FI95577B - Menetelmä uusien, terapeuttisesti käyttökelpoisten lysogangliosidijohdannaisten valmistamiseksi - Google Patents

Description

95577

Menetelmä uusien, terapeuttisesti käyttökelpoisten lysogang-liosidijohdannaisten valmistamiseksi Tämä keksintö liittyy uusiin, terapeuttisesti käyttökelpoisiin lysogangliosidijohdannaisiin, etenkin sellaisiin uusiin N-asyylilysogangliosideihin, joissa asyyliryhmä on johdettu ali£aattisesta haposta, joka on substituoitu yhdellä tai useammalla polaarisella ryhmällä. Tarkemmin sanottuna keksinnön kohteena on patenttivaatimuksen 1 johdannon mukainen menetelmä tällaisten uusien lysogangliosidijohdannaisten valmistamiseksi.

Lysogangliosidit ovat johdannaisia, jotka saadaan gangliosi-deistä deasyloimalla keramidiryhmä ja jotka säilyttävät ainoastaan sfingosiinitähteen. Gangliosidit ovat yleensä erilaisten yhtenäisten kemiallisten yhdisteiden seoksia, jotka vastaavat seuraavaa kaavaa:

iiunimiiOH ( niiniin OH

happo | = lunniini OH keramidi HOOC""""" O Ö O H OH Ö (I) • w · " -

OH OLIGOSAKKARIDI OH

Nämä molekyylit sisältävät oligosakkaridiosa, joka on yleensä kemiallisesti hyvin määritelty jokaiselle gangliosidille, siaaliosan (muodostuu yhdestä tai useammasta siaalihaposta) ja keramidiosan, jolloin nämä kolme viimeistä osaa muodostuvat yleensä eri siaalihappojen ja eri keramiditähteiden seoksesta.

Siaalihapot ovat kaavan H 95577 2 i Λ— ° ΗιΝ /H—C-?0H N. ,

/ *J \ JCOOH

j / H—C-OH

JSv ’chjOH

\h («> 41 3

OH

mukaisia neuramiinihapon asyylijohdannaisia, joissa asyyli-ryhmä on asyloitu etikka- tai glykolihapolla ja hydroksyyli-ryhmSt voi olla myös esteröity tällaisilla hapoilla. Kerami-diryhmä on N-asyylisfingosiini, joka vastaa jompaakumpaa seuraavista kaavoista: CHj—o— ch2—o— CH—NH—acy! CH—NH—acyl

I I

CH—OH CH—OH

I I

CH CH 2 % \ CH CH:

1 I

(CHj)n—CHj (CH2)n—CHj jossa n on 6 - 18 ja asyyliryhmä on johdettu tyydyttyneestä tai tyydyttymättömästä, 16 - 22 hiiliatomia sisältävästä rasvahaposta tai vastaavasta hydroksihaposta. Kuten yllä on mainittu, gangliosideissä siali- ja keramiditähteet ovat . . yllä olevien kaavojen mukaisten ryhmien seoksia, ja tämä koskee myös kirjallisuudessa esitettyjä puhdistettuja gang-liosidejä. Gangliosideissä läsnä olevien sialihappojen määrä on tavallisesti 1-5. Sialitähteet on sidottu oligosakkaridiin ketosidisidoksella, joka on muodostettu 2-aseman hydroksyylillä oligosakkaridin hydroksyyliryhmän kanssa. Kun useita sialihappoja on sidottu yhteen, niiden välinen yhtymä saadaan aikaan ketosidisidoksilla, jotka on muodostettu kahden sialihappomolekyylin 2- ja 8-aseman hydroksyyliryh-mien väliin. Gangliosidien ja edellä esitettyjen puhdistettujen gangliosidien sialihapot ovat erilaistan kemiallisesti yhtenäisten happojen, esimerkiksi N-asetyylineuramiiniha- 3 95577 pon ja N-glykolyylineuramiinihapon, jolloin ensin mainittu on vallitseva, ja mahdollisesti yhden tai useamman niiden O-asyy-lijohdannaisen, esimerkiksi 8-0-asyylijohdannaisen seoksia.

Oligosakkaridi on muodostettu korkeintaan 5 monosakkaridista ja niiden asyyliaminoryhmän sisältävistä johdannaisista, etenkin heksooseista ja niiden yllä mainitun tyyppisistä johdannaisista. Oligosakkaridissa on kuitenkin aina läsnä vähintään yksi glukoosi- tai galaktoosimolekyyli, jolloin yleisin tähde yllä mainittujen sokerien asyyliaminojohdannaisena on N-asetyyliglukosamiini ja N-asetyyligalaktosamiini. Yllä määritellyt lysogangliosidit voidaan saada deasyloimalla entsymaattisesti keramidin typpi. Jos deasylointi suoritetaan kemiallisesti, esimerkiksi alkalisen hydrolyysin avulla, tällöin deasyloidaan muut esteröidyt asyyliaminotai hydroksi-ryhmät, kuten etenkin asyyli, joka on läsnä neuramiini- tai asyylihappojen typessä, joka on mahdollisesti läsnä (tavallisesti vähemmässä määrin) tällaisten happojen hydroksiryhmissä.

Kuten yllä on manittu, asyyliryhmät, jotka ovat läsnä gang-liosideissä neuramiinihapon typessä, on johdettu etikkahaposta ja mahdollisesti, paljon vähemmässä määrin, glykolihaposta. Selektiivinen uudelleenasylointi, esimerkiksi sfingosiini-aminoryhmän tilapäisen suojaamisen jälkeen tuottaa sen tyyppisiä lysogangliosidien tuotteita, jotka on saatu deasyloimalla : entsymaattisesti ja jotka poikkeavat niistä ainoastaan siinä, että asetyyli esiintyy yksinomaan neuramiinitypessä ja mahdollisesti asylointiryhmät puuttuvat tämän hapon hydroksyyliryhmissä. Nämä deasyloidut johdannaiset toimivat myös substraattina uusien N-asyyli-lysogangliosidien valmistuksessa ja käsite "lysogangliosidit" tarkoittaa tässä hakemuksessa sekä entsymaattisen deasyloinnin tuotteita että tuotteita, jotka on saatu yllä manitulla tavalla kemiallisen deasyloinnin avulla.

Tämän keksinnön avulla saadaan aikaan yhdisteitä, jotka ovat puolisynteettisiä gangliosidianalogeja. Ne poikkeavat ganglio-sideistä sikäli, että sfingosiiniosassa on yksinkertainen, 4 95577 hyvin määritelty N-asyyliryhmä, joka on muodostettu hapoista, jotka poikkeavat paljon luonnollisten tuotteiden hapoista.

Yhdisteet ovat uusia, vaikkakin luonnollisissa gangliosideissä on löydetty tuotteita, jotka hydrolysoituna saavat aikaan sellaisten korkeampien alifaattisten happojen muodostumisen, jotka on substituoitu hydroksiryhmillä (ja siten polaarisilla ryhmillä, kuten esillä olevilla ryhmillä). Kuitenkaan vastaavia tuotteita ei ole koskaan eristetty eikä niitä ole koskaan esitetty. Keksintö liittyy myös uusien N-asyyli-lysoganglio-sidien sialikarboksiryhmien funktionaalisiin johdannaisiin, s.o. estereihin ja amideihin ja siis myös sisäisiin esterei-hin, joissa on laktonisidoksia sialikarboksiryhmissä ja oligosakkaridin hydroksyyliryhmissä, gangliosidien analogeihin ja tunnettuihin johdannaisiin samoin kuin gangliosidiin, sekä itse N-asyyli-lysogangliosidien että niiden yllä mainittujen funktionaalisten johdannaisten hydroksyyliryhmien perasyloi-tuihin johdannaisiin.

Tämän keksinnön kohteena on patenttivaatimuksen 1 tunnusmerk-kiosan mukainen menetelmä sellaisten N-asyyli-lysogangliosidi-en valmistamiseksi, joissa asyyliryhmä on johdettu 2-24 hiiliatomia sisältävästä alifaattisesta haposta, joka on substituoitu yhdellä tai useammalla polaarisella ryhmällä, joka on valittu ryhmästä, johon kuuluvat: - kloori, bromi tai fluori, : - hydroksiryhmät, jotka on esteröity orgaanisella tai epäor gaanisella hapolla, ja eetteröidyt hydroksiryhmät, - keto-, ketaali- ja asetaaliryhmät, jotka on johdettu alemmista alifaattisista tai aralifaattisista alkoholeista, - ketoksiimi-, aldoksiimi- tai hydratsoniryhmät, jotka mahdollisesti on substituoitu alempialkyyli- tai aralkyyliryhmillä, - vapaat merkaptoryhmät tai merkaptoryhmät, jotka on esteröity alemmalla alifaattisella tai aralifaattisella hapolla tai eetteröity alemmilla alifaattisilla tai aralifaattisilla alkoholeilla, - vapaat tai esteröidyt karboksiryhmät, - vapaat sulfonihapporyhmät tai sulfoniryhmät, jotka on es- * m ; iin i i i «k i 5 95577 teröity alemmilla alifaattisilla tai aralifaattisilla alkoholeilla, - sulfamidi- tai alempialkyyli- tai aralkyyliryhmillä tai alkyleeniryhmillä substituoidut sulfamidiryhmät, - sulfoksidi- tai sulfoniryhmät, jotka on johdettu alempialkyyli- tai aralkyyliryhmistä, - nitriiliryhmät, - vapaat tai substituoidut aminoryhmät, ja tällaisten amino-ryhmien kvaternaariset ammoniumjohdannaiset, edellyttäen, että happo on muu kuin aminolauriinihappo. Keksinnön avulla saadaan myös aikaan N-asyyli-lysogangliosidi-en sialikarboksiryhmien esterit ja/tai amidit, N-asyyli-lysogangliosidien sisäiset esterit, happamia ryhmiä sisältävien N-asyyli-lysogangliosidien metallisuolat tai orgaaniset emässuolat, N-asyyli-lysogangliosidien happoadditiosuolat ja vastaavat N-asyyli-lysogangliosidien seosten johdannaiset.

Seuraavassa kuvataan myös farmaseuttisia valmisteita, jotka sisältävät yhtä tai useampaa yllä mainittua lysogangliosidien johdannaista tai niiden seosta tai vastaavaa suolaa, samoin kuin niiden terapeuttinen käyttöä.

Lysogangliosidien asylointi on ennestään tunnettu. On valmistettu N-asyylijohdannaisia, jotka muistuttavat tämän keksinnön mukaisia yhdisteitä [ks. "Lysogangliosides: Synthesis and Use in Preparing Labeled Gangliosides", Gunther Schwarzmann ja Konrad Sandhoff kirjassa "Methods in Enzymology", Voi. .138, s. 319 - 341 (1987)]. Tunnettuja yhdisteitä on käytetty biokemiallisissa tutkimuksissa koskien gangliosidien vaikutusta solukelmussa käyttämällä sopivasti leimattuja asyyliryhmiä. Viitejulkaisussa esitetyt N-asyylilysogangliosidit on johdettu olennaisesti joko ei-alifaattisista hapoista tai alifaattisis-ta hapoista, jotka on substituoitu tämän keksinnön mukaisista ryhmistä poikkeavilla ryhmillä. Kuitenkin eräässä näiden lysogangliosidien (joissa on hyvin määritelty sfingosiiniketju päinvastoin kuin tämän keksinnön mukaisissa johdannaisissa) esitetyssä valmistusmenetelmässä käytetään sfingosiiniä, 6 95577 t jossa hydroksiryhmä on suojattu 3-asemassa bentsoyyliryhmällä ja 2-aseman aminotyppi on suojattu dikloorietikkahaposta johdetulla asyyliryhmällä. Tämä reagenssi johtaa kondensoi-malla gangliosidin GMi oligosakkaridi-sialiosasta johdetun tähteen kanssa välituotteeseen, joka koostuu N-diklooriase-tyyli-lysogangliosidistä GMi, joka on bentsoyloitu sfingo-siin.itähteen maintussa asemassa. Tämän keksinnön mukaista diklooriasetyyli-lyso-GMi:tä, joka on esitetty esimerkiksi esimerkissä 3, ei ole valmistettu tällä synteesillä, jolloin sekä yllä mainittu bentsoyyliryhmä että dikloorietikkahappo-ryhmä on eliminoitu samanaikaisesti seuraavassa vaiheessa.

Eräs johdannainen, joka on suojattu samanlaisilla bentsoyy-li- ja vastaavasti dikloorietikkaryhmillä, on myös esitetty Schwarzmannin et ai.:in julkaisussa lyso-GM3~gangliosidin valmistuksen suhteen, mutta tässäkään tapauksessa ei ole valmistettu lyso-GM3~diklooriasetyyliä.

Lysogangliosidit, jotka toimivat tämän keksinnön mukaisten uusien N-asyyli-johdannaisten valmistuksen perustana, saadaan deasyloimalla gangliosidit, jotka voidaan uuttaa luonnollisista tuotteista ja etenkin selkärankaisten keskus- tai ääreishermoston kudoksista, mutta myös lisämunuaisten ytimestä, erytrosyyteistä, pernasta tai muista elimistä. Ne voivat olla puhdistettuja gangliosidejä, kuten kirjallisuudessa esitettyjä gangliosideja, sellaisia, jotka voidaan jäljittää yhtenäiseen rakenteeseen niiden sakkaridiosan suhteen, tai ne voivat olla gangliosidiseoksia. Tärkeimmistä gangliosideistä, joita voidaan käyttää lähtöaineena keksinnön mukaisissa uusissa johdannaisissa, mainittakoon esimerkiksi sellaiset, joissa oligosakkaridi on muodostettu korkeintaan 4 heksoositähteellä ja jossa tämä sakkaridiosa on kemiallisesti yhtenäinen yksikkö. Heksooseiksi tulisi valita edullisesti N-asetyyliglukosamiini ja N-asetyyligalakto-samiini (gangliosidiryhmä A). Tähän ryhmään kuuluvat gangliosidit ovat esimerkiksi sellaisia, jotka on uutettu selkärankaisten aivoista, kuten sellaiset, joita on esitetty artikkelissa "Gangliosides of the Nervous System" kirjassa 7 95577 "Glycolipid Methodology", Lloyd A. Witting, julk., American Oil Chemists Society, Champaign, III. 187 - 214 (1976) (ks. etenkin taulukko 1). Nämä käsittävät gangliosidit Gm4, G^3, Gm2/ Gmi-GIcNAc, GD2/ GDla-GalNAc, Gt1c, Gq, Gn ja etenkin sellaiset, joissa oligosakkaridiosuus sisältää vähintään yhden glukoosi- tai galaktoositähteen ja joko N-asetyyliglu-kosamiinin tai N-asetyyligalaktosamiinin ja ennen kaikkea seuraavat (gangliosidiryhmä B): GH1

Gal (1-^3)GalNAC(l-* 4) Gal (1-» 4) Glc (1 -^1) Ceramide 3 t 2

NANA

Gd1a

Gal(1~^>3)GalNAC(1 -} 4) Gal (4) Glc (1 1) Ceramide 3 l ϊ ΐ 2 2

NANA NANA

• i * * 8 95577 GD1b

Gal (1->3)GalNAC(l->4) Gal (1-^4)Glc(l-^1) Ceramide 3

T

2

NANA

8

T

2

NANA

GT1b

Gal (1—>3)GalNAC(1-^ 4)Gal (1-^ 4)Glc(l ^ 1) Ceramide 3 3

1 T

2 2

NANA NANA

8

T

2

NANA

9 95577 joissa Glc merkitsee glukoosia, GalNAC merkitsee N-asetyyli-galaktosamiinia, Gal merkitsee galaktoosia ja NANA merkitsee N-asetyylineuramiinihappoa.

Yllä olevan kaavan mukaisten gangliosidien rakenteen selventämiseksi, joka on olennaisesti sama kuin tämän keksinnön mukaisissa johdannaisissa ja sakkaridiosassa, sialihapoissa ja keramidissa, seuraava on "puhtaan" gangliosidin GMi koko kaava, joka sisältää yhden ainoan sialihapon (esitetty N-asetyylineuramiini- tai N-glykolyylineuramiinihapolla): n r v/trr\ cx,-co-h/ CXX \coon h5 m/ "p/" \r-^.0_VoVV \N *1/ \l~·<— ceramide M\p*< M\ H/h m\ | m/m \Ken H/1 N h OH m Jm H I »*M Oh

Sama kaava pätee olennaisesti tämän keksinnön mukaisen gangliosidin GMi johdannaisen suhteen käyttämällä keramiditäh-dettä, joka on substituoitava vastaavalla "keinotekoisella" keramidilla, jossa N-asyyliryhmä on johdettu jostakin mai-tuista, polaarisilla ryhmillä substituoiduista alifaattisis-: ta hapoista. Samoin tähän keksintöön kuuluvat uusien N-asyy- li-lysogangliosidien seokset ja etenkin sellaiset, jotka on johdettu gangliosidiseoksista, joita on läsnä erilaisten eläinkudosten uutteissa, kuten "täydellisissä" uutteissa tai eri fraktioissa, esimerkiksi kirjallisuudessa esitetyissä. Tällaisia uutteita ja fraktioita on esitetty yllä esitetyis-·· sä artikkeleissa ja samoin mainitun julkaisun artikkelissa "Extraction and Analysis of Materials Containing Lipid Bound Sialic Acid", s. 159 - 186 (1976) ja saman kirjan artikkelissa "Gangliosides of the Nervous System", s. 187 - 214 sekä saksalaisessa patentissa n:o 25 49 680. Tällaisissa se- 10 95577 - oksissa gangliosidiseosten N-asyyli-osa on substituoitu jollakin mainituista asyyliryhmistä. Nämä johdannaiset voidaan saada tämän keksinnön menetelmän mukaisesti, kuten tässä on esitetty gangliosidiseosten deasylointia ja tämän jälkeen suoritettavaa uudelleenasylointia varten, valinnaisesti gangliosidien sialiosan muiden deasyloitujen ryhmien uudel-leenasyloinnin jälkeen. Lähtötuotteina käytettäviä tärkeimpiä gangliosidiseoksia ovat gangliosidiuutteet, jotka saadaan hermostosta, etenkin aivoista ja jotka sisältävät gangliosidejä GM]., GDla, GD1b ja GT1b.

On jo tunnettua, että gangliosideillä on tärkeä merkitys hermostossa ja hiljattain on osoitettu, että gangliosidit ovat käyttökelpoisia perifeeriseen hermostoon vaikuttavien sairauksien terapiassa ja keskushermostoon vaikuttavien sairauksien terapiassa [Acta Psychiat. Scand., 55, 102, (1977);

Eur. Medicophys., 13, 1, (1977); Ric. Sei. Educ. Perm.

Suppl. 9, 115, (1978); Adv. Exp. Med. Biol. 71, 275, (1976); Electromyogr. Clin. Neurophysiol., 19, 353, (1979); Minerva Medica, 69, 3277, (1978); Minerva Stomat., 27, 177, (1978);

Med. del Lavoro, 68, 296 (1977); Brain Res. 197, 236, (1980)].

Gangliosidien terapeuttisena vaikutuksena näyttää olevan hermosolujen kasvuilmiöiden stimuloiminen ja hermoärsykkei-den johtamiseen osallistuvien membraanientsyymien, kuten : entsyymin (Na+,K+)ATPaasi aktivoiminen [Brain Res., 197, 236 (1980), J. of Neurochem. 37, 350 (1981)]. Gangliosidi-stimu-loitu hermokasvu parantaa sairaan hermokudoksen funktionaalista regeneroitumista.

Edelleen on suoritettu tutkimuksia yhdisteiden löytämiseksi, jotka voivat olla tehokkaampia kuin gangliosidit hermoston sairauksien terapiassa. Tällaiset tutkimukset ovat johtaneet esimerkiksi siihen havaintoon, että sisäiset gangliosidies-terit, joissa yksi tai useampi sakkaridiosan hydroksyyliryh-mä on esteröity yhdellä tai useammalla sialihappojen karbok-siryhmillä (intramolekulaarinen reaktio), jolloin muodostuu si iit-l· uit; l i t st 11 95577 sama määrä laktonirenkaita, ovat aktiivisempia kuin itse gangliosidit hermokasvun parantamisessa ja hermoärsykkeiden johtamiseen osallistuvien membraanientsyymien aktivoimisessa. Eräs esimerkki on entsyymi (Na+,K+)ATPaasi (ks. US-patentit 4,476,119, 4,593,091 ja 4,716,223).

Parantunutta hermokasvuaktiivisuutta ja hermoärsykkeen johtamista havaitaan myös gangliosidien "ulommilla" estereillä, s.o. sialihappojen karboksifunktioiden estereillä, jotka on muodostettu erilaisten alifaattisten, aralifaattisten, ali-syklisten tai heterosyklisten alkoholien kanssa. Myös gang-liosidiamideilla on samat ominaisuudet samoin kuin sekä amidien ja estereiden että yksinkertaisten gangliosidien per-asyloiduilla johdannaisilla. Kaikkia näitä johdannaisia, joita on esitetty US-patentissa 4,713,374, on pidettävä myös tämän keksinnön mukaisten uusien N-asyyli-johdannaisten perusaineina .

