DK147625B - Fremgangsmaade til fremstilling af interferon - Google Patents

Description

147625

Opfindelsen angår en fremgangsmåde til fremstilling af de stoffer, der betegnes som interferoner, som har uspecifik antiviral virkning.

Et interferon er et antiviralt proteinstof eller proteinhol-digt stof, der dannes af en celle i respons på en af et virus eller andet induktionsmiddel udøvet stimulans. Interferoner kan dannes af de fleste celler, f.eks. hvide blodceller, fibroblaster, lymphoblast-celler, celler af epitheltypen, såsom nyreceller eller HeLa-celler, rayelomceller etc. De specielle celler, der vælges til dannelse af interferon, vil afhænge af, hvilket produkt der ønskes, eftersom interferoner har egenskaber, som afhænger af den vært, fra hvilken de er opnået. Hvis der ønskes interferon til anvendelse i mennesker, 2 147625 foretrækkes humane celler. Når interferonet er dannet, udskilles det fra cellen og kan derpå indvirke på andre celler til hæmning af virus-replikation eller til frembringelse af andre virkninger. Den antivi-rale virkning er ikke specifik over for specielle vira, selv om nogle vira er mere følsomme over for indvirkning af interferoner end andre.

Interferon er også blevet anvendt kemoterapeutisk til behandling af visse typer cancer og synes at have en gunstig virkning (H. Strander, K. Cantell et al. i "Fogargty Intern. Center Proc.", U.S. Govt. Printing Office, Washington D.C., 28, side 377-381, 1977. Præsenteret ved konferencen på National Institute of Health, Bethezda, 9. til 11. decmeber, 1974).

Der er beskrevet tre hovedkilder for betydelige mængder af humant interferon, nemlig humane perifere blod-leukocyter, humane fibrcfolaster og humane lymphoblastceller. Imidlertid har det indtil videre været vanskeligt at producere betydelige mængder af humant interferon af en standard, som er egnet for klinisk anvendelse. Eksempelvis er fremstilling af interferon ud fra humane perifere leu-kocyter begrænset af den mængde, hvori humant blod står til rådighed. Fremstilling af interferon i stor målestok ud fra fibroblaster hæmmes af den omstændighed, at disse celler kun vil vokse, når de klæber til en overflade. Lymphoblastceller har den fordel, at de kan vokse i store suspensions-kulturer og kan induceres til dannelse af interferon ved behandling med et virus.

Ved én af de fremgangsmåder, som er beskrevet til fremstilling af humant lymphoblast-interferon, behandles en cellesuspension med en lille mængde interferon fra den homologe art med det formål at sætte cellernes interferon-produktion i gang. Denne igangsætning efterfølges af tilsætning af et inuuktions-virus (se H. Strander et al. i "J. Clin. Micro.", 1, side 116-117, 1975).

Det har vist sig, at mængden af interferon, som dannes af humane lymphoblastceller ved sådanne fremgangsmåder, kan variere betydeligt. F.eks. kan der opnås så store koncentrationer som 6-80 mega-enheder (en megaenhed er lig med 10^ enheder interferon i overensstemmelse med den af Medical Research Council angivne research-stan-dardfremstilling af interferon, 69/19, se N. Finter "Interferons", 1973, side 485-486, udgivet af North Holland) interferon pr. liter svarende til udbytter på 30-40 megaenheder pr. 10 celler. I andre tilfælde kan det ske, at der kun opnås koncentrationer på 1 megaenhed 9 eller mindre pr. liter (eller 0,5 til 0,7 megaenheder pr. 10 celler) 147625 3 ud fra lignende celler induceret, eller stimuleret, under tilsyneladende identiske betingelser. Årsagerne til sådanne variationer i udbyttet af interferon er ukendte.

