DK168268B1

DK168268B1 - Farmaceutiske præparater af N-phenylbenzamidderivater

Info

Publication number: DK168268B1
Application number: DK057492A
Authority: DK
Inventors: Gerhard Satzinger; Manfred Herrmann; Edgar Fritschi; Ute Weiershausen
Original assignee: Goedecke Ag
Priority date: 1983-02-19
Filing date: 1992-05-01
Publication date: 1994-03-07
Also published as: US4857662A; ES8501368A1; EP0116967A1; DD216452A5; DK76784D0; YU28784A; GR79506B; DK166383B; JPH041738B2; ZA841187B; SU1333234A3; AU2440184A; DE3305755C2; YU43563B; US4816485A; EP0116967B1; US4933368A; DE3305755A1; CA1244050A; AU565185B2

Description

i DK 168268 Bl

Den foreliggende opfindelse angår farmaceutiske præparater af N-phenylbenzamidderivater, der er anvendelige til bekæmpelse af sygdomme i immunsystemet.

Visse diaminobenzanilidderivater er kendt som udgangs-5 produkter ved fremstillingen af polyurethanelastomere fra USA patentskrift nr. 3.926.922. Indtil nu har man imidlertid ikke kendt nogen pharmakologisk virkning af denne type forbindelser.

Det har nu vist sig, at forbindelser med formlen

AiN --- 0 ___ . NHR2 R3 12 3 hvor grupperne R , R og R , der kan være ens eller forskellige, 15 er et hydrogenatom eller en methylgruppe, samt pharmakologisk acceptable syrer deraf er i besiddelse af interessante pharmako-logiske egenskaber, der gør dem anvendelige især til behandling af maligne, proliferative og autoimmune sygdomme samt til immunsuppressiv terapi ved transplantationer.

20 Den foreliggende opfindelse angår således farmaceu tiske præparater, som er ejendommelige ved, at de indeholder mindst ét N-phenylbenzamidderivat med formlen R1HN _____ 0 ____ . NHR2 (I) ^ Hør ΈΓ hvor grupperne R1, R2 og R3, der kan være ens eller forskel-30 lige, hver er et hydrogenatom eller en methylgruppe, eller farmakologisk acceptable salte deraf til bekæmpelse af maligne, proliferative og autoimmune sygdomme og til immunsuppressiv terapi i forbindelse med transplantationer.

De forbindelser med formlen I, der som grupperne R1 35 og/eller R2 har mindst én methylgruppe, er hidtil ukendte forbindelser, der har den følgende formel DK 168268 B1 2 R4HN --- O --- NHR5 (11) xyster 5 hvor mindst én af grupperne R4 og R5 er en methylgruppe, og de øvrige grupper R4-R6, der kan være ens eller forskellige, er et hydrogenatom eller en methylgruppe.

Forbindelserne med formlen II kan fremstilles ved 10 omsætning på kendt måde af forbindelserne med formlen Illa og b: -0Γ rO’ 15 a) b) hvor A er en reaktionsdygtig syregruppe, Z er et hydrogenatom eller en methylgruppe, og X og Y, der kan være ens eller forskellige, er en amino-gruppe, der er forsynet med en beskyttelsesgruppe eller en nitrogruppe, hvorefter de således opnåede forbindelser med formlen •Ογ'τΟ’ hvor X, Y og Z har de ovenfor anførte betydninger, omsættes med hydrogen, og derpå eventuelt omdannes ved hjælp af syrer til pharmakologisk acceptable salte deraf.

Forbindelserne med formlerne I og II er særlig fore- 1 4 trukne, når grupperne -NH-R og -NH-R er i para-stilling i forhold til carbonylgruppen.

__ Følgende specifikke stoffer er særlig foretrukket på grund af deres gode pharmakologiske virkning: 4-Amino-N- (2' -aminophenyl) -benzamid, 4-methvlamino-N- (2' -aminophenyl) -benzamid, 4-amino-N- (2 * -methylaminopheny 1) -benzamid og 4-Amino-N- (2' -aminophenyl) -N-methyl-benzamid.

O

3 DK 168268 B1

Som salte kan anvendes alle terapeutisk anvendelige syreadditionssalte, f.eks. salte med hydrohalogensyrer, såsom saltsyre eller brombrintesvre, svovlsyrer, phosphorsvrer, salpetersyre, aliphatiske, alicycliske, aromatiske eller heterocycli-5 ske carboxyl- eller sulfonsyrer, såsom myresyre, eddikesyre, pro-pionsyre, ravsvre, glycolsyre, mælkesyre, æblesyre, vinsyre, citronsyre, ascorbinsyre, maleinsvre, hydroxymaleinsyre eller pyrodruesyre; phenyleddikesyre, benzoesyre, p-aminobenzoesvre, anthranilinsyre, p-hydroxybenzoesvre, salicylsyre eller p-amino-10 salicylsyre, methansulfonsyre, ethansulfonsyre, hydroxyethan-sulfonsyre, ethylensulfonsyre, halogenbenzensulfonsvre, toluen-sulfonsyre, naphthalensulfonsvre eller sulfanilinsyre; methionin, tryptophan, lysin eller arginin.

