HU179655B

HU179655B - Process for improving interferon-production

Info

Publication number: HU179655B
Application number: HU78WE579A
Authority: HU
Inventors: Michael D Johston
Original assignee: Wellcome Found
Priority date: 1977-07-15
Filing date: 1978-07-14
Publication date: 1982-11-29
Also published as: IL55143A0; CA1115209A; DK316978A; AU524099B2; DK147625B; IT7850322A0; JPS5646797B2; PL208407A1; DE2860559D1; FI60971B; ATA510378A; US4216203A; EP0000520B1; JPS5420119A; FI782249A; IT1107573B; PL110704B1; AT362334B; EP0000520A1; DK147625C

Description

Eljárás interferon termelés fokozására

2

A találmány tárgya eljárás interferon termelés fokozására, amelynek során epitlieliális vagy limphoblastoid sejtek tenyészetéhez interferon termelés megindítására alkalmas gerjesztő szert adagolunk.

Az eljárást oly módon végezzük, hogy a sejteket gerjesztés előtt 0,1—10 mmól mennyiségben egyenes szénláncú, 2—8 szénatomos, telített karbonsavat vagy annak sóját tartalmazó közegben inkubáljuk.

Az interferon olyan, nem specifikus vírusellenes hatású fehérjeszerű anyag, amely a sejtekben képződik vírus vagy más gerjesztő szer hatására. A legtöbb sejt képes interferon termelésére, fgy például a fehérvérsejtek, a kötőszöveti sejtek, a limphoblastoid-sejtek, az epitheliális típusú sejtek, igy a vesesejtek vagy HeLasejtek, myeloma-sejtek stb. Az interferon termelésre kiválasztott sejttípus az előállítani kívánt terméktől függ, mivel az interferonoknak származásuktól függő jellegzetes tulajdonságaik vannak. Ha az interferont humángyógyászatban kívánják hasznosítani, akkor erre a célra az emberi sejt a legalkalmasabb forrás. Képződése után az interferon a sejtből kiválasztódik, képes más sejtekkel kölcsönhatásba lépni és ezáltal megakadályozza a vírusok szaporodását vagy más hatást fejt ki. Ez a vírusellenes hatás nem specifikus egyes sejtekre, jóllehet bizonyos vírusok érzékenyebbek 25 az interferonok behatására, mint más vírusok.

Az interferont felhasználják kemoterápiás területen bizonyos rákbetegségek kezelésére. Kedvező hatásukról tudósit a szakirodalom (H. Strandéi, K. Cantell és munkatársai, Fogargty Intem. Center Proc., U.S.

Govt. Printing Office, Washington, D.C., 28; 377—381 pp, 1977. Előadás a National Institute of Hcalth, Bethezda, 1974. dec. 9—11. konferenciáján).

A humán interferon kinyerésére három fő forrást 5 jelölnek meg, amelyből jelentősebb mennyiségű anyag nyerhető, ez pedig a humán perifériás vérleukocyták, a humán kötőszövet sejtek és a humán lymphoblastoid sejtek. Ennek ellenére ez idáig rendkívül nehéz feladatot jelentett standard minőségű klinikai célra hasz10 nálható humán interferon előállítása nagyobb menységben. így például a humán periferikus vérleukocyták felhasználása interferon kinyerésére azért korlátozott, mivel az emberi vérsavó csak korlátozott mértékben áll rendelkezésre. A kötőszövetből kinyerhető nagyobb 1.5 mennyiségű interfeion képződését az gátolja, hogy ezek a sejtek csak felülethez tapadva fejlődnek. A lymphoblostoid sejteknek az az előnye, hogy nagyobb mennyiségben szuszpenziós kultúrában szaporíthatok és interferon termelésre serkenthetők vírus behatására. 20 A humán lymphoblastoid felhasználása interferon kinyerésére ismert módon úgy történhet, hogy a sejtszuszpenziót homológ fajtából származó kisebb menynyiségű interferonnal kezelik azzal a céllal, hogy azt interferon termelésre serkentsék. Az interferon termelés megindul akkor, ha a sejtszuszpenzióhoz gerjesztő vírust adagolnak (v. ö. Strander, H. és munkatársai, J. Clin. Micro., 1, 116—117. oldal, 1975).