Keksinnön mukaisilla uusilla gangliosidijohdannaisilla on mielenkiintoisia farmakologisia ominaisuuksia ja etenkin niillä on inhiboiva vaikutus proteiinikinaasi-C:n aktivointiin, joka voi osoittautua ei-tovotuksi ja negatiiviseksi määrätyissä olosuhteissa, joissa esiintyy normaalin neuro-transmissiotoiminnan epätasapainoa. Aktivointi laukaistaan eksitatiivisten (kiihottavien) aminohappojen, kuten gluta-miinihapon ja/tai asparagiinihapon lisänyneellä konsentraa-; tiolla, jolloin näillä hapolla on tällaisissa epänormaaleis sa olosuhteissa suora toksinen vaikutus hermosoluihin. Eräs tämän keksinnön mukaisten tuotteiden suuri etu, joka erottaa ne muista proteiinikinaasi-C-inhibiittoreista, kuten itse gangliosideistä tai sfingosiinistä, on niiden kyky estää ja vastustaa yllä mainittua neurotoksista toimintaa. On koros-• ·· tettava, että tämän keksinnön mukaiset tuotteet, päinvastoin kuin kalsiumantagonistit ja glutamaattireseptoriantagonistit (etenkin NMDA), vaikuttavat ainoastaan epänormaalien olosuhteiden esiintyessä ja ne rajoittavat tästä syystä neurotok-sisuutta ja säilyttävät hermosolun plastisuuden, jolloin ne mahdollistavat vaurioituneiden fysiologisten toimintojen 12 95577 helpomman regeneroitumisen. Uusien N-asyyli-lysogangliosi-dien farmakologiset ominaisuudet voidaan havainnollistaa seuraavilla kokeilla, jotka on suoritettu N-diklooriasetyy-li-lyso-GMi:llä ja N-monoklooriasetyyli-lyso-GMi:llä.

N-asyyll-lysoqanqllosldlen suojaava vaikutus eksltatlivisten aminohappojen neurotoksisten vaikutusta vastaan

Rotan kortikaalisten ja serebraalisten neuronien primaarisissa viljelyissä eksitatiiviset aminohapot (EAA) säätävät proteiinikinaasi-C- (PKC) aktivointia ja translokaatiota ja aiheuttavat solukuoleman. Etenkin glutamaatin lisäys näihin soluviljelyihin aiheuttaa vaurion, jonka saa todennäköisesti aikaan Ca+2:n vaikutus, itse glutamaatin aiheuttamana, mitä seuraa PKC:n translokaatio ja sitten aktivointi. Vaccarino et ai. [Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84, 8707 - 8711 (1987)], Hannun Y. A. et ai. [J. Biol. Chem. 261, 12604 - 12609 (1986) ], Merrill A. H. et ai. [J. Biol. Chem. 261, 12610 -12615 (1986)], Wilson E. et ai. [J. Biol. Chem. 261, 12616 -12623 (1986)] ja Hannun Y. A. et ai. [Science 235, 670 - 673 (1987) ] ovat esittäneet, että aivojen jyvässolujen altistaminen gangliosidien (trisialosyyli-N-tetraglykosyylikerami-di-Giib tai monosialosyyli-N-tetraglykosyyli-keramidi-GMi) vaikutukselle inhiboi glutamaatin aikaansaaman PKC:n trans-lokaation ja aktivoinnin. Nämä gangliosidit estävät glutamaatin vuorovaikutuksen sen korkean affiniteetin omaavan : tunnistuspaikan ja [3H]PDBu-sitoutumisen kanssa. Edelleen tällaiset gangliosidit tarjoavat suojan glutamaatin aikaansaamaa soluvauriota vastaan. Alla selitetään tutkimuksia, jotka on suoritettu käyttämällä uusia gangliosidijohdannai-sia, N-dikooriasetyyli-lyso-GMi:tä ja N-monoklooriasetyyli-lyso-GMi:tä verrattuna gangliosidifraktioihin (GMi ja GTib). Etenkin tutkitaan tämän keksinnön mukaisten johdannaisten vaikutuksia glutamaatin aikaansaamaan neurotoksisuuteen in vitro ja in vivo ja PKC:n translokaatioon aivojen jyvässolujen primaarisissa viljelyissä.

95577

Aineet ja menetelmät In vitro-tutkimukset l.a. 8 päivän ikäisten Sprague Dawley-rottien aivojen jyväs-solujen primaariset viljelyt (Zivic Miller) [Gallo V. et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 79, 7919 - 7923 (1982)]. Nämä viljelyt sisältävät > 90 % jyvässoluja, > 5 % GABAergisiä neuroneja (hermosoluja) ja > 5 % gliasoluja (hermotukikudos-soluja) [Vaccarino F. M. et ai., J. Neurosci. 7, 65 - 76 (1987)]. Soluja käytetään kokeissa viljelyn 8. ja 9. päivänä.

l.b. Viljelyyn lisättävät aineet (menetelmä ja parametrit)

Viljelyn 8. ja 9. päivänä lisätään seuraavia aineita kon-sentraatioiden ollessa 7 ja 100 μΜ: N-diklooriasetyyli-lyso-GMi:tä, N-monoklooriasetyyli-lyso-GMi:tä, GTi^rtä, GMirtä. Tarkemmin määriteltynä jyvässolujen monomolekulaarisia kerroksia esi-inkuboidaan näiden yhdisteiden kanssa Locke'n liuoksessa (1 ml) 120 minuutin ajan (tai aikajaksojen ajan, jotka vaihtelevat 0 minuutista 120 minuuttiin) 37*C:ssa. Gangliosidit ja johdannaiset on ennalta liuotettu ja sen jälkeen tarvittaessa laimennettu metanoli:H20-seokseen (95:5). Liuoksen määräeriä kuivatetaan ^-virrassa ja otetaan sopivaan määrään Locke'n liuosta, kunnes saavutetaan lopullinen konsentraatio.

l.c. Glutamaatin aikaansaama neurotoksisuus

Glutamaatin neurotoksista vaikutusta analysoitiin erilaisissa koeolosuhteissa: - Aineiden inkubaatioajan (0 - 120eC) vaikutus ennen niiden glutamaatti-käsittelyä: intakteja (vahingoittumattomia) soluja esi-inkuboidaan N-diklooriasetyylilyso-GMi:n, N-mono-klooriasetyyli-lyso-GMi:n (7 μΜ) ja GTib:n (60 μΜ) kanssa 37eC:ssa. Ylimääräinen yhdiste poistetaan pesemällä, sitten soluja inkuboidaan glutamaatin 50 μΜ:η kanssa ilman Mg+2:ta “ 95577 15 minuutin ajan huoneen lämpötilassa, minkä jälkeen solut pestään vielä 3 kertaa ja sitten ne pannaan takaisin alustalle. Solujen eloonjäänti analysoidaan 24 tunnin kuluttua histokemiallisilla menetelmillä tai jodidifluoreseiini-diasetaatti-värjäyksellä, joka tuottaa vihreän fluoresenssin elävissä soluissa ja punaisen kuolleissa soluissa.

- Aikajakson vaikutus, joka on gangliosidijohdannaisilla tai itse gangliosideillä suoritetun esikäsittelyn ja glutamaat-tikäsittelyn välillä: intakteja jyväissoluja esi-inkuboidaan 2 tunnin ajan 37"C:ssa N-diklooriasetyyli-lyso-GMx:n (7 μΜ), GTib*n ja GMi:n (100 μΜ) kanssa. Ylimääräinen yhdiste poistetaan pesemällä ja soluja käsitellään 50 μΜ:1^ glutamaat-tia (ilman Mg+2:ta) 15 minuutin ajan eri aikajaksojen (1, 2, 4, 6, 12, 18, 24 ja 48 tuntia) jälkeen.

- Samanaikaisen glutamaatti- ja gangliosidikäsittelyn vaikutus: intakteja jyvässoluja käsitellään (15 ja 35 minuutin ajan) 50 μΜ:11β glutamaattia ja gangliosideillä N-dikloori-asetyyli-lyso-GMx (7 μΜ), GTib ja GMx (100 μΜ). Ensimmäisessä koetyypissä (yhteiskäsittely 15 minuutin ajan) ylimääräinen yhdiste poistetaan pesemällä ja sitten analysoidaan solujen eloonjäänti esitetyllä menetelmällä. Toisessa koetyypissä (yhteiskäsittely 30 minuutin ajan) yhteiskäsittelyä pidennetään käsittelemällä niitä gangliosideillä vielä 35 minuutin ajan.

> * - N-diklooriasetyyli-lyso-GMx:n vaikutus jaksottaisen gluta-maattikäsittelyn jälkeen: jyvässolut käsitellään jaksottain glutamaatilla ja käsitellään N-diklooriasetyylilyso-GMi:llä (7 μΜ) 20 minuutin ajan (ilman Mg+2:ta). Ylimääräinen tuote poistetaan pesemällä.

« * - N-diklooriasetyyli-lyso-GMi:n suojaava vaikutus soluanok- sian jälkeen (^-kammiossa) endogeenistä glutamaatin aikaansaamaa neurotoksisuutta vastaan: solujen elinkykyisyys analysoidaan kolorimetrialla 24 tunnin kuluttua (MTT värjää ainoastaan elävät solut).

1= 95577 1. d. PKC:n glutamaatilla aikaansaatu translokaatio: [3H]-forboliesteri-sitoutumisen analyysi intakteissa soluissa.

[3H]-forboliesterin sitoutumisen vaikutukset analysoidaan kahdessa erilaisessa koeolosuhteiden tyypissä: - yhteiskäsittely 15 minuutin ajan 50 yM:lla glutamaattia, gangliosideillä ja johdannaisilla N-diklooriasetyyli-lyso-GMi (7 μΜ), GTXb ja GM^ (100 μΜ).

- yhteiskäsittely 30 minuutin ajan 50 pM:lla glutamaattia ja N-diklooriasetyyli-lyso-GMi:llä (7 μΜ), GTib:llä ja GMiillä (100 μΜ), minkä jälkeen käsitellään vielä (35 min.) gangliosideillä. Yhteiskäsittelyn jälkeen solut pestään ja [*H]-PDBu-sitoutuminen analysoidaan Mg+2:n läsnäollessa. Jyvässo-luja kasvatetaan levyillä, joiden läpimitta on 35 mm, ja sitten ne pestään ja niitä inkuboidaan Locke'n liuoksessa, joka sisältää 4-B-[*H]-forboli-12,13-dibutyraattia, [*H]-P(Bto)2, 12,5 Ci/mmoolia (1 Ci = 37 GBq, New England Nuclear) 0,1 %:ssa rasvahappovapaata naudan seerumialbumii-nia (Sigma Chemical Co.). Koska alustavat kokeet osoittivat, että tasapaino saavutetaan 10 minuutissa, soluja inkuboidaan [*H]-P(Bto)2:lla 15 minuutin ajan 22*C:ssa. Sitoutuminen on vakio yli tunnin ajan. Inkubaation jälkeen solut pestään 3 kertaa kylmällä Locke’n liuoksella ja suspendoidaan NaOHtlla (0,1 M). Suspension määräeriä käytetään proteiinimäärityk-seen [Lowry O. H. et ai., J. Biol. Chem. 193, 256 - 275 f (1951)]. Ei-spesifinen sitoutuminen analysoidaan forboli-12- tetradekanoaatti-13-asetaatin (PTA, 2 μΜ) läsnäollessa.

2. a. Soluviljelyt

Hiiren varhaishermosoluja (neuroblasteja) (N2A) 180. vaiheessa sijoitetaan syvennyksiin konsentraation ollessa 10.000 solua/syvennys (COSTAR-24). Seuraavana päivänä kasvualusta korvataan 350 piillä seoksella DMEM + P/G + 10 % FCS.

16 95577 2.b. Viljelyyn lisätyt yhdisteet: lisäysmenetelmä ja havaitut parametrit

Kaikki yhdisteet liuotetaan kloroformi/metanoliin (2:1), kuivatetaan N2~virrassa ja suspendoidaan uudelleen seokseen DMEM + P/G + 10 % FCS. Neuriittien määrä analysoidaan 24 tunnin kuluttua.

In vivo-tutklmukset

Vastasynteisiin rottiin (7-päiväisiä), jotka painavat n. 13 g, injektoidaan 25 nmoolia NMDA:ta i.c.v. Näissä olosuhteissa eksitotoksiini saa aikaan sen, että injektoidun aivopuoliskon paino laskee 28 % ja kuolleisuusmääräksi tulee 53,6 %.

Yhdisteiden antaminen: injektlomenetelmä ja havaitut parametrit

Rotat käsitellään N-diklooriasetyyli-lyso-GMx:llä ja N-mono-klooriasetyyli-lyso-GMx:llä annoksen ollessa 200 pmoolia/-eläin s.c. tuntia ennen NMDA-injektiota ja välittömästi sen jälkeen. Yhdisteet liuotettiin PBS:ään. N-diklooriasetyyli-lyso-GMi- ja N-monoklooriasetyyli-lyso-GMi-johdannaisia testattiin vertaamalla magnesiumsulfaattiin MK-801 (NMDA-reseptorin ei-kilpailukykyinen agonisti) [G. McDonald et ai., Eur. J. Pharmacol. 140: 153 - 157 (1987)] ja kinureenihap-j poon [P. Andinö, Neuro-science Letters, 90: 208 - 212 (1988)], joka pystyy vähentämään aivovauriota. Kuolleisuus analysoitiin 5 päivän kuluttua NMDA-injektiosta.

Tulokset

Kokeet osoittivat, että in vitro aivojen jyvässoluissa - esikäsittely 2 tunnin ajan N-diklooriasetyyli-lyso-GMx:llä (LIGA 20) ja GTifc>:llä estää lähes kokonaan glutamaatin aiheuttaman neurotoksisuuden (kuvio 1). On huomattava, että N-diklooriasetyyli-lyso-GMx:n (7 μΜ) tarjoama suoja on jo ilmeinen ainoastaan 5 minuuttia kestävän esi-inkubaation jäi- 17 95577 keen, kun taas GTib:n (60 μΜ) kohdalla se on merkittävä, vaikkakin vähemmässä määrin, 60 minuuttia kestävän inkubaa-tion jälkeen. On myös mielenkiintoista havaita, että N-di-klooriasetyyli-lyso-GMi:n maksimaalinen vaikutus vaatii yli 8 kertaa pienemmän konsentraation kuin GTib:n vaikutus (7 μΜ vs. 60 μΜ).

- N-diklooriasetyyli-lyso-GMi:n suojavaikutus glutamaatin aiheuttamaan neurotoksisuuteen kestää vähintään 24 tunnin ajan kasvualustan poistamisen jälkeen, kun taas GTifc,:n vaikutus kestää 4 tunnin ajan (kuvio 2) ja GM].:n vaikutus ei kestä enempää kuin tunnin ajan (GM].<GT].b<N-diklooriasetyy-li-lyso-GMi).

- Yhteiskäsittely (15 min.) glutamaatilla ja N-diklooriase-tyyli-lyso-GMi:llä suojaa soluja glutamaatin neurotoksiselta vaikutukselta, kun taas käsittely GTib:llä ja GM^illä ei suojaa (kuvio 3). Vastaavasti yhteiskäsittely N-diklooriase-tyyli-lyso-GMi:llä ja glutamaatilla inhiboi glutamaatilla aikaansaadun PKC-translokaation maksimaalisen aktiivisuuden esiintyessä 30 minuutin kuluttua (kuvio 4). Samoin yhteiskäsittely 35 minuutin ajan (kuvio 5) ja tämän jälkeinen pidennetty inkubaatioaika gangliosidien kanssa sekä suojaa neurotoksiselta vaikutukselta että inhiboi PKC-translokaation. Näissä koeolosuhteissa N-diklooriasetyyli-lyso-GMi:llä saadut arvot ovat verrattavissa GM].:llä ja GTib:llä saatuihin : arvoihin. On tärkeää huomata, että N-diklooriasetyyli-lyso- GMi:n vaikutusta voidaan silti pitää parempana verrattuna GM^in ja GTib:n vaikutuksiin, koska se saavutetaan paljon pienemmillä annoksilla (7 μΜ vs. 100 μΜ).

- Jälkikäsittely (20 min.) N-diklooriasetyyli-lyso-GMi:llä on myös aktiivinen neurotoksisen vaikutuksen peruuttamiseksi, joka on saatu aikaan jaksottain annettavalla glutamaatilla (kuvio 6).

- N-diklooriasetyyli-lyso-GM]. ja N-monokloori-asetyyli-lyso-GMi (LIGA 21) suojaavat myös endogeeniselta glutamaatin ai- * « 95577 heuttamalta neurotoksisuudelta anoksisissa olosuhteissa (kuvio 7 ) .

- N-monoklooriasetyyli-lyso-GMi:IIS on farmakologinen profiili, jota voidaan verrata N-diklooriasetyyli-lyso-GMi:n farmakologiseen profiiliin (suoja 10 yM:n alueella).

In_vivo-tutkimuksissa N-diklooriasetyyli-lyso-GMi ja N-mono-klooriasetyyli-lyso-GMi suojasivat testieläimet kuolemalta NMDA:n i.c.v.-injektion jälkeen, joka tuottaa vaurion, jota voidaan verrata iskemiaan. N-diklooriasetyyli-lyso-GMi:n ja N-monoklooriasetyyli-lyso-GMi:n vaikutusta voidaan verrata Mg+2:n tai kinureenihapon vaikutukseen (taulukko 3).

« « 19 95577 —‘ > f' 00 >,

H VO O <H O iH +J

r- O 4-> O 0.0 0 4->

• * Il φ * » » * QJ

-P O -P O ooo -p

Ci “H -H

00 -H — P-H -H -H -H P

rr to to — m «# TO on oo m to

co E ld in t* cm E

Eh II OS (S rH es oo

£h * -H - * * ·> -H

X e O © O OOO ©

VO

II

— e (0 · ·—· ω -P >1 >i

n m· P in <# o r~ -P

•H oo αο ρ αο σ\ m co -P

3 m· in O) co in o m· ©

(H — cn.p,Hc-iin -P

0 "H -H

W · -H P -H -H -H -H P

1 P ao TO

< Ό co r-iTOO1 vo vo m TO

cm Eh E on in rH m E

X, Il CM 00 CM O O

K O-iHO rf VO m -H

m m C M* <D M* h m φ Ρ

rH P

n

O -H

« > e

X -H O

O -H -H

PJ -P >

a m »J

< (0 -P 10

En r-1 -H

e 30 Dl rH

(Uno -h x

C "H rH 2 O

•h no Oi

C Ή I O

<u ra p on <U -n O dP n >1

en 0) e >i H

O -P rH I

-M +J e — OOO I -H

ί I ·η -h©· oo σι σ\ -h rH

>· P -H Tl H-1 H >1 3 P 3 III >1 >1

© 3 rH m· m in in in >, -P

Z © o CM OOO -P © Z n vvr~ ao oo v v ©n n © © Ή

H P

P O

o o

O rH

H M M O

O 2 2 2 2 O C

W ·μ< in vo m· CO

2 l i i l O E

Q O O O O Ei rH rH rH rH I —

+ 2 x x x x z Z

M1 rH in in rH

•H -H I II II

rH f—I O

f—I rH Ή rH CM rH CM

O O X CM CM CM CM

P P rH

P -P < < < <

C C rH o O O O

O O 2 M M H H

X X O J PJ PJ

20 95577 c

(0 I

(0 w

P P

11 H 0

-P 10 -H

•H W

O <D M — — — —

T-ι rH O dP dP dP dP

•H rH C

WQ)< r-J o O <N in

W O O <H ι-H O

' -H · ro H r-l I-I H

C 90 ID VO — ^ ~

ao P p I

300)4-) o c- o ch co

-P Qj -P f- O rH rH rH

w p p inoooo 11 H '— ----

Qi r-i p O O O O

<0 M

0) Ω -Η -Η -Η -H

C C3 C * <0 -h O m o tn <n C 10 C M· vo vo in

OJ-PC 9h I—( i-H rH i—I

-P O) 3 Eh - -- - 4-»4->44 2 0 0 0 0 H p <s n 10 d

iH <N

O - « « ο a 0 « (—1 m D rH <0 to — iJ (0 -n C 10 ·

D > <0 ·· —· C

< (0 M CH · -H

H -P C + G E

O G CD -H

30 O ·· 2 ε O

rH -rl rH

1—I g E-) G O

>1 E 2 (0 rH * 44 10 ε ε a) >: c rH * a

44 I to -H E

H CH <0 3. in w z ε c :, Q) — -ri ίο in

1 · 0 10 rH

G G O' Μ 2 30 -H (0 -H rH ϋ

30 -H « (0 2 I

rH W M 0 O

rH -rl -rl I (0 1) 1) G -P O >1

-P -P (0 M M H

H 45 <0 0) — >1 I

W 3 -P W · rH -H

30 W Φ -H C I rH

4ίΟ-ΡΗ Λ -Η -H >, H rH 10 1—I + ε rH >,

W O 10 <0 <N >1 -P

. a> w > 0 0 >1 © G <a 2 vo -p w 30 -Η φ 44 0) (0 "Π Ή C 5>-l + - W Ή

-P >1 W G 44 -— 2 (0 M

(0 P rH -H ·· (0 rH 3.-HO

-H rH <D W <1) <0 (U-H PO

W Οτ-ιΛίΠΤ) -PrHOOrH

M WrHOHIO -Η Η ο ο λ;

