HU196422B - Process for producing anthracycline derivatives and pharmaceutical compositions comprising the same - Google Patents

Process for producing anthracycline derivatives and pharmaceutical compositions comprising the same Download PDF

Info

Publication number
HU196422B
HU196422B HU842747A HU274784A HU196422B HU 196422 B HU196422 B HU 196422B HU 842747 A HU842747 A HU 842747A HU 274784 A HU274784 A HU 274784A HU 196422 B HU196422 B HU 196422B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
acid
formula
roa
preparation
solution
Prior art date
Application number
HU842747A
Other languages
English (en)
Other versions
HUT36837A (en
Inventor
Gerhard Huber
Hans G Berscheid
Hans-Wolfram Fehlhaber
Hans P Kraemer
Original Assignee
Hoechst Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hoechst Ag filed Critical Hoechst Ag
Publication of HUT36837A publication Critical patent/HUT36837A/hu
Publication of HU196422B publication Critical patent/HU196422B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H15/20—Carbocyclic rings
    • C07H15/24—Condensed ring systems having three or more rings
    • C07H15/252—Naphthacene radicals, e.g. daunomycins, adriamycins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H7/00—Compounds containing non-saccharide radicals linked to saccharide radicals by a carbon-to-carbon bond

Description

A találmány tárgya eljárás (I) általános képletű új antraciklin-származékok és az azokat tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására. Az (l) általános képletben Rí és R2 különböző jelentésű, és (al képletű, -Roa jelű cukorcsoportot vagy (b) képletű, -Roa-dF=CinB jelű cukorkonibinációt jelent.
Roa = L-rodózamin dF = 2-dezoxi-L-fukóz
CinB = L-cinerulóz.
A találmány szerinti eljárásra jellemző, hogy az Y-11472 jelű, DSM 2658 szám alatt a Német Mikroorganizmusgyűjteménynél 1983. május 24-én letétbe helyezett mikroorganizmusnak a 0 131 181 sz. alatt publikált európai szabadalmi leírás szerint végzett fermentálása, a micéiium és a tenyészlé szerves oldószerrel történő extrahálása útján kapott maradékot híg savval kezeljük.
A fenti módon előállított vegyületek erős citostatikus hatással rendelkeznek.
Az említett szabadalmi bejelentés szerint az Y-11472 jelű Streptomyces purpurascens törzset tápközegben, mintegy 24-40°C-on 6,5 és 8,5 közötti pH-érték mellett aerob körülmények között ismert módon fermentálják. A micéliuntból az antraciklin-vegyületeket például vizes acetonnal 3,5 pH érték mellett végzett extrahálással kioldják, az acetont eltávolítják, és a vizes fázist 7,5 pH érték mellett előnyösen etil-acetáttal extrahálják. A micéliu inból nyert etil-acetátos extraktumot és a szürlet extraktumát egyesítik, szárazra párolják. Az igy kapott maradék a találmány szerinti módon savval kezelhető, de általában az említett bejelentés leírásában leirt módon dolgozzék fel.
A feldolgozás során a maradékot toluolban oldják, 3,5 pH-jú acetátpufferrel extrahálják, és a vizes fázist dolgozzák fel oly módon, hogy a pH-értéket 7,5-re állítják, a vizes fázist etil-acetáttal extrahálják, és a szerves fázist betöményítik, aminek során úgynevezett citorodin nyersterméket kapnak. Az említett szabadalmi bejelentés szerint a nyerstermékből kromatográfiai módzserekkel citostatikusan ható antraciklin-származékok izolálhatok.
Meglepő módon azt találtuk, hogy új, szintén citostatikusan ható antraciklin-származékok állíthatók eló, ha a fenti nyers maradékot vagy az úgynevezett citorodin nyersterméket erős vag.v közepesen erős sav híg oldutával kezeljük. Alkalmas savak például az alábbiak: sósav, kénsav, foszforsav, hangyasav, ecetsav, trifluorecetsav és egyéb savak, amelyek adott esetben vizzel elegyedő szerves oldószert, például metanolt vagy etanolt is tartalmazhatnak. A savas kezelés erősen savas, H-formájú ioncserélővel Ipl. Dowcx 50x8 (H*)] is végezhető. Ez esetben a terméket például sóoldattal kell az ioncserélőről eluálni.
A savas kezelést szobahőmérsékleten vagy enyhén emelt hőmérsékleten, előnyösen 3 °C-on végezzük. A reakcióidő 30 perctől néhány óráig terjedhet. Semlegesítés után a kívánt vegyületeket extrahálással izoláljuk, és oszlopkrómatográfíás módszerrel, előnyösen Kieselgélen szétválasztjuk.
A találmány szerinti eljárásban az alábbi vegyületeket állíthatjuk eló.
S-citorodin
Vörös, amorf anyag, metanolban, etil-acetátban, kloroformban és toluolban jól oldódik, vízben és hexánban oldhatatlan.
Vékonyréteg-kromatográfia: Kieselgél 60 Fűs-t .Merck':
BI rendszer: kloroform/metanol/jégecet/ víz = 70 : 20 : 10 : 2
Rr 0,67
UV-maximumok: 236, 252 (váll), 293, 497,
563 nm (metanol és 10% IN HC1 elegyében)
NMR-szlnkép: lásd 1. ábra összegképlet: ΟίθΗβίΝζΟπ M ssaaitott = 940 (FAB-MS-szinképpel igazolva).
Az S-citorodin olyan (I) általános képletű vegyület, amelyben Rí jelentése -Roa és R; jelentése -ROa-dF=CinB.
T-citorodin
Vörös, amorf anyag, metanolban, etil— -acetátban, kloroformban és toluolban könynyen oldódik, vízben és hexánban oldhatatlan.
Vékonyrétegkromatográfia: Kieselgél 6OF254 .Merck'
B; rendszer: kloroform/metanol/jégecet/ víz = 70 : 20 : 10 : 2
Rí 0,53
UV-niaximuinok: 236, 252 (sch), 293, 496,
563 nm (metanol és 10% IN sósav elegyében
NMR-szlnkép: lásd 2. ábra összegképlet: CísHmN20i7
Mswamitott -940 (FAB— MS— színképpel igazolva).
A T-citorodin olyan (I) általános képletű vegyület, amelyben Rí jelentése -RoadF = CinB és R2 jelentése -Roa.
