HU195474B

HU195474B - Process for production of n-phenil-benzamid-derivatives

Info

Publication number: HU195474B
Application number: HU84633A
Authority: HU
Inventors: Gerhard Satzinger; Manfred Herrmann; Edgar Fritschi; Ute Weierhausen
Original assignee: Goedecke Ag
Priority date: 1983-02-19
Filing date: 1984-02-17
Publication date: 1988-05-30
Also published as: DK76784A; CA1244050A; EP0116967A1; YU28784A; DK166383C; DK57492D0; DK76784D0; US4816485A; DD216452A5; SU1333234A3; JPS59163356A; AU565185B2; DK57492A; DE3460026D1; IE56587B1; DE3305755A1; ZA841187B; US4857662A; US4933368A; ES8501368A1

Description

Találmányunk alapját az képezi, hogy az 1 általános képletű vegyületek — ahol

R^l, R² és R³ azonos vagy különböző lehet és jelentésük hidrogénatom vagy metilcsoport —, valamint gyógyászatilag elfogadható sóik értékes farmakológiai tulajdonságokkal rendelkeznek, melyek alkalmassá teszik ó'ket különösen malignus, proliferativ és autoimmun betegségek kezelésére, valamint transzplantációknál immunszuppressziós (a természetes immunválaszt bénító) terápia számára.

Diamino-benzaldehid-szárntazékok a 39 26 922 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásból poliuretán elasztomerek előállítására alkalmas kiindulási anyagokként váltak ismertté. E vegyületcsoport farmakológiai hatását azonban mindezideig nem írták le.

A Japán Kokai Tokkyo Kono JP 82 21,320 irodalmi helyről ismertek továbbá bizonyos 3-amino-benzamid származékok, melyek hipoglikémiás aktivitással rendelkeznek.

Azok az I általános képletű vegyületek szűkebb körét képező vegyületek, melyekben az R’ és/vagy R²szubsztituens legalább egy metilcsoportot tartalmaz, új vegyületek, melyeket külön jelöltünk a II általános képlettel; e képletben R⁴ és R⁵ közül legalább az egyik szubsztituens metilcsoportot jelent, a másik hidrogénatomot vagy metilcsoportot jelentenek, és R⁶ jelentése hidrogénatom vagy metilcsoport.

Így találmányunk tárgyát az új II általános képletű vegyületek előállítása, valamint az I vagy II általános képletű vegyületeket tartalmazó, az immunrendszer betegségeinek kezelésére és immunszuppresszív terápiára alkalmas gyógyszerkészítmények előállítása képezi.

A II általános képletű vegyületeket úgy állítjuk elő, hogy a Illa és a Illb általános képletű vegyületeket — ahol

A reakcióképes savcsoportot,

Z hidrogénatomot vagy metilcsoportot jelent és X és Y azonos vágj' különböző lehet és jelentésük védó'csoporttal ellátott aminocsoport vagy nitrocsoport — ismert módon reagáltatjuk egymással és így IV általános képletű vegyületeket — álról X Y és Z jelentése a fenti kapunk; e vegyületeket hidrogéngázzal reagáltatjuk és — kívánt esetben — hidrolizáljuk, majd savak segítségével farmakológiailag elfogadható sókká alakítjuk át.

Különösen előnyben részesítjük azokat a II általános képletű vegyületeket, ahol az -NHR¹ általános képletű csoportok a karbonilcsoporthoz viszonyítva parahelyzetűek.

A gyógyászati készítmények előállításánál jó farmakológiai hatásuk alapján különösen előnyösek a következő vegyületek:

— 4-amino-n-(2’-amino-fenil)-benzamid — 4-metil-amino-N -(2 ’-amino-fenil)-benzamid — 4-amino-N-(2’-metiI-amino-fenil)-benzamid — 4-amino-N-(2’-amino-fenil)-N-metil-benzamid.

A sók tekintetében minden gyógyászatilag alkalmazható savaddíciós só tekintetbe jön, például hidrogén halogenidekkel, mint hidrogén-kloriddal vagy hidrogén-bromiddal, kénsavval, foszforsavval, salétromsavval; alifás, aliciklusos, aromás vagy heterociklusos karbonvagy szulfonsavakkal, mint hangyasavval, ecetsawal, propionsawal, borostyánkó'sawal, glikolsavval, tejsavval, almasawal, borkősawal, citromsavval, aszkorbino savval, maleinsawai, hidroxi-maleinsawai vagy piroszőlősavval; fenil-e cet savval, benzoesawal, p-amino-benzoesawal, antranilsavval, p-liidroxi-benzoesavval, szalicilsawal vagy p-amino-szalicilsawal, metánszulfonsnwal, etánszulfonsawal, hidroxi-etánszulfonsawal, etílén-szulfonsavvai; haiogén-benzolszulfonsawal, toluolszulfonsawal, naftilinszulfonsawal vagy szulfanilsawal; metioninnal, lizinnel vagy argininnel képezett sók.

Az I és II általános képletű vegyületek előnyösen alkalmazhatók olyan gyógyászati készítmények alakjában, melyek a hatóanyagokat szabad formában, vagy gyógyászatilag elfogadható só formájában tartalmazzák, például helyi, enterális, mint orális vagy rektális, vagy mindenekelőtt parenterális, mint intramuszkuláris vagy intravénás adagolásra alkalmas szerves vagy szervetlen szilárd gyógyszerészeti hordozóanyagokkal elkeverve. A készítmények előállításához a vegyületekkel nem reagáló anyagok jönnek tekintetbe, így például zselatin, tejcukor, keményítő, sztearil-alkohol, magnézium-sztearát, talkum, növényi olajok, benzil-alkoholok, propilénglikolok, vazelin vagy egyéb gyógyszerészeti vivőanyagok.

A gyógyszerkészítmények formája például tabletta, cukorral bevont tabletta, kapszula, végbélkúp, kenőcs, krém lehet, vagy folyékonyak lehetnek, mint oldatok, szuszpenziók vagy emulziók. Szükség esetén sterilizáljuk őket és/vagy segédanyagokat, mint tartósító, stabilizáló, nedvesítő, oldódást elősegítő szereket vagy az ozmózisnyomás módosítására sókat, vagy puffereket tartalmaznak. További hatóanyagokat is tartalmazhatnak.

Az alkalmazandó dózis függ a kezelendő betegség ki nikai képétől és egyéni tényezőktől.

Általában 10—300 mg, különösen 20—100 mg dózisokat alkalmazunk. Speciális esetekben az egyedi adagolás nagyobb is lehet.

A Illa általános képletű vegyületeket a Illb általános képletű vegyületekkel ismert eljárással reagáltatjuk. Reakcióképes A savcsoportokként különösan savhalogenid-, savanhidrid-, savimidazolid- vagy észtercsoportokat alkalmazunk, melyek lehetővé teszik az aminocsoporttal való reagálást. így az A szubsztituens előnyösen halogénatomot, imidazolil-, acil- vagy kisszénatomszámú alkilcsoportot jelent.

Az X és/vagy Y szubsztituens védőcsoportjaként a peptidkémiában is szokásosan használt csoportokat, például acetil-, benzil- vagy karbobenzoxiesoportot alkalmazunk.

A hidrogéngázzal való reagáltatást alkalmas katalizátorokat használva (Pt, Pd) oly módon hajtjuk végre, hogy egyrészt a szabad nitrocsoportok primer aminocsoportokká redukálódnak és másrészt az aminocsoportokhoz kötődő védőcsoportok hidrogenolízis útján lehasadnak. Abban az esetben, ha acetilcsoport van jelen, e csoportot hidrolízissel távolítjuk el, például sósavoldat segítségével. Ilyen módon a kívánságnak megfelelően meril-szubsztituált vagy szubsztituálatlan R’-NHvagy R⁴-NH- aminocsoportokat kapunk.

Az I és II általános képletek meglepő farmakológiai hatásokkal rendelkeznek és különösen bőr-, szerv- és csontvelőátültetéseknél immunszuppresszióra/immunregulációra, a celluláris és humorális immunrendszer zavarainak (például autoagresszív betegségek, immunkomplex betegségek) immunszuppresszióra/immunregulációra, rosszindulatú daganatok (beleértve a

-2195 474 vérképzőrendszer, a bőr, a központi idegrendszer daganatait) helyi és/vagy szisztémás kezelésére, és jóindulatú proliferatív (sejtbuijánzással járó) betegségek (például pikkelysömör) helyi és/vagy szisztémás kezelésére szolgáló hatóanyagok. Bizonyított citosztatikus (sejtoszlást gátló) hatásuk alapján vírusellenes hatásuk is felvehető.

Az I általános képletű vegyületek az ismert citosztatikus és immunszuppresszív anyagoktól különösen a kémiai szerkezetükből adódó Iipofiliájuk, továbbá hatásosságuk, helyi hatásuk, és speciális hatáskinetikájuknak köszönhetően aktivitásuk és mellékhatásaik ellenőrizhetősége különbözteti meg.

Ellentétben a legtöbb anyaggal, melyek hidrofil tulajdonságaik következtében nem tudnak áthatolni a vér-likvorgáton és így nem teszik lehetővé például a központi idegrendszer rosszindulatú daganatainak kielégítő gyógyászati befolyásolását, a találmány szerinti vegyületek kedvező megoszlási együtthatójuk következtében (az 1. példához lóg = 2,2; n-oktanol/víz, pH 7,4/20 °C) elérik a központi idegrendszert. Ugyanez a helyzet gyomorbeli alkalmazásánál, amint ezt bizonyos gyógyszerhatások mutatják.

A vér-likvorgát átlépése ezideig ismeretlen perspektívákat nyitott meg a központi idegrendszer proliferatív és autoimmun folyamatainak terápiás befolyásolása előtt. Lipofil citosztatikus anyagok erősen zsírdús daganatokban fel is dúsúlhatnak, ami az ilyen daganatok hatásosabb orvosi kezelését engedi meg.

A találmány szerinti anyagok és az azatioprin immunszuppresszív standard összehasonlító vizsgálatai a találmány szerinti vegyületek felsőbbrendűségét mutatják: patkányoknál allogén bőrtranszplantátumok körülbelül azonos túlélési idejének eléréséhez 300—700%-kal magasabb dózisok szükségesek azatioprin esetében, összehasonlítva az I általános képletű vegyületekkel.

Szokványos citosztatikus szerek esetében helyi antiproliferatív hatást eddig nem írtak le, a találmány szerinti anyagokról azonban kimutattuk, hogy ilyen hatással rendelkeznek.

Ezen felül azt találtuk, hogy Rhesus-majmoknál a perifériás leukocitákra és limpfocitákra gyakorolt szuppresszív hatás gyorsan megfordítható, ha a találmány szerinti anyagok alkalmazását abbahagyjuk. A szokványos citosztatikumok és immunszuppresszív szerek (például ciklofoszfamid, metotrexát, azatioprin) esetében a normális hematológiai kép nem áll helyre hasonlóan rövid idő alatt. Ebből az a következtetés vonható le, hogy az egyénileg változó reagálásból eredő túladagolások és a kialakuló mellékhatások jobban ellenőrizhetők, mint a szokványos citosztatikumoknál és immunszuppresszív anyagoknál.

Immunszuppresszióhoz szteroidok, azatioprin, antilimfocita globulin (ALG), antitimocita globulin (ATG) és ciklosporin A használatos. E terápiák mellékhatásai jelentősek, és a komplikációk veszélyesek. A találmány szerinti vegyületek nem okoznak mellékhatásokat, és már egyedül ebből adódóan nagy gyógyászati előrelépést jelentenek.

A pikkelysömör jelenlegi gyógykezelését rendkívül elégtelennek kell tartani. A kortikoidok (mellékvesekéreg-hormonok) a leghatásosabb pikkelysömör elleni szerek közé tartoznak. Szisztémikusan azonban olyan magas dózisokban kell őket alkalmazni, hogy gyakran fellép szteroid toxicitás. Alkalmazásuk abbahagyása után súlyos visszaesések, sőt krónikus gennyhólyagos formákba való átalakulások is előfordulhatnak. Súlyosbodások és kortikoidok helyi alkalmazását követően is felléphetnek.

A folsav-antagonista metotrexátot szintén hatásos pikkelysömör elleni szernek tekintik. A metotrexátot hatásos anyagnak tartják ízületi gyulladással járó pikkelysömör közepestől súlyos eseteinél. A májat, csontvelőt és a gyomor-bélrendszert pusztító hatásának nagy veszélye miatt azonban a metotrexát kezelést csak a pikkelysömör generalizált súlyos formáinál, akut megbetegedések kezelésére korlátozzák. A találmány szerinti vegyületek proliferációt gátló hatással rendelkeznek helyi alkalmazás esetén is, és ebből kifolyólag az ízületi gyulladással járó pikkelysömör szisztémás kezelésén kívül fontosak lehetnek a pikkelysömörös bőr rendellenességeinek helyi kezelésében. A forgalomban levő pikkelysömör elleni szerek soránál tapasztalható mellékhatások a találmány szerinti anyagoknál kémiai tulajdonságaik alapján nem várhatók.

Nagy fontosságot kell tulajdonítani a lipofil citosztatikus szerek kifejlesztésének, mivel az ismert anyagok a központi idegrendszerhez vagy egyáltalán nem, vagy csak gyógyászatilag hatástalan koncentrációkban jutnak el, és így a központi idegrendszer rosszindulatú daganatainak kielégítő citosztatikus gyógykezelése jelenleg nem lehetséges. Lipofil citosztatikus szerekkel való kezeléshez különösen tekintetbe jönnek a leukémia különböző típusai, mivel ezek gyakran szóródnak a központi idegrendszerbe, ahonnan a daganatos folyamat tovább teljed. A lipofil tulajdonságokkal rendelkező citosztatikus szerek másik potenciális előnyét a különösen zsírdús daganatokban való feldúsúlások jelenti, ami e daganatok előnyös befolyásolását teszi lehetővé,

A következő összehasonlító próbák az 1 általános képletű vegyületek hatását igazolják.

Összehasonlító próbák

I. Immunszuppresszív hatás vizsgálata patkánynál bőrtranszplantátum-túlélési próbában

A találmány szerinti A anyag (4-amino-N-/2’-amino-fenil/-benzamid) immunszuppresszív hatását patkányon és Rhesus-majmon vizsgáljuk bőrtranszplantációs modell segítségével; a patkányokon végzett kísérletekben a találmány szerinti vegyületet a nemzetközi standard immunszuppresszív azatioprinnel, valamint a jelenleg szervátültetéseknél általánosan használt nagy dózisú azatioprin és kis dózisú metil-prednizolon kombinatív kezelésével hasonlítjuk össze. E próbákban az A anyag legalább annyira hatásos volt, mint az összehasonlításképpen használt gyógyszer, noha a találmány szerinti anyagból sokkal kisebb mennyiségeket kell használni. Az immunszuppresszív hatás Rhesus-majmoknál is kifejezett volt. Mint e fajnál kimutattuk, allogén bőrtranszplantátumok normális túlélési idejének az A anyag hatására történő meghosszabbodását a perifériás limfociták egyidejű határozott redukciója jellemzi.

A) Technika összehasonlító gyógykezelés: I. próba (azatoprin + metil-prednizolon)

-3195 474

II. próba (azatioprin)

Előállítás: minden alkalmazás előtt frissen előállított szuszpenzió

Alkalmazás módja: intragasztikus (i.g.) (gyomron át történő) gyomorszonda segítségével; 0,8% metocclben szuszpetidálva

Térfogat: 0,01 rnl per testsúly-g és dózis Adagolási rend: I. próba / -3 naptól + 6 napig (nulladik nap a transzplantálás napja)

II. próba / -2 naptól + 9 napig

Vizsgált dózis: I. próba / 10 mg/kg 6 napig, majd 5 mg/ kg 4 napit

II. próba / naponta 4—8 mg/kg, napi emelkedő dózisban 12 napon át.·

B) Próba leírása

Egy donor patkányból származó 2 allogén bőrlebenyt rokonságban nem álló, beltenyésztett törzsből származó recipiens patkányba visszük át. A bőrlebenyhez tapadó panniculus carnosust (bőralatti izomszövet) metszéssel eltávolítjuk (szuprapannikuláris tanszplantátum), vagy rajta hagyjuk a bőrlebenyen (szubpannikuláris transzplantátum). Az átültetést a „zérus” napon 25 hajtjuk végre enyhe éter-narkózis alatt, az átültetési helyek leborotválása és megtisztítása után. A bőrlebenyeket a receptor helyekre rögzítjük alkalmas kötés segítségével. A 9. naptól kezdve védő gallért helyezünk az állatokra, a kötést eltávolítjuk és a transzplantátumok állapotát naponta ellenőrizzük. A transzplantátum működését osztályozó skála segítségével értékeljük, amely 3-fokú súlyossági pontozással lehetővé teszi a kilökődés 5 differenciálását. A próba azon a napon ér véget, amikor egy állatcsoport 50%-ánál mindkét transzplantátum kilökődik. A transzplantátum túlélésének a kontrolihoz viszonyított meghosszabbodását napokban adjuk meg. IQ C) Eredmények

Amint a következő I. és II. táblázat mutatja, az I. próbán az A anyag fölülmúlja az azatioprint és metilprednizolont tartalmazó standard immunszuppresszív 15 szer hatását. A II. próbában az A anyag ugyanolyan hatásos, mint az azatioprin immunszuppresszív standard. Az A anyagból azonban nagy aktivitása miatt jóval kisebb mennyiség szükséges a hatás eléréséhez, mint a standard gyógyszerből. Az I. táblázat a patkányon végzett I. próba (börtranszplantátum túlélési teszt) eredményeit mutatja.

Recipiens: Long Evans i. Donor: Lewis i.

A donorról a recipiensre 2 szuprapannikuláris bőrlebenyt viszünk át.

A II. táblázat a patkányon végzett II. próba (börtranszplantátum túlélési teszt) eredményeit mutatja. Recipiens: Osborne Mendel <5. Donor: Lewis á.

A donorról a recipiensre 2 szuprapannikuláris börlebenyt viszünk át.

I. táblázat

Állatok 2 kilökődött börtanszplmtátumma! (n/%)

Vizsgált anyag

Dózis	+9 nap	+ 10 nap	+ 11 nap	+ 12 nap	+13 nap	+ 14 nap	+ 15 nap	+16 nap	+17 nap
Kontroll (Mctocel i.g.)	1/6(17)	4/6 (50)^{* xx}	4/6 (66)	4/6 (66)	4/6 (66)	5/6 (83)	6/6 (100)	-	-
A anyag ^xx	0/5 (0)	0/5 (0)	0/5 (0)	0/5 (0)	1/5 (20)	1/5 (20)	3/5 (60)^x	4/5 (80)	5/5 (100)
10 mg/kg i. g. - 3 naptól +2 napig, utána 5 mg/kg i.g. +3 naptól +6 napig
Azatioprin	0/6 (0)	0/6 (0)	1/6 (17)	2/6 (33)	2/6 (33)	4/6 (66)^x	6/6 (100)	-	-
40 mg/kg i.g. + metil-prednizo- lon 2 mg/kg i. g. -3 naptól + 6 napig

^x Kilökődés napja: az állatoknak legalább 50%-ánál mindkét transzplantátum kilökődött ^xx A anyag: 4-amino-N-/2’-amino-feml/-benzamid (1. példa)

-4195 474

11. táblázat

Vizsgált anyag Állatok 2 kilökődött bőrtranszplantátummal (n/%)

Dózis	+ 8 nap	♦ 9 nap	+ 10 nap	+ 11 nap	⁺ 12 nap
Kontroll (Metocel i. g.)	2/10(20)	5/10 (50)^x	6/10(60)	8/10(80)	9/10(90)
A anyag™ 4-8 mg/kg i.g. -1 -tői + 9 napig	0/10(0)	1/10 (10)	1/10(10)	1/10(10)	6/10 (60)^x
Azatioprin	0/10(0)	1/10 (10)	2/10(20)	4/10(40)	5/10 (50)^x

20—60 mg/kg i. g. - 2-től + 9 napig ^x Kilökődés napja: az állatoknak legalább 50%-ánál mindkét ^xx A anyag: 4-amino-N-/2’-amino-fenil/-benzamid (1. példa) ll.Az A anyag immunszuppressziv hatásának vizsgálata börtranszplantátum-túlélési tesztben. Rhesus-majom (Macaca mulatta)

A bőrátültetési modellben kimutatott hatást a celluláris immunrendszerre (T-limfociták) gyakorolt gátlásként értékeljük, mivel a mai álláspont szerint ez vesz részt elsősorban az allogén transzplantátum kilökődési reakciójában. 30

A humorális immunrendszernek (antitestképző Blímfociták) a találmány szerinti vegyületek általi gátlására és az ebből eredő terápia lehetőségére például autoagresszív betegségek esetében — melyeket túlzott antitest-képzés jellemez a saját szövetekkel szemben — 35 jelenleg csak indirekt módon következtethetünk. Az A anyag nagy dózisaival huzamos ideig kezelt patkányoknál a baktériumos fertőzésekkel szemben megfigyelt fokozott érzékenység a humorális immunrczisztencia közvetett bizonyítékának tekinthető. 40

A) Technika

Kontroll standard: nem használtunk etikai okokból 45 Előállítás: minden alkalmazás előtt frissen előállítva Alkalmazás módja: intragasztrikus (i. g.), gyomorszondán át, 0,8% metocelben szuszpendálva Adagolási rend: lx naponta 10 napig

Vizsgált dózis: 10 mg/kg 50

B) Kísérlet leírása különböző donor állatból származó, összesen 4 al- 55 logén bőrlebenyt keresztezve átviszünk rokonságban nem álló 1 recipiens állatra. Először a bőrlebenyt ketamin-narkózis alatt eltávolítjuk a donor állatok leborotvált és megtisztított gyomortáji bőréből és megszabadítjuk a hozzátapadó zsírszövettől. A négy bőrlebenyt 60 befogadó helyeket a recipiens állat leborotvált és megtisztított hátán ketaminnarkózis alatt készítjük elő megfelelő méretű bőrdarabok eltávolítása útján. Eredményes vérzéscsillapítást követően a bőrlebenyeket szétterítjük a receptor helyeken és a seb széleihez varr- 65 ranszpkintátum kilökődött juk. A sebet alkalmas kötszerrel lefedjük és ezt rugalmas kötéssel rögzítjük. A kötést felnyitjuk a transzplantálás utáni 5., 7. és 9. napon és megfigyeljük a transzplantátumok funkcióját. A 9. napon a kötést nem tesszük vissza. A transzplantátum funkciót azután naponta ellenőrizzük a kilökődés bekövetkeztéig.

C) Eredmények

A kontrollokat etikai okokból mellőzzük ebben a főemlősökön végzett próbában. Az összehasonlítás alapjául régebbi kontrollok allogén bőrtranszplantátumainak normális túlélése szolgál, amit 10 napban jelölnek meg. A transzplantátum normális túlélési idejének meghosszabbodása érhető el az A anyaggal a vizsgált dózisban, éspedig a ZE kísérleti állatnál 6—7 nappal és az XL kísérleti állatnál 4—5 nappal. Ezt a hatást a találmány szerinti vegyület kifejezett immunszuppreszszív hatásának kell tulajdonítani.

Az 1. és 2. ábra az A anyag 10 napos alkalmazásának hatását mutatja Rhesus-majmok vérplazmájának leukocitáira és limfocitáira.

Dózis: 1 x napi 10 mg/kg i. g.

1. ábra: Rhesus-majom ZE, 9

2. ábra: Rhesus-majom XL, 9

J1I. Az A anyag daganatgátló hatásának vizsgálata egéren, 3 tumor modellen

Az A anyagot tumoros- egereknek intragasztrikusan alkalmazva az állatok átlagos túlélési ideje jelentősen megnő, és a vizsgált daganat növekedésének kifejezett retardádiója (késleltetése) figyelhető meg, összehasonlítva a kezeletlen kontroll állatokkal.

Patkányoknál az A anyag alkalmas oldószerben való helyi alkalmazása a növekedő szőrtüsző kifejezett gátlását eredményezi.

A növekedő szőrtüsző gátlása gyakran megfigyelhető mellékhatás, melyet a szisztémás citosztatikus kezeléssel kapcsolatban a szakirodalomban leírtak. A jelenség az ilyen vegyületek proliferáció elleni hatásának megnyilvánulása, amely különösen a gyorsan proliferáló szöveteket érinti.

-5195 474 !0

A) Technika

Preparálás: minden alkalmazás előtt frissen készített szuszpenzió

Alkalmazás módja: orális, 0,8% metocelben szuszpendálva

Térfogat: 0,01 ml per gramm testsúly és dózis

Adagolási rend: naponta 9 napon át, egyéb megjegyzés híján

Vizsgált dózisok: napi 60, 120, 180, 240 mg/kg

B) A daganatok leírása

L 1210/Rij: L 1210 leukémia adaptációja CD₂ egérben (C5751 x DBA2, Fi hibrid). Az anyag alkalmazása előtti napon 10⁵ leukémia-sejtet oltunk be intraperitoneálisan. A ketreceket naponta kétszer ellenőrizzük az állatok pusztulása szempontjából. A kísérlet végpontját a dóziskénti 5 egér átlagos túlélése képezi, 10 kezeletlen kontrolihoz viszonyítva.

Osteosarcoma C22LR, BCBA egerekben (CB7BL x CBA/'Rij, Fi hibrid). A tumort szubkután oltjuk be az állatok mindkét oldalába. Legalább kétszer hetenként 3 dimenzióban lemérjük a daganatot. A végpont a növekedés retardációja. Ezt mint átlagos időkülönbséget adjuk meg, mely alatt 5—10 tumor térfogata 5 kezelt állatnál elér egy adott értéket, összehasonlítva a kezeIenlen kontroll állatok 5—10 tumorjával. Ezt az értéket a kezelés elkezdésekor tapasztalat átlagos tumor-térfogat négyszereseként állapítottuk meg.

Lewis Lung tumor BCBA egéren. Az eljárás azonos az osteosarcománál leírttal. A tumor térfogatát itt 800 mm³-ben (= a 3 dimenzióban mért átmérők eredménye) határoztuk meg.

C) Eredmények

A megválasztott dózisok toxieitása következtében a legtöbb dózis-csoportban nem volt lehetséges a napi alkalmazás. Miután mindegyik csoportban elhullás következett be 120 mg/kg vagy ennél nagyobb dózis kétszeri vagy többszöri alkalmazása után, a túlélő állatoknál csökkentettük az alkalmazások számát. Az észleléseket az alábbi III—V. táblázat mutatja.

Értékelés: a vizsgált dózisok túl magasak voltak. Ennek ellenére a vizsgált anyag jelentős aktivitását állapíthattuk meg. L 1210 leukémiánál mérsékelt dózisban, jó aktivitást osteosarcománál és mérsékelt aktivitást Lewis Lung tumornál.

A következő III—V. táblázat az A anyag daganatgátló hatásának vizsgálati eredményeit mutatja egéren:

III. táblázat

L 1210 leukémia

Dózis Átlagos Átlagos túltúlélési élési idő idő, na- növekedése, pókban %

Kontrollok	(n=10)	8	—
Kísérleti csoportok
9x60 nvg/kg p.o.	(n=5)	11	38
7x120 mg/kg p.o.	(n=5)	6	tox. halál
4x180 mg/kg p.o.	(n=5)	5	tox. halál
4x240 mg/kg p.o.	(n=5)	5	tox. halál

IV. táblázat

Osteosarcoma

Dózis Túlélő Tumornövekeállatok des retardációja (napok)

Kontrollok Kísérleti csoportok	(n=5)	5/5	—
9x60 mg/kg i.p.	(n=5)	5/5	7.8 (p=0,0001)
4x120 mg/kg p.o.	(n=5)	0/5 (5. nap)	toxikus halál
2> 180 mg/kg p.o.	(n=5)	1/5	9,6
1x240 mg/kg p.o.	(n:5)	5/5	3,1 (p=0,001)

V. táblázat

Lewis Lung tumor

Dózis	Túlélő Tumornöveke-
állatok	dés retardációja (napok)
Kontrollok	(n=5)	5/5	_
Kísérleti csoportok
9x60 mg/kg i.p.	(n=5)	5/5	3.8 (p=0,061)
4x120 mg/kg p.o.	(n=5)	0/5	toxikus halál
2x180 mg/kg p.o.	(n=5)	0/5	toxikus halál
1x240 mg/kg p.o.	(n=5)	5/5	3,5 (p=0,018)

IV. Az A anyag proliferáció elleni hatásának vizsgálata pa'kányon, helyi alkalmazás esetén

A) Technika

Kontroll standard: nincs ismert kontroll standard

Előállítás: frissen előállítva alkalmazás előtt

Alkalmazás módja: helyileg pipettázás útján, 0,5% oldatként abszolút etanolban

Térfogat: 1 ml per állat és dózis

Vizsgált dózisok: napi 5 mg/állat 14 napig, majd napi 10 mg/állat 10 napig.

B) Próba leírása

Long Evans törzsű, „fekete csuklyás ’ fehér szőrű hím patkányokra védő gallért teszünk. 3 cm hosszú és 1,5 cm széles téglalapot jelölünk meg sablon segítségével a háti bőrön a fekete háti szőrcsík régiójában, borotválás és megtisztítás után. A próbaoldatot lassan csepegtetjük e téglalapra, elkerülve a környező bőrre való lecsurgást. Az oldószert hasonlóképpen alkalmazzuk a kontroll állatokon. 21 napi kezelés után értékeljük a szőr növekedését a kezeit területeken, összehasonlítva a kontroll területekkel.

C) Eredmények

A kezelt állatoknál a szőrnövés egyértelmű gátlása látható, összehasonlítva a kontroll állatokkal.

Értékelés: bár nem zárható ki, hogy az alkalmazott anyag egy része szisztémás úton vett részt a növekedő szertüszők gátlásában a lehetséges bőrön keresztüli abszorpció következtében, kimutatható volt, hogy határozott proliferáció elleni hatás érhető el a találmány szerinti anyaggal a bőrfüggelékeken, helyi alkalmazás hatására.

V. 4z A anyag centrális hatásai

A találmány szerinti anyageknak a központi idegrendszerbe és más zsírdús szervekbe való behatoló képessége jelentős görcsoldó hatásuk alapján is kimutatható az elektromos ingerléssel kiváltott izomgörcs-pró-6195 ^74 búban (Swinyard ós munkatársai, J. Pliarm. exp. Ther. 106. 3 19 (1952)) ős a pentetrazollal indukált konvulzió (görcsös vonaglás) próbájában (fent idézett közlemény):

VI. táblázat

Az A anyag antikonvulzív hatása egéren

Konvulziós Az anyag, Difenil-hidanmodell ED₅₀ mg/kg toin,ED_S0 (i.g.) mg/kg (i.g.)

Elektro-konvulzió 30,0 (21-42) 22,5 (18-28)

Pentetrazol-konvulzió 44,0 (32—60) 9,5 ( 7—13)

A centrális hatások mértékének megvilágítása céljából a difenil-iiidantoin standard antiepileptikumot használjuk referencia-anyagként.

Az A anyag és a difenil-hidantoin akut, orális (i.g.) toxieitásának 7 napos értékeit (egéren) a VII. táblázatban hasonlítjuk össze:

VII. táblázat

LD₅ θ Konfidencia határ mg/kgmg/kg bán p = 0,05 alsó határ felső határ

A anyag 625 469,9 831,2

Difenil-hidantoin 128 1 14,2 143,3

Megvizsgáltuk a 4-metil-amino-N-/2 -amino-fenil/-N-benzamid (B vegyület) citotoxicitását is, az A vegyület citotoxicitásához hasonlítva. A következő eredményeket kaptuk:

VIII. táblázat

Citotoxicitási eredmények (LD_{S 0} fg/mlj

Vegyület 1. vizsgálat 2. vizsgálat átlag

A 3,67 1,88 2,78

B 2,69 5,38 4,04

A találmány ismertetése céljából közöljük az alábbi példákat:

I. példa

4-Amino-N-/2’ -amino-fenü/-benzamid

Cl ₃Hi ₃N₃O Molekulasúly 227,26

22,7 g o-nitro-anilint 130 ml vízmentes dioxánban oldunk és az oldatot cseppenként elkeverjük 30,4 g p-nitro-benzoil-klorid 150 ml vízmentes dioxánnal készült oldatával. A reakció visszafolyatás közben forralva 1 óra alatt lezajlik. 15 °C-ra lehűtve N-/2’-nitro-fenil/-4-nitro-benzamid válik ki kristályos formában. Klór-benzolból átkristáiyosítva 39 g (83%) terméket kapunk; olvadáspont 217—218 °C.

A 39 g dinitro-terméket 550 ml dimetil-formamidban hidrogénezzük. 10 g Raney-nikkel jelenlétében 1 óráig 25 °C-on, 2.10⁵ Pa feletti nyomáson.

A katalizátort leszűrjük, az oldószert vákuumban lepároljuk és a címben szereplő vegyületet etanolból átkristályosítjuk. Kitermelés 20,2 g (667?); olvadáspont 180-181 °C.

Etanolban oldott sósavgázt hasznába a vegyület dihidrokloriddá alakítható át. melynek vízoldhatósága 4%.

Hasonló módon állítjuk elő a következő vegyületeket:

4-amino-N-/2 -amino-fenil/-benzamid-dihidroklorid;

C, ₃H₁₅N₃C1₂O Molekulasúly 300,18 Olvadáspont:340 °C (etanolból);

4-anúno-N-/2 -amino-feriil/-N-metil-benzamid;

C₁₄H₁₅N₃O Molekulasúly 241,30 Olvadáspont :159-160 °C;

4-metil-amino-N-/2 -amino-fenil/-N-benzamid; Olvadáspont 189 °C;

4-amino-N-/2 metil-amino-fenil/-N-benzamid; Olvadláspont 193 °C.

2. példa

4-Metil-amino-N-/2 -amino-fenil/-N-benzamid

2,71 g N-/2-nitro-fenil/-4-metil-amino-benzamidot 300 ml tetrahidrofuránban oldunk és rázógépben Raneynikkellel hidrogénezzük. A hőmérséklet 21 °C-ról 26 °C-ig emelkedik a hidrogénezés folyamán. A katalizátor leszűrése után a tiszta oldatot bepároljuk és a maradékot etil-acetátból átkristályosítjuk.

1,3 g (56,6%) 4-metil-amino-N-/2’-amino-fenil/-N-benzamidot kapunk; olvadáspont 189 °C.

A kiindulási anyagként használt N-/2-nitro-fenil/-4-metil-amino-benzamidot a következőképpen állítjuk elő:

4,535 g (0,03 mól) 4-metil-amino-benzoesavat keverés közben 9,19 g (0,09 mól) ecetsavanhidriddel 1 óráig 100 °C-on melegítünk. A tiszta oldat lehűtése után kivált kristályokat leszivatjuk és etil-acetáttal mossuk (olvadáspont 199—201 °C). A kapott N-acetil-4-metil-amino-benzoesavat (62% kitermelés) azután tionil-kloriddal dioxánban savkloriddá alakítjuk át. A tionil-klorid feleslegét kevés dioxánnal együtt vízsugár-vákuumban eltávolítjuk. 10 ml vízmentes dioxánban oldott 2,76 g (0,02 mól) o-nitro-anilint csepegtetünk a reakcióelegyhez és az oldatot elkeverjük 4,04 g (0,04 mól) trietil-aminnal (sósavmegkötő anyag). Ezután a reakciókeveréket visszafolyatás közben 1 óráig forraljuk. Bepárlás után a maradékot elkeverjük 40 ml vízzel és metilén-kloriddal extraháijuk. A szerves fázis bepárlása után 4 ml izopropanolt adunk hozzá és a képződött kristályokat 30 perc keverés után leszivatjuk.

5,1 g N-/2-nitro-fenil/-4-N-acetil-N-metil-amino-benzatnidoí (55,6%) kapunk; olvadáspont 162 °C. A kapott nyersterméket kevés etanolban szuszpendáljuk és hétszeres moláris mennyiségű tömény sósavoldatta] visszafolyatás közben 9 óráig hidrolizáljuk. A reakcióelegyet szárazra pároljuk, izopropanolt hozzáadva kristályosítjuk, majd 40 ml vízben oldjuk és ammóniával meglúgosítjuk. Metilén-kloriddal extrahálva 1,4 g N-/2-nitro-fenil/-4-metil-amino-benzamidot kapunk (51% kitermelés);olvadáspont 187 °C.

Hasonló módon állítjuk elő a következő vegyületet:

4-amino-N-/2 -metil-amino-fenil/-N-benzamid, olvadáspont 193 °C.

3. példa

4-Amino-N-/2 -amino-fenil/'-N-metil-benzamid

22,82 g (0,15 mól) N-mctil-o-nitro-anilint 70 ml víz-7195 474 mentes tetrahidrofuránban oldunk és keverés és nitrogengáz átvezetése közben cseppenként elkeverjük 90 ml vízmentes tetrahidrofuránban oldott 30.6 g (0,165 mól) p-nitro-benzoil-kloriddal. A keverést nitrogénatmoszférában, visszafolyatás közben 2 óráig folytatjuk. A reakcióelegyet bepároljuk és acetil-acetátból átkristályosítjuk.

29,2 g (64,6%) N-metil-N-/2-nitro-fenil/-4-nitro-benzamidot kapunk (folyáspont 137—138 °C), melyet 800 ml tetrahidrofuránban oldunk és vízzel való hűtést alkalmazva rázógépben 10 g Raney-nikkellel hidrogénezzük. A hőmérséklet nem haladhatja meg a 25 °C felső határt. 7 óra múlva ismét hozzáadunk 10 g Raney-nikkelt és további 6 óra múlva a színtelen oldatot szárazra pároljuk, a maradékot etil-acetátban oldjuk és diizopropil-éterrel kicsapjuk.

g 4-amino-N-/2’-amino-fenil/-N-metiI-benzamidot kapunk; olvadáspont 159—160 °C.

4. példa

Tabletta előállítás

a) 2 kg 4-Amino-N-/2’-amíno-fenii/-benzamidot 9 kg mikrokristályos cellulózzal nagyfordulatszámú keverőben jól összekeverünk. Ezután 4,5 kg laktózt adunk hozzá. A kapott keveréket 500 g polivinil-pirrolidon oldattal 5 1 vízben granuláljuk. A száraz granulátumot 2 kg kukoricakeményítővel, 1,8 kg laktózzal, 100 g kolloid kovasavval és 1 kg magnézium-sztearáttal jól összekeverjük és 200 mg súlyú tablettákká sajtoljuk. A tabletták 20 mg hatóanyagot tartalmaznak.

b) 10 kg 4-Metil-amino-N-/2’-aniino-fenil/-benzamídot 6 kg mikrokristályos cellulózzal nagyfordulatszámú keverőben jól összekeverünk. A kapott keveréket 600 g polivinil-pirrolidon oldattal 5 1 vízben granuláljuk. A száraz granulátumot 2,5 kg kukoricakeményítővel, 1,7 kg laktózzal, 200 g kolloid kovasawal és 2 kg magnézium-sztearáttal jól összekeverjük és 250 mg súlyú tablettákká sajtoljuk. A tabletták 100 mg hatóanyagot tartalmaznak.

c) 2 kg 4-Amino-N-/2’-metil-amino-fenil/-benzamidot 2 kg mikrokristályos cellulózzal intenzíven összekeverünk és 3,8 kg laktóz, 2,0 kg kukoricakemcnyítő, 1 kg kolloid kovasav és 1 kg magnézium-sztearát hozzáadása után még egyszer jól összekeverjük. A keverékből 100 mg-os tablettákat sajtolunk, 20 mg/tabletta hatóany ag-ta rtalommal.

d) 10 kg 4-Metil-amino-N-/2’-amino-fenil/-N-benzamidot 6 kg mikrokristályos cellulózzal, majd 6 kg laktózzal, 2,5 kg kukoricakeményítővel, 2 kg kolloid kovasavval és 2 kg magnézium-sztearáttal 250 mg-os tablettákká sajtolunk, 100 mg/tabletta hatóanyag-tartalommal.

5. példa

Kapszula előállítás

a) 2 kg 4-Amino-N-/2’-amíno-fenil/-benzamidot 2 kg kukoricakeményítővel nagyfordulatszámú keverőben intenzíven összekeveijük, ezt követően 4,5 kg laktózt, 1 kg kukoricakeményítőt és 100 g finoman eloszlatott talkumot adunk hozzá, és ismételt keverés után 100 mg-os kapszulákba töltjük. A hatóanyag-tartalom 20 mg/kapszula.

b) 10 kg N-/N-Metil-amino-benzoil/-o-fenilén-diamint 10 kg kukoricakeményítővel nagyfordulatszárnú keverőben intenzíven összekeverjük, majd 6 kg laktózt, 8

2,5 kg kukoricakeményítőt és 1,5 kg talkumot adunk iiozzá és a keveréket 300 mg-os kapszulákba töltjük. A kapszulák 100 mg hatóanyagot tartalmaznak.

6. példa

Injekciós oldat előállítás

100 mg N-/4-Metil-amino-benzoil,'-o-fenilén-diamint 0,83 ml 1 n sósav-oldattal dihidrokloriddá alakítunk és ionnentesített vízzel 10 ml-re feltöltjük.

Az oldatot steril szűrés után azonnal felhasználjuk, mert nem stabil. Az oldat 10 mg/ml hatóanyagot tartalmaz.

7. példa

Kúp előállítás

Olvasztó kemencében 40—42 °C-on 32 kg kemény zsírt 4,4 kg semleges olajjal megolvasztunk. Az olvadékot 1,6 kg Aerosil-lal diszpergáljuk.

perces keverés után 2 kg mikronizált 4-amino-N-/2 -amino-fenil/-benzamidot keverünk az olvadékba és homogénen elválasztjuk. 15 perc után nagyfordulatszámú keverővei dezagglomerizáljuk és 35-37 °C-ra melegítjük. Ezután 2 g-os kúpokat formálunk és lehűtjük azokat. A kúpok hatóanyag-tartalma 100 mg.

Analóg módon állítunk elő 100 mg hatóanyag-tartalmú kúpokat N-/4-metiI-amino-benzoil/-o-femlén-diamin hatóanyag alkalmazásával.

8. példa

Szirup készítés

1 tisztított vizet 70 °C-ra melegítünk. A meleg vízbe nagy fordulatszámmal 1,6 kg hidroxi-etil-cellulózt (H300) keverünk, majd hideg vízzel a keveréket 15-20°C-rahűtjük. A hűtési folyamat alatt 220 g citromsavat és 150 g szorbinsavat adagolunk. Ezután 2—3 órán át folytatjuk a keverést, míg tiszta gél képződik. Ezt egy éjszakán át állni hagyjuk. Következő napon 1 kg 4-amino-N-/2’amino-fenil/-benzamid-dihidrokloiidot és 21 kg kristálycukrot adunk a gélbe. Ezután 42 g színezőanyagot és 12 g aroma-esszenciát (vadcseresznye) 3 1 vízben, illetve 600 g etanolban oldunk és ezeket is a gélhez adjuk. Az anyagot szűrjük és alapos keverés közben 100 1-re feltöltjük. A kapott szirup hatóanyag-tartalma 50 mg/5 ml.

Claims

Szabadalmi igénypontok

1. Eljárás a II. általános képletű vegyületek — ahol az

R⁴ és R⁵ szubsztituensek közül legalább az egyik metilcsoportot jelent és a másik hidrogénatomot vagy metilcsoportot jelent,

R⁶ hidrogénatomot vagy metilcsoportot képvisel — valamint szervetlen vagy szerves savakkal képezett gyógyászatilag elfogadható sóik előállítására, azzal jellemezve, hogy a Illa és a Illb általános képletű vegyületet — ahol

A reakcióképes savcsoportot.,

Z hidrogénatomot vagy metilcsoportot jelent,

X és Y azonos vagy különböző lehet és jelentésük védőcsoporttal ellátott aminocsoport vagy nitrocsoport — egymással reagáltatjuk, a kapott IV általános képletű vegyületeket — ahol

-8195 474

X, Y és Ζ jelentése a fenti hidrogéngázzal reagáltatjuk cs - kívánt esetben - hidrolizáljuk, majd savak segítségével farniakológiailag elfogadható sókká alakítjuk át.
2. Eljárás immunszuppresszív hatású és malignus, proliferatív és autoimmun betegségek kezelésére alkalmas gyógyszerkészítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely, az 1. igénypont szerint előállított II általános kepletű vegyületet — ahol

R⁴, R⁵ cs R⁶ az 1. igénypontban megadott — a gyógyszertechnológiában szokásos segédanyagokkal együtt gyógyszerkészítménnyé feldolgozzuk.
3. Eljárás intmunszupresszív hatású és malignus, proliferatív és autoimmun betegségek kezelésére alkalmas gyógyszerkészítmények előállítására Illa és ÍHb általános képletű vegyületek — ahol

Z jelentése hidrogénatom vagy metilcsoport,

X és Y azonos vagy különböző lehet és jelentésük védőcsoporttal ellátott aminocsoport vagy nitrocsoport.

A jelentése valamely reakcióképes savcsoport — egymással való reagáltatásával cs a kapott IV általános képc letű vegyület hidrogéngázzal történő reagáltatásával, kívánt esetben savak segítségével történő farmakológiaílag elfogadható sóvá történő átalakításával előállított

I általános képletű vegyületből — ahol

R¹ , R² jelentése azonos és hidrogénatom vagy metil1Q csoport lehet, és

R³ jelentése hidrogénatom vagy metilcsoport, azzal jellemezve, hogy valamely 1 általános képletű vegyületet. ahol R¹, R² cs R³ jelentése a tárgyi körben megadott, a gyógyszcrteclinológiában szokásos segédjg anyagokkal együtt gyógyszerkészítménnyé alakítjuk.
4. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az I általános képletű vegyületek körébe tartozó 4-amino-N-/2’-amino-fenil/N-benzamidot dolgozzuk fel a gyógyszertechnológiában szokásos segédanyagokkal.