CS215108B2

CS215108B2 - Method of making the interferrone

Info

Publication number: CS215108B2
Application number: CS784645A
Authority: CS
Inventors: Denis Johnston
Original assignee: Wellcome Found
Priority date: 1977-07-15
Filing date: 1978-07-11
Publication date: 1982-07-30
Also published as: IL55143A0; CA1115209A; DK316978A; AU524099B2; DK147625B; IT7850322A0; JPS5646797B2; PL208407A1; DE2860559D1; FI60971B; ATA510378A; US4216203A; EP0000520B1; JPS5420119A; FI782249A; IT1107573B; PL110704B1; AT362334B; EP0000520A1; HU179655B

Description

(54) Způsob výroby interferonu

Vynález se týká způsobu výroby interferonu jako látky s nespecifickým protivirovým účinkem.

Interferon je protivirová látka bílkovinné povahy, která je produkována buňkami jako odpověď na stimulaci virem nebo jiným indukčním prostředkem. Interferony mohou být produkovány velkým množstvím buněk, například bílými krvinkami, fibroblasty, lyfoblastoidními buňkami, buňkami epitheliálního typu, například buňkami ledvin nebo HeLa buňkami, buňkami myelomu a podobně. Volba buněk, které produkují interferon, závisí na požadovaném produktu, protože různé interferony mají vlastnosti, které závisí na tkáni, z níž jsou odvozeny. V případě, že interferon má být použit u člověka, jsou nejvýhodnějším zdrojem lidské buňky. Po svém vzniku se interferon z buňky vylučuje a může dojít k jeho působení na další buňky, čímž se brání replikaci viru nebo vzniku škodlivých účinků. Tyto protivirové účinky nejsou specifické vzhledem k určitým virům, přestože některé viry jsou na působení interferonu citlivější.

Interferon byl rovněž užit jako chemoterapeutikum při léčbě určitých typů karcinomů, kde bylo dosaženo příznivých účinků. [Strander, H., Cantell К., a další, Fo2 gargty Intern. Center Proč., U. S. Govt. Printing Office, Washington D. C., 2.8: str. 377 až 381, 1977 předneseno na The Conference at the Natíonal Institute of Health, Bethezda, 9. až 11. prosince 1974].

Větší množství lidského interferonu je možno získat ze tří hlavních zdrojů, a to z lidských bílých krvinek, lidských fibroblastů a lymfoblastoidních buněk. Až dosud bylo velmi obtížné získat větší množství lidského interferonu s takovou čistotou, aby byl použitelný pro klinické účely. Výroba interferonu z bílých krvinek je například omezena dostupností lidské krve. Výroba interferonu z fibroblastů je brzděna skutečností, že tyto buňky rostou pouze v souvislosti s určitým povrchem. Lymfoblastoidní buňky mají tu výhodu, že je možno pěstovat je v suspenzi a je možno u nich vyvolat tvorbu interferonu působením viru.

Jedním z možných způsobů výroby lidského interferonu z lymfoblastoidních buněk je způsob, při němž se na suspenzi buněk působí malým množstvím interferonu homologního druhu a tím se u těchto buněk vyvolá produkce interferonu. Pak se přidá ještě vhodný virus [Strander H., a další, J. Clin. Micro., 1, str. 116 až 117 (1975)].

Bylo zjištěno, že se produkce interferonu z lidských lymfoblastoidních buněk svr215108 chu uvedeným způsobem podle podmínek podstatně mění, je například možno získat až 60 až 80 megajednotek interferonu v 1 litru, což odpovídá výtěžku 30 až 40 megajednotek na 10⁹ buněk. 1 megajednotka je rovna 10⁶ jednotek interferonu podle podmínek uvedených v Medical Research Council research standard preparation of interferon, 69/19, N- Finter, Interferons, 1973, str. 485 až 486, published by North Holland. V jiných příkladech bylo možno dosáhnout pouze 1 megajeclnotky v 1 litru, to znamená 0,5 až 0,7 megajednotek na 10⁹ buněk nebo ještě méně z podobných buněk, které byly ošetřeny naprosto stejným způsobem. Příčiny těchto rozdílů výtěžku interferonu nejsou známy.