A tapasztalat szerint a humán limphoblastoid sejtekből kinyerhető interferon mennyisége jelentős mér30 tékben ingadozik, így például a hozam 1 literre szá179655 mítva 60—80 mega-egység lehet (1 mega-egység 10⁶interferon egységnek felel meg a Medical Research Council standard interferon előállitásmódja szerint, 69/19, v. ö. Finter, N. Interferons, 1973, 485 -486 o., North Holland). Ez a koncentráció 10⁹ sejtre számítva 30 —40 mega-egyscgnek felel meg. Más esetekben a koncentráció 1 literre számítva csak 1 mega-egység vagy ennél is kevesebb (vagy 10⁹ sejtre számítva 0,5—0,7 mega-egység), és pedig hasonló sejteket és gerjesztő körülményeket és csaknem azonos termelési feltételeket figyelembevéve. Az interferon hozamingadozása pontosan meg nem magyarázható jelenség.

Interferon termeléssel foglalkozik az 1 464 939 számú nagy-britanniai szabadalmi leírás is. Azonban az ott ismertetett eredmények alapján az interferon hozama meglehetősen alacsonynak adódik. (10-szer kevesebbnek a találmány szerinti megoldással elérhető hozamnál).

Azt találtuk, hogy ha az interferon-termelő sejteket egy karbonsavval vagy annak sójával kezeljük, majd azokat interferon termelésre gerjesztjük, akkor az interferon reprodukálható módon viszonylag magas hozammal nyerhető ki.

A bejelentés szerinti, interferon termelésére alkalmas eljárás, amelynek során az interferontermelő sejtekhez valamely gerjesztő szert adunk, azzal jellemezhető, hogy a sejteket gerjesztésük előtt hatásos, de toxikus mennyiségnél alacsonyabb koncentrációban egyenes szénláncú telített karbonsavat vagy annak sóját tartalmazó közegben inkubáljuk.

Az interferon termelésre a sejteket a követelményeknek megfelelően választjuk meg, így például ha az interferont humán célokra kívánjuk hasznosítani, akkor humán-sejteket választunk. A sejtek epitheliális vagy lymphoblastoid-sejtek lehetnek, így Namalva-sejtek vagy más lymphoblastoid-sejtvonalak. Lymphoblastoid-sejtvonalak, amelyek tenyészetben sorozatban szaporíthatok, származhatnak perifériás humán vérleukocyták tenyészeteiből ismert módon [v. ö. Hope, J. H., Horné, Μ. K., Scott, W., Int. J. Cancer, 3, 857—866. o. (1978), Hope, J. H., Horné, Μ. K., Scott, W., Int J. Cancer, 4, 255—260. o. (1969), Chang, R. S., Golden H. D„ Natúré, 234, 359—360. o. (1971)]. Ennek megfelelően a leukoeyták normál vagy megbetegedett személyektől nyerhetők és származhatnak „spontán”, ha a sejtek már fertőzöttek Epstein-Barr vírussal (EBV); EBV-val nem fertőzött leukoeyta tenyészetből is nyerhetők, például ha olyan köldökzsinórból származó vérleukocytákat tenyésztünk, amelyhez mononucleosis infectiosa-t vagy Burkitt lymphoma eredetű EBV-t adagolunk.