0 W -H £5 (0 10 W O rH rH O

C 30 > (0 -P W 30 U ^ t5

(0 > M 44 -H O

1 >1 Λ -H c Η Ό E

CH T~l Ή W O 2 I I

* z — w « 0 z z 95577 21 ©

I—I

P I—I

H 2

O W O

aO >31

P (0 3 O

w p w w P P >1

C >i ID 0) H

©WP T~|P I

C 3 Ή P P

Ή 3 ID ΙΟ O I—I

P W P I—I 3 >i p P P P Stf >i

(DOW -Η -P

© p ao w · © ro -P -Η λ: .* C w W Λ O p vo co in o Q> (0 W 3 3 dP ·> * * * C 0) Ή

p CO >! —· ncor-OOCNor·- CM P

p in ρ p co (0 r-l O

O ao O

P ao 1—I H

P M

ao H fi O

W -HOC

03 — >i W O

P W P -PE

© 3 \ > © Ή I

C 3 -P P -p -p 2:

>i W © P -H W

p ρ © © w ao II

C © Ρ -P © E

>, H rH -H rH ao P

W Ρ O W CM t~~ VD P -P (N

(0 o 3 ao co's.pcticococdp -p p 3 &tj M \ N\ \\ NS\ (OP <

W PCMPOOPOVO WP O

(0 w ao H

> O > J

M

W 3 © cn 3 P *n 3 3 O w in © Λ « p σ> oo p · « w X ' > ·

3,¾ \ in in p oo p (S c · C

JO σ> CM CM CM CN PU© 3 P E p · ©

< Ο P p M

H P W P P

3 0 © © ao © C P P τί

c c P P

»5 W o C P

3 ao Ο >ι X

p \ M E P O

©PC C © I

(0 P P ^ P o w o ao o o m o o in Dun p w C 2 p o o p o o r- NP >1 • © Cd) I I CN P CM CN P^W p

. (0 p ao I

M © M P

p O P P

(0 COG >i P P © >i

CO © P η P

p U 0*M © © P W · © © .. ϋ O ft * Ti C ©

< CO W W · ao C ao P

Q fQ P P P > l-J

s Ou OP W I P O

a U cm cm p p < ao O

+ w o ao D ft p

< C oo >2 M

UCOUOUOO P 2 in P

>CQWWWHH!*; ao Ό

P ft, J J 2 ftC C I

CM CM CM © P 2 w + WWfrc + + + r- C ρ

X O OOO —CPU

J 3U<<<>>> © P

W P > O U U POO

Eh PP + + + PPP © © W CM

E-t © E P >i

H PPP <C

CO OPQQQPQO ao C © O

:< DSJSPSSJEJES P 3 C P

UZ COZZZZSZZ WP© J

22 95577

Toksinen potentiaali 1. Hemolyysi kaniinin veressä

Menetelmä: 100 yl liuoksena olevaa yhdistettä inkuboidaan 1 ml:ssa tuoretta kaniinin verta (500 USP yksikköä natriumhe-pariinia/12 ml verta) 5 minuutin ajan huoneen lämpötilassa. Sentrifugoinnin jälkeen (3000 rpm, 3 min.) laimenettu plasma mitataan spektrofotometrialla (aallonpituus = 545 nm). Hemo-lyyttinen aktiivisuus ilmaistaan sfingosiini-indusoidun he-molyysin prosenttimääränä.

Tulokset: N-asyyli-lyso-johdannaiset eivät aiheuta hemolyy-siä kaniinin veressä 1 mM:n konsentraatiossa.

2. Neurotoksisuus GMi:n N-asyyli-lyso-johdannaisten neurotoksisuutta testattiin aivojen jyvässolujen primaarisissa viljelyissä. FDA-PI-värjäys suoritettiin 24 tunnin kuluttua ja yhdisteillä suoritetun kaksituntisen inkubaation jälkeen.

Tulokset: Testatut N-asyyli-lyso-johdannaiset aiheuttavat neurotoksisuutta konsentraatioissa, jotka ovat vähintään 2 kertaa suurempia kuin aktiiviset konsentraatiot. Yllä esitettyjen farmakologisten ominaisuuksien johdosta tämän keksinnön mukaisia N-asyyli-lysogangliosidi-johdannaisia voidaan käyttää lääkeaineina seuraavissa sairauksissa: aivois-i kemia, metaboliset enkefalopatiat (aivotaudit), kuten hy- poglykemia (verensokerin niukkuus) ja hypoksia (hapen niukkuus), toksista alkuperää olevat enkefalopatiat, trauma, ikääntyminen, epilepsia, neurodegeneratiiviset sairaudet, kuten parkinsonismi ja Huntingtonin tauti ja mielisairaudet.

.. Kaikki keksinnön mukaiset N-asyyli-lysogangliosidien johdan naiset, kuten esterit, sisäiset esterit, amidit ja perasy-laatit voidaan valmistaa alalla gangliosidejä vastaavia johdannaisia varten tunnetuilla menetelmillä. Keksintö käsittää etenkin näiden johdannaisten seokset, joita saadaan keksin- 23 95577 nön mukaisten N-asyyli-lysogangliosidien seoksista, jotka puolestaan saadaan gangliosidien seoksista.

Uusien N-asyyli-lysogangliosidi-johdannaisten esteriryhmät on johdetettu etenkin alifaattisista ja etenkin korkeintaan 12, etenkin korkeintaan 6 hiiliatomia sisältävistä alifaattisista alkoholeista tai aralifaattisista alkoholeista, joissa on edullisesti ainoastaan yksi bentseenirengas, joka on valinnaisesti substituoitu 1-3 alempialkyyliryhmällä (Ci_4), esimerkiksi metyyliryhmällä, ja korkeintaan 4 hiili-atomia alifaattisessa ketjussa, tai alisyklisistä tai ali-faattis-alisyklisistä alkoholeista, joissa on ainoastaan yksi sykloalifaattinen rengas ja korkeintaan 14 hiiliatomia, tai heterosyklisistä alkoholeista, joissa on korkeintaan 12, etenkin korkeintaan 6 hiiliatomia ja ainoastaan yksi hetero-syklinen rengas, jossa on heteroatomina N, 0 tai S.

Tämän keksinnön mukaisten N-asyyli-lysogangliosidi-johdannaisten karboksifunktioiden amidiryhmät on johdettu ammoniakista tai amiineista, joissa on edullisesti korkeintaan 12 hiiliatomia.

Alkoholit ja amiinit voivat olla substituoimattomia tai substituoituja, etenkin funktioilla, joina ovat hydroksi-, amino-, alkoksiryhmät, joissa on korkeintaan 4 hiiliatomia alkyyliosassa, karboksi- tai karbalkoksiryhmät, joissa on . korkeintaan 4 atomia alkyyliosassa, alkyyliamino- tai dial- kyyliaminotähteet, joissa on korkeintaan 4 hiiliatomia alkyyliosassa ja jotka voivat olla tyydyttyneitä tai tyydytty-mättömiä ja joissa on etenkin ainoastaan yksi kaksoissidos.

Alkoholit, jotka esteröivät tämän keksinnön mukaisten N-asyyli-lysogangliosidien karboksifunktiot, voivat olla yksi-arvoisia tai moniarvoisia, etenkin kaksiarvoisia.

Alifaattisista alkoholeista mainittakoon etenkin alemmat alkoholit, joissa on korkeintaan 6 hiiliatomia, kuten metyyli-alkoholi, etyylialkoholi, propyyli- ja isopropyylialkoholi, n-butyylialkoholi, isobutyylialkoholi, tert-butyylialkoholi, i 95577 ja kaksiarvoisista alkoholeista mainittakoon etyleeniglykoli ja propyleeniglykoli. Aralifaattisista alkoholeista mainittakoon etenkin sellaiset, joissa on ainoastaan yksi bentsee-nitähde, kuten bentsyylialkoholi ja fenetyylialkoholi. Ali-syklisistä alkoholeista mainittakoon etenkin sellaiset, joissa on ainoastaan yksi sykloalifaattinen rengas, kuten sykloheksyylialkoholi (sykloheksanoli) tai terpeenialkoho-lit, kuten mentanoli, karvomentoli, tai terpineolit tai ter-pinenolit tai peritoli. Heterosyklisistä alkoholeista mainittakoon etenkin tetrahydrofuranyyli tai tetrahydropyranyy- li. N-asyyli-lysogangliosidien karboksiryhmien esteröimisek-si on mahdollista käyttää myös alifaattisia alkoholeja, jotka on substituoitu esimerkiksi aminofunktioilla, kuten ami-noalkoholeja, joissa on korkeintaan 4 hiiliatomia ja etenkin aminoalkoholeja, joissa on dialkyyli-(Ci_4)aminoryhmä, kuten dietyyliaminoetanolia.

Tämän keksinnön mukaiset karboksamidifunktiot on johdettu joko ammoniakista (ja amidi on tässä tapauksessa substituoi-maton amidi -CONH2) tai primaarisista tai sekundaarisista amiineista, etenkin sellaisista, jotka sisältävät korkeintaan 12 hiiliatomia. Tällaiset amiinit voivat olla aromaattisia, heterosyklisiä, alisyklisiä, mutta etenkin alifaattisia. Tämän keksinnön edullisia suoritusmuotoja ovat korkeintaan 12 hiiliatomia sisältävien alifaattisten amiinien kar-boksamidijohdannaiset ja näissä amiineissa voi olla avoimia, / suoria tai haarautuneita ketjuja tai ne voivat olla sykli siä, kuten alkyyliamiinit, jotka on johdettu 1-6 hiiliatomia sisältävistä alkyyliryhmistä, kuten metyyliamiini, etyy-liamiini, propyyliamiini, heksyyliamiini, dimetyyliamiini, dietyyliamiini, di-isopropyyliamiini, diheksyyliamiini, tai alkyleeniamiinit, jotka on johdettu alkyleeniryhmistä, jois-sa on suoria, 3-6 hiiliatomia sisältäviä ketjuja, tai vastaavia ketjuja, jotka on substituoitu 1-3 metyyliryhmällä, kuten pyrrolidiini, piperidiini ja atsepiini. Näiden amiinien alkyyli- tai alkyleeniryhmät voi olla katkaistu hiili-atomiketjussa tai substituoitu muilla heteroatomeilla, eten- * · 25 95577 kin typpiatomeilla. Keksinnön mukaiset amidit on johdettu tässä tapauksessa diamiineista, esimerkiksi etyleenidiamii-nista, trimetyleenidiamiinista tai piperatsiinista. Jos al-kyyli- tai alkyleeniryhmät on katkaistu tai substituoitu happi- tai rikkiatomeilla, amidit ovat aminoalkoholien, kuten aminoetanolin tai aminopropanolin johdannaisia tai ne pvat morfoliipin tai tiomorfoliinin johdannaisia. Etenkin mielenkiintoisia tälle keksinnölle ovat N-asyylilysoganglio-sidien esterit ja amidit, jotka on johdettu yllä mainittujen ryhmien A ja B ja niiden seosten gangliosideistä.

Keksintö käsittää myös tässä esitettyjen estereiden ja amidien sakkaridiosan, sialihappojen ja keramidien hydroksyy-liryhmien perasyloidut johdannaiset. Tällaisissa johdannaisissa asyyliryhmät voi olla johdettu alifaattisista, aromaattisista, aralifaattisista, alisyklisistä tai heterosyk-lisistä hapoista. Nämä hapot ovat edullisesti alifaattisia happoja, joissa on korkeintaan 10, etenkin korkeintaan 6 hiiliatomia, esimerkiksi muurahais-, etikka-, propioni-, voi-, valeriaana-, n-kaproni- tai n-kapriinihappoja. Ne voi olla johdettu myös hapoista, joissa on esimerkiksi sama määrä hiiliatomeja, mutta jotka on substituoitu, etenkin hydroksihapoilla, kuten maitohapolla, aminohapoilla, kuten glysiinillä tai kaksiemäksisillä hapoilla, kuten meripihka-, maloni- tai maleiinihapolla. Aromaattisista hapoista etenkin mielenkiintoisia ovat sellaiset, joissa on ainoastaan yksi bentseeniydin, etenkin bentsoehappo ja sen metyyli-, hydrok-si-, amino- tai karboksiryhmiä sisältävät johdannaiset, kuten p-aminobentsoehappo, salisyylihappo tai ftaalihappo.

Keksintö käsittää myös yllä esitettyjen N-asyyli-lysogang-liosidien ja seosten perasyloidut johdannaiset, joissa on vapaita karboksifunktioita. Myös näiden johdannaisten kohdalla etenkin mielenkiintoisia ovat tässä lueteltujen happojen asyloidut johdannaiset. Eräs uusien johdannaisten ryhmä käsittää gangliosidejä, jotka on esteröity tai muunnettu amideiksi tai perasyloitu hydroksiryhmissä.

t 95577 Tällaisten johdannaisten esteriryhmät muodostetaan alifaat-tisista tyydyttyneistä alkoholeista, joissa on korkeintaan 6 hiiliatomia ja jotka ovat substituoimattomia tai substituoi-tuja hydroksi-, korkeintaan 4 hiiliatomia sisältävillä al-koksi-, amino-, alkyyliamino- tai dialkyyliaminoryhmillä, joissa on korkeintaan 4 hiiliatomia alkyyliosassa, karboksi-ryhmillä, karbalkoksiryhmillä, joissa on korkeintaan 4 hiiliatomia alkyyliosassa, tai vastaavista alkoholeista, joissa on korkeintaan yksi kaksöissidos, aralifaattisista alkoholeista, joissa on ainoastaan yksi bentseenirengas, joka on substituoimaton tai substituoitu 1-3 metyyliryhmällä, syk-loalifaattisista tai alifaattis-sykloalifaattisista alkoholeista, joissa on sykloheksaanirengas, joka on substituoimaton tai substituoitu 1-3 metyyliryhmällä, ja joissa on korkeintaan 4 hiiliatomia alifaattisessa osassa, tetrahydro-furanolista tai tetrahydropyranolista.

Tällaisten johdannaisten amidiryhmät on johdettu ammoniakista tai alkyyliamiineista, dialkyyliamiineista tai alkyleeni-amiineista, joissa on korkeintaan 6 hiiliatomia alkyyliryh-missä ja 4 - 8 hiiliatomia alkyleeniryhmissä ja joissa al-kyyli- tai alkyleeniryhmät voi olla katkaistu hiiliatomiket-jussa heteroatomeilla, joina ovat typpi, happi tai rikki, amino-NH-ryhmällä, jolloin typpiatomin läsnäollessa ne on substituoitu alkyylillä, jossa on korkeintaan 4 hiiliatomia, ja/tai jotka voi olla substituoitu amino-, alkyyliamino- tai \ dialkyyliaminoryhmillä, joiden alkyyliosassa on korkeintaan 4 hiiliatomia, tai hydroksi- tai alkoksiryhmillä, joiden alkyyliosassa on korkeintaan 4 hiiliatomia, tai aralifaattisista amiineista, joissa on ainoastaan yksi bentseenirengas ja joka on valinnaisesti substituoitu korkeintaan 3 metyyli-ryhmällä ja jossa on korkeintaan 4 hiiliatomia alifaattises-·' sa osassa.

Muita johdannaisia ovat sellaiset, joissa asyyliryhmät, jot ka esteröivät hydroksiryhmät, on johdettu tyydyttyneistä tai tyydyttymättömistä alifaattisista hapoista, joissa on korkeintaan 6 hiiliatomia ja jotka voi olla substituoitu funk-tiolla, jona on hydroksi-, amino- tai karboksiryhmä.

27 95577

Keksintö käsittää myös N-asyyli-lyso-gangliosidien ja niiden johdannaisten farmaseuttisesti hyväksyttävät suolat.

Yllä esitetty N-asyyli-ryhmä, joka on tunnusomainen tämän keksinnön mukaisille yhdisteille, on johdettu alifaattisesta haposta, jossa on 2 - 24 hiiliatomia. Nämä hapot voivat olla moniemäksisiä, mutta ne ovat edullisesti sellaisia, joissa on ainoastaan yksi karboksifunktio. Ne ovat edullisesti suo-raketjuisia. Haarautuneita ketjuja sisältävissä ryhmissä nämä ketjut ovat edullisesti korkeintaan 4 hiiliatomia sisältäviä alempialkyyliryhmiä, etenkin metyyliryhmiä. Asyyleis-sä, etenkin haarautuneita ketjuja sisältävissä asyyleissä on edullisesti korkeintaan 12 hiiliatomia, edullisesti korkeintaan 6 hiiliatomia. Asyyliryhmät ovat edullisesti tyydyttyneitä, mutta niissä voi olla myös kaksoissidoksia, edullisesti 1-2 kaksoissidosta. Polaarisia ryhmiä, jotka on substituoitu N-asyyliryhmässä, on edullisesti 1 - 3 ja ne voivat olla samanlaisia tai erilaisia. Etusijalla ovat yhdisteet, joissa on asyyliryhmiä, jotka on substituoitu a-asemassa, etenkin sellaiset, joissa on suurempi hiiliatomien pitoisuus, ja/tai tyydyttymättömät yhdisteet.

Polaariset ryhmät ovat vapaita funktioita, kuten hydroksi-tai aminoryhmiä, tai funktionaalisia johdannaisia, kuten es-tereitä, eettereitä, ketaaleja jne. Esterit, esimerkiksi hydroksiryhmien esterit voi olla muodostettu alifaattisista, ; aromaattisista, aralifaattisista, alisyklisistä tai hetero- syklisistä hapoista. Tällaiset esteriryhmät on johdettu edullisesti terapeuttisesti hyväksyttävistä hapoista. Ali-faattisia happoja ovat edullisesti alemmat hapot, joissa on korkeintaan 8 hiiliatomia, kuten etikka-, propioni-, voi-tai valeriaanahappo, esimerkiksi isovaleriaanahappo, tai niiden substituoidut johdannaiset, kuten hydroksihapot, esimerkiksi glykoli- tai hydroksivoihappo ja maitohappo, aminohapot, kuten luonnolliset aminohapot, esim. glysiini, ala-niini, väliini tai fenyyliglysiini, tai kaksiemäksiset hapot. Kaksiemäksiset hapot voi olla myös substituoitu, kuten malonihappo, meripihkahappo, maleiinihappo ja omenahappo.

28 9 5 5 7 7

Aromaattisia happoja ovat esimerkiksi bentsoehappo tai sen johdannaiset, jotka on substituoitu 1-3 alempialkyyliryh-mällä, hydroksiryhmällä tai alempialkoksiryhmällä tai halogeeneilla, kuten kloorilla, fluorilla tai bromilla. Arali-faattisista hapoista mainittakoon etenkin sellaiset, joissa on ainoastaan yksi bentseenirengas, kuten fenyylietikka- tai fenyylipropionihappo, jotka on valinnaisesti substituoitu yllä esitetyllä tavalla. Alisyklisiä happoja ovat edullisesti sellaiset, joissa on 5 tai 6 hiiliatomia, esimerkiksi heksaanihiilihappo tai heksaanidihiilihappo. Heterosyklisiä happoja ovat edullisesti yksinkertaiset yhdisteet, joissa on ainoastaan yksi heterosyklinen ryhmä, kuten pyridiinin tai piperidiinin johdannaiset, esim. nikotiini- tai isonikotii-nihappo tai a-pyrrolidiinihiilihappo.

Esteröidyt hydroksiryhmät voi olla johdettu yllä esteröity-jen sialiryhmien yhteydessä mainituista alkoholeista. Etenkin edullisia ovat ryhmät, jotka on esteröity korkeintaan 4 hiiliatomia sisältävillä alifaattisilla hapoilla tai arali-faattisilla alkoholeilla, joissa on korkeintaan 4 hiiliatomia alifaattisessa osassa ja yksi bentseeniryhmä, joka on valinnaisesti substituoitu yllä esitetyllä tavalla.

Substituoidut aminoryhmät voivat olla myös sellaisia, jotka on johdettu yllä sialihappojen amidiryhmien yhteydessä esitetyistä amiineista. Etenkin edullisia ovat aminoryhmät, : jotka on substituoitu korkeintaan 4 hiiliatomia sisältävillä alkyyliryhmillä tai aralkyyliryhmillä, joissa on korkeintaan 4 hiiliatomia alifaattisessa osassa ja yksi bentseeniryhmä, joka on valinnaisesti substituoitu yllä esitetyllä tavalla. Substituoitu aminoryhmä voi käsittää myös aminoryhmän, joka on asyloitu esimerkiksi yllä esteröityjen hydroksiryhmien yhteydessä mainituilla hapoilla, etenkin korkeintaan 4 hiiliatomia sisältävällä alifaattisella hapolla.

Alemmat alifaattiset tai aralifaattiset hydrokarbyyliryhmät, joita on esitetty tässä ja jotka koskevat keto-, aldehydi-, aldoksiimi-, merkapto-, sulfoni-, sulfamidi-, sulfoni- ja •» 29 95577 sulfoksidi-osien substituutiota, ovat ryhmiä, joissa on korkeintaan 8 hiiliatomia, etenkin 1-4 hiiliatomia. Hydratso-niryhmät voi olla myös johdettu tällaisista hydrokarbyyli-ryhmistä, mukaanlukien fenyylihydratsoniryhmä.