Nyní bylo zjištěno, že v případě, že se na buňky produkující interferon působí karboxylovou kyselinou nebo její solí a pak se provádí indukce výroby interferonu, je možno reprodukovatelně získat poměrně vysoké výtěžky interferonu.

Předmětem vynálezu je tedy způsob výroby interferonu spočívající v pěstování epitheliálních nebo lymfoblastoidních buněk, v nichž je možno tvorbu interferonu vyvolat na vhodném prostředí pro zvolené buňky při přidání indukčního činidla, například'W izolací interféronu produkovaného buňkami, vyznačující se tím, že se před indukcí buňky inkubují v prostředí, které obsahuje účinné netoxické množství nasycené karboxylové kyseliny o 2 až 6 atomech uhlíku s přímým řetězcem nebo její soli, například sodné, draselné nebo amonné, při teplotě 33 až 38 °C po dobu 12 až 72 hodin.

Buňky zvolené pro výrobu interferonu jsou například v případě, že interferon má být podáván lidem, lidské buňky. Zvolenými buňkami mohou být epitheliální buňky nebo lymfoblastoidní buňky, například buňky Nam.alva nebo jiné lymfoblastoidní buněčné linie. Linie lymfoblastoidních buněk, které je možno sériově množit ve tkáňové kultuře, je možno odvodit od tkáňových kultur lidských bílých krvinek z periferní krve známými způsoby. [Норе, J. H., Horné Μ. K., Scott W., Int. J. Cancer, 3, str. 857 až 866 (1978), Норе J. H., Horné Μ. K., Scott. W., Int. J. Cancer, 4, str. 255 až 260 [1969), Chang R. S., Golden H. D,, Nátuře, 234, str. 359 až 360 (1971)]. Leukocity mohou být zíkány ze zdravých nebo nemocných lidí a je možno je jednoduchým způsobem odvodit v případě, že tyto buňky se infikují virem Epstein-Barr (EBV), nebo je možno odvodit je i z kultur bílých krvinek, které tímto virem infikovány nebyly, například buňky z pupečníkové krve, к nimž byly přidány buňky EBV nebo buňky in fekční mononukleózy nebo Burkitova lymphomo.

Lymfoblastoidní buněčné linie je možno snadno odvodit od buněk nemocných s burkitovým lymphomem, protože tyto buňky již jsou infikovány EBV. Zvláští linií Namalva bylo možno odvodit způsobem podle publikace [Nyornoi O., Klein G., Adams A., Dombon L., Int. J. Cancer 12, str. 396 až 408 (1973)]. Tato linie byla získána z afrického děvčátka téhož jména. Buňky této linie jsou schopny při vhodné stimulaci produkovat velká množství interferonu. [Strander H., Morgensen К. E., Cantoll K., J. Clin. Micro., 1, str. 116 až 117, (1975)]. Subkultura těchto buněk byla získána od Dr. Iona Gressera {Villejuif, Francie) v lednu 1975. V této době byla buněčná linie adaptována tak, aby mohla růst na živném prostředí RMPI 1640 s 10 %, telecí fetální krve. V laboratoři byly buňky přizpůsobeny tak, že rostou na tomtéž prostředí, doplněném 5 až 7 % krevního séra z telat starých 6 až 8 měsíců a bylo možno kulturu udržet tak, že byla 2 až 3x týdně přeočkována v průběhu 18 měsíců. V průběhu tohoto přeočkování byly získány subkultury. Tyto buňky jsou nyní nazývány Namalva (WRL) a byly uloženy do velkého počtu ampulí, které jsou skladovány v kapalném dusíku. Buňky jsou prosté infekce mykoplasmaty a jejich vzorky byly uloženy v Američan Type Culture Collection pod číslem CRL 1432.

