HU185315B

HU185315B - Siliconpolymer compositions for treating textile materials

Info

Publication number: HU185315B
Application number: HU812698A
Authority: HU
Inventors: Eugene R Martin
Original assignee: Sws Silicones Corp
Priority date: 1980-09-19
Filing date: 1981-09-18
Publication date: 1985-01-28
Also published as: FI74475B; DK157687B; ZA815993B; ATE8843T1; FR2490495B1; IE812177L; EP0049181B1; FI74475C; CA1151545A; EP0049181A1; JPH0148920B2; US4356171A; DE3165412D1; FI812924L; AU546494B2; AU7545081A; DK414881A; ES505594A0; PT73705A; DK157687C

Description

A találmány tárgya eljárás új vízoldható immunstimuláns glikoproteinek Klebsiella pneumoniae-ből történő előállítására.

Klebsiella pneumoniae-ből kivont glikoproteineket néhány francia szabadalmi leírás, így például a 2 043 475, 2 088 112 és 2 171 907 számú ismertet.

A találmány közelebbről 20-35% fehérjét, 50-70% neutrális aldózokat, 3-8% glükuronsavat és 1,5-3% aldózaminokat tartalmazó, 100 000 daltonnái nagyobb molekulasúlyú, Klebsiella pneumoniae-ből extrahált új vízoldható immunstimuláns glikoproteinek előállítására vonatkozik.

Neutrális aldózokként előnyösen neutrális hexózokat, például glükózt, inannózt és galaktózt használunk.

A találmány szerinti eljárással kapott glikoproteinek molekulasúlyát ultracentrifugálással határozzuk meg, s három olyan frakciót kapunk, melyek molekulasúlya 100 000 daltonnái nagyobb.

A találmány szerinti glikoproteineket különböző Klebsiella pneumoniae törzsekből állíthatjuk elő, előnyösen a Pasteur Intézetben 52 145 számon letétbe helyezett törzset használjuk.

E glikoproteinek szerkezetének vizsgálatát, összetételének meghatározását kémiai módszerekkel, előnyösen az uronsav-részek karbodiimides redukciójával, permetilezéssel, uronos lebontással, perjódos oxidációval vagy króm-oxiddal végzett oxidációval végezzük.

A találmány szerinti előnyös glikoproteinek kb. 30%-ban savanyú aminosavat tartalmaznak. Savanyú aminosavat kifejezés alatt például aszparaginsavat vagy glutaminsavat értünk.

A találmány szerinti előnyös glikoproteinek poliszacharid frakciója 1 mól glükózra vonatkoztatottan kb, 1 — 1,5 mól mannózt, 1 — 1,5 mól glükuronsavat és 2—2,5 mól galaktózt tartalmaz.

A találmány szerinti új vízoldható glikoproteineket olyan módon állítjuk elő, hogy a lizált Klebsiella pneumoniae kultúrák extraktumából dialízist alkalmazó szűréssel kapott glikoprotein oldatot egy kvaternerammónium-sóval kezeljük, a felülúszó folyadékot a kivált anyagtól elkülönítjük, majd a felülúszót — mely a glikoprotein sóoldata — hidegen egy kis molekulasúlyai alkanollal kezeljük. Az így kapott újonnan kivált anyagot vízben feloldjuk, s adott esetben dializáljuk, majd liofilizáljuk.

Az eljárás kiindulási anyagaként különböző glikoprotein oldatokat használhatunk, melyeket lizált Klebsiella pneumoniae kultúrákból egy bizonyos molekulasúlynak megfelelő vagy ennél nagyobb molekulasúlyú molekulák visszatartására képes kalibrált membránpórusokon (melyet a pórusállandóval jellemezünk) történő dialízist alkalmazó szűréssel kapunk.

Szűrőmembránként például a kereskedelemben kapható AMICON XM50, PM30 és UM2 típusokat, előnyösen a 100 000 dalton retenciós küszöbértékkel jellemezhetőket, mint amilyen például az AMICON XM100 vagy Π1Ρ100 típusú, különösen előnyösen a 300 000 daltonnái nagyobb molckulasúlyú molekulák visszatartására képes típusokat, így például az AMICON és ROMICON XM300-zal kezdődő típussorozatokat használjuk.

A megfelelő membrán kiválasztásával a dialízist alkalmazó szűrés folyamán az oldatban lévő, az adott molekulasúlynál nagyobb molekulasúlyú molekulákat — a kívánt retenciós küszöbérték függvényeként - elkülönítjük. Nyilvánvalóan az azonos minőségű, más mód2 szerekkel kapott — például polimerizált hidrofil gélen kromatografált - egyéb oldatok is megfelelőek.

Az elkülönítési műveletet megelőzően előnyös, ha a zsírokat és nukleinsavakat eltávolítjuk.

