HU193512B - Process for preparing hybride interferones from human erythrocytes - Google Patents

Description

A találmány hibrid leukocita interferonoknak dezoxiribonukleinsav rekombinációs technológia útján történő mikrobiológiai előállítására vonatkozik. A találmány szerinti eljárással kapott termékek felhasználhatók vírusos és daganatos megbetegedések kezelésére.

Viszonylag homogén leukocita interferonokat eddig egészséges véradók vagy fehérvérűségben szenvedők vérében lévő leukocitákból állítottak elő. Ezek az interferonok fehérjék, és az őket tartalmazó sejteket képesek a vírusok kai szemben ellenállóvá tenni. Emellett az inter férőn gátolhatja a sejtburjánzást, és mérsékel heti az immunreakciót

A fenti tulajdonságok arra ösztönöznek, hogy az interferont felhasználják a gyógyászat bán vírusos fertőzések és rosszindulatú daganatok kezelésére

Újabban a dezoxiribonukleinsav (DNS) rekombinációs technológiát felhasználták több különféle leukocita interferon mikrobiológiai úton történő termelésére. Az így előállított le ukocita interferonok aminosav-szekvenciája 70% körüli mértékben homológ — egymáshoz viszonyítva [Dávid V Goeddel és munkatársai, Natúré, 290, 20 26 (1981)].

A különféle, többek között LelF A,B,C,D,F,G és H jelölésű leukocita interferonok aminosav-szekvenciáit kódoló géneket a KG-1 sejtvonalból állítják elő, amelyet Koeffler és Golde írt le [Science, 200, 1153-1154 (1978)] A KG-1 sejtvonal az American Type Culture Collection gyűjteményben lett letétbe helyezve, s ATCC CRL 8031 számon hozzáférhető Ezek a gének bakteriális kifejeződésére alkalmas plazmidlartalmú hordozókban felhasználhatók a „gazda baktériumok transzformálására „Gazda baktériumként előnyösen az Escherichia coll K-12 294 törzset alkalmazzák, amely 1978 október 28-án lett deponálva ATCC 31446 számon.

A DNS-rekombinációs eljárások középpontjában a plazmid áll, amely a baktériumokban és más mikrobákban található kétszálú DNS nem-kromoszóma hurok-része, s gyakran sejtenként többszörös kópiában is megtalálható. A plazmid DNS bán kódolt információ tartalmazza azt az információt is, amely szükséges a plazmid újabb sejtekben történő reprodukálásához (azaz „replikon” létrehozásához), és rendszerint egy vagy több olyan kivá lasztási jellemzőnek, mint pl baktériumok esetén az antibiotikumokkal szembeni ellenállókópességnek az átadásához. Ezek a kiválasztási jellemzők biztosítják, hogy a szóbanforgó plazmidot tartalmazó „gazda sejt kiónjainak növekedése előnyben részesüljön a szelektív tápta lajon

A plazmidok hasznosíthatósága azon alapul, hogy specifikus módon hasíthatok egyik vagy másik restrikciós endonukleázzal (vagy restrik ciós enzimmel) Az egyes restrikciós enzimek a plazmidban lévő DNS különböző helyei! „isme rik fel” Ezután heterológ gének vagy géntore dékek illeszthetők be a plazmidba úgy, hogy a végükkel kapcsolódnak a hasítási helyhez vagy 2 az azzal szomszédos rekonstruált végekhez

A DNS rekombinációt a sejten kívül végezzük, a létrehozott „rekombináns plazmid azonban bevihető a sejtbe a transzformációnak nevezett eljárással, és nagy mennyiségben nyerhető heterológ gént tartalmazó rekombináns plazmid a transzformáns szaporítása útján.

Továbbá, ha megfelelően történt a gén beillesztése a plazmid azon részeihez képest amelyek a DNS ben kódolt üzenet átírását (transcription) és lefordítását (translation) irá nyitják, akkor a kapott expresszió hordozó fel használható annak a polipeptid szekvenciának a tényleges termelésére, amelyet a beillesztett gén kódol. Ezt a folyamatot kifejeződésnek (expresszió) nevezik.

A polipeptid kifejeződése a promotor néven ismert tartományban indul be, amelyet ribonukleinsav (RNS) polímeraz ismer fel és kötődik hozzá Egyes esetekben, például a találmánynyal kapcsolatban előnyös triptofán (trp) promotor esetében, a promotor tartományokat átfedik az „operátor” tartományok, és így kombinált promotor-operátor jön létre Az operátorok olyan DNS szekvenciák, amelyeket felismernek az úgynevezett represszor fehérjék ezek arra szolgálnak, hogy szabályozzák az átírás beindulásának gyakoriságát egy bizonyos piomotornál.

A polimeráz enzim végighalad a DNS mentén, és átírja a kódolt spirálágban az 5' végétől a 3' végéig tárolt információt üzenethordozó (messenger) ribonukleinsavvá, amely viszont lefordítódik a DNS által kódolt aminosav szék venciájú polipeptiddé. Minden egyes amtnosa vat egy nukleotid triplett vagy „kodon xodol azon belül, amelyet ebben a szabadalmi leírás bán szerkezeti génnek nevezünk. Ez az a rész, amely a kifejezett termék aminosav szekven ciáját kódolja

A promolorhoz történő kötődés után az RNS polimeráz először átírja azokat a nukleotidokat amelyek egy riboszóma kötési helyet kódolnak majd a lefordítás kiváltása vagy „startjel követ kezik [ez rendszerint ATG (adenin timin gua nin), amely a létrejövő üzenethordozó RNS bán AUG-vé alakul], azután pedig a nukleotid kodo nők jönnek létre magában a szerkezeti génben Úgynevezett megállító kodonok íródnak át a szerkezeti gén végén, amelyek után a polimeráz további üzenethordozó RNS szekvenciát hozhat létre. Ezt a megállító jel miatt a riboszomák nem fordítják le

A riboszómák az üzenethordozó RNS-ontalálhato kötési helyhez kapcsolódnak — baktériumokban rendszerint amint az üzenethordozó RNS (mRNS) megképződött — és létrehozzák a kódolt polipeptidet, a lefordítás startjelétol kezdve a fentebb említett megállító jelig A kívánt termék akkor képződik, ha a riboszóma kötési helyét kódoló szekvenciák megfelelően helyezkednek el az AUG indító kodonhoz képest, és ha valamennyi többi kodon követi fázisban az indító kodont. A képződő terméket úgy különítik el, hogy a „gazda” sejtet lízissel

-2193512 roncsolják és megfelelő tisztítást alkalmaznak a többi baktériumfehérje eltávolítására

A különféle leukocita interferonokat kódoló gének nukleotidszekvenciájának vizsgálata azt mutatja, hogy bizonyos fokú azonosság áll fenn közöttük az egyes restrikciós endonukleázok által felismert hasítási helyek jelenlétét és elhelyezkedését illetően. Azt találtuk, hogy ezt az azonosságot felhasználhatjuk új hibrid gének DNS-rekombinációval történő előállítására, s e gének irányításával olyan hibrid leukocita interferonokat termelhetünk mikrobiológiai úton, amelyek várhatóan rendelkeznek kisebb vagy nagyobb mértékben az eredeti gének által kódolt vírusellenes és egyéb, az interferonokra jellemző tulajdonságokkal.

A kiindulási leukocita interferon gének — amelyek az említett leukocita interferon fehérjéket kódolják — természetes alléles eltéréseket mutatnak Ezeket az alléi változatokat az jellemzi, hogy egy vagy több aminosavban eltérnek egymástól a fehérjeszekvenciák, vagy a szekvenciában egy vagy több aminosavat érintő törlés, helyettesítés, beillesztés, inverzió vagy kiegészítés található. Minden egyes kiindulási leukocita interferonnál — jelölésük LelF A, LelF B... LelF J stb — a jelölés vagy definí ció, s ennek következtében a találmány is, ezekre az alléi változatokra is kiterjed..

Az ábrák leírása:

Az 1. ábrán nyolc leukocita interferon (LelF) kiegészítő DNS (cDNS) klónjainak kódoló tartományai nukleotid szekvenciáját mutatjuk be. Közülük az egyik, amelyet LelF E jelöléssel láttunk el, látszólag pszeudogén, amely nem kódol aktív leukocita interferont, míg egy másik a LelF G jelölésű nem tartalmazza a megfelelő interferon teljes szekvenciáját Minden egyes leukocita interferonnál aláhúztuk az ATG lefordításbeindító kodont valamint a lezáró triplettet.

A 2. ábra nyolcféle LelF típussal klónozott kiegészítő dezoxiribonukleinsavak (A-H) restrikciós endonukleáz enzimekkel törlónő feltárással kapott összetételét szemlélteti. A klóno-. kát tartalmazó plazmldokat.a dC:dG farokkópző módszerrel hoztuk létre [Goeddel és munkatársai, Natúré, 287, 411-416 (1980)] A cDNS beillesztéseket Pst I enzim alkalmazásával hasíthatjuk, azaz mindegyik beillesztés mindegyik Vége Pst I restrikciós endonukleáz hasítási hely. Az egyes cDNS beillesztések végén található vonalak a szegélyező homopolimer dC:dG farkakat jelentik. Jeleztük a Pvu II, Eco Rl és Bgl II restrikciós helyek elhelyezkedését Az ábra pontozott részei a-z érett leukocita interferonok kódoló szekvenciáinak felelnek meg, a vonalkázott részek pedig a jel—peptid kódoló szekvenciáit jelképezik. Az üresen hagyott részek a 3 és 5’ nem-kódoló szekvenciákat mutatják.

A 3. ábrán a nukleotid szekvenciák alapján meghatározott nyolc LelF fehérje-szekvencia kát hasonlítjuk össze Azokat az egybetűs rövidítéseket használjuk, amelyeket a lUPAC-lUB biokémiai nomenklatúrával foglalkozó bizottsága ajánl:

A(alanin), C(cisztein), D(aszparaginsav), E(glutaminsav), F(fenil-alanin), G(glicin), H(hisztidin), l(izoleucin), K(lizin), L(leucin), M(metionin), N(aszparagín), P(prolin), Q(glutamin), R(arginin), S(szerin), T(Treonin), V(valin), W(triptofán) és Y(tirozin).

A számok az aminosavak helyzetére vonatkoznak (S a jel pepiidre vonatkozik).

A 165 aminosavból álló LelF A szekvenciában a 44-es helyzetben található vízszintes vonal szerepe az, hogy összevethető legyen a LelF A szekvencia a többi LelF 166 aminosavból álló szekvenciáival. A LelF E szekvencia meghatározásánál figyelmen kívül hagytuk a kódoló tartományában lévő külön nukieotidot (187-es helyzetben az 1. ábrán). A csillagok fázison belüli lezáró kodonokat jelölnek. Olyan aminosavak is láthatók, amelyek valamennyi LelF-ben megtalálhatók, a pszeudogén LelF E kivételével. Az aláhúzott maradókok olyan aminosavak, amelyek az emberi fibroblaszt interferonban is jelen vannak.

Az 1 ábrán szereplő 11 és 69 közötti nukleotidok a 3. ábrán feltüntetett S1-S23 aminosa vaknak felelnek meg. Az 1 ábrán szereplő TGT kodon (70 72 nukleotid) a 3 ábrán látható ciszteinnek (C, 1 aminosav) felel meg. A 3 ábrán a Pvu II restrikciós endonukleáz hasítasi hely a 92. és 93. aminosavra vonatkozó kodonok között helyezkedik el a LelF A, B, D, F és G esetén, azaz az 1 ábrán lévő 346. és 347. nukleotid között

A 4. ábrán az A és D érett leukocita interfe ron aminosav-szekvenciáit hasonlítjuk össze szaggatott vonalakkal jelölve a 44 aminosav törlését a LelF A-nál. A LelF D-nek csak azon aminosavjait tüntettük fel, amelyek eltérnek a LelF A megfelelő aminosavjaitól, a LelF D aminosav-szekvenciája egyébként azonos a LelF A aminosav-szekvenciájával. A 4 ábrán a Bgl II és Pvu II restrikciós endonukleáz hasítási helyének viszonylagos helyzetét is feltüntettük a megfelelő génen (e hasítási helyeket felhasználjuk a találmány szerinti előnyös hibrid leukooita gének kialakításához).

