HU192456B

HU192456B - Process for preparing l-lysine

Info

Publication number: HU192456B
Application number: HU362484A
Authority: HU
Inventors: Guntara R Mezhinja; Galina T Szultanova; Jevgenyij N Szagildin; Lidia B Skagale
Original assignee: Latvijskij G Uni Im Petra Sztu
Priority date: 1984-09-25
Filing date: 1984-09-25
Publication date: 1987-06-29
Also published as: HUT38127A

Description

Jelen találmány a mikrobiológiai iparra vonatkozik, és tárgya eljárás L-lizin előállítására, amelyet a gyógyszerészeti és élelmiszeriparban, valamint az állattenyésztésben a takarmányok feldúsításához és kiegyensúlyozásához használnak.

Ismeretes olyan eljárás az L-lizin mikrobiológiai szintézisére, amely a Brevibacterium fajhoz tartozó termelő törzs aerob feltételek melletti, süllyesztett kultúrájában olyan tápközeget használ, amely szén- és nitrogénforrást, ásványi sókat és növekedésserkentőket tartalmaz. L-lizintermelőként a Brevibacterium fajhoz tartozó baktériumok auxotróf mutánsait, például a Brevibacterium flavum RC—115 vagy sp. E—531 jelű törzseket alkalmazzák, szénforrásként szénhidrátokat, leggyakrabban melaszt, cukrot, valamint ecetsavat, etanolt, szénhidrogént vesznek igénybe. A szükséges nitrogén-, foszfor-, káliummennyiséget szervetlen sók formájában adják a tápközegbe.

A szükséges növekedésserkentőt kukoricalekvár vagy fehérjehidrolizátumok formájában juttatják a tápközegbe. A tenyésztés a tápközeg levegőztetése és kevertetése mellett történik. A fermentáció úgy is végezhető, hogy a tápanyagok egy részét a fermentáció során adagolják. 11—13% redukáló anyagot tartalmazó tápközegben történő fermentáláskor 72—90 óra alatt 26—39 g/1 L-lizint állítanak elő, 0,2—0,3 cukorátalakítási tényező mellett.

Az L-lizin feldúsulási sebessége 0,2—0,5 g/1 óránként (671 384 sz. szovjet szerzői tanúsítvány, 679 980 sz. szovjet szerzői tanúsítvány).

Az L-lizin előállítására vonatkozó ismert eljárásokat komplikált technológia és alacsony L-lizin-hozam jellemzi, amely a hosszabb lag-fá^ zis következménye. Termelési feltételek mellett 12—15 órát tesz ki.

A végtermék-hozam bizonyos mértékben emelkedik, ha a fermentálás alatt tápanyagokat adnak a tenyészléhez, habár viszonylag komplikált műszerek szükségesek az anyag hozzáadásához és a koncentráció ellenőrzéséhez.

A 78 151 sz. román szabadalmi leírás szerint a Brevibacterium lactofermentum termelő törzset 2,0—3,5-10⁵ Rád dózisú /-sugárzásnak teszik ki, ami mutánsokat eredményez a populációban. A bonyolult szelektálás során nyert legjobb mutáns termelőképessége mintegy 20%-kal haladja meg a kiindulási törzsét.

A találmány célja, hogy új technológiai eljárás bevezetésével a gyártási technológia egyszerűsödjön, a végtermék hozama emelkedjék és a tenyésztési folyamat időtartama lerövidüljön.

Á cél megvalósítható olyan eljárással, amelyben a Brevibacterium fajhoz tartozó, L-lizint termelő baktériumtörzset süllyesztett kultúrában aerob körülmények között szénforrást, nitrogénforrást, ásványi sókat és növekedésserkentőket tartalmazó tápközegben fermentáljuk és a végterméket izoláljuk. A találmány szerinti eljárásra jellemző, hogy az L-lizin-termelőt a tenyésztés előtt 0,5—4,0 kRad/perc dóziserősségű, max. 50 kRad összdózisú ionizáló sugárzásnak vetjük alá.