Lymphocyta sejtvonalat Burkitt-lymphomában megbetegedett páciensek sejtjeiből vehetjük, mivel ezek már EBV-vel fertőzöttek. Egy bizonyos Namalvasejtvonalat Stockholmban Kiéin, G. professzor fejlesztett ki [Kiéin, G., Adams, A., Dombon, L., Int. J. Cancer, 12, 396—408. o. (1973)]. Ezt a sejtvonalat Namalva elnevezésű afrikai lánygyerek sejtjeiből tenyésztették ki. Ez a sejttörzs megfelelő stimuláló hatásra nagyobb mennyiségű interferon termelésre képes [Strander, H., Morgensen, K. E., Cantell, K., .1. Clin. Micro., I, 116—117. o. (1975)]. E sejtvonal másodlagos tenyészetét 1975-ben dr. Gresser Ion professzor (Villejuif, Franciaország) nyerte ki. A sejtvonalat 10% foetális borjúvéisavót tartalmazó RMPI 1640 közegben való szaporodásra adaptálták. A laboratóriumban tenyésztett sejteket ugyanilyen összetételű, de 5—7% 6—8 hónapos boíjúvérsavó adalékot tartalmazó közegben való szaporodásra adaptálták, majd kétszerháromszor hetente — 18 hónapon keresztül — másodlagos tenyészetben szaporították. Az így előállított és tárolt sejttenyészetet Naraalva/WRL tenyészetnek nevezik, ampullákban tárolják cseppfolyós nitrogénnel hűtve. Ezek a sejtek mycoplasmás fertőzéstől mentesek és a törzs az ATCC (American Type Culture Collection) törzsgyűjteménybe letételre került.

A következő példákban Namalva/WRL sejteket alkalmazunk. A találmány azonban felhasználható egyéb Namalva-sejtvonalak vagy egyéb lymphoblastoid sejtek alkalmazásával is.

A tenyészközegben használt karbonsav előnyösen 2—8, célszerűen 3—6 szénatomos, legelőnyösebben vajsav. Ha magát a savat használjuk, akkor a különböző szervetlen vagy szerves sókat tartalmazó tenyészközegben rendszerint a sav sója képződik. Alternatív módszer szerint lehetséges az is, hogy karbonsav sóját adjuk a tenyészközeghez, ilyen esetben nátrium-, kálium- vagy ammónium-sót alkalmazunk.

Az interferon előállítása céljából az erre a célra kiválasztott sejteket először olyan feltételek mellett tenyésztjük, amely megfelelő és célszerű a szakirodalomban leírt minden egyes sejttípus vagy törzs esetén, így tenyészthetünk humán lymphoblastoid sejteket, így Namalva-scjttörzs esetében a felhasznált tenyészközeg rendszerint 5—10 térfogatrész vérsavóval, például borjú vagy ló vérsavóval adalékolt RPMI 1640 közeg (Moore, G. E. és munkatársai 1967, J. Amer. Med. Assoc. 199, 519—524.).

Ha az interferont lymphoblastoid sejtek, így Namalva-sejtek felhasználásával termeljük, akkor a sejttenyészetet addig szaporítjuk, amíg a szuszpenzióban megfelelő, például 0,5—lOxlO⁶ sejt/ml koncentráció alakul ki, ezután a sejteket célszerűen felhasználhatjuk interferon termelésére. Ebből a célból a sejtkoncentrációt 0,25—6 x 10⁶ sejt/ml, célszerűen 0,5—3 x 10⁶sejt/ml, kiváltképp pedig 1 x 10⁶ sejt/ml koncentrációra állítjuk be valamely következő közegben:

a) friss tenyészközeg,

b) előzőleg sejttenyésztésre használt és friss tenyészközeggel adalékolt, kimerült tenyészközeg, vagy

c) friss tápanyagokkal felerősített kimerült tenyészközeg.

Ebben a fázisban adagoljuk a karbonsavat vagy sóit, a sejttenyészethez, amelyben 0,1—10 mmól, előnyösen 0,2—5 mmól, kiváltképp pedig 0,5—2,0 mmól végső koncentrációt állítunk be. A karbonsavkoncentrációt a sejtekre gyakorolt toxieitás korlátozza, azonban a karbonsavnak olyan hatásos mennyiségben kell jelen lennie, hogy az interferon termelést fokozza, így ^egy kiválasztott sav esetében optimális egyensúlyt kell beállítani az interferon termelési hozam javulása és a sejtekre gyakorolt toxikus hatás között. Ha karbonsavként tehát nem vajsavat alkalmazunk, akkor az előbbi koncentrációhatároktól eltérő értéket állítunk be. A sejteket ezután a karbonsav alkalmazott koncentrációjától függően 33—38, előnyösen 35—37 °C között 12—72 óra hosszat inkubáljuk. Például humán lymphoblastoid-sejtek Namalva-törzsét 48 óra hosszat 1 mmól vajsavkoncentráció mellett 6,2—7,4, célszerűen 6,6—7,2 pH-érték között inkubáljuk.