Az 5. és 6. ábrán azokat az eredményeket mutatjuk be, amelyeket egy találmány szerinti előnyös hibrid leukocita interferon (LelF-A/D) összehasonlító vizsgálatánál kaptunk . A vizsgalatok során az enkefalomiokarditisz vírussal (EMC), illetve a veszikuláris sztomatitisz vírussal (VSV) szembeni aktivitást határoztuk meg egér sejteken.

A 7. és 8. ábrán azokat az eredményeket mutatjuk be, amelyeket a LelF A/D interferonnal EMC vírusfertőzéseknél végzett összeha sonlíto vizsgálatoknál kaptunk egéren, illetve hörcsögön A 7 ábrán feltüntetett adatok 3 óra val a megfertőzés előtti i.p. kezelés eredményei A LelF A/D és LelF A interferonokból megadott dózisok WISH sejteken végzett titráláson alapul nak

A 9 ábra öt leukocita interferon fehérje Közöttük az I és J típusok DNS szekvenciáit tartalmazza

A találmányt az alábbiakban részletesen is

-3193512 mertetjük:

Az alkalmazott mikroorganizmusok Munkánk során'két mikroorganizmus törzset használtunk: Escherichia coli x 1776 [amelyet a 4 190 495 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban ismertetnek] és Escherichia coli K 12 294 (A végződés, thr, hsr, hsmk') [amelyet a 2 055 382A sz nagybritanniai publikált szabadalmi bejelentésben ismertetnek | Mindkét törzs az American Type Culture Collection mikroorganizmus-győjteményben lett deponálva ATCC 31537, illetve 31446 számon, 1979. július 3 án, illetve 1978. október 28. án Az összes DNS rekombinációs kísérletet az Amerikai Egyesült Államokban lévő National Institutes of Health által megadott idevágó irányelvekkel összhangban végeztük.

Jóllehet a találmány szerinti eljárás különösen előnyös változatainál az Escherichia coli 1776 és az Escherichia coli K-12 294 törzset használtuk, azonban más ismert Escherichia coli törzs is alkalmazható, például az Escherichia coli B vagy egyéb mikrobatörzsek, amelyek közül számos deponálva van és beszerezhető az ismert mikroorganizmus-gyűjteményektől, mint amilyen az American Type Culture Collection. Lásd ezzel kapcsolatban az ATCC katalógust és a 2 644 432 sz. német szövetségi köztársaságbeli közrebocsájtási iratot.

A LelF hibrideknek a találmány szerinti előállítása során az egyes kiindulási génekben egyformán elhelyezkedő restrikciós endonukleáz hasítási helyeket és a gén-végeket hasznosítjuk a hordozó expressziós plazmidok (vektorok) hasonló helyeivel kapcsolatban. Például a pLelF A trp 25 expressziós plazmid Xba I és Pst I közötti nagy feltárási töredéket (mintegy 3900 bázispárból áll) összekapcsolhatjuk különböző kiindulási leukocita interferon gének Xba I és Pvu II közötti, valamint Pvu II és Pst I közötti feltárási töredékeivel, és ekkor olyan expressziós plazmidokat kapunk, amelyek segítségével a megfelelő hibrid leukocita interferonhoz jutunk.

Az egyes LelF expressziós plazmidokat egymástól függetlenül állítottuk elő különböző plaz midokból [például pLelF A trp 25, pLelF B trp 7, pLelF C trp 35, pLelF D trp 11, pLelF F trp 1, pLelF G, pLelF H, pLelF I stb., amelyek kialakítását a Natúré, 287, 411 (1980) szakcikk tárgyalja] vagy a pBR322 plazmidból [amelynek az előállítását a Gene,2,95 (1977) szakcikk ismerteti] elkülönített hasítási töredékekkel A fenti plazmidok némelyikénél a „trp jelölés triptofán promotor-operátor rendszert jelent, amely igen előnyösen alkalmazható a bakteriális úton történő termeléshez, amint azt a 36 776 sz közzétett európai szabadalmi bejelentés ismerteti.

Egy első érett leukocita interferon közvetlen kifejeződése

A LelF Á interferon érett interferon polipeptidkónt történő közvetlen kifejeződését célzó eljárás során szintetikus (N-terminális) és kiegészítő dezoxiribonukleinsavakat kapcsoltunk össze.

Egy Sau 3a restrikciós endonukleáz hely cél 4 szerűen a LelF A 1. és 2. kodonja között található. Két szintetikus dezoxioligonukleotidot választottunk ki, amelyek ATG lefordítást kiváltó kodont tartalmaznak, helyreállítják az 1. számú aminosavat (cisztein) kódoló kodont és EcoRl „fapados” (sticky) véget hoznak létre. Ezeket az oligomereket a pL31 plazmid 34 bázispárból álló, Sau 3a és Ava II közötti töredékéhez kapcsoltuk. A képződött, 45 bázispárból álló terméket két további DNS töredékhez kapcsoltuk. Ilyen módon egy 865 bázispárból álló, szintetikus (természetes eredetű hibrid gén képződött, amely a LelF A-t kódolja, és amely az Eco Rl es Pst I restrikciós helyekkel van határolva Ezt a gént beillesztettük a pBR322 plazmidba az Eco és Pst I helyek közé így a pLelF A 1 plazmidot kaptuk.

A pGM1 plazmid tartalmazza az Escherichia coli triptofán operont, amely a ALe1413 törlést foglalja magába [Miozzari és munkatársai, J Bacteriology, 133, 1457-1466 (1978)], ennek következtében olyan összekapcsolt fehérjét te jez ki, amely tartalmazza a trp vezető első 6 aminosavját és a trp E polipeptidnek mintegy utolsó harmadát (ez a továbbiakban Le’ jelöléssel szerepel), valamint az egész trp D polipeptidet. Az egész összekapcsolt fehérje kifejeződése a trp promotor-operátor rendszer irányítása alatt történik.

μg pGM1 plazmidot kezeltünk a Pvu H restrikciós enzimmel, amely öt helyen hasítja a plazmidot. A géntöredékeket ezután EcoRl összekapcsolókkal kapcsoltuk össze (ezek egy pCATGAATTCATG szekvenciája ónkiegészítő oligonukleotidból állnak), és így egy EcoRl ha sítási hely jött létre, amelyet később egy EcoRl helyet tartalmazó plazmidba lehetett klónozni

A pGM1 plazmidból nyert 20 μg mennyiségű DNS töredéket 10 egység T₄ DNS-ligázzal kezeltük 200 pikomól mennyisegű, az 5 végén foszforilezett szintetikus oligonukleotid (pCATGAATTCATG) és 20 μΙ T₄ DNS-ligáz pufferoldat [összetétele: 20 mM trisz, pH=7.6; 0,5 mM adenozin-trifoszfát, 10 mM magnézium- klorid és 5 mM ditiotreitol] jelenlétében, 4 C

- on, egy éjszakán át. (A trisz jelentése trisz(hidr oxi-metil)-amino-metán.) Az oldatot ezután 10 percig hevítettük 70“C-on az összekapcsolás megállítása céljából Az összekapcsolókat EcoRI-vel lehasítottuk, és a töredékeket — amelyek most EcoRl végeket tartalmaztak — szétválasztottuk 5% os poliakrilamidgéllel végzett elektroforézissel (PAGE). A három legnagyobb töredéket különítettük el a gélről úgy, hogy először etídium-bromiddal megfestettük, ultraibolya fénnyel történő megvilágításnál a töredékek elhelyezkedését meghatároztuk, és levágtuk a gélből az elkülöníteni kívánt anyagot tartalmazó részeket.

Az egyes géntöredékeket tartalmazó gélda rabokat 300 μΙ 0,1xTBE pufferoldattal együtt dializáló zsákba helyeztük és 1 órán at vegez tünk elektroforézist 100 V feszültséggel 0,1 xTBE pufferoldatban (a TBE pufferoldat összetétele: 10,8 g trisz bázis, 5,5 g bórsav és 0,09 g etilen

-4193512

-diamin-tetraecetsav-dinátriumsó 1 liter vízben). A dializáló zsákból a vizes oldatot eltávolítottuk, fenollal exlraháltuk, kloroformmal extraháltuk és 0,2 M nátrium klorid-koncentrációt állítottunk be. A DNS-at etanolos kicsapással nyertük ki a vizes közegből.

A trp promotor-operátor rendszert tartalmazó, EcoRI tapados végekkel ellátott gént az alábbiakban ismertetett módon azonosítottuk. A töredékeket tetraciklinre érzékeny plazmidba illesztettük, amely a promotor-operátor beillesztése után ellenállóvá vált a tetraciklinnel szemben.

A pBRH1 plazmid [Rodriguez és munkatársai, Nucleic Acids Research, 6, 3267-3287 (1979)] ampieillinnel szembeni rezisztenciát hoz létre, és tartalmazza a tetraciklinnel szembeni rezisztenciát biztosító gént, azonban ehhez kapcsolódó promotor hiányában nem hozza létre ezt a rezisztenciát. Ennek megfelelően a plazmid érzékeny tetraciklinre. Ha beviszünk egy promotor-operátor rendszert az EcoRI helyre, a plazmid rezisztenssé válik tetraciklinnel szemben.

A pBRH1 plazmidot EcoRI enzimmel hasítottuk, és az enzimet fenolos extrakcióval, majd kloroformos extrakcióval eltávolítottuk. A terméket etanolos kicsapás után vizes közegből nyertük ki. A DNS molekulát a fenti három DNS töredék mindegyikével összekapcsoltuk, és az előbbiekben ismertetett módon T4 DNS ligázzal kapcsoltuk össze A reakcióelegyben jelenlévő dezoxiribonuklelnsavat felhasználtuk a megfelelő Escherichia coli K-12 294 törzs transzformálására [Backman és munkatársai, Proc. Natl. Acad., Sci. USA, 73, 4174-4198 (1976)], a szokásos módszerekkel [Hershfield és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 71, 3455-3459 (1974)]. A baktériumokat LB (Luria-Bertani) lemezekre vittük fel, amelyek 20 ^g/ml ampicillint és 5 μg/ml tetraciklint tartalmaztak. Néhány, tetraciklinre rezisztens tenyészetet kiválasztottunk, a plazmid DNS-at elkülönítettük, és a kívánt töredék jelenlétét restrikciós enzimmel végzett analízissel igazoltuk. A kapott plazmid jelölése: pBRHtrp.