Esteröidyt karboksiryhmät mahdollisina polaarisina substi-tuentteina tämän keksinnön mukaisessa N-asyyli-ryhmässä voivat olla sellaisia, joita on esitetty yllä gangliosidijoh-dannaisten sialiryhmien estereiden yhteydessä, mutta ne on edullisesti johdettu alifaattisista alkoholeista, joissa on korkeintaan 8 hiiliatomia ja etenkin korkeintaan 4 hiiliatomia. Alemmista tyydyttyneistä hapoista, joissa on yllä esitetty määrä hiiliatomeja ja joista N-asyyli-ryhmä on johdettu, mainittakoon etenkin halogenoidut ja etenkin klooratut tai fluoratut hapot ja erityisesti sellaiset, jotka on di-kloorattu 2-asemassa. Etenkin mainittakoon dikloorietikka-happo, trikloorietikkahappo ja sen fluoratut tai bromatut analogit, 2,2-diklooripropionihappo, 2,3-diklooripropioni-happo, 2,2,3-triklooripropionihappo, n-2,2-dikloorivoihappo, 2.2- dikloorivaleriaanahappo, 2-kloori-isovaleriaanahappo, 2.2- dikloorivaleriaanahappo, pentafluoripropionihappo, 3,3-diklooripivaliinihappo, 3-kloori-2,2-dimetyylipropionihappo, klooridifluorietikkahappo, 2,2-dikloorikapronihappo, 2-mono-klooripropionihappo, 2-monokloori-n-voihappo, 2-monokloori-valeriaanahappo, 2-monokloorikapronihappo, ja näiden happojen fluoratut tai bromatut analogit, 2-klooripalmitiinihap- j po, 2-klooristeariinihappo, 2-kloorioleiinihappo, 2-kloori- lauriinihappo, 2-klooribehenhappo, 4-kloorifenoksietikkahap-po, 2-hydroksipropionihappo (maitohappo), 3-hydroksipropio-nihappo, 2-hydroksivoihappo, 2-hydroksivaleriaanahappo, 3-hydroksivaleriaanahappo, 2,3-dihydroksivoihappo ja 2,3-di-hydroksivaleriaanahapot tai niiden eetterit alempien ali-faattisten, korkeintaan 4 hiiliatomia sisältävien alkoholien kanssa tai niiden hydroksiryhmiä sisältävät esterit korkeintaan 4 hiiliatomia sisältävien alempien alifaattisten happojen kanssa, tai jonkin yllä mainitun aromaattisen, arali-faattisen, alisyklisen tai heterosyklisen hapon kanssa. Täi- 30 95577 laisia happoja ovat metoksietikkahappo, 12-hydroksistearii-nihappo, 2-(4-hydroksifenoksi)-propionihappo, 2-hydroksi-isokapronihappo, 2-hydroksi-isovoihappo, 4-fluorifenoksi-etikkahappo, etoksietikkahappo, palorypälehappo, asetoetik-kahappo, levuliinihappo ja niiden ketaalit, jotka on muodostettu alempien alifaattisten, korkeintaan 4 hiiliatomia sisältävien alkoholien kanssa, tai niiden oksiimit tai korkeintaan 4 hiiliatomia sisältävillä alkyyliryhmillä substi-tuoidut oksiimit, merkaptoetikka-, 2-merkaptopropioni-, 2-merkaptovoi- tai 2-merkaptovaleriaanahappo ja niiden esterit, jotka on muodostettu korkeintaan 4 hiiliatomia sisältävien alempien alifaattisten yksiarvoisten alkoholien kanssa, tai niiden eetterit, jotka on muodostettu korkeintaan 4 hiiliatomia sisältävien alempien alifaattisten happojen kanssa.

Samoin mielenkiintoisia ovat 2-merkaptolauriinihapot, -oleiini- ja -palmitiinihapot ja niiden yllä esitetyn tyyppiset esterit tai eetterit, malonihappo, glutaarihappo, mo-nometyyliglutaarihappo, 3-hydroksi-3-metyyliglutaarihappo, maleiinihappo, omenahappo, meripihkahappo, fumaarihappo, at-selaiinihappo ja niiden esterit korkeintaan 4 hiiliatomia sisältävien alifaattisten alkoholien kanssa, sulfoetikkahap-po, 2-sulfopropionihappo, 2-sulfovoihappo, 2-sulfovaleriaa-nahappo ja niiden esterit korkeintaan 4 hiiliatomia sisältävien alifaattisten alkoholien kanssa. Korkeammista hapoista, jotka on substituoitu sulfoniryhmillä, voidaan mainita 2-sulfolauriinihappo, 2-sulfo-oleiinihappo, 2-sulfopalmitii-nihappo, 2-sulfosteariinihappo ja niiden yllä esitetyn tyyppiset esterit samoin kuin vastaavat sulfamidit tai sulfami-dit, jotka on substituoitu korkeintaan 4 hiiliatomia sisältävillä alempialkyyliryhmillä tai 4 tai 5 hiiliatomia sisältävillä alkyleeniryhmillä, etikka-, propioni-, voi- ja vale-riaanahapot, jotka on substituoitu 2-asemassa alkyylisulfok-* sidi- tai alkyylisulfoniryhmällä, jonka alkyylissä on kor keintaan 4 hiiliatomia, syaanietikkahappo, 2-syaanipropioni-happo, 2-syaanivoihappo, 2-syaanivaleriaanahappo, aminoetik-kahappo, 2-aminopropionihappo, 2-aminovoihappo, 3-aminovoi-happo, 4-aminovoihappo, 2-aminovaleriaanahppo, 4-aminovale- 31 95577 riaanahappo ja niiden johdannaiset, joissa on 1 tai 2 alkyy-liä, jotka on substituoitu amiinivedyssä ja joissa korkeintaan 4 hiiliatomia, tai joissa on yksi 4 tai 5 hiiliatomia sisältävä alkyleeniryhmä, tai näiden happojen johdannaiset, joissa on asyloitu aminoryhmä ja jotka on muodostettu alemman alifaattisen, 1-4 hiiliatomia sisältävän hapon kanssa tai jonkin yllä mainitun aromaattisen, alisyklisen tai hete-rosyklisen hapon kanssa. Tällaisia johdannaisia ovat korkeintaan 4 hiiliatomia sisältävistä alkyyliryhmistä johdettujen tertiaaristen aminoryhmien kvaternaariset ammoniumsuo-lat. Muita happoja ovat etioniini, dimetyyliglysiini, 3-di-etyyliaminopropionihappo, karnitiini ja kysteiinihappo.

On mahdollista valmistaa metalli- tai orgaanisia emässuoloja vapaita karboksiryhmiä sisältävistä keksinnön mukaisista N-asyyli-lysogangliosidi-yhdisteistä, ja nämä muodostavat samoin keksinnön osan. Samoin on mahdollista valmistaa metalli- tai orgaanisia emässuoloja myös muista keksinnön mukaisista johdannaisista, joissa on vapaita happamia funktioita, kuten estereistä tai kaksiemäksisillä hapoilla perasyloi-duista amideista. Samoin keksinnön osana ovat emäksisen funktion, kuten vapaan aminofunktion sisältävien gangliosi-dijohdannaisten, esimerkiksi aminoalkoholien kanssa muodostettujen estereiden happoadditiosuolat. Metalli- tai orgaanisista emässuoloista mainittakoon etenkin sellaiset, joita voidaan käyttää terapiassa, kuten alkali- tai maa-alkalime-: tallien suolat, esimerkiksi kaliumin, natriumin, ammonium, - · kalsiumin tai magnesiumin tai aluminiumin suolat ja myös orgaaniset emässuolat, esimerkiksi alifaattisten, aromaattisten tai heterosyklisten primaaristen, sekundaaristen tai tertiaaristen amiinien, kuten metyyliamiinin, etyyliamiinin, propyyliamiinin, piperidiinin, morfoliinin, efedriinin, fur-furyyliamiinin, koliinin, etyleenidiamiinin ja aminoetanolin emässuolat. Niistä hapoista, jotka voivat tuottaa keksinnön mukaisten gangliosidijohdannaisten happoadditiosuoloja, mainittakoon etenkin vetyhapot, kuten kloorivetyhappo, bromive-tyhappo, fosforihappo, rikkihappo, alemmat alifaattiset ha- . · » 32 9 5 5 7 7 pot, joissa on korkeintaan 7 hiiliatomia, kuten muurahais-, etikka- tai propionihappo, meripihka- ja maleiinihappo. Happoja tai emäksiä, joita ei voida käyttää terapeuttisesti, kuten pikriinihappoa voidaan käyttää tämän keksinnön mukais-* ten gangliosidijohdannaisten puhdistamiseksi j a ne muodostavat samoin keksinnön osan.

Johtuen uusien vapaassa muodossa ja suolojen muodossa esiintyvien johdannaisten välisestä läheisestä suhteesta näiden kahden muodon välillä ei tehdä mitään erityistä eroa, mikäli toisin ei ole mainittu ja mikäli itse merkitys sulkee pois tämän mahdollisuuden.

Tämän keksinnön mukaisista uusista N-asyyli-lysogangliosi-deistä ja niiden johdannaisista mainittakoon etenkin sellaiset, joissa on asyyliryhmä, joka on johdettu yllä mainituista substituoiduista hapoista ja joissa on emäksisenä gang-liosidinä jokin seuraavista: GMi, GM3, GDla, GDlb, GT^b, niiden sialihappoesterit, jotka on johdettu etyyli-, propyy-li-, isopropyyli-, n-butyyli-, isobutyyli-, tert-butyyli-, bentsyyli-, allyyli-, etoksikarbonyylimetyyli- tai syklohek-syylialkoholista, sialihappoamidit ja amidit, jotka on johdettu metyyliamiinista, etyyliamiinista, propyyliamiinista, dimetyyliamiinista, dietyyliamiinista, pyrrolidiinistä, pi-peridiinistä, piperatsiinista, morfoliinista, tiomorfolii-nista, niiden perasylaatit, perpropionylaatit, perbutyrilaa-: tit, permaleinylaatit, permalonylaatit, persukkinylaatit ja mainittujen sialihappoestereiden ja -amidien perasyloidut analogit. Samoin mainittakoon N-asyyli-lysogangliosidien seokset, jotka käsittävät pääasiassa sellaisia, jotka on johdettu gangliosideistä GM^, GDla, GDlb, GTib, jotka on N-asyloitu yllä mainituilla hapoilla, ja samat funktionaaliset johdannaiset, kuten yllä on mainittu yksittäisten gangliosi-dien johdannaisten yhteydessä. Etenkin mainittakoon seuraa-vat N-asyyli-lysogangliosidit: diklooriasetyyli-lyso-GMi, klooriasetyyli-lyso-GMi, 3-klooripivaloyyli-lyso-GMi, hyd-roksiasetyyli-lyso-GMi, trifluoriasetyyli-lyso-GMi, trikloo-riasetyyli-lyso-GMi, tribromiasetyyli-lyso-GMi, merkaptoase- 33 95577 tyyli-lyso-GMi, maleyyli-lyso-GMi, 12-hydroksistearoyyli-lyso-GMi, 2-hydroksi-isobutyroyyli-lyso-GMi, fluoriasetyyli-lyso-GMi, difluoriasetyyli-lyso-GMi, 3-aminopropionyyli-ly-so-GMi, syanoasetyyli-lyso-GMi, 3-dietyyliaminopropionyyli-lyso-GMi, aminoasetyyli-lyso-GMi, ja esterit ja amidit ja perasylaatit, jotka vastaavat yllä mainittuja.

Tämän keksinnön mukaiset uudet lysogangliosidijohdannaiset voidaan valmistaa tunnetulla tavalla. On mahdollista deasy-loida gangliosidit selektiivisesti sfingosiinitypessä sopivilla entsyymeillä, jolloin saadaan suoraan lysoganglioside-jä, jotka säilyttävät muut läsnä olevat asyyliryhmät koskemattomina, etenkin neuramiinihapon aminoryhmässä olevat. Asyloimalla tunnetulla tavalla on siten mahdollista saada N-asyyli-lysogangliosidejä.

Vaihtoehtoisesti gangliosidit voidaan deasyloida kemiallisesti, jolloin saadaan de-N-asetyyli-lysogangliosidejä, s.o. yhdisteitä, joissa sfingosiinin ja neuramiinihappojen amino-ryhmät on deasyloitu ja joissa on mahdollisesti esteröityjä hydroksiryhmiä. Nämä tuotteet voidaan asyloida tunnetulla tavalla, jolloin saadaan de-N-asetyyli-N-asyyli-lysoganglio-sidejä. Nämä voidaan sitten asetyloida neuramiinihapon amino ryhmän suhteen.

Eräässä tämän menetelmän muunnelmassa sfingosiiniaminoryhmä suojataan tilapäisesti, mikä voidaan tehdä esimerkiksi hydrofobisen vuorovaikutuksen avulla fosfatidyylikoliinin kanssa tai asyloimalla suojaryhmillä, asetyloimalla tämän jälkeen neuramiinihapon typessä ja valinnaisesti vapauttamalla sfingosiinityppi ja lopuksi N-asyloimalla sfingosiinitypessä. Kaikki nämä toimenpiteet voidaan suorittaa myös esitetyillä gangliosidiseoksilla.

N-asyyli-lysogangliosideissä on mahdollista haluttaessa muuntaa sialihappojen karboksiryhmät tai tällaisten happojen hydroksyylit, esimerkiksi muuntaa karboksyylit estereiksi tai amideiksi tai hydroksyylit niiden hapoilla esteröidyiksi • · i 34 95577 ryhmiksi (perasylointi). Toisaalta on mahdollista joko ennen näitä funktionaalisia muuntoja, samanaikaisesti niiden kanssa tai niiden jälkeen muuntaa joko funktionaalisesti tai ei keramiditähteen asyyliryhmässä läsnä olevat polaariset ryhmät, esimerkiksi esteröidä hydroksiryhmät tai alkyloida ami-noryhmät tai saattaa karbonyyliryhmät reagoimaan O-alkyyli-hydroksyyliamiinin kanssa. Samoin on mahdollista muuntaa saadut yhdisteet niiden suoloiksi.

Tämän keksinnön mukaisessa menetelmässä asyloidaan lysogang-liosidi tai de-N-asetyyli-lysogangliosidi tai näiden yhdisteiden seokset, mahdollisesti sen jälkeen, kun asylointikom-ponentin vapaat funktionaaliset ryhmät on suojattu alifaat-tisella, 2-24 hiiliatomia sisältävällä hapolla, joka on substituoitu yhdellä tai useammalla polaarisella ryhmällä, joina on jokin seuraavista: - kloori, bromi tai fluori, - vapaat hydroksiryhmät tai hydroksiryhmät, jotka on este-röity orgaanisella tai epäorgaanisella hapolla, - eetteröidyt hydroksiryhmät, - keto-, ketaali- ja asetaaliryhmät, jotka on johdettu alemmista alifaattisista tai aralifaattisista alkoholeista, - ketoksiimi-, aldoksiimi- tai hydratsoniryhmät, jotka on valinnaisesti substituoitu alempialkyyli- tai aralkyyliryh-millä, - vapaat merkaptoryhmät tai merkaptoryhmät, jotka on este- j röity alemmalla alifaattisella tai aralifaattisella hapolla tai eetteröity alemmilla alifaattisilla tai aralifaattisilla alkoholeilla, - vapaat tai esteröidyt karboksiryhmät, - vapaat sulfonihapporyhmät tai sulfoniryhmät, jotka on es-teröity alemmilla alifaattisilla tai aralifaattisilla alkoholeilla, - sulfamidiryhmät tai sulfamidiryhmät, jotka on substituoitu alempialkyyli- tai aralkyyliryhmillä tai alempialkyleeniryhmillä, - sulfoksidi- tai sulfoniryhmät, jotka on johdettu alempial- 95577 35 kyyli- tai aralkyyliryhmistä, - nitriiliryhmät, - vapaat tai substituoidut aminoryhmät, ja tällaisten amino-ryhmien kvaternaariset ammoniumjohdannaiset.

Keksinnön mukainen menetelmä käsittää myös sen, että näin saatu de-N-asetyyli-N-asyyli-lysogangliosidi tai tämän tyyppisten yhdisteiden seos asetyloidaan ja haluttaessa muunnetaan saatu N-asyyli-lysogangliosidi estereiksi tai amideiksi tai sisäisiksi estereiksi tai hydroksiperasylaateiksi tai tällaisten yhdisteiden seokseksi ja/tai valinnaisesti muunnetaan polaariset ryhmät, jotka on substituoitu N-asyyliryh-mässä, toisiinsa ja haluttaessa muunnetaan saadut tuotteet sopiviksi suoloiksi.

Esitetyn menetelmän mukainen N-asylointi voidaan suorittaa tavanomaisella tavalla, esimerkiksi saattamalla lähtötuot-teet reagoimaan asylointiaineen, etenkin sen hapon reaktiivisen funktionaalisen johdannaisen kanssa, jonka tähde on liitettävä. Siten on mahdollista käyttää hapon funktionaalisena johdannaisena halogenidia tai anhydridiä ja asylointi suoritetaan edullisesti tertiaarisen emäksen, kuten pyridii-nin tai kollidiinin läsnäollessa. Työt voidaan suorittaa vedettömissä olosuhteissa, huoneen lämpötilassa tai kuumentaen ja myös edullisesti Schotten-Baumann-menetelmän mukaisesti vesipitoisissa olosuhteissa epäorgaanisen emäksen läs-• näollessa. Joissakin tapauksissa on mahdollista käyttää hap pojen estereitä reaktiivisina funktionaalisina johdannaisi na. Asylointia varten on myös mahdollista käyttää menetelmiä, joissa käytetään aktivoituja karboksijohdannaisia ja jotka ovat tunnettuja peptidikemiassa, esimerkiksi käyttämällä seka-anhydridejä tai johdannaisia, jotka saadaan kar-bodi-imidien tai isoksatsolisuolojen kanssa.

Useista valmistusmenetelmistä sopivimpia ovat seuraavat: 1. lysogangliosidijohdannaisen reaktio hapon atsidin kanssa, 2. lysogangliosidijohdannaisen reaktio hapon asyyli-imidat- a · 36 95577 solin kanssa, joka saadaan haposta N,N'-karbonyylidi-imidat-solin kanssa, 3. lysogangliosidijohdannaisen reaktio hapon ja trifluori-etikkahapon seka-anhydridin kanssa, 4. lysogangliosidijohdannaisen reaktio hapon kloridin kanssa, 5. lysogangliosidijohdannaisen reaktio hapon kanssa karbodi-imidin (kuten disykloheksyylikarbodi-imidin) ja valinnaisesti aineen, kuten 1-hydroksibentsotriatsolin läsnäollessa, 6. lysogangliosidijohdannaisen reaktio hapon kanssa kuumentamalla , 7. lysogangliosidijohdannaisen reaktio hapon metyyliesterin kanssa korkeassa lämpötilassa, 8. lysogangliosidijohdannaisen reaktio hapon fenoliesterin, kuten para-nitrofenolin kanssa muodostetun esterin kanssa, ja 9. lysogangliosidijohdannaisen reaktio esterin kanssa, joka on muodostettu hapon suolan ja l-metyyli-2-klooripyridiini-jodidin tai vastaavien tuotteiden välisestä vaihdosta.

* 4 i 37 95577 * (a) hydrofobinen vuorovaikutus fosfatidyylikoliinin kanssa sfingosiinitypen suojaamiseksi (b) astylointi neuramiinihapon typessä ** tetra-alkyyliammoniumin hydroksidit, KOH, muut reagenssit *** (a) asylointi sfingosiinitypessä, joka on suojattu suoj aryhmillä (b) asetylointi neuramiinihapon typessä (c) sfingosiinitypen vapauttaminen 3β 95577

Siinä erityisessä tapauksessa, että valmistetaan tuotteita, jotka on johdettu hapoista, jotka sisältävät vapaita hydrok-si- tai merkapto- tai karboksiryhmiä tai primaarisia tai sekundaarisia amminoryhmiä, on edullista suojata tällaiset ryhmät asylointireaktion aikana käyttämällä edullisesti pep-tidikemiassa käytettäviä suojamenetelmiä. Tällaiset suoja-ryhmät on voitava tietenkin eliminoida helposti reaktion päättyessä, kuten ftaloyyliryhmä tai bentsyylioksikarbonyy-liryhmä, joka suojaa edullisesti aminoryhmän. Siten esimerkiksi valmistettaessa johdannaisia, jotka sisältävät D-ami-novoihappoa, valmistetaan ensin tämän hapon johdannainen, jossa aminoryhmä on sidottu ftaloyyliryhmään, ja lysogang-liosidijohdannaisen kanssa suoritetun asyloinnin jälkeen ftaloyyliryhmä eliminoidaan hydratsinolyysillä. Bentsyyliok-sikarbonyyliryhmä voidaan eliminoida hydraamalla. Tämä tähde voi toimia myös hydroksiryhmien suojaamiseksi. Karboksiryhmä voidaan suojata esteröimällä, esimerkiksi peptidikemiassa käytetyillä alkoholeilla.