Ha L-Iizin-termelőként a Brevibacterium flavum RC—115 jelű törzset alkalmazzuk, az aktivitás emelése érdekében 10—30 kRad összdózisú ionizáló sugárzásnak vetjük alá.

A Brevibacterium sp. E—531 törzset célszerűen 0,5—1,0 kRad összdózisú ionizáló sugárzásnak tesszük ki.

A különböző Brevibacterium törzsek sugárzási érzékenysége jelentősen különbözik, és nemcsak a törzsi tulajdonságoktól, hanem a sugárzás külső feltételeitől is függ.

A sugárzás következtében a sejtek életműködésének folyamatai felgyorsulnak.

A tenyésztési folyamat elején a tápanyagok intenzív felhasználása és az L-lizin nagy sebességű feldúsulása figyelhető meg. 48 órás tény észidő alatt az L-lizin-koncentráció 118— 160%-kal magasabb, mint a be nem sugárzott kultúra esetén. Ezenkívül a besugárzott populáció gyorsabban alkalmazkodik, ha az optimális tenyészfeltételek romlanának a fermentálás során, és 200—300%-kaI magasabb L-lizin-hozamot termel, mint a be nem sugárzott kultúra.

A cukorátalakítási tényező értéke 0,3—0,4-es felső határon marad, jelentősen azonban nem változik, ami arról tanúskodik, hogy a besugárzott sejtek anyagcseréje változatlan marad, tehát a javasolt sugárzás révén elért aktivitásnövekedésnek nem genetikai változások az alapjai.

A találmány szerinti eljárás során az alábbiak szerint járunk el.

A Brevibacterium törzset hús-pepton-agarra oltjuk, és termosztátban 28—30 °C hőmérsékleten 24 órán keresztül tenyésztjük. Ezután a ferde agaron levő kultúrát 0,5—4,0 kRad/perc dóziserősségű és max. 50 kRad összdózisú ionizáló sugárzásnak vetjük alá. A sugárzási feltételek a Brevibacterium faj L-lizin-termelőinek meghatározott törzseire vonatkozóan eltérőek, és az adott törzs érzékenységének megfelelően kísérletezzük ki.

Sugárzáskor a mikroorganizmus sejtjeinek anyagcseréje felgyorsul. A sejtek növekedési és fejlődési sebessége, a tápanyagok asszimilációja és az L-lizin-bioszintézis kétszeresére növekedik. Ha mikroorganizmusokat 0,5 kRad alatti dózissal besugározzuk, akkor ilyen hatást nem érhetünk el. Nem változik a sejtek anyagcseréje. 50 kRad összdózis feletti besugárzáskor a sejtek növekedése csökken, a sejtosztódási folyamatban fellépő anomália miatt, ami a DNS és RNS károsodásából következik.

Besugárzás után az agaron levő kultúrát az inokulum tenyésztéséhez használjuk. Ehhez olyan tápközeget használunk, amely szén-, nitrogénforrást, ásványi sókat és növekedésserkentőket tartalmaz és például a következő összetételű (g per 1 liter-csapvíz):

50%-os cukortartalmú melasz 200,0 (ami 10 + 0,5% redukálóanyagtartalomnak felel meg)

192 456 élesztőhidrolizátum (f ehérje—vitamin-koncentrátum) vagy

kukoricalekvár	40,0
ammónium-szulfát	20,0
KH₂PO₄	5,0
k₂hpo₄	5,0
CaCO₃	10,0
pH-értéke 7,0—'7,2 A fermentáláshoz a következő összetételű (g/1)
tápközeget használjuk: 50%-os cukortartalmú melasz	250,0
(ami 12,5 + 0,5% redukálóanyagtartalomnak felel meg) Kukoricalekvár vagy élesztőhidrolizátum (fehérje—vitaminkoncén trátum)	40,0
ammónium-szulfát	25,0
kh₂po₄	5,0
szintetikus habzásgátló	0,5-1,0

pH-érték 7,0—7,2

A fermentációs közeget 0,1—8 tf% mennyiségben beoltjuk az inokulummal. A fermentáció 30—33 °C hőmérsékleten, 7,0—7,8-as pH-érték és a teljes telítettség 20%-át kitevő pO₂-érték mellett történik.