A hepatitisz B vírus genóm EcoRI és BamHI enzimekkel a szokásos módon kapott hasítási termékét a pGH6 plazmid EcoRI és BamHI helyeibe klónoztuk (Goeddel es munkatársai, Natúré 28/,(1979)). Ekkora pHS32 plazmidot kaptuk. Ez utóbbit Xbal enzimmel hasítottuk, fenollal extraháltuk, kloroformmal extraháltuk, és a terméket etanollal kicsaptuk. Ezután 1 μΙ Escherichia coli polimeraz I Klenow-töredékkel (Boehringer-Mannheim) kezeltük 30 μΙ polímeráz pufferoldatban (összetétele: 50 mM káliumfoszfát, pH-74,7 mMmagnézium-klorid, 1 mM beta-merkapto-etanol), 0,1 mM dTTP és 0,1 mM dCTP jelenlétében, 30 percig 0“C-on, majd 2 órán át 37 C-on. E kezelés hatására az Xbal hasítási hely 5’-nél túlnyúló végénél lévő 4 kiegészítő nukleotid közül 2 belép a 3’ véghez:

5’ CTAGA- _„ 5’ CTAGA —

3’ T — 3’ TCT8

Két nukleotid, dC és dT, beépült, és az 5’ végződésnél ekkor két túlnyúló nukleotid ma radt. A pHS32 plazmidnak ezt a lineáris mara dékát (fenolos és kloroformos extrakció, majd vízben etanolos kicsapással történő kinyerés után) EcoRI enzimmel hasítottuk. A nagy plazmidtöredéket poliakrilamidgél elektroforézissel választottuk el a kisebb EcoRI Xbal töredéktől, és elektroelúcióval elkülönítettük Ezt a pHS32 plazmidból származó, 0,2 μg mennyisé gű DNS töredéket a fentebb leírtakhoz hasonló körülmények között a pBRHtrp plazmidból készített triptotán operon mintegy 0,01 μg menynyisógü EcoRI Taql töredékével kapcsoltuk össze

A pHS32 plazmid töredékét az EcoRI Taql töredékhez kapcsoló eljárás során a Taql túl nyúló véget kapcsoljuk az Xbal megmaradt túl nyúló véghez, jóllehet nem áll fenn tökéletes Watson-Crick bázispárosítás:

—T . CTAGA—__k —TCTAGA — —AGC TCT— — AGCTCT Ennek az összekapcsoló reakcióelegynek egy részét Escherichia coli 294 törzs sejtjeibe transzformáltuk, hőkezeltük és ampicillint tartalmazó LB lemezekre vittük át. 24 tenyészetet választottunk ki, 3 ml LB táptalajon szaporítottuk, és a plazmidot elkülönítettük. Hat esetben tapasztaltuk azt, hogy az Xbal hely regenerálódott az Escherichia coli által katalizált DNS párosítás és reprodukció útján:

—TCTAGA- -TCTAGA —AGCTCT- — AGATCT—

Ezek a plazmidok mind EcoRI, mind pedig Hpal enzimmel hasíthatok, és a várt restrikciós töredéket szolgáltatják. Az egyik pTrp 14 jelzé sű plazmidot felhasználtuk heterológ polipepti dek termelésére az alábbiakban ismertetett mó dón.

A pHGH plazmid [Goeddel és munkatársai Natúré, 281,544 (1979)] az emberi növekedési hormonra vonatkozó gént tartalmaz, amely szintetikus DNS töredékekből származó23 aminosav kodonból és 163 olyan aminosav kodonból áll, amely kiegészítő DNS-böl képződött az emberi növekedési hormon üzenethordozó RNS fordított átírása útján. Ez a gén, jóllehet hiány zanak belőle az emberi növekedési hormon „elő” szekvenciájának kodonjai, tartalmaz egy ATG lefordítást beindító kodont A gént ¹0 μg pHGH 107 plazmidból különítettük el EcoRI enzimmel végzett kezeléssel, majd Escherichia coli DNS polimeráz I Klenow töredékkel, dTTP vei és dATP-vel végzett kezeléssel, a fentebb tárgyalt módon. Fenolos és kloroformos extrakció, s etanolos kicsapás után a plazmidot BamHI enzimmel kezeltük.

Az emberi növekedési hormon (HGH) gémet tartalmazó töredéket poliakrilamidgél elektro forézissel, majd elektroelúcióval különítettük el A kapott DNS töredék a tetraciklinnel szembe ni rezisztenciát biztosító szerkezeti gén első 350 nukleotidját is tartalmazza, azonban hiányzik belőle a tetraciklin promotor operátor rendszer,

S

-5193512 és így ha termelő plazmidba klónozzuk, a betétet tartalmazó plazmidok lokalizálhatok a tetraciklinnel szembeni rezisztencia visszaállása alapján. Mivel a töredék EcoRI végét kitöltöttük a Klenow polimeráz I enzimes eljárással, a töredéknek egy „tompa és egy „tapadós vége van, ami megfelelő irányítottságot biztosít, ha később egy kifejeződő plazmidba illesztjük a töredéket.

Ezután a pTrp14 kifejeződő plazmidot készítettük elő a fenti HGH gént tartalmazó töredék befogadására. A pTrp14 plazmidot Xbal enzimmel hasítottuk, majd a kapott tapadós végeket kitöltöttük a Klenow polimeráz I enzimes el· járással, dATP, dTTP, dGTP és dCTP alkalmazásával. Fenolos és kloroformos extrakció, végül etanolos kicsapás után a kapott DNS-at BamHI enzimmel kezeltük, és a képződött nagy plazmidtöredéket poliakrilamidgél-elektroforézissel és elektroelúcióval különítettük el. A pTrp14 plazmidból nyert töredéknek egy tompa és egy tapadós vége van, ami lehetővé teszi a megfelelő irányítottságú rekombinációt a fentebb ismertetett, HGH gént tartalmazó töredékkel.

A HGH gént tartalmazó töredéket és a pTrp14 áXba-BamHI töredéket hasonló körülmények között kapcsoltuk össze, mint amit fentebb leírtunk. A kitöltött Xbal és EcoRI végek a tompa végek összekapcsolásával kapcsolódtak össze, a helyreállt mind az Xbal, mind pedig az EcoRI hely

Xbal(k itöltött) EcoRI(kitöltött) —TCTAG AATTCTATG- _ —AGATC TTA AGATAC —

Ez a szerkezet a tetraciklinnel szemben rezisztens gént is helyreállítja. Mivel a pHGH 107 plazmid tetraciklinnel szembeni rezisztenciát fejez kr a HGH génen túl elhelyezkedő promotor (lac promotor) hatására, ez a pHGH 207 jelzésű szerkezet tetraciklinnel szembeni rezisztenciát biztosító gén kifejezését teszi lehetővé, amelyet a triptofán promotor-operátor szabályoz. Az összekapcsolt terméket Escherichia co li 294 törzsbe transzformáltuk, és 5 μg/ml tetraciklint tartalmazó LB táptalajlemezeken választottuk ki a tenyészeteket.

A pHGH207 plazmidot EcoRI enzimmel kezeltük, majd poliakrilamidgól-elektroforózissel s azt követő elektroelúcióval egy olyan, 300 bázispárból álló töredéket különítettünk el, amely tartalmazta a trp promotort, operátort és a trp vezető riboszóma kötési helyet, hiányzott azonban belőle a lefordítás kiváltásához szükséges szekvencia. Ezt a DNS töredéket a pLelF A plazmid EcoRI helyéhez klónoztuk.

A fenti trp töredék analóg az Escherichia coli triptofán operonnal, amelyből törölve az úgynevezett trp csillapító, a kifejeződés szintjének szabályozható megnövelése érdekében. A módosított trp regulont tartalmazó kifejeződő plazmidokat előre meghatározott mértékben szaporíthatjuk olyan táptalajokon, amelyekben elegendő mennyiségű triptofán adalékanyag van 6 jelen a promotor-operátor rendszer elnyomásához. Ezután triptofán hiányt idézhetünk elő a promotor-operátor rendszer elnyomásának megszüntetésére és a kívánt termék kifejezé5 sértek biztosítására.

Közelebbről az alábbiak szerint jártunk el.

250 μρ pL31 plazmidot hasítottuk Pst I enzimmel, és az 1000 bázispárból álló betétet 6%-os poliakrilamidgólen végzett gólelektroforézissel különítettük el. A gélből elektroelúcióval mintegy 40 μ9 mennyiségben nyertük ki a töredéket, és három alikvot részre osztottuk a további feltáráshoz:

a) A töredék 16 μ^ mennyiségét részleges hasításnak vetettük alá 40 egység Bgl II enzimmel 45 percig 37“C-on, és a reakcióelegyet 6°/o-os poliakrilamidgélen tisztítottuk. Körülbelül 2 μg kívánt, 670 bázispárból álló töredéket nyertünk ki.

b) Az 1000 bázispárból álló töredék egy másik, 8 μ9 mennyiségű részét Ava II és Bgl II enzimmel kezeltük. 1 μg mennyiségű, 150 bázispárból álló töredéket nyertünk ki gélelektroforézissel.

c) Az 1000 bázispárból álló töredék 16 μg mennyiségét Sau3a és Ava II enzimmel kezeltük. 10%-os poliakrilamidgélen végzett elektroforézis után közelítőleg 0,25 μg ( - 10 pmól) mennyiségű, 34 bázispárból álló töredéket kap30 tünk.

HGH gén kiváltás ___ - TCTAGAATTCTATG— —AGATCTTAAGATAC—

Xbal EcoRI

A két jelzett dezoxioligonukleotidot 5 -dAATTCATGTGT (1. számú töredék) és 5-dGATCACACATG (2. számú töredék) a foszfor40 savtriészteres módszerrel szintetizáltuk [Maxam és Gilbert, Methods Enzymol., 65, 499-560 (1980)]. A 2. számú töredéket a következőképpen foszforileztük:

QO

200 μΙ (~40 pmol) (γ P) adenozin-trifosz45 fátot (Amersham, 5000 Ci(mmól) megszárítottunk és az alábbi összetételű elegyben szuszpendáltunk: 30 μΙ 60 mM trisz-hidroklorid (pH=8), 10 mM magnézium-klorid, 15 mM béta-merkapto-etanol, 100 pmól DNS töredék és 2 egység T4 polinukleotidKináz. A reakcióelegyet 15 percig tartottuk 37 C-on, majd 1 μΙ 10 mM adenozin-trifoszfátot adtunk hozzá, és a reagáltatást további 15 percig folytattuk. Ezután a reakcióelegyet 15 perci^melegítettük 70 “C on és 100 pmól 5’-OH töredékkel (1. számú), valamint 10 pmól mennyiségű, 34 bázispárbol allé Sau3a Ava II töredékkel kapcsoltuk össze Az összekapcsolást 5 órán át végeztük 4 *Con a következő összetételű elegyben 50 uf 20 mM trisz hidroklorid (pH=7,5), 10mM magnézium klorid, 10 mM ditiotreitol, 0,5 mM ATP és 10 egység T4 DNS ligáz. Az összekapcsolás után a reakcióelegyet elektroforézisnek vetettük ala 6% os poliakrilamidgélen, és a 45 bazisparbol álló terméket elektroelúcióval nyertük ki

-6193512

Mintegy 30 pg (1 pmól) mennyiségű terméket (860 000 Cerenkov cpm) 0,5 μ9 (5 pmól) Avall-Bglll töredékkel (150 bázispárttól áll) és 1 μg, (2 pmól) Bglll-Pstl töredékkel (670 bázispárból áll) kapcsoltuk össze, 20°C-on 16 órán 5 át, 20 egység T4 DNS ligáz alkalmazásával. A ligázt ezután 10 percig 65C-on történő hevítéssel inaktíváltuk. A reakcióelegyet Eco Rl és Pst I enzimmel kezeltük a gén polimerjei eltávolítása céljából, majd 6%-os poliakrilamidgólen 10 végzett elektroforózissel tisztítottuk. Mintegy 20 μ^ (0,04 pmól) (36 000 cpm) terméket különítettünk el, amely 865 bázíspárból állt

A kapott termék felét (10 μ9) 0,3 μ-g pBR322 plazmidhoz kapcsoltuk, az Eco Rl és Pst I ré- 15 szék közé, majd a terméket Escherichia coli 294 törzsbe transzformáltuk. A transzformációval 70 terméket kaptunk, amelyek tetraciklinre rezisztensek, ampicillinre érzékenyek voltak. Közülük 18 termékből elkülönített plazmid DNS-at 20

EcoRI és Pst I enzimmel feltártunk. A 18 plazmid közül 16 esetben az EcoRI Pstl töredék 865 bázispár hosszúságú volt. Az egyikből (pLelF Al) 1 μg mennyiséget EcoRI enzimmel feltártunk, és 0,1 μρ mennyiségű, 300 bázispárból ál- 25 ló EcoRI töredékhez kapcsoltunk. Ez utóbbi töredék az Escherichia coli trp promotort és trp vezető riboszóma kötési helyet tartalmazta, s a fentebb ismertetett módon lett előállítva. A trp promotort tartalmazó transzformált termékeket 30 ^S2P izotóppal jelzett trp minta és a GrunsteinHogness-fóle telepvizsgáló eljárás alkalmazásával azonosítottuk |Grunsteín és munkatársai Proc Natl. Acad. Sci (USA), 72, 3961 (1975)] A trp töredékben aszimmetrikusan elhelyezkedő 35 Xba I hely lehetővé lette azoknak a rekombi· náns termékeknek a meghatározását, amelyekben a trp promotor a LelF A génnek megfelelően volt irányítva.