A kiindulási glikoprotein oldatokat előnyösen a 2 043 475 sz. francia szabadalmi leíráshoz benyújtott 2 171 907 sz. második pótszabadalmi bejelentés szerinti eljárás alapján kapjuk. E pótszabadalmi bejelentés szerint a glikoproteinek molekulasúlyát gélkiszorításos módszerrel határozzuk meg.

Kvaterner-ammónium-sóként - mellyel a kiindulási glikoprotein oldatot kezeljük - például cetil-piridilammónium-kloridot, előnyösen trimetil-cetil-ammónium-bromidot (Cetavlont) használunk.

A kvaterner-ammónium-sóval végzett kezelést követően kapott csapadékot a felülúszótól szokásos módszerekkel, például dekantálással vagy szűréssel, előnyösen centrifugálással különítjük el.

A felülúszót ezután hidegen, kb. 4 °C hőmérsékleten kis molekulasúlyú alkanollal, például metanollal, etanollal, n-propanollal vagy izopropanollal kezeljük. Előnyösen etanolt használunk. Különösen előnyösen egy térfogatú sóoldatra vonatkoztatottan 4 °C hőmérsékleten éjjelen át hat térfogatrész etanollal végezzük a kezelést.

A kivált anyagot vízben ismét feloldjuk, s tisztítás céljából dializáljuk. A dialízist például kollodium vagy cellulóz membránnal határolt standard dializáló egységgel végezzük. Előnyösen regenerált cellulóz membránú egységeket használunk, melynek közepes pórusátmérője kb. 24 A, és így a 12 000-14 000 daltonnái nagyobb molekulasúlyú anyagokat visszatartja, különösen előnyösen VISKING csöveket használunk.

A dialízissel a glikoproteines oldatból a kis molekulasúlyú szennyezéseket, például az alkanol-nyomokat távolíthatjuk el.

Természetesen, ha a dialízises tisztítást nem végezzük el, valamivel kevésbé tisztán kapjuk a találmány szerinti glikoproteineket.

A liofilizálást a szokásos módszerekkel, például közepes méretű fagyasztó-szublimáló berendezésben, például SMU vagy SMRG típusú készülékekben (Usifroid Co.) vagy nagyméretű liofilizátorokban, például CA1 fagyasztóban és SMIRS szublimálóban (Usifroid Co.) végezzük. Kisebb méretű, laboratóriumi készüléket, például Sérail Co. készülékeit is használhatunk.

A találmány szerinti eljárást előnyösen az alábbi módon végezzük:

— kvaterner-ammóniumsóként cetil-trimetil-ammónium-bromidot használunk;

— a felülúszót centrifugálással különítjük el;

— kis molekulasúlyú alkanolként etanolt használunk.

A találmány szerinti glikoproteinek előnyös farmakológiái tulajdonságokkal rendelkeznek, így különösen kedvezőek immunstimuláns sajátságaik, valamint tolerabilitásuk. A továbbiakban a kísérleti részben ismertetett példákkal illusztráljuk azokat a farmakológia! tulajdonságokat, melyek alapján a találmány szerinti glikoproteineket gyógyászati hatóanyagként használhatjuk.

A találmány szerinti gyógyászati kompozíciókat például humán és állatgyógyászatban baktériumok vagy vírusok által okozott infekciók megelőzésére, paraziták okozta megbetegedések, toxikus, valamint klinikai és sebészeti beavatkozásokat követő infekciók kezelésére használjuk.

Az alkalmazott dózis a humán gyógyászatban — a

-2185 315 hatóanyagtól, a kezelt személytől és betegségtípusoktól függően - orális és rektális adagolás esetén naponta 1—15 mg, parenterális adagolás esetén pedig naponta 0,2-5 mg.

A találmány szerinti glikoproteineket így gyógyászati kompozíciók hatóanyagaként használjuk.

A hatóanyagokat az emésztőrendszeren keresztül, parenterálisan vagy lokálisan alkalmazhatjuk.

Gyógyászati kompozíciókként például a humán gyógyászatban szokásos szilárd vagy folyékony kompozíciókat, például cukorral bevont vagy bevonat nélküli tablettákat, granulátumokat, oldatokat, szirupokat, kúpokat, injektálható, adott esetben liofilizált kompozíciókat, hüvelykúpokat, krémeket, cseppeket, kenőcsöket, lemosókat, szemcseppeket, aeroszolokat használunk, melyeket a szokásos módszerekkel készítünk el.

A kompozíciókban töltőanyagként - melyet a hatóanyag(ok)on kívül a kompozíció tartalmaz — a gyógyszertechnológiában szokásosan használt anyagokat, például talkumot, gumiarábikuinot, laktózt, keményítőt, magnézium-sztearátot, kakaóvajat, vizes és nem-vizes hordozóanyagokat, állati vagy növényi zsírokat, paraffinszármazékokat, glikolokat, különböző nedvesítő, diszpergáló vagy emulgeáló ágenseket, valamint tartósító szereket használunk.