A sejteket inkubálás után a karbonsavat tartalmazó közegtől elválasztjuk olyan módszerekkel, amellyel a sejtek nem károsodnak, például centrífugálással vagy szűréssel. Ezután a sejteket ismert módon [Tovey, M. G., és munkatársai Proc. of Soc. fór Exp. Bioi. And Med., 146, 809—815. o. (1974)] megfelelő közegben, ismét szuszpendáljuk és interferon termelésre gerjesztjük. Ilyen módszer például abban áll, hogy a sejteket vérsavótól mentes vagy legfeljebb 5 térfogatrész vérsavóval adalékolt RPMI 1640 közegben ismét szuszpendáljuk, a végső sejtkoncentráció 0,25—8 x 10⁶sejt/ml, előnyösen 0,5—4X10⁶ sejt/ml. Ezután egy megfelelő gerjesztő szert, így egy vírust, például Sendai-vírust adagolunk a sejtszuszpenzióhoz, melynek végső koncentrációját 5—200 HAU/ml (HAU=haemagglutinációs egység),előnyösen 10—50 HAU/ml értékre állítjuk be. Alapos átkeverés után a sejtszuszpenziót 34—37 'C-on 12—48 óra hosszat inkubáljuk. így például 35 °C-on a sejttenyészetet előnyösen egy éjjelen át inkubálhatjuk, eközben interferon szabadul fel a sejtekből és a közegbe megy át. A sejteket inkubálás után centrífugálással eltávolítjuk; a felülúszóban a nyers interferon található.

Ha a sejteket, mielőtt azokat interferon termelésre gerjesztenénk, előzőleg valamely egyenes szénláncú karbonsav vagy annak sója jelenlétében inkubáljuk, akkor viszonylag magas interferon hozam: literenként 5—50 mega-egység vagy ennél nagyobb hozam érhető el. Ez szignifikánsan nagyobb mennyiség, mint a kezelés nélküli értek. Ezenkívül viszonylag alacsony vérsavó adalékanyagot, így 1—2 térfogatrész vérsavót tartalmazó közegben szaporított sejtek ugyanannyi interferont termelnek fenti körülmények között, mint a 3—4-szeres mennyiségű vérsavót tartalmazó közegben szaporított sejtek. Ez a körülmény rendkívül fontos, mivel a vérsavó költsége az interferon termelési költségének egy jelentős részét teszi ki. Ha a sejteket karbonsav jelenlétében inkubáljuk, akkor az a külön előny érhető el, hogy kis mennyiségű homológ interferonnal való beoltási lépés is kiküszöbölhető, ezáltal a termelési költség csökkenthető.

A találmány további részleteit a kiviteli példákban ismertetjük anélkül, hogy az oltalmi kört erre korlátoznánk.

1. példa

Namalva/WRL sejtvonalhoz tartozó humán, lymphoblastoid sejteket szuszpendálunk mechanikailag kevert 10 literes edényben, amely 7% borjúvérsavóval, ncomycinnel és polimyxinnel, valamint a pH szabályozására hidrogcnkarbonáttal kiegészített RMPI 1640 táptalajt tartalmaz. Amikor a sejt-koncentráció 2xl0⁶sejt/ml-re növekszik, akkor 10 liter közeget az edényből eltávolítunk és azt egyenlő térfogatmennyisegu friss tenyészközeggel hígítjuk. Vajsavat adunk hozzá 1 mmól koncentrációban és a vegyületet 37 ^üC-on 48 óra hosszat inkubáljuk. Inkubálás közben a sejteket üveglombikban keverjük, a sejtszuszpenzió és a felette elhelyezkedő levegő térfogatarányát körülbelül 2:5-re állítjuk be.