A következőképpen készítettünk extraktu- 40 mókát interferonvizsgálathoz:

1-1 ml tenyészetet szaporítottunk L húsleves táptalajon, amely 5 μg/ml tetraciklint tartalmazott. A szaporítást 1,0 körüli Asso-értékig. végeztük, majd 5 μg/ml tetraciklint tartalmazó 45 25 ml M9 táptalajjal hígítottuk. Amikor az A550 értéke 1,0 lett, 10-10 ml mintát különítettük el centrifugálással. A sejtszemcséket 1 ml 15%os szacharóz-oldatban szuszpendáltuk, amely 50 mM trisz-hidrokloridot (pH=8,0) és 50 mM éti- 50 lén-diamin-tetraecetsavat tartalmazott. 1 mg lizozimot adtunk hozzá, 5 percig tartottuk 0“C-on, majd a sejteket ultrahanggal történő kezeléssel szétválasztottuk. A mintákat 10 percig centrifugáltuk 15 ΘΟΟ/perc fordulatszámon, Sor- 55 vall SM 24 rotor alkalmazásával. A felülúszó folyadék interferonaktlvitását standard LelF mintákéval összehasonlítva határoztuk meg a citopatikus hatás (CPE) gátlásának vizsgálata alapján. A sejtenként! interferonrpolekulák számá- 60 nak meghatározásához 4x10⁸ egység/mg fajlagos aktivitású leukocita interferont használtunk [Rubinstein és munkatársai, Proc. Natl Acad. Sci. (USA), 76, 640(1979)].

A pLelF A trp 25 klón, amelybe a trp promo 65 tort a kívánt irányítottsággal illesztettük be, nagy aktivitást mutat (2,5x10⁸ egység per liter). A pLelF A trp 25 kiónt tartalmazó Escherichia coli K-12 törzs által termelt interferon autentikus emberi leukocita interferonként viselkedik; ellenáll a pH=2 értéken történő kezelésnek, és semlegesítik a nyúl antihumán leukocita antitestek. Az interferon látszólagos molekulasúlya közelítőleg 20.000.

A kiegészítő dezpxiribonukleinsavak elkülönítése további leukocita interferonok számára

A teljesen jellemzett LelF A cDNS-tartalmú plazmidból DNS-at hasítottunk ki Pst I enzyp mel, elektroforétikus úton elkülönítettük és p izotóppal megjelöltük [Taylor és munkatársai, Biochem. Biophys. Acta, 442,324 (1976)]. A kapott, radioaktív izotóppal jelzett DNS-at felhasználtuk mintaként az Escherichia coli 294 törzzsel nyert további transzformált termékek vizsgálatához, in situ végzett telep-szűrő módszerrel (Grunstein és munkatársai, fentebb idézett hivatkozás). Azokat a telepeket különítettük el, amelyek az izotóppal jelzett mintával különböző mértékben hibridizálódtak. Ezekből a tenyészetekből és a fentebb hivatkozott tíz hib ridizáló tenyészetből a plazmid DNS-at Pst I en zimmel végzett hasítással különítettük el, és ha rom különböző módszerrel jellemeztük;

Először, ezeket a Pst töredékeket a restrikciós endonukleáz enzimekkel (Bgl II, Pvu II és Eco Rl) való hasítási jellemzőkkel vizsgáltuk. Ez az analízis legalább nyolc különféle típusra való felbontást tett lehetővé (LelF A, LelF B, LelF C, LelF D, LelF E, LelF F, LelF G és LelF H). Ezzel megközelítettük a különböző restrikciós hasításoknak a jelenleg ismert LelF A előszekvenciához és kódoló szekvenciához viszonyított elhelyezkedését Úgy véljük, hogy az egyik típus, a LelF D azonos azzal, amelyről Nagata és munkatársai beszámoltak [Natúré, 284, 316-320 (1980)|

Másodszor, bizonyos dezoxiribonukleinsa vakat hibridizációs kiválasztási teszttel vizsgáltunk [Cleveland és munkatársai, Cell, 20, 95 (1980)]. Ennél a tesztnél azt a képességet nézzük, amely biztosítja a LelF mRNS szelektív eltávolítását a KG-1 sejt ribonukleinsavját tartalmazó poli/A/ ból

Harmadszor, az utóbbi Pst töredékeket be illesztettünk egy kifejeződő plazmidba, Escherichia coli 294 törzset transzformáltunk a plazmiddal, és a törzs töredékeket fejezte ki A kapott termékek — feltehetően elő interferonok — mindegyike mutatott interferonaktivitast a CPE teszt során, bár a LelF F töredék esetében az aktivitás csekély mértékűnek bizonyult

A fentieken túlmenően, valamennyi fentebb ismertetett leukocita interferon típus szekven ciáit is meghatároztuk.

Második érett leukocita interferon

Az érett LelF B-hez szükséges gént tártál mazó elkülönített töredék szekvenciája azt mu tatja, hogy a LelF A és LelF B első 14 nukleotid ja azonos. Ennek megfelelően felmerült az az

-7193512 elképzelés, hogy elkülönítsük a pLelF A25-ből egy olyan töredéket, amely tartalmazza a trp promotor-operátor rendszert, a riboszóma kötési helyet és a LelF (A=B) gén kezdetét, s összekapcsoljuk a B szekvencia további részével egy kifejeződő plazmidban.

Ahhoz, hogy megkapjuk a közelítőJeg 950 bázispárból álló, Sau 3a és Pst I közötti töredéket a 7a. ábrán bemutatott szekvenciából, különböző lépésekre volt szükség egy vagy több zavaró Sau 3a restrikciós hely jelenléte miatt:

1. Az alábbi töredékeket különítettük el:

a) Sau 3a és Eco Rl közötti, 110 bázispárból álló töredék;

b) Eco Rl és Xba közötti, 132 bázispárból álló töredék;

c) Xba és Pst közötti, >700 bázispárból álló töredék

2. A fenti 1.a) és 1.b) töredéket összekapcsoltuk, s Xba és Bgl II enzimmel szétvágtuk, hogy elejét vegyük a Sau 3a és Xba végződéseken keresztüli önpolimerizációnak (ez a Sau 3a hely a Bgl II helyen belül volt, a Bgl II hasításnál fapados Sau 3a végződés marad vissza). Egy 242 bázispárból álló töredéket különítettünk el.

A fenti 2. pont és az 1 .c) pont szerinti terméket összekapcsoltuk, majd szétvágtuk Pst I és Bgl II enzimekkel, az önpolimerizáció megakadályozására Egy közelítőleg 950 bázispárból álló töredéket különítettünk el, amely a 7a ábrán látható Sau 3a és Pst I közötti résznek felel meg Ez a töredék tartalmazta a LelF B génnek azt a részét, amely nem közös a LelF A génjével

A pLelF A25 bői egy közelítőleg 300 bázispárból álló töredéket (Hind III es Sau 3a közötti rósz) különítettünk el, amely tartalmazta a LelF A Irp promotor operator rendszerét, riboszóma kötési helyét, ATG beindító jelét és cisztein kodonjál

5. A pBR322 plazmidból egy közelítőleg 3600 bázispárból álló, a Pst I és a Hind III között elhelyezkedő töredéket különítettünk el. Ez tartalmazta a replikont, és kódolta a tetraciklinnel szembeni rezisztenciát, nem kódolta azonban az ampicillinriei szembeni rezisztenciát

6. A 3., 4. és 5. pont szerinti lépésben kapott töredékeket összekapcsoltuk, és a kapott plazmidot Escherichia coli K-12 294 törzsbe transzformáltuk.

A transzformált termékeket megvizsgáltuk [Bimbóim és munkatársai, Nucleic Acids Rés., /, 1513 (1979)], és a plazmid mintákat Eco Rl enzimmel hasítottuk. A hasítás három töredéket szolgáltatott:

1) EcoRI - EcoRI trp promotor töredék;

2) pL4 belső EcoRI - EcoRI töredéke, és

3) pL4 EcoRI töredékéig terjedő, fehérje-lefordítást kiváltó startjel.

A CPE vizsgálat azt az eredményt szolgál tatta, hogy a fenti módon nyert kiónok bakteriális extraktumaiban az interferonaktivitás 10x10° egység/liter volt As5o=1 értéknél. Egy ily módon előállított jellemző klón az Escherichia coli 294/pLelF B trp 7.

További érett leukocita interferonok

Más leukocita interferon típusokat tartalmazó további, teljes hosszúságú géntöredókek ál· líthatók össze és vihetők be kifejeződés-hordozókba, ugyanúgy, mint a LelF A esetén. Az ismert módon történő szekvenciameghatározás feltárja, hogy valamely restrikciós hely elég közel fekszik-e az érett interferon típus első aminosavkodonjához, hogy ezáltal lehetővé tegye az előszekvencia eltávolítását restrikciós hasítással, és az ennek során eltávozott, az N-terminális aminosavakra vonatkozó kodonok pótlását szintetikus DNS töredékekkel való összekapcsolás útján. Ha ez nem lehetséges, Kleid és munkatársai fentebb hivatkozott eljárását alkalmazzuk. Röviden, ennek során az előszekvéneiét tartalmazó töredéket pontosan azon a helyen hasítjuk el, ahol az érett polipeptid első aminosavjára vonatkozó kodon kezdődik úgy, hogy

1. a kótszálas DNS-at egyszálas DNS-vá alakítjuk az illető helyet körülvevő tartományban;

az egyszálassá alakított tartományhoz egy kiegészítő alaprészt hibridizálunk az egy szálas DNS-ból olyan módon, hogy az alaprész 5’ vége a tervezett hasítási hely melletti nukleotiddal szemközt helyezkedjen el;

3. az 1. pont szerinti művelet során a második szál eltávolított részét helyreállítjuk. Ez a 3' irányban helyezkedik el az alaprészhez képest. A helyreállítást DNS-polimerázzal végezzük, adenint, timint, guanint és citozint tartalmazó dezoxinukleotid-trifoszfátok jelenlétében; és

4. a DNS megmaradt egyszálú részét — amely túlnyúlik a tervezett hasítási ponton — lehasítjuk.

A kódoló szál 3' végénél végződő, rövid, szintetikus DNS darab, amely tartalmazza a lefordítást kiváltó ATG jelet, hozzákapcsolható például tompa végződésen keresztül az érett interferonokra vonatkozó, kapott génhez, a gén pedig kifejeződő plazmidba illeszthető, s egy promotor és az azzal kapcsolatos riboszóma kötési hely irányítása alá vihető.

Hasonló módon, mint ahogy fentebb ismer tettük, előállítottunk a LelF C-t és a LelF D-t kódoló géntöredékeket az említett interferon típusok közvetlen, bakteriális úton történő kifejező déséhez. Ezeknek a leukocita interferonoknak az előállítása minden esetben egy közelítőleg 300 bázispárból álló töredéken alapult (Hind III és Sau 3a közötti rész), amely a trp promotor -operátor rendszert, a riboszóma kötési helyet, az ATG beindító jelet és a cisztein kodont tártál mázzá a pLelF A25-ből (s így a LelF A megfelelő részeinek felelnek meg). Ehhez a töredékhez a többi interferon génből nyert géntöredékeket kapcsoltunk, amelyek az egyes aminosav-szekvenciákat kódolták a kezdeti cisztein után, mely mindegyikben megtalálható. Az egyes kapott plazmidokat felhasználtuk az Escherichia coli K 12 294 törzs transzformálásához Az illető gének kialakítását célzó Összekapcsolásokat a következőképpen végeztük.