Lähtögangliosidit voidaan saada, kuten jo mainittiin, gang-liosideistä deasyloimalla entsymaattisesti typessä keramidi-deasylaaksi kutsutulla entsyymillä. Tätä menetelmää on selitetty esimerkiksi julkaisussa J. Biochem. 103, 1 (1988). De-N-asetyylilysogangliosidit, joita voidaan käyttää myös läh-tötuotteina, saadaan gangliosideistä alkalisten hydrolysoin-tiaineiden, esimerkiksi tetra-alkyyliammoniumhydroksidien, kaliumhydraatin ja vastaavien kanssa [ks. Biochemistry 24, 525, (1985); J. Biol. Chem. 255, 7657, (1980); Biol. Chem.

Hoppe Seyler 367, 241 (1986); Carbohydr. Res. 179, 393 (1988); Bioch. Bioph. Res. Comm. 147, 127 (1987)].

De-N-asetyyli-lysogangliosidit, jotka ovat lähtöaineina esi-tetyn menetelmän eräässä muunnelmassa, voivat muodostaa myös lähtöaineet erään toisen muunnelman lähtöaineiden, s.o. ly-sogangliosidien valmistamiseksi. Kuten taulukosta 4 voidaan nähdä, tämä muunto voidaan suorittaa taulukon osien (3) ja (4) mukaisesti. Menetelmän (3) reaktiot (a) ja (b) ja menetelmän (4) reaktiot (a), (b) ja (c) ovat jo tunnettuja. On 39 95577 mahdollista valmistaa tämän menetelmän mukaisesti saatujen uusien N-asyyli-lysogangliosidien karboksi- tai hydroksijoh-dannaisia jo tunnettujen menetelmien mukaisesti lukuunottamatta niitä menetelmiä, jotka muuttaisivat perusgangliosidi-rakennetta, kuten sellaisia, joissa käytetään erittäin happamia aineita tai jotka suoritetaan erittäin aikalisissä tai happamissa olosuhteissa, tai myös sellaisia menetelmiä, jotka johtaisivat sakkaridiosan hydroksiryhmien ei-toivottuun alkylointiin.

N-asyyli-gangliosidien karboksiryhmien esteröinti tai niiden muunto amideiksi voidaan suorittaa esimerkiksi US-patentissa 4,713,374 gangliosideille esitetyllä tavalla. Keksinnön mukaisten johdannaisten sisäiset esterit voidaan muodostaa myös samalla tavalla kuin gangliosidien esterit, kuten on esitetty esimerkiksi US-patentissa 4,593,091 ja EPO-paten-tissa n:o EP 0072 722. Nämä sisäiset esterit eivät käsitä ainoastaan yhdisteitä, jotka on muodostettu laktonisoimalla sialikarboksiryhmät hydroksisakkarideillä, vaan myös esimerkiksi ne, jotka sisältävät laktonirenkaita, jotka on muodostettu sialikarboksyylien ja sialihydroksyylien väliin, jolloin viimeksi mainitut on puolestaan sidottu sakkaridiosaan, ja myös muut mahdolliset 1aktonirakenteet. Menetelmässä, joka on esitetty mainituissa patenteissa sisäisten estereiden muodostamiseksi, gangliosidi käsitellään vedettömässä orgaanisessa liuottimessa vedettömissä olosuhteissa laktonisoin-tiaineella. Sopivia orgaanisia liuottimia ovat dimetyylisul-foksidi, dimetyyliformamidi, sulfolaani, tetrahydrofuraani, dimetoksietaani, pyridiini tai näiden liuottimien seokset. Sopivia laktonisointiaineita ovat karbodi-imidit, jotka liukenevat orgaanisiin liuottimiin, kuten disykloheksyylikarbo-di-imidi, bentsyyli-isopropyylikarbodi-imidi, bentsyylietyy-likarbodi-imidi, 2-kloori-l-metyylipyridiinisuolat, etoksi-asetyleeni ja Woodward'in reagenssi (N-etyyli-5-fenyyli-isoksatsoli-3'-sulfonaatti). Vanhemmissa menetelmissä käytetään reaktiota gangliosidin ja etikka- tai trikloorietikka-hapon tai karbodi-imidin kanssa, joka liukenee veteen tai 40 95577 vesipitoiseen väliaineeseen. Kaikkia näitä menetelmiä voidaan käyttää uusien N-asyyli-lysogangliosidien sisäisten es-tereiden valmistamiseksi.

Karboksiryhmien esteröimiseksi "ulkoisesti", s.o. yllä mainittujen ryhmien alkoholeilla on mahdollista esimerkiksi saattaa N-asyyli-lysogangliosidit reagoimaan halutun alkoholin kanssa ioninvaihtimen, kuten hartsin, esim. Dowex 50:n läsnäollessa, jolloin saanto on rajoitettu sisäisten este-reiden samanaikaisen muodostumisen ja reaktioaikojen johdosta, jotka ovat melko pitkiä. Eräässä toisessa esteröintime-netelmässä alkoholi ohjataan hartsin, kuten Dowex-50W-8:n (100 - 200 mesh, H-muoto) läpi ja liuennut eluaatti käsitellään samassa alkoholissa vastaavalla diatsoalkaanilla. Eräässä toisessa sopivassa estereiden valmistusmenetelmässä lysogangliosidijohdannaisen metallisuola käsitellään eette-röintiaineella. Käytetään alkalimetallisuoloja tai maa-alka-limetallisuoloja tai myös jotain muuta metallisuolaa. Eette-röintiaineena on mahdollista käyttää kirjallisuudessa esitettyjä, etenkin erilaisten epäorgaanisten happojen tai orgaanisten sulfonihappojen, kuten vetyhappojen estereitä, s.o. toisin sanoen hydrokarbyylihalogenideja, kuten metyyli-tai etyylijodideja jne. tai neutraaleja sulfaatteja tai hyd-rokarbyylihappoja, sulfIittejä, karbonaatteja, silikaatteja, fosfiitteja tai hydrokarbyylisulfonaatteja, kuten bentso-tai p-tolueenisulfonaattia. Reaktio voidaan suorittaa sopivassa liuottimessa, esimerkiksi alkoholissa, edullisesti sellaisessa, joka vastaa liitettäviä alkyyliryhmiä, mutta myös ei-polaarisissa liuottimissa, kuten ketoneissa, eettereissä, kuten dioksaanissa tai dimetyylisulfoksidissa. Eräässä erittäin edullisessa esteröintimenetelmässä lysogangliosidi johdannaisen sisäinen esteri käsitellään halutun ai- • · ” koholin ja sen vastaavan alkoholaatin seoksella. Reaktio voidaan suorittaa alkoholin kiehumispistettä vastaavassa lämpötilassa, mutta se voidaan suorittaa myös alhaisemmassa lämpötilassa, jolloin reaktioajat ovat pitempiä.

Tämän keksinnön mukaisten lysogangliosidijohdannaisten amidit voidaan valmistaa tunnetuilla menetelmillä ja etenkin 95577 seuraavilla menetelmillä: a) N-asyyli-lysogangliosidijohdannaisten sisäisten esterei-den reaktio ammoniakin tai amiinien kanssa, b) N-asyyli-lysogangliosidijohdannaisten karboksiestereiden reaktio ammoniakin tai amiinien kanssa, c) aktivoituja karboksiryhmiä sisältävien N-asyyli-lysogangliosidi johdannaisten reaktio ammoniakin tai amiinien kanssa.

Reaktio (a) voidaan suorittaa käsittelemällä sisäinen gang-liosidiesteri suoraan, liuottimen kanssa tai ilman sitä, ammoniakilla tai amiinilla, jonka amidi on valmistettava. Reaktio voidaan suorittaa myös melko alhaisissa lämpötiloissa, kuten esimerkiksi -5 - +10eC:ssa, mutta edullisesti huoneen lämpötilassa tai sen yli, esimerkiksi 30 - 120*C:ssa. Liuottimina on mahdollista käyttää ketoneja, aromaattisia hiilivetyjä, dimetyyliformamidia, dimetyylisulfoksidia, di-oksaania tai tetrahydrofuraania. Reaktio (b) tulisi myös suorittaa edullisesti reaktiolle (a) esitetyissä olosuhteissa.

Samoin kuin tätä keksintöä varten esitettyjä estereitä on myös mahdollista käyttää muita estereitä, esimerkiksi fenolien kanssa muodostettuja estereitä. Karboksiryhmien aktivoimiseksi menetelmän (c) mukaisessa reaktiossa tulisi käyttää peptidikemiassa tunnettuja menetelmiä välttämällä kuitenkin sellaisia menetelmiä, joissa tarvitaan liian happamia tai liian emäksisiä olosuhteita, jotka hajottaisivat gangliosidimolekyylin. Jos lähtögangliosidit ovat esimerkiksi natriumsuolojen muodossa, on edullista käsitellä ensin suola Dowex-tyyppisellä ioninvaihtimella tai jollakin muulla happamalla ioninvaihtimella. Esimerkiksi on mahdollista käyttää kondensaatiomenetelmää karbodi-imidien, esimerkiksi disykloheksyylikarbodi-imidin, bentsyyli-isopropyylikarbodi-imidin tai bentsyylietyylikarbodi-imidin läsnäollessa, 1-hydroksibentsotriatsolin läsnäollessa tai kondensaatiota N,N'-karbonyylidi-imidatsolin läsnäollessa.

42 9 5 5 7 7

Sakkaridi- tai sialiosan ja valinnaisesti keramiditähteen karboksiryhmien asylointi voidaan suorittaa tunnetulla tavalla, esimerkiksi asyloimalla asylointiin käytettävän hapon halogenidilla tai anhydridillä, edullisesti tertiaarisen emäksen, kuten pyridiinin tai kollidiinin läsnäollessa. Näin saadaan perasyloituja johdannaisia.

On myös mahdollista tämän keksinnön menetelmän määritelmän mukaisesti asyloida de-N-asetyyli-lysogangliosidi ja muodostaa uudelleen asetyyliaminoryhmä neuramiinihapossa asyloin-nin jälkeen. Tällainen asetylointi voidaan suorittaa samoin tunnetulla tavalla. Tässä tapauksessa valitaan suhteellisen miedot menetelmät N-asylointia varten, jossa neuramiinihapon hydroksiryhmä pysyy muuttumattomana. Tämän ryhmän asetylointi, joka suoritetaan asylointireaktion jälkeen sfingosiini-typessä, voidaan suorittaa käyttämällä erittäin tehokkaita menetelmiä, etenkin käyttämällä etikkahappoanhydridiä. Tämän menetelmän mukaisesti saaduissa yhdisteissä on mahdollista haluttaessa muuntaa N-asyyliryhmässä läsnä olevat funktiot toisiinsa. Esimerkiksi on mahdollista asyloida hydroksiryh-mät selektiivisesti jättämällä muut hydroksiryhmät koskemattomiksi, kuten sialiryhmät käyttämällä mietoja reagensseja ja olosuhteita.

On mahdollista eetteröidä hydroksi- tai merkaptoryhmät tai alkyloida aminoryhmät tai asyloidut aminoryhmät. Lopuksi kaikissa yhdisteissä, jotka saadaan menetelmien mukaisesti ja joissa on suolaksi muodostettavia ryhmiä, tällaiset ryhmät voidaan muodostaa suolaksi tunnetulla tavalla.

Keksintö käsittää myös uusien johdannaisten valmistusmenetelmän muunnelmat, joissa menetelmä katkaistaan jossakin vaiheessa tai joissa välituotteena saatavaa yhdistettä käytetään lähtöaineena ja suoritetaan puuttuvat vaiheet tai joissa lähtötuotteet muodostetaan in situ.

Tämän keksinnön kohteena ovat myös farmaseuttiset valmisteet, jotka sisältävät aktiivisena aineena yhtä tai useampaa a mu i nm f w» “ 95577 uutta N-asyyli-lysogangliosidijohdannaista ja etenkin yllä jo selitettyjä johdannaisia. Farmaseuttiset valmisteet voivat olla oraaliseen, rektaaliseen, parenteraaliseen, paikalliseen tai transdermaaliseen käyttöön tarkoitettuja valmisteita. Ne ovat siten kiinteiden tai puolikiinteiden aineiden muodossa, esimerkiksi pillereiden, tablettien, gelatiinikap-seleiden, kapseleiden, suppositorioiden tai pehmeiden gela-tiinikapseleiden muodossa. Parenteraaliseen käyttöön voidaan käyttää intramuskulaariseen, subkutaaniseen tai transdermaaliseen käyttöön tarkoitettuja muotoja tai infuusioon tai intravenoosiseen injektioon sopivia muotoja. Nämä valmisteet voivat siten olla aktiivisten yhdisteiden liuosten tai aktiivisten yhdisteiden jäädytyskuivatettujen jauheiden muodossa, jotka sekoitetaan yhden tai useamman farmaseuttisesti hyväksyttävän täyteaineen tai laimentimen kanssa, jotka sopivat näihin käyttötarkoituksiin ja joiden osmolaarisuus sopii yhteen fysiologisten nesteiden kanssa. Paikallisesti voidaan käyttää sumutemuotoja, esimerkiksi nenäsumutteita, tooppisesti voidaan käyttää voiteita tai salvoja ja trans-dermaalisesti voidaan käyttää erityisesti valmistettuja kiinnelaastareita.

Keksinnön mukaisia valmisteita voidaan antaa sekä ihmiselle että eläimille. Liuokset, sumutteet, salvat tai voiteet sisältävät edullisesti 0,01 - 10 paino-% aktiivista yhdistettä ja kiinteät valmistemuodot sisältävät 1 - 100 paino-% ja * etenkin 5-50 paino-% aktiivista yhdistettä. Annettavat an nokset riippuvat yksilöllisistä tarpeista, halutusta vaikutuksesta ja antotavasta. Päivittäiset annokset annettaessa uusia N-asyyli-lysogangliosidejä injektiolla ihmiselle (sub-kutaanisesti tai intramuskulaarisesti) tai transdermaalises-ti tai oraalisesti ovat 0,05 - 5 mg aktiivista ainetta/kg.

Seuraavat esimerkit 3 - 16 ja 18 - 32 havainnollistavat uusien keksinnön mukaisten johdannaisten valmistusta ja esimerkit 33 - 34 havainnollistavat farmaseuttisten valmisteiden valmistusta. Esimerkit 1, 2 ja 17 esittävät joidenkin keksinnön mukaiseen menetelmään tarvittavien lähtöaineiden k valmistusta.

44 95577

Esimerkki 1 de-N-asetyyli-lyso-GMi 10 g GM^itä liuotetaan 200 ml:aan 3N KOHrta ja hydrolysoidaan 72 tunnin ajan 90eC:ssa. Sitten liuos jäähdytetään ja saatetaan pH-arvoon 6,5 kloorivetyhapolla. Annetaan seistä 18 tunnin ajan 4eC:ssa ja sitten saostuneet rasvahapot eliminoidaan suodattamalla. Dialysoidaan vettä vastaan ja konsentroidaan 500 ml:aan ja saostetaan 5 Iraan diasetonia.

Tuote kuivatetaan ja suoritetaan piihappogeelitarkkuuskroma-tografia käyttämällä eluenttina kloroformin, metanolin ja 5N NH3:n seosta (55:45:10). Tuotteen sisältävät fraktiot kuivatetaan ja liuotetaan uudelleen veteen. Saatetaan pH-arvoon 10 0,01 N NaOHrlla ja dialysoidaan, konsentroidaan 100 mg:aan/ml ja saostetaan 5 tilavuusosaan asetonia. De-N-ase-tyyli-lyso-GMi:n saanto 5,7 g (70 % teoreettisesta).

Piihappogeelikromatografia käyttämällä liuottimena kloroformin, metanolin ja 5N NH3 :n seosta (55:45:10) osoittaa, että tuote on yhtenäinen yhdiste, Rf = 0,05 (GMi = 0,35).

Esimerkki 2 Lyso-GMi 10 g (6,37 mmoolia) GMi:tä liuotetaan 200 ml:aan 3N KOH:ta ja hydrolysoidaan 72 tunnin ajan 90*C:ssa.

• : Sitten liuos jäähdytetään ja saatetaan pH-arvoon 6,5 kloori vetyhapolla. Annetaan seistä 18 tunnin ajan 4*C:ssa ja sitten saostuneet rasvahapot eliminoidaan suodattamalla. Dialysoidaan vettä vastaan ja konsentroidaan 500 ml:aan ja saostetaan 5 Iraan asetonia.

Tuote, joka sisältää de-N-asetyyli-lysogangliosidejä ja de-N-asetyyli-gangliosidejä (20 %), tyhjökuivatetaan ja liuotetaan uudelleen 100 ml:aan dimetyyliformamidia. Tähän lisätään hitaasti 2,15 g (6,37 mmoolia) 9-fluorenyylimetyyliok-sikarbonyyli-N-hydroksisukkinimidiä, joka on liuotettu 20 * · 45 95577 ml:aan tetrahydrofuraania, ja sitten sen annetaan reagoida tunnin ajan huoneen lämpötilassa. Lopuksi lisätään 3 ml (31,85 mmoolia) etikkahappoanhydridiä ja 0,9 ml (63,7 mmoo-lia) trietyyliamiinia. 30 minuutin kuluttua lisätään 12,5 ml piperidiiniä suojaryhmän poistamiseksi. Annetaan reagoida 18 tunnin ajan huoneen lämpötilassa ja seostetaan 2 l:aan asetonia ja kuivatetaan. Näin saatu aine liuotetaan IM Na2C03:een ja pidetään 60eC:ssa tunnin ajan. Dialysoidaan, konsentroidaan 100 mg:aan/ml ja saostetaan 5 tilavuusosaan asetonia. Tuote, joka muodostuu lyso-GMi:stä (70 %) ja de-N-asetyyli-lyso-GMi:stä, ohjataan S. Sepharose-pylvään (H+-muoto) läpi, joka on tasapainotettu metanolissa. Eluoidaan metanolilla ja näin saadaan lyso-GMi eluoimalla Nl^Clrllä (10 mmoolia) metanolissa.

Tuotteen sisältävät fraktiot kuivatetaan ja liuotetaan uudelleen veteen. Saatetaan pH-arvoon 10 0,01N NaOH:lla ja dialysoidaan, konsentroidaan 100 mg:aan/ml ja saostetaan 5 tilavuusosaan asetonia. Tuotteen saanto: n. 5 g (60 % teoreettisesta) .

Piihappogeelikromatografia käyttämällä liuottimena kloroformin, metanolin ja 5N NH3:n seosta (55:45:10) osoittaa, että tuote on yhtenäinen, Rf 0,11.

Esimerkki 3 N-diklooriasetyyli-lyso-GMi 500 mg (0,38 mmoolia) lyso-GMi:tä (valmistettu esimerkin 2 mukaisesti) liuotetaan 1 ml:aan dimetyyliformamidin ja metanolin l:l-seosta oeC:ssa ja lisätään 528 pl (3,8 mmoolia) trietyyliamiinia ja 579 pl (3,8 mmoolia) dikloorietikkahap-poanhydridiä ja annetaan reagoida huoneen lämpötilassa 72 tunnin ajan. Saostetaan 20 tilavuusosaan etyyliasetaattia, suodatetaan ja kuivatetaan. Tuote puhdistetaan sitten pii-happogeelikromatografialla käyttämällä eluenttina kloroformin, metanolin ja veden seosta (60:35:8).

Puhtaat fraktiot yhdistetään, haihdutetaan, kerätään IN Na2C03:lla, dialysoidaan tislattua vettä vastaan ja konsen- 46 9 5 5 7 7 troidaan sitten 5 ml:aan ja saostetaan 50 ml:aan diasetonia.

Tuotteen saanto: 423 mg (78,0 % teoreettisesta).

Piihappogeelikromatografia käyttämällä liuottimena kloroformin, metanolin ja CaCl2:n (0,2 %) seosta (50:42:11) osoittaa, että tuote on yhtenäinen yhdiste, jonka Rf = 0,35 (GM^ = 0,43, lyso-GMi = 0,24).

Esimerkki 4 N-monoklooriasetyyli-lyso-GMi 500 mg (0,38 mmoolia) lyso-GMi:tä (valmistettu esimerkin 2 mukaisesti) liuotetaan 1 ml:aan dimetyyliformamidin ja metanolin l:l-seosta ja sitten lisätään 0eC:ssa 528 μΐ (3,8 mmoolia) trietyyliamiinia ja 649,7 mg (3,8 mmoolia) mono-kloorietikkahappoanhydridiä, ja seoksen annetaan reagoida huoneen lämpötilassa 72 tunnin ajan. Saostetaan 20 tilavuus-osaan etyyliasetaattia, suodatetaan ja kuivatetaan.

Tuote puhdistetaan sitten piihappogeelikromatografialla käyttämällä eluenttina kloroformin, metanolin ja veden seosta (60:35:8).

Puhtaat fraktiot yhdistetään, haihdutetaan, kerätään IN Na2C03:lla, dialysoidaan tislattua vettä vastaan ja konsentroidaan sitten 5 ml:aan ja saostetaan 50 ml:aan asetonia.

.: Tuotteen saanto: 391 mg (74,0 % teoreettisesta).

Piihappogeelikromatografia käyttämällä liuottimena kloroformin, metanolin ja CaCl2:n (0,2 %) seosta (50:42:11) osoittaa, että tuote on yhtenäinen yhdiste, jonka Rf = 0,30 (GM^ = 0,43, lyso-GMi = 0,24).