Az inkubációs periódus után a sejteket 2500 fordulatszám/perc sebességgel 5 percig 20 °C-on MSE

Coolspin centrifugán centrifugáljuk. A kinyert sejttömeget 2°/₀ borjúvérsavót tartalmazó RMPI 1640 közegben ismét szuszpendáljuk és a scjtkonccntrációt megbecsüljük. A sejteket 2,75 x1ο⁶ sejt/ml koncentrációra hígítjuk, majd gerjesztés céljából annyi előtermelt lymphoblastoid interferont adagolunk hozzá, hogy 100 referencia interferonegység/ml koncentráció alakuljon ki. Az interferon képzése és gerjesztése céljából 75 vörösvértcst agglutinációs egység/ml végkoncentrációban Sendai-vírust adagolunk. Alapos átkeverés után a sejtszuszpenziót Thompson lombikba helyezzük (lombikonként 300 ml-t) és 35 °C-on egy éjjelen át inkubáljuk. A következő napon a sejtszuszpenziót 3000 fordulatszám/perc sebességgel 10 percig 4 °C-on Coolspin centrifugán centrifugáljuk. A nyers interferont tartalmazó felülúszót 24 óra hosszat 2 pHértéken tartjuk, majd 4 pH-értéken tároljuk.

A sejtszuszpenzió másik részét a 10 literes edényből az előzőkben ismertetett eljárással teljesen azonos módon kezeljük, azonban vajsavat nem adunk hozzá.

A kontroll és vajsavval kezelt sejtek mintáit interferon tartalom szempontjából megvizsgáljuk. A kapott eredmény a következő:

Kontroll sejtek: 3,75 log_i0 referencia interferonegység/ml, amely 6 mega-egység/liter koncentrációval ekvivalens.

Vajsawal kezelt sejtek: 4,8 log₁₀ referencia interferon-egység/ml, mely 63 mega-egység/liter koncentrációval ekvivalens.

2. példa

Namalva/WRL sejteket az 1. példa szerinti közegben 2,5 x 10⁶ sejt/ml koncentrációban tenyésztünk, majd 10 percig 800 xg gyorsulással centrifugáljuk. A sejtmasszát friss tenyészközegben ismét szuszpendáljuk. A sejtszuszpenziót 1,3 xlO⁶ sejt/ml koncentrációra hígítjuk, 50 ml-es mintákat 75 cm² hasznos területű, műanyagból készült, szövettenyészetre alkalmas lombikokba helyezzük. Minden egyes lombikhoz különböző mennyiségű, foszfáttal pufferolt sóoldatban levő, 100 mmól koncentrációjú nátrium-butirátot adunk, hogy a következő koncentrációk alakuljanak ki: 0, 0,1, 0,2, 0,5, 1, 2 és 5 mmól. A lombikokat 36 °C-on 48 óra hosszat inkubáljuk, majd a sejteket minden egyes lombikban 800xg gyorsulás mellett 5 percig centrifugáljuk. A kapott sejtmasszát 2 térfogati borjúvérsavót tartalmazó RMPI 1640 közegben (fenntartó közeg) ismét szuszpendáljuk 4,3 x1ο⁶ sejt/ml koncentrációra. 10 ml-es sejtszuszpenzió mintákat két-két 25 cm²-es, műanyagból készült szövettenyésztő lombikba helyezünk, ezekhez 40 HAU/ml végső koncentrációban Sendai-vírust adagolunk és ezzel az interferonkepzest megindítjuk.

A lombikokat 20 óra hosszat 36 °C-ra visszahelyezzük. Az egyes tenyészetek által termelt interferont úgy gyűjtjük össze, hogy a sejteket 1000xg gyorsulással 5 percig centrífugálással ülepítjük. Az interferont tartalmazó felülúszót koncentrált sósavval 2,0 pH-értékre állítjuk be és 4 °C-on egy éjjelen át tároljuk. A következő napon 7,0 pH-értéket állítunk be és az egyes minták interferon-tartalmát mérjük. Az eredményeket az I. táblázat tartalmazza.

I. táblázat
A sejtek előkezelésénél alkalmazott nátrium-butirát koncentráció (mmól)	koncentráció (logio referencia interferonegység/ml)	Interferon-hozam rocga-cgység) liter
0	4,09	12
0,1	4,05	11
0,2	4.26	18
0,5	4,62	42
1,0	4,92	83
2,0	4,96	91
5,0	4,70	50

3. példa

A 2. példa szerinti módszert alkalmazzuk interferon előállítására azzal az eltéréssel, hogy nátrium-butirát helyett nátrium-acetátot alkalmazunk a következő koncentrációs értékek mellett: 0, 0,2, 1,0, 5,0 mmól.