Det har nu vist sig, at der ved behandling af celler, ud fra hvilke interferon skal fremstilles, med en ligekædet, mættet carboxylsyre ellet et salt deraf og påfølgende induktion af cellerne til interferondannelse kan opnås vedvarende, relativt høje udbytter af interferon.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen til fremstilling af interferon er således af den art, ved hvilken der sættes et induktionsmiddel til celler, som kan induceres eller stimuleres til dannelse af inter-ron, og fremgangsmåden er ejendommelig ved, at cellerne inden induktionen inkuberes i et medium indeholdende en effektiv, ikke-toksisk mængde af en ligekædet, mættet carboxylsyre eller et salt deraf.

De til interferonfremstillingen benyttede celler vælges efter den påtænkte anvendelse af interferonet. Hvis interferonet således er til human indgivelse, vælges der sædvanligvis humane celler. Cellerne kan være epithelceller eller lymphoblastceller, såsom Namalva-celler eller lymphoblast-cellelinier. Linier af lymphoblastceller, som kan propageres i seriekultur, kan let opnås fra kulturer af perifere humant blod-leukocyter ved velkendte fremgangsmåder (se eksempelvis J.H.Hope, M.K.Horne, W. Scott "Int. H. Cancer", 3, side 857-866 (1978), J.H.Hope, M.K.Horne, W. Scott "Int. J. Cancer", 4, side 255-260 (1969), R.S.Chang, H.D.Golden "Nature", 234, side 359-360 (1971)). I overensstemmelse hermed kan leukocyterne fås fra sunde eller syge individer, og de kan udvindes "spontant", hvis cellerne allerede er inficerede med Epstein-Barr-virus (EB V), eller de kan udvindes fra kulturer af leukocyter, som ikke er inficerede med EBV, f.eks. navlestreng-blodleukocyter, hvortil der er sat EBV hidrørende fra infektiøs mononucleose eller Burkitt's lymfom.

Lymphoblastcelle-linier fås let fra celler fra patienter med Burkitt's lymfom, da disse allerede er inficerede med EBV. En speciel linie af Namalva-celler er blevet opnået i Stockholm af professor G. Klein (O. Nyornoi, G. Klein, A. Adams, L. Dombon "Int. J. Cancdr", 12, side 396-408 (1973)) ud fra celler fra en lille afrikansk pige med det angivne navn. Celler af denne linie har vist sig at danne store mængder interferon ved passende stimulering (H. Strander, K.E. Mor gens en, K. Cantell "J. Clin. Micro.", 1^, side 116-117, . (1975)). Underkulturer af denne cellelinie blev opnået fra dr. Ion Gresser (Villejuif, Frankrig) i januar 1975. På det tidspunkt var linien tilpasset til at vokse på medium RMPI 1640 med 10% fosterkalv- 4 147625 serum. I disse laboratorier er cellerne blevet tilpasset til at vokse på det samme medium suppleret med 5-10% serum fra 6-8 måneders kalve, og der er blevet fremstillet underkulturer to eller tre gange om ugen i en 18 måneders pediode. Et forråd af disse celler, der nu betegnes Namalva/WRL, er blevet indført i et antal ampuller, som er opbevaret i flydende nitrogen. Disse celler har vist sig at være fri for mycoplasma-infektioner, og celleprøver er blevet deponeret i American Type Culture Collection.

Namalva/WRL-celler er blevet anvendt i de senere beskrevne udførelseseksempler, men opfindelsen er også blevet anvendt på andre underlinier af Namalva-celler og andre lymphoblastceller.

Den i mediet anvendte carboxylsyre har fortrinsvis fra 2-8 carbonatomer, og blandt disse foretrækkes syrer med 3-6 carbonatomer, og allemest foretrækkes smørsyre. Hvis syren anvendes som sådan, vil der ved tilsætning til mediet, som vil indeholde forskellige uorganiske eller organiske salte, sædvanligvis dannes saltet af syren. Alternativt kan man tilsætte et salt af carboxylsyren til mediet, i hvilket tilfælde der kan anvendes sådanne salte som natrium-, kalium- eller ammoniumsaltet.

