd feloldottuk a maradékot vízben. Az oldat pH-ját 10-re állítjuk be 0,01 normál nátrium-hidroxid-oldattal, majd a dializálást követőén 100 mg/ml koncentrációra töményítjük az oldatot, és ötszörös térfogatú acetonnal kicsapjuk a terméket. Megközelítőleg 5 g anyagot kaptunk, amely 60%-os hozamnak felel meg.

A szilikagélen végzett kromatográfiás vizsgálat azt mutatta, hogy a tennék egységes, az Rf-érték 0,11. A vizsgálathoz oldószerként kloroform, metanol és 5 normál ammóniaoldat 55:45:10 térfogatarányú elegyét használtuk.

3. példa

N-Diklór-acetil-lizo-GMi előállítása

500 mg (0,38 mM) mennyiségű, a 2. példa szerint előállított lizo-GMi-et feloldottunk 1 ml mennyiségű, dimetil-formamidot és metanolt 1:1 térfogatarányban tartalmazó oldószerelegyben 0 °C- on, majd az oldathoz hozzáadtunk 579 μΐ (3,8 mM) diklór-ecetsavanhidridet és a reakcióelegyet állni hagytuk szobahőmérsékleten 72 óra hosszat A terméket 20 térfogat etil- acetáttal kicsaptuk, szűrtük és szárítottuk, majd kromatográfiás módszerrel tisztítottuk szilikagéllel töltött oszlopon. Eluálőszerként kloroform, metanol és víz 60:35:8 térfogatarányú elegyét használtuk. Atisztított frakciókat ezután egyesítettük, bepároltuk, 1 normál nátrium-karbonát-oldattal felvettük a maradékot, desztillált víz alkalmazásával dializálást hajtottunk végre, majd bepároltuk az oldatot és 50 ml acetonnal kicsaptuk a terméket.

423 mg anyagot kaptunk, amely 78,0%-os hozamnak felel meg. Az anyagot szilikagélen kromatografáltuk. Oldószerként kloroform, metanol és 0,2 t%-os kalcinm-klorid-oldat 50:42:11 térfogatarányú elegyét használtuk. A kromatográfiás vizsgálat eredményei szerint egységes termékről van szó (Rf=O,35; GMi=0,43; lízo- GMi=0,24).

4. példa

N-Monoklór-acetil-lizo-GMi előállítása

A 2. példa szerint készített lrzo-GMi-ból feloldottunk 500 mg-ot (0,38 mM-t) dimetil-formamid és metanol 1:1 térfogatarányú elegyének 1 ml-ében, majd a kapott oldathoz 0 °C-os hőmérsékleten hozzáadtunk 528 pl (3,8 mM) trietil-amint és 649,7 mg (3,8 mM) monoklőr-ecetsavanhidridet, majd az elegyet állni hagytuk szobahőmérsékleten 72 óra hosszat. A terméket kicsaptuk hússzoros térfogatú etil-acetáttal, majd szűrtük és szárítottuk.

A terméket ezt követően kromatográfiás módszerrel tisztítottuk szilikagéllel töltött oszlopban. Eluálószerként kloroform, metanol és víz 60:35:8 térfogatarányú elegyét használtuk.

A tiszta frakciókat egyesítettük, bepároltuk, a maradékot felvettük 1 normál nátrium-karbonát-oldattal, desztillált víz alkalmazásával dializáltuk az oldatot, majd 5 ml-re való bepárlást követően 50 ml acetonnal kicsaptuk a terméket.

Ilyen módon 391 mg anyagot kaptunk, amely megfelel 74,0%-os hozamnak. Szilikagélen végzett kromatografálással megállapítottuk, hogy a termék egységes vegyület; eluálőszerként kloroform, metanol és 0,21%os kalcium-klorid-oldat 50:42:11 térfogatarányú elegyét használtuk (Rf=0,30; GMi=0,43; lizo-GMi=0,24).

5. példa

N-Monofluor-acetil-lizo~GM\ előállítása

A 2. példa szerint előállított lizo-GMi-ből 500 mg-ot feloldottunk 2,5 ml dimetil-formamidban, majd az így kapott oldathoz hozzáadtunk 528 pl (3,8 mM) trietilamint, 193 mg (3,8 mM) fluorecetsavas nátriumsót és 194,2 mg (0,76 mM) l-metil-2-klór-piridinium-jodidot

2,5 ml dimetil-formamidban feloldva.

A reakcióelegyet állni hagytuk 18 óra hosszat szobahőmérsékleten, majd a terméket kicsaptuk 50 ml vízzel telített etil-acetáttal. A terméket megszárítottuk, majd szilikagéllel töltött oszloppal kromatografáltuk. Eluálószerként kloroform, metanol és víz 60:35:8 térfogatarányú elegyét használtuk. A tiszta frakciókat egyesítettük, bepároltuk, a maradékot felvettük 1 normál nátrium-karbonát-oldattal, az oldatot desztillált víz alkalmazásával dializáltuk, majd - miután bepároltuk 5 ml-re - 50 ml acetonnal kicsaptuk a terméket.

Hyen módon 481 mg anyagot kaptunk, amely megfelel 92%-os hozamnak. Szilikagélen kloroform, metanol és 0,3 t%-os kalcium-klorid-oldat 50:42:11 térfogatarányú elegyének eluálószerkénti alkalmazása mellett végrehajtott kromarográfiás vizsgálat azt mutatta, hogy a tennék egységes vegyület (Rf-0,33; GMi-0,43; h‘zo-GMi-0,24).

6. példa

N-Difluor-acetil-lizo-GMi előállítása

A 2. példa szerint előállított lizo-GMi-ből 500 mg (0,38 mM) mennyiséget feloldottunk 2,5 ml dimetilformamidban, majd az így kapott oldathoz hozzáadtunk 528 μΐ (3,8 mM) trietil-amint, 243 μΐ (3,8 mM) difluor-ecetsavat és 194,2 mg (0,76 mM) l-metií-2klór-piridinium-jodidot 2,5 ml dimetil-formamidban feloldva.

A reakcióelegyet állni hagytuk szobahőmérsékleten 18 óra hosszat, majd a terméket kicsaptuk 50 ml mennyiségű, vízzel telített etil-acetáttal. A terméket megszárítottuk, majd szilikagéllel töltött oszlopon kromatografálást hajtottunk végre. Eluálőszerként kloroform, metanol és víz 60:35:8 térfogatarányú elegyét használtuk. A tiszta frakciókat egyesítettük, bepárlást követően a maradékot felvettük 1 normál nátrium-karbonát-oldattal, az oldatot dializáltuk desztillált víz alkalmazásával. Az oldatot ezután bepároltuk 5 ml-re és a terméket kicsaptuk 50 ml acetonnal.

Ilyen módon 365 mg terméket kaptunk, és ez 84%os hozamnak felel meg. Szilikagélen kloroform, metanol és 0,3 t%-os kalcium-klorid-oldat 50:42:11 térfogatarányú elegyének, mint eluálószemek a felhasználása mellett kromarografálva megállapítottuk, hogy a termék egységes vegyület (Rf=0,35; GMi-0,43; lizoGMi-0,24).

HU 205 129 Β

7. példa

N-Metoxi-acetil-lizo-GMí előállítása

A 2. példa szerint előállított lizo-GMi-ből 500 mgot (0,38 mM-t) feloldottunk 2,5 ml dimetil-formamidban, és az így kapott oldathoz hozzáadtunk 161 μΐ (1,14 mM) trietil-amint, 293 μΐ (3,8 mM) metoxiecetsavat és 194,2 mg (0,76 mM) l-metil-2-klór-piridinium-jodidot 2,5 ml dimetil-formamidban feloldva.

A reakcióelegyet állni hagytuk 18 óra hosszat szobahőmérsékleten, majd kicsaptuk a terméket 50 ml mennyiségű, vízzel telített etil-acetáttal. A terméket megszárítottuk, majd szilikagélen kromatografáltuk. Eluálószerként kloroform, metanol és víz 60:35:8 térfogatarányú elegyét használtuk. A tiszta frakciókat egyesítettük, majd a maradékot felvettük 1 normál nátrium-karbonát-oldattal. Az oldatot dializáltuk desztillált víz felhasználásával, majd bepároltuk 5 ml-re. A terméket 50 ml acetonnal csaptuk ki.

325 mg terméket kaptunk ilyen módon, és ez megfelel 74%-os kitermelésnek. A termék szilikagéles kromatografálásával - eluálószerként kloroform, metanol és 0,3 t%-os kalcium-klorid-oldat elegyét alkalmaztuk - kimutattuk, hogy a tennék egységes vegyület (Rf 0,36; GMf 0,43; lizo-GMf0,24).

8. példa

N-[3-(Dietil-amino)-propionil]-Uzo-GMi előállítása

A 2. példa szerint előállított lizo-GMi-ből 500 mg-ot (0,38 mM-t) feloldottunk 23 ml dimetil-formamidban, majd az így kapott oldathoz hozzáadtunk szobahőmérsékleten 528 μΐ (3,8 mM) trietil-amint, 350 mg (1,9 mM) 3-(dietil-amino)-propionsavat és - 2,5 ml dimetil-formamidban feloldva - 194,2 mg (0,76 mM) l-metil-2-klórpiridinium-jodidot.

Az elegyet állni hagytuk szobahőmérsékleten 18 óra hosszat, majd a terméket kicsaptuk 100 ml acetonnal. Szűrést és szárítást követően a terméket szilikagélen kromatografáltuk. Eluálószerként kloroform, metanol és víz 60:35:8 térfogatarányú elegyét használtuk a kromatografálás során. A tiszta frakciókat egyesítettük, majd bepárlást követően 1 normál nátrium-karbonát-oldattal felvettük a maradékot. Desztillált víz felhasználásával dializáltunk, majd az oldatot bepároltuk 5 ml-re és 50 ml acetonnal kicsaptuk a terméket.

Ilyen módon 411 mg anyagot kaptunk, és ez 75%-os kitermelésnek felel meg. Szilikagélen, kloroform, metanol és 0,3 t%-os kalcium-klorid-oldat elegyének eluálószerkénti alkalmazása mellett végrehajtott kromatografálással kimutattuk, hogy a termék egységes (Rf0,22; GMi-0,43; lizo-GMi-0,24). (Az eluálóelegyben a komponensek térfogataránya az említés sorrendjében: 50:42:11.)

9. példa

N-Trifluor-acetil-lizo-GM\ előállítása

A 2. példa szerint előállított, 500 mg (0,38 mM) mennyiségű lizo-GMi-et feloldottunk dimetil-formamid és metanol 1:1 térfogatarányú elegyében, majd a keletkezett oldathoz 0 °C-on hozzáadtunk 161 μΐ (1,14 mM) trietil-amint és 161 μΐ (1,14 mM) trifluorecetsavanhidridet. Az elegyet állni hagytuk 72 óra hosszat szobahőmérsékleten, majd a terméket kicsaptuk 20-szoros térfogatú etil-acetáttal. Szűrést és szárítást követően szilikagélen kromatográfiás módszerrel tisztítottuk a terméket. Eluálószerként kloroform, metanol és víz 60:35:8 térfogatarányú elegyét használtuk.

A tiszta frakciókat egyesítettük, bepárlást követően a maradékot felvettük 1 normál nátrium-karbonát-oldattal. Desztillált víz alkalmazásával végrehajtott dializálást követően az oldatot 5 ml-re pároltuk be, majd a terméket kicsaptuk 50 ml acetonnal.