A kultúra növekedése az oltás pillanatával kezdődik, a növekedés lag-fázisa kimarad. Addig fermentálunk, míg a közegben levő redukáló anyag koncentrációja 0,5% alá nem csökken.

A fő fermentáció 48—55 óráig tart.

A fermentáció végén a közegben 53 g/1 L-lízis dúsul fel (L-lizin-monohidrokloridra átszámítva).

A cukorátalakítási tényező = 0,42, az L-lizinszintézis sebessége pedig 0,96 g/1 óránként. A közegben levő biomasszatartalom 15—20 g/1.

Ezután a tenyészléből ismert módon izoláljuk a végterméket folyékony vagy száraz L-lizin-takarmánykoncentrátum vagy tiszta kristályos L-lizin formájában.

A találmány szerinti eljárásnak a következő előnyei vannak az ismert eljárásokkal összehasonlítva :

— a termelő növekedési sebessége az oltás pillanatától kezdve nő, mivel a növekedés lagfázisa kimarad;

— az L-lizin-szintézis sebessége a kétszeresére nő, a szintézis a fermentációs folyamat beindulásával kezdődik;

— a fermentációs ciklus 25%-kal lerövidül, ami a folyamat gyártási technológiáját egyszerűsíti és a készülékigényt csökkenti.

A találmányt az alábbi példákkal közelebbről ismertetjük.

1. példa

L-lizin-termelőként a Brevibacterium flavum RC—115 törzset használjuk. A hús-pepton-agarra frissen beoltott kultúrát 1 kRad/perc és 10 kRad Összdózisú sugárzásnak vetjük alá.

Ezután a ferdeagaras kultúrát inokulumként használjuk fel. Minden lombikba 10 ml steril csapvizet öntünk és rázzuk. A kapott szuszpenziót oltóanyagként alkalmazzuk, amit 2 ml (8%) mennyiségben adunk a fermentációs közeghez. A fermentációs közeg Összetétele a következő (g per 11 csapvíz):

50%-os cukortartalmú melasz 250,0 (ami 12,5% redukálóanyag-tar falómnak felel meg) kukoricalekvár (50%-os szárazanyag-tartalommal) 40,0 (NH₄)₂SO₄ 25,0

KH₂PO₄ 5,0

K₂HPO₄ 5,0

CaCO₃ 10,0

A tápközeget 10⁵ Pa túlnyomáson 40 percig sterilizáljuk. A táptalaj sterilizálása után a pHértéket 25%-os ammónium- hidrovid-oldat hozzáadásával 7,0—7.2 szintre állítjuk be. Λ tenyésztést 750 ml térfogatú lombikban, 25 ml tápközegben 230 fordulat/perc frekvenciájú rázóasztalon, 30—33 °C hőmérsékleten végezzük. A fermentálás 50 óráig tart, ez alatt az idő alatt a cukorkoncentráció 0,5%-ra csökken és 40,7 g/1 L-lizin termelődik (L-lizin-monohidrokloridra átszámítva), a cukorátalakítási tényező 0,33. Az L-lizin bioszintézis átlagos sebessége az egész fermentációs periódusban 0,81 g/1 óránként.

2. példa

L-lizin termelőjeként a Brevibacterium flavum RC—115 törzset alkalmazzuk. A hús-pepton-agarra frissen oltott kultúrát 3 kRad/perc dóziserősségű 20 kRad összdózisú sugárzásnak vetjük alá. A tenyésztést az 1. példához hasonlóan végezzük.

A 24 órás fermentálás alatt a cukorkoncentráció 0,5%-ra csökken és 43,4 g/1 L-lizin termelődik (L-lizin-monokloridra átszámítva). A cukorátalakítási tényező 0,35. Az L-lizin bioszintézis átlagos sebessége a teljes fermentációs folyamat alatt 0,90 g/1 óránként.