A kapott eredmények a II. táblázatban láthatók.

II. táblázat
A sejtek előkezelésénél alkalmazott nátrium-acetát koncentráció (mmól)	Interferon koncentráció (logto referencia interferonegység/ml)	Interferon-hozam megaegység/liter
0	3,55	3,5
0,2	3,52	3,3
1,0	3,59	3,9
5,0	3,98	9,6

4. példa

A 2. példa szerinti módszert alkalmazzuk interferon termelésre, azzal a különbséggel, hogy nátrium-butirát helyett a következő koncentráció értékekben nátriumpropionátot alkalmazunk: 0, 0,5, 1,0, 2,0, 5,0 és 10,0 mmól.

A kapott eredmények a 111. táblázatban láthatók.

III. táblázat

A sejtek előkezelésénél alkalmazott nátrium-propionát koncentráció (mmól)	Interferon koncentráció (logi o referencia interferonegység/ml)	Interferon-hozam megaegyseg'liter
0	3,69	5
0,5	3,71	5
1,0	4,20	16
2,0	4,49	31
5,0	4,05	11
10,0	4,15	14

5. példa

A 2. példában megadott módszert alkalmazzuk interferon termelésre azzal a különbséggel, hogy nátrium-butirát helyett nátrium-pentanoátot alkalmazunk a következő koncentrációértékek mellett: 0, 0,2, 0,5, 1,0, 2,0 és 5,0 mmól.

A kapott eredmények a IV. táblázatban láthatók.

IV. táblázat
A sejtek előkezlésénél alkalmazott nátrium-pentanoát koncentráció (mmól)	Interferon koncentráció (íugio referencia interferonegység/ml)	Interferon-hozam megaegység/liter
0	3,81	6
0,2	3,94	9
0,5	4,26	18
1,0	4,59	39
2,0	4,85	71
5,0	4,37	23

6. példa

A 2. példa szerinti módszert alkalmazzuk interferon termelésre azzal a különbséggel, hogy nátrium-butirát helyett a következő koncentrációban nátrium-hexanoátot alkalmazunk: 0, 0,2, 0,5, 1,0 és 2,0 mmól.

A kapott eredmények az V. táblázatban láthatók.

V. táblázat

A sejtek előkezelésénél alkalmazott nátrium-hexanoát koncentráció (mmól)	Interferon koncentráció (logio referencia interferonegység/ml)	Interferon-hozam megaegység/liter
0	3,20	2
0,2	3,69	5
0,5	3,63	4
1,0	3,80	6
2,0	3,99	10

7. példa

Nátrium-butirátos kezelés következtében kialakult interferon hozam növekedésének visszaesése Namalva/WRL sejteknél 50 ml-es mennyiségű, 1,0 X10⁶sejt/ml koncentrációjú Namalva/WRL sejtszuszpenziót 7 térfogati borjúvérsavót tartalmazó friss RPMI 1640 közegben szuszpendáljuk és a szuszpenziót 75 cm²hasznos területű 5 db szövettenyésztésre alkalmas műanyag lombikba helyezzük. Foszfátpufferes sóoldatban oldott nátrium-butirátot adunk 4 mintához olyan mennyiségben, hogy 1,0 mmól végkoncentráció alakuljon ki. A lombikokat 36 °C-on 48 óra hosszat inkubáljuk. A nátrium-butiráttal nem kezelt cs az 1 mmól koncentrációban nátrium-butiráttal kezelt lombikokban levő sejteket a közegtől lOOOxg gyorsulás mellett 5 percig centrifugálással ülepítjük, majd a sejtmasszát térfogati borjúvérsavót tartalmazó RPMI 1640 közegben ismét szuszpendáljuk 3,0 xlO⁶ sejt/ml koncentrációra. A sejteket interferon termelésre gerjesztjük oly módon, hogy 20 HAU/ml koncentrációban Sendaivírust adunk hozzá. A többi lombikban levő sejtmaszszát összegyűjtjük, 1000xg gyorsulás mellett 5 percig centrifugáljuk, majd nátrium-butirátot nem tartalmazó friss RPMI 1640 tenyészközegben 1,0xlO⁶ sejt/ml koncentrációra ismét felszuszpendáljuk. A sejteket 50 ml-es mennyiségben szövettenyésztésre alkalmas, 75 cm² hasznos területű 3 műanyag lombikban helyezzük, 36 C-on inkubáljuk. Egymást követő napokon egy-egy lombikból származó sejtmasszát 1000xg gyorsulással 5 percig centrifugálunk, majd 2 térfogat% borjúvérsavót tartalmazó RPMI 1640 közegben ismét felszuszpendáljuk 3,0xlO⁶ sejt/ml koncentrációra és az interferon termelést az előbbihez hasonló módon Sandai-vírussal megindítjuk.