Ilyen módon 292 mg (55,0%-os hozam) terméket kaptunk, amely - szilikagélen kromatografálva - megállapítottuk, hogy egységes vegyületről van szó (Rf 0,37; GMi=0,43; lizo-GMi=0,24). A kromatografáláskor eluálószerként kloroform, metanol és 0,3 t%os kalcium-klorid-oldat 50:42:11 térfogatarányú elegyét használtuk.

10. példa

N-Triklór-acetil-lizo-GMí előállítása

A 2. példa szerint előállított lizo-GMi-ből 500 mg-ot (0,38 mM) feloldottunk dimetil-formamid és metanol 1:1 arányú elegyének 1 ml-ében, majd a keletkezett oldathoz hozzáadtunk 0 °C-on 528 μΐ (3,8 mM) trietilamint és 352 mg (1,14 mM) triklór-ecetsavanhidridet. A reakcióelegyet állni hagytuk szobahőmérsékleten 72 óra hosszat, majd a terméket kicsaptuk 20 térfögatrész etil-acetát alkalmazásával. Szűrés és szárítás után a terméket szilikagélen kromatografálva tisztítottuk. Eluálószerként kloroform, metanol és víz 60:35:8 térfogatarányú elegyét használtuk.

A tiszta frakciókat egyesítettük, bepároltuk, majd a maradékot felvettük 1 normál nátrium-karbonát-oldattal. Desztillált víz alkalmazásával dializáltunk, majd az oldatot bépároltuk 5 ml-re és a terméket kicsaptuk 50 ml acetonnal.

Ilyen módon 358 mg (65,0%-os hozam) terméket kaptunk. Szilikagélen végzett kromatografálással megállapítottuk, hogy a termék egységes vegyület; a kromatografáláshoz kloroform, metanol és 0,3 t%-os kalcium-klorid-oldat 50:42:11 térfogatarányú elegyét alkalmaztuk (Rf 0,37; GMi=0,43; lizo- GMf 0,24).

11. példa

N-Ciano-acetil-lizo-GMí előállítása

A 2. példa szerint előállított lizo-GMi-ből feloldottunk 500 mg-ot (0,38 mM-t) 2,5 ml dimetil-formamidban, majd a keletkezett oldathoz hozzáadunk 0 °C-on 106 μΐ (0,76 mM) trietil-amint és ciano-ecetsavanhídridet, amelyet közvetlenül a hozzáadást megelőzően készítettünk el olyan módon, hogy 620 mg (7,6 mM) ciano-ecetsavat reagáltattunk 20 ml tetrahidrofuránban feloldott 939 mg (9,12 mM) diciklohexil-karbodiimiddel, majd két óra elteltével leszűrtük a képződött diciklohexil-karbamidot.

A reakcióelegyet 18 óra hosszat kevertettűk 0 °C-on, miközben kondenzációs reakció játszódott le. Amint a reakció befejeződött, az oldatot bepároltuk 1 ml-re,

HU 205 129 Β majd a terméket 10 ml acetonnal kicsaptuk és vákuumban szántottuk. A terméket ezt követően szilikagéles kromatografálással tisztítottuk; eluálőszerként kloroform, metanol és víz 60:35:8 térfogatarányú elegyét alkalmaztuk.

A tiszta frakciókat ezt követően egyesítettük, bepároltuk, majd. a maradékot felvettük 1 normál nátrium-karbonát-oldattal. Desztillált víz alkalmazásával dializáltunk, majd az oldatot bepároltuk 5 ml-re és a terméket kicsaptuk 50 ml acetonnal. 273 mg terméket kaptunk ilyen módon, és ez megfelel 52%-os hozamnak.

Szilikagéles kromatografálással kimutattuk, hogy a tennék egységes vegyület; akromatografáláskor kloroform, metanol és 0,3 t%-os kalcium-klorid-oldat 50:42:11 térfogatarányú elegyét használtuk fel eluálószerként (Rt=0,40; GMi=0,43; lizo-GMi=0,24),

12. példa

N-Maleil-lizo-GMi előállítása

A 2. példa szerint készült lizo-GMi-ből feloldottunk 500 mg-ot (0,38 mM-t) 1 ml dimetil-formamidban, majd a keletkezett oldathoz hozzáadtunk 53,6 pl (0,38 mM) trietil-amint és 37 mg (0,38 mM) maleinsavanhidridet. A reakcióelegyet állni hagytuk 72 óra hosszat szobahőmérsékleten. A tennéket kicsaptuk 20-szoros mennyiségű etil-acetáttal, majd leszűrtük és szántottuk. A tennéket ezt követóén szilikagélen kromatografálva tisztítottuk. Eluálőszerként kloroform, metanol és víz 60:35:8 térfogatarányú elegyét használtuk. A tiszta frakciókat egyesítettük, bepároltuk, majd a maradékot felvettük 1 normál nátrium-karbonát-oldattal. Desztillált víz alkalmazásával dializáltunk, majd azt oldatot bepároltuk 5 ml-re és 25 ml acetonnal kicsaptuk a tennéket, amelynek a mennyisége 492 mg volt, és ez 85%-os hozamnak felel meg.

A szilikagélen végrehajtott kromatografálás azt mutatta, hogy a termék egységes vegyület; a kromatografáláshoz kloroform, metanol és 0,3 t%-os kalcium-klorid-oldat 50:42:11 térfogatarányú elegyét használtuk fel (Rf=0,27; GM!=0,43; lizo- GMi=0,24).

13. példa

N-(Hidroxi-acetil)-lizo-GMi előállítása

A 2. példa szerint előállított lizo-GMi-ből 500 mgot (0,38 mM-t) feloldottunk 2,5 ml dimetil-formamidban, majd a keletkezett oldathoz hozzáadtunk 0 °C-on 106 μΐ (1,14 mM) trietil-amint és glikolsavanhidridet, amelyet közvetlenül a hozzáadást megelőzően állítottunk elő 173 mg (2,28 mM) glikolsav és 939 mg (9,12 mM) mennyiségű, 20 ml tetrahidrofuránban feloldott diciklohexil-karbodiimidből olyan módon, hogy a reagáltatás után 2 órával leszűrtük a képződött diciklohexil- karbamidot.

A kondenzálást 18 órás keverés mellett hajtottuk végre 0 °C-on. Amint a reakció befejeződött, az oldatot bepároltuk 1 ml-re, a terméket kicsaptuk 10 ml acetonnal, majd vákuumban szárítottuk.

A tennéket ezt követőén szilikagéles kromatografálással tisztítottuk. Eluálőszerként kloroform, metanol és víz 60:35:8 térfogatarányú elegyét használtuk.

A tiszta frakciókat egyesítettük, bepároltuk, a maradékot felvettük 1 normál nátrium-karbonát-oldattal. Desztillált víz alkalmazásával dializáltunk, majd az oldatot bepároltuk 5 ml-re és 50 ml acetonnal kicsaptuk a terméket.

261 mg tennéket kaptunk, amely 50%-os hozamnak felel meg. A szilikagélen végrehajtott kromatografálás azt igazolta, hogy a termék egységes. Akromatografáláskor kloroform, metanol és 0,3 t%-os kalcium-kloridoldat 50:42:11 térfogatarányú elegyét használtuk oldószerként (Rf=O,33; GMi=0,43; lizo- GMi=0,24).

14. példa

N-(Tribróm-acetil)-lizo-GM}. előállítása

A 2. példa szerint elkészített lizo-GMi-ből 500 mg-ot (0,38 mM-t) feloldottunk 2,5 ml 1:1 térfogatarányú dimetil-formamid/metanol elegyben, majd a keletkezett oldathoz hozzáadtunk 0 °C-on 528 μΐ (3,8 mM) trietilamint és tribróm-ecetsavanhidridet, amelyet közvetlenül a beadagolás előtt készítettünk 2,25 g (7,6 mM) tribrómecetsav és 939 mg (9,12 mM) mennyiségű, 20 ml tetrahidrofuránban feloldott diciklohexil-karbodiimid reagáltatásával olyan módon, hogy két órával a komponensek összekeverését követően kiszűrtük a képződött dicildohexil-karbamidot

A kondenzálást 18 óra hosszat folytattuk 0 °C-on, keverés mellett. Amint a reakció befejeződött, az oldatot bepároltuk 1 ml-re a terméket kicsaptuk 10 ml acetonnal, majd vákuumban szárítottuk.

A terméket ezután szilikagéles kromatografálással tisztítottuk; eluálőszerként kloroform, metanol és Víz 60:35:8 térfogatarányú elegyét használtuk.

A tiszta frakciókat egyesítettük, bepároltuk, majd a maradékot felvettük 1 normál nátrium-karbonát-oldattal. Desztillált víz alkalmazása mellett dializáltunk, majd az oldatot bepároltuk 5 ml-re és a terméket kicsaptuk 50 ml acetonnal. Ilyen módon 267 mg anyagot kaptunk, és ez 44%-os hozamnak felel meg.

Szilikagéles kromatografálással kimutattuk, hogy a tennék egységes vegyület; a kromatografáláskor eluálószerként kloroform, metanol és 0,3 t%-os kalciumklorid-oldat 50:42:11 térfogatarányú elegyét használtuk (Rf=0,37; GMi=0,43; lizo- GMi=0,24).

15. példa

N-(12-Hidroxi-sztearoil)-lizo-GMi előállítása

Az 1. példa szerint készített N-dezacetil-lizo-GMi-ből 500 mg-ot (0,37 mM-t) feloldottunk 5 ml dimetil-formamidban, majd az így kapott oldathoz hozzáadtunk 1 ml Triton· 100-at és 104 μΐ (0,75 mM) trietil-amint. Areakcióelegyet addig kevertettük, amíg tiszta oldatot nem kaptunk. Ehhez az oldathoz hozzáadtunk 25 ml tetrahidrofurános oldatot, amely 598 mg (1,5 mM) mennyiségben N-hidroxi-szukcinimidnek és 12-hidroxi-sztearinsavnak az észterét tartalmazza. [Ezt az észtert a következőképpen állítottuk elő: 18 óra hosszat reagáltattunk szobahőmérséken 15 ml vízmentes tetrahidrofuránban feloldott 870 mg 12-hidroxi-sztearinsavat 10,5 mgdi(N-szukcinimidil)-karbonáttal és 550 μΐ trietil-aminnal 40 ml acetonban.]

HU 205 129 Β

A reakciót 24 óra alatt játszattuk le szobahőmérsékleten, majd az oldatot bepároltuk és ismételt kicsapást végeztünk etil-acetáttal. A nyersterméket szilikagéles kromatografálással tisztítottuk; oldószerként kloroform, metanol és víz 60:30:6 térfogatarányú elegyét alkalmaztuk.

Az ilyen módon intermedierként kapott Ni-dezacetil-N2-(12-hidroxi-sztearoil)-lizo-GMi-et ezután Nacetileztük ekvimoláris mennyiségű ecetsavanhidriddel, amelyet kloroform és metanol 1:1 térfogatarányú elegyében feloldva alkalmaztunk. Amint a reakció befejeződött, a terméket szárítottuk, a maradékot felvettük 2 ml 1:1 térfogatarányú kloroform/metanol elegygyel és a terméket kicsaptuk 10 ml acetonnal.

A terméket ezután tisztítottuk szilkagéles kromatográfiás módszerrel. Oldószerként kloroform, metanol és víz 60:35:8 térfogatarányú elegyét alkalmaztuk. A tiszta frakciókat egyesítettük, bepároltuk és a maradékot felvettük 1 normál nátrium-karbonát-oldattal. Desztillált víz alkalmazásával végrehajtott dializálást követően 5 ml-re pároltuk be az oldatot és a terméket kicsaptuk 50 ml acetonnal.