Az új citorodinok mellett az ismert űrcdomicin II (rodomicin A, H. Brockmann et al , Naturwiss. 37, 492, 1950, valamint 42, 154, 1955) is képződik, azaz olyan (I) általános képletű vegyület, amelyben Rí és R2 jelentése egyaránt -Roa.
A találmány szerint előállítható citorodínck erős citostatikus hatással rendelkeznek, és L 1210 jelű leukémia-sejtekkel végzett sejtproliferációs tesztben az alábbi eredményeket adták:
IC5o(jug/ml)
S-citorodin 3 x IO-4
196122
T-citorodin 2 x ΙΟ*3
Ennek a tesztnek a lényege az alábbi. Exponentiális növekedési fázisban (5 x 103/ml ΠΡΜΙ-kőzeg) lévő L-1210 sejteket míkrotitráló lapon 72 órán keresztül a vizsgálni kívánt anyag különböző koncentrációval inkubálunk (37 °C, 5% CO2. 95% relatív páratartalommal). A kontroll sorozat sejtjeit csupán friss közeggel inkubáljuk. Mindegyik kísérletet négy ismétléssel hajtjuk végre. 65 óra elteltével 14C-vel jelzett timidint adagolunk 50 ul( = 1,5 uC/ml) mennyiségben, ezzel a sejtek DNA-ját radioaktív jelzéssel jelöljük. 7 óra inkubáció után a sejteket leszivatjuk, a DNA-t 5%-os triklór-ecetsavval kicsapjuk és először vizzel, majd metanollal mossuk. Az 50°C-on végzett szárítás, valamint 5 ml szcintillációs folyadék hozzáadása után a DNA-ba beépített radioaktivitást megmérjük. Eredményként a kísérleti anyaggal inkubált minta szcintillációs mutatóját számítjuk ki a kezeletlen kontroll százalékában. Az így kapott értékek felhasználásával dózis-hatás-grafikont rajzolunk, amelyből az ICso-érléket grafikus eszközökkel állapítjuk meg. {ICso = a kísérleti anyagnak az a koncentrációja, amely a teszt körülmények között a radioaktív timidin beépítését 50%-kal csökkenti a kezeletlen kontrolihoz képest.)
A találmány szerinti eljárást az alábbiakban közelebbről ismertetjük.
1. példa
4,5 g nyers citorodin-komplex (a 0131 181 sz alatt publikált európai szabadalmi leirés szerint előállítva) 250 ml 0,2 n sósav oldattal készített oldatát egy órán ét 37 °C-on tartjuk, majd az oldat pH-értékét hűtött nátrium-hidroxid-oldattal 7,5-re állítjuk. Az oldatot 300-300 ml kloroformmal négyszer extraháljuk, és az egyesitett kloroformos extrakturnokat vákuumban szárazra pároljuk. A maradékot (2,1 g) kloroform, metanol, jégecet és víz 50 : 50 : 5 : 2 arányú elegyének (A/ rendszer) 30 ml-jében feloldjuk és olyan oszlopra visszük, amelyet 200 ml 40-63 mikron szemcseméretü, A) rendszerben feliszapolt Kieselgéllel (Merck 60) töltöttünk. Az eluáláshoz szintén a fenti oldószerelegyet használjuk. Az első 100 ml-t elfolyatjuk, utána 10 ml-es frakciókat gyűjtünk, amelyeket vékonyréteg-kromatográfiával elemezünk (Ki— eselgel 60 F254 Merck, B) rendszer: kloroforni/nietanol/jégecet/-viz = 70 : 20 : 10 : 2). Az aktív anyagok az alábbi frakciókban vannak:
18-31. frakció: S-T-cilorodin
45-67. frakció: 0-rodomicin II.
A 18-31. frakciókat egyesítjük és addig hígítjuk 5%-os vizes dinátrium-hidrogén-foszfát-oldattal, mig a kloroformos fázis ki nem válik. A kloroformos fázist egy térfogat dinátriwn-hidtOgén-foszfát-oldattal, egy térfogat vízzel mossuk, vízmentes nátriuni-szul4 fáttal szárítjuk, vákuumban betöményítjük és a terméket hexánnal kicsapjuk.
Hozam: 540 mg kétkomponenses (S- és Tcitorodin) elegy.
2. példa
Az 1. példa szerint kapott kétkomponenses elegy 300 mg-ját 20 ml B)-rendszerben (lásd 1. példa) feloldjuk és olyan oszlopra visszük, amelyet 100 ml 15-40 mikron méretű, B)-rendszerben feliszapolt Kieselgéllel (Merck 60) töltöttünk. Az oszlopot a B)-rendszerrel
eluáljuk. Az első 5 ml-es frakciókat 100 ml-t elfolyatjuk, gyűjtünk: utána
21-32. frakció S-citorodin 160 mg
41-80. frakció S-citorodin, kevés
T-citorodin 35 mg
81-100. frakció T-citorodin 40 mg.
A (termék szerint külön-külön) egyesített frakciókat 5%-os vizes dinátrium-hidrogén-foszfát-oldattai addig hígítjuk, mig a kloroformos fázis ki nem válik. A kloroformos fázist azonos térfogatú dinátrium-hidrogén-foszfát-oldattal, majd azonos térfogatú vízzel mossuk, vákuumban betöményítjük, és a terméket hexánnal kicsapjuk.
Hozam: 160 mg tiszta S-citorodin mg tiszta T-citorodin.
3. példa
1,1 g citorodin-komplex 60 ml 0,2 n hangyasavval készített oldatát 24 órán át 37 °C-on tartjuk. Az oldat a vékon.vréteg-kromatográfiai vizsgálat szerint S- és Tcitoroding tartalmaz. Az oldat pH-értékét nátrium-hidroxid-oldattal 7,5-re állítjuk, majd az oldatot az 1. példában leírtak szerint feldogozzuk.
4. példa
0,5 g citorodin-komplex 28 ml vizzel készített oldatához keverés közben 0,64 ml trifluorecetsavat adunk, és a reakcióelegyet szobahőmérsékleten 4 órán át állni hagyjuk. Utána az oldatból az 1. és 2. példa szerint kinyerjük az S- és T-citorodint.
A komponenseket az alábbi mérési körülmények között azonosítottuk. A protonrezonancia-szénképet (Hl-NMR-színkép) HX 270 BRUKER Fourier-transzform tipusú magrezonancia-spektrométerrel vettük fel 270 MHz frekvenciával. A koncentrációk 2-4 mg/0,5 ml 99,8%-os CDCb voltak; az oldatokat mindjárt elkészítésük után 0,1 ml 5?£-os Na2CO3-oId.aLI.al (99,5% D20). összerázzuk.
Az ábrákon csillaggal jelölt jel%-os nagyságrendben jelenlévő kisrnolekulatöniegű szennyeződésekből és oldószer-maradékokból ered.
A tömegspektrumokat MS-902 S típusú, AEI gyártotta tömegspektrométerrel vettük fel FAB-ionforrás (Fast-Aloni-Bombardment) alkalmazásával. A vizsgálni kívánt anyagokat - adott esetben ammónium-klorid adagolása mellett - tioglicerin-mátrixban vittük az ionforrásba.

