HU196128B

HU196128B - Process for production of compound substituating bile and forwarding digestion of fat

Info

Publication number: HU196128B
Application number: HU8575A
Authority: HU
Inventors: Jozsef Szejtli; Lajos Szente; Andrea Gerloczy; Katalin Kaloy; Jenoe Marton
Original assignee: Chinoin Gyogyszer Es Vegyeszet
Priority date: 1985-01-10
Filing date: 1985-01-10
Publication date: 1988-10-28
Also published as: DK9286A; CA1259925A; EP0187653B1; JPS61218521A; AU588271B2; DE3685222D1; US4774232A; HUT40149A; AU5216686A; EP0187653A3; CN86100624A; DK9286D0; ATE75943T1; EP0187653A2

Description

Találmányunk lényege eljárás olyan gyógyszerkészítmény előállítására, amely metilezett béta-ciklodextrint tartalmaz, ami orálisan bevéve képes arra, hogy a táplálék zsírtartalmát zárványkomplexképzéssel diszpergálja, a lipázos bontás számára hozzáférhetővé tegye, és ílymódon a zsírok emésztését, felszívódását lehetővé téve helyettesítse a természetes epét olyan esetekben, amikor az valamilyen ok miatt nem áll rendelkezésre a bélcsatornában normális funkciójának kifejtéséhez,

Az epe a májsejtek által szekretált váladék, amely vagy közvetlenül a duodénumba ömlik, vagy átmenetileg az epehólyagban tárolódik, ott részlegesen koncentrálódik, majd az emésztés szükségleteinek megfelelően továbbítódik ugyancsak a patkóbélbe. A közvetlenül ürülő ún. inájepe mindig híg, a hólyagból ürülő úgynevezett hólyag-epe többnyire ennél lényegesen sűrűbb, gyakran tízszeresen is bekoncentrálódik.

Az emberi táplálék fajlagosan legnagyobb energiatartalmú komponensét a lipidek, zömében a trigliceridek képezik. Az átlagos emberi táplálékkal bevitt összkalória kb. 40%-a lipidek, mintegy napi 100 g elfogyasztásából ered. Egészséges állapotban az elfogyasztott zsírok legfeljebb 5%-a kürül emésztetlenül a széklettel. A trigliceridek vízben oldhatatlanok, lebontásukat a vékonybél felső szakaszán főként zsírsavakra és monoglíceridekre a pankreász lipáz katalizálja. Az optimális lipázaktivitás feltétele az epesavak jelenléte. Az epesavak szolubílizáió hatására a lipidek finom szemcsékké diszpergáló dnak. Az epe jelenléte nemcsak az enzimes bontáshoz, hanem a lipoh'zis vízben oldhatatlan termékeinek abszorpciójához is szükséges. Az epesavak a szabad szírsavakkal és monogliceridekkel micellákat képezve szívódnak fel passzív transzporttal a mikrovillus membránon át a bél hámsejtekbe. Hasonlóan vegyes aggregátumok, micellák formájában szívódnak fel szolubilizáltan más lipidek és a zsíroldékony vitaminok.

A lipidek micelláris abszorpciójának biztosítására az epesavaknak a bélben a kritikus micelláris koncentrációt (mintegy 2 mM) el kell érnie. Mivel az emberi szervezet összes epesav készlete mintegy 2—4 g és a bélcsatornába naponta élettani körülmények között mintegy 20-30 g epesav kerül, a szükséges mennyiséget az epesavak enterohepatikus körforgása biztosítja. A duodénumba kiválasztott, lipidekkel aggregált micellák formájában fel nem szívódott rész a distális, terminális ileumból aktiv transzport útján a portális íftringés közvetítésével a májba visszajutva újra szecernálódik. Egy étkezés és az azt követő emésztés során a szervezet teljes epesav készlete akár többször is végighaladhat az enterohepatikus körforgáson. Naponta összesen mintegy 600 mg epesav szintetizálódik újonnan, ez megfelel a széklettel ürített mennyiségnek.

A természetes epe (marhaepe) 5—6% kólsavat, 0,6-0,8% dezoxikólsavat, valamint egészen kis mennyiségben két további epesav származékot tartalmaz. Ezek valamennyien a kolánsav különböző mértékben hidroxilált származékai. Az epében az epesavak glikolhoz vagy taurinhoz kötve vízoldható nátriumsóként fordulnak elő, azaz glikolsavként vagy taurokolsavként. Terápiás szempontból azonban ezek a konjugátumok a tiszta epesavakkal szemben nem mutatnak semmi előnyt. A bélbe kerülő epe funkcionális alkotórészeit az epesavak alkotják, ezeknak 9/10 része ismét felszívódik a bélből és recirkulál.

Vizeletben csak akkor jelenik meg epesav, ha a májfunkció károsodott, A szervezetben az epesavak nem bomlanak le. Az epesavakra jellemző, hogy a vérkeringésbe jutva toxikusak, hemolitikus sajátságúak. Ezen túlmenően toxikus hatást mutatnak az izmokra és az idegekre is.

Az elégtelen lipidemésztés (lipid maiabszorpció) és következményes steatorrhoea klinikai megnyilvánulásai: puffadás, bélgörcsök, diarrhoea, gyakori abnormális székürítés, energiavesztés, fogyás, valamint a zsíroldékony vitaminok (A, D, K) felszívódásának csökkenése következtében hypovitaminózisra utaló tünetek:

Az. elégtelen micellaképzést, azaz a zsíremésztés és felszívódás gátlását kiváltó okok:

— Az epesavak csökkent szintézise (parenchymás májbetegségek), — Az epesavak gátolt bejutása a bélbe, epeelzáródás (epekő, tumor, primer biliáris cirrhosis), cholestatikus májbetegség esetén, — A konjugált epesavak hatékony koncentrációjának csökkenése vagy a fokozott aciditás (Zollinger-Ellison szindróma - az epesavak csökkent ionizációja, fokozott promixálís felszívódással) következtében, vagy gyógyszer okozta (neomycin, cholestyramin) mellékhatás miatt.