Ilyen módon 217 mg N-(12-hidroxi-sztearoil)-lizoGMi-et kaptunk, és ez 34,5%-os hozamnak felel meg.

Oldószerként kloroform, metanol és 0,3 t%-os kalcium-klorid-oldat elegyét alkalmazva szilikagéles kromatografálással megállapítottuk, hogy a termék egységes vegyület (Rf-0,39; N-dezacetil-lizo-GMi-0,05; N-dezacetil-GMi-0,20; GMi-0,40).

16. példa

N-(3-Klár-pivaloil)4izo-GM-í előállítása

A 2. példa szerint előállított lizo-GMi-ből 500 mg-ot (0,38 mM-t) feloldottunk 1:1 térfogatarányú dimetilformamid/metanol elegy 1 ml-ében, majd a keletkezett oldathoz hozzáadtunk szobahőmérsékleten 1,160 μΐ (7,6 mM) trietil-amint és 990 μΐ (7,6 mM) 3-klór-pivaloil-kloridot.

A kondenzálást szobahőmérsékleten hajtottuk végre, 4 óra alatt. Amint befejeződött a reakció, a terméket kicsaptuk 10 ml mennyiségű, vízzel telített etil-acetáttal, majd szűrés és vákuumszárítás következett.

A terméket ezt követően szilikagéles kromatografálással tisztítottuk. Oldószerként kloroform, metanol és víz 60:35:8 térfogatarányú elegyét alkalmaztuk.

A tiszta frakciókat egyesítettük, bepároltuk, a maradékot felvettük 1 normál nátrium-karbonát-oldattal. Desztillált víz alkalmazásával dializáltunk, majd az oldatot bepároltuk 5 ml-re és a terméket kicsaptuk 50 ml acetonnal.

Ilyen módon 404 mg anyagot kaptunk, és ez 74%-os hozamnak felel meg. Oldószerként kloroform, metanol és 0,3 t%-os kalcium-klorid-oldat 50:42:11 térfogatarányú elegyét használva szilikagéles kromatografálással megállapítottuk, hogy a termék egységes vegyület (Rf-0,33; GMi-0,43; lizo-GMi-0,24).

17. példa

Gangliozidelegy (GA) előállítása marhaagyszövetből extrahálással Az állatból eltávolított agykéreg egy részét 6,8 pHértékű foszfátpufferben homogenizáltuk, majd ehhez az elegyhez hozzáadtunk hatszoros mennyiségű tetrahidrofuránt és az így keletkezett elegyet centrifugáltuk. A felülúszó réteget kétszer ismételten extraháltak tetrahidrofuránnal. A centrifugálást követően a nempoláris anyagokat eltávolítottuk dietil-éteres megosztással, majd a vizes-tetrahidrofurános fázist bevezettük egy ioncserélő oszlopba, amely 50%-os etanollal volt egyensúlyba hozva. Az oszlopból eltávozó folyadékhoz bárium-hidroxidot adtunk négyszeres térfogatú, jéghideg etanollal együtt. Az elegyet 18 óra hosszat tartottuk hidegen, majd a csapadékot összegyűjtöttük és feloldottuk vízben, majd az oldatot kissé megsavanyítottuk sósavval. Az így kapott oldatot dializáltuk és liofilizáltak. Az előállításnak ebben a fázisában az alkalmazott idegszövet 1 grammjára vonatkoztatva mintegy 0,6 mg volt a nyers gangliozidok mennyisége.

A liofilizált port 20-szoros térfogatú, 2:1 térfogatarányú kloroform/metanol elegyben diszpergáltunk. Amint létrejött az oldat, szűréssel teljesen tisztává tettük, majd megosztottuk olyan módon, hogy 0,2-szeres térfogatú, 0,88 t%-os vizes kálium-klorid-oldatot adtunk az oldathoz. A felső fázist elkülönítettük, dializáltuk, majd liofilizáltak. A hozamnak a végső értéke 1 gramm agyszövetre vonatkoztatva hozzávetőlegesen 0,3 mg volt, tisztított gangliozidsó-elegyre megadva. A kapott gangliozidelegyet különböző frakciókra lehet ezután szétválasztani, amelyek - a már ismertetettek szerint - tiszta formában tartalmazzák a gangliozidokat. A szétválasztáshoz szilícium-dioxiddal töltött oszlopot használtunk, eluálószerként pedig metanol és kloroform elegyét alkalmaztuk. A keletkező anyag megközelítőleg a következő összetételű: 40% GDugangliozid, 21% GMi-gangliozid, 19% GTib-gangliozid és 16% GDib-gangliozid.

18. példa

N-(Diklór-acetil)-származékok előállítása lizogangliozidok elegyéböl

1. Lizogangliozidok előállítása A17. példa szerint előállított gangliozidelegyből 10 got feloldottunk 200 ml 3 normál kálium-hidroxidban, majd az elegyet 72 óra hosszat 90 °C-on tartva hidrolizáltunk. Az oldatot ezt követően lehűtöttük és a pH-ját 6,5re állítottak be sósavval. Az elegyet 18 óra hosszat 4 ’Con tartottak, majd a kicsapódott zsírsavakat szűréssel távolítottuk el. Az oldatot víz alkalmazásával dializáltuk, majd 500 ml-re bepároltuk és 5 liter acetonnal kicsaptuk a terméket.

Az N-dezacetil-lizogangliozidokat és 20% N-dezacetil-gangliozid-elegyet tartalmazó anyagot vákuumban szárítottuk, majd ismételten feloldottuk dimetilformamidban. Ehhez az oldathoz hozzáadtunk 20 ml tetrahidrofuránban feloldva 2,15 g (6,37 mM) 9-fluorenil-metoxi-karbonil-N-hidroxi-szukcinimidet, majd az egész elegyet 1 óra hosszat hagytuk állni szobahőmérsékleten. Végül az elegyhez hozzáadtunk 3 ml (31,85 mM) ecetsavanhidridet és 0,9 ml (63,7 mM) trietil-amint. Fél óra elteltével a védőcsoport eltávolítására 12,5 ml piperidint adagoltunk be és állni hagytuk az elegyet 18 óra hosszat szobahőmérsékleten,

HU 205 129 Β majd a terméket kicsaptuk 2 liter acetonnal. Aszárítás után visszamaradt anyagot feloldottuk 1 mólos nátrium-karbonát-oldatban és az oldatot állni hagytuk 1 óra hosszat, majd ezt követően dializáltuk és bepároltuk 100 mg/ml-es koncentrációjúra, majd a terméket kicsaptuk ötszörös térfogatú acetonnal. A 70%-ban lizogangliozidokat, továbbá N-dezacetil-lizogangliozidokat tartalmazó terméket átengedtük egy S. Sepharose (H⁺ formájú) oszlopon, amelyet metanollal hoztunk egyensúlyba. Az N-dezacetil-lizogangliozidokat metanollal eluáltuk, a lizogangliozidokat pedig 10 mM metanolos ammónium-klorid-oldattal.

A terméket tartalmazó frakciót megszárítottuk, majd ismételten feloldottuk az anyagot vízben. Az oldat pH-ját 10-re állítottuk be 0,01 normál nátrium-hidroxid-oldattal, majd az oldatot dializáltuk és bepároltuk 100 mg/ml koncentrációjúra, majd ötszörös térfogatú acetonnal kicsaptuk a terméket, amelynek a mennyisége 4,7 g volt (ez a mennyiség 55%-os hozamnak felel meg).

2. Diklór-acetil-származékok előállítása

Az előzőek szerint elkészített lizogangliozidelegyből 500 mg-ot (0,32 mM) feloldottunk 1:1 térfogatarányú dimetil-fonnamid/metanol elegyben, majd 0 ’C hőmérsékleten az oldathoz hozzáadtunk 430 μΐ (3,1 mM) trietilamint és 472 pl (3,1 mM) diklőr-ecetsavanhidridet. Az így kapott elegyet azután leszűrtük és szárítottuk.

Az acilezett terméket eztkövetően elválasztottuk areakcióba nem lépett anyagtól kromatografálással. A kromatografálást S. Sepharose (H⁺ formájú) oszlopon végeztük, amelyet metanollal hoztunk egyensúlyba. A diklór-acetii-származékot metanollal eluáltuk, majd szárítottuk. A maradékot felvettük 1 normál nátrium-karbonát-oldattal, az oldatot dializálást követően 2,5 ml-re töményítettük, majd 25 ml acetonnal kicsaptuk a terméket.

Ilyen módon 345 mg anyagot kaptunk, amely az elméleti mennyiségnek a 64%-a.

19. példa

N-(Metoxi-acetil)-lizo-GMi metil-észterének előállítása

A 7. példa szerint előállított N-(metoxi-acetil)-lizoGMi-nátrium-sóból 500 mg-ot (0,36 mM-t) feloldottunk 5 ml N-metil-pirrolidonban, majd az így kapott oldathoz hozzáadtunk 44,5 μΐ (0,72 mM) metil-jodidot.

A reakcióelegyet 3 óra hosszat szobahőmérsékleten tartottuk, majd kicsaptuk a terméket etil-acetáttal. Szűrés, majd vákuumszárítás következett.

A terméket ezt követóén szilikagéles kromatografálással tisztítottuk. Eluálószerként kloroform, metanol és víz 60:30:6 térfogatarányú elegyét használtuk.

A tiszta frakciókat egyesítettük, bepároltuk, majd a maradékot ismét feloldottuk - 2,5 ml 1:1 térfogatarányú kloroform/metanol elegyben -, majd kicsaptuk a terméket 25 ml acetonnal.

Ilyen módon 457 mg anyagot kaptunk, és ez a mennyiség megfelel az elméletileg számított mennyiség 74%-ának. Szilikagéles kromatografálással megállapítottuk, hogy a tennék egységes vegyület; eluálószerként kloroform, metanol és 0,3 t%-os kalciumklorid-oldat 50:42:11 térfogatarányú elegyét használtuk [Rf=0,4; N-(metoxi-acetiI)-lizo-GMi=0,36].

20. példa

N-(Metoxl-acetil)-lizo-GMi belső észterének előállítása

A 7. példa szerint előállított N-(metoxi-acetil)-lizoGMi-nátrium-sőból 500 mg-ot (0,36 mM-t) feloldottunk 4 ’C-on 5 ml N-metil-piirolidonban, majd a keletkezett oldatot reagáltattuk 55 μΐ (0,4 mM) trietil-amínnal és 100 mg (0,41 mM) l-metiI-2-klór-piridxnium-jodiddal. A reakció 4 óra alatt kvantitatív módon végbement. A terméket kicsaptuk 50 ml aceton beadagolásával, majd leszűrtük a csapadékot, felvettük 5 ml 1:1 térfogatarányú kloroform/izopropíl-alkohol eleggyel, majd a terméket ismételten kicsaptuk 25 ml acetonnal.

Ilyen módon 483 mg anyagot kaptunk, az elméletileg számított mennyiségnek a 98%-át. Kloroform, metanol, 0,3 t%-os kalcium-klorid-oldat 50:42:11 térfogatarányú elegyének oldószerként! felhasználásával szilikagéles kromatografálást hajtottunk végre, amely azt mutatta, hogy a tennék egységes vegyület [Rf=0,43; N-(metoxi-acetil)-lizo-GMi=0,36].

21. példa

Az N-(MetoxTacetil)-llzo-GMi 2-butil-amidjának előállítása

Az N-(metoxi-acetil)-lizo-GMi metil-észteréből 500 mg-ot (0,36 mM-t) feloldottunk 5 ml piridinben, majd az így kapott oldathoz hozzáadtunk 2,5 ml 2-butil-amint. Areakcióelegyet állni hagytuk szobahőmérsékleten 72 óra hosszat, majd forgó bepárlókészülékben szárítottuk. A maradékot felvettük 5 ml 1:1 térfogatarányú kloroform/metanol eleggyel. A terméket kicsaptuk 25 ml acetonnal, majd szűrtük és szárítottuk.