Claims (3)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Eljárás (I) általános képletű antraciklin-száramzékok - az (I) általános képletben Rt és R2 különböző jelentésű és (a) képletű -Roa jelű cukorcsoportot vagy (b) képletű, -Roa-dF=CinB jelű cukorkombinációt jelent előállítására, azzal jellemezve, hogy a Streptomyces purpurascens Y-11-172 törzzsel (deponálási szám: DSM 2658), annak valamely mutánsával vagy variánsával végzett fermentációjával,majd a kapott fermentlé és micélium egy vagy több szerves oldószerrel történt extrahálásával előállított nyers citorodin5 keveréket sav hig oldatával kezeljük és a kívánt termékeket extrahálással, valamint kromatográfiai módszerekkel izoláljuk.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy savként sósavat, kénsavat,
    10 foszforsavat, hangyasavat, ecetsavat vagy trfluorecetsavat alkalmazunk.
  3. 3. Eljárás gyógyszerkészítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy az 1. igénypont szerinti eljárással készített (1) általános
    15 képletű vegyületek - az (I) általános képletben Rí és R2 jelentése az 1. igénypontban megadott - valamelyikét a gyógyszeriparban használatos hordozó- és egyéb segédanyagokkal összekeverve gyógyászati készitmény20 nyé alakítjuk.
HU842747A 1983-07-19 1984-07-13 Process for producing anthracycline derivatives and pharmaceutical compositions comprising the same HU196422B (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19833325957 DE3325957A1 (de) 1983-07-19 1983-07-19 Anthracyclin-derivate, ein verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung als cytostatika

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HUT36837A HUT36837A (en) 1985-10-28
HU196422B true HU196422B (en) 1988-11-28

Family

ID=6204326

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU842747A HU196422B (en) 1983-07-19 1984-07-13 Process for producing anthracycline derivatives and pharmaceutical compositions comprising the same

Country Status (20)

Country Link
US (1) US4737583A (hu)
EP (1) EP0131942B1 (hu)
JP (1) JPS6048994A (hu)
KR (1) KR850001226A (hu)
AR (1) AR240460A1 (hu)
AT (1) ATE30727T1 (hu)
AU (1) AU562684B2 (hu)
CA (1) CA1246062A (hu)
DE (2) DE3325957A1 (hu)
DK (1) DK352884A (hu)
ES (1) ES534377A0 (hu)
FI (1) FI75173C (hu)
GR (1) GR81549B (hu)
HU (1) HU196422B (hu)
IL (1) IL72432A0 (hu)
NO (1) NO162023C (hu)
NZ (1) NZ208917A (hu)
PH (1) PH24156A (hu)
PT (1) PT78932A (hu)
ZA (1) ZA845538B (hu)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS6117597A (ja) * 1984-07-03 1986-01-25 Microbial Chem Res Found アントラサイクリン化合物
DE3425357A1 (de) * 1984-07-10 1986-01-23 Hoechst Ag, 6230 Frankfurt 1-hydroxy-cytorhodine, ein mikrobiologisches verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung als cytostatika
DE3524117A1 (de) * 1985-07-05 1987-02-05 Hoechst Ag Neue anthracyclin-tetrasaccharide, ein verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung als cytostatik
JPH0822869B2 (ja) * 1986-06-25 1996-03-06 ヘキストジヤパン株式会社 サイトロジンｓ誘導体およびそれを含有する抗癌剤
DE3641833A1 (de) * 1986-12-08 1988-06-09 Behringwerke Ag Zytostatisch wirksame anthracyclinderivate
DE3709337A1 (de) * 1987-03-21 1988-10-13 Hoechst Ag Neue anthracyclin-glycoside, ein verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung als cytostatika
DE3733885A1 (de) * 1987-10-07 1989-04-27 Hoechst Ag Neue anthracyclin-derivate, ein verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung als arzneimittel
DE3801178A1 (de) * 1988-01-18 1989-07-27 Hoechst Ag Stabilisierte trockenzubereitung zytostatisch wirksamer anthracyclin-antibiotika und verfahren zu ihrer herstellung
DE3819092A1 (de) * 1988-06-04 1989-12-14 Behringwerke Ag Zytostatisch wirksame anthracyclinderivate
US20050208037A1 (en) * 2003-10-21 2005-09-22 Board Of Regents, The University Of Texas System Thioredoxin increases redox-cycling of anticancer agents thereby sensitizes cancer cells to apoptosis

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS6023679B2 (ja) * 1979-07-13 1985-06-08 メルシャン株式会社 ロドマイシン群抗生物質とその製造法
JPS5982395A (ja) * 1982-11-02 1984-05-12 Microbial Chem Res Found アントラサイクリン化合物、その製造法およびその用途
JPS59148795A (ja) * 1983-02-08 1984-08-25 Microbial Chem Res Found アントラサイクリン化合物、その製造法およびその用途
DE3323025A1 (de) * 1983-06-25 1985-01-10 Hoechst Ag, 6230 Frankfurt Anthracyclin-derivate, ein mikrobiologisches verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung als cytostatika

Also Published As

Publication number Publication date
JPS6048994A (ja) 1985-03-16
ES8600326A1 (es) 1985-10-01
EP0131942B1 (de) 1987-11-11
FI75173C (fi) 1988-05-09
ZA845538B (en) 1985-02-27
AU562684B2 (en) 1987-06-18
US4737583A (en) 1988-04-12
DK352884D0 (da) 1984-07-18
NZ208917A (en) 1988-03-30
CA1246062A (en) 1988-12-06
ATE30727T1 (de) 1987-11-15
NO162023B (no) 1989-07-17
NO842938L (no) 1985-01-21
KR850001226A (ko) 1985-03-16
AR240460A1 (es) 1990-04-30
GR81549B (hu) 1984-12-11
ES534377A0 (es) 1985-10-01
NO162023C (no) 1989-10-25
EP0131942A1 (de) 1985-01-23
PH24156A (en) 1990-03-22
FI842877A (fi) 1985-01-20
FI842877A0 (fi) 1984-07-17
IL72432A0 (en) 1984-11-30
JPH0150714B2 (hu) 1989-10-31
FI75173B (fi) 1988-01-29
DK352884A (da) 1985-01-20
AU3082384A (en) 1985-01-24
DE3467350D1 (en) 1987-12-17
DE3325957A1 (de) 1985-02-07
PT78932A (de) 1984-08-01
HUT36837A (en) 1985-10-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US4345068A (en) Process for the preparation of 4'-epidaunorubicin, 3',4'-diepidaunorubicin, their doxorubicin analogs, and intermediates used in said process
EP0041355A1 (en) Novel erythromycin compounds
Bauch et al. Aromatic metabolites in cell suspension cultures of Galium mollugo L.
Maltsev et al. Triterpene glycosides from sea cucumber Stichopus japonicus Selenka
PT92263B (pt) Processo para a preparacao de analogos da serina com actividade antibiotica
HU196422B (en) Process for producing anthracycline derivatives and pharmaceutical compositions comprising the same
EP0131181B1 (de) Anthracyclin-Derivate, ein mikrobiologisches Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung als Cytostatika
US5525594A (en) Treatment of hyperandrogenic disorders
Pazur et al. The synthesis of 1, 6-anhydro-β-D-glucopyranose and D-glucosyl oligosaccharides from maltose by a fungal glucosyltransferase
EP0286926B1 (de) Semisynthetische Rhodomycine, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung als Zytostatika
EP0064635B1 (de) Aminocyclitderivate, ihre Herstellung und sie enthaltende Arzneimittel
DE1643521C3 (de) 4'-Demethyl-epipodophyllotoxin-ß-Dglucosidderivate sowie ein Verfahren zu ihrer Herstellung und Arzneimittel mit einem Gehalt dieser Verbindungen
Setter et al. Identification of a dihydrophaseic acid aldopyranoside from soybean tissue
US4963667A (en) Ivermectin derivative compounds and process for preparing the same
WO1988003135A2 (en) Method of isolating vinblastine
Chakrabarti et al. Bitter constituents of the seeds of Corchorus olitorius L.,“Corchorgenin”—A new cardiac-active aglycone
Kondo et al. The chemical and enzymatic syntheses of specifically deuterated dinucleoside monophosphates
JPH02111785A (ja) スフインゴ糖脂質
US4795808A (en) Anthracycline tetrasaccharides
US2788346A (en) Process of preparing orotidine
EP0186807A2 (de) Anthracyclin-Derivate, ein mikrobiologisches Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung als Arzneimittel
US5037971A (en) Anthracyclinone glycosides containing an n-oxidized sugar
DE60132703T2 (de) Citrullimycine, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung als arzneimittel
US3518248A (en) Scilliglaucosidin - alpha - l-rhamnoside and method for its isolation from white squill
DE2314518A1 (de) Pyrono-rifamycine und verfahren zu ihrer herstellung

Legal Events

Date Code Title Description
HU90 Patent valid on 900628
HMM4 Cancellation of final prot. due to non-payment of fee
HRH9 Withdrawal of annulment decision
HMM4 Cancellation of final prot. due to non-payment of fee