Živné prostředí RMPI 1640 má následující složení:

Složka	Koncentrace mg/l
Aminokyseliny
1-arginin	200
1-asparagin	50
1-asparagová kyselina	20
1-cystin	50
1-glutamová kyselina	20
1-glutamin	300
redukovaný glutathion	1
glycin	10
1-histidin	15
1-hydroxyprolin	20
1-isoleucin	50
1-leucin	50
1-lysinhydrochlorid	40
1-methionin	15
1-fenylalanin	15
1-prolin	20
1-serin	30
1-threonin	20
1-tryptofan	5
1-tyrosin	20
1-valin	20

Vitaminy p-aminobenzoová kyselina1 biotin0,2 panthothenát vápenatý0,25 cholinchlorid3 kyanokobalamin0,005 kyselina listová1

1-rnositol35 nikotinamid1 pyridoxinhydrochlorid1 riboflavin0,2 thiaminhydrochlorid1

Soli dusičnan vápenatý (tetrahydrát)100 hydrogenfosforečnan sodný (heptahydrát)1512 síran horečnatý (heptahydrát)100 chlorid draselný400 liydrogenuhličitan sodný2000 chlorid sodný6000

Různě glukóza2000 fenosulfoftalein5 pH se upraví na 7,2 přidáváním 10'% vodného roztoku uhličitanu sodného

Buňky Namalva/WRL byly užity v následujících příkladech, vynález je · však proveditelný i s dalšími subliniemi buněk · Namalva a dalších lymfoblastoidních buněk.

Karboxylová kyselina užitá jako přísada do prostředí s výhodou obsahuje 2 až 8 atomů uhlíku, zvláště 3 až 6 atomů uhlíku, nejvýhodnější kyselinou je . kyselina máselná. Užije-li se kyselina jako taková, pak se obvykle vytváří v živném prostředí sůl této kyseliny, protože prostředí obsahuje různé anorganické a organické soli. Je také možno přidat do prostředí sůl karboxylové kyseliny, v tomto případě jde obvykle o sůl sodnou, draselnou nebo amonhou.

Aby bylo možno získat interferon, je nutno zvolené buňky nejprve pěstovat za podmínek, které jsou vhodné pro zvolený buněčný typ, jak je možno zjistit v literatuře. Například lidské lymfoblastoidní buňky, například buňky Namalva, . dobře rostou v suspenzi v živném. prostředí, jako je například prostředí RMPI 1640 [Moore G. E., a další, 1967, J. Amer. Med. Assoc. 199, 519 až 524], přičemž prostředí je doplněno šerem, například telecím nebo koňským, obvykle v množství 5 až 10 objemových %o>

Pro výrobu interferonu z lymfoblastoidních buněk, například z buněk Namalva, se tyto · buňky pěstují v suspenzi tak dlouho, až se dosáhne žádané koncentrace, například 0,5 až 10x 10⁶ buněk/ml, pak je možno · · buňky · užít pro výrobu interferonu. K tomuto účelu se koncentrace buněk upraví na hodnotu 0,25 až 6 x 10⁶ buněk/ml, s výhodou 0,2 až ' 3 x 106 buněk/ml, zvláště 1 x 106 buněk/ml ve vhodném živném prostředí, například v některém z následujících prostředí:

a) je možno užít svrchu uvedeného čerstvého živného prostředí;

b) je možno užít živného prostředí, v němž byly buňky pěstovány, a přidat čerstvé živné prostředí; nebo

c) je možno užít živné prostředí, · v němž byly buňky pěstovány, a toto prostředí doplnit čerstvými živnými látkami.

V tomto stupni se také přidává karboxylová kyselina nebo její sůl do konečné koncentrace 0,1 až 10 mmolů, s výhodou 0,2 až 5 mmolů, zvláště 0,5 až · 2,0 mmoly. Koncentrace kyseliny · je omezena její toxicitou pro buňky, kyselina však má být přítomna v takovém množství, aby účinně podporovala výrobu intérféronu, takže je nutno dosáhnout optimální hranice mezi zlepšeným výtěžkem interferonu a buněčnou toxicitou. Tuto hodnotu je nutno stanovit pro každou použitou kyselinu · zvlášť. V případě, že se užije jiná kyselina než kyselina máselná, je tedy obvykle nutno užít jiné molární množství. Po přidání kyseliny se pak buňky inkubují při teplotě 33 až 38 °C, s výhodou 35 až 37 °C po dobu 12 až 72 hodin v závislosti na koncentraci užité karboxylové kyseliny, například buňky linie Namalva lidských lymfoblastoidních buněk je nutno inkubovat 48 hodin při konečné koncentraci kyseliny máselné 1 mmol a při pH 6,2 až 7,4, · s výhodou 6,6 až 7,2.