A terméket ezután szilikagéles kromatografálással tisztítottuk. Eluálószerként kloroform, metanol és víz 60:25:4 térfogatarányú elegyét használtuk. A tiszta frakciókat összegyűjtöttük, majd feloldottuk őket

2,5 ml 1:1 térfogatarányú kloroform/metanol elegyben. Ezt követően 25 ml acetonnal kicsaptuk a terméket.

Ilyen módon 371 mg anyagot állítottunk elő. Ez a mennyiség megfelel az emléletileg számított mennyiség 72%-ának.

Oldószerként kloroform, metanol és 0,3 t%-os kalcium-klorid-oldat elegyét alkalmazva szilikagéles kromatografálással megállapítottuk, hogy a termék egységes vegyület (Rp-0,48; N-(metoxi-acetil)-lizo-GMimetil-észter-0,4],

22. példa

AzN-(Metoxi-acetil)-lizo-GMi-metil-észter peracetátjának előállítása Az N-(metoxi-acetil)-lizo-GMi metil-észteréből

500 mg-ot (0,36 mM-t) feloldottunk 5 ml piridinben, majd az így kapott oldathoz hozzáadtunk 2,5 ml frissen desztillált ecetsavanhidridet és az így kapott elegyet 72 óra hosszat kevertettük szobahőmérsékleten.

HU 205 129 Β

Amint a reakció befejeződött, az oldatot bepároltuk rotációs készülékben és a maradékot megosztottuk 10 ml jéghideg víz és 10 ml etil-acetát között. Az etil-acetátot hideg, 1 mólos sósavoldattal, majd ezt követően vízzel és 1 mólos nátrium-karbonát-oldattal mostuk. A szerves fázist vízmentesítettük nátriumszulfáttal, bepároltuk, majd a maradékot szilikagéles kromatográfiás módszerrel tisztítottuk. Eluálószerként klór-metán, etil-acetát és izopropanol 70:30:45 térfogatarányú elegyét használtuk. A tiszta frakciókat egyesítettük, bepároltuk, majd ismét feloldottuk 5 ml etil-acetáttal, majd kicsaptuk a terméket 25 ml n-hexánnal.

Ilyen módon 450 mg terméket kaptunk; ez a menynyiség megfelel 61%-os hozamnak.

Eluálőszerként kloroform, metanol és etil-acetát 70:10:30 térfogatarányú elegyét alkalmazva, majd etilacetát és izopropanol 95:5 térfogatarányú elegyét felhasználva szilikagéles kromatografálást hajtottunk végre, amelynek az eredménye azt mutatta, hogy a termék egységes vegyület (Rf=Ö,45, illetve 0,26).

23. példa

A lizogangliozidelegyekből előállítható N-(diklór-acetil)-származékok belső észtereinek előállítása

A 18. példa szerint készített anyagból - vagyis lizogangliozidelegyből előállított N-diklór-acetil-származékok nátriumsójából - 500 mg-ot (0,29 mM-t) feloldottunk 5 ml N-metil-pirrolidonban 4 °C-on, majd az oldatot reagáltattuk 44,5 pl (0,32 mM) trietil-aminnal és 82,2 mg (0,32 mM) l-metil-2-klór-piridinium-jodiddal. A reakció 4 óra alatt 4 °C-on teljes egészében végbement. A terméket kicsaptuk 50 ml aceton hozzáadásával, szűrtük, majd felvettük diklór-metán és izopropanol 1:1 térfogatarányú elegyének 5 ml-ében, majd ismét kicsaptuk 25 ml acetonnal. Ilyen módon 457 anyagot állítottunk elő.

A belső észterek jelenlétéről meggyőződtünk infravörös spektroszkópiai, valamint vékonyréteg-kromatográfiás vizsgálattal. Az infravörös spektroszkópiai vizsgálatot KBr-pelletekkel valósítottuk meg, és 1750 cm’’-nél észterekre jellemző sávot mutattunk ki.

Az oldószerként kloroform, metanol és 0,3 t%-os kalcium-klorid-oldat 50:42:11 térfogatarányú elegyével végzett szilikagéles kromatográfiás vizsgálat eredményei azt mutatták, hogy a terméknek az Rf-értéke 0,43 és 0,60 között van, tehát magasabb, mint 0,35, vagyis a kiindulási vegyületek Rf- értéke. A kromatográfiás vizsgálattal tehát kimutattuk, hogy a termékben nincs jelen kiindulási anyag. Ezt követően hidrolizáltuk az észterkötést 0,1 normál nátrium-karbonát-oldat alkalmazásával 60 °C-on, 1 óra alatt. így visszakaptuk a gangliozidszármazékok eredeti elegyét.

24. példa

Lizogangliozidelegyből előállított N-(diklór-acetil)-származékok metil-észtereinek előállítása

Lizogangliozidelegyből előállított N-(diklór-acetil)származékok belső észtereinek az elegyéből - amelyet a 23. példa szerint állítottunk elő-feloldottunk 500 mg-ot (0,30 mM) metilén-klorid és metanol 4:1 térfogatarányú, vízmentes elegyének 20 ml-ében. Az így keletkezett oldathoz hozzáadtunk 32,4 mg (0,60 mM) mennyiségű, 5 ml vízmentes metanolban feloldott nátrium-metilátot és a kapott elegyet visszafolyatás mellett forraltuk 2 óra hosszat. Amint a reakció befejeződött, az elegyet semlegesítettük vízmentes, H⁺ formájú DOWEX AG 50«8-as gyantával, majd a gyantát elválasztottuk szűréssel és metanollal mostuk.

Az oldatot szárazra pároltuk, a maradékot felvettük 5 ml 1:1 térfogatarányú metilén-klorid/metanol elegygyel, majd a reakcióterméket kicsaptuk olyan módon, hogy a reakcióelegyet 25 ml acetonba öntöttük.

A nyersterméket ezután Α-25-ös Sephadex-DEAE acetát formájú gyantán tisztítottuk kromatografálással. Oldószerként kloroform, metanol és víz 30:60:8 térfogatarányú elegyét alkalmaztuk. A semleges frakciókat összegyűjtöttük, bepároltuk, víz alkalmazásával dializáltuk és feloldottuk 1:1 térfogatarányú kloroform/metanol elegy 15 ml-ében a szárazra párlás után kapott maradékot, majd a terméket 75 ml acetonnal csaptuk ki.

Ilyen módon 430 mg anyagot kaptunk.

A KBr-pelleteken elvégzett infravörös spektroszkópiai vizsgálattal észterekre jellemző kötéseket mutattunk ki 1750 cm⁴-nél.

Az eluálőszerként kloroform, metanol és 0,3 t%-os kalcium-klorid-oldat 50:42:11 térfogatarányú elegyének alkalmazása mellett végrehajtott szilikagéles kromatografálás eredményei azt mutatták, hogy a tennék N-(diklór-acetil)-lizogangliozidok metil-észtereinek az elegye, amelynek az Rrértékei 0,40 és 0,54 között vannak. (A gangliozidszármazékok nátriumsóinak az elegyében legfeljebb 0,35-ös Rf-értékkel rendelkező komponensek találhatók.)

Az átészterezés teljes végbemeneteléről meg lehet győződni olyan módon, hogy meghatározzuk a keletkezett alkoxicsoportok, valamint a szialinsavcsoportok közötti arányt. A meghatározás annak a metil-alkoholnak a „head-space” gázkromatográfiás módszerrel való kvantitatív mérésével lehet elvégezni, amely 0,1 normál nátrium-karbonát-oldattal 60 °C-on végrehajtott 1 órás kezelés során szabadul fel az összes észterkötés felbomlása miatt, továbbá a Svennerholm-módszeirel, amely az Nacetil-neuraminsavnak a meghatározására szolgál.

25. példa

Lizogangllozidelegy N-(diklór-acetil)-származékainak 2-butil-amidjaira vonatkozó előállítási eljárás

A 23. példa szerinti, lizogangliozidelegyből előállított N-(diklór-aceül)-származékok belső észtereinek elegyéből 500 mg-ot (0,30 mM-t) feloldottunk 2,5 ml vízmentes piridinben. A keletkezett oldathoz hozzáadtunk 1,25 ml 2-butil-amint és a kapott elegyet állandó keverés mellett vízmentes körülmények között tartottuk 25 °C-on 24 óra hosszat.

Amint a reakció befejeződött, az oldószert elpárologtattuk, a maradékot felvettük kloroform és metanol 1:1 térfogatarányú elegyének 5 ml-ével, majd kicsaptuk a reakcióterméket 25 ml acetonnal.

HU 205 129 Β

Az így előállított nyersterméket 25 °C-on 30 percen keresztül kezeltük 10 ml 1 t%-os nátrium-karbonát-oldattal, hogy a megmaradt észtercsoportok is hidroEzálódjanak, majd az oldatot víz alkalmazásával diaEzáltuk, vákuumban szántottuk és a maradékot kromatografálással tisztítottuk. A kromatografáláshoz acetát formájú Sephadex-DEAE Α-25-tel töltött oszlopot, valamint - oldószerként - kloroform, metanol és víz 30:60:8 térfogatarányú elegyét használtuk.

A semleges frakciókat ezután szárazra pároltuk, diaEzáltuk, majd ismételten bepároltuk. A maradékot feloldottuk 1:1 térfogatarányú klorofonn/metanol elegy 5 miében, majd 25 ml acetonnal kicsaptuk a reakcióterméket. Ilyen módon 425 mg terméket kaptunk. Az infravörös spektroszkópiai vizsgálat eredményei arra utalnak, hogy a termékben nincs jelen már észter, mert nem mutatkozik az észterkötésre jeUemző sáv 1750 cm’^l-nél.

Az oldószerként kloroform, metanol és 0,3 t%-os kalcium-klorid-oldat 50:42:11 térfogatarányú elegyének alkalmazása meUett végrehajtott szilikagéles kromatografálás, valamint a rezorcinos meghatározás eredményei azt mutatták, hogy az elegy olyan N-(diklór-acetil)-EzogangEozid-2-butil-ainidokből áll, amelyeknek az Rf-értékei 0,48 és 0,71 között vannak. (A gangliozidszármazékok nátriumsőiból álló elegyben a komponensek Rf-értékei 0,35-nél kisebb értékek.)

26. példa

Lizogangliozidelegyekből előállított N-(diklór-acettl)-származékok metil-észtereinek peracilezett származékaira vonatkozó előállítási eljárás LizogangEozidelegy N-(diklór-acetil)-származékainak metil-észtereiből álló, a 24. példa szerint előállított elegyből 500 mg-ot (0,29 mM-t) feloldottunk 5 ml piridinben, majd a keletkezett oldathoz hozzáadunk 2,5 ml frissen desztillált ecetsavanhidridet és az elegyet 72 óra hosszat kevertettük szobahőmérsékleten. Amint a reakció befejeződött, az oldatot forgó bepárlókészülékben bepároltuk és a maradékot megosztottuk 10 ml jéghideg víz és 10 ml etil-acetát között. Az etil-acetátos fázist először hideg, 1 mólos sősavoldattal, majd vízzel és végül 1 mólos nátriumhidrogén-karbonát-oldattal mostuk. A szerves fázist vízmentesítettük nátrium-szulfát alkalmazásával, majd bepároltuk és a maradékot szilikagélen tisztítottuk kromatográfiás módszerrel. Eluálószerként diklór-metán, etil- acetát és izopropanol 70:30:45 térfogatarányú elegyét használtuk. A tiszta frakciókat egyesítettük, majd bepároltuk újra, feloldottuk őket 5 ml dietil-éterrel és a reakciőterméket kicsaptuk 25 ml n-hexánnal.