A találmányt az alábbi példákkal világítjuk meg, közelebbről az oltalmi kör korlátozása nélkül.

1. Példa

A 2 171 907 sz. francia szabadalmi leírás 1. példája szerinti tennék 20 g-ját 2 1 ioncserélt vízben feloldjuk. Ezután 1,61 3 %-os Cetavlont adunk lassan hozzá, és 1 órán át keverjük, majd 10 000 f/perc (rpm) fordulatszámmal 15 percen át centrifugáljuk. A csapadék eltávolítása után az elkülönített felükíszóhoz 15 perc alatt 31 95 %-os alkoholt adunk. Ezután 1 órán át keverjük és 10 000 f/perc fordulatszámmal 15 percen át centrifugáljuk. Az így kapott felülúszót eltávolítjuk és a csapadékot 11 vízben feloldjuk, majd Visking csőben ioncserélt vízzel szemben 4 °C hőmérsékleten dializáljuk. A dialízis végén az oldatot liofilizáljuk. így 7,12 g várt terméket kapunk.

A kapott termékjellemzői a következők:

— neutrális áldozok: 57,77%, kénsavas rezorcinmódszerrel meghatározva (Tíllmanns J. és Philippi K., Biochem. Z., 215, 36 (7, 16), 1929, módosította: Rimington, C. Biochem. J., 25, 1062 (8) 1931);

— aldózaminok: 1,75%, meghatározás módosított módszerrel (Elsőn L. A. és Morgan W. T, J., Biochem. 1.,27, 1824(9, 15), 1933);

— uronsavak: 6,83%, kénsavas karbazol módszerrel meghatározva (Dische, Z., J. Bioi. Chem., 167, 189 (9, 15), 1947);

— összetétel a glükózmaradékok alapján számítva: galaktóz 2,04, mannóz 0,61, glükóz 1. Á meghatározást gázkromatográfiásán végeztük oly módon, hogy szilikonon meghatároztuk a trifluor-acetilezett metil-glikozidokat, melyeket úgy kaptunk, hogy a glikoproteineket metanolízisnek vetettünk alá 0,5 n metanolos sósavval, majd trifluor-acetileztük trifluor-ecetsav és diklór-metán 1:1 arányú elegyével [Zanetta és munkatársai: J. duómat. 69, 291 (1972)];

— molekulasúly ultracentrifugálással való becslés útján: 3 csúcs, ülepedési állandó: 0,94 · 10~¹³ ± 5 %.

2. Példa

A 2 171 907 sz. francia szabadalmi leírás 1. példa szerinti termék 20 g-ját 1 1 ioncserélt vízben feloldjuk. Ezután keverés közben 0,800 1 3 %-os Cetavlont adunk hozzá és 1 órán át keverjük, majd 10000 f/perc fordulatszámmal 15 percen át centrifugáljuk. A csapadék eltávolítása után az elkülönített felülúszó hoz 1,5 1 95 %-os etanolt adunk és 1 órán át keveqük, majd 15 percen át 10 000 f/perc fordulatszámmal centrifugáljuk. A felülúszót elkülönítjük, és 0,5 1 vízben felvesszük a csapadékot. Ezután 4 °C hőmérsékleten ioncserélt vízzel szemben Visking csőben 48 órán át dializáljuk.

A dialízis végén az oldatot liofilizáljuk, és így 6 g várt glikoproteint kapunk.

3. Példa

Tabletta kompozíció előállítása — 1. példa szerinti glikoprotein 5 mg

- töltőanyag 100 mg-os tabletta végsúly eléréséig (töltőanyagként laktózt, keményítőt, talkumot és magnézium-sztearátot használunk)

4. Példa

Kenőcs kompozíció előállítása

- 2. példa szerinti glikoproteinek 200 mg — töltőanyag 100 g-os végsúly eléréséig

Farmakológiai rész

A, Immunstimuláns és mitogén hatás vizsgálata

Tíz egérből álló csoportoknak állatonként íntraplantárisan 40 pg vizsgálandó anyagot és 40 pg szarvasmarha szérum albumint adunk. Tíz nap múlva intravénásán letalitást és sokkot nem okozó dózisban (állatonként 100 pg-ot) szérum albumint adunk. A kontroll állatok az injekcióban csak szérum albumint kapnak.

Az immunstimuláns hatást az anafilaktikus sokk válaszreakció növekedése alapján, a mitogén hatást az injekciós pontnál lévő ganglionkivezetések súlynövekedése alapján határozzuk meg.

Immunstimuláns hatás

A szérum albumin intravénás beadása után 2 órával a pusztulások és a sokkos állapotban — melyet az orr cianózisával kísért nehéz légzés, a hátsó féltekék paralízise, konvulziók és pusztulás jellemez - lévő állatok számát meghatározzuk.