Til fremstilling af interferonet skal de valgte celler først dyrkes under betingelser, som er egnede og hensigtsmæssige for hver celletype eller cellestamme, således som det er dokumenteret i litteraturen. Eksempelvis vokser humane lymphoblastceller, såsom Namal-va-cellelinien, let i suspension i et vækstmedium, såsom RPMI 1640 (G.E. Moore et al., 1967 "J. Amer. Med. Assoc.", 199, 519-524) suppleret med serum, f.eks. kalve- eller hesteserum, sædvanligvis 5-10% (v/v).

Til fremstilling af interferon ud fra lymphoblastceller, f.eks. Namalva-celler, dyrkes cellerne i suspension, indtil de har nået en g tilstrækkelig koncentration, f.eks. fra 0,5 til 10 x 10 celler/ml, hvorefter de kan behandles på passende måde med henblik på interferon-produktion. Til dette formål indstilles cellekoncentrationen til at ligge mellem 0,25 til 6 x 10^ celler/ml, fortrinsvis 0,5 til 3 6 6 x 10 celler/ml, og bedst 1 x 10 celler/ml, i et medium, som kan være et af følgende: (a) frisk vækstmedium, (b) brugt vækstmedium, hvori cellerne tidligere har været dyrket, suppleret med frisk vækstmedium, eller (c) brugt medium suppleret med friske næringsstoffer.

Det er på dette stadium, at carboxylsyren eller saltet deraf kan sættes til cellekulturen til en slutkoncentration på 0,1 til 10 mM, fortrinsvis 0,2 til 5 mM, og bedst 0,5 til 2,0 mM. Toksiciteten 147625 5 af carboxylsyren for cellerne sætter en grænse for koncentrationen af syren, men denne skal være til stede i en sådan mængde, at den er effektiv til forøgelse af interferon-dannelsen, og den optimale balance mellem forbedret interferon-udbytte og celle-toksicitet må således fastlægges for den til anvendelse valgte syre. For andre carboxylsyrer end smørsyre kan således andre molariteter være at foretrække. Cellerne inkuberes derpå ved 33-38°C, fortrinsvis 35-37°C, i fra 12 til 72 timer afhængig af koncentrationen af den anvendte carboxylsyre. Eksempelvis inkuberes celler af Namalva-linien af humane lymphoblastceller i 48 timer med en slutkoncentration af smørsyre på 1 mil og ved en pH-værdi på fra 6,2 til 7,4, fortrinsvis 6,6 til 7,2.

Efter inkubation separeres cellerne fra mediet indeholdende carboxylsyren ved hjalp af en passende fremgangsmåde, som ikke be-skadiger cellerne, f.eks. ved centrifugering eller filtrering. Cellerne kan derpå i overensstemmelse med kendt teknik (M.G.Tovey et al. "Proc. of Soc. for Exp. Biol. & Med.", 146, 809-815 (1974))på ny suspenderes i et passende medium og induceres til dannelse af interferon. F.eks. kan de resuspenderes i medium RPMI 1640, som enten ikke indeholder serum eller er suppleret med op til 5% v/v serum, således at der fås en sluttelig cellekoncentration på fra 0,25 til 8 x 6 6 10 celler/ml, fortrinsvis 0,5 til 4 x 10 celler/ml. Et passende induktionsmiddel, såsom et virus, f.eks. Sendai-virus, sættes til cellesuspensionen til opnåelse af en slutkoncentration på 5 til 200 HAU/ml, fortrinsvis 20 til 50 HAU/ml. Efter grundig blanding inkuberes cellesuspensionen i et tidsrum på 12 til 48 timer ved en temperatur på fra 34 til 37°C. F.eks. ved 35°C kan cellekulturen passende inkuberes natten over, i hvilket tidsrum interferon frigøres fra cellerne til mediet. Efter inkubation fjernes cellerne ved f.eks. centrifugering, hvorved der fås en supernatant indeholdende urent interferon.