De pharmaceutiske præparater ifølge opfindelsen in-15 deholder de aktive forbindelser i fri form eller i form af et af deres terapeutisk acceptable salte, blandet med pharmaceutiske organiske eller uorganiske faste eller flydende bærestoffer, der f.eks. er anvendelige til topisk, enteral, f.eks. oral eller rectal, eller fremfor alt parenteral, såsom in-20 tramuskulær eller intravenøs anvendelse. Til fremstilling heraf kommer sådanne stoffer i betragtning, der ikke reagerer med forbindelserne, f.eks. gelatine, lactose, stivelse, stea-rylalkohol, magnesiumstearat, talkum, vegetabilske olier, benzylalkoholer, propylenglycoler, vaseline eller andre phar-25 maceutiske bærestoffer.

De pharmaceutiske præparater kan f. eks. være i fom af f.eks. tabletter, sukkerovertrukne tabletter, kapsler, suppositorier, salver, cremer eller i flydende form som opløsninger, suspensioner eller emulsioner. Om nødvendigt steriliseres de og/. 30 eller indeholder hjælpestoffer såsom konserverende, stabiliserende, emulgerende eller fugtemidler, opløseliggørende midler eller salte for at ændre det osmotiske tryk eller puffere. De kan også indeholde andre aktive stoffer.

Den dosering, der skal anvendes, afhænger af sygdom-35 mens kliniske billede og af individuelle faktorer.

Doser på 10-300 mg, især 20-100 mg er almindeligt anvendt. Den individuelle dosering kan også være større i særlige tilfælde.

O

4 DK 168268 B1

Forbindelserne med formlen Illa omsættes med forbindelser med formlen Hib på kendt måde. Der anvendes især syre-halogenider, svreanhydrider eller svreimidazolider eller estergrupper som reaktionsdygtive syregrupper A, idet disse tillader 5 omsætning med aminogruppen. A betyder således fortrinsvis halogen, imidazolvl, acyl eller lavere alkylgrupper.

De sædvanlige grupper i peptidkemien, f.eks. en acetyl-, en benzyl- eller en carbobenzoxygruppe, anvendes som beskyttelsesgruppe for X og/eller Y.

10 Reaktionen med hydrogen ved hjælp af passende kataly satorer (platin eller palladium) foregår på en sådan måde, at på den ene side de frie nitrogrupper reduceres til primære ami-nogrupper, og på den anden side beskyttelsesgrupperne knyttet til aminogrupper fraspaltes hydrogenolytisk. Når det drejer sig 15 om en acetylgruppe, elimineres denne gruppe ved hydrolyse, f.eks. med saltsyre.

På denne måde fås de methylsubstituerede eller usub-1 4 stituerede aminogrupper R -NH- eller R -NH- efter ønske.

Forbindelserne med formlen I er i besiddelse af 20 overraskende pharmakologiske virkninger og er især midler til immunsuppression/immunregulering ved hud-, organ- og benmarvstransplantationer, til immunsuppression/immunregulering ved forstyrrelser i det cellulære eller humorale immunsystem (f.eks. autoaggressions sygdomme, immunkomplekssygdomme, sygdomme af rheu-25 matisk typologi), til topisk og/eller systemisk behandling af maligne neoplasmer (herunder sådanne i det hæmatopoietiske system, huden, centralnervesystemet) og til topisk og/eller systemisk behandling af godartede proliferative sygdomme (f.els. psoriasis) . På basis af den beviste cytostatiske virkning må en 30 antiviral virkning også forventes.

Forbindelserne med formlen I kan skelnes fra de kendte cy tostatiske og immunsuppressive midler især på grund af deres lipophili, naturligt forbundet med deres kemiske struktur, ved hjælp af deres styrke, deres topiske aktivitet og deres kontrol-35 lerbare virkning og bivirkninger på grund af særlig virkningskinetik.

I modsætning til de fleste stoffer, der ikke kan passere blod/hjernebarrieren på grund af deres hydrophile egenskaber

O

5 DK 168268 B1 og derfor ikke får lov til at udøve en tilfredsstillende terapeutisk virkning, f.eks. på maligne tumorer i centralnervesystemet, når forbindelserne ifølge opfindelsen centralnervesystemet på grund af deres gunstige fordelingskoefficient (log VR i eksempel 5 1=2,2, n-octanol/vand pH 7,4/20°C). Dette er også tilfældet ved intragastrisk anvendelse således som det påvises ved visse pharmakologiske virkninger.

At blod/hjernebarrieren passeres, har åbnet nye veje for terapeutisk påvirkning af proliferative samt autoimmune pro-10 cesser i centralnervesystemet. Med et lipophilt cytostatisk middel er der desuden mulighed for berigelse især af stærkt fede tumorer, hvorved der kan opnås en mere effektiv medicinsk påvirkning af sådanne neoplasmer.

Sammenligningsundersøgelser af forbindelserne med 15 formlen I versus det immunsuppressive standard-azathioprin viser de førstnævntes overlegenhed: For at opnå omtrent samme virkning på allogene hudtransplantater på rotter er 300-700% højere doser nødvendige med azathioprin sammenlignet med forbindelserne med formlen I.

20 Der er endnu ikke fremkommet nogen rapport om konven tionelle cytostatiske midler med hensyn til topisk antiprolife-rativ virkning, således som det er tilfældet med forbindelserne med formlen I.

Det har endvidere vist sig, at den suppressive virk-25 ning på perifere leukocyter og lymphocyter hos rhesusaber er hurtigt reversibel efter ophør med en af forbindelserne med formlen I. En sådan kortfristet omfattende genopretning af normale hæmatologiske resultater kan ikke konstateres med de gængse cytostatika og immunsuppressive midler (f.eks. cyclo-30 phosphamid, methotrexat, azathioprin). Heraf kan det konkluderes, at overdosering opstået af individuelt varierende reaktioner og de deraf følgende bivirkninger lettere kan kontrolleres end med gængse cytostatika og immunsuppressive midler.

Steroider, azathioprin, antilymphocyt globulin (ALG), 35 antithymocyt globulin (ATG) og cyclosporin A anvendes til immunsuppression. Disse behandlingers bivirkninger er betydelige, og komplikationerne farlige. Forbindelserne med formlen I udviser en særlig mangel på bivirkninger og alene af denne grund DK 168268 ΒΊ 6 o udgør de et stort terapeutisk fremskridt.

Den for øjeblikket anvendte medicinske behandling af psoriasis må betegnes som usædvanlig utilfredsstillende. Corti-coider er blandt de mest effektive antipsoriasis-midler. Men sy-5 stemisk bør de indgives i så høje doser, at der ofte forekommer steroid toksicitet. Når behandlingen afbrydes kan der forekomme alvorlige tilbagefald eller endog. omdannelse til kroniske pu-stulare former. Tilbagefald forekommer også efter topisk anvendelse af corticoider.

10 Det folinsyre-antagcnistiske methotrexat betragtes ligeledes som et effektivt anti-psoriasis-middel. Methotrexat anses som et effektivt middel over for middelsvær til svær psoriasis-arthritis. På grund af den høje risiko for hepato-tok-sicitet, myelotoksicitet og gastrointestinal toksicitet må metho-15 trexatbehandling imidlertid begrænses til patienter, der er akut syge med udbredte alvorlige former for psoriasis. Forbindelserne med formlen I har en inhiberende virkning på proliferation selv ved topisk anvendelse, hvoraf følger, at foruden til den systemiske behandling af psoriasis-arthritis kan de også 20 få betydning for den topiske behandling af hudanormaliteter som følge af psoriasis. Bivirkninger i lighed'med dem, der er knyttet til de anti-psoriasis-midler, der allerede findes på markedet, forventes ikke ved anvendelse af forbindelserne med formlen I ud fra deres kemiske egenskaber.

25 Udviklingen af lipophile cytostatika bør tillægges stor betydning, eftersom de kendte forbindelser hverken når centralnervesystemet og heller ikke i terapeutisk tilstrækkelige koncentrationer, og en tilfredsstillende cytostatisk medicinsk behandling af maligne tumorer i centralnervesystemet er derfor 30 for øjeblikket ikke mulig. De forskellige typer af leukæmi kommer især i betragtning som en særlig interessant indikation til et lipophilt cytostatisk middel, eftersom disse hyppigt breder sig til centralnervesystemet, hvorfra sygdommens fremad-skriden forsættes yderligere. En anden mulig fordel ved et cyto-35 statisk middel med lipophile egenskaber er berigelsen i særligt fedtrige tumorer, som derfor muligvis fortrinsvis kan påvirkes.

Ved følgende sammenligningsforsøg konstateres virkningen af forbindelserne med formlen I.

O

7 DK 168268 B1

Sammenligningsforsøg I. Undersøgelse med hensyn til immunsuppressiv virkning ved en hudtransplantatoverlevelsesprøve på rotter

Forbindelse A (4-amino-N- (2 '-aminophenyDbenzamid) i-5 følge opfindelsen afprøves på rotter og rhesusaber med hensyn til immunsuppressiv virkning i et hudtransplantatmodelforsøg; ved forsøgene på rotter sammenlignes med den internationale im-minsuppressive standardforbindelse azathioprin samt med en kombineret medicinbehandling, der almindeligvis anvendes for tiden 10 ved organtransplantationer, bestående af højt doseret azathioprin og lavt doseret methylprednisolon. Forbindelse A er mindst lige så effektiv som sammenligningsmedicinbehandlingen ved disse prøver, men der anvendes langt mindre kvantiteter. Hos rhesusr aber er den immunsuppressive virkning også udpræget tydelig. Som 15 vist på disse arter er forlængelsen af den normale overlevelsestid for allogene hudtransplantater forårsaget af forbindelse A kendetegnet af den Øjeblikkelige distinkte reduktion af de perifere lympcyter.

A) Teknik 20 Sammenligningsmedicinbehandling:

Prøve I: azathioprin + methylprednisolon Prøve II: azathioprin

Fremstilling: Som suspension, der fremstilles frisk før hver indgivelse.

25 Indgivelsesvej: Intragastisk via mavesonde suspen deret i 0,8% "Methocel".

Volumen: 0,01 ml pr. gram legemsvægt og dosis.

Doseringsskema: Prøve I: fra dag -3 før transplantation til dag +6.

30 Prøve II: fra dag -2 før transplan tation til dag +9.

Afprøvede doser: Prøve I: 10 mg/kg i 6 dage efter 5 mgAg daglig i 4 dage Prøve II: 4-8 mg/kg daglig stigende 35 over 12 dage.

O

8 DK 168268 B1 B) Prøveplan 2 allogene hudtransplantater fra en donorrotte overføres til en modtagerrotte fra en ikke-be-slægtet indavlet stamme. Panniculus carnosus på 5 transplantatet kan enten fjernes ved dissektion (suprapanniculært transplantat) eller blive siddende på transplantatet (subpanniculært transplantat) . Transplantationen sker på dag 0 under let æternarkose efter barbering og rensning af trans-10 plantationsstederne. Transplantaterne fastgøres på transplantatmodtagerstederne ved anlæggelse af en passende forbinding. Fra dag +9 anbringes en beskyttelseskrave på dyrene, forbindingen fjernes og transplantaternes tilstand kontrolleres hver 15 dag. Bedømmelsen af transplantatfunktionen sker ved hjælp af en gradueret skala, der giver mulighed for differentiering af afstødningen svarende til en sværhedsgrad inddelt i 3 grader. Prøven slutter den dag, hvor 50% af dyrene i en gruppe 20 har afstødt begge transplantater. Forlængelsen af transplantatoverlevelsestid sammenlignet med kontroldyrene bestemmes i dage.

C) Resultater ®

Som det kan ses af tabellerne I og II, er ved 25 prøve I forbindelsen A overlegen sammenlignet med en standard medicinbehandling bestående af azathioprin og methylprednisolon. Ved prøve II er forbindelse A lige så effektiv som det immunsuppressive standardazathioprin. På grund af for-30 bindelse A's store aktivitet er imidlertid langt mindre mængder af forbindelsen påkrævet for at opnå en virkning på lige fod med standardmedicinbehandlingen .

Tabel I viser resultaterne af prøve I, hudtransplantat-35 overlevelsesprøven, på rotter.

Recipient Long Evans han. Donor: Lewis han.

2 suprapanniculære transplantater overføres fra donor til recipient.

9 DK 168268 B1

O

Tabel II viser resultaterne af prøve II, hudtransplan-tatoverlevelsesprøve, på rotter.

Recipient: Osborne Mendel han. Donor: Lewis han.

2 suprapanniculære transplantater overføres fra en 5 donor til en recipient.

10 15 20 25 30 35 DK 168268 B1 10 r- o H o

+ I rH I

tn m rd \ Q 1Λ

VD

«-1 O

+ . s S ^

D

~ * — in o —» o

rH O O O

+ H i—1 w *.—·* **—

tn vd tn VD

ro \ \ \

Q ID m VO

Λ * C*3 Η n O VD 5-1 w + co rq vo flj „ tn id in vd id

C id \ \ \ +J

\ Q CO rH -tf C

j-ι ro —

tt) τ' H

Jf η Λ Λ — tn4 r-) ro t-r vd o en c fl) P + vd cm n ro a

s s ^ 5 5 a I

B Q " " ft « tn tn w H S 2 s s? $ g φ £ + £ S ZL £ 1 X! tn vd in vd © ro d ti ro \ s \ -p c E-t+iQ^o cm tn ω

I ^ I

-P iH — U iH

tn H vd r-~ ro >i ih + vo o H Æg ro tn vo in vd (l) æ ro \ \ \ c ft cm o ^ o r-Γ δα i «Λ 11 .

ε h o — u-ι i + m o o ro -

Vi w ^ cm s, & un wn vo <x> ^ o ro \ \ \ o i

u Q en o o in B

+» Q

^ Λ || + γη o o ·§ ro tji vo in vo m* ro \ \ \ « Q Η Λ O O O' ·· 0) · rt in tn* rø h · β h h I tn <u o) *H <3 · ή »td *h · O' vo tn tn S = « ? ++ & » " „ ? 1 < S + 1¾ 3 S ·* s g ·° g 1 g « ί i 1 s < 1 n‘ n » S < ϊ " ΐ h ^ a S!shoSrs?Soii?n ** DK 168268 B1 11 o

Tabel II

Prøveforbindelse _Dyr med 2 afstødte transplantater/n (%)

Dosering_Dag +8 Dag +9 Dag +10 Dag +11 Dag +12

Kontrol 2/10(20) 5/10(50)* 6/10(60) 8/10(80) 9/10(90) 5 ("Methocel" i.g.)

Forbindelse A** 0/10(0) 1/10(10) 1/10(10) 1/10(10) 6/10(60)* 4-8 mgAg i.g. fra dag -2 til dag +9 10 Azathioprin 0/10(0) 1/10(10) 2/10(20) 4/10(40) 5/10(50)* 20-60 mg/kg i.g. fra dag -2 til dag +9 15 * Afstødningsdag: mindst 50% af dyrene har af stødt begge transplantater.

Forbindelse A: 4-amino-N- (2' -aminophenyl) -benzamid (eksempel 1).

II. Undersøgelse af forbindelse A med hensyn til immunsuppressiv aktivitet ved en hudtransplantatoverlevelsesprøve på rhesus-20 aber (Macaca mulatta) Påvisningen af virkningen ved hudtransplantatmodellen skal bedømmes som et bevis på en inhibering af de cellulære immunsystem (T-lymphocyter), eftersom dette på afgørende måde er involveret i afstødelsen af allogene transplantater efter den for 25 øjeblikket herskende opfattelse.

En inhibering af det humorale immunsystem (antistofproducerende B-lymphocyter) ved hjælp af forbindelserne ifølge opfindelsen og muligheden af en terapi som følge heraf, f.eks. af autoaggressionssygdomme, der er karakteriserede ved for stor 30 antistofproduktion mod endogent væv, kan for tiden kun konkluderes indirekte. En forøget tilbøjelighed til bakterielle infektioner, der observeres hos rotter behandlet i længere tid med høje doser forbindelse A må anses som en indirekte påvisning af inhiberingen af humoral immunresistens.

35

O

12 DK 168268 B1 A) Teknik

Kontrolstandard: Anvendes ikke af ethiske grunde.

Fremstilling: Frisk tilberedt før hver indgivelse.

Indgivelsesvej: Intragastrisk via mavesonde suspen-5 deret i 0,8% "Methocel".

Doseringsskema: 1 gang daglig i 10 dage.

Afprøvet dosis: 10 mg/kg B) Prøveplan I alt 4 allogene hudtransplantater fra 2 forskel-10 lige donordyr overføres over kors til 1 ikke-be- slægtet modtagende dyr. Først fjernes transplantaterne under narkose med ketamin fra donordyrenes barberede og rensede maveskind og befries for eventuelt vedhængende fedt. De fire transplantat-re-15 ceptorsteder forberedes på modtagerdyrets barbe rede og rensede ryg under ketamin-narkose ved at fjerne plassende store stykker hud. Efter heldig gennemført hæmostase bredes transplantaterne ud på transplantatmodtagerstederne og sys til sårets 2o kanter. Såret dækkes med passende forbindsmate riale, og dette fastholdes med en elastisk bandage. Bandagen åbnes på dag 5, 7 og 9 efter transplantation, og transplantaternes funktion undersøges. På dag 9 anbringes ingen bandage. Trans-25 plantatfunktionen kontrolleres derpå dagligt, indtil afstødning har fundet sted.

C) Resultater

Kontroldyr anvendes ikke ved denne prøve på primater af etiske grunde. Sammenligninger foreta-30 ges med den normale overlevelse for allogene hud transplantater eller historiske kontroldyr, anført som 10 dage. En forlængelse af den normale transplantatoverlevelsestid kan opnås med forbindelse A ved den afprøvede dosering på prøvedyr ZE 35 med 6-7 dage og med 4-5 dage med prøvedyr YL.

Dette resultat må fortolkes som en klar immunsuppressiv virkning af forbindelsen A.

O

13 DK 168268 B1

Fig. 1 og 2 viser, hvorledes en 10-dages medicinbehandling med forbindelse A påvirker leukocyter og lymphocyter i rhesusarbers plasma.

Dosering: 10 mg/kg i.g. i gange daglig 5 Fig. 1: Rhesus abe ZE, hun.

Fig. 2: Rhesus abe YL, hun.

III. Undersøgelse af forbindelse A's anti-neoplastiske virkning på 3 turoormodeller hos mus

Efter intragastrisk indgivelse af forbindelse A til 10 mus med tumorer viser disse en afgørende stigning i den gennemsnitlige overlevelsestid og en klar retardering af den pågældende tumors vækst sammenlignet med de ubehandlede kontroldyr ifølge den anvendte tumormodel.

Hos rotter resulterer topisk påførelse af forbindelse 15 A i et passende opløsningsmiddel i en klar inhibering af voksendende hårfollikeler.

Inhiberingen af voksende hårfollikeler er en ofte iagttaget bivirkning, der beskrives i litteraturen vedrørende systemisk cytostatisk medicinbehandling. Det er et udtryk for den 20 anti-proliferative virkning af denne type forbindelser, der i-sær påvirker de hurtigt prolifererende vævstyper.

A) Teknik

Fremstilling: Som suspension, der fremstilles frisk før hver indgivelse.

25 Indgivelsesven: Oral, suspenderet i 0,8% "Methocel".

Volumen: 0,01 ml pr. g legemsvægt dg dosis.

Doseringsskema: Daglig i 9 dage, medmindre andet er anført.

Afprøvede doser: 60, 120, 180 og 240 mg/kg daglig.

30 B) Tumorbeskrivelse L 1210/Rij-adaption af L 1210 leukæmi hos CD2~mus (C57B1 x DBA2, F1 hybrid). Dagen før indgivelse 5 af forbindelsen inokkuleres 10 leukæmiske celler intraperionealt. Burene kontrolleres 2 gange dag-35 lig for døde dyr. Slutpunktet er den gennemsnitli ge overlevelse af 5 mus/dosis sammenlignet med 10 ubehandlede kontroldyr.

O

14 DK 168268 B1

Osteosarcoma C22LR hos BCA-mus (C57BL x CBA/Rij, Fl-hybrid). Tumoren inokkuleres subcutant bilateralt i siderne. Den måles mindst 2 gange ugentlig med 3 dimensioner. Slutpunktet er retardering af 5 vækst. Dette defineres som forskellen i gennemsnitstid, under hvilken 5-10 tumorers volumen hos 5 behandlede dyr når en givet værdi sammenlignet med 5-10 tumorer hos kontrodyrene. Denne værdi bestemmes som 4 gange gennemsnitsvoluminet ved 10 behandlingsbegyndelse.

Lewis lungetumor hos BCBA-mus. Metoden er den samme som med osteosarcoma. Tumorens volumen bestem- 3 mes her ved 800 mm (= produktet af diametrene i 3 dimensioner).

15 C) Resultater På grund af de valgte doseringers toksicitet er daglig påføring ikke mulig i de fleste doseringsgrupper. Efter at der har været dødsfald i alle grupper efter 2 eller flere påføringer af 120 mg/kg el-20 ler derover, reduceres antallet af indgivelser til de overlevende dyr. Resultaterne er anført i tabellerne III-V.

Bedømmelse: De afprøvede doser er for høje. Til trods herfor kunne en klar aktivitet mod LI210 hos 25 den afprøvede forbindelse bevises i en moderat dosis, en god aktivitet over for osteosarcoma og moderat aktivitet over for Lewis lungetumor.

Følgende tabeller III-V viser resultaterne af afprøvningen af Forbindelse A med hensyn til neoplastisk 30 aktivitet hos mus.

35 15 DK 168268 B1

O

Tabel III L 1210

Dosering Gen.sn. over- % stigning af ______ levelse (dage)_gen.sn. overlev.

5 Kontroldyr (n = 10) 8

Prøvegrupper: 9 x 60 mg/kg p.o. (n = 5) 11 7 x 120 mg/kg p.o. (n = 5) 6 38% 4 x 180 mg/kg p.o. (n = 5) 5 toksisk død 10 4 x 240 mg/kg p.o. (n = 5) 5 toksisk død

Tabel IV Osteosarcoma

Dosering Gen.sn. over- % stigning af 15__ levelse (dage)_gen.sn. overlev.

Kontroldyr (n = 5) 5/5

Prøvegrupper: 9 x 60 mg/kg i.p. (n = 5) 5/5 7,8 (p * 0,001) 4 x 120 mg/kg p.o. (n = 5) 0/5 (dag 5) toksisk død 20 2 x 180 mg/kg p.o. (n = 5) 1/5 9,6 1 x 240 mg/kg p.o. (n *= 5) 5/5 3,1 (p = 0,001)

Tabel V

Lewis lungetumor 25 Dosering Overleyende Retardering af _dyr_tumorvækst (dage)

Kontroldyr (n = 5) 5/5

Prøvegrupper: 9 x 60 mg/kg i.p. (n = 5) 5/5 3,8 (p = 0,061) 4 x 120 mg/kg p.o. (n = 5) 0/5 toksisk død 2 x 180 mg/kg p.o. (n = 5) 0/5 toksisk død 1 x 240 mg/kg p.o. (n = 5) 5/5 3,5 (p = 0,018) 35 DK 168268 B1

O

16 IV. Undersøgelse af forbindelse A's antiproliferative virkning ved topisk indgivelse til rotter A) Teknik

Kontrolstandard: Der kendes ingen kontrolstandard.

5 Fremstilling; Frisk før hver indgivelse.

Indgivelsesvej; Topisk ved hjælp af pipettering som 0,5% opløsning i absolut ethanol.

Volumen: 1 ml pr. dyr og dosis.

Afprøvede doser: 5 mg/dyr daglig i 14 dage, derpå 10 10 mg/dyr daglig i 7 dage.

B) Prøveplan

En beskyttelseskrave anbringes på hanrotter af Long Evans-stammen, pelsfarve "sort hætte". Et rektangel, der er 3 cm langt og 1,5 cm bredt, mar-15 keres ved hjælp af en skabelon på ryghuden i om rådet med sort ryghårsstribe efter barbering og rensning. Prøveopløsningen påføres langsomt dråbevis på dette rektangel, så at man undgår, at den løber ud på den omgivende hud. Opløsnings-20 midlet påføres på samme måde på kontroldyrene.

Efter 21 dages behandling bedømmes hårvæksten på de behandlede områder i sammenligning med kontrolområderne .

C) Resultater 25 Der ses en klar inhibering af hårvækst hos de be handlede dyr sammenlignet med kontrodyrene. Bedømmelse: Selv om det ikke kan udelukkes, at en del af det indgivne stof er involveret på en systemisk måde i inhiberingen af væksten af hår-30 follikeler på grund af en mulig percutan absorp tion, kan det påvises, at der opnås en klar anti-proliferativ virkning med forbindelsen A på den tilknyttede hud efter topisk påføring.

35

O

17 DK 168268 B1 V. Forbindelse A's centrale virkninger

Den gennemtrængende evne hos forbindelserne med formlen I ind i centralnervesystemet og andre lipoide organer kan også påvises ved hjælp af deres udtalte antikonvulsiviske 5 virkninger ved den maksimale elektro-konvulsionsprøve (Swinyard m.fl., J. Pharm. exp. Ther. 106, 319 (1952) og ved pentetrazol-konvulsionsmodellen (som ovenfor):

Forbindelse A's antikonvulsiviske virkning hos mus.

10 Tabel VI

Konvulsionsmodel Forbindelse A Diphenvlhydantoin ED50 mg/kg (i.g.) ED5Q mg/kg (i.g.)

Elektrokonvulsion 30,0 (21-42) 22,5 (18-28)

Pentetrazolkonvulsion 44,0 (32-60) 9,5 (7 -13) 15 -

For at gøre størrelsen af de centrale virkninger klar, anvendes det antiepileptiske standardmiddel diphenylhydantoin som referenceforbindelse.

7. dags-værdierne for den akutte orale (i.g.) toksici-20 tet for forbindelse A og diphenylhydantoin hos mus er anført til sammenligning i tabel VII.

Tabel VII

LDj.q Konfidensgrænse i mg/kg, p = 0,05 25 _mg/kg_øver s te_nederste_

Forbindelse A 625 494,9 831,2

Diphenylhydantoin 128 114,2 143,3

Fremstillingen af forbindelserne med formlen I illu-3° streres i de følgende eksempler.

Eksempel 1 4-Amino-N-(2'-aminophenyl)-benzamid C1oH.,N-0 Molekylevægt 227,26 35 13 13 3 22,7 g o-nitroanilin opløst i 130 ml vandfri dioxan blandes dråbevis med en opløsning af 30,4 g p-nitrobenzoylchlo-

O

18 DK 168268 B1 rid i 150 ml tør dioxan. Reaktionen bringes til ophør ved opvarmning i en time under tilbagesvaling. Efter afkøling til 15°C udfældes N-(2'-nitrophenyl)-4-nitrobenzamid i krystallinsk form. Efter omkrystallisation ud fra chlorbenzen fås 39 g (83% 5 af det teoretiske) med et smeltepunkt på 217-218°C.

39 g af dinitroproduktet hydratiseres i 550 ml dime-thylformamid i nærvær af 10 g Raney-nikkel i en time ved 25°C og et tryk på 2 over atmosfæretryk.

Katalysatoren filtreres fra, opløsningsmidlet fjernes 10 i vakuum, og den i overskriften nævnte forbindelse omkrystalliseres ud fra ethanol. Udbytte 20,2 g (66% af det teoretiske) med et smeltepunkt på 180-181°C.

Ved hjælp af en opløsning af HCl-gas i ethanol kan forbindelsen omdannes til sit dihydrochlorid, der er 4% vandop-u 15 løseligt: 4-Åmino-N-(21-aminophenyl)-benzamid-dihydrochlorid C13H15N3C^20# 300,18, smeltepunkt 340°C (ud fra ethanol).

20 Eksempel 2 4-Methylamino-N- (2' -aminophenyl) -N-benzamid 2,71 g N-(2-nitrophenyl)-4-methylamino-benzamid opløses i 300 ml tetrahydrofuran og hydratiseres med Raney-nikkel i et rysteapparat. Temperaturen stiger fra 21 til 26°C under 25 hydratiseringen. Efter at katalysatoren er filtreret fra, inddampes den klare opløsning, og remanensen omkrystalliseres ud fra ethylacetat.

Der fås 1,3 g (56,5% af det teoretiske) 4-methylamino--N-(21-aminophenyl)-N-benzamid, smeltepunkt 189°C.

30 N-(2-Nitrophenyl)-4-methylaminobenzamidet, der anven des som udgangsprodukt, fremstilles på følgende måde: 4,535 (0,03 mol) 4-methylamino-benzoesyre opvarmes under omrøring med 9,19 g (0,09 mol) eddikesyreanhydrid til 100°C i en time. De efter afkøling af deri klare opløsning ud-* 35 fældede krystaller filtreres fra ved sugning og vaskes med ethylacetat (smeltepunkt 199-201°C). Den opnåede N-acetyl-4-methyl-amino-benzoesvre (udbytte 62%) omdannes derefter ved hjælp af

O

19 DK 168268 B1 thionylchlorid i dioxan til syrechloridet. Derefter fjernes overskud af thionylchlorid med lidt dioxan i vandstrålevakuum. Der tildryppes 2,76 g (0,02 mol) o-nitroanilin i 10 ml tør dioxan til reaktionsblandingen, og opløsningen blandes med 4,04 g (0,04 5 mol) triethylamin (som HCl-absorptionsmiddel). Reaktionsblandingen koges derpå under tilbagesvaling i en time. Den inddampede reaktions remanens blandes med 40 ml vand og ekstraheres med me-thvlenchlorid. Efter afdampning af den organiske fase tilsættes hertil 4 ml isopropanol, og de dannede krystaller filtreres fra 10 ved sugning efter forudgående omrøring i 30 minutter.

Der fås 5,1 g N-(2-nitrophenvl)-4-N-acetyl-N-methyl)--aminobenzamid (smeltepunkt 162°C) i et udbytte på 55,6% af det teoretiske. Det således opnåede rå produkt suspenderes i en lille smule ethanol og hydrolyseres med 7 gange den molære mængde 15 koncentreret saltsyre under tilbagesvaling i 9 timer. Reaktionsblandingen inddampes til tørhed og bringes til krystallisation ved tilsætning af isopropanol, opløses derpå i 40 ml vand og gøres basisk med ammoniak. Efter ekstraktion med methylenchlorid fås 1,4 g N- (2-nitrophenyl) -4-methylamino-benzamid med et smelte-20 punkt på 187°C og i et udbytte på 51% af det teoretiske.

På analog måde fås følgende forbindelser: 4-Amino-N- (2' -methylaminopheny 1) -N-benzamid og 4-methy lamino-N- (2' -methv laminophenvl) -N-benzamid.

25 Eksempel 3 4-Amino-N- (21 -aminophenvl) -N-methvlbenzamid 22,82 g (0,15 mol) N-methyl-o-nitroanilin opløses i 70 ml tør tetrahydrofuran og blandes dråbevis med 30,6 g (0,165 mol) p-nitrobenzoylchlorid i 90 ml tør tetrahydrofuran under omrøring 30 og gennembobling med nitrogen i hele reaktionsblandingen. Omrøringen fortsættes under tilbagesvaling i 2 timer under nitrogenatmosfære. Den fremkomne reaktionsblanding inddampes og omkrystalliseres ud fra acetylacetat.

Der fås 29,2 α (64,6% af det teoretiske) N-methyl-N-(2-35 -nitrophenyl)-4-nitrobenzamid med et smeltepunkt på 137-138°C, og dette opløses i 800 ml tetrahydrofuran og hydratiseres med 10 g Raney-nikkel i et rysteapparat under afkøling med vand.

DK 168268 B1

O

20

Temperaturen bør ikke overstige en øverste grænse på 25°C.

Efter 7 timers forløb tilsættes atter 10 g Ranev-nikkel, og efter yderligere 6 timer inddampes den farveløse opløsning til tørhed, remanensen opløses i ethvlacetat og fældes med diisopro-5 pylether.

Der fås 18 g 4-amino-N-(2,-aminophenyl)-N-methvlbenz-amid, smeltepunkt 159-160°C.

På analog måde fås følgende forbindelser: 4-Methvlamino-N- (21 -aminophenyl) -N-methylbenzamid, 1 o 4-methylamino-N- (2' -methylaminophenyl) -N-methylbenzamid og 4-amino-N- (2 * -methylaminophenyl) -N-methylbenzamid.

15 20 25 30 35

Claims

1. Farmaceutiske præparater, kendetegnet ved, at de indeholder mindst ét N-phenylbenzamidderivat med formlen R3 hvor grupperne R1, R2 og R3, der kan være ens eller forskel-10 lige, hver er et hydrogenatom eller en methylgruppe, eller farmakologisk acceptable salte deraf til bekæmpelse af maligne, proliferative og autoimmune sygdomme og til immunsuppressiv terapi i forbindelse med transplantationer.

2. Farmaceutiske præparater ifølge krav 1, k e n-15 detegnet ved, at de indeholder 4-amino-N-(2 '-amino- phenyl)-N-benzamid eller farmakologisk acceptable salte deraf. 20