-8193512

LelF C

Elkülönítettük az alábbi töredékeket a pLelF C plazmidból:

(a) 35 bázispár hosszúságú, Sau 3a és Sau 96 közötti rész (b) >900 bázispár hosszúságú, Sau 96 és Pst I közötti rósz (ej Elkülönítettünk egy közelítőleg 300 bázispárból álló töredéket (Hind III és Sau 3a közötti rósz) a pLelF A-25. plazmidból a fentebb leírtak szerint.

(d) Elkülönítettük a fentebbi, közelítőleg 3600 bázispárból álló töredéket.

Előállítás (1) A fenti (a) és (c) pont szerinti töredéket összekapcsoltuk, majd a kapcsolási terméket elhasítottuk Bgl II és Hind III enzimmel, és elkülönítettük a körülbelül 335 bázispárból álló terméket.

(2) A fenti (1), (b) és (d) pont szerinti három terméket összekapcsoltuk, és a kapott plazmid dal Escherichia coli törzset transzformáltunk

Az így kapott jellemző klón az Escherichia coli K-12 294/pLelF C trp 35.

LelF D

Elkülönítettük az alábbi töredékeket a pLelF D plazmidból.

a) 35 bázispárból álló, Sau 3a és Ava II közötti rész.

b) 150 bázispárból álló, Ava II és Bgl II közötti rész.

c) Közelítőleg 700 bázispárból álló, Bgl II és Pst I közötti rész.

Elkülönítettük a pLelF A25 plazmidból az alábbi töredéket.

d) 300 bázispárból álló, Hind III és Sau 3a közötti rész.

Elkülönítettük a pBR322 plazmidból az alábbi töredéket:

e) Közelítőleg 3600 bázispárból álló, Hind III és Pst I közötti rósz.

Előállítás (1) összekapcsoltuk a fenti a) és b) pont szerinti töredéket, a terméket Bgl II enzimmel elhasítottuk, és a kapott,185 bázispárból álló terméket tisztítottuk.

(2) Összekapcsoltuk a fenti (1) és d) pont szerinti terméket, az összekapcsolási terméket Hind III és Bgl II enzimmel hasítottuk. Tisztítás után közelítőleg 500 bázispárból álló terméket kaptunk.

(3) A fenti (2) pont szerinti terméket öszekapcsoltuk a c) és e) pont szerinti töredékekkel, és a kapott plazmiddal Escherichia coli törzset transzformáltunk

Egy így nyert jellemző klón az Escherichia coli K-12 294/pLelF D trp 11.

LelF F

A LelF F-tartalmú töredéket annak alapján állíthatjuk elő, hogy a LelF B és a LelF F 1. 13 számú aminosavjai teljesen homológok.

A fentebb leírt pHGH 207 plazmidból megfelelő konfigurációjú végekkel rendelkező trp promotort tartalmazó töredéket (a) állítottunk elő Pst I és Xba I enzimmel végzett hasítás és a körülbelül 1050 bázispárból álló töredék elkülönítése útján. Egy második töredéknek (b) a pHKY 10 plazmid Pst I és Bgl ll enzimekkel végzett hasításánál képződő töredékek közül a nagyobbikat vettük. (A pHKY 10 plazmid a pBR322 plazmid származéka, s tartalmaz egy Bgl II helyet a tetraciklinnel szembeni rezisztenciára vonatkozó promotor és a szerkezeti gén között.)

Az (a) töredék tartalmazza az ampicillinnel szembeni rezisztenciát kódoló génnek mintegy felét, a (b) töredék pedig e gén többi részét tartalmazza, továbbá a tetraciklinnel szembeni rezisztenciát kódoló teljes gént, a promotor kivételével.

Az (a) és (b) töredéket T4 ligázzal összekapcsoltuk, az összekapcsolási terméket Xbal és Bgl II enzimmel kezeltük a dimerizáció kiküszöbölésére. Ekkor a (c) töredéket kaptuk, amely a trp promotor-operátor rendszert, valamint a tetraciklinnel és ampicillinnel szembeni rezisztenciát kódoló géneket tartalmazza.

A pLelF F plazmid Ava II és Bgl II enzimekkel végzett feltárásával egy közelítőleg 580 bázispárból álló (d) töredékhez jutottunk. Ez a LelF F 14.-166. aminosavjaira vonatkozó kodonokat tartalmaz.

A pLelF B plazmid Xbal és Ava II enzimekkel végzett hasítása útján az (e) töredéket kaptuk, amely 49 bázispárból áll. Az (e) töredék a LelF F 1.-13. aminosavját kódolja.

A (c), (d) és (e) töredéket összekapcsoltuk T4 ligáz jelenlétében. Az illető töredékek kohéziós végei olyanok voltak, hogy a felépített plazmid megfelelően köralakú lett, és így a tetraciklinnel szembeni rezisztenciát kódoló gén az érett LelF F-re vonatkozó génnel együtt a trp promotor-operátor rendszer irányítása alá került. Ennek következtében a kívánt plazmiddal transzformáit baktériumokat tetraciklin tartalmú táptalajlemezeken lehetett kiválogatni. Egy ily módon nyert jellemző klón az Escherichia coli ΚΙ 2 294/pLelF F trp 1.

LelF H

Az érett leukocita interferon kifejezéséhez szükséges teljes LelF H gént a következőképpen állítottuk elő:

1. A pLelF H plazmidot Hae II és Rsa I enzimmel hasítottuk, és egy 816 bázispárból álló töredéket különítettünk.el, amely a 10. számú jel peptid aminosavtól a 3’ nem kódoló tartományig terjed.

2. A töredéket denaturáltuk, és Klenow töredékkel kezelve _l [klenow és munkatársai Proc Natl. Acad. Sci. USA, 65, 168 (1970)] bazispárosító szintézist végeztünk az 5' dATG TGT AAT CTG TCT szintetikus dezoxiribooligonukleotid alaprész alkalmazásával Ezt az altalános módszert Goeddel és munkatársai 1980. szeptember 25 én benyújtott, 190 799 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentése is tárgyalja.

3. A kapott terméket Sau 3a enzimmel ha sítottuk, és egy 452 bázispárból álló töredéket különítettünk el Ez a töredék az 1 150 számú aminosavaknak felelt meg.

-9193512

4. A pLelF H plazmidot Sau 3a és Pst I enzimmel hasítottuk ós egy 500 bázispárból álló töredéket különítettünk el. Ily módon olyan gént Kaptunk, amely a 150. számú aminosav és a kódoló szekvencia vége közötti aminosavakat kódolja.

5. A fenti 3. és 4. pont szerint elkülönített töredékeket összekapcsoltuk, és így egy olyan töredéket kaptunk, amely a LelF H 166 aminosavját kódolja;

166 met cys asp megállító

ATG TGT...-1-...GAT TGA ... Pst I

Sau 3a

6. A pkelF A trp 25 plazmidot Xba I enzimmel hasítottuk, DNS polimeráz I enzimmel tompavégűvé alakítottuk, majd a terméket Pst I enzimmel feltártuk. A kapott nagy töredéket elkülönítettük, és összekapcsoltuk a fenti 5. pont szerinti termékkel. Olyan termelő plazmidot kaptunk,amely Escherichia coli K-12 294 törzsbe vagy más „gazda” baktériumba transzformálva képes az érett LelF H termelésére.

LelF /

Az emberi genom λ fág Charon 4A rekombináns „könyvtárát”, amelyet Lawn es munkatársai hoztak létre [Cell, 75, 1157 (1978)], szűrővizsgálatnak vetettük alá a leukocita interferon génekre vonatkozólag a Lawn és mlsai (idézett irodalmi hely), valamint Maniatis és munkatársai [Cell, 75, 687 (1978)] által leírt mó dón. Egy, a cDNS LelF A kiónból származó radioaktív LelF mintát [Goeddel és munkatársai, Natúré, 287, 411 (1980)] használtunk közelítőleg 500 000 vérlemezke szűrővizsgálatához. Ennek során hat LelF genom kiónt kaptunk. Ismételt szűrővizsgálat ós vérlemezke-tisztítás után e kiónok egyikót ( XHLelF2) választottuk ki a további elemzéshez.

A fentebb ismertetett módszer segítségével más mintákat is alkalmazhatunk további LelF kiónoknak az emberi genomból való elkülönítéséhez. Ezek viszont felhasználhatók további leukocita interferon fehérjéknek a találmány szerinti előállítására.

1. A \HLelF2 genom klón 2000 bázispárból

7.

álló töredékét alklónozással bevittük a pBR325 plazmidba az Eco Rl helynél. A kapott LelF I plazmidot Eco Rl enzimmel hasítottuk, és elkülönítettük a 2000 bázispárból álló töredéket: A dAATTCTGCAG dezoxioligonukleotidot (Eco RI>Pst I átalakító) hozzákapcsoltuk a 2000 bázispárból álló Eco Rl töredékhez, majd a terméket Pst I enzimmel hasítottuk. így egy 2000 bázispárból álló, Pst I végeket tartalmazó töredé10 két kaptunk. Ezt Sau 96 enzimmel elhasítottuk, és egy 1100 bázispárból álló töredéket különú tettünk el, amelynek egy Pst I és egy Sau 96 vége van.

A pLelF C trp 35 plazmidot kezeltük Pst l és Xba I enzimmel. A nagy töredéket különítettük el

3. A pLelF C trp 35 plazmid Xba I ós Pst I enzimmel végzett feltárásánál képződött kis töre_ déket Xba I és Sau 96 enzimmel kezeltük. Egy

40 bázispárból álló, Xba l-Sau 96 töredéket különítettünk el.

4. A fenti 1., 2. és 3. pont szerinti elkülönített töredéket összekapcsoltuk, és ilyen módon a pLelF I trp 1 termelő plazmidot kaptuk.

LelF J

1. A pLelF J plazmid az emberi genom dezoxiribonukleinsavból egy 3,8 kilobázisú Hind III töredéket tartalmaz, amely magába foglalja a LelF J gónszekvenciát. Ebből a plazmidból egy

760 bázispárból álló, Dde l-Rsa I közötti töredéket különítettünk el.

2. A pLelF B trp 7 plazmidot Hind III és Dde I enzimekkel elhasítottuk. Egy 340 bázispárból álló, Hind III és Dde I közötti töredéket különítet35 tünk el.

3. A pBR322 plazmidot Pst I enzimmel elhasítottunk, DNS polimeráz I (Klenow töredék) enzimmel inkubálva tompavégűvé alakítottuk, és Hind III enzimmel hasítottuk. A nagy (körülbelül

3600 bázispárból álló) töredéket különítettük el.