Ilyen módon 485 mg tennéket áhítottunk elő. SziEkagélen végzett kromatografálással megáEapítottuk, hogy kloroform, metanol és etil-acetát 70:10:30 térfogatarányú elegyének - mint eluálószemek - az alkalmazása esetén a termék Rf-értékei 0,23 és 0,54 között voltak, míg abban az esetben, ha etil-acetát és izopropanol 95:5 térfogatarányú elegyét alkalmaztuk eluálószerként, az említett Rpértékek 0,01 és 0,52 között voltak.

27. példa

N-(3,3-Diklór-pivaloil)-Ezo-GMielőálEtása

500 mg (0,3 8 mM) Ezo-GMi-et feloldottunk 25 ml dimetil-foimamidban, majd a keletkezett oldathoz hozzáadtunk 528 μΐ (3,8 mM) trietil-amint, 650 mg (3,8 mM) 3,3-diklőr-pivalinsavat és - 2,5 ml dimetil-formamidban feloldva - 194,2 mg (0,76 mM) 2-klór-l-metil-piridinium-jodidot.

A reakcióelegyet állni hagytuk szobahőmérsékleten 18 óra hosszat, majd 50 ml, vízzel teEtett etil-acetáttal kicsaptuk a reakcióterméket, amelyet ezt követően szárítottunk és szilikagéles kromatografálással tisztítottuk. Eluálószerként kloroform, metanol és víz 60:35:8 térfogatarányú elegyét alkalmaztuk.

A tiszta frakciókat egyesítettük, bepároltuk, majd a maradékot felvettük 1 normál nátrium-karbonát-oldattal. Az oldatot desztillált víz alkalmazásával dializáltuk, majd bepároltuk 5 ml-re és a reakcióban keletkezett tennéket kicsaptuk 50 ml acetonnal. Ilyen módon 365 mg terméket állítottunk elő, és ez a mennyiség megfelel az elméletileg számított mennyiség 84%ának.

Az eluálószerként kloroformot, metanolt és 0,3 t%os kalcium-klorid-oldatot 50:42:11 térfogatarányban tartalmazó elegyet alkalmazó sziEkagéles kromatografálás eredményei azt mutatták, hogy a tennék egységes és az Rf-értéke 0,36.

28. példa

N-Treonil-lizo-GMi előállítása

500 mg (0,38 mM) lizo-GMi-et feloldottunk 25 ml dimetil-formamidban, majd a keletkezett oldathoz hozzáadtunk 528 μΐ (3,8 mM) trietil-amint, 648 mg (1,9 mM) FMOC-treonint és 194,2 mg (0,76 mM) mennyiségű,

2,5 ml dimetil-formamidban feloldott 2-klőr-l-metil-piridinium-jodidot. A reakcióelegyet 18 óra hosszat hagytuk áEni szobahőmérsékleten, majd hozzáadtunk a reakcióelegyhez 2 ml piperidint az FMOC-védőcsoport eltávoEtása céljából. Ezt követően ismét állni hagytuk - 3 óra hosszat - a reakcióelegyet szobahőmérsékleten, majd a reakcióterméket kicsaptuk 100 ml acetonnal. A tennéket ezt követően szűrtük és szántottuk, majd sziEkagéles kromatografálással tisztítottuk. Eluálószerként kloroform, metanol és víz 60:35:8 térfogatarányú elegyét alkalmaztuk.

A tiszta frakciókat összegyűjtöttük, bepároltuk, majd a maradékot felvettük 1 normál nátrium-karbonát-oldattal. Az oldatot desztillált víz alkalmazása mellett dializáltuk, majd 5 ml-re bepároltuk. Arekcióterméket 50 ml acetonnal csaptuk ki. Ilyen módon 323 mg (60%-os hozam) terméket álEtottunk elő.

Oldószerként kloroformot, metanolt és 0,3 t%-os kalcium-klorid-oldatot tartalmazó eleggyel sziEkagélen kromatografálva kimutattuk, hogy a tennék egységes vegyület, amelynek az Rf-értéke 0,29.

29. példa

N-(Dimetil-glicil)-lizo-GMi előállítása

500 mg (0,38 mM) Ezo-GMi-et feloldottunk 2,5 ml dimetil-formamidban, majd a keletkezett oldathoz szo1

HU 205 129 Β bahőmérsékleten hozzáadtunk 528 μΐ (3,8 mM) trietilamint, 196 mg (1,9 mM) dimetil-glicint, valamint

2,5 ml dimetil-formamidban feloldott, 194,2 mg (0,76 mM) mennyiségű 2-klór-l-metil-piridinium-jodidot. A reakciólegyet állni hagytuk szobahőmérsékleten 18 óra hosszat, majd a reakcióterméket kicsaptuk 100 ml acetonnal. A keletkezett terméket leszűrtük és szárítottuk, majd szilikagéles kromatografálással tisztítottuk. Eluálószerként kloroform, metanol és víz 60:35:8 térfogatarányú elegyét alkalmaztuk.

A tiszta frakciókat összegyűjtöttük, bepároltuk, majd a maradékot felvettük 1 normál nátrium-karbonát-oldattal. Az oldatot desztillált víz alkalmazása mellett dializáltuk, majd bepároltuk 5 ml-re és a reakcióterméket kicsaptuk 50 ml acetonnal. Ilyen módon 309 mg (58%-os hozam) anyagot kaptunk.

Szilikagéles kromatografálással - 50:42:11 térfogatarányú kloroform/metanol/0,3 t%-os kalcium-klorid-oldat elegy oldószerként! alkalmazása mellett - a keletkezett termék egységes vegyületnek bizonyul, amelynek az Rf-értéke 0,11.

30. példa

N-Glutaril-lizo-GMi előállítása

Feloldottunk 500 mg (0,38 mM) lizo-GMi-et dimetilformamid és metanol 1:1 térfogatarányú elegyének 1 miében, majd a keletkezett oldathoz hozzáadunk 0 °C-on 161 μΐ (1,14 mM) trietil-amint és 130 pl (1,14 mM) glutársavanhidridet. A reakcióelegyet állni hagytuk szobahőmérsékleten 72 óra hosszat, majd a keletkezett terméket 20-szoros térfogatú etil-acetáttal kicsaptuk, szűrtük és szárítottuk.

A terméket ezt követően^ szilikagéles kromatografálással tisztítottuk. Eluálószerként kloroform, metanol és víz 60:35:8 térfogatarányú elegyét használtuk fel.

A tiszta frakciókat összegyűjtöttük, bepároltuk, majd a maradékot felvettük 1 normál nátrium-karbonát-oldattal. Az oldatot desztillált víz alkalmazása mellett dializáltuk, majd bepároltuk 5 ml-re. A terméket 50 ml acetonnal kicsaptuk. Ilyen módon 217 mg terméket kaptunk, amelynek a mennyisége 40,0%-os hozamnak felel meg.

Szilikagéles kromatografálással - eluálószerként kloroform, metanol és 0,2 t%-os kalcium-klorid-oldat 50:42:11 térfogatarányú elegyét alkalmazva - kimutattuk, hogy a termék egységes vegyület, amelynek az Rrértéke 0,30.

31. példa

N-(Klór-difluor-acetil)-lizo-GM] előállítása

Feloldottunk 500 mg (0,38 mM) lizo-GMi-et dimetil-formamid és metanol 1:1 térfogatarányú elegyének 2,5 ml-ében, majd a keletkezett oldathoz 0 °C-on hozzáadtunk 528 μΐ (3,8 mM) trietil-amint és 277 mg (1,14 mM) klór-difluor-ecetsavanhidridet. A reakcióelegyet 72 óra hosszat hagytuk állni szobahőmérsékleten, majd a keletkezett terméket 20-szoros térfogatú etil-acetáttal kicsaptuk, szűrtük és szárítottuk.

A terméket ezt követően tisztítottuk szilikagéles kromatografálással. Eluálószerként kloroform, metanol és víz 60:35:8 térfogatarányú elegyét alkalmaztuk.

A tiszta frakciókat összegyűjtöttük, bepároltuk és a maradékot felvettük 1 normál nátrium-karbonát-oldattal, majd desztillált víz alkalmazása mellett dializálást hajtottunk végre. Az oldatot ezután bepároltuk 5 ml-re és a keletkezett terméket kicsaptuk 50 ml acetonnal. Ilyen módon 333 mg anyagot kaptunk, és ez a mennyiség megfelel 62,0%-os kitermelésnek.

Oldószerként kloroform, metanol és 0,2 t%-os kalcium-klorid-oldat 50:42:11 térfogatarányú elegyének alkalmazásával végzett szilikagéles kromatografálással kimutattuk, hogy a termék egységes vegyület, amelyek az Rf-értéke 0,37.

32. példa

N-Izoleucil-lizo-GMx előállítása

Feloldottunk 500 mg (0,38 mM) lizo-GMi-et 2,5 ml dimetil-formamidban, majd a keletkezett oldathoz szobahőmésékleten hozzáadtunk 528 pl (3,8 mM) trietil-amint és 671 mg (1,9 mM) FMOC-izoleucint és 194,2 mg (0,76 mM) mennyiségű, 25 ml dimetil-formamidban feloldott 2-klór-l-metil-piridinium-jodidot. A reakcióelegyet állni hagytuk szobahőmérsékleten 18 óra hosszat, majd - a védőcsoport eltávolítása érdekében - a reakcióelegyhez hozáadtunk 2 ml piperidint. A reakcióelegyet 3 óra hosszat hagytuk állni szobahőmérsékleten, majd a reakcióterméket kicsaptuk 100 ml acetonnal, leszűrtük és szárítottuk.

A keletkezett terméket szilikagéles kromatografálással tisztítottuk. Eluálószerként kloroform, metanol és víz 60:35:8 térfogatarányú elegyét alkalmaztuk.

A tiszta frakciókat egyesítettük, majd bepároltuk. A maradékot felvettük 1 normál nátrium-karbonát-oldattal, majd desztillált víz alkalmazása mellett dializálást hajtottunk végre. Az oldatot bepároltuk 5 ml-re, majd 50 ml acetonnal kicsaptuk a terméket. Ilyen módon 298 mg terméket állítottunk elő, és ez a mennyiség megfelel 55%-os kitermelésnek.

A kloroform, metanol, 0,3 t%-os kalcium-klorid-oldat 50:42:11 térfogatarányú elegyéből álló eluálószer alkalmazása mellett végrehajtott szilikagéles kromatografálás eredményei azt mutatták, hogy a termék egységes; az Rrérték 0,28.

33. példa

N-(Merkapto-acetil)-lizo-GMi előállítása

500 mg (0,38 mmól) lizo-GMi-et - amelyet a 2. példában leírt módon állítottunk elő - feloldottunk 10 ml piridinben, majd szobahőmérsékleten 833 μΐ (7,6 mmól) etiltio-glikolátot adtunk az oldathoz. Az elegyet szobahőmérsékleten 36 óra hosszat reagálni hagy tűk, majd 2,5 ml térfogatra bepároltuk, azután 25 ml hideg aceton hozzáadásával leválasztottuk a terméket, ezt szűréssel elkülönítettük és megszárítottuk.

Az így kapott terméket szilikagéles kromatografálással tisztítottuk; eluálószerként kloroform, metanol és víz 60:35:5 térfogatarányú elegyét alkalmaztuk.