- fokozott epesav vesztés ( Ileum betegségei, resection esetén.

Az epét vagy epesavas sókkal helyettesítik (ilyen pl. Suprachol drazsé, amely dehidrokólsavat tartalmaz, a Bilagit drazsé, amely egyebek mellett a kólsav nátriumsóját tartalmazza, vagy a Bilival tabletta, amely a kólsav nátriumsójának a lecitinnel képezett komplexét tartalmazza) vagy pedig detergens típusú vegyületekkel. Ilyen célra alkalmazzák a Tween-60, Polysorbat 80 stb. típusú terméket, amelyek a szorbitán-hidrid polioxi-etilén éterek sztearinsav és olajsav észtereinek a keveréké. Ezek a detergensek viszonylag nagy dózisban (naponta 6 g) alkalmazandók orálisan (pl. elzáródásos icterusban, sprueban, coeliakiában), a zsírsavak felszívódásának az előmozdítására.

A detergensek csak micellákat képeznek a lipidekkel, nem pedig viszonylag nagy stabilitású komplexeket, ezért viszonylag csak nagy mennyiségben képesek kifejteni hatásukat. Epesav tartalmú gyógyszerek alkalmazásával az epetermelés fokozódik.

Az epesavakat többnyire a természetes epe helyettesítésére alkalmazzák pl. epe flsztula esetében, amikor is az epe beömlés a bélbe nem történik meg. Ilyen esetekben az orálisan beadott epesavak a gátolt zsfr-reszorpciót meg tudják javítani. Elzáródásos sárgaság esetén, amikor az epetermelés a májban tulajdonképpen folytatódik, nem szabad a betegnek adni epesavtartalmú gyógyszereket. Ugyanis ezáltal csak fokozódik annak az epének a termelése, ami nem képes bejutni a bélcsatornába. Eperoham esetén nem szabad adni az epeköves pácienseknek epesavtartalmú készítményeket azon célból, hogy a nagy mennyiségű híg epe termelésével próbáljuk meg az epekő eltávolítását. Ez az epehólyag rupturáját okozhatja. Különösképpen kérdéses az, hogy hepatitisben szenvedő, tehát károsodott májfunkciójú betegeknek szabad-e a máját terhelni a szervezetben recirkuláló epesavak-21 kai.

Az epesavak és a vérkoleszterin szintje közötti szoros összefüggés kontraindikálja azt, hogy a zslremésztést a szervezetbe bejuttatott epesavakkal segítsük elő. Magas vérkoleszterin szint esetében — ami az arterioszklerózis velejárója, ill. előidézője — epesavaknak a bélcsatornából történő folyamatos eltávolítása a vérkoleszterin-szint csökkenést eredményezi. A cholestipol (cholestyramin) orális adagolása a bélcsatornában az epesavakat megköti, azok a széklettel folyamatosan kiürülnek, igy recirkulációjuk csökkentett mértékű. Ez ahhoz vezet, hogy a máj az epetermeléshez a vér koleszterin tartalmát veszi igénybe. A gondolatmenet megfordításával arra lehet következtetni, hogy a kívülről bejuttatott epesav azt eredményezi — ha az epesavnak koleszterinné történő alakulása nem bizonyított —, hogy kevesebb koleszterint von el a vérből a máj az epesavak szintéziséhez. Amennyiben tehát a zsíreinésztést epesavaknak a kívülről történő beadagolása nélkül is normalízálni tudjuk, akkor nem rontunk a májnak a koleszterint epesavvá átalakító tevékenységén. A hiperkoleszterinémia kezelése a már említett ioncserélő gyanták orális adagolásával történik. Ezek a bélcsatornában nemcsak az epesavakat kötik meg, hanem a megfigyelések szerint jelentős mértékben gátolják a zsíroldékony vitaminok felszívódását is. A K vitamin felszívódási zavara pl. hipoprotrombinémiát okozhat. Ilyen esetekben az eddig alkalmazott epesav tartalmú gyógyszerek orális adagolása nem jöhet számításba, hiszen éppen azoknak a bél csatornából történő eltávolítása a célja a kezelésnek. A cholestipol típusú ioncserélő gyanták említett epesav eltávolító hatását törvényszerűen kíséri a maiabszorpció, mint komoly panaszokat okozó mellékhatás. A zsíremésztést és felszívódást elősegítő gyógyszerre tehát szükség van, viszont az epesavak alkalmazása ilyen esetben számos hátránnyal jár.

Ezért az epét célszerű lenne egészen eltérő típusú, nem a májon át kiválasztódó, illetve az epehólyagba ürülő vegyülettel helyettesíteni. Találmányunk lényege az a meglepő felismerés, hogy a különböző metilezett ciklodextrinek alkalmasak erre a célra.

A keményítőt egy speciális keményítőbontó enzimmel, az ún. ciklodextrin transzglikoziláz enzimmel lebontva ciklikus szerkezetű dextrinek állíthatók elő. Ezek a 6,7 vagy 8 glükóz egységből felépülő ún. ciklodextrinek. Jellemzőjük, hogy vízben oldódnak és különböző alkalmas méretű apoláros ún. venijígmolekulákkal zárványkomplexeket képeznek. A zárványkomplexek vízoldékonysága kicsi. Korábban megfigyeltük azt, hogy parciálisán metilezett ciklodextrin vízoldékonysága jelentős mértékben megnövekszik és ugyanakkor a zárványkomplexeik vizoldékonysága is lényegesen jobb, mint a nem szubsztituált ciklodextrinek zárványkomplexeié.

Részletesebb vizsgálatok igazolták azt, hogy vízben nem, vagy csak nagyon kis mértékben oldható anyagokból alkalmas metilezett ciklodextrin származékokkal olyan oldatok állíthatók elő, amelyek pl. injektálhatok is. A béta ciklodextrin parente rálisan beadva a szervezetbe súlyos vesekárosodásokat okoz. Ezzel szemben dimetil-béta ciklodextrin vesekárosító hatása olyannyira csökkent mértékű, hogy injektábílís karrier anyagként alkalmazása lehetséges.