4. A fenti 1.,2. ós 3. pont szerint elkülönített töredékeket összekapcsoltuk egymással. így a pLelF J trp 1 termelő plazmidot kaptuk

A következőkben a fentebb már ismertetett 45 módszereket ós anyagokat alkalmaztuk. Az 1 táblázat tartalmazza a hibrid LelF plazmidok előállításával kapcsolatos részleteket.

táblázat

LelF hibrid	Összes aminosav*	Kifejeződési plazmid (vektor)
AD	165	a
DA	166	a
AD	165	-
DA	166	-
AB	165	a
AF	165	a

Elülső rész

Töredék Aminosavak

Xba l-Pvu II rész a pLelF A trp

25-ből (285 bázispár) 1-91

Xba l-Pvu II rész a pLelF D trp

-tői (288 bázispár) 1 -92

Bgl ll-Pst I nagy töredék a pLelF

A trp 25-ből 1-62

Bgl ll-Pst I nagy töredék a pLelF

D trp 11-ből 1-63

Xba l-Pvu II rész a LelF A trp

25-ből (285 bázispár) 1-91

Xba l-Pvu II rész a LelF A trp

25-ből (285 bázispár) 1-91

-10193512

1. táblázat

LelF hibrid	Összes aminosav*	Kifejeződési piazmid (vektor)	Elülső rész
Töredék	Aminosavak
AG	165	a	Xba l-Pvu II rész a LelF A trp 25-bŐI (285 bázispár)	1-91
Al	165	a	Xba l-Bgl II rész a pLelF A trp 25-ből ( -455 bázispár)	1-150
BA	166	b	Hlnd lll-Pvu II rész a pLelF trp 7-ből ( -630 bázispár)	1-92
BD	166	b	Hind lll-Pvu II rész a pLelF B trp 7- ből ( -630 bázispár)	1-92
BF	166	b	Hind lll-Pvu II rész a pLelF B trp 7-ből ( -630 bázispár)	1-92
BG	166	b	Hind lll-Pvu II rész a pLelF B trp 7-ből ( -630 bázispár)	1-92
DB	166	a	Xba l-Pvu II rósz a pLelF D trp 11 -bői (288 bázispár)	1-92
DF	166	a	Xba l-Pvu II rósz a pLelF D trp 11 -bői (288 bázispár)	1-92
DG	166	a	Xba l-Pvu II rész a pLelF D trp 11 -bői (288 bázispár)	1-92
FA	166	a	Xba l-Pvu II rész a pLelF F trp 1 -bői (288 bázispár)	1-92
FB	166	a	Xba l-Pvu II rész a pLelF F trp 1 -bői (288 bázispár)	1-92
FD	166	a	Xba l-Pvu II rósz a pLelF F trp 1-ből (288 bázispár)	1-92
FG	166	a	Xba l-Pvu II rész a pLelF F trp 1 -bői (288 bázispár)	1-92
IA	166	a	Xba l-Bgl II rész a pLelF I trp 1 -bői (458 bázispár)	1-151

* Az N-terminális metionin kivételével.

a - pLelF A trp Xba l-Pst I hasítási termékének nagy (kb. 3900 bázispárt tartalmazó) töredéke b - pBR322 Hind lll-Pst I hasítási termékének nagy (kb. 3600 bázispárt tartalmazó) töredéke.

1. táblázat (folytatás)

LelF hibrid	Hátsó rész	Képződő kifej piazmid
Töredék	Aminosavak
AD	Pvu ll-Pst l rész a pLelF D trp 11-ből ( ~550 bázispár)	93-166	pLelF AD trp (Pvu II)
DA	Pvu ll-Pst I rósz a pLelF A trp 25-ből ( -550 bázispár)	92-165	pLelF DA trp (Pvu II)
AD	Bgl ll-Pst I rész a pLelF D trp 11-ből ( -600 bázispár)	64-166	pLelF AD trp (Bgl II)
DA	Bgl ll-Pst I rósz a pLelF A trp 25-ből ( -700 bázispár)	63-165	pLelF DA trp (Bgl II)
AB	Pvu ll-Pst I rész a pLelF B trp 7-ből ( -750 bázispár)	93-166	pLelF AB trp (Pvu II)
AF	Pvu ll-Pst I rósz a pLelF F trp 1-ből ( -700 bázispár)	93 166	pLelF AF trp (Pvu II)
AG	Pvu ll-Pst I rész a pLelF G-ből ( -750 bázispár)	93-166	pLelF AG trp (Pvu II)
Al	Bgl ll-Pst I rész a LelF I trp 1-ből ( -650 bázispár)	151-165	pLelF Al trp (Bgl II)
BA	Pvu ll-Pst I rósz a pLelF A trp 25-ből ( -550 bázispár)	92-165	pLelF BA trp (Pvu II)

-11193512

7. táblázat (folytatás)

LelF Hátsó rész hibrid Töredék

BD	Pvu II Pst 1 rész a pLelF D trp 11—bői ( -550 bázispár)
BF	Pvu ll-Pst I rész a pLelF F trp 1-ből ( -700 bázispár)
BG	Pvu ll-Pst I rész a pLelF G-ből ( -750 bázíspár)
DB	Pvu ll-Pst I rész a pLelF B trp 7-ből ( -750 bázispár)
DF	Pvu ll-Pst I rész a pLelF F trp 1-ből ( -700 bázispár)
DG	Pvu ll-Pst I rész a pLelF G-ből ( -750 bázispár)
FA	Pvu ll-Pst I rész a pLelF A trp 25-ből ( - 550 bázispár)
FB	Pvu ll-Pst I rész a pLelF B trp 7-ből ( -750 bázispár)
FD	Pvu ll-Pst l rész a pLelF D trp 11 -bői ( -550 bázispár)
FG	Pvu ll-Pst I rósz a pLelF G-ből ( -750 bázíspár)
IA	Bgl ll-Pst I rész a pLelF A trp 25-ből ( -430 bázispár)

Aminosavak	képződő kifej, plazmid
93-166	pLelF BD trp (Pvu II)
93-166	pLelF BF trp (Pvu II)
93-166	pLelF BG trp (Pvu II)
93-166	pLelF DB trp (Pvu II)
93-166	pLelF DF trp (Pvu II)
93-166	pLelF DG trp (Pvu II)
92-165	pLelF FA trp (Pvu II)
93-166	pLelF FB trp (Pvu II)
93-166	pLelF FD trp (Pvu II)
93-166	pLelF FG trp (Pvu II)
152-166	pLelF IA trp (Bgl II)

Az 1. táblázatban leírt első négy hibrid leukocita interferont két LelF kifejeződési plazmidból állítottuk elő. A LelF A és a LelF D kiegészítő dezoxiribonukleinsavakban egyformán megtalálható Bgl II helyei használtuk fel a pLelF trp AD (Bgl II) kifejeződési plazmid kialakításához, amely kódolja a LelF A amino terminális 63 aminosavját, valamint a LelF D karboxil terminális 102 aminosavját.

Ugyanezt a helyet használtuk fel a pLelF trp DA (Bgl II) kifejeződési plazmid kialakításához, amely kódolja a LelF D amino N-terminális 64 aminosavját és a LelF A karboxil-termlnális 102 aminosavját.

A Pvu II helyet két másik hibrid interferont kifejező plazmid kialakításához használtuk fel: a LelF A amino terminális 91 aminosavja es a LelF D karboxil-terminális 74 aminosavja [pLelF trp AD (Pvu II)], valamint a LelF Damino-terminális 92 aminosavja és a LelF A karboxil-terminális 74 aminosavja [pLelF trp DA (Pvu II)].

Összefoglalva, pLelF AD trp (Pvu II): A pLelf A trp 25 Xba I és Pst l enzimmel végzett hasításánál képződött nagy (3900 bázispár körüli) töredékét összekapcsoltuk a pLelF A trp 25 Xba I es Pvu II közötti, 285 bázispártról álló töredékével és a pLelF D trp 11 Pvu II ós Pst I közötti, közelítőleg 550 bázispárból álló töredékével pLelF DA trp (Pvu II): A pLelF A trp 25 Xba

I és Pst I enzimmel végzett hasításánál képződött nagy (3900 bázispár körüli) töredékét összekapcsoltuk a pLelF D trp 11 Xba I és Pvu

II közötti, 288 bázispárból álló töredékével és a 12 pLelF A trp 25 Pvu II ós Pst I közötti, közelítőleg 550 bázispárból álló töredékével.

pLelF AD trp (Bgl II): A pLelF A trp 25 Bgl II és Pst I enzimmel végzett hasításánál képző5 dött nagy töredéket összekapcsoltuk a pLelF D trp 11 Bgl II és Pst I közötti mintegy 600 bázispárból álló töredékével.

pLetF DA trp (Bgl II): A pLelF D trp 11 Bgl II ós Pst I enzimmel végzett hasítása útjával kép10 ződött nágy töredéket egy közelítőleg 700 bázispárból álló töredékkel kapcsoltuk össze, amelyet úgy kaptunk, hogy a pLelF A trp 25 öt Pst I enzimmel elhasítottuk, majd Β1II enzimmel részlegesen hasítottuk.

' Az 1. táblázatban feltüntetett ötödik hibrid.

pLelF AB trp (Pvu II): A pLelF A trp 25 Xba I és Pst I enzimmel végzett hasítása útján nyert nagy (3900 bázispár körüli) töredéket összekapcsoltuk a pLelF A trp 25 Xba I ós Pvu II kö20 zötti, 285 bázispárból álló töredékével és a pLelF B trp 7 Pvu II enzimmel végzett részleges hasítása és Pst I enzimmel végzett hasítása útján kapott, közelítőleg 750 bázispárból álló töredékével.

Hasonló módon állítottuk elő az 1. táblázatban feltüntetett többi szerkezetet is. További példaként utalunk arra, hogy a LelF C és/vagy LelF H részt tartalmazó hibrid előállításánál felhasználhatjuk a közös Bbv I helyeket, amelyek körülbelül a 294. számú nukleotidnái (GCTGC) találhatók a gónszekvenciákban.

Hasonló módon alakíthatunk ki más új hibrid leukocita interferonok mikrobiológiai úton való kifejezésére alkalmas plazmidokat. a ter35 mészetben előforduló leukocita interferonok tel-1219351?

jes aminosav-szekvenciáját vagy annak egy részét kódoló, kétszáías dezoxiribonukleinsav megfelelő kezelésével.

Kiválasztunk egy első kétszáías DNS töredéket, amely kódolja egy első, a természetben előforduló leukocita interferon aminosav-szekvenciájának amino vógcsoportját, és onnan a 3’ Irányban az aminosav-szekvencia jelentős részét. A töredék tartalmaz egy restrikciós endonukleáz hasítási helyet, amely az első leukocita' interferon „n ’ aminosavjára vonatkozó kodönok szomszédságában helyezkedik el — ahol n aminosav alkotja az első interferon aminosav -szekvenciájának adott részét. A restrikciós endonukleázzal végzett hasítás egy olyan töredéket szolgáltat, amely tartalmazza az első interferon amino végcsoportját és a közelítőleg n aminosavra vonatkozó kodonokat..

Ezután egy második töredéket választunk ki, amely egy második, az előzőtől eltérő leukocita interferon aminosav-szekvenciájára vonatkozó összes kodont vagy e kodonok egy részét tartalmazza. Ebben a töredékben jelen van egy azonos restrikciós endonukleáz hasítási hely, amely a második interferon aminosavjaira vonatkozó kodonok szomszédságában helyezkedik el. Itt az aminosavak száma (a második interferon amino végcsoportjától kezdve) közelítőleg 166-n.

A második töredéket elhasítjuk a restrikciós endonukleázzal, és ekkor egy olyan terméket kapunk, amely kiegészíti az első töredék hasításával nyert termék végét, és így a két hasítási termék összekapcsolható. Ekkor ismét kialakul a restrikciós endonukleázt felismerő hely, és újból létrejön az első interferon n-edik aminosavjára vonatkozó kodon, ha az eltűnt a korábbi hasítás során A második töredékből a restrikciós endonukleázzal végzett hasítással kapott termék előnyösen a hasítás folytán képződött végtől a 3’ irányban tart azokon a nukleotidokon keresztül, amelyek a második leukocita interferon karboxil 'végcsoportját kódolják.

Olyan hibrideket is előállíthatunk, amelyek, kettőnél több, a természetben előforduló leukocita interferon aminosav-szekvenciáinak lényeges részeit tartalmazzák. Ebben az esetben például úgy járunk el, hogy a fentebb említett második töredéket úgy választjuk meg, hogy az egy második restrikciós endonukleáz helyet is tartalmazzon az első után, és ez a második restrikciós endonukleáz hely azonos legyen egy további töredék hasonló elhelyezkedésű helyével, ahol a további töredék egy harmadik leukocita interferon karboxil végcsoportot tartalmazó részét kódolja stb.