Fordelen ved at inkubere cellerne i nærværelse af en ligekædet carboxylsyre eller et salt deraf, før de induceres til dannelse af interferon, ligger i, at der opnås forholdsvis høje udbytter af interferon, dvs. 5-10 megaenheder pr. liter eller mere, samtidig med at disse udbytter opnås mere vedvarende end uden denne behandling. Endvidere vil celler, som er blevet tilpasset til at vokse i et medium indeholdende et lavt serumtilskud, f.eks. 1-2% v/v, danne lige så meget interferon som celler, der vokser i et medium med en 3-4 gange så stor tilsætning af serum. Dette forhold er af betydelig vigtighed, 6 147625 eftersom omkostningerne ved serumtilsætningen udgør en stor del af omkostningerne ved interferon-fremstillingen.

En yderligere fordel ved inkubering af cellerne i nærværelse af en carboxylsyre ligger i, at igangsætningen af cellerne med en lille mængde homologt interferon bliver overflødig, hvorved der opnås en besparelse i produktionsomkostninger.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen forklares nærmere i de efterfølgende udførelseseksempler.

Eksempel 1 I en 100 liters beholder dyrkedes humane lymphoblastceller af Namalva/WRL-linien i suspension under mekanisk omrøring i et vækstmedium bestående af medium RMPI 1640 med tilsætning af 7% kalveserum, neomycin og polymyxin og med tilsætning af bicarbonat til pH-kontrol. Efter at der var opnået en cellekoncentration på 2 x 106 celler pr. ml, udtoges 10 liter fra beholderen og fortyndedes med et lige så stort rumfang frisk vækstmedium. Der tilsattes smørsyre til en slutkoncentration på 1 mM, og cellerne inkuberedes ved 37°C i 48 timer. I dette tidsrum omrørtes cellerne i glaskolber, og forholdet mellem rumfanget af cellesuspensionen og den overliggende luft var tilnærmelsesvis 2:5.

Efter denne inkubationsperiode centrifugeredes cellerne i 5 minutter ved 2500 omdrejninger pr. minut ved 20°C i en MSE Coolspin-centrifuge. Cellekagen resuspenderedes i medium RMPI 1640 indeholdende 2% kalveserum, og cellekoncentrationen bedømtes. Cellesuspensionen 6 fortyndedes til en slutkoncentration på 2,75 x 10 celler pr. ml, og til igangsætning af cellerne tilsattes forud dannet lympho-blast-interferon til en slutkoncentration på omkring 100 reference-interferonenheder pr. ml. Der tilsattes derpå Sendai-virus til en slutkoncentration på 75 hæmagglutinationsenheder pr. ml til induce-ring af interferondannelse. Efter grundig blanding fyldtes cellesuspensionen på Thompson-flasker (300 ml pr. flaske), som inkuberedes ved 35°C natten over. Den følgende dag centrifugeredes cellesuspensionerne i 10 minutter ved 3000 omdrejninger pr. minut og ved 4°C i en Coolspin-centrifuge. Supernatanten, indeholdende det urene interferon, gjordes sur til pH lig 2 i 24 timer og afstumpedes derpå til pH lig 4 med henblik på efterfølgende opbevaring.

En anden del af cellesuspensionen fra 100 liters beholderen behandledes på nøjagtig samme måde hele vejen igennem, bortset fra at der ikke tilsattes smørsyre.

147625 7

Prøver af kontrolcellerne og af cellerne behandlet med smørsyre undersøgtes parallelt for deres interferonindhold. De opnåede resultater var som følger:

Kontrolceller: 3,75 log referenceenheder af interferon/ml svarende til 6 megaenheder/liter.

Smørsyrebe- handlede celler: 4,80 log referenceenheder af interferon/ml svarende til 63 megaenheder/liter.