A tiszta frakciókat egyesítettük, bepároltuk, a maradékot 1 n nátrium-karbonát-oldattal kezeltük, majd a kapott oldatot vízzel szemben dializáltuk, azután 5 ml térfogatra bepároltuk és a terméket 50 ml acetonnal

HU 205 129 Β leválasztottuk. 376 mg cím szerinti vegyületet (az elméleti hozam 72%-a) kaptunk.

Ezt a terméket szilikagélen kromatografáltuk, eluálószerként kloroform, metanol és 0,3 %-os kalcium-klorid-oldat 50:42:11 térfogatarányú elegyét alkalmazva, így a termék egységes vegyületnek bizonyult; Rf=0,34 (GMi=0,43; lizo- GMi=0,24).

34. példa

N-(Glicil)-lizo-GMi előállítása

500 mg (0,38 mmól) lizo-GMi-et- amelyet a 2. példában leírt módon állítottunk elő - feloldottunk 2,5 ml dimetil-formamidban 749 μΐ (1,9 mmól) fluorenil-metoxikarbonil-glicil-szukcinimidát (FMOC-Gly-OSu) hozzáadásával. A reakcióelegyet szobahőmérsékleten 24 óra hosszat kevertük. A reakció befejeződése után a termék védőcsoportját 0,25 ml piperidin hozzáadásával eltávolítottuk. 2 óra állás után a terméket hideg aceton hozzáadásával leválasztottuk és vákuumban megszárítottuk. Az így kapott terméket szilikagéles kromatografálással tisztítottuk; eluálószerként kloroform, metanol és víz 60:35:8 térfogatarányú elegyét használtuk.

A tiszta frakciókat egyesítettük, 5 ml térfogatra bepároltuk, majd 50 ml aceton hozzáadásával leválasztottuk a terméket 328 mg cím szerinti vegyületet (az elméleti hozam 63,5%-a) kaptunk.

Ezt a terméket szilikagélen kromatografáltuk, eluálószerként kloroform, metanol és 0,3 t%-os kalciumklorid-oldat 50:42:11 térfogatarányú elegyét használva, így a termék egységes vegyületnek bizonyult; Rp=0,31 (GMí-0,43; lizo- GMi-0,24).

35. példa

N-(ct-L-Alanil)-Uzo-GMi előállítása

500 mg (0,38 mmól) lizo-GMi-et-amelyet a 2. példában leírt módon állítottunk elő - feloldottunk 2,5 ml dimetil-formamid és 776 μΐ (1,9 mmól) fluorenil-metoxikarbonil-alanil-szukcinimidát (FMOC-Ala-OSu) elegyében. A reakcióelegyet szobahőmérsékleten 24 óra hosszat kevertük. Areakció befejeződése után a termék védőcsoportját 0,25 ml piperidin hozzáadásával eltávolítottuk. 2 óra állás után a terméket hideg aceton hozzáadásával leválasztottuk és vákuumbanmegszántottuk. Az így kapott terméket szilikagéles kromatografálással tisztítottuk; eluálószerként kloroform, metanol és yíz 60:35:8 térfogatarányú elegyét használtuk.

A tiszta frakciókat egyesítettük, 5 ml térfogatra bepároltuk, majd 50 ml aceton hozzáadásával leválasztottuk a terméket. 356 mg cím szerinti vegyületet (az elméleti hozam 68,2%-a) kaptunk.

Ezt a terméket szilikagélen kromatografáltuk, eluálószerként kloroform, metanol és 0,3 t%-os kalciumklorid-oldat 50:42:11 térfogatarányú elegyét használva, így a termék egységes vegyületnek bizonyult; Rp-0,33 (GMi-0,43; lizo- GMi-0,24).

36. példa

N-fö-L-Alanilflizo-GMi előállítása

500 mg (0,38 mmól) lizo-GMi-et - amelyet a 2. példában leírt módon állítottunk elő - feloldottunk

2,5 ml dimetil-formamid és 776 μΐ (1,9 mmól) fluorenil-metoxi-karbonil-alanil-szukcinimidát (FMOC-βAla-OSu) elegyében. Areakcióelegyet szobahőmérsékleten 24 óra hosszat kevertük. A reakció befejeződése után a termék védőcsoportját 0,25 ml piperidin hozzáadásával eltávolítottuk. 2 óra állás után a terméket hideg aceton hozzáadásával leválasztottuk és vákuumban megszárítottuk. Az így kapott terméket szilikagéles kromatografálással tisztítottuk; eluálószerként kloroform, metanol és víz 60:35:8 térfogatarányú elegyét használtuk.

A tiszta frakciókat egyesítettük, 5 ml térfogatra bepároltuk, majd 50 ml aceton hozzáadásával leválasztottuk a terméket. 371 mg cím szerinti vegyületet (az elméleti hozam 71%-a) kaptunk.

Ezt a terméket szilikagélen kromatografáltuk, eluálószerként kloroform, metanol és 0,3 t%-os kalciumklorid-oldat 50:42:11 térfogatarányú elegyét használva, így a tennék egységes vegyületnek bizonyult; Rf=0,33 (GMi=0,43; lizo- GM_L=0,24).

37. példa

N-(a.-L-Metionil)-lizo-GMi előállítása

500 mg (0,38 mmól) lizo-GMi-et- amelyet a 2. példában leírt módon állítottunk elő—feloldottunk 25 ml dimetil-formamid és 890 mg (1,9 mmól) fluorenil-metoxikarbonil-metionil-szukcínimidát (FMOC-Met-OSu) elegyében. A reakcióelegyet szobahőmérsékleten 24 óra hosszat kevertük. A reakció befejeződése után a tennék védőcsoportját 0(25 ml piperidin hozzáadásával eltávolítottuk. 2 óra állás után a tennékethideg aceton hozzáadásával leválasztottuk és vákuumban megszárítottuk. Az így kapott terméket szilikagéles kromatografálással tisztítottuk; eluálószerként kloroform, metanol és víz 60:35:8 térfogatarányú elegyét használtuk.

A tiszta frakciókat egyesítettük, 5 ml térfogatra bepároltuk, majd 50 ml aceton hozzáadásával leválasztottuk a terméket. 316 mg cím szerinti vegyületet (az elméleti hozam 57,3%-a) kaptunk.

Ezt a terméket szilikagélen kromatografáltuk, eluálószerként kloroform, metanol és 0,3 t%-os kalciumklorid-oldat 50:42:11 térfogatarányú elegyét használva, így a termék egységes vegyületnek bizonyult; Rt=0,37 (GMi=0,43; lizo- GMi=0,24).

38. példa

N-(4-Amino-butiril)-lizo-GMi előállítása

500 mg (0,38 mmól) lizo-GMi-et feloldottunk

2,5 ml dimetil-formamid és 528 μΐ (3,8 mmól) trietilamin elegyében, majd szobahőmérsékleten hozzáadtuk 618,3 ml (1,9 mmól) FMOC-4-amino-vajsav és 194,2 ml (0,76 mmól) 2-klór-l-metil-piridmium-jodid 2,5 ml dimetil-formamiddal készített oldatát. Az elegyet szobahőmérsékleten 18 óra hosszat állni hagytuk, majd 2 ml piperidint adtunk hozzá az FMOC-védőcsoport eltávolítása céljából. Az elegyet további 3 óra hosszat hagytuk szobahőmérsékleten állni, majd 100 ml aceton hozzáadásával a képződött reakcióterméket leválasztottuk. Az így kapott terméket szűréssel elkülönítettük és megszárítottuk, majd

HU 205 129 Β szilikagéles kromatografálással tisztítottuk; eluálószerként kloroform, metanol és víz 60:35:8 térfogatarányú elegyét használtuk.

A tiszta frakciókat egyesítettük és bepároltuk, majd normál nátrium-karbonát-oldatban oldottuk és desztillált vízzel szemben dializáltuk. A kapott oldatot 5 ml térfogatra bepároltuk, és 50 ml aceton hozzáadásával leválasztottuk a terméket.

339 mg cím szerinti vegyületet (az elméleti hozam

64.3 %-a) kaptunk.

Ezt a terméket szilikagélen kromatografáltuk, eluálószerként kloroform, metanol és 0,3 %-os kalciumklorid-oldat 50:42:11 térfogatarányú elegyét használva, így a termék egységes vegyületnek bizonyult: Rf=0,35 (GMi=0,43; lizo- GMi=0,24).

39. példa

N-(4-Amino-kaproil)-lizo-GM\ előállítása

500 mg (0,38 mmól) lizo-GMi-et feloldottunk

2,5 ml dimetil-formamid és 528 μΐ (3,8 mmól) trietilamin elegyében, majd szobahőmérsékleten hozzáadtuk 671,6 ml (1,9 mmól) FMOC-6-amino-hexánsav és 194,2 ml (0,76 mmól) 2-klór-l-metil-piridiniumjodid 2,5 ml dimetil-formamiddal készített oldatát. Az elegyet szobahőmérsékleten 18 óra hosszat állni hagytuk, majd 2 ml piperidint adtunk hozzá az FMOC-védőcsoport eltávolítása céljából. Az elegyet további 3 óra hosszat hagytuk szobahőmérsékleten állni, majd 100 ml aceton hozzáadásával a képződött reakcióterméket leválasztottuk. Az így kapott terméket szűréssel elkülönítettük és megszárítottuk, majd szilikagéles kromatografálással tisztítottuk; eluálószerként kloroform, metanol és víz 60:35:8 térfogatarányú elegyét használtuk. A tiszta frakciókat egyesítettük és bepároltuk, majd normál nátrium-karbonát-oldatban oldottuk és desztillált vízzel szemben dializáltuk. A kapott oldatot 5 ml térfogatra bepároltuk, és 50 ml aceton hozzáadásával leválasztottuk a terméket.

378 mg cím szerinti vegyületet (az elméleti hozam

70.3 %-a) kaptunk.

Ezt a terméket szilikagélen kromatografáltuk, eluálószerként kloroform, metanol és 0,3 %-os kalcium-klorid-oldat 50:42:11 térfogatarányú elegyét használva, így a tennék egységes vegyületnek bizonyult: Rf=0,38 (GMj-0,43; lizo-GMi-0,24).

40. példa

N-(a-L-Szeril)-lizo-GMi előállítása

500 mg (0,38 mmól) lizo-GMi-et feloldottunk 2,5 ml dimetil-formamid és 528 μΐ (3,8 mmól) trietil-amin elegyében, majd szobahőmérsékleten hozzáadtuk 621,9 ml (1,9 mmól) FMOC-szerin és 194,2 ml (0,76 mmól) 2klór-l-metil-piridinium-jodid 2,5 ml dimetil-formamiddal készített oldatát. Az elegyet szobahőmérsékleten 18 óra hosszat állni hagytuk, majd 2 ml piperidint adtunk hozzá az FMOC-védőcsoport eltávolítása céljából. Az elegyet további 3 óra hosszat hagytuk szobahőmérsékleten állni, majd 100 ml aceton hozzáadásával a képződött reakcióterméket leválasztottuk. Az így kapott tennéket szűréssel elkülönítettük és megszántottuk, majd szilikagéles kromatografálással tisztítottuk; eluálószerként klofororm, metanol és víz 60:35:8 térfogatarányú elegyét használtuk.

A tiszta frakciókat egyesítettük és bepároltuk, majd normál nátrium-karbonát-oldatban oldottuk és desztillált vízzel szemben dializáltuk. A kapott oldatot 5 ml térfogatra bepároltuk, és 50 ml aceton hozzáadásával leválasztottuk a terméket.

351 mg cím szerinti vegyületet (az elméleti hozam 60,5%-a) kaptunk.