A hivatkozott példában a restrikciós endonukíeázokkal végzett hasítások során képződött három terméket kapcsolhatjuk össze. Az így nyert hibrid gén az első Interferon amino végcsoportot tartalmazó részét, a második interferon aminosav szekvenciájának középső részét és a harmadik interferon karboxil végcsoportot tartalmazó részét kódolja (Egy olyan változat is előállítható, ahol az első és harmadik interferon azonos, és ékkor a hibrid gén az el24 ső interferon karboxil végcsoporlot tartalmazó részét kódolja)

A fentebb említett első töredék előnyösen valamely termelő plazmidtól ered, azaz az első leukocita interferon amino végcsoportot tartalmazó részére vonatkozó kodonokat megelőzi egy ATG vagy más lefordítást kiváltó kodon és egy promotor vagy promotor-operátor rendszer. Ekkor a fenti műveletek végterméke egy olyan plazmid, amelft képes a hibrid gén által kódolt polipeptid termelésére a plazmiddal transzformált baktériumokban vagy más mikrobákban.

A találmány szerinti eljárás előnyös változatai szerint a hibrid gének 165-166 aminosavból álló új leukocita interferon aminosav-szekvenciát kódolnak, amely két vagy több leukocita Interferon aminosav-szekvenciájának lénye ges részeit egyesíti. E leukocita interferonok a LelF A, LelF B, LelF C, LelF D, LelF E, LelF F, LelF G és LelF H lehetnek, amelyek szekvenciáit a 3. ábra mutatja be

Különösen előnyösen, a hibrid gének által kódolt új leukocita interferonokban olyan aminosavak vannak jelen és olyan helyzetben, amint azt a 3 ábra All szekvenciája jelzi

A találmány szerint kialakított plazmidok által kifejezett termékek vírusellenes aktivitását ismert módon határozhatjuk meg, a biológiai aktivitás vizsgálatánál a következőkben leírtak szerint.

A vírusellenes aktivitás meghatározása

Escherichia coli K-12 294 törzset önmagában ismert módon transzformáltunk, külön-külön, a következő plazmidokkal: pLelF trp A 25, pLelF trp D, pLelF trp A/D (Bgl II) és pLelF trp D/A (Bgl II). A transzformáns baktériumokat 5-5 ml L táptalajon tenyésztettük, amely 5 mg/ml tetraciklint tartalmazott. A tenyésztést addig folytattuk, amíg az A550 értéke 1,0 körüli nem lett. Ekkor az egyes tenyészeteket 5 p.g/ml tetraciklint tartalmazó, 1 liter térfogatú M9 táptalajokra vittük át, és a tenyésztést tovább folytattuk. A sejteket akkor különítettük el, amikor az A550 értéke 1,0 lett, majd a sejt szemcséket 10 ml 15%-os szacharóz-oldatban szuszpen dáltuk, amely 50 mM trisz-hidrokloridot (pH=8,0) és 50 mM etilén-diamin-tetraecetsavat tártál mázott 10 mg lizozimot adtunk hozzá, 5 percig 0C-on tartottuk, majd a sejteket ultrahanggal kezeltük. A mintakai 10 percig centrifugáltuk Sorvall SM 24 rotor alkalmazásával, l5O00/perc fordulatszámon. A felülúszó folyadékokban Jelenlévő interferonaktivitást vírusellenes hatását vizsgáltuk.

A 2. táblázatban az 1 liter tenyészet interferonaktivitását tüntettük fel egy emberi sejtvonallal (WISH) végzett titrálás alapján. A táblázatból kitűnik, hogy a LelF A/D aktivitás nagyobb mértékben jött létre, mint a többi interferoné Ezt az eltérést okozhatja a LelF A/D nagyobb aktivitása vagy az, hogy több képződik ebből az interferonból mg fehérjében kifejezve Mivel mindegyik vizsgált interferonnál a genetikai felépítés azonos volt, az látszik a legvalószínűbb

-13193512 nek, hogy a LelF A/D aktivitása nagyobb, mint a többi interferoné.

2. táblázat

Rázópalackban létrehozott Escherichia coli tenyészetekben képződő leukocita interferonok termelése Interferont! pus Termelés (aktivitás) per liter^x

A 8χ10θ egység

D 5x1 (Γ egység

AD (Bgl II) 2x10® θ9Υ^δθ9

DA (Bgl II) 1x10° egység ^xAz aktivitást a citopatikus hatás gátlásával mértük WISH sejteken, amelyeket VSV-vel fertőztünk meg

A különféle interferonok hatékonyságát többféle, emlősöktől származó sejtvonalakon határoztuk meg (emberi, WISH; afrikai kabóca majom, VERŐ; hörcsög fibroblaszt, BHK; nyúl vesesejtek, RK-13; egér L-929; és szarvasmarha vesesejtek, MDBK).

Ahhoz, hogy összehasonlítsuk az egyes interferonok viszonylapos aktivitását, a különböző sejteken mórt aktivitásukat a WISH sejteken mórt aktivitáshoz viszonyítottuk. A WISH sejteken mórt aktivitást 100-nak vettük.

A 3. táblázatban feltüntetett eredmények azt mutatják, hogy a LelF A/D Interferonnak igen nagy az aktivitása VERŐ és L-929 sejteken, míg a LelF D/A interferonnak csekély az aktivitása ezeken a sejtvonalakon. Ezek az eredmények jelzik, hogy a LelF A amino végcsoportot tartalmazó részének és a LelF D karboxil végcsoportot tartalmazó részének egyetlen molekulában való kombinációja (LelF AD) különleges hatékonyságot biztosít a hibrid fehérjének, és eza hatékonyság több emlős sejten is kimutatható. Továbbá, ezek a tulajdonságok nem egyszerűen az eredeti kiindulási interferonok tulajdonságainak összegzései. Ez világosan látható a L-929 sejteken mért aktivitás esetén (3. táblázat), amikor sem a LelF A és a LelF D keveréke, sem a másik hibrid, a LelF D/A nem mutat jelentősebb aktivitást.

3. táblázat

Különféle leukocita interferonok titrálása különböző emlősöktől származó sejtvonalakban

Sejtvonal	Leukocita interferonokx	Bőrhártya
A	D	A/D	D/A	A,D
WISH	100	100	100	100	100	100
VERŐ	250	75	1670	20	200	200
BHK	400	200	833	2000	400	20
RK-13	12	500	6	nincs adat	120
L-929	150	5	3300	2	10	0,1

x VSV-vel fertőzött különféle sejtvonalakon vizsgált interferonok. Az aktivitás értékek a WISH sejteken megfigyelt aktivitás százalékában vannak megadva.

A LelF A/D aktivitását más vírusokkal szem ben is vizsgáltuk. A 5. ábrán bemutatott adatok az EMC vírusfertőzéssel szembeni vírusellenes hatást jelzik L sejteken, a 6 ábra adatai pedig a VSV fertőzéssel szembeni hatást adják meg, szintén L-sejteken. Az adatokból nyilvánvaló, hogy a LelF A/D nagyobb aktivitása nem korlátozódik egyetlen vírusra (VSV), és ez a nagyobb aktivitás valószínűleg általános tulajdonság számos vírussal szemben. A természetes emberi bőrhártya interferon készítmények hatástalanok egérsejteken (lásd a 3. táblázatot). Ezért megvizsgáltuk a LelF A/D aktivitását CD-1 egéren EMC vírusfertőzéssel szemben. A 7. ábrán feltüntetett eredmények azt mutatják, hogy a LelF A/D rendkívül hatékony az egyébként halálos EMC vírusfertőzéssel szemben, és a LelF A is rendelkezik vírusellenes aktivitással, amint az várható a sejtvonalakon mutatott aktivitása alapján (3. táblázat). A 7 ábra adatai a fertőzés előtt 3 órával i.p. végzett kezelésekből szármáz nak A LelF A/D és a LelF A megadotl dózisai WISH sejteken végzett titráláson alapulnak

Hörcsögök halálos EMC vírusfertőzését szín tén befolyásolja a LelF A/D és a LelF A (8 áb ⁶⁵ 14 ra), s az előbbi a leghatékonyabb. A bőrhártya interferonnak mindössze csekély a hatása, amely statisztikusan nem szignifikáns. A 8. áb, ra olyan vizsgálatokra vonatkozik, amelyeknél ^ö az összes interferont 3 órával a megfertőzés előtt adtuk be i.p. 5x10 p.g/kg dózisban A dó zis WISH sejteken végzett titráláson alapult.

Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a LelF A/D jelentős vírusellenes hatása egy sor ⁵⁰ emlősnél nem korlátozódik sejttenyészetekre, hanem halálos vírusfertőzéseknél is megfigyelhető.

Az EMC vírus modell rendszerként tekinthető, s a vele szembeni vírusellenes hatás az al⁵⁵ tala képviselt víruscsalád elleni antivírális hatást jelzi (például idetartozik a pikornavírus család, amelynek egyes tagjai a száj- és körömfájást, valamint a gyermekbénulást okozzák

A VSV vírus szintén modellrendszerként tekinthető, s a vele szembeni vírusellenes hatás az általa képviselt víruscsalád elleni antivírális hatást jelzi (például idetartozik a rabdovírus család, amelynek egyik tagja a veszettséget okozza).

-14193512

A 4. táblázatban különböző LelF hibrideknek WISH, illetve MDBK sejteken mért aktivitását, továbbá a kétféle sejten meghatározott aktivitások hányadosát tüntetjük fel.

4. táblázat

LelF hibrid (Pvu II)	Egység/liter WISH sejt tenyészet	Egység/liter MDBK sejt tenyészet	Aktivitások hányadosa WISH/MDBK
AB	2,4x108	4x10?	6
AD	1,2x108	2x1O7	6
AF	6x107	1x107	6
AG	4x107	1,5x107	2,7
Al	3,2x107	1,2x107	2,7
BA	1,5x107	1x107	1,5
BD	6x1O7	1,5x107	4
BF	1x106	3,5x105	0,3
BG	2x107	6x107	0,3
DA	3x1.06	1,2x10®	0,025
DB	2x10®	5x107	0,04
DF	2x105	4x10®	0,05
DG	2x105	1,5x107	0,014
FA	2x10s	6x107	0,003
FB	2x106	8x107	0,025
FD	1x107	2x107	0,5
FG	1x10®	4x107	0,025
IA	2,4x10®	6x107	0,04
A*	8x1O7	1,2x10®	0,7
B*	8x107	4x10®	0,2
c*	2x107	1,5x107	1,3
Dx	5x10®	2,5x10^	0,2
F*	2x107	2x10®	0,1
lx	1,6x1O7	1,2x1O7	1,3

^x Összehasonlítási célokra

Parenterális beadás

A találmány szerinti hibrid leukocita interferonok beadhatók parenterálisan olyan személyeknek, akiknél daganatellenes vagy vírusellenes kezelésre van szükség, valamint olyan esetekben, amikor Immunszuppresszív viszo- 40 nyok állnak fenn. Az alkalmazott dózis ugyanolyan lehet, mint a jelenleg klinikai vizsgálat alatt álló, emberi eredetű anyagoké, például körülbelül napi (1—10)x 10⁶ egység. Olyan anyagok esetében, amelyejs koncentrációja 1% feletti, való- 45 színűleg 5x10 egységig terjedhet a napi dózis

A fentebb ismertetett, majmokkal végzeti vizsgálatok kezdeti eredményei arra mutatnak, hogy a bakteriális úton előállított leukocita interferonból lényegesen nagyobb dózisok alkal- 50 mázhatok a nagyobb hatás elérése érdekében, annak következtében, hogy nincsenek jelen a leukocita interferontól eltérő, emberi eredetű fehérjék. Ezek a fehérjék ugyanis pirogén anyagokként hathatnak, s kedvezőtlen hatásuk le- 55 hét, például rossz közérzetet, testhőmérsókletetnelkedést stb. okozhatnak

Például a következőképpen állíthatunk elő egy parenterálisan beadható, gyakorlatilag homogén, bakteriális úton termelt LelF készít- 60 mónyt:

mg leukocita interferont, amelynek a fajlagos aktivitása mondjuk 2x10⁸ egység/mg, ml 5 N emberi szérum albuminban oldunk, az oldatot bakteriológiai szűrőn vezetjük át. és 65 a szűrletet aszeptikus körülmények között 100 ampullába töltjük. Minden egyes ampulla 6x10⁶ egység tiszta interferont tartalmaz, amely parenterálisan beadható. Az ampullákat célszerűen hidegen (-20“C) tároljuk, felhasználásig.