Eksempel 2 g

Namalva/WRL-celler dyrkedes til en koncentration på 2,5 x 10 celler/ml i det i eksempel 1 anvendte medium og samledes ved centrifugering ved 800 g i 10 minutter. Cellekagen resuspenderedes i frisk vækstmedium. Cellesuspensionen fortyndedes til en slutkoncentration på 1,3 x 10 celler/ml, og 50 ml-portioner fyldtes i 75 cm vævskultur-kolber af plast. Forskellige mængder af en 100 mM opløsning af natriumbutyrat i phosphatpufret saltopløsning sattes derpå til de enkelte kolber til opnåelse af en slutkoncentration af natriumbutyrat på 0, 0,1, 0,2, 0,5, 1,2 og 5 mM. Kolberne inkuberedes i 48 timer ved 36°C, og cellerne i de enkelte flasker koncentreredes derpå ved centrifugering i 5 minutter ved 800 g. Hver enkelt cellekage resuspen- g deredes til en slutkoncentration på 4,3 x 10 celler/ml i RMPI 1640- medier indeholdende 2% v/v kalveserum (vedligeholdelsesmedium). 10 2 ml-portioner fra hver cellesuspension anbragtes i to 25 cm vævskultur-kolber af plast, og cellerne induceredes til interferon-dannelse ved tilsætning af Sendai-virus til en slutkoncentration på 40 HAU/ml.

Kolberne bragtes atter på 36°C i 20 timer. Den af hver enkelt kurtur dannede interferon-mængde udvandtes ved sedimentation af cellerne ved centrifugering i 5 minutter ved 1000 g.Supernatanten indeholdende interferonet indstilledes på en pH-værdi på 2,0 ved tilsætning af koncentreret saltsyre og opbevaredes ved 4°C natten over. Den efterfølgende dag indstilledes pH-værdien på 7,0, og hver enkelt portion afprøvedes for interferon-indholdet.

8 147625 .Koncentration af Interferon-styrke Interferon-udbytte, natriumbutyrat, (log... reference- megaenheder pr. liter, anvendt til be- interreronenheder/ handling af celler ml).

(mM) .___________ 0 4,09 12 0,1 4,05 11 0,2 4,26 18 0,5 4,62 42 1.0 · 4,92 83 2.0 4,96 91 5.0 4,70 50

Eksempel 3

Der anvendtes den i eksempel 2 beskrevne fremgangsmåde til. fremstilling af interferon, med undtagelse af at der anvendtes natriumacetat i stedet for natriumbutyrat, og at de anvendte koncentrationer var 0, 0,2, 1,0 og 5,0 mM. De opnåede resultater var som følger.

Koncentration af Interferon-styrke Interferon-udbytte, natriumacetat, an- (log1Q reference- megaenheder pr. liter, vendt til behandling interferonenheder/ af celler (mM)._ml)._ 0 3,55 3,5 0,2 3,52 3,3 1.0 3,59 3,9 5.0 3,98 9,6

Eksempel 4

Der anvendtes den i eksempel 2 beskrevne fremgangsmåde til fremstilling af interferon med undtagelse af, at der anvendtes natri-umpropionat i stedet for natriumbutyrat, og at de anvendte koncentrationer var 0, 0,5, 1,0, 2,0, 5,0 og 10,0 mM. De opnåede resultater var som følger: 147625 9

Koncentration af Interferon-styrke Interferon-udbytte, natriumpropionat, (log.Q reference- megaenheder pr. liter, anvendt til be- interferinenheder/ handling af celler ml).

(mM)._ 0 3,69 5 0,5 3,71 5 1.0 4,20 · 16 2.0 4,49 31 5.0 4,05 11 10,0 4,15 14

Eksempel 5

Der anvendtes den i eksempel 2 beskrevne fremgangsmåde til fremstilling af interferon med undtagelse af, at der anvendtes natri-umpentanoat i stedet for natriumbutyrat, og at de anvendte koncentrationer var 0, 0,2, 0,5, 1,0, 2,0 og 5,0 mM. De opnåede resultater var som følger:

Koncentration af Interferon-styrke Interferon-udbytte, natriumpentanoat, (log.Q reference- megaenheder pr. liter, anvendt til be- interferonenheder/ handling af celler ml).