3. példa

L-lizin-termelőként a Brevibacterium flavum RC—115 törzset alkalmazzuk. A frissen átoltott kultúrát 4 kRad/perc dóziserősségű és 30 kRad összdózisú sugárzásnak vetjük alá.

A fermentáláshoz 750 ml-es lombikot használunk, amely a következő összetételű oltótápközeget tartalmaz 25 ml mennyiségben:

50%-os cukortartalmú melasz 200,0 (ami 10%-os redukálóanyagtartalomnak felel meg) kukoricalekvár (50%-os szárazanyag-tartalommal) 40,0 (NH₄)₂SO₄ 20,0

KH₂PO₄ 5,0

K₂HPO₄ 5,0

CaCO₃ 10,0 órás növekedés után 165 ml (a tápközegtérfogat 1%-a) inokulumot steril körülmények között átjuttatunk egy 30 1 térfogatú fermentorba (a fermentor 18 1 tápközeget tartalmaz). A biomassza kiindulási koncentrációja 0,3 g/1. A fermentor rendelkezik keverőművel és mű-31

192 456 szerekkel a hőmérséklet és a pH-érték mérésére és szabályozására. A fermentációs közeg összetétele a következő ,(g/l):

50%-os cukortartalmú melasz 250,0 (ami 5%-os redukálóanyagtartalomnak felel meg) kukoricalekvár (50%-os szárazanyag-tartalommal) 40,0 (NH₄)₂SO₄' 25,0

KH₂PO₄ 5,0

K₂HPO₄ 5,0

A tenyésztést 30—33 °C hőmérsékleten, 7,0—

7,8 pH-érték és a teljes telítettség 20%-ának megfelelő pO₂-érték mellett végezzük.

Addig fermentáljuk a tény észlét, míg cukorkoncentrációja 0,5%-ra nem csökken. 55 óra alatt a fermentációs közegben 44,8 g/1 L-lizin termelődik (L-lizin-monohidrokloridra átszámítva). A cukorátalakulási tényező 0,36, az L-lizin-szintézis átlagos sebessége 0,81 g/1 óránként.

4. példa

L-lizin-termelőként a Brevibacterium sp. E— 531 törzset alkalmazzuk. A frissen átoltott kultúrát 0,5 kRad/perc dóziserősségű és 0,5 kRad összdózisú sugárzásnak vetjük alá. A tenyésztést lombikban, az 1. példában leírtak szerint végezzük, a következő tápközeg alkalmazásával:

50%-os cukortartalmú melasz 250,0 (ami 12,5%-os redukálóanyagtartalomnak felel meg) takarmányélesztő-hidrolizátum (fehérje—vitamin-koncentrátum 20%-os szárazanyag-tartalommal) 40,0 (NH₄)₂SO₄ 25,0

KH₂PO₄ 5,0

K₂HPO₄ 5,0

CaCO₃ 10,0 órás fermentálás után a cukorkoncentráció 0,5%-ra csökken, és 48 g/1 L-lizin keletkezett (L-lizin-monohidrokloridra átszé íítva).

A cukorátalakítási tényező 0,38, a : L-lizinszintézis átlagos sebessége óránként 0,37 g/1.

5, példa

L-lizin-termelőként a Brevibacterium sp. E— 531 törzset alkalmazzuk. A frissen átoltott kultúrát 1,0 kRad/perc dóziserősségű és 1 kRad összdózisú sugárzásnak vetjük alá. Az inokulumot két lépcsőben tenyésztjük, Az első lépcsőben az inokulumot rázólombik'<?. - a 3. példához hasonlóan a következő összetételű tápközegber állítjuk .lő:

50%-os cukortartalmú melasz 200,C (ami 10%-os redukálóanyagtartalomnak felel meg) takarmányélesztő-hidrolizátum (fehérje—vitamin-koncentrátum

20%-os szárazanyag-tartalommal) 40,0 (NH₄)₂SO₄ 20,0

KH₂PO₄ 5,0

K₂HPO₄ 5,0

CaCO₃ 10,0

A második lépcsőben az inokulumot 5000 1 térfogatú oltófermentorban (amely 3000 1 tápközeget tartalmaz) a következő összetételű tápközegben tenyésztjük: (g/1)