A találmány szerinti vegyületeket önmagában ismert módón gyógyszerkészítményekké alakíthatjuk. Ekkor a polipeptidet gyógyászatilag elfogadható vivőanyaggal/anyagokkal keverjük össze. Az alkalmas vivőanyagokat és gyógyszerformákat például a Remington's Pharmaceutical Sciences (szerkesztő E.W Martin) ismerteti. A gyógyszerkészítmények a találmány, szerinti interferon fehérje hatékony mennyiségét tartalmazzák, megfelelő mennyiségű vivőanyaggal együtt.

Claims (23)

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1) kiválasztunk egy első kótszálas DNS töredéket, amely egy első, a természetben előforduló leukocita interferon aminosav-szekvenciáját vagy annak egy részét kódoló kodonokat tartalmaz és amely töredék az említett ámino-terminális részét kódoló kodonokat, valamint attól 3’-irányban egy első restrikciós endonukleáz hasítási helyet foglal magába;

1. Eljárás egy 165-166 aminosavból — vagy ha az első aminosav N-terminálisához metionin kapcsolódik, 166-167 aminosavból — álló, aminosav-szekvenciájában két különálló, egymást sorban követő, az aminosavak fajtája és száma tekintetében különböző természetes előtör dulású leukocita interferonoknak megfelelő al szekvenciát tartalmazó, vírusellenes hatású polipeptid előállítására, amely polipeptid amino sav-szekvenciája a teljes összetétel tekinteté ben eltér a természetben előforduló leukocita interferonokétól, azzal jellemezve, hogy repli kációra képes plazmid-jellegű kifejeződő hor

-15193512 dozóba a polipeptidet kódoló szálat tartalmazó hidrid kétszálú dezoxiribonukleinsav töredéket viszünk be, ezzel valamely Escherichia nemzetségben, előnyösen E. coli mikroorganizmust transzformálunk, a mikroorganizmust tenyésztjük és kiváltjuk a kódolt peptid kifejeződését, majd a képződött mikroorganizmust elroncsoljuk és belőle a polipeptidet elkülönítjük. (Elsőbbség: 1980. 11. 10.)

2) az említett töredéket hasítjuk az említett restrikciós endonukleáz enzimmel;

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan polipeptidet kódoló szálat tartalmazó hibrid kétszálú dezoxiribonukleinsav töredéket alkalmazunk, amely ben az N-terminális rész a LelF-D 1-92 számú aminosavjából és karboxil-terminális rész pedig a LelF-A 92-165 számú aminosavjából áll. (Elsőbbség: 1980. 11. 10.)

3) kiválasztunk egy második kótszálas DNS töredéket, amely egy második, az említett elsőtől különböző, a természetben előforduló leukocita interferon aminosav-szekvenciáját vagy annak egy részét kódolja és amely egy,az előbbivel azonos és a két interferon aminosav-számozása szempontjából lényegileg azonos helyzetű restrikciós endonukleáz hasítási helyet és ezen a helyen túl a második interferon karboxil-terminális részét kódoló kodonokat foglalja magába;

3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan polipeptidet kódoló szálat tartalmazó hibrid kótszáió dezoxiribonukleinsav töredéket alkalmazunk, amelyben az N-terminális rész a LelF-A 1-91 számú aminosavjából és a karboxil-terminális rész pedig a LelFD 93 166 számú aminosavjából áll. (Elsőbbség. 1980. 11 10.)

4) az említett második töredéket hasítjuk az említett restrikciós endonukleáz enzimmel;

4 Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan polipeptidet kódoló szálat tartalmazó hibrid kétszálú dezoxiribonukleinsav töredéket alkalmazunk, amelyben az N-terminális rész a LelF-D 1-63 számú aminosavjából és a karboxil-terminális rész pedig a LelFA 63 165 számú aminosavjából áll (Elsőbbség. 1980. 11. 10)

5) a 2) és 4) hasítási lépésben kapott restrikciós endonukleázos hasítási termékeket kapcsoljuk az említett restrikciós endonukleáz hasítási helyek helyreállítására és így olyan hibrid töredéket képezünk, amely egymást követően az első interferon amino-terminális részét és a másik interferon karboxil-terminális részét kódoló kodonokat tartalmaz. (Elsőbbség: 1980.

5. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan polipeptidet kódoló szálat tartalmazó hibrid kétszálú dezoxiribonukleinsav töredéket alkalmazunk, amelyben az N-terminális rósz a LelF-A 1-62 számú aminosavjából és a karboxil-terminális rész pedig a LelF-D 64-166 számú aminosavjából áll. (Elsőbbség 1980 11 10)

6. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan polipeptidet kódoló szálat tartalmazó hibrid kétszálú dezoxiribonukleinsav töredéket alkalmazunk, amelyben az N-terminális rész a LelF A 1-91 számú aminosavjából és a karboxil-terminális rész pedig a LelF-B 93-166 számú aminosavjából áll. (Elsőbbség: 1981 02. 23.)

7. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan polipeptidet kódoló szálat tartalmazó hibrid kétszálú dezoxiribonukleinsav töredéket alkalmazunk, amelyben az N-terminális rész a LelF-A 1—91 számú aminosavjából és a karboxil-terminális rész pedig a LelF-F 93-166 számú aminosavjából áll. (Elsőbbségi 981. 02. 23.)

8. Eljárás az 1. igénypont tárgyi köre szerinti, 165-166, ill. 166-167 aminosavból álló, aminosav-szekvenciájában két különálló, egymást sorban követő, az aminosavak fajtája és száma tekintetében különböző természetes előfor dulású leukocita interferonoknak megfelelő alszekvenciát tartalmazó, de aminosav-szekvenciájának teljes összetétele szempontjából a 16 természetben előforduló leukocita interferonok aminosav-szekvenciájától eltérő vírusellenes hatású polipeptidet kódoló kétszálú dezoxiribonukleinsav előállítására, azzal jellemezve, hogy

9. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a természetben előforduló első leukocita interferonként LelF D-t és a természetben előforduló második leukocita interferonként LelF A-t alkalmazunk. (Elsőbbség:

1980.11.10.)

10. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy első kótszálas DNS töredékként a LelF-D 1 63 számú aminosavát kódoló kodonokat tartalmazó töredéket, második kótszálas DNS töredékként a LelF A 92-165 számú aminosavát kódoló kodonokat tartalmazó töredéket választunk. (Elsőbbség: 1980. 11. 10.)

11. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy első kótszálas DNS töredékként a LelF D 1-63 számú aminosavát kódoló kodonokat tartalmazó töredéket, második kótszálas DNS töredékként a LelF A 63-165 számú aminosavát kódoló kodonokat tartalmazó töredéket választunk. (Elsőbbség: 1980. 11. 10.)

11.10.)

12. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a természetben előforduló első leukocita interferonként LelF A-t és a természetben előforduló második leukocita interferonként LelF D-t alkalmazunk. (Elsőbbség:

1980. 11. 10.)

13. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy első kótszálas DNS töredékként

-16193512 a LelF A 1-92 számú aminosavát kódoló kodonokat tartalmazó töredéket, második kótszálas DNS töredékként a LelF D 93-166 számú aminosavát kódoló kodonokat tartalmazó töredéket választunk. (Elsőbbség: 1980. 11. 10.) 5

14. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy első kétszálas DNS töredékként a LelF A 1 -62 számú aminosavát kódoló kodonokat tartalmazó töredéket, második kótszálas DNS töredékként a LelF D 64-166 számú ami- 10 nosavát kódoló kodonokat tartalmazó töredéket választunk. (Elsőbbség: 1980. 11. 10.)

15. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a természetben előforduló első leukocita interferonként LelF A-t és a termé- 15 szetben előforduló második leukocita interferonként LelF B-t alkalmazunk (Elsőbbsége: 1981.02.23.)

16. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy első kétszálas DNS töredékként 20 a LelF A 1-91 számú aminosavát kódoló kodonokat tartalmazó töredéket, második kétszálas DNS töredékként a LelF B 93-166 számú aminosavát kódoló kodonokat tartalmazó töredéket választunk. (Elsőbbség:1981. 02. 23.) 25

17. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a természetben előforduló első leukocita interferonként LelF A-t és a természetben előforduló második leukocita interferonként LelF F-et alkalmazunk. (Elsőbbség: 30

1981. 02. 23.)

18. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy első kótszálas DNS töredékként a LelF A 1-91 számú aminosavját kódoló kodonokat tartalmazó töredéket, második kétszálas 35 DNS töredékként a LelF F 93-166 számú aminosavát kódoló kodonokat tartalmazó töredéket választunk (Elsőbbség: 1981.02. 23.)

19. Eljárás az 1. igénypont tárgyi körében említett 165-166 aminosavból — vagy ha az el- 40 ső aminosav N-terminusához metionin kapcsolódik, 166-167 aminosavból — álló, aminosav-szekvenciájában két különálló, egymást sorban követő, az aminosavak fajtája és száma tekintetében különböző természetes előfordulású 45 leukocita Interferonoknak megfelelő alszekvenciát tartalmazó, de aminosav szekvenciájának teljes összetétele tekintetében a természetben előforduló leukocita interferonokétól eltérő vírusellenes hatású polipeptidet egy Esche- 50 richia nemzetségbe tartozó transzformáns mikroorganizmusban kifejezni képes, replikálható plazmid jellegű expressziós hordozó előállítására, azzal jellemezve, hogy az 1-7. igénypontokban említett vírusellenes hatású polipeptidet kódoló, 8-18. igénypont szerinti DNS szekvenciát egy további, az említett interferon mikrobiális expressziójára képes DNS szekvenciájával kapcsoljuk. (Elsőbbség: 1980. 11. 10.)

20. Eljárás az 1. igénypont tárgyi körében említett 165-166 aminosavból álló, aminosav-szekvenciájában két különálló, egymást sorban követő, az aminosavak fajtája és száma tekintetében különböző természetes előfordulású leukocita interferonoknak megfelelő alszekvenciát tartalmazó, de aminosav szekvenciájának teljes összetétele tekintetében a természetben előforduló leukocita interferonokétól eltérő vírusellenes hatású polipeptid kifejezésére képes mikroorganizmus előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely Escherichia nemzetségben mikroorganizmust a 19. igénypont szerint előállított replikálható, plazmid jellegű expressziós hordozóval transzformálunk. (Elsőbbség: 1980. 11. 10.)

21. Eljárás az 1. igénypont szerint előállított,

165- 166 aminosavból — vagy ha az első aminosav N-terminusához metionin kapcsolódik,

166- 167 aminosavból — álló, aminosav-szekvenciájában két különálló, egymást sorban követő, az aminosavak fajtája és száma tekintetében különböző természetes előfordulású leukocita interferonoknak megfelelő alszekvenciát tartalmazó, de aminosav szekvenciájának teljes összetétele tekintetében a természetben előforduló leukocita interferonokétól eltérő ví rusellenes hatású polipeptidet tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy az említett polipeptidet gyó gjyászati szempontból elfogadható, nem toxikus, inért vivöanyaggal keverjük össze, és a keveréket gyógyszerkészítménnyé alakítjuk (Elsőbbség: 1980. 11. 10.)

22. Eljárás a 6., 7., 15.-18. igénypontok bármelyike szerint előállított, 165-166 aminosavból — vagy ha az első aminosav N-terminusához metionin kapcsolódik, 166-167 aminosavból — álló polipeptidet tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy az említett polipeptidet gyógyászati szempontból elfogadható, nem toxikus, inért vivőanyaggal keverjük össze és a keveréket gyógyszerkészítménnyé alakítjuk. (Elsőbbség:-1981. 02.

23.)