(mM)._ 0 3,81 6 0,2 3,94 9 0,5 4,26 18 1.0 4,59 39 2.0 4,85 71 5.0 4,37 23

Eksempel 6

Der anvendtes den i eksempel 2 beskrevne fremgangsmåde til fremstilling af interferon med undtagelse af, at der anvendtes natri-umhexanoat i stedet for natriumbutyrat, og at de anvendte koncentrationer var 0, 0,2, 0,5, 1,0 og 2,0 mM. De opnåede resultater var som følger: ίο 147625

Koncentration af Interferon-styrke Interferon-udbytte, natriumhexanoat, (1ο9χη reference- megaenheder pr. liter, anvendt til be- interreronenheder/ handling af celler ml).

(mM) .__ 0 3,20 2 0,2 3,69 5 0,5 3,63 4 1.0 3,80 6 2.0 3,99 10

Eksempel 7

Forringelse i stigningen i interferon-dannelse hidrørende fra natri-umbutyrat-behandling af Namalva/WRL-celler.

50 ml portioner af en suspension af Namalva/WRL-celler med g en koncentration på 1,0 x 10 celler/ml i frisk RPMI 1640-medium indeholdende 7% v/v kalveserum anbragtes i vævskultur-kolber af plast 2 med et for cellevækst tilgængeligt overfladeareal på 75 cm . Natrium-butyrat i phosphatpufret saltopløsning sattes til fire af kolberne til en slutkoncentration på 1 mM. Kolberne inkuberedes ved 36°C i 48 timer. Cellerne i den kolbe, hvortil der ikke var sat natriumbutyrat, og i én af kolberne, hvortil der var sat 1 mM natriumbutyrat, sedimenteredes fra mediet ved centrifugering i 5 minutter ved 1000 g, resuspenderedes i RPMI 1640-medium indeholdende 2% v/v kalveserum og ind-stilledes på en koncentration på 3,0 x 10 celler/ml. Cellerne induceredes til syntese af interferon ved tilsætning af Sendai-virus til en slutkoncentration på 20 HAU/ml. Cellesuspensionerne i de øvrige kolber hældtes sammen, centrifugeredes i 5 minutter ved 1000 g, g og cellerne resuspenderedes til en koncentration på 1,0 x 10 celler/ ml i frisk RPMI 1640-vækstraedium uden indehold af natriumbutyrat. Cellesuspensionen fordeltes i mængder på 50 ml på tre nye vsvskultur-kolber af plast med et tilgængeligt cellevækstareal på 75 cm . På hinanden følgende dage centrifugeredes cellerne fra en af disse kolber i 5 minutter ved 1000 g og resuspenderedes i RPMI 1640-medium g indeholdende 2% v/v kalveserum til en cellekoncentration på 3,0 x 10 celler/ml og induceredes på den før angivne måde med Sendai-virus.

De opnåede resultater var som følger: 147625 11 i β

<D

fd

tP

I Φ P s g 0) 0 +> M--H Hr^ocnoo 0) Φ r-t H ro cg ιρ -P \ P -P P Φ >i 0) ’

Pflfl β Ό 0) Η β Si

O

1 H

β tnH

0 O g m h o m n Φ m o m co σ\ σ\ 4-1 Q) fl) ****** ^ tn n Φ Ρ Φ •P >iÆ β -Ρ β h m Φ β m X β β •η ρ « φ > Ό β β Ρ φ ΙΗ tn φ i—1 ·Η ϋ1 •εχ -Ρ β ο ο ρΡ cg co m β β Ό ΡΟΡ^ Φ ·Η >1 -Ρ -Ρ -Ρ m β β Η Λ Λ