Az összes metilezett ciklodextrin származék közül a hepatisz-(2,6-di-0-metil)-béta ciklodextrin látszik legalkalmasabbnak a gyakorlati alkalmazásra. A kisebb, vagy nagyobb mértékben parciálisán metilezett ciklodextrinek oldékonysága kisebb.

A heptakisz-(2,6-diO-metíl)-béta ciklodextrin, röviden dimetil-béta ciklodextrin' (a továbbiakban DIMEB), egy hideg vízben nagyon jól oldódó fehér por, amelynek különleges jellemzője az, hogy felmelegítés hatására a koncentráció viszonyoktól függő hőmérsékletnél hirtelen kikristályosodik, lehűtve újra feloldódik.

Ez a hőmérséklet - a koncentrációtól függően 45-60 °C között van. A metilezett ciklodextrinek, ezen belül a dimetil-béta ciklodextrin előállítása a béta ciklodextrin parciális metilezésével történik, erre különböző eljárások ismeretesek. így a béta-ciklodextrin Muskat-féle metilezése — (J. Am. Chem. Soc. 56, 693, 2449 /1934/) vagy a kuhn-féle metilezés — dimetil-formamidban metil-jodiddal bárium-oxid jelenlétében —, illetve ennek egy másik változata — dimetil-formamid és dimetil-szulfoxidban, bárium-oxid és -hidroxid jelenlétében dimetil-szulfáttal — (Tetrahedron, 24,803 /1968/).

A 180.580. sz. magyar szabadalmi leírás a béta-ciklodextrin dimetil-szulfáttal történő metilezését ismerteti vizes oldatban alkálifém-hidroxid jelenlétében 50-100 °C-on. Vízmentes ciklodextrin primer Júdroxil-csoportjait dimetil-formamidban nietil-jodiddal is lehet metilezni (Helv. Chim. Acta, 61, 2190 /1978/). A 190.584, sz. magyar szabadalmi leírás szerint a béta-ciklodextrint dimetil-szulfáttal metilezik -10-0 °C-on abszolút dimetil-formamidban porított nátrium-hidroxid jelenlétében.

A 194.917. sz. magyar szabadalmi leírás béta-ciklodextrin metil-halogeniddel vagy dimetil-szulfáttal való metilezését írja le heterogén fázisban fázistranszfer-katalizátor és szilárd szervetlen bázis jelenlétében.

A 195.524. sz. magyar szabadalmi leírásban leírják a béta-ciklodextrin metilezését dimetil-szulfáttal vagy metil-halogeniddel végzik dimetil-formamid vagy dimetil-szulfoxid oldószerben katalitikus mennyiségű bárium-vegyület és szervetlen bázis alkalmazásával.

A dimetil-béta-ciklodextrin szerves oldószerekben is oldódik. Az állatkísérletek szerint orálisan beadva nem szívódik fel, egereken 3000 mg/ttkg-ig nem sikerült megfigyelni toxikus jelenségeket. Intravénásán beadva 6 órán belül a vesén keresztül teljes egészében kiválasztódik.

Meglepő módon azt találtuk, hogy a természetes epesavakat a dimetil-béta-ciklodextrin helyettesíteni képes mind in vitro (trigliceridek ligázzal végzett hidrolízisénél), mind in vivő körülmények között. In vitro kísérleteinknél azt figyeltük meg, hogy a ligáz hatása fokozódott. Az in vivő kísérleteink során műtéti beavatkozással meggátoltuk azt, hogy a kísérleti állatok (patkányok, nyulak stb.) saját epéjüket tudják használni az orálisan bejuttatott trighcerir dek diszpergálására, illetve felszívódására. A DIMEBet eddig vízben · rosszul oldódó hatóanyagok oldékonyságának fokozására és oldatban kevéssé stabil anyagok stabilitásának fokozására használták. Dimetil-béta-ciklodextrin egyidejű adagolásával az epét sikerült pótolni, az állatok zsírfelszívódása gyakorlatilag normalizálódott.

A dimetil-béta-ciklodextrin (DIMEB) zsíremésztést fokozó hatásának alapja egyrészt az, hogy a

DIMEB még igen kis koncentrációban is képes a víz felületi feszültségének csökkentésére. Ennek igen fontos szerepe van a biológiai lipolizis bevezető folyamatában, a víz—zsír emulzióképződésben. (Az epe szerepe is az emulzióképződés folyamatában lényeges.) A ligázok zsírbontó hatását elsődlegesen az emulzifikálás foka határozza meg. Másrészt kísérletileg igazoltuk, hogy a DIMEB jelenléte fokozza a ligáz aktivitását is, azaz a szer valamilyen módon az enzimre is hat. Ez a hatás alapulhat a zsírok aktiválási folyamatának (koenzim-A-ból történő tioészterképződés) kedvező irányban történő befolyásolásán, illetve közvetlenül az enzim aktív helyén a vízmolekulák mobilizálásával. Ez utóbbi hatás a DIMEB erős vízmegkötő képességén alapszik. A DIMEB találmány szerinti zsíremésztést fokozó hatása tehát nem a hagyományos zárványkomplex-képződésnek és az ebből fakadó zsíroldékonyság növekedésének köszönhető.

Találmányunk tárgya tehát eljárás epehelyettesítő, a zsír emésztését és felszívódását elősegítő gyógyszerkészítmény előállítására, mely a természetes epe pótlására parciálisán metilezett ciklodextrint — előnyösen DÍMEB-et — tartalmaz a gyógyszerkészítésnél szokásosan alkalmazott adalék- és segédanyagokkal összekeverve.

Mivel az elégtelen epefunkció miatt hátrányos zsíremésztés fájdalmas bélgörcsökkel járó bomlási folyamatokat eredményez, a készítmény célszerűen fertőtlenítő, görcsoldó, bélperisztaltika fokozó komponenseket, illetve emésztő enzimeket is tartalmazhat,

A következő példák — találmányunk csupán azokra korlátozásának szándéka nélkül — szemléltetik a metilezett ciklodextrinek epehelyettesítő hatását in vitro és in vivő kísérletekben, illetve a gyógyszerkészítmények előállítását.

Gyógyszerkészítmény példák

1. példa

Heptakiz 2,6-di-0-methyl/

-béta-ciklodextrin 250 mg

Taicum 50 mg

Polividonum 10 mg

Magnesium stearinicum 4 mg

Lactosum 36 mg

350 mg

A ható- és segédanyagokat homogenizáljuk és a polividon alkoholos oldatával granuláljuk.

A granulátum száradása után a tablettázás önmagában ismert szabályai szerint 350 mg-os tablettává préseljük.

2. példa

Heptakisz (2,6-di-O-methyI)-béta-ciklodextrin 50 mg

Lactosum 25 mg

Taicum 19 mg

Magnesium stearinicum 2 mg

Polividonum 4 mg

100 mg

A tabletta készítésénél az 1. példa szerint járunk el, de a granulátumot 100 mg-os tablettává préseljük.

3. példa

Heptakisz (2,6-di-0-methyl)-béta-ciklodextrin 200 mg

Papaverin hydrochloricum 20 mg

Nátrium choleinicum 50 mg

Taicum 14 mg

Lactosum 10 mg

Magnesium stearinicum 4 mg

Polyvidonum 2 mg

300 mg

A drazsémag készítésénél az 1. példa szerint járunk el. A bevonás túlnyomásos készülékben a filmdrazsírozás önmagában ismert szabályai szerint történik.

4. példa

Heptakisz (2,6-di-0-methyl)-
-béta ciklodextrin Polioxie ti len-szorb itan-	150 mg
-monostearát (Tween-60)	150 mg
Aerosil 972	12 mg
Magnézium stearinicum	4 mg
Taicum	30 mg
Polividonum	_4 mg 350 mg

A Tween-60-at az aerosillal apró részletekben homogenizáljuk, majd a ható- és segédanyagokat hozzákeverve a PVP alkoholos oldatával granuláljuk. A granulátum száradása után tablettává préseljük.

Hatástani példák

5. példa

A lipáz hatásfokozódása dimetil-0-ciklodextrin oldatokban

Triglicerideket a lipáz vizes közegben csak rendkívül kis sebességgel képes hasítani. Vagy szerves oldószert kell a rendszerhez adni, ami fokozza a trigliceridek oldékonyságát — ez azonban csökkenti az enzimaktivitást — vagy valamilyen detergenst - célszerűen epét kell alkalmazni. 37 °C-on összehasonlítottuk az epe és a dimetil-0-ciklodextrin hatását olymódon, hogy a reakcióelegyből különböző időpontokban vett mintában a képződött szabad zsírsavak mennyiségét nátrium-hidroxiddal titráltuk.

1,5 ml-es össztérfogatban 4 gmól szubsztrát (trióiéin vagy olívaolaj) 10 mg marhaszérum-albumin, 75 /umól NaCl, 50 Mmól foszfátpuffer (pH= 7,4), és 0,25 ml enzimoldat volt. Az alkalmazott enzimek: Serva gyártmányú lipáz 1 mg/10 ml-es oldatban, illetőleg pankreászpor 0,5 g 10 ml desztillált vízben szuszpendálva, szűrve, a szűrés után kapott enyhén opálos oldatot alkalmaztuk,

A vizsgálandó oldatokat a következőképpen állítottuk össze:

0,5 ml puffer + 10 mg szérumalbumin + 3,54 mg szubsztrát + 0,25 ml enzimoldat + vagy a) = 0,25 ml hígított epe + 0,50 ml deszt.víz, + vagy b) = 50 mg DIMEB 0,75 ml vízben oldva, + vagy c) = 0,75 ml víz.

Mint az 1. táblázatból látható, a dimetil-(?-ciklodextrin jelentős mértékben képes gyorsítani a lipáz hatását.

1, táblázat

In vitro enzimes triglicerid hidrolízis epe vagy DIMEB jelenlétében

Reakcióidő Fogyott 0,005 N NaOH ml óra

I. epe: 5x hígított sertésepe, szubsztrát: olívaolaj, enzim: patikreász szuszpenzió

	a. (epe)	b. (DIMEB)	c. (kontroll)
0,5	0,82	1,74	0,0
1	1,17	2,00	0,36
2	1,37	2,20	0,48
19	2,62	4,77	0,63
reakcióseb.
növekedése	4x	7,4x

II. epe: csirkeepe lOx higítva, szubsztrát: glicerin-trioleát, enzim: lipáz

	a. (epe)	b. (DIMEB)	c. (kontroll)
1	0,20	0,34	0,0
2	0,32	0,80	0
3	0,48	1,16	0
21	0,58	1,86	0,1
reakcióseb.
növekedése	6x	18x

III epe: csirkeepe 5x hígítva, szubsztrát: glicerin-trioleát, enzim: lipáz

	a. (epe)	b. (DIMEB)	c. (kontroll)
1	0,26	0,28	0
2	0,46	0,68	0
4	0,74	1,20	0,14
reakcióseb.
növekedése	5x	8,5x
		6. példa

Lipid felszívódás fokozása DIMEB per os alkalmazásával intakt patkányokon

Intakt patkányokon vizsgáltuk a DIMEB hatását étolaj felszívódására. A kísérlet célja annak tisztázása Költ, hogy fiziológiás epe-funkciók mellett a DIMEB stimulálja-e az étolaj eniulgeálását és intestinális abszorpcióját. A kísérleti állatoknak egyidejűleg adtunk be orális úton (gyomorszondával (2 ml naprafogó-étolajat) és 50 mg DIMEB-et. Ezután különböző időpontokban vizsgáltuk a vérplazma triglicerid és szabad zsírsav koncentrációját (II. és III. táblázat).

A kezelést követő első órában a kontroll és a kezelt csoportok plazma-triglicerid szintjei (II. táblázat) között nincs szignifikáns különbség. A 4. órában a kontroll és az olajjal kezelt csoportok triglicerid koncentrációja között még nincs szignifikáns eltérés jelezvén azt, hogy az emésztés folyamata még zajlik, de az olaj+DIMEB-el kezelt állatcsoporthoz viszonyítva is szignifikánsan nagyobb plazma triglicerid koncentráció figyelhető meg. A 4. órára a DIMEB alkalmazása több, mint 100%-al emeli a plazma triglicerid koncentrációját. A 6. órában már az olajjal kezelt állatok plazma triglicerid szintje is szignifikánsan emelkedik a kontrolihoz viszonyítva, de ez az érték még mindig szignifikánsan alacsonyabb, mint az olaj* +DIMEB-el kezelt csoportban. Hasonló tendenciák figyelhetők meg a szabad zsírsav tekintetében is (III. táblázat).

A plazma triglicerid koncentrációját Van Handel (Van Handel E. 1961. Clin. Chem. 7, 249—251.) szerint, a szabad zsírsav koncentrációját pedig Dumcombe (Dumcombe W. G. 1963. Biochem. J. 88, 7—10.) szerint határoztuk meg.

II. táblázat

Normál patkányok plazma triglicerid koncentrációja mg/100 mi ben kifejezve (kezelés: 2 ml étolaj, illetve 2 ml étolaj* *50 mg DIMEB)

Kontroll Olaj Olaj*DIMEB

0 óra	49112
1 óra		43+ 8	441 6
2,5óra		72+18	61H8
4 óra		58+11	12U 7
6 óra		88± 5	122±15

III, táblázat

Normál patkányok plazmájának szabad zsírsav koncentrációja mg/100 ml-ben kifejezve (kezelés: 2 ml étolaj, illetve 2 ml étolaj* *50 mg DIMEB)

	Kontroll	Olaj	Olaj*DIMEB
0 óra	97136
1 óra		240+ 70	3261 15
2,5óra		412+146	4941183
4 óra		318+ 93	64U126
6 óra		412+ 88	347+ 65

Az ismertetett kísérleti eredmények azt bizonyítják, hogy a DIMEB hatékonyan fokozza a trigliceridek formájában a bélbe juttatott lipidek felszívódását egészséges, intakt állatokon is.

7. példa

Az epe helyettesítése nyulakon

Nyulakon az epe vezeték lekötésével (choledochus ligatura) tanulmányozni tudjuk azt, hogy normális pankreász elválasztás esetén hogyan pótolható az epe.

A kísérleti nyulakat (Orychtolagus cuniculus) a kísérlet előtt 10 napon át standard tápon tartottuk, melynek szerves anyagösszetétele a következő volt:

nyersfehéqe 16,0% oldható szénhidrát 42,7% nyersrost 12,6% nyerszsír 7,3% vitaminkeverék 1,0%

100 g tápszer energiatartalma 1360 Joule volt. Az állatokat az operatív beavatkozások előtt 12—24 órán át éheztettük, vizet ad libitum kaptak. Egy kísér-51

Jeti sorozaton belül azonos nemű, 2500-3000 g tömegű nyulakat használtunk, a műtéteket egyidőben végeztük. Kontrollként ál-műtött állatok szolgáltak. A choledocus ligaturát nembutal-éter narkózisban, médián laparatomia után végeztük. Ezzel egyidejűleg az epehólyagot steril körülmények között pungáltuk (elkerülendő a ligatura utáni epehólyag rupturát). A sebszélek zárásával egyidejűleg antibiotikumot használtunk. A míítött kísérleti állatokat 48 óra múlva alkalmaztuk a kísérletekhez.

A vizsgált anyagokat az állatoknak orálisan, gyomorszondán keresztül adtuk be. A vérvétel a v. auricurális marginálisból történt.

Az első kísérletsorozatban az állatoknak 3 ml napraforgó olajat vagy 3 ml napraforgó olajat és 3 ml vízben oldott 200 mg DIMEB-et adtunk be. A kontroll (álműtött) állatok 6 ml vizet kaptak. A IV. táblázat adatai szerint epesavak hiányában és lipáz jelenlétében a lipidek emésztése igen lassú, mivel számottevően nem fokozódott a plazma triglicerid koncentrációja a 6 órás kísérleti periódus alatt. Azon csoport, mely az étolaj adásával egyidejűleg DIMEB-et is kapott, már az első órától kezdve szembetűnően és szignifikáns triglicerid-szint emelkedést mutatott. A 6. órában a csak étolajjal kezelt csoportban 45,30± ±10,83 mg/100 ml triglicerid koncentrációt mértünk a plazmában, míg a zsír+DIMEB-el kezelt csoportnál ez az érték csaknem a háromszorosára 125,63±3,14 mg/100 ml-re emelkedett.

Ismeretes, hogy a zsírok emésztése lassúbb folyamat, mint az olajoké. Ezért a második kísérletben choledochus ligáit nyulakon 5 ml sertészsír, vagy 5 ml sertészsír + 300 mg DIMEB orális bevitele után követtük a plazma triglicerid koncentráció változásait (V. táblázat) (Kontroll: 6 ml víz).

Már a kezelést követő 1 óra elteltével mintegy 100%-al emelkedett a triglicerid mennyisége, a másik két csoporthoz viszonyítva. Ez a tendencia a 6 órás kísérleti idő alatt permanensen megmaradt. Minden időpontban mért érték szignifikánsan magasabb, mint a másik két csoportnál.

E kísérleti sorozat egyértelmű bizonyítékot adott arra, hogy a DIMEB szignifikánsan képes elősegíteni a triglicerídek felszívódását acut kísérletes epesav-hiányban, azaz helyettesíti a természetes epét. Elősegíti a lipidek diszpergálását, a lipáz emésztő funkcióját, és a felszabaduló zsírsavak abszorpcióját.

IV. táblázat

Choledochus ligatura utáni kezelés hatása nyulak plazma triglicerid koncentrációjára, mg/ /100 ml-ben. (Kezelés: 3 ml napraforgó olaj, illetve 3 ml napraforgó olaj ♦ 200 mg DIMEB). Kontroll:

ml víz.

abszolút kontroll: 51,0±12,82 mg/100 ml órás műtött kontroll: 49,03±16,57 mg/100 ml

	Álműtött kontroll	Olaj	Olaj+DIMEB
0 óra	36± 7	461 5	51±19
1 óra	34± 5	57±10	96132
2,5óra	301 5	47110	87130
4 óra	46±10	401 6	61114
6 óra	701 6	45110	1251 3

V. táblázat

Choledochus utáni kezelés hatása nyulak plazma triglicerid koncentrációjára, mg/100 ml-ben (kezelés: 5 ml sertészsír, illetve 5 ml sertészsír+

300 mg DIMEB) Kontroll: 6 ml víz

	Kontroll	Zsír	Zsír+DIMEB
0 óra	49+14	46± 5	58119
1 óra	341 5	57HO	104+30
2,5óra	301 5	47110	92±26
4 óra	46110	40+ 6	83125
6 órá .	701 6	45110	1251 3

8. példa

Az epe helyettesítése patkányokban

A kísérleti patkányokat (Etyinis rattus var. albínó) a kísérlet előtt 10 nappal standard tápon tartottunk, melynek összetétele:

nyersfehérje 19,6% nyersrost 5,6% oldható szénhidrát 49,2% zsír 4,6% vitamin-keverék 1,0%

100 g ilyen tápszer energiatartalma 1382 Joule.

Az első kísérletsorozatban a plazma totállipid kocentrációját vizsgáltuk epe-hiányos patkányokban. A choledochus-Iigaturát éter-narcozisban hoztuk létre. A műtét után 48 óra elteltével 1,5 ml sertés zsírt, vagy 1,5 ml sertészsírt + 75 mg DIMEB-et yittünk be orálisan. 4,5 óra múlva az állatokat dekapitáltuk és a plazma totállipid koncentrációját meghatároztuk. (A totállipid meghatározása de La Huerga et al: Amer. J. Clin. Pathol. 23, 1163 /1953/ szerint történt.) A VI. táblázat adatai szerint a ligatura után nem változott jelentősen a totállipid koncentráció. A csak zsírral kezelt epevezeték-ligaturás állatokban az előző csoporthoz és a kontrolihoz viszonyítva is szignifikáns totállipid koncentráció fokozódást tapasztaltunk. Mindhárom állatcsoporthoz viszonyítva nagyon jelentős és erősen szignifikáns totállipid koncentráció emelkedést figyeltünk meg a zsír + DIMEBel kezelt állatcsoportban. Míg a zsírt kapottak esetében 2,5-szeresére, addig a zsír + DIMEB kezeiteknél 5-szörösére emelkedett a totállipid frakció a vérplazmában.

Egy másik kísérletsorozatban vizsgáltuk az epe-hiányos patkányok által ürített faeces totállipid tartalmát.

órával a ligatura létesítése után kezdtük meg az orális kezelést 1 ml sertészsír, illetve 1 ml sertészsír + + 150 mg DIMEB nap mennyiségekkel 5 napon keresztül. A faecest a kezelés első 4 napjában összegyűjtöttük. Az 5. napi kezelés után 4 órával későbbi kísérleti állatokat dekapitáltuk, mintáikat feldolgoztuk. A VII. táblázatban a 4 nap alatt a faecesben kiürült lipid mennyiségek változásait látjuk. Az intakt és standard módon táplált kontroll patkányokhoz viszonyítva a hasonló módon táplált, de epevezeték-ligatúrával ellátott állatok faecesében szignifikánsan magasabb az ürülő lipid koncentrációja. A zsírral táplált állatok faecesében rendkívül sok lipid ürül, A lipid-ürülést azonban dramatikusan csökkenti a 150

19(1.128 mg/nap DIMEB adása. A bevitt zsírnak csaknem 100%-a abszorbeálódott a DIMEB hatására.

Ezen eredményekkel teljes összhangot mutat a plazma totállipid, triglicerid és a máj triglicerid koncentrációjának alakulása, melyet a Vili. táblázat szemléltet. A plazma totállipid koncentrációja a zsír és a zsír + DIMEB-el kezelt csoportban szignifikánsan magasabb, mint az epeligaturás vagy kontroli-csoportban megfigyelt hasonló érték. Lényeges azonban az, hogy a zsír + DIMEB kezeiteké szignifikánsan magasabb, mint a csak zsírral kezeiteké.

Teljesen hasonló a tendencia a plazma triglicerid koncentrációjának esetében is. A zsír és zsír + DIMEB kezelt csoportok között szignifikáns az eltérés. Az epeligaturás, de más kezelést nem kapott csoportban szignifikánsan csökkent a máj triglicerid koncentrációja. A zsírral történt kezelés e csoportban a kontroll értékére állítja vissza a triglicerid koncentrációt. A zsír + DIMEB kezelés az előző csoporthoz viszonyítva szignifikáns triglicerid koncentráció emelkedést okoz.

Annak bizonyítására, hogy a vér lipidszint emelkedése nem a szervek (máj, zsírszövet) lipid tartalmának a mobilizálásából ered, hanem a zsírfelszívódás fokozódásából, normál tápon tartott patkányokat 31 napon át napi 150, illetve 300 mg/kg DIMEB-el kezeltünk orálisan. A IX. táblázat adatai szerint sem a plazma, sem a máj triglicerid tartalmát nem befolyásolta a DIMEB,

VI, táblázat

Choledochus lígatura utáni zsír beadás hatása patkányok vérplazmájának totállipid koncentrációjára, mg/100 ml-ben (kezelés: 1,5 ml zsír, illetve 1,5 ml zsír + 75 mg DIMEB kontroll lígatura előtt: kontroll lígatura után: zsír kezelés: zsír * DIMEB kezelés:

207,1+ 43,3 266,6+ 39,5 657,7+262,6 1266,6+86,5

VII. táblázat

Epesav-hiányos patkányok zsírürítése, g/100 g-ban kifejezve (kezelés: 1 ml zsír, illetve 1 ml zsír + + 150 mg DIMEB naponta, 5 napon át)

kontroll lígatura előtt:	0,44+0,23
kontroll lígatura után:	4,08+1,96
ligatura * zsír:	27,55+4,72
lígatura + zsír + DIMEB:	6,16+2,37

Vili. táblázat

Epesav-hiányos patkányok plazma totállipid, plazma triglicerid, illetve máj triglicerid koncentrációja mg/100 ml-ben 5 napos kezelés után

Totállipid Plazma Máj triglicerid triglicerid kontroll lígatura előtt után lig.+zsíi ligjzsír+DIMEB

281 ± 54,5 319,9+ 32,3 528,3+111,2 688,7+ 95,8

IX. táblázat

35,4+ 4,8 7,3+1,6 28,1+ 4,3 4,2+0,3 40,1+11,5 6,4+1,9 71,9+19,1 9,1+2,2 napig tartó orálisan napi 150, illetve 300 mg/kg DIMEB kezelés hatása normál patkányokon mg/100 ml-ben

Plazma triglicerid máj triglicerid kontroll

150 mg/kg DIMEB 300 mg/kg DIMEB

52,5+7,4

48,3+4,5

45,9+3,1

4,5+0,9 3,6+1,0 3,8+1,4 tartott patkányokat 31 napon át napi 150, illetve 300 mg/kg DIMEB-el kezeltünk orálisan. A IX. táblázat adatai szerint sem a plazma, sem a máj triglicerid tartalmát nem befolyásolta a DIMEB.

Az ismertetett kísérletek bizonyítják, hogy DIMEB-el a természetes epe helyettesíthető. Mivel más irányú kísérletek bizonyították, hogy a DIMEB az emésztőcsatornából nem szívódik fel, sőt intravénásán beadva is gyorsan és maradéktalanul kiürül, lehetséges a természetes epét pótló gyógyszerkészítmény előállítása és alkalmazása,

9. példa ³ H-sztearinsav felszívódásának vizsgálata DIMEB egyidejű per os alkalmazásával intakt patkányokon

Intakt patkányokon vizsgáltuk a DIMEB hatását a ³ H-sztearinsav felszívódására. A kísérlet célja annak tisztázása volt, hogy fiziológiás epe-funkciók mellett a DIMEB stimulálja-e a sztearinsav felszívódását. Az állatokat a kísérlet előtt egy éjszakán át és a kísérlet alatt éheztettük, vizet ad Ubitum kaptak. A kísérleti állatok — átlag 180 g tömegű CFY nőstény patkányok — egyik csoportja (3 állat) 13 mg ³H-sztearinsavat (specifikus radioaktivitása: 147,22 kBq/mg), a másik csoport (3 állat) 11,3 mg ³H-sztearinsavat és 50 mg DIMEB-et kapott 2 ml desztillált vízben. Az anyagokat a desztillált vízben ultrahanggal szuszpeifdáltuk el. Ezután különböző időpontokban folyadék-szcintillációs módszerrel meghatároztuk a vér radioaktivitásszintjét (X. táblázat).

Nem találtunk különbséget a 2 csoport vérszintje között. A vér radioaktivitása 1,8-1,9%-a volt a beadott radioaktivitásnak 1 órával a kezelés után, majd lassan emelkedett. A 24. óránál a beadott radioaktivitás 2,7%-a volt a vérben. Fiziológiás epe-funkciók mellett tehát a DIMEB-nek nem volt felszívódást fokozó hatása.

196.128

X. táblázat

Intakt patkányok 10 ml vérében mért radioaktivitás a beadott össz-radioaktivitás százalékában kifejezve (kezelés: 13 mg ³H-sztearinsav, illetve 11,3 mg³ H-sztearinsav* +50 mg DIMEB 2 ml desztillált vízben)

Idő	³ H-sztearinsav	³ H-sztearinsav+DIMEB
(óra)	1 2 3	X	4	5	6	X

1	1,92	1,97	1,47	1,79	1,71	1,74	2,23	1,89
2	1,95	2,10	1,93	1,99	1,84	1,88	2,00	1,91
3	2,15	1,97	2,03	2,05	2,03	1,75	2,13	1,97
4	2,12	1,98	2,11	2,C7	2,12	1,71	1,99	1,94
5	2,11	1,89	2,12	2,04	2,10	1,75	2,00	1,95
6	2,08	1,87	2,15	2,03	2,16	1,84	2,04-	1,98
8	2,35	1,93	2,23	2,17	2,16	1,84	1,94	1,98
10	2,59	2,39	2,50	2,49	2,20	2,02	2,21	2,14
24	2,97	2,63	2,43	2,68	2,84	2,94	2,39	2,72

10. példa ³H-sztearinsav felszívódásának vizsgálata DIMEB egyidejű per os alkalmazásával epehiányos patkányokon

Patkányokon az epevezeték lekötésével tanulmányoztuk, hogy epehiány esetén hogyan helyettesíti a DIMEB az epét.

Az állatokat — átlag 180 g-os CFY nőstény patkányokat - 24 óra éheztetés után nembutal narcosisban megműtöttük, epevezetéküket lekötöttük. 48 óra múlva végeztük el a felszívódás vizsgálatot, előzőleg az állatok egy éjszakán át éheztek. A vizsgálat során is éheztek, vizet ad libitum kaptak. A patkányok egyik csoportja (3 állat) 12,8 mg ³H-sztearin30 savat (specifikus radioaktivitása: 171,12 kBq/mg), másik csoportja (3 állat) 14,7 mg ³H-sztearinsavat és 50 mg DIMEB-et kapott 2 ml desztiUált vízbén. Az anyagokat a desztiUált vízben ultrahanggal szuszpendáltuk el. Ezután különböző időpontokban folyadék-szcintülációs módszerrel meghatároztuk a vér radioaktivitás szintjét (XI. táblázat).

A két csoport vérszintje között lényeges különbséget találtunk. A ³H-sztearinsav+DIMEB-el kezelt csoportban a beadott radioaktivitás 1,97%-át mértük az állat 10 ml vérében a beadás után 1 órával, mig a ³ H-sztearinsawal kezelt csoportban csak 0,73%-át. A beadás utáni 24. órában a DIMEB-bel is kezelt áUatok vérszintje 1,4-szerese volt a csak sztearinsawal kezeitekének. A DIMEB tehát elősegítette a zsírsav felszívódását kísérletes epehiányos áUatokban.

196.128

XI, táblázat

Epehiányos patkányok 10 ml vérében mért radioaktivitás a beadott össz-radioaktivitás százalékában kifejezve (kezelés: 12,8 mg ³H-sztearinsav, illetve 14,7 mg ³H-sztearinsav+ +50 mg DIMEB 2 ml desztillált vízben)

Idő (óra)

1

2

³H-sztearinsav 3 x

4

5

³ H-sztearinsa v+DIMEB 6 x

1	0,59	0,82	0,78	0,73	0,86	3,45	1,61	1,97
2	0,68	1,06	1,06	0,93	1,05	3,25	2,56	2,29
3	0,77	1,19	1,16	1,04	1,14	3,22	2,39	2,25
4	0,84	1,32	1,30	1,15	1,19	3,06	2,28	2,18
5	0,92	-	1,50	1,21	1,24	3,08	2,27	2,20
6	0,93	1,50	1,51	1,31	1,25	2,91	2,56	2,24
7	0,96	1,68	1,64	1,43	1,33	3,03	2,67	2,34
8	1,10	1,65	1,67	1,47	1,37	3,13	2,58	2,36
10	1,10	1,84	1,57	1,50	1,29	3,26	2,67	2,41
24	2,44	. 2,60.	2,09	2,38	1,60	4,56	4,00	3,39

11. példa ^aH-sztearinsav felszívódásának vizsgálata DIMEB egyidejű per os alkalmazásával epehiányos patkányokon

Patkányokon az epevezeték lekötésével tanulmányoztuk, hogy epehiány esetén hogyan helyettesíti a DIMEB az epét. Az állatokat - átlag 150 g-os CFY nőstény patkányokat - 24 óra éheztetés után nembutal narcosisban megműtöttük, epevezetéküket lekötöttük. 48 óra múlva végeztük el a felszívódás vizsgálatot, előzőleg az állatok egy éjszakán át éheztek. A vizsgálat során is éheztek, vizet ad libitum kaptak.

A patkányok egyik csoportja (4 állat) 22,2 mg ’H-sztearinsavat (specifikus radioaktivitása: 92,5 kBq/mg), másik csoportja (4 állat) 23,5 mg ³H-sztearinsavat és 60 mg DIMEB-et kapott 2 ml desztillált vízben. Az anyagokat a desztillált vízben ultrahanggal szuszpendáltuk el. Ezután különböző időpontokban

4θ folyadék-szcintillációs módszerrel meghatároztuk a vér radioaktivitás szintjét (XII. táblázat). A két csoport vérszintje között lényeges különbséget találtunk. A beadás után 1 órával 4,4-szer magasabb volt a DIMEB-bel is kezelt állatok vérszintje, majd a küjr lönbség lassan csökkent, a 24. órában már csak 2-szerese volt a DIMEB-bel is kezelt állatok vérszintje a csak sztearinsawal kezeitekének.

A DIMEB tehát elősegítette a zsírsav felszívódását kísérletes epehiányos állatokban.

196.128

XII. táblázat

Epehiányos patkányok 10 ml vérében mért radioaktivitás a beadott össz-radloaktivitás százalékában kifejezve (kezelés: 22,2 mg ³H-sztearinsav, illetve 23,5 mg ³H-sztearinsav+60 mg DIMEB)

Idő ³H-sztearinsav ³H-sztearinsav+DIMEB

	1	2	3	4	X	5	6	7	8	X
1	0,26	0,36	0,22	0,24	0,27	1,18	1,41	1,66	0,50	1,19
2	0,43	0,57	0,29	0,35	0,41	1,46	1,52	1,52	0,64	1,28
3	0,53	0,75	0,37	0,33	0,49	1,29	1,63	1,37	0,61	1,22
4	0,62	0,76	0,43	0,38	0,55	1,42	1,67	1,56	0,60	1,31
5	0,57	0,85	0,50	0,39	0,56	1,39	1,73	1,54	0,69	1,34
6	0,59	0,85	0,55	0,40	0,60	1.41	1,92	1,76	0,73	1,45
8	0,57	0,96	0,83	0,43	0,70	1,43	1,90	1,85	0,72	1,47
10	0,71	0,91	0,83	0,47	0,73	1,57	1,56	1,45	0,89	1,37
24	0,74	0,82	0,86	1,03	0,86	1,50	1,94	1,59	1,95	1,74

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Eljárás hatóanyagként parciálisán metilezett béta-ciklodextrint tartalmazó gyógyszerkészítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy metil-halogemddel vagy dimetil-szulfáttal ismert módon parciálisán metilezett béta-ciklodextrint a gyógyszerkészítményeknél szokásosan alkalmazott töltő-, hígító- és egyéb adalék anyagokkal összekeverünk és zsíremésztést és -felszívódást elősegítő gyógyszerkészítménnyé készítünk ki.

(1985.01. 10.)
2. Eljárás hatóanyagként parciálisán metilezett béta-ciklodextrint tartalmazó gyógyszerkészítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy

a) heterogén fázisban fázistranszfer-katalizátor és szilárd szervetlen bázis jelenlétében vagy

b) dimetil-formamid vagy dimetil-szulfoxid oldószerben katalitikus mennyiségű bárium vegyület és

30 szervetlen bázis jelenlétében metil-halogeniddel vagy dimetil-szulfáttal ismert módon parciálisán metilezett béta-ciklodextrint a gyógyszerkészítményeknél szokásosan alkalmazott töltő-, hígító- és egyéb adalék anyagokkal összekeverünk és zsíremésztést és -felszívódást elősegítő gyógyszerkészítménnyé készítünk ki.

(1988. 03. 29.)
3, Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy parciálisán metilezett béta-ciklodextrinként heptakisz(2,6-di-0-metil)-béta-ciklodextrint alkalmazunk.

(1985.01.10.)
4. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy parciálisán metilezett béta-ciklodextrinként heptakisz(2,6-di-0-metil)-béta-ciklodextrint alkalmazunk.