Ezt a terméket szilikagélen kromatografáltuk, eluálószerként kloroform, metanol és 0,3 %-os kalcium-klorid-oldat 50:42:11 térfogatarányú elegyét használva, így a tennék egységes vegyületnek bizonyult: Rf=0,29 (GMr-0,43; lizo- GM^O.24).

41. példa

N-Szulfo-acetii-lizo-GM; előállítása

500 mg (0,38 mmól) lizo-GMi-et feloldottunk 2,5 ml dimetil-formamidban, és az oldathoz hozzáadtunk 161 μΐ (l,14mmól) trietil-amint, 532ml (3,8 mmól) szulfo-ecetsav és 194,2 mg (0,76 mmól) l-metil-2-klór-piridiniumjodid 2,5 ml dimetil-formamiddal készített oldatát.

Az elegyet szobahőmérsékleten 18 óra hosszat reagálni hagytuk, majd a reakcióterméket 50 ml vízzel telített etil-acetát hozzáadásával leválasztottuk. Az így kapott terméket beszárítottuk és szilikagéles kromatografálással tisztítottuk; eluálószerként kloroform, metanol és víz 50:40:11 térfogatarányú elegyét használtuk.

A tiszta frakciókat egyesítettük és bepároltuk, a maradékot normál nátrium-karbonát-oldattal 60 °C hőmérsékleten 1 óra hosszat kezeltük, majd az elegyet desztillált vízzel szemben dializáltuk, az oldatot 5 ml térfogatra bepároltuk és a tennéket 50 ml aceton hozzáadásával leválasztottuk.

273 mg cím szerinti vegyületet (az elméleti hozam 50,4%-a) kaptunk.

Ezt a terméket szilikagélen kromatografáltuk, eluálószerként kloroform, metanol és 0,3 %-os kalciumklorid-oldat 50:42:11 térfogatarányú elegyét használva, így a termék egységes vegyületnek bizonyult: Rf=0,12 (GMi=0,43; lizo-GMi=0,24).

42. példa

Oldat formájú, injektálásra alkalmas gyógyászati készítmény előállítása

1. sz. készítmény:

Egy ampulla (2 ml-es) a következő anyagokat tartalmazza:

- hatóanyag 5 mg

- nátrium-klorid 16 mg desztillált vízzel készült

6-os pH-jú puffer-citrátból, a 2 ml-hez szükséges mennyiségben

Az aktív anyag bármelyik lehet a 3., a 4. és a 18. példákban ismertetett gangliozidszármazékok közül.

HU 205 129 Β

2. sz. készítmény:

Egy 2 ml-es ampulla a következő anyagokat tartalmazza:

- hatóanyag 50 mg

- nátrium-klorid 16 mg

- desztillált vízzel készült citrát-puffer (pH=6), a 2 ml-hez szükséges mennyiségben

Az aktív anyag (hatóanyag) bármelyik lehet az 5., a 6. vagy a7. példák szerint előállítottak közül.

3. sz. készítmény:

Egy 4 ml-es flakon a következő anyagokat tartalmazza:

- hatóanyag 100 mg

- nátrium-klorid 32 mg

- desztillált vízzel készült, a 6-os pH-jú citrát-puffer a 4 ml-hez szükséges mennyiségben

A hatóanyag bármelyik lehet a 9., 10. vagy a 14. példa szerint előállítottak közül.

Az 1., 2. vagy 3. készítményeket közvetlenül be lehet adni embereknek és állatoknak egyaránt, az ismertetett adagolási módszerek bármelyikével.

Mindezeken túlmenően, a készítmények tartalmazhatnak egyéb, gyógyászati szempontból aktív anyagot.

43. példa

Kétflakonos gyógyászati készítmények előállítása

A példa szerinti készítményeket az jellemzi, hogy két flakonban kerülnek kiszerelésre. Az első flakon gyógyászati szempontból elfogadható kötőanyag-például glicin vagy mannit - mellett 10-90 t% hatóanyagot tartalmaz liofílizált por alakjában. A második flakon tartalmazza az oldószert, a nátrium-klorid-oldatot, valamint a citrátpuffert. A két flakon tartalmát közvetlenül a felhasználást megelőzően keveqük össze; a hatóanyag liofílizálással előállított pora gyorsan feloldódik és ilyen módon injektálható oldat keletkezik.

A találmányunk szerinti eljárással célszerűen olyan módon állítjuk elő a gyógyászati készítményeket, hogy flakonos kiszerelésben liofilizált por alakjában hozzuk forgalomba a hatóanyagot.

1. összeállítás:

a) egy 2 ml-es, liofilizált hatóanyag befogadására szolgáló ampulla a következő anyagokat tartalmazza:

- hatóanyag 5 mg

- glicin 30 mg

b) egy 2 ml-es oldószeres ampulla a következő anyagokat tartalmazza:

- nátrium-klorid 16 mg

- desztillált vízzel készült citrátpuffer: a 2 ml-hez szükséges mennyisében

Az alkalmazott hatóanyag bármelyik lehet a 19., 20. és 22. példák szerint előállítottak közül.

2. összeállítás:

a) egy 3 ml-es, liofilizált hatóanyag befogadására szolgáló ampulla a következő anyagokat tartalmazza:

- hatóanyag 5 mg

- mannit 40 mg

b) egy 2 ml-es oldószeres ampulla a következő anyagokat tartalmazza:

- nátrium-klorid 16 mg

- desztillált vízzel készített citrátpuffer a 2 ml-hez szükséges mennyiségben.

Hatóanyagként alkalmazhatjuk bármelyik gangliozidot a 23. és a 24. példában ismertetettek közül.

3. összeállítás:

a) egy 3 ml-es, liofilizált hatóanyag befogadására szolgáló ampulla a következő anyagokat tartalmazza:

- hatóanyag 50 mg

- glicin 25 mg

h) egy 3 ml-es oldószeres ampulla a következő anyagokat tartalmazza:

- nátrium-klorid 24 mg

- desztillált vízzel készült citrátpuffer, a 3 ml-hez szükséges mennyiségben.

Hatóanyagként felhasználjuk bármelyik, a 26. példában megjelölt gangliozidszármazékot.

4. összeállítás:

a) egy 3 ml-es, liofílizált hatóanyag befogadására szolgáló ampulla a következő anyagokat tartalmazza:

- hatóanyag 50 mg

- mannit 20 mg

b) egy 3 ml-es oldószeres ampulla a következő anyagokat tartalmazza:

- nátrium-klorid 24 mg

- desztillált vízzel készített citrátpuffer, a 3 ml-hez szükséges mennyiségben.

Hatóanyagként fel lehet használni a 26. példában ismertetett gangliozidszármazékokat.

5. összeállítás:

^a) ^egy 5 ml-es, liofilizált hatóanyag befogadására alkalmas flakon a következő anyagokat tartalmazza:

- hatóanyag 150 mg

- glicin 50 mg

b) egy 4 ml-es oldószeres ampulla a következő anyagokat tartalmazza:

- nátrium-klorid 32 mg

- desztillált vízzel készült citrátpuffer a 4 ml-hez szükséges mennyiségben.

Aktív anyagként fel lehet használni bármelyiket a 23. és a 24. példában ismertetett gangliozidszármazékok közül.

HU 205 129 Β

6. összeállítás:

a) egy 5 ml-es, liofilizált hatóanyag befogadására szolgáló flakon a következő anyagokat tartalmazza:

- hatóanyag 100 mg

- mannit 40 mg

b) egy 4 ml-es oldószeres ampulla a következő anyagokat tartalmazza:

	r»
	0
	43
ω	T3
Ό	0
ω	ra
0)
ω	+3
A	-d
'0	ra
	n
4=	ra
φ	a
r-1
Ί4	a
	0
	,O
	43
	0
	r-1
	- '14

- nátrium-klorid 32 rag

- desztillált vízzel készült citrátpuffer a 4 ml-hez szükséges mennyiségben.

Hatóanyagként bármelyiket fel lehet használni a 23., a 24. és a 26. példákban felsorolt gangliozidszármazékok közül.

A glutamát hatásának való kitétel előtti, gangliozidokkal végzett előinkubálás időtartama percekben kifejezve

Az előinkubálás időtartama befolyásolja a ganglio- Glutamát:

zidoknak a glutamát által keltett neurotoxicitás elleni GTib:

védőhatását. LIGA 20:

2, ábra μΜ 60μΜ 7 μΜ

A gangliozidokkal való kétórás előinkubálás és 50 μΜ glutamát hatásának való 15 perces kitétel között eltelt órák száma

A gangliozidokkal végzett előkezelés és a glutamát hatásának való kitétel közötti időintervallum befolyása a sejtek túlélésére.

HU 205 129 B

3. ábra

μΜ, Glut, 15 perc

A glutamáttal és a gangliozidokkal végrehajtott együttes, 15 perces kezelés hatása a sejtek túlélésére.

4. ábra

w	X rd αί tq ω
Ό) 43	•Η
•Ό	Ρ
Λί	. «Ρ
I	φ γ4
ő	Φ Μ
pq
o	r-i
ή1	γ4
Ο
w	Κ
Λ	•Ρ
	d ο 44

Az 50 μΜ glutamáttal, valamint 100 μΜ GM_r, GTi-gangliozidokkal vagy 7 μΜ LIGA 20-szal végrehajtott együttes kezelés hatása a ³H-PDBu- kötésre.

HU 205 129 Β

5. ábra

³H-PDBu-kötés Sejttúlélés

A glutamáttal és gangliozidokkal végrehajtott, 35 perces együttes kezelés, valamint a gangliozidok további 35 perces hatásának való kitétel befolyása a ³H-PDBu-kötésre és a sejttúlélésre.

6. ábra

IOO

-© ω

w ©

Pi 'CU

P ©

r-l ©

•p •rs ©

ctí © ,Q P © I”1

+ +
-D KONTROLL-Mg 0 Glut Glut + LIGA 20	T
		B	1

A glutamát beadását követő 20 perces kezelés 7 μΜ LIGA 20-szal megakadályozza a glutamát által előidézett neurotoxicitást.

HU 205 129 Β

7. ábra

N2 által indukált anoxia (szélsőségesen nagy oxigén- A sejteket mostuk szérummal és Mg²⁺-ionok távolléhiány) tében 5 óra hosszat oxigénmentesen tartottuk őket a

Előkezelés: LIGA 20 és 21,10 perc tápközegbe való visszahelyezés előtt. A sejtek életkéGMi: 60 perc pességét 24 órával később mértük MTT-vel.