•Η I

β Φ Λ 0> β m Ό β (0 β φ <-* ο ω Φ •Η Η tn ο cg og cg cg Ρ Φ β β Ρ Ό Λ SJ -Ρ'-' β > β X Ρ Ρ β « >ι Η β -Ρ β Ο •Η Ρ β Ρ -Ρ β φ ο β 0 2 ,¾ g Ο Η Η Η Η -Ρ -- β Ρ >ι -Ρ β 03 η cg tn ^ m 147625 12

Eksempel 8

Interferon-dannelse med cellelinie V3-celler fra nyrer, hvilke celler er behandlet med natr iumbutyrat.

På vævskultur-kolber af plast og med et for cellevækst tilgængeligt overfladeareal på 25 cm^ fyldtes V3-celler (&TCC CRt-1433) (G.J.Cristofinis, J. Med.Micro, 3(2), 251-258,197o) til en koncentration på 1,5 x lo5 celler/ml i lo ml Eagles Basal medium indeholdende 4% v/v fosterkalv-serum. Kolberne anbragtes i 24 timer ved 36°C med henblik på at lade cellerne lægge sig på plastmaterialet og blive "etableret" . Vækstmediet fjernedes fra hver enkelt kolbe, og cellerne forsynedes med 10 ml frisk vækstmedium. Til én af kolberne sattes natri-umbutyrat i phosphatpufret saltopløsning til en slutkoncentration på 2 mM. Begge kolber inkuberedes derpå i 48 timer ved 36°C. Vækstmediet fjernedes, og hver enkelt kultur podedes med 0,5 ml Sendai-virus til 2000 HAU/ml. Kolberne anbragtes igen ved 36°C i 1 time med henblik på at lade virus knytte sig til cellerne. Inoculet fjernedes, og cellelagene vaskedes én gang med phosphatpufret saltopløsning og forsynedes derpå på ny med 10 ml Eagles Basal medium indeholdende 2% v/v fosterkalv-serum. Kolberne inkuberedes ved 36°C i 24 timer, hvorefter interferonet i supernatant-mediet indhøstedes. Det interferon-holdige medium behandledes på sædvanlig måde ved pH lig 2 og undersøgtes .

Interferon-styrke Interferon-udbytte, (log^g enheder/ral) megaenheder/liter 1. V3 uden natriumbutyrat 0,66 0,005 2. V3 med natriumbutyrat 1,32 0,021

Eksempel 9

Forøgelse i interferonstyrkerne fra natriumbutyrat-behandlede Namal-va/WRL-celler induceret med forskellige induktionsmidler.

Namalva/WRL-celler sedimenteredes fra brugt vækstmedium og resuspenderedes i frisk RPMI 1640-medium indeholdende 7% v/v kalve- g serum til en koncentration på 1,38 x 10 celler/ml. 500 ml anbragtes i hver af to 1-liters glaskrukker, og til den ene kultur sattes natriumbutyrat i phosphatpufret saltopløsning til en slutkoncentration på 1 mM. Kulturerne omrørtes i 48 timer ved 36°C. Cellerne blev udvundet ved centrifugering og resuspenderedes i RPMI 1640-medium in- g deholdende 2% v/v kalveserum til en koncentration på 5,0 x 10 cel- 147625 13 ler/ml. Portioner på 10 ml af disse cellepræparater induceredes med de afprøvede midler. Supernatanterne fra de virusinducerede kulturer behandledes på sædvanlig måde ved pH lig 2, før de undersøgtes for deres interferonindhold.

De opnåede resultater var som følger: i 14 147625 (ΰ Μ En (!) ι ø μ 3 i H m oo OH o cm o m μ ro o o o o 00)5-1 - - - - m-PomioocMoo o o Μ μ Ti ro 0) >i 0) 3 Ό 3

H 3 <D

·· 0

X H

μ E

-μ μ (0 (!) i ’ϋ Π0) η co in σ> cm cm cm id

Oi r-m^Hr-cM o id MC κ η h ^ <k % *.