50%-os cukortartalmú melasz 200,0 (ami 10%-os redukálószertartalomnak felel meg) takarmányélesztő-hidrolizátum (fehérje—vitamin-koncentrátum 20°/ o-os szárazanyag-tartalommal) 40,0 (NH₄)₂SO₄ 20,0

KH₂PO₄ 5,0

K₂HPO₄ 4,0

A tápközeget az inokulum részére 1,2-10⁵ Pa túlnyomáson 60 percig sterilizáljuk, majd lehűtjük és a tápközeg pH-értékét 25%-os vizes ammónium-hidroxid-oldat hozzáadásával 7,0—

7,2-re állítjuk be. A tápközeget a rázólombikból származó 2—3 1 inokulummal (0,1% a tápközeg térfogatra vonatkoztatva) beoltjuk.

Az inokulumot 20—24 órán. át 30—33 °C hőmérsékleten, 7,0—7,8 pH-érték és a teljes telítettség 20%-ának megfelelő pO₂-érték mellett tenyésztjük. A fermentációt ezután 50 000 literes fermentorban végezzük, amely az alábbi összetételű tápközeget tartalmazza 35 000 liter mennyiségben:

50%-os cukortartalmú melasz 250,0 (ami 12,5%-os redukálóanyagtartalomnak felel meg) takarmányélesztő-hidrolizátum (fehérje—vitamin-koncentrátum

20%-os szárazanyag-tartalommal) 40,0 ammónium-szulfát 25,0

KH₂PO₄ 5,0

K₂HPO₄ 5,0 szilikonolaj 1,0

A tápközeget folyamatos üzemű berendezésben 1,2-10⁵ Pa nyomáson sterilizáljuk, majd 30—33 °C-ra lehűtjük és a pH-értéket 25%-os vizes ammónium-hidroxid-oldat hozzáadásával 7,0—7,2-re állítjuk be. A tápközeget 2800 1 inokulummal (8% a tápközegtérfogatra vonatkoztatva) beoltjuk.

A fermentálást 30—33 °C hőmérsékleten, 7,0—

7,8 pH-érték és a teljes telítettség 20%-ának megfelelő pO₂-érték mellett végezzük 55 órán át. A fermentálás végén az L-lizin 52,7 g/1 mennyiségben dúsult fel a fermentlében (L-lizin-monohidrokloridra átszámítva). A cukorkonverzió 0,42, az L-lizin átlagos képződési sebessége 0,96 g/1 óránként.

Ő. példa (összehasonlító példa)

Az 1. példa szerint járunk el, de besugárzást nem alkalmazunk. 48 óra fermentálás alatt a cukorszint 0,5%-ra csökken. Az L-lizin bioszin’-ézisének átlagos sebessége 0,5 g/1 óránként.

Claims

1. Eljárás L-lizin előállítására ionizáló sugárzás felhasználásával, a Brevibacterium fajhoz tartozó termelő törzs süllyesztett kultúrában, aerob körülmények között szénforrást, nitrogénforrást, ásványi sókat és növekedésserkentőt tartalmazó tápközegen végzett fermentálása, majd a végtermék elkülönítése útján, azzal jellemezve, hogy az L-Iizin-termelőt a te- 10 nyésztés előtt 0,5—4,0 kRad/perc dóziserősségű és max. 50 kRad összdózisú ionizáló sugárzásnak vetjük alá.

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy L-lizin-termelőként a

5 Brevibacterium flavum CMPM RC—115 törzset használjuk és a tenyésztés előtt 10—30 kRad összdózisú ionizáló sugárzásnak tesszük ki.

3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, az al jellemezve, hogy L-lizin-termelőkén a Brevibacterium sp. CMPM E—531 törzset aí. ilmazzuk és a tenyésztés előtt 0,5—1,0 kRad összdózisú sugárzásnak tesszük ki.