8. ábra

GANGLIOZIDOK

Enzimek (glikoszfingolipidek, ceramid-dezaciláz) 3

Lizoganglxozidok A

Tetraalkilammőniuma) foszfatidil-kolin hidrofób kölcsönhatása révén a szfingozin-nitrogén megvédése b) acetilezés a neuraminsav nitrogénjén N-dezacetil-lizogangliozidok

Pl w Ό N ·

Ü — ΓΖ3 Γ O 8

-hidroxid,

KOHstb.

a) a védőcsoportokkal ellátott szfingozin-nitrogénatomon végzett acilezés

b) a neuraminsav nitrogénjén végrehajtott_ acetilezés

c) a szfingozin-nitrogén védőcsoportjának eltávolítása acetilezés

N-dezacetil-N-acil-lizogangliozidok-> N-acil-lizogangliozidok

Claims (50)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Eljárás a lizo-GMi-gangliozid és gangliozidkeverékek új, a ceramidrész nítrogénatomján acilcsoportot tartalmazó származékainak - amelyekben az acilcsoport poláris szubsztituensként a

   - klór-, bróm-vagy fluoratom,

   - hidroxilcsoport,

   HU 205 129 Β

   - 1-7 szénatomos alkoxicsoport,

   - karboxilcsoport,

   - cíanocsoport,

   - adott esetben 1-4 szénatomos alkilcsoporttal éterezett merkaptocsoport,

   - adott esetben 1-7 szénatomos alkilcsoporttal monovagy diszubsztituált aminocsoport, —SO3H szulfocsoport szubsztituensek közül eggyel vagy többel helyettesített 2-20 szénatomos alkil-karbonil-csoport, vagy karboxilcsoporttal helyettesített 3-7 szénatomos alkenilkarbonil-csoport lehet - valamint a szialinsavrész karboxilcsoportján képezett 1-7 szénatomos alkil-észtereik, 1-7 szénatomos alkil-amidjaik; a szialinsav aminocsoportján acetilezett vagy a gangliozid hidroxilcsoportjain 2-7 szénatomos alkanoilcsoporttal peracilezett származékaik, továbbá belső észtereik és sóik előállítására, azzal jellemezve, hogy lizo-GMj-gangliozidot vagy N-dezacetil-lizo-GMi-gangliozidot vagy pedig lizo-GMi-gangliozid mellett más lizogangliozidokat is tartalmazó lizogangliozidelegyet - adott esetben az acilezőszerben lévő funkciós csoportok átmeneti megvédése után - a ceramidrész nitrogénatomján a tárgyi körben felsorolt poláris csoportok közül eggyel vagy többel helyettesített 2-20 szénatomos alkánsavval vagy karboxilcsoporttal helyettesített 3-7 szénatomos alkénsavval vagy ezek reakcióképes származékával acilezünk, kívánt esetben a kapott termék karboxilcsoportjait 1-7 szénatomos alkilcsoporttal képezett észterré vagy 1-7 szénatomos alkilcsoportot tartalmazó alkil-amiddá alakítjuk, és/vagy kívánt esetben a gangliozid hidroxilcsoportjait 2-7 szénatomos alkanoilcsoporttal peracilezzük, és/vagy adott esetben a szialinsavrészben jelen levő szabad aminocsoportot acetilezzük, az adott esetben jelen levő védőcsoportokat eltávolítjuk, és/vagy kívánt esetben az említett csoportok bevonásával belső észtert képezünk, és/vagy kívánt esetben a kapott termékből sót képezünk.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az N-acilezést a megfelelő karbonsav anhidridjével vagy halogenidjével végezzük.
3. 3. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az acilezést savaziddal hajtjuk végre.
4. 4. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az acilezést acil-imidazollal hajtjuk végre.
5. 5. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az acilezést vegyes anhidriddel és trifluor-ecetsavval hajtjuk végre.
6. 6. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az acilezést karbonsav-kloriddal hajtjuk végre.
7. 7. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az acilezést karbodiimid és - adott esetben - 1-hidroxi-benzotriazol - jelenlétében végezzük karbonsavval.
8. 8. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az acilezést magas hőmérsékleten végezzük savval.
9. 9. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az acilezést karbonsav metil-észterével végezzük, magas hőmérsékleten.
10. 10. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az acilezést karbonsav fenol-észterével végezzük, magas hőmérsékleten.
11. 11. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az acilezést olyan észterrel végezzük, amelyet az 1. igénypontban definiált sókból állítjuk elő l-metil-2klór-piridinium-jodiddal vagy annak analógjaival.
12. 12. Az 1-11, igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az acilezési művelet előtt átmenetileg megvédjük a hidroxilcsoportokat, primer aminocsoportokat, szekunder aminocsoportokat és/vagy szabad karboxilcsoportokat.
13. 13. Az 1-12. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy N-dezacetil-lizogangliozidokból indulunk ki, az acilezést enyhe körülmények között hajtuk végre és a változatlan neuraminsavas rész aminocsoportját acetilezzük.
14. 14. A 13. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az acetilezést ecetsavanhidriddel végezzük.
15. 15. Az 1-14. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az előállított vegyületet észterré, amiddá vagy belső észterré alakítjuk.
16. 16. Az 1-14. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az előállított vegyületet a hidroxilcsoportokon peracilezett származékká alakítjuk.
17. 17. Az 1, igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az acilezést legfeljebb 12 szénatomot tartalmazó, egyenes láncú, helyettesített karbonsavval végezzük.
18. 18. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az acilezést legfeljebb 12 szénatomot tartalmazó, elágazó láncú, az oldalláncban legfeljebb 4 szénatomos, helyettesített karbonsavval végezzük.
19. 19. Az 1., a 17. vagy a 18. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az acilezést 1-3 poláris csoporttal helyettesített karbonsavval végezzük.
20. 20. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az acilezést mono-, di- vagy triklór-karbonsavval, illetve mono, di- vagy trifluor-karbonsavval végezzük.
21. 21. A 25. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az acilezést diklór-acetsavval, triklór-ecetsavval, difluor-ecetsavval, trifluor-ecetsavval, dibróm-ecetsavval vagy tribróm-ecetsavval végezzük.
22. 22. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az acilezést monohidroxi-propionsavval, monohidroxi-vajsavval, monohidroxi-valeriánsavval, illetve ezeknek a savaknak rövidláncú alifás alkoholokkal képzett étereivel vagy rövidláncú alifás karbonsavakkal képzett észtereivel végezzük.
23. 23. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az acilezést a következő monoaminosavak valamelyikével végezzük: amino-ecetsav, 2-amino-propionsav, 2-amino-vajsav, 3-amino-vajsav, 2-amino-váleriánsav, 4-amino-vajsav, 4-amino-valeriánsav.
24. 24. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az acilezést merkapto-ecetsavval, 2-merkapto-propionsavval vagy 2-merkapto-valeriánsavval végezzük.
25. 25. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az acilezést szulfo-ecetsavval, 2-szulfo-propionsavval, 2-szulfo-vajsavval vagy 2-szulfo-valeriánsav27

    HU 205 129 B val, illetve a felsorolt savaknak rövidláncú alifás alkoholokkal képzett észtereivel végezzük.
26. 26. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az acilezést ciano-ecetsavval, 2-ciano-propionsavval vagy 2-ciano-Yaleriánsavval végezzük.
27. 27. Az 1. igénypont szerinti eljárás az 1., valamint a 17-26. igénypontok bármelyike szerint előállított Nacil-lizogangliozidok belső észtereinek előállítására, azzal jellemezve, hogy a szialinsav karboxilcsoportjait szacharidos hidroxilcsoportokkal laktonizáljuk.
28. 28. Az 1. igénypont szerinti eljárás az 1., valamint a 17-26. igénypontok bármelyike szerint előállított Nacil-lizogangliozidok belső észtereinek előállítására, azzal jellemezve, hogy a szialinsav karboxilcsoportjait a szialinsav hidroxilcsoportjaival laktonizáljuk.
29. 29. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy alapgangliozidként GMi-, GM₃-, GD_U-, GDu,vagy GTib-gangliozidot tartalmazó lizogangliozidot acilezünk.
30. 30. Az 1. igénypont szerinti eljárás N-diklór-acetil-lizo-GMi előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat reagáltatjuk.
31. 31. Az 1. igénypont szerinti eljárás N-klór-acetil-lizoGMi előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat reagáltatjuk.
32. 32. Az 1. igénypont szerinti eljárás N-(3-klór-pivaloil)-lizo-GMi előállítására, azzal jellemezve, hogy amegfelelő kiindulási anyagokat reagáltatjuk.
33. 33. Az 1. igénypont szerinti eljárás N-(hidroxí-acetil)-lizo-GMi előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelőkiindulási anyagokat reagáltatjuk.
34. 34. Az 1. igénypont szerinti eljárás N-(trifluor-acetiI)-lizo-GMi előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelőkiindulást anyagokat reagáltatjuk.
35. 35. Az 1. igénypont szerinti eljárás N-(tribróm-acetil)-lizo-GMi előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelőkiindulási anyagokat reagáltatjuk.
36. 36. Az 1. igénypont szerinti eljárás N-(merkapto-acetil)-lizo-GMi előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelőkiindulási anyagokat reagáltatjuk.
37. 37. Az 1. igénypont szerinti eljárás N-maleil-lizoGMi előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat reagáltatjuk.
38. 38. Az 1. igénypont szerinti eljárás N-(12-hidroxisztearoil)-lizo-GMi előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelőkiindulási anyagokat reagáltatjuk.
39. 39. Az 1. igénypont szerinti eljárás N-(2-hidroxi-butiroil)-lizo-GM₁ előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat reagáltatjuk.
40. 40. Az 1. igénypont szerinti eljárás N-(fluor-acetil)lizo-GMi előállí tására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat reagáltatjuk.
41. 41. Az 1. igénypont szerinti eljárás N-(difluor-acetil)lizo-GMi előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat reagáltatjuk.
42. 42. Az 1. igénypont szerinti eljárás N-(3-amino-propionil)-lizo-GMi előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat reagáltatjuk.
43. 43. Az 1. igénypont szerinti eljárás N-(ciano-acetil)lizo-GMi előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat reagáltatjuk.
44. 44. Az 1. igénypont szerinti eljárás N-(3-dietil-amino-propionil)-lizo-GMi előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat reagáltatjuk.
45. 45. Az 1, igénypont szerinti eljárás N-(amino-acetil)lizo-GMi előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat reagáltatjuk.
46. 46. Az 1-45. igénypontok bármelyike szerinti eljárás legalább egy karboxilcsoportot tartalmazó N-acil-lizogangliozid-származékok gyógyászati szempontból elfogadható fémsóinak vagy N-acil-lizogangliozid-származék-elegyek gyógyászati szempontból elfogadható fémsóinak előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő N-acil-lizogangliozid-származékokat vagy azok elegyét a megfelelő fémvegyületekkel reagáltatjuk.
47. 47. A 46. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a megfelelő N-acil-lizogangliozid-származékokat vagy azok elegyeit nátriumvegyülettel, káliumvegyülettel, ammőniumvegyülettel, kalciumvegyülettel, magnéziumvegyülettel vagy alumíniumvegyülettel reagáltatjuk.
48. 48. Az 1-45. igénypontok bármelyike szerinti eljárás legalább egy szabad karboxilcsoportot tartalmazó Nacil-lizogangliozid-szánnazékok vagy azokból álló elegyek gyógyászati szempontból elfogadható szerves bázisokkal alkotott sóinak előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő N-acil-lizogangliozid-származékokat vagy azok elegyeit a megfelelő szerves bázisokkal reagáltatjuk.
49. 49. Az 1-45. igénypontok bármelyike szerinti eljárás legalább egy bázikus funkciós csoportot tartalmazó Nacil-lizogangliozid-száimazékok vagy azokból álló elegyek gyógyászati szempontból elfogadható savakkal alkotott savaddíciós sóinak előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő N-acil-lizogangliozidokat vagy azok elegyeit a megfelelő savakkal reagáltatjuk.
50. 50. Eljárás gyógyászati készítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely, az 1. igénypont szerint előállított N-acil-lizogangliozid-származékot, amelyben az N-acilcsoport és annak poláris szubsztituensei megegyeznek az 1. igénypontban megadottal, vagy egy ilyen N-acil-lizogangliozid gyógyászati szempontból elfogadható és az 1. igénypontban adott meghatározásnak megfelelő észterét, amidját, acil- vagy peracilszármazékát gyógyászati szempontból elfogadható vivőanyaggal, hígítószerrel és/vagy egyéb gyógyszerészeti segédanyaggal összekeverve gyógyászati készítménnyé alakítjuk.