Eredmények:

A vegyület példaszáma	A sokkos állatok száma (%)	Pusztulások száma (%)
1	50	20
2	50	30
kontroll	0	0

-3185 315

Mi fogén hatás:

A szérum albumin intravénás beadása után 2 órával a túlélő állatokat leöljük és a térdhajlati ganglionokat - melyek az injekció helyénél a lábat kivezetik - eltávolítjuk és súlyukat megmérjük.

A mitogén hatást a vizsgált vegyülettel kezelt állatok és a csak szérum albumint kapott kontroll állatok ganglionjai közepes súlyértékeinek arányával jellemezzük. Eredmények:

A vegyület peldaszáma	Index
1	6,2
2	5,0

A kapott eredmények alapján az 1. és 2. példa szerinti vegyületek igen jó immunstimuláns és mitogén hatással rendelkeznek.

B. A nem-specifikus védőrendszer stimulálása

E hatást a Halpern által kidolgozott szén-clearence teszt alapján jellemezzük, mely szerint kolloid szén szuszpenziót injektálunk az állat szemüregébe és az idő függvényében optikai sűrűség-méréssel a szén vérbe való bejutásának kinetikáját meghatározzuk.

A vizsgált vegyületeket 24 és 48 órával a teszt előtt intraperitoneálisan adagoljuk. Az eredményeket a szénrészecskék eliminációjának százalékában adjuk meg, kontrollként a csak kolloidális szénrészecskéket kapott állatok esetén a szénrészecskeszámot 100%-nak véve.

Eredmények:

A vegyület példaszáma	Dózis (mg/kg)	40 Kontrolihoz viszonyított hatás, (%) 8 perccel az 30 perccel az injekció után injekció után
1	0,25	50 70 ⁴⁵
2	0,25	60 70

Fentiek alapján a szervezet védekezését a két vegyület stimulálja. f,0

C. Akut toxieitás

Behrens és Karber módszerével egereken intraperitoneális adagolással határozzuk meg az 50 %-os pusztu- 55 lást okozó dózis (LD_S0) értékeket.

Az 1. és 2. példa szerinti vegyületek esetén LD₅₀ = = 30 mg/kg.

D. Tolerancia

Az 1, és 2. példa szerinti vegyületek 1000 γ/kg dózisban való 0,2 ml-es szubkután injekciója egereken semmiféle helyi vagy általános intoleranciát nem okoz.

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Eljárás 20-35% fehérjét, 50—70% neutrális 15 aldózokat, 3—8 % glükuronsavat és 1,5—3% aldózaminokat tartalmazó 100 000 daltonnál nagyobb molekulasúlyú, Klebsiella pneumoniae-ből extrahált vízoldható immunstimuláns glikoproteinek előállítására, azzal jellemezve, hogy Klebsiella pneumoniae kultúra lizátum

20 extraktumának dialízist alkalmazó szűrésével kapott glikoprotein oldatát egy kvaterner ammónium vegyülettel kezeljük, a felülúszót - mely a glikoproteinsóoldata - a kapott csapadék elkülönítése után hidegen kis molekulasúlyú alkanollal kezeljük, és az így kapott

25 csapadékot vízben ismét feloldjuk, kívánt esetben dializáljuk, majd liofilizáljuk.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatositási módja, azzal jellemezve, hogy — kvaterner ammónium vegyületként cetil-trimetil30 ammónium-bromidot használunk;

— a felülúszót centrifugálással különítjük el;

— kis molekulasúlyú alkanolként etanolt használunk.
3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás foganatosí35 tási módja, azzal jellemezve, hogy a glikoproteineket a Pasteur Intézetben 52 145 számon letétbe helyezett törzsből extraháljuk.
4. Az 1., 2. vagy 3. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a fehéqefrakció 30% savanyú aminosavat tartalmaz.
5. Az 1., 2., 3. vagy 4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás foganatositási módja, azzal jellemezve, hogy a poliszacharid frakció 1 molekula glükózra vonatkoztatottan 1-1,5 molekula mannózt, 1 — 1,5 molekula glükuronsavat és 2-2,5 molekula galaktózt tartalmaz.
6. Eljárás baktérium és vírusellenes hatású gyógyászati kompozíció előállítására, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként az 1. igénypont szerinti glikoproteint a gyógyszerkészítésben szokásos vivőanyagokkal és kívánt esetben segédanyagokkal összekeverjük.
7. Eljárás baktérium és vírusellenes hatású gyógyászati kompozíció előállítására, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként a 3-5. igénypontok bármelyike szerinti glikoproteint a gyógyszerkészítésben szokásos vivőanyagokkal és kívánt esetben segédanyagokkal összekeverjük.