Po inkubaci se buňky oddělí od prostředí s obsahem karboxylové kyseliny způsobem, který buňky nepoškozuje, například odstředěním nebo . filtrací. Buňky je možno znovu uvést v suspenzi ve vhodném prostředí a znovu indukovat tvorbu interferonu známým způsobem [Tovey M. G., a další. Proč, of Soc. for Exp. Biol. a Med., 146, 809 až 815 (1974)]. Je například možno buňky znovu uvést v suspenzi v prostředí RMPI 1640 bez obsahu séra nebo s obsahem až 5 objemových % séra na konečnou koncentraci buněk 0,25 až 8 x 10⁶ buněk/ml, s výhodou 0,5 až 4 x 10⁶ buněk/ml. Pak se přidá vhodný indukční prostředek, například virus jako Sendai, k buněčné suspenzi do konečné koncentrace 5 až 200 HAU/ /ml, s . výhodou 20 až 50 HAU/ml. Buněčná suspenze se důkladně promísí a pak se inkubuje 12 až 48 hodin při teplotě 34 až 37 stupňů Celsia. V případě, že se užije teploty 35 °C, je nutno inkubovat buněčnou suspenzi přes ndc, v této době se interferon z buněk uvolní a přejde do prostředí. Pak se buňky odstraní, například odstředěním, čímž se získá supernatant s obsahem surového interferonu.

Výhodou inkubace buněk za přítomnosti karboxylové kyseliny s přímým řetězcem nebo její soli před indukcí tvorby interferonu jsou poměrně vysoké výtěžky interferonu, a to 5 až 10 megajednotek v 1 litru nebo více, přičemž tyto výtěžky jsou reprodukovatelnější, než . bez inkubace buněk s kyselinou. Mimoto se buňky adaptují na růst v prostředí, které obsahuje menší množství séra, například 1 až 2 objemová %, a v tomto prostředí pak produkují stejné množství interferonu jako buňky v živném prostředí s trojnásobným nebo čtyřnásobným množstvím séra. Tento výsledek je velmi důležitý, protože cena séra tvoří větší část nákladů na výrobu interferonu.

Další výhodou inkubace buněk za přítomnosti karboxylové kyseliny je, že je možno opustit stimulaci buněk před výrobou interferonu malým množstvím homologního interferonu, čímž je opět možno ušetřit část nákladů.

Vynález bude osvětlen následujícími příklady. V ' příkladech jsou užity zkratky HAU/ml [hemaglutinační jednotky/ml) a pfn/cell (jednotky tvorby plaků/buňka).

Přikladl

Lidské lymfoblastoidní buňky linie Namalva WRL byly pěstovány v suspenzi za stálého míchání v nádobě o · obsahu 100 1 v živném prostředí RMPI 1640 se 7 . % telecího séra, s přídavkem neomycinu a polymycinu a hydrogenuhličitanu pro řízení pH. Jakmile bylo dosaženo buněčné koncentrace 2 x 106 buněk/ml, bylo z nádoby odebráno 10 1 prostředí a prostředí bylo zředěno stejným množstvím . čerstvého živného prostředí, současně byla přidána kyselina máselná do konečné koncentrace 1 mmol a buňky byly inkubovány při teplotě 37 °C po dobu 48 hodin. V průběhu této doby byly buňky míchány ve skleněných nádobách, přičemž poměr mezi objemem buněčné suspenze a vzduchem v nádobě byl přibližně 2 : 5.

Po inkubaci byly buňky odstředěny při 2500 otáčkách za minutu po dobu 5 minut při teplotě 20 °C v odstředivce MSE Coolspin.