Esimerkki 5 N-monofluoriasetyyli-lyso-GMi 500 mg (0,38 mmoolia) lyso-GMi:tä (valmistettu esimerkin 2 mukaisesti) liuotetaan 2,5 ml:aan dimetyyliformamidia ja tä- •.

47 95577 hän lisätään 528 μΐ (3,8 nunoolia) trietyyliamiinia, 193 mg (3,8 mmoolia) fluorietikkahapponatriumsuolaa ja 194,2 mg (0,76 mmoolia) l-metyyli-2-klooripyridiinijodidia liuotettuna 2,5 ml:aan dimetyyliformamidia.

Annetaan reagoida 18 tunnin ajan huoneen lämpötilassa ja sitten saostetaan 50 ml:aan etyyliasetaattia, joka on kyllästetty vedellä. Kuivatetaan ja suoritetaan piihappogeelik-romatografia käyttämällä eluenttina kloroformin, metanolin ja veden seosta (60:35:8).

Puhtaat fraktiot yhdistetään, haihdutetaan, kerätään IN Na2C03:lla, dialysoidaan tislattua vettä vastaan ja konsentroidaan sitten 5 ml:aan ja saostetaan 50 ml:aan asetonia.

Tuotteen saanto: 481 mg (92 % teoreettisesta).

Piihappogeelikromatografia käyttämällä liuottimena kloroformin, metanolin ja CaCl2:n (0,3 %) seosta (50:42:11) osoittaa, että tuote on yhtenäinen yhdiste, jonka Rf = 0,33 (GMi = 0,43, lyso-GMi = 0,24).

Esimerkki 6 N-difluoriasetyyli-lyso-GMi 500 mg (0,38 mmoolia) lyso-GMi:tä (valmistettu esimerkin 2 mukaisesti) liuotetaan 2,5 ml:aan dimetyyliformamidia ja tähän lisätään 528 μΐ (3,8 mmoolia) trietyyliamiinia, 243 μΐ : (3,8 mmoolia) difluorietikkahappoa ja 194,2 mg (0,76 mmoo lia) l-metyyli-2-klooripyridiinijodidia liuotettuna 2,5 ml:aan dimetyyliformamidia.

Annetaan reagoida 18 tunnin ajan huoneen lämpötilassa ja sitten saostetaan 50 ml:aan etyyliasetaattia, joka on kyllästetty vedellä. Kuivatetaan ja suoritetaan piihappogeelikromatografia käyttämällä eluenttina kloroformin, metanolin ja veden seosta (60:35:8).

Puhtaat fraktiot yhdistetään, haihdutetaan, kerätään IN Na2C03:lla, dialysoidaan tislattua vettä vastaan ja konsen-.. troidaan sitten 5 ml:aan ja saostetaan 50 ml:aan asetonia.

« 95577

Tuotteen saanto: 365 mg (84 % teoreettisesta).

Piihappogeelikromatografia käyttämällä liuottimena kloroformin, metanolin ja CaCl2:n (0,3 %) seosta (50:42:11) osoittaa, että tuote on yhtenäinen yhdiste, jonka Rf = 0,35 (GM^ = 0,43, lyso-GMx = 0,24) .

Esimerkki 7 N-metoksiasetyyli-lyso-GMi 500 mg (0,38 mmoolia) lyso-GMi:tä (valmistettu esimerkin 2 mukaisesti) liuotetaan 2,5 ml:aan dimetyyliformamidia ja tähän lisätään 161 yl (1,14 mmoolia) trietyyliamiinia, 293 μΐ (3,8 mmoolia) metoksietikkahappoa ja 194,2 mg (0,76 mmoolia) l-metyyli-2-klooripyridiinijodidia liuotettuna 2,5 ml:aan dimetyyliformamidia.

Annetaan reagoida 18 tunnin ajan huoneen lämpötilassa ja sitten seostetaan 50 ml:aan etyyliasetaattia, joka on kyllästetty vedellä. Kuivatetaan ja suoritetaan piihappogeelikromatografia käyttämällä eluenttina kloroformin, metanolin ja veden seosta (60:35:8).

Puhtaat fraktiot yhdistetään, haihdutetaan, kerätään IN Na2C03:lla, dialysoidaan tislattua vettä vastaan ja konsentroidaan sitten 5 ml:aan ja seostetaan 50 ml:aan asetonia.

Tuotteen saanto: 325 mg (74 % teoreettisesta).

Piihappogeelikromatografia käyttämällä liuottimena kloroformin, metanolin ja CaCl2:n (0,3 %) seosta (50:42:11) osoittaa, että tuote on yhtenäinen yhdiste, jonka Rf = 0,36 (GM]_ = 0,43, lyso-GM], = 0,24).

Esimerkki 8 N-(3-dietyyliaminopropionyyli)-lyso-GM^ 500 mg (0,38 mmoolia) lyso-GMi:tä (valmistettu esimerkin 2 mukaisesti) liuotetaan 2,5 ml:aan dimetyyliformamidia ja tähän lisätään huoneen lämpötilassa 528 μΐ (3,8 mmoolia) tri- 49 95577 etyyliamiinia, 350 mg (1,9 mmoolia) 3-dietyyliaminopropioni-happoa ja 194,2 mg (0,76 mmoolia) l-metyyli-2-klooripyridii-nijodidia liuotettuna 2,5 mitään dimetyyliformamidia.

Seoksen annetaan reagoida .18 tunnin ajan huoneen lämpötilassa ja sitten saostetaan 100 mitään asetonia. Suodatetaan ja kuivatetaan. Tuote puhdistetaan sitten piihappogeelikroma-tografiällä käyttämällä eluenttina kloroformin, metanolin ja veden seosta (60t35:8).

Puhtaat fraktiot yhdistetään, haihdutetaan, kerätään IN Na2CC>3illa, dialysoidaan tislattua vettä vastaan ja konsentroidaan sitten 5 ml:aan ja saostetaan 50 ml:aan asetonia.

Tuotteen saanto: 411 mg (75 % teoreettisesta).

Piihappogeelikromatografia käyttämällä liuottimena kloroformin, metanolin ja CaCl2:n (0,3 %) seosta (50:42:11) osoittaa, että tuote on yhtenäinen yhdiste, jonka Rf = 0,22 (GMi = 0,43, lyso-GMi = 0,24).

Esimerkki 9 N-trifluoriasetyyli-lyso-GMi 500 mg (0,38 mmoolia) lyso-GMi:tä (valmistettu esimerkin 2 mukaisesti) liuotetaan 1 ml:aan dimetyyliformamidin ja metanolin l:l-seosta ja tähän lisätään 0*C:ssa 161 μΐ (1,14 mmoolia) trietyyliamiinia ja 161 μΐ (1,14 mmoolia) trifluo- « “ rietikkahappoanhydridiä ja seoksen annetaan reagoida huoneen lämpötilassa 72 tunnin ajan. Saostetaan 20 tilavuusosaan etyyliasetaattia, suodatetaan ja kuivatetaan.

Tuote puhdistetaan sitten piihappogeelikromatografialla käyttämällä eluenttina kloroformin, metanolin ja veden seosta (60:35:8).

Puhtaat fraktiot yhdistetään, haihdutetaan, kerätään IN Na2CC>3:lla, dialysoidaan tislattua vettä vastaan ja konsentroidaan sitten 5 ml:aan ja saostetaan 50 ml:aan asetonia.

•« so 95577 '

Tuotteen saanto: 292 mg (55,0 % teoreettisesta).

Piihappogeelikromatografia käyttämällä liuottimena kloroformin, metanolin ja CaCl2:n (0,3 %) seosta (50:42:11) osoittaa, että tuote on yhtenäinen yhdiste, jonka Rf =0,37 (GMi = 0,43, lyso-GMi = 0,24).

Esimerkki 10 N-triklooriasetyyli-lyso-GMi 500 mg (0,38 mmoolia) lyso-GM]_:tä (valmistettu esimerkin 2 mukaisesti) liuotetaan 1 ml:aan dimetyyliformamidin ja metanolin l:l-seosta ja tähän lisätään 0eC:ssa 528 μΐ (3,8 mmoolia) trietyyliamiinia ja 352 mg (1,14 mmoolia) trikloori-etikkahappoanhydridiä ja seoksen annetaan reagoida huoneen lämpötilassa 72 tunnin ajan. Seostetaan 20 tilavuusosaan etyyliasetaattia, suodatetaan ja kuivatetaan.

Tuote puhdistetaan sitten piihappogeelikromatografialla käyttämällä eluenttina kloroformin, metanolin ja veden seosta (60:35:8).

Puhtaat fraktiot yhdistetään, haihdutetaan, kerätään IN Na2C03:lla, dialysoidaan tislattua vettä vastaan ja konsentroidaan sitten 5 ml:aan ja seostetaan 50 ml:aan asetonia.

Tuotteen saanto: 358 mg (65,0 % teoreettisesta).

: Piihappogeelikromatografia käyttämällä liuottimena klorofor min, metanolin ja CaCl2:n (0,3 %) seosta (50:42:11) osoittaa, että tuote on yhtenäinen yhdiste, jonka Rf = 0,37 (GMx = 0,43, lyso-GMi 0,24).

Esimerkki 11 N-syanoasetyyli-lyso-GMi 500 mg (0,38 mmoolia) lyso-GMi:tä (valmistettu esimerkin 2 mukaisesti) liuotetaan 2,5 ml:aan dimetyyliformamidia ja tähän lisätään 0eC:ssa 106 μΐ (0,76 mmoolia) trietyyliamiinia ja syanoetikkahappoanhydridiä, joka on valmistettu välittö- 51 95577 mästi ennen käyttöä saattamalla reagoimaan 620 mg (7,6 mmoo-lia) syanoetikkahappoa ja 9,39 (9,12 mmoolia) disykloheksyy-likarbodi-imidiä liuotettuna 20 mitään tetrahydrofuraania ja 2 tunnin kuluttua suodattamalla muodostunut disyklohek-syyliurea.

Kondensaatioreaktio suoritetaan 0*C:ssa 18 tunnin kuluessa sekoittaen. Kun reaktio on päättynyt, liuos konsentroidaan 1 mitään, seostetaan 10 mitään asetonia ja tyhjökuivatetaan.

Tuote puhdistetaan sitten piihappogeelikromatografialla käyttämällä eluenttina kloroformin, metanolin ja veden seosta (60:35:8).

Puhtaat fraktiot yhdistetään, haihdutetaan, kerätään IN Na2C03tlla, dialysoidaan tislattua vettä vastaan ja konsentroidaan sitten 5 mitään ja seostetaan 50 mitään asetonia.

Tuotteen saanto: 273 mg (52 % teoreettisesta).

Piihappogeelikromatografia käyttämällä liuottimena kloroformin, metanolin ja CaCl2:n (0,3 %) seosta (50:42:11) osoittaa, että tuote on yhtenäinen yhdiste, jonka Rf * 0,40 (GMx * 0,43, lyso-GMi = 0,24).

Esimerkki 12 N-maleyyli-lyso-GMi i 500 mg (0,38 mmoolia) lyso-GM^tta (valmistettu esimerkin 2 mukaisesti) liuotetaan 1 mitään dimetyyliformamidia ja tähän lisätään 53,6 μΐ (0,38 mmoolia) trietyyliamiinia ja 37 mg (0,38 mmoolia) maleiinihappoanhydridiä ja annetaan reagoida huoneen lämpötilassa 72 tunnin ajan. Saostetaan 20 tilavuus-osaan etyyliasetaattia, suodatetaan ja kuivatetaan.

Tuote puhdistetaan sitten piihappogeelikromatografialla käyttämällä eluenttina kloroformin, metanolin ja veden seosta (60:35:8).

Puhtaat fraktiot yhdistetään, haihdutetaan, kerätään IN Na2CC>3:lla, dialysoidaan tislattua vettä vastaan ja konsen- i 52 95577 troidaan sitten 5 ml:aan ja seostetaan 25 ml:aan asetonia.

Tuotteen saanto: 492 mg (85 % teoreettisesta).

Piihappogeelikromatografia käyttämällä liuottimena kloroformin, metanolin ja CaCl2:n (0,3 %) seosta (50:42:11) osoittaa, että tuote on yhtenäinen yhdiste, jonka Rf = 0,27 (GM! = 0,43, lyso-GM! = 0,24).

Esimerkki 13 N-hydroksiasetyyli-lyso-GMi 500 mg (0,38 mmoolia) lyso-GM!:tä (valmistettu esimerkin 2 mukaisesti) liuotetaan 2,5 ml:aan dimetyyliformamidia ja tähän lisätään 0®C:ssa 106 μΐ (1,14 mmoolia) trietyyliamiinia ja glykolihappoanhydridiä, joka on valmistettu välittömästi ennen käyttöä saattamalla reagoimaan 173 mg (2,28 mmoolia) glykolihappoa ja 939 mg (9,12 mmoolia) disykloheksyylikarbo-di-imidiä liuotettuna 20 ml:aan tetrahydrofuraania ja suodattamalla 2 tunnin kuluttua muodostunut disykloheksyyli-urea.

Kondensaatioreaktio suoritetaan 0eC:ssa 18 tunnin kuluessa sekoittaen. Kun reaktio on päättynyt, liuos konsentroidaan 1 ml:aan, seostetaan 10 ml:aan asetonia ja tyhjökuivatetaan.

Tuote puhdistetaan sitten piihappogeelikromatografialla käyttämällä eluenttina kloroformin, metanolin ja veden seos-: ta (60:35:8).

Puhtaat fraktiot yhdistetään, haihdutetaan, kerätään IN Na2CC>3:lla, dialysoidaan tislattua vettä vastaan ja konsentroidaan sitten 5 ml:aan ja seostetaan 50 ml:aan asetonia.

: Tuotteen saanto: 261 mg (50 % teoreettisesta).

Piihappogeelikromatografia käyttämällä liuottimena kloroformin, metanolin ja CaCl2:n (0,3 %) seosta (50:42:11) osoittaa, että tuote on yhtenäinen yhdiste, jonka Rf 0,33 (GM! = 0,43, lyso-GMi = 0,24).

Esimerkki 14 N-tribromiasetyyli-lyso-GMi 95577 500 mg (0,38 mmoolia) lyso-GMi:tä (valmistettu esimerkin 2 mukaisesti) liuotetaan 2,5 ml:aan dimetyyliformamidin ja me-tanolin l:l-seosta ja tähän lisätään 0*C:ssa 528 yl (3,8 mmoolia) trietyyliamiinia ja tribromietikkahappoanhydridiä, joka on valmistettu välittömästi ennen käyttöä saattamalla reagoimaan 2,25 g (7,6 mmoolia) tribromietikkahappoa ja 939 mg (9,12 mmoolia) disykloheksyylikarbodi-lmidiä liuotettuna 20 ml:aan tetrahydrofuraania ja suodattamalla 2 tunnin kuluttua muodostunut disykloheksyyliurea.

Kondensaatioreaktio suoritetaan 0*C:ssa 18 tunnin kuluessa sekoittaen. Kun reaktio on päättynyt, liuos konsentroidaan 1 ml:aan, seostetaan 10 ml:aan asetonia ja tyhjökuivatetaan.

Tuote puhdistetaan sitten piihappogeelikromatografialla käyttämällä eluenttina kloroformin, metanolin ja veden seosta (60:35:8).

Puhtaat fraktiot yhdistetään, haihdutetaan, kerätään IN Na2C03:lla, dialysoidaan tislattua vettä vastaan ja konsentroidaan sitten 5 ml:aan ja seostetaan 50 ml:aan asetonia.

Tuotteen saanto: 267 mg (44 % teoreettisesta).

Piihappogeelikromatografia käyttämällä liuottimena kloroformi min, metanolin ja CaCl2:n (0,3 %) seosta (50:42:11) osoit taa, että tuote on yhtenäinen yhdiste, jonka Rf = 0,37 (GMi = 0,43, lyso-GMi = 0,24).

Esimerkki 15 N-(12-hydroksistearoyyli)-lyso-GMi 500 mg (0,37 mmoolia) de-N-asetyyli-lyso-GMi:tä (valmistettu esimerkin 1 mukaisesti) liuotetaan 5 ml:aan dimetyyliforma-midia ja tähän lisätään 1 ml Triton X 100:a ja 104 μΐ (0,75 mmoolia) trietyyliamiinia. Sekoitetaan, kunnes muodostuu kirkas liuos. Tähän lisätään 25 ml tetrahydrofuraania, joka « 54 9 5 5 7 7 sisältää 598 mg (1,5 mmoolia) N-hydroksisukkinimidin 12-hyd-roksisteariinihapon kanssa muodostettua esteriä, joka on valmistettu siten, että 870 mg hydroksisteariinihappoa, joka on liuotettu 15 mitään vedetöntä tetrahydrofuraania, ja 10,5 mg di-(N-sukkinimidyyli)karbonaattia.ja 550 yl trietyyli-amiinia saatetaan reagoimaan 40 mltssa asetonia 18 tunnin ajaksi huoneen lämpötilassa.

Reaktio suoritetaan 24 tunnin kuluessa huoneen lämpötilassa ja lopuksi liuos konsentroidaan ja seostetaan toistuvasti etyyliasetaattiin. Raakatuote puhdistetaan piihappogeelikro-matografiällä käyttämällä eluenttina kloroformin, metanolin ja veden seosta (60:30:6).

Näin saatu välituote, de-Ni-asetyyli-^-(,12-hydroksistea-royyli)-lyso-GMi N-asetyloidaan sitten etikkahappoanhydri-dillä liuotettuna kloroformin ja metanolin l:l-seokseen moo-lisuhteessa 1:1:1.

Kun reaktio on päättynyt, tuote kuivatetaan, kerätään 2 ml:11a kloroformin ja metanolin l:l-seosta ja saostetaan 10 ml:aan asetonia.

Tuote puhdistetaan sitten edelleen piihappogeelikromatogra-fiällä käyttämällä liuottimena kloroformin, metanolin ja veden seosta (60:35:8). Puhtaat fraktiot yhdistetään, haihdutetaan, kerätään IN Na2C03:lla, dialysoidaan tislattua vettä vastaan ja konsentroidaan sitten 5 ml:aan ja saostetaan 50 ml:aan asetonia.

N-(12-hydroksistearoyyli)-lyso-GMi:n saanto = 217 mg (34,5 % teoreettisesta).

Piihappogeelikromatografia käyttämällä liuottimena kloroformin, metanolin ja kalsiumkloridin (0,3%:ista) seosta (60:35:8) osoittaa, että tuote on yhtenäinen yhdiste, jonka Rf = 0,39 (de-N-asetyyli-lyso-GMi = 0,05, de-N-asetyyli-GMi = 0,20, GMX = 0,40).

Esimerkki 16 N-(3-klooripivaloyyli)-lyso-GMi 55 95577 500 mg (0,38 mmoolia) lyso-GMi:tä (valmistettu esimerkin 2 mukaisesti) liuotetaan 1 ml:aan dimetyyliformamidin ja meta- . nolin l:l-seosta ja tähän lisätään huoneen lämpötilassa 1,160 μΐ (7,6 mmoolia) trietyyliamiinia ja 990 yl (7,6 mmoolia) 3-klooripivaloyylikloridia.

Kondensaatioreaktio suoritetaan huoneen lämpötilassa 4 tunnin kuluessa. Kun reaktio on päättynyt, liuos saostetaan 10 ml:aan vedellä kyllästettyä etyyliasetaattia, suodatetaan ja tyhj ökuivatetaan.

Tuote puhdistetaan sitten piihappogeelikromatografialla käyttämällä eluenttina kloroformin, metanolin ja veden seosta (60:35:8).

Puhtaat fraktiot yhdistetään, haihdutetaan, kerätään IN Na2CC>3:lla, dialysoidaan tislattua vettä vastaan ja konsentroidaan sitten 5 ml:aan ja saostetaan 50 ml:aan asetonia.

Tuotteen saanto: 404 mg (74 % teoreettisesta).

Piihappogeelikromatografia käyttämällä liuottimena kloroformin, metanolin ja CaCl2Jn (0,3%:ista) seosta (50:42:11) osoittaa, että tuote on yhtenäinen yhdiste, jonka Rf = 0,33 (GMx = 0,43, lyso-GMi =0,24).