A kapott eredmények a VI. táblázatban láthatók.

VI. táblázat

	Butirátkoncentráció (mmól)	Inkubációs napok száma nátrium-butirát jelenlétében	További inkubálási idő butirát távollétébe	Interferon koncentráció logio egység/ml	Interferon hozam megaegység/ liter
1.	0	0	0	4,05	11
2.	1	2	0	4,57	37
3.	1	2	1	4,30	20
4.	1	2	2	3,95	9
5.	1	2	3	3,92	8

8. példa

Interferon termelés nátrium-butiráttal kezelt Cercopitheus aethiop szürke majomvese V3 sejtvonal felhasználásával.

Műanyag szövettenyésztő lombikba, amelynek sejtszaporodásra hasznos területe 25 cm², V3 sejteket helyezünk [Cristofinis G. J., J. Med. Micro., 3, (2), 251—258. o. 1970] 1,5 x1ο⁵ sejt/ml koncentrációban 10 ml 4 térfogat/í foetális borjúvérsavót tartalmazó Eagles-Basal közegbe. [Eagle H.: Proc. Soc. Exp. Bioi, and Med. 89, 362 (1955)]. A lombikokat 24 óra hosszat 36 C-on inkubáljuk, igy a sejtek a műanyagfelülethez tapadnak és elkülöníthetők. A tenyészközeget az egyes lombikokból eltávolítjuk és a sejtekhez 10 ml friss tenyészközeget adunk. Az egyik lombikba foszfátpufferes sóoldatban levő nátrium-butirátot ada-

Claims

golunk, hogy 2 mmól koncentráció alakuljon ki. Mindkét lombikot 36 °C-on 48 óra hosszat inkubáljuk. A tenyészközeget eltávolítjuk és az egyes tenyészeteket 2000 HAU/ml koncentrációjú, 0,5 ml Sendai-vírussal 5 beoltjuk. A lombikokat 36 °C-ra visszahelyezzük, igy a vírus a sejtekkel egyesül. A beoltásra használt anyagot eltávolítjuk és a sejtrétegeket foszfátpufferes sóoldattal egyszer mossuk, majd 10 ml 2 térfogat^ foetális borjúvérsavót tartalmazó Eagles-Basel közegben ismét szusz10 pendáljuk. A lombikokat 36 C-on 24 óra hosszat inkubáljuk, majd a felülúszóból a nyers interferont izoláljuk. Az interferont tartalmazó közeget 2 pH-értéken a szokásos módon feldolgozzuk és mennyiségét mérjük. A kapott eredmények a VII. táblázatban lát15 hatók.

VII. táblázat

20 Interferon koncentráció (logio egység/ml) Interferon-hozam megaegység/liter 1. nátrium-butirát mentes V3 törzs 0,66 0,005 25 2. nátrium-butiráttal kezelt V3 töizs 1,32 0,021

9. példa

Különböző gerjesztő anyagokkal kezelt, nátrium-butirátot tartalmazó Namalva/WRL sejtek interferon hozamának növelése.