Pak byly ' buňky znovu uvedeny v suspenzi v prostředí RMPI 1640 s obsahem 2 % telecího séra · a byla znovu stanovena koncentrace buněk. Buňky pak byly zředěny na koncentraci 2,75 x 106 buněk v 1 ml a pak byl přidán předem vytvořený lymfoblastoidní interferon do konečné koncentrace ' přibližně 100 referenčních jednotek interferonu v 1 ml. Pak byl přidán virus Sendai do konečné koncentrace 75 hemaglutinačních jednotek v 1 ml, k indukci tvorby interferonu. Po důkladném promíchání byla buněčná suspenze . uložena do Thompsonových lahví v množství 300 ml do jedné láhve. Láhve byly pak inkubovány přes noc při teplotě 35 °C. Další den byla buněčná suspenze odstředěna při 3000 otáčkách za minutu po dobu 10 minut při teplotě 4 °C ve svrchu uvedené odstředivce. Supernatant s obsahem surového interferonu byl okyselen na 24 hodin na pH 2 a pak byl neutralizován na pH 4 pro následné skladování.

Další podíl buněčné suspenze z nádoby o obsahu 100 1 byl zpracováván týmž způsobem, s tím rozdílem, že nebyla přidána kyselina máselná.

Vzorky kontrolních buněk a buněk po ' působení kyseliny máselné byly zkoumány souběžně na obsah interferonu. Byly získány následující výsledky:

Kontrolní buňky:

3,75 log referenčních jednotek interferonu/ml, což je ekvivalentní 6 megajednotka/1

Buňky po působení kyseliny máselné:

4,80 log referenčních jednotek interferonu/ml, což je ekvivalentní 63 megajednotka/1

Příklad 2

Buňky Namalva/WRL se pěstují do koncentrace 2,5 x 106 buněk/ml v živném prostředí z příkladu 1 a pak se oddělí odstředěním při 800 g po dobu 10 minut. Buňky se uvedou znovu v suspenzi v čerstvém živném prostředí. Pak se buněčná suspenze _xzředí na konečnou koncentraci 1,3 x 10⁶buněk/ml a vzorky o obsahu 50 ml se uloží do nádob z plastické hmoty pro pěstování tkáňových kultur o obsahu 75 cm². K jednotlivým nádobám se přidá různé množství roztoku sodné soli kyseliny máselné v chloridu sodném s obsahem fosfátového pufru při koncentraci soli kyseliny máselné 100 mmolů, a to tak, že konečná koncentrace této soli v jednotlivých nádobách je 0, 0,1, 0,2, 0,5, 1, 2 a 5 mmolů.

Nádoby se pak inkubují při teplotě 36 °C po dobu 48 hodin a buňky v každé nádobě se pak odstředí při 800 g 5 minut. Každý podíl buněk se znovu uvede v suspenzi do konečné koncentrace 4,3 x 10° buněk/ml v prostředí RMPI 1640 s obsahem 2 %' telecího séra (udržovací prostředí). Vzorky 10 ml každé buněčné suspenze se uloží do dvou nádob z plastické hmoty o obsahu 25 cm² a provede se indukce tvorby interferonu přidáním viru Sendai do konečné koncentrace 40 HAU/ml.

Nádoby se pak vrátí na 20 hodin do prostředí s teplotou 36 °C. Interferon, produkovaný každou z těchto . kultur, se izoluje odstředěním z buněk 5 minut při 1000 g. Supernatant s obsahem interferonu se upraví na pH 2,0 přidáním koncentrované kyseliny chlorovodíkové a skladuje se přes noc při teplotě 4 °C. Následující den se pH upraví na 7,0 a každý z uvedených vzorků se zkoumá na obsah interferonu. Výsledky jsou uvedeny v následující tabulce.

Výtěžek interferonu megajednotky/1

Koncentrace sodné soli kyseliny máselné v mmolech

Titr interferonu (log₁₀referenčních jednotek interferonu/ml]

0	4,09	12
0,1	4,05	11
0,2	4,26	18
0,5	4,62	42
1,0	4,92	83
2,0	4,96	91
5,0	4,70	50

Příklad 3

Opakuje se způsob výroby interferonu podle příkladu 2, s tím rozdílem, že se místo máselnanu sodného užije octan sodný a užije se koncentrací 0, 0,2, 1,0, 5,0 mmolů. Výsledky jsou uvedeny v následující tabulce:

Koncentrace octanu sodného v mmolech	Titr interferonu ( logj0 refe · renčních jednotek inter- Výtěžek interferonu mega- f eronu/ml) jednotky/1
0 0,2 1,0 5,0	3,55 3,5 3,52 3,3 3,59 3,9 3,98 9,6

Příklad 4

Byl opakován způsob výroby interferonu podle příkladu 2, s tím · rozdílem, že místo sodné soli kyseliny máselné byl užit propionát sodný v koncentraci 0, 0,5, 1,0, 2,0, 5,0 a 10,0 mmolů. Výsledky jsou uvedeny v následující tabulce:

Titr interferonu (logiQ refeKoncentrace propionátu renčních jednotek interfe- Výtěžek interferonu megasodného v mmolech ronu/ml) jednotky/1

0	3,69	5
0,5	3,71	5
1,0	4,20	16
2,0	4,49	31
5,0	4,05	11
10,0	4,15	14

P ř í k 1 a d 5

Opakuje se způsob výroby interferonu podle příkladu 2 s tím rozdílem, . že místo sod né solí kyseliny máselné se užije ' pentanoát sodný v koncentraci 0, 0,2, 0,5, 1,0, 2,0 a 5,0 mmolů. Výsledky jsou uvedeny v následující tabulce:

Koncentrace pentanoátu sodného v mmolech

Titr interferonu (log(₀ referenčních jednotek interferonu/ml)

Výtěžek interferonu megajednotky/1

0	3,81	6
0,2	3,94	9
0,5	4,26	18
1,0	4,59	39
2,0	4,85	71
5,0	4,37	23

ná sůl ' kyseliny máselné nahradí hexanoátem sodným v koncentraci 0, 0,2, 0,5, 1,0 a

2,0 mmolů. Výsledky jsou uvedeny v následující tabulce:

Příklad 6

Opakuje se způsob výroby interferonu podle příkladu 2, s tím rozdílem, že se sod215108

	Titr interferonu (log_K) refe-
Koncentrace hexanoátu	renčních jednotek interfero-	Výtěžek interferonu mega-
sodného v molech	nu/ml)	jednotky/1
0	3,20	2
0,2	3,69	5
0,5	3,63	4
1,0	3,80	6
2,0	3,99	10

Příklad 7

Dobři trvání účinku na tvorbu interferonu po působení sodné soli kyseliny máselné na buňky Namalva/WRL.

ml suspenze buněk Namalva/WRL s koncentrací 1,0 χ 10^tí buněk/ml v čerstvém prostředí RPMI 1640 s obsahem 7 objemových % telecího séra se uloží do 5 nádob z plastické hmoty s povrchem pro růst buněk 75 cm². Pak se přidá ke 4 z těchto nádob sodná sůl kyseliny máselné v chloridu sodném s obsahem fosfátového pufru do konečné koncentrace 1 mmol. Nádoby se pak inkubují p^iii teplotě 36 °C po dobu 48 hodin. Buňky v nádobě bez máselnanu sodného a v jedné z nádob s obsahem 1 rninolu máselnanu sodného se pad odstředí 5 minut při 1000 g, znovu se uvedou v suspenzi v prostředí RPMI 1640 s obsahem 2 objemových % telecího séra a upraví se na množství 3,0 x 10^G buněk/ml. K těmto buňkám se pak přidá virus Sendai do konečné koncentrace 20 HAU/ml.

Buňky ve zbývajících nádobách se slijí, odstřeďují 5 minut při 1000 g a pak se znovu uvedou v suspenzi do konečné koncentrace 1,0 χ 10^c buněk/ml v čerstvém živném prostředí RPMI 1640, které vůbec neobsahuje máselnan sodný. Tyto buňky se pak rozdělí po 50 ml do tří nových nádob z plastické hmoty o plošném obsahu pro růst buněčné kultury 75 cm² a inkubují při teplotě 36 °C. Další dny se buňky z jedné z těchto nádob odstředí 5 minut při 1000 g, znovu uvedou v suspenzi v prostředí RPMI 1640 s obsahem 2 objemová % telecího séra na koncentraci 3,0 χ 106 buněk/ml a znovu se přidá virus Sendai. Výsledky jsou uvedeny v následující tabulce:

Následná in-

	Koncentrace máselnanu ()	Inkubace za přítomnosti máselnanu (dny)	kubace bez máselnanu (dny)	Titr interferonu log_w jednotek/ml	Výtěžek interferonu megajednotky/1
1.	0	0	0	4,05	11
2.	1	2	0	4,57	37
3.	1	2	1	4,30	20
4.	1	2	2	3,95	9
5.	1	2	3	3,92	8

P říklad 8

Produkce interferonu tkáňovou kulturou opičích ledvinových buněk linie V3 po působení sodné soli kyseliny máselné.

Nádoby z plastické hmoty pro pěstování tkáňových kultur s plochou 25 cm*² se naočkují buněčnou ·linií V3 [Christofinis G. Ji, J. Med. Mícro, 3(2), 251 až 258, 1970] při koncentraci 1,5 χ 10⁵ buněk/ml v 10 ml Eaglesova prostředí s obsahem 4 objemových % fetálního telecího séra. Nádoby se uloží na 24 hodin při teplotě 36 °C, aby se buňky přizpůsobily nádobě. Pak se z každé nádoby odstraní živné prostředí a přidá se 10 ml čerstvého živného prostředí. K jedné z nádob se přidá máselnan sodný v chloridu sodném s obsahem fosfátového puf ru do konečné koncentrace 2 mmoly. Obě nádoby se pak inkubují 48 hodin při teplotě 36 °C. Živné prostředí se odstraní a každá z kultur se naočkuje 0,5 ml viru Sendai při 2000 HAU/ml. Nádoby se ještě 1 hodinu udržují při teplotě 36 °C, aby virus mohl proniknout do buněk. Pak se materiál z buněk odstraní, buňky se promyjí roztokem chloridu sodného s obsahem fosfátového pufru a pak se k nim znovu přidá 10 ml svrchu uvedeného prostředí s obsahem 2 objemových % fetálního telecího séra. Nádoby se inkubují 24 hodin při teplotě 36 °C a pak se supernatant s obsahem interferonu odstředí a prostředí s obsahem interferonu se dále zpracovává obvyklým způsobem při pH 2 a zkoumá na obsah interferonu. Výsledky jsou uvedeny v následující tabulce:

Titr interferonu (log^ jed- Výtěžek interferonu, meganotek/ml) jednotky/1

1. V3 bez přidání máselnanu sodného 0,66

2. V3 s přidáním máselnanu sodného 1,32

0,005

0,021

Příklad 9

Zlepšení titru interferonu přídavkem máselnanu sodného při použití buněk Namalva/WRL po indukci různými prostředky.

Buňky Nainalva/WRL se odstředí a uvedou v suspenzi do čerstvého prostředí RMPI 1640 s obsahem 7 objemových % telecího séra do koncentrace 1,38 x 106 buněk/ml. Vždy 500 ml suspenze se uloží do dvou skleněných nádob o obsahu 1 litr a k jed né z těchto nádob se přidá máselnan sodný v chloridu sodném s obsahem fosfátového pufru do koncentrace 1 mmol. Kultura se míchá 48 hodin při teplotě 46 °C, pak se odstředí a buňky se uvedou v suspenzi v prostředí RMPI 1640 s obsahem 2 objemových % telecího séra do koncentrace 5,0 x 10⁶ buněk/ml. Vždy 10 ml této suspenze se užije k indukci různými indukčními prostředky. Supernatanty se zpracovávají běžným způsobem při pH 2. Výsledky jsou uvedeny v následující tabulce:

Množství

Buňky, předem ošetře- Titr interfené máselna- ronu log_wnem jednotek/ml

Výtěžek interferonu megajednotky/1

1. Sendal virus

2. Sendai virus

3. Newcastle Disease virus

4. Newcastle Disease virus

5. Semliki Forest virus

6. Semliki Forest virus

7. kyselina polyribosinová — komplex kyseliny polyribocytidylové DEAE-dextran

8. polyribosinová kyselina — komplex kyseliny polyribocytidylové DEAE-dextran

40 HAU/ml	—	3,71