• ·

Esimerkki 17

Gangliosidiseoksen (GA) valmistus uuttamalla naudan aivokudoksesta

Naudan aivokuoren määrä homogenisoidaan fosfaattipuskurissa pH-arvossa 6. Lisätään 6 tilavuusosaa tetrahydrofuraania ja muodostunut seos sentrifugoidaan. Supernatantti uutetaan uudelleen 2 kertaa tetrahydrofuraanilla. Sentrifugoinnin jälkeen ei-polaariset aineet poistetaan jakamalla etyylieette-rillä ja tetrahydrofuraani-vesifaasi johdetaan ioninvaihto-pylvääseen, joka on tasapainotettu 50 %:lla etanolia. Ba- • · l 56 95577 riumhydroksidia lisätään pylväästä tulevaan aineeseen yhdessä jääkylmän etanolin (4 tilavuusosaa) kanssa. Annetaan olla 18 tunnin ajan kylmissä olosuhteisssa, sitten kerätään sakka, joka tehdään sitten hieman happamaksi kloorivetyhapolla sen jälkeen, kun se on liuotettu veteen. Näin saatu liuos dialysoidaan ja jäädytyskuivatetaan. Saanto on tässä kohdassa n. 0,6 mg raakojen gangliosidien seosta/g käytettyä aivo-kudosta. Jäädytyskuivatettu jauhe dispergoidaan 20 tilavuus-osaan kloroformin ja metanolin 2:l-seosta. Kun saatu liuos on suodatettu täysin kirkkaaksi, se jaetaan lisäämällä 0,2 tilavuusosaa kaliumkloridin vesiliuosta (0,88%:ista). Ylempi faasi erotetaan, dialysoidaan ja jäädytyskuivatetaan. Lopullinen saanto on n. 0,3 mg puhdistettua gangliosidisuolojen seosta/g aivokudosta. Saatu gangliosidiseos voidaan fraktioida erilaisiin osiin, jotka ovat puhtaita gangliosidejä (kuten yllä on esitetty), käyttämällä piihappopylväitä ja eluoimalla metanolin ja kloroformin seoksilla. Keskimäärin saadussa koostumuksessa on n. 40 % gangliosidiä Goia, 21 % gangliosidiä GM^, 19 % gangliosidiä G-rib ja 16 % gangliosidiä G^ib·

Esimerkki 18

Lysogangliosidien seoksen N-diklooriasetyyli-johdannaiset 1) Lysogangliosidien valmistus 10 g esimerkin 17 mukaisesti valmistettua gangliosidiseosta : liuotetaan 200 ml:aan 3N KOH:ta ja hydrolysoidaan 72 tunnin ajan 90eC:ssa. Sitten liuos jäähdytetään ja saatetaan pH-arvoon 6,5 kloorivetyhapolla. Annetaan seistä 18 tunnin ajan 4eC:ssa ja sitten saostuneet rasvahapot eliminoidaan suodattamalla. Dialysoidaan vettä vastaan ja konsentroidaan 500 ml:aan ja seostetaan 5 l:aan asetonia.

Tuote, joka sisältää de-N-asetyyli-lysogangliosidejä ja de-N-asetyyli-gangliosidejä (20 %), tyhjökuivatetaan ja liuotetaan sitten uudelleen 100 ml:aan dimetyyliformamidia. Tähän lisätään hitaasti 2,15 g (6,37 mmoolia) 9-fluorenyylimetyy- : at» » «itu i-i t «a s? 95577 lioksikarbonyyli-N-hydroksisukkinimidiä, joka on liuotettu 20 ml:aan tetrahydrofuraania, ja sitten annetaan reagoida tunnin ajan huoneen lämpötilassa. Lopuksi tähän lisätään 3 ml (31,85 mmoolia) etikkahappoanhydridiä ja 0,9 ml (63,7 mmoolia) tr-ietyyliamiinia. 30 minuutin kuluttua lisätään 12,5 ml piperidiiniä suojaryhmän poistamiseksi. Annetaan reagoida 18 tunnin ajan huoneen lämpötilassa ja seostetaan 2 Iraan asetonia ja kuivatetaan. Näin saatu aine liuotetaan IM Na2C03:een ja pidetään 60eC:ssa tunnin ajan. Dialysoidaan, konsentroidaan 100 mg:aan/ml ja seostetaan 5 tilavuusosaan asetonia. Tuote, joka muodostuu lysogangliosideistä (70 %) ja de-N-asetyyli-lysogangliosideistä, ohjataan S-Sepharose-pylvään (H+-muoto) läpi, joka on tasapainotettu metanolissa. De-N-asetyyli-lysogangliosidit eluoidaan metanolilla ja ly-sogangliosidit eluoimalla Nigelillä (10 mmoolia) metanolissa.

Tuotteen sisältävät fraktiot kuivatetaan ja liuotetaan uudelleen veteen. Saatetaan pH-arvoon 10 0,01N NaOHtlla ja dialysoidaan, konsentroidaan 100 mg:aan/ml ja seostetaan 5 tilavuusosaan asetonia. Saanto: 4,7 g (55 % teoreettisesta).

2) Diklooriasetyylijohdannaisen valmistus 500 mg (0,31 mmoolia) ennalta valmistettua lysogangliosidi-seosta liuotetaan 1 ml:aan dimetyyliformamidin ja metanolin l:l-seosta ja 0eC:ssa lisätään 430 μΐ (3,1 mmoolia) trietyy-'· liamiinia ja 472 μΐ (3,1 mmoolia) dikloorietikkahappoanhyd- ridiä. Suodatetaan ja kuivatetaan.

Asyloitu tuote erotetaan reagoimattomasta yhdisteestä kroma-tografoimalla S-Sepharose-pylväässä (H+-muoto), joka on tasapainotettu metanolissa. Diklooriasetyylijohdannainen • eluoidaan metanolissa, kuivatetaan, kerätään IN Na2C03:lla, dialysoidaan, konsentroidaan 2,5 ml:aan ja seostetaan 25 ml:aan asetonia.

Tuotteen saanto: 345 mg (64 % teoreettisesta).

Esimerkki 19 N-metoksiasetyyli-lyso-GMi:n metyyliesterl 58 9 5 5 7 7 500 mg (0,36 mmoolia) N-metoksiasetyyli-lyso-GMi-natriumsuo-laa (valmistettu esimerkin 7 mukaisesti) liuotetaan 5 ml:aan N-metyylipyrrolidonia ja tähän lisätään 44,5 pl (0,72 mmoolia) metyylijodidia.

Annetaan reagoida 3 tunnin ajan huoneen lämpötilassa, seostetaan etyyliasetaattiin, suodatetaan ja tyhjökuivatetaan.

Tuote puhdistetaan sitten piihappogeelikromatografialla käyttämällä eluenttina kloroformin, metanolin ja veden seosta (60:30:6).

Puhtaat fraktiot yhdistetään, haihdutetaan, liuotetaan uudelleen 2,5 ml:aan kloroformin ja metanolin l:l-seosta ja seostetaan 25 ml:aan asetonia.

Tuotteen saanto: 457 mg (74 % teoreettisesta).

Piihappogeelikromatografia käyttämällä liuottimena kloroformin, metanolin ja CaCl2:n (0,3%:ista) seosta (50:42:11) osoittaa, että tuote on yhtenäinen yhdiste, jonka Rf = 0,4 (N-metoksiasetyyli-lyso-GMi = 0,36).

Esimerkki 20 N-metoksiasetyyli-lyso-GMi:n sisäinen esteri • i 500 mg (0,36 mmoolia) N-metoksiasetyyli-lyso-GMi-natriumsuo-laa (valmistettu esimerkin 7 mukaisesti) liuotetaan 5 ml:aan N-metyylipyrrolidonia 4°C:ssa ja saatetaan reagoimaan trie-tyyliamiinin (55 μΐ, 0,4 mmoolia) ja l-metyyli-2-klooripyri-diinijodidin (100 mg, 0,41 mmoolia) kanssa.

.> ·

Reaktio suoritetaan 4 tunnin kuluessa kvantitatiivisella saannolla. Tuote seostetaan lisäämällä 50 ml asetonia, sitten se suodatetaan ja kerätään 5 ml:11a kloroformin ja iso-propyylin l:l-seosta ja sitten se saostetaan uudelleen 25 ml:aan asetonia.

* »•4 s* 95577

Tuotteen saanto: 483 mg (98 % teoreettisesta).

Piihappogeelikromatografia käyttämällä liuottimena kloroformin, metanolin ja CaCl2:n (0,3%:ista) seosta (50:42:11) osoittaa, että tuote on yhtenäinen yhdiste, jonka Rf * 0,43 (N-metoksiasetyyli-lyso-GM2 = 0,36).

Esimerkki 21 N-metoksiasetyyli-lyso-GMi:n 2-butyyliamidi 500 mg (0,36 mmoolia) N-metoksiasetyyli-lyso-GMi:n metyyli-esteriä liuotetaan 5 ml:aan pyridiiniä ja tähän lisätään 2,5 ml 2-butyyliamiinia. Annetaan reagoida 72 tunnin ajan huoneen lämpötilassa, minkä jälkeen kuivatetaan kiertohaihdut-timessa, kerätään 5 ml:11a kloroformin ja metanolin lyseosta ja seostetaan 25 ml:aan asetonia, sitten suodatetaan ja tyhjökuivatetaan. Tuote puhdistetaan sitten piihappogee-likromatografialla käyttämällä eluenttina kloroformin, metanolin ja veden seosta (60:25:4).

Puhtaat fraktiot yhdistetään, kerätään, liuotetaan uudelleen 2,5 ml:aan kloroformin ja metanolin l:l-seosta ja saostetaan 25 ml:aan asetonia.

Tuotteen saanto: 371 mg (72 % teoreettisesta).

Piihappogeelikromatografia käyttämällä liuottimena klorofor-. min, metanolin ja CaCl2:n (0,3%:ista) seosta (50:42:11) osoittaa, että tuote on yhtenäinen yhdiste, jonka Rf * 0,48 (N-metoksiasetyyli-lyso-GMi:n metyyliesteri = 0,4).

Esimerkki 22

Metoksiasetyyli-lyso-GMi:n metyyliesterin perasetylaatti 500 mg (0,36 mmoolia) N-metoksiasetyyli-lyso-GMi:n metyyli-esteriä liuotetaan 5 ml:aan pyridiiniä ja tähän lisätään 2,5 ml juuri tislattua etikkahappoanhydridiä ja seosta sekoitetaan 72 tunnin ajan huoneen lämpötilassa. Kun reaktio on päättynyt, liuos haihdutetaan kiertohaihduttimella ja jäännös jaetaan jääkylmän veden (10 ml) ja etyyliasetaatin (10 - · · 60 95577 ml) välillä. Etyyliasetaatti pestään kylmällä IM HCl:llä, vedellä ja Na2C03:n lM-liuoksella. Orgaaniset faasit kuivatetaan natriumsulfaatilla, haihdutetaan ja jäännös puhdistetaan piihappogeelikromatografialla käyttämällä kloroformin, etyyliasetaatin ja isopropanolin seosta (70:30:45).

Puhtaat fraktiot yhdistetään, kerätään, liuotetaan uudelleen 5 ml:aan etyyliesteriä ja seostetaan 25 ml:aan n-heksaania.

Tuotteen saanto: 450 mg (61 % teoreettisesta).

Piihappogeelikromatografia käyttämällä liuottimena kloroformin, metanolin ja etyyliasetaatin seosta (70:10:30) ja etyylin ja isopropanolin (95:5) asetaattia osoittaa, että tuote on yhtenäinen, Rf * 0,45 ja vastaavasti 0,26.

Esimerkki 23

Lysogangliosidien seoksen N-diklooriasetyylijohdannaisten sisäiset esterit 500 mg (0,29 mmoolia) lysogangliosidien seoksen N-dikloori-asetyylijohdannaisia (natriumsuola, esimerkki 18) liuotetaan 5 ml:aan N-metyylipyrrolidonia 4°C:ssa ja saatetaan reagoimaan trietyyliamiinin (44,5 μΐ, 0,32 mmoolia) ja 1-metyyli-2-klooripyridiinijodidin (82,2 mg, 0,32 mmoolia) kanssa. Reaktio suoritetaan 4 tunnin kuluessa 4*C:ssa kvantitatiivisella saannolla. Tuote seostetaan, lisätään 50 ml | asetonia, suodatetaan, kerätään 5 ml:11a dikloorimetaanin ja isopropanolin l:l-seosta ja seostetaan sitten uudelleen 25 ml:aan asetonia.

Tuotteen saanto: 457 mg.

Sisäisten estereiden läsnäolo vahvistetaan infrapunaspektro-skopialla ja ohutkerroskromatografiällä. KBr-palloilla suoritettu IR-spektroskopia osoittaa tyypillisen esterikaistan 1750 cm_1:ssä.

Piihappogeelikromatografia käyttämällä liuottimena kloroformin, metanolin ja CaCl2:n (0,3%:ista) seosta (50:42:11) fil 95577 O 1 osoittaa tuotteen Rf-arvoksi 0,43 - 0,60. Saatujen tuotteiden Rf-arvo on korkeampi kuin lähtöyhdisteiden seoksen (<0,35).

Kromatografia osoittaa siten alkutuotteen täydellisen puuttumisen. Käsittely 0,1N Na2C03:lla 60eC:ssa tunnin ajan saa aikaan esterisidosten hydrolysoitumisen, jolloin saadaan gangliosidijohdannaisten alkuperäinen seos.

Esimerkki 24

Lysogangliosidien seoksen N-diklooriasetyylijohdannaisten metyyliesterit 500 mg (0,30 mmoolia) lysogangliosidien seoksen N-dikloori-asetyylijohdannaisten sisäisten estereiden seosta (esimerkki 23) liuotetaan 20 ml:aan metyleenin ja metanolikloridin vedetöntä 4:l-seosta.

Tähän liuokseen lisätään 32,4 mg (0,60 mmoolia) natriummety-laattia, joka on liuotettu 5 ml:aan vedetöntä metanolia, ja seosta kuumennetaan palautusjäähdyttäen 2 tunnin ajan. Kun reaktio on päättynyt, seos neutraloidaan vedettömällä Dowex AG 50x8-hartsilla (H+-muoto), hartsi erotetaan suodattamalla ja pestään metanolilla ja liuos haihdutetaan kuiviin. Jäännös kerätään 5 ml:aan metyleenin ja metanolikloridin lyseosta ja reaktiotuote saostetaan kaatamalla se 25 ml:aan asetonia. Raakatuote puhdistetaan sitten kromatografoimalla Sephadex-DEAE A-25:llä (asetaattimuoto) käyttämällä liuottimena kloroformin, metanolin ja veden 30:60:8-seosta. Neutraalit fraktiot kerätään, haihdutetaan, dialysoidaan vedessä ja haihdutetaan kuiviin. Jäännös liuotetaan 15 ml:aan kloroformin ja metanolin l:l-seosta ja tuote saostetaan 75 ml:11a asetonia.

Saanto: 430 mg.

KBr-palloilla suoritettu IR-spektroskopia osoittaa tyypillisen esterisidoksen 1750 cm_1:ssä.

62 95577

Piihappogeelikromatografia käyttämällä liuottimena kloroformin, metanolin ja CaCl2:n (0,3%:ista) seosta (50:42:11) osoittaa, että tuotteen, joka on lysogangliosidien N-dikloo-riasetyylijohdannaisten metyyliestereiden seos, Rf on 0,40 -0,54 (gangliosidijohdannaisten, natriumsuolojen seoksen Rf on < 0,35).

Täydellinen uudelleenesteröinti voidaan vahvistaa määrittämällä alkoksiryhmien ja sialiryhmien välinen molekyylisuhde, jotka saadaan kvantitatiivisella metyylialkoholin ylätila-kaasukromatografiällä, joka vapautetaan käsittelemällä Na2C03:n 0,lN-liuoksella 60eC:ssa tunnin ajan, mikä saa aikaan kaikkien esterisidosten leikkauksen, ja Svennerholmin menetelmällä N-asetyylineuramiinihapon määrittämiseksi.

Esimerkki 25

Lysogangliosidien seoksen N-diklooriasetyylijohdannaisten 2-butyyliamidit 500 mg (0,30 mmoolia) lysogangliosidien seoksen N-diklooriasetyyli johdannaisten sisäisten estereiden seosta (esimerkki 23) liuotetaan 2,5 ml:aan vedetöntä pyridiiniä. Liuokseen lisätään 1,25 ml 2-butyyliamiinia ja seosta sekoitetaan vedettömissä olosuhteissa 24 tunnin ajan 25eC:ssa.

Kun reaktio on päättynyt, liuotin eliminoidaan haihduttamalla ja jäännös kerätään 5 ml:11a kloroformin ja metanolin , l:l-seosta ja saostetaan 25 ml:11a asetonia.

Näin saatu raakatuote käsitellään 10 ml:11a l%:ista Na2C03:a 30 minuutin ajan 25eC:ssa jäljellä olevien esteriryhmien hydrolysoimiseksi, sitten dialysoidaan vedessä. Liuos tyhjö-kuivatetaan ja jäännös puhdistetaan kromatografoimalla Se-phadex-DEAE A-25:llä (asetaattimuoto) käyttämällä liuottimena kloroformin, metanolin ja veden 30:60:8-seosta.

Neutraalit fraktiot haihdutetaan kuiviin, dialysoidaan, haihdutetaan uudelleen, liuotetaan 5 ml:aan kloroformin ja metanolin l:l-seosta ja tuote saostetaan 25 ml:11a asetonia.

Saanto: 425 mg.

63 95577 IR-spektrissä ei nähdä enää mitään tyypillistä esterikaistaa 1750 cm_1:ssä.

Piihappogeelikromatografia käyttämällä liuottimena kloroformin, metanolia ja CaCl2:n (0,3%:ista) seosta (50:42:11) ja määritettynä resorsinolireagenssilla osoittaa, että tuotteen, joka on lysogangliosidien N-diklooriasetyylijohdan-naisten 2-butyyliamidien seos, Rf-arvo on 0,48 - 0,71 (gang-liosidijohdannaisten, natriumsuolojen seoksen Rf on < 0,35).

Esimerkki 26

Lysogangliosidien seoksen N-diklooriasetyylijohdannaisten metyyliestereiden perasetyloitu johdannainen 500 mg (0,29 mmoolia) lysogangliosidien seoksen N-dikloori-asetyylijohdannaisten metyyliestereiden seosta (esimerkki 24) liuotetaan 5 ml:aan pyridiiniä ja tähän lisätään 2,5 ml juuri tislattua etikkahappoanhydridiä ja seosta sekoitetaan 72 tunnin ajan huoneen lämpötilassa. Kun reaktio on päättynyt, liuos haihdutetaan kiertohaihduttimessa ja jäännös jaetaan jääkylmän veden (10 ml) ja etyyliasetaatin (10 ml) välillä. Etyyliasetaatti pestään kylmällä IM HCl:llä, vedellä ja NaHC03:n lM-liuoksella. Orgaaniset faasit kuivatetaan natriumsulfaatilla, haihdutetaan ja jäännös puhdistetaan piihappogeelikromatografiällä käyttämällä dikloorimetaanin, etyyliasetaatin ja isopropanolin 70:30:45-seosta.

Puhtaat fraktiot yhdistetään, kerätään, liuotetaan uudelleen . 5 ml:aan etyylieetteriä ja saostetaan 25 ml:ssa n-heksaania.

Tuotteen saanto: 485 mg.

Piihappogeelikromatografia käyttämällä liuottimena kloroformin, metanolin ja etyyliasetaatin 70:10:30-seosta ja etyylin ja isopropanolin (95:5) asetaattia osoittaa, että tuotteen Rf on 0,23 - 0,54 ja vastaavasti 0,01 - 0,52.

• · 95577 64

Esimerkki 27 N-(3,3-diklooripivaloyyli)-lyso-GMi 500 mg (0,38 mmoolia) lyso-GMi:tä liuotetaan 2,5 mitään di-metyyliformamidia ja tähän lisätään 528 μΐ (3,8 mmoolia) trietyyliamiinia, 650 mg (3,8 mmoolia) 3,3-diklooripivalii-nihappoa ja 194,2 mg (0,76 mmoolia) kloorimetyylipyridiini-jodidia liuotettuna 2,5 mitään dimetyyliformamidia. Annetaan reagoida 18 tunnin ajan huoneen lämpötilassa ja sitten seostetaan 50 mitään vedellä kyllästettyä etyyliasetaattia. Tuote kuivatetaan ja sitten se puhdistetaan piihappogeelikroma-tografiällä eluoimalla kloroformin, metanolin ja veden 601 3518-seoksella.

Puhtaat fraktiot yhdistetään, haihdutetaan, kerätään IN Na2CC>3!lla, dialysoidaan tislattua vettä vastaan ja konsentroidaan sitten 5 ml:aan ja seostetaan 50 ml:aan asetonia.

Tuotteen saanto: 365 mg (84 % teoreettisesta).

Piihappogeelikromatografia käyttämällä liuottimena kloroformin, metanolin ja CaCl2:n (0,3%:ista) seosta (50:42:11) osoittaa, että tuote on yhtenäinen yhdiste, jonka Rf = 0,36.

Esimerkki 28 N-(treonyyli)-lyso-GM* 500 mg (0,38 mmoolia) lyso-GMi:tä liuotetaan 2,5 ml:aan dimetyyliformamidia ja sitten lisätään huoneen lämpötilassa 528 yl (3,8 mmoolia) trietyyliamiinia, 648 mg (1,9 mmoolia) FMOC-treoniinia ja 194,2 mg (0,76 mmoolia) kloorimetyylipy-ridiinijodidia liuotettuna 2,5 ml:aan dimetyyliformamidia. Annetaan reagoida 18 tunnin ajan huoneen lämpötilassa ja sitten lisätään 2 ml piperidiiniä suojaryhmän (FMOC) poistamiseksi. Annetaan reagoida edelleen 3 tunnin ajan huoneen lämpötilassa ja sitten saostetaan 100 ml:aan asetonia. Tuote suodatetaan ja kuivatetaan. Muodostunut tuote puhdistetaan sitten piihappogeelikromatografialla käyttämällä eluenttina kloroformin, metanolin ja veden 60:35:8-seosta.

5· «MJ »III II I N

es 95577

Puhtaat fraktiot yhdistetään, haihdutetaan, kerätään IN Na2CC>3:lla, dialysoidaan tislattua vettä vastaan ja konsentroidaan sitten 5 ml:aan ja saostetaan 50 mlrssa asetonia.

Tuotteen saanto: 323 mg (60 % teoreettisesta).

Piihappogeelikromatografia käyttämällä liuottimena kloroformin, metanolin ja CaCl2:n (0,3%:ista) seosta (50:42:11) osoittaa, että tuote on yhtenäinen yhdiste, jonka Rf = 0,29.

Esimerkki 29 N-(dimetyyliglysyyli)-lyso-GMi 500 mg (0,38 mmoolia) lyso-GMi:tä liuotetaan 2,5 ml:aan di-metyyliformamidia ja lisätään huoneen lämpötilassa 528 μΐ (3,8 mmoolia) trietyyliamiinia, 196 mg (1,9 mmoolia) dime-tyyliglysiiniä ja 194,2 mg (0,76 mmoolia) kloorimetyylipyri-diinijodidia liuotettuna 2,5 ml:aan dimetyyliformamidia. Annetaan reagoida 18 tunnin ajan huoneen lämpötilassa ja sitten saostetaan 100 ml:aan asetonia. Tuote suodatetaan ja kuivatetaan. Muodostunut tuote puhdistetaan sitten piihappo-geelikromatografiällä käyttämällä eluenttina kloroformin, metanolin ja veden seosta (60:35:8).

Puhtaat fraktiot yhdistetään, haihdutetaan, kerätään IN Na2C03:11a, dialysoidaan tislattua vettä vastaan ja konsentroidaan sitten 5 ml:aan ja saostetaan 50 ml:aan asetonia.

: Tuotteen saanto: 309 mg (58 % teoreettisesta).

Piihappogeelikromatografia käyttämällä liuottimena kloroformin, metanolin ja CaCl2:n (0,3%:ista) seosta (50:42:11) osoittaa yhtenäisen yhdisteen, jonka Rf = 0,11.

Esimerkki 30 N-(glutaryyli)-lyso-GMi 500 mg (0,38 mmoolia) lyso-GMi:tä liuotetaan 1 ml:aan dime-tyyliformamidin ja metanolin l:l-seosta ja lisätään 0*C:ssa 161 μΐ (1,14 mmoolia) trietyyliamiinia ja 130 μΐ (1,14 mmoo- 66 9 5 5 7 7 lia) glutaarihappoanhydridiä. Annetaan reagoida 72 tunnin ajan huoneen lämpötilassa ja sitten seostetaan 20 tilavuus-osaan etyyliasetaattia, suodatetaan ja kuivatetaan.

Tuote puhdistetaan sitten piihappogeelikromatografialla käyttämällä eluenttina kloroformin, metanolin ja veden seosta (60:35:8).

Puhtaat fraktiot yhdistetään, haihdutetaan, kerätään IN Na2CC>3:lla, dialysoidaan tislattua vettä vastaan ja konsentroidaan sitten 5 ml:aan ja seostetaan 50 ml:aan asetonia.

Tuotteen saanto: 217 mg (40,0 % teoreettisesta).

Piihappogeelikromatografia käyttämällä liuottimena kloroformin, metanolin ja CaCl2:n (0,2%:ista) seosta (50:42:11) osoittaa yhtenäisen yhdisteen, jonka Rf = 0,30.

Esimerkki 31 N-(klooridifluoriasetyyli)-lyso-GM^ 500 mg (0,38 mmoolia) lyso-GMi:tä liuotetaan 2,5 ml:aan di-metyyliformamidin ja metanolin l:l-seosta ja lisätään 528 μΐ (3,8 mmoolia) trietyyliamiinia ja 277 mg (1,14 mmoolia) klooridifluorietikkahappoanhydridiä 0*C:ssa. Annetaan reagoida huoneen lämpötilassa 72 tunnin ajan, seostetaan 20 ti-lavuusosaan etyyliasetaattia, suodatetaan ja kuivatetaan.

Tuote puhdistetaan sitten piihappogeelikromatografialla käyttämällä eluenttina kloroformin, metanolin ja veden seosta (60:35:8).

Puhtaat fraktiot yhdistetään, haihdutetaan, kerätään IN Na2C03.*lla, dialysoidaan tislattua vettä vastaan ja konsentroidaan sitten 5 ml:aan ja seostetaan 50 ml:aan asetonia.

Tuotteen saanto: 333 mg (62,0 % teoreettisesta).

Piihappogeelikromatografia käyttämällä liuottimena kloroformin, metanolin ja CaCl2*«n (0,2%:ista) seosta (50:42:11) ·· osoittaa yhtenäisen yhdisteen, jonka Rf = 0,37.

• · · '· «U i ms* t,ia m 67 95577

Esimerkki 32 N-(isoleusyyli)-lyso-GMi 500 mg (0,38 mmoolia) lyso-GMi:tä liuotetaan 2,5 ml:aan di-metyyliformamidia ja lisätään huoneen lämpötilassa 528 μΐ (3,8 mmoolia) trietyyliamiinia, 671 mg (1,9 mmoolia) FMOC-isoleusiinia ja 194,2 mg (0,76 mmoolia) kloorimetyylipyri-diinijodidia liuotettuna 2,5 ml:aan dimetyyliformamidia. Annetaan reagoida 18 tunnin ajan huoneen lämpötilassa ja sitten lisätään 2 ml piperidiiniä suojaryhmän (FMOC) poistamiseksi. Annetaan reagoida edelleen 3 tunnin ajan huoneen lämpötilassa, seostetaan 100 ml:aan asetonia, suodatetaan ja kuivatetaan. Tuote puhdistetaan sitten piihappogeelikroma-tografiällä käyttämällä eluenttina kloroformin, metanolin ja veden seosta (60:35:8).

Puhtaat fraktiot yhdistetään, haihdutetaan, kerätään IN Na2C03:lla, dialysoidaan tislattua vettä vastaan ja konsentroidaan sitten 5 ml:aan ja seostetaan 50 ml:aan asetonia.

Tuotteen saanto: 298 mg (55 % teoreettisesta).

Piihappogeelikromatografia käyttämällä liuottimena kloroformin, metanolin ja CaCl2:n (0,3%:ista) seosta (50:42:11) osoittaa yhtenäisen yhdisteen, jonka Rf = 0,28.

Esimerkki 33

Farmauseuttiset valmisteet liuoksena injektiota varten

Valmiste n:o 1 - yksi 2 ml:n pienpullo sisältää: - aktiivista ainetta 5 mg - natriumkloridia 16 mg - sitraattipuskuria, pH 6, tislatussa vedessä ad 2 ml

Aktiivisena aineena käytetään jotakin esimerkeissä 3, 4 ja 18 esitetyistä gangliosidijohdannaisista.

68 95577

Valmiste n:o 2 - yksi 2 ml:n pienpullo sisältää: - aktiivista ainetta 50 mg - natriumkloridia 16 mg - sitraattipuskuria, pH 6, tislatussa vedessä ad 2 ml

Aktiivisena aineena käytetään jotakin esimerkeissä 5, 6 ja 7 esitetyistä gangliosidijohdannaisista.

Valmiste n:o 3 - yksi 4 ml:n pullo sisältää: - aktiivista ainetta 100 mg - natriumkloridia 32 mg - sitraattipuskuria, pH 6, tislatussa vedessä ad 4 ml

Aktiivisena aineena käytetään jotakin esimerkeissä 9, 10 ja 14 esitetyistä gangliosidijohdannaisista.

Valmisteita 1, 2 ja 3 voidaan antaa suoraan eläimille tai ihmisille jollakin esitetyllä tavalla. Edelleen valmisteet voivat sisältää farmaseuttisesti aktiivista ainetta.

Esimerkki 34

Kaksoispulloissa valmistetut farmaseuttiset koostumukset Tässä esimerkissä esitetyt valmisteet valmistetaan kaksoispulloissa. Ensimmäinen pullo sisältää aktiivista ainetta .· jäädytyskuivatun jauheen muodossa 10 - 90 paino-% yhdessä farmaseuttisesti hyväksyttävän täyteaineen, glysiinin tai mannitolin kanssa. Toinen pullo sisältää liuottimen nat-riumkloridin ja sitraattipuskurin liuoksena. Näiden kahden pullon sisällöt sekoitetaan yhteen välittömästi ennen käyttöä ja jäädytyskuivatetun aktiivisen aineen jauhe liukenee nopeasti injektoitavan liuoksen muodostamiseksi. Tämän keksinnön parhaimpana pidetty muoto on pullossa oleva farmaseuttinen muoto, joka sisältää aktiivisen aineen jäädytys-kuivatettua jauhetta.

· I· i »H e min i t « «4 69 9 5 5 7 7 järjestelmä n:o 1 a. Yksi 2 ml:n pienpullo jäädytyskuivatettua ainetta sisältää: - aktiivista ainetta 5 mg - glysiiniä 30 mg b. Yksi 2 ml:n pienpullo liuotinta sisältää: - natriumkloridia 16 mg - sitraattipuskuria tislatussa vedessä ad 2 ml

Aktiivisena aineena käytetään jotakin esimerkeissä 19, 20 ja 22 esitetyistä gangliosidijohdannaisista.

Järjestelmä n:o 2 a. Yksi 3 ml:n pienpullo jäädytyskuivatettua ainetta sisältää: - aktiivista ainetta 5 mg - mannitolia 40 mg b. Yksi 2 ml:n pienpullo liuotinta sisältää: - natriumkloridia 16 mg - sitraattipuskuria tislatussa vedessä ad 2 ml

Aktiivisena aineena käytetään jotakin esimerkeissä 23 ja 24 • esitetyistä gangliosidijohdannaisista.

Järjestelmä n:o 3 a. Yksi 3 ml:n pienpullo jäädytyskuivatettua ainetta sisältää: - aktiivista ainetta 50 mg - glysiiniä 25 mg b. Yksi 3 ml:n pienpullo liuotinta sisältää: - natriumkloridia 24 mg - sitraattipuskuria tislatussa vedessä ad 3 ml 70 95577

Aktiivisena aineena käytetään jotakin esimerkissä 26 esitetyistä gangliosidij ohdannaisista.

Järjestelmä n:o 4 a. Yksi 3 ml:n pienpullo jäädytyskuivatettua ainetta sisältää: - aktiivista ainetta 50 mg - mannitolia 20 mg b. Yksi 3 ml:n pienpullo liuotinta sisältää: - natriumkloridia 24 mg - sitraattipuskuria tislatussa vedessä ad 3 ml

Aktiivisena aineena käytetään jotakin esimerkissä 26 esitetyistä gangliosidijohdannaisista.

Järjestelmä n:o 5 a. Yksi 5 ml:n pullo jäädytyskuivatettua ainetta sisältää: - aktiivista ainetta 150 mg - glysiiniä 50 mg b. Yksi 4 ml:n pienpullo liuotinta sisältää: - natriumkloridia 32 mg - sitraattipuskuria tislatussa vedessä ad 4 ml • i

Aktiivisena aineena käytetään jotakin esimerkeissä 23 ja 24 es itetyistä gangliosidij ohdannaisista.

Järjestelmä n:o 6 a. Yksi 5 ml:n pullo jäädytyskuivatettua ainetta sisältää: - aktiivista ainetta 100 mg - mannitolia 40 mg » · 71 95577 b. Yksi 4 ml:n pienpullo liuotinta sisältää: - natriumkloridia 32 mg - sitraattipuskuria tislatussa vedessä ad 4 ml

Aktiivisena aineena käytetään jotakin esimerkeissä 23, 24 ja 26 esitetyistä gangliosidijohdannaisista.

Claims (13)

1. 95577
2. 1. Menetelmä uusien, terapeuttisesti käyttökelpoisten N-asyylilysogangliosidien valmistamiseksi, joiden yhdisteiden asyyliryhmä, joka asyloi keramidin aminoryhmän, on yhtenäinen ja johdettu 2-24 hiiliatomia sisältävästä alifaattisesta haposta, joka on substituoitu yhdellä tai useammalla polaarisella ryhmällä, joka on valittu ryhmästä, johon sisältyvät: - kloori, bromi tai fluori, - hydroksiryhmät, jotka on esteröity orgaanisella tai epäorgaanisella hapolla, - eetteröidyt hydroksiryhmät, - keto-, ketaali- ja asetaaliryhmät, jotka on johdettu alemmista alifaattisista tai aralifaattisista alkoholeista, - ketoksiimi-, aldoksiimi- tai hydratsoniryhmät, jotka on valinnaisesti substituoitu alemmilla alkyyli- tai aral-kyy1iryhmi11ä, - vapaat merkaptoryhmät tai merkaptoryhmät, jotka on esteröity alemmalla alifaattisella tai aralifaattisella hapolla tai eetteröity alemmilla alifaattisilla tai ara-lifaattisilla alkoholeilla, - vapaat tai esteröidyt karboksiryhmät, - vapaat sulfoniryhmät tai sulfoniryhmät, jotka on este- • · . röity alemmilla alifaattisilla tai aralifaattisilla al koholeilla, - sulfamidiryhmät tai sulfamidiryhmät, jotka on substituoitu alempialkyyli- tai aralkyyliryhmillä tai alempial-kyleeniryhmillä, - sulfoksidi- tai sulfoniryhmät, jotka on johdettu alempialkyyli- tai aralkyyliryhmistä, - nitriiliryhmät, ja - vapaat tai substituoidut aminoryhmät, ja tällaisten ami-noryhmien kvaternaariset ammoniumjohdannaiset, edellyttäen, että happo on muu kuin aminolauriinihappo; sekä N-asyylilysogangliosidien siaalikarboksyyliryhmien es-; tereiden ja/tai amidien, N-asyylilysogangliosidien sisäisten 95577 estereiden, N-asyylilysogangliosidien perasyloitujen johdannaisten, happoryhmiä sisältävien N-asyylilysogangliosidien metallisuolojen tai orgaanisten emässuolojen, N-asyylilysogangliosidien happoadditiosuolojen sekä N-asyylilysogangliosidien seosten vastaavien johdannaisten valmistamiseksi, tunnettu siitä, että lysogangliosidi tai de-N-asetyy-lilysogangliosidi tai tällaisten yhdisteiden seos asyloidaan mahdollisesti suojaamalla tilapäisesti asylointikomponentin funktionaaliset ryhmät 2-24 hiiliatomia sisältävällä ali-faattisella hapolla, joka on substituoitu yhdellä tai useammalla polaarisella ryhmällä, joka on valittu seuraavasta ryhmästä: - kloori, bromi tai fluori, - hydroksiryhmät, jotka on esteröity orgaanisella tai epäorgaanisella hapolla, - eetteröidyt hydroksiryhmät, - keto-, ketaali- ja asetaaliryhmät, jotka on johdettu alemmista alifaattisista tai aralifaattisista alkoholeista, - ketoksiimi-, aldoksiimi- tai hydratsoniryhmät, jotka on valinnaisesti substituoitu alempialkyyli- tai aralkyyli-ryhmillä, - vapaat merkaptoryhmät tai merkaptoryhmät, jotka on esteröity alemmalla alifaattisella tai aralifaattisella hapolla tai eetteröity alemmilla alifaattisilla tai arali- . faattisilla alkoholeilla, - vapaat tai esteröidyt karboksiryhmät, - vapaat sulfoniryhmät tai sulfoniryhmät, jotka on esteröity alemmilla alifaattisilla tai aralifaattisilla alkoholeilla, - sulfamidiryhmät tai sulfamidiryhmät, jotka on substituoitu alempialkyyli- tai aralkyyliryhmillä tai alempial-kyleeniryhmillä, - sulfoksidi- tai sulfoniryhmät, jotka on johdettu alempialkyyli- tai aralkyyliryhmistä, - nitriiliryhmät, - vapaat tai substituoidut aminoryhmät, ja tällaisten ami-noryhmien kvaternaariset ammoniumjohdannaiset, 95577 ja haluttaessa saatujen tuotteiden karboksifunktiot muunnetaan estereiksi tai amideiksi tai valmistetaan gangliosidien sisäisiä estereitä tai läsnä olevat hydroksiryhmät perasyloi-daan ja haluttaessa N-asyyliryhmässä läsnä olevat polaariset ryhmät muunnetaan toisiinsa ja haluttaessa saadut tuotteet muunnetaan niiden suoloiksi.
3. 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että menetelmänä on jokin seuraavista reaktiosta: 1. lysogangliosidijohdannaisen reaktio happoatsidin kanssa, 2. lysogangliosidijohdannaisen reaktio asyyli-imidatsolin kanssa, 3. lysogangliosidijohdannaisen reaktio hapon ja trifluori-etikkahapon seka-anhydridin kanssa, 4. lysogangliosidijohdannaisen reaktio hapon kloridin kanssa, 5. lysogangliosidijohdannaisen reaktio hapon kanssa karbodi-imidin ja valinnaisesti 1-hydroksibentsotriatsolin läsnäollessa, 6. lysogangliosidijohdannaisen reaktio hapon kanssa korkeassa lämpötilassa, 7. lysogangliosidijohdannaisen reaktio hapon metyyliesterin kanssa korkeassa lämpötilassa, 8. lysogangliosidijohdannaisen reaktio hapon fenoliesterin, kuten para-nitrofenolin kanssa muodostetun esterin kanssa, tai * 9. lysogangliosidijohdannaisen reaktio esterin kanssa, joka on muodostettu hapon suolan ja l-metyyli-2-klooripyridii-nijodidin tai sen vastaavien tuotteiden välisestä vaihdosta .
4. 3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että menetelmä keskeytetään jossakin vaiheessa tai että se aloitetaan välivaiheessa ja suoritetaan sitten jäljellä olevat vaiheet.
5. 4. Jonkin patenttivaatimuksen 1, 2 tai 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan N-asyylilysogang- . liosidejä, joiden N-asyyliryhmä on johdettu mono-, di- tai 95577 trikloorihaposta tai mono-, di- tai trifluorihaposta.
6. 5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan N-asyylilysogangliosidejä, joiden N-asyyliryhmä on johdettu dikloorietikkahaposta, trikloorie-tikkahaposta tai näiden fluori- tai bromianalogeista.
7. 6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan N-asyylilysogangliosidien siaalikar-boksyylihappoestereitä, jotka on johdettu korkeintaan 12 hiiliatomia sisältävistä alifaattisen sarjan alkoholeista, tai aralifaattisen sarjan alkoholeista, jotka sisältävät korkeintaan 4 hiiliatomia alifaattisessa osassaan ja yhden ainoan bentseenirenkaan, joka mahdollisesti on substituoitu 1 - 3 alemmalla alkyyliryhmällä, tai alisyklisen tai alifaat-tis-alisyklisen sarjan alkoholeista, joissa on yksi ainoa sykloalifaattinen rengas ja korkeintaan 14 hiiliatomia, tai heterosyklisen sarjan alkoholeista, joissa on korkeintaan 12 hiiliatomia ja yksi ainoa heterosyklinen rengas, joka sisältää yhden heteroatomi, joka voi olla N, 0 tai S.
8. 7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan N-asyylilysogangliosidien sisäisiä estereitä laktonisoimalla siaalikarboksyyliryhmät sakkaridi-hydroksidiryhmillä.
9. 8. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnet tu siitä, että valmistetaan N-asyylilysogangliosidien perasyloi-tuja johdannaisia, jotka on johdettu korkeintaan 6 hiiliatomia sisältävistä alifaattisista hapoista.
10. 9. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan N-asyylilysogangliosidejä, joiden perusgangliosidina on GMlf GM3, GDU, GDlb tai GTlb. 1 Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan . - N-diklooriasetyylilyso-GM,, 95577 - N-klooriasetyylilyso-GM,, - N-3-klooripivaloyylilyso-GM,, - N-trifluoriasetyylilyso-GMp - N-tribromiasetyylilyso-GMj, - N-merkaptoasetyylilyso-GM,, - N-maleyylilyso-GMj, - N-fluoriasetyylilyso-GM,, - N-difluoriasetyylilyso-GM,, - N-3-aminopropionyylilyso-GM,, - N-syanoasetyylilyso-GM,, - N-(3-dietyyliaminopropionyyli)lyso-GMj tai - N-aminoasetyylilyso-GMj.
11. 11. Jonkin patenttivaatimuksen 1-10 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan sellaisten N-asyy-lilysogangliosidien tai vastaavien seosten terapeuttisesti hyväksyttävät metallisuolat, jotka molekyylissään sisältävät ainakin yhden funktionaalisen happoryhmän.
12. 12. Jonkin patenttivaatimuksen 1-10 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan sellaisten N-asyy-lilysogangliosidien tai vastaavien seosten terapeuttisesti hyväksyttävät orgaaniset emässuolat, jotka molekyylissään sisältävät ainakin yhden funktionaalisen happoryhmän.
13. 13. Jonkin patenttivaatimuksen 1-10 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan sellaisten N-asyy-lilysogangliosidien tai vastaavien seosten terapeuttisesti hyväksyttävät happoadditiosuolat, jotka molekyylissään sisältävät ainakin yhden emäsfunktion. I· H , «UH i · 1 «4 95577