Namalva/WRL sejteket kimerült tenyészközegböl ülepítjük és 7 térfogat”/, borjúvérsavót tartalmazó friss RPMI 1640 közegben 1,38XlO⁶ sejt/ml koncentrációra ismét felszuszpendáljuk. 2 db 1 literes üvegedénybe 500 ml szuszpenziót helyezünk és az egyik 40 tenyészethez annyi foszfátpufferes sóoldatban levő nátrium-butirátot adunk, hogy 1 mmól legyen a végkoncentráció. A tenyészeteket 36 C-on 48 óra hosszat keverjük. A sejteket centrifugálással elkülönítjük és 2 térfogat/, borjúvérsavót tartalmazó RPMI 1640 közegben 5,0 x 10⁶ sejt/ml koncentrációra ismét szuszpendáljuk. A sejtkészitményekből 10 ml-es részmennyiségeket kiválasztott gerjesztő anyagokkal kezelünk. A vírussal kezelt tenyészetek felülúszóiból az interferon hozamot megvizsgáljuk a szokásos 2 pH-értéken tör50 ténő feldolgozás után. A kapott eredmények a VIII. táblázatból láthatók.

VIII. táblázat

Koncentráció Butiráttal előkezelt sejtek Interferon koncentráció logio egység/ml Interferon-hozam megaegység/liter 1. Sendai vírus 40 HAU/ml 3,71 5 2. Sendai vírus 40 HAU/ml + 4,56 36 3. „Newcastle” betegség vírusa 20 HAU/ml — 2,45 0,3 4. „Newcastle” betegség vírusa 20 HAU/ml 3,19 2 5. „Semliki Forest” vírus 10 pfu*/cell — 0,72 0,005 6. „Semliki Forest” vírus 10 pfu*/cell T 1,22 0,02

Koncentráció Butíráttal előkezelt sejtek Interferon koncentráció íoglO egység/ml Interferon-hozam megaegység/liter 7. poliribóz-sav poliribocitidil sav-komplex: DEAE-dcxtrán 100 pg 0,92 0,008 8. poliribóz-sav poliribocitidil sav-komplex: DEAE-dextrán 100 pg + 1,66 0,05

Poliribóz-sav—poliribocitidil-sav-komplex: P—L Biochemicals Inc. gyártmánya Lót. No. 447121. * pfu=rétegképző egységek

10. példa

Interferon hozam növelése vajsavas kezeléssel Namalva/WRL sejtekkel, amelyeket kevesebb vérsavót tartalmazó közegben tenyésztünk.

Normál feltételek mellett 7% borjúvérsavót tartalmazó RPMI 1640 közegben tenyésztett Namalva/WRL sejteket csak 2 térfogati borjúvérsavót tartalmazó közegben tenyésztés céljából adaptálunk. A tenyészetek sejtkoncentrációja rendszerint 1,5—2,0 x1ο⁶ sejt/ml.

Két tenyészetből mintát veszünk, (1,67 és 2,5 x1ο⁶sejt/ml koncentrációval) és felére hígítjuk friss tenyészközeggcl. Mindegyik tenyészethez 1 mmól koncentrációban vajsavat adunk és a két tenyészetet 37 °C-on 48 óra hosszat keverjük.

A vajsavas kezelést követően a sejteket interferon termelésre gerjesztjük. Kontroll gerjesztéseket is végzünk két olyan sejtminta felhasználásával, amelyeket vajsavval nem kezelt tenyészetből veszünk. Ezeket természetesen korábban 2 napig normál tenyészkőzegben tenyésztettük. Mind a vajsavval kezelt, mind a kontroll sejttenyészetet centrifugáljuk és 2,75 x 10⁶ sejt/ml koncentráció mellett friss közegben újra szuszpendáljuk. 50 HAU/ml koncentrációban Sendai-vírust adunk hozzá és a tenyészeteket 35 °C-on egy éjjelen át inkubáljuk.

A tenyészetekből kinyerhető interferon hozam a következő:

Kontroll (vajsavval nem kezelt): log₁₀3,45 és 3,46 ml 3 mega-egység/liter;

vajsawal kezelt sejtek: log_l04,69 és 4,82 ml átlagosan 30 58 mega-egység/liter.

A kiadásírt felel: a Közgazdasági és Jogi Könyvkiadó igazgatója

83.580.66-4 Alföldi Nyomda, Debrecen — Felelős vezető: Benkő István igazgató