(Ud) M^CMrOOH O H

μ μ o

O) H

μ tn c o

Η H

•μ ø « iH l—l *d i 3 ft μ f3 0 S-l a μ *μ om μ μ >i i + i + i + i + <!>

4) »(C

M 3 S

0) Λ ft

H O

Η Ό

Od) *·

OS HH CO

M 1-1 Η H r—! i—li—1 d) d) (1) S S E S o o h \ \ \ \ \ \ ft

<D p p D D 3 3 tn tn S

Ό < < tal λ! μ μ μ μ 0 cn atcæKCiiao o m

S O O I

8) oooooo H H (1)

g ·ί >J (Μ (Ί Η Η M

>1 · to H

H CM >lH

« ·· ΙΟ ΓΙΟ CO H "ri1 Μ Μ μ 0) d) >i H H O · P-4 a oo to to S S λ la

3 3 o OH

MM X Μ Μ μ

Η H 10 10 I I ΪΜ O

>>33 0 0 Η P

I I Μ Μ Μ M O

0 0 Η H >i >1 Di · ta to > > i to i ta i o cdØllØH ØH 03 0 0 μ μ Μ >ι Μ >1 ΜΗ to to ω ιο >)Ό >1 (0 C0 Η Η 0 0 W Η 3 10 Η 3 (0 10 2 3αΡΜΜ3μ(ΰΰμ3 3 Η ΜΜ Ο Ο Η >ι Μ -Η >ι Μ Η 3 ΗΗ0 0!Μ!Μωομωομ too >>ΗΗ ΟΟΚΟΟΧ Ο Η I ι μμΗΗΛΛ0ΛΛΦ Λ Ε •r!H ta ta Μ Η Η Η Η Ό Η 0 tdcdrtSctJHHMMI Μ Μ I Μ -3 3 3 Ο Ο Η Η >i>)W >ι>ιή Ο 3 3 5 & Ε Ε Η Η ril HHrfi ΗΟ

0 0 0 0 0 0 Ο Ο Η OOP OH

cn co s s cn cn ft ftp ft DiQ ft ffl ······· · H CM ro in ID t— 00 147625 15

Eksempel 10

Med smørsyre forøget interferon-udbytte fra Namalva/WRL-celler, tilpasset til at vokse på medium indeholdende reduceret serummængde.

Namalva/WRL-celler, som normalt vokser i medium RPMI 1640 indeholdende 7% kalveserum, tilpassedes til at vokse i medium indeholdende blot 2% kalveserum. Disse kulturer gav regelmæssigt celletal på 1,5 til 2,0 x 10^/ml.

En portion blev udtaget fra hver af to sådanne kulturer (med g celletal på 1,67 og 2,05 x 10 /ml) og fortyndedes 1/2 med frisk vækstmedium. Smørsyre tilsattes til hver af kulturerne til en slut-koncentration på 1 mM, og de to kulturer omrørtes i 48 timer ved 37°C.

Efter smørsyre-behandlingen induceredes cellerne til dannelse af interferon. Der blev også gennemført kontrol-induktioner under anvendelse af en yderligere portion celler fra de to stamkulturer (som ikke var behandlet med smørsyre), hvilke kulturer selvsagt havde vokset i yderligere 2 dage i normalt vækstmedium. De smørsyrebehandlede celler og kontrolcellerne centrifugeredes og resuspenderedes i

C

frisk medium til en koncentration på 2,75 x 10 celler pr. ml. Sendai-virus, 50 HAU/ml, tilsattes, og kulturerne inkuberedes ved 35°C natten over.

Interferon-styrkerne fra disse kulturer var:

Lo«10 3'45 °S 3'46/ml aller 3 "^enheder/liter led^celler311^ : Lo^10 °9 4,82/ml eller gennemsnitlig 58 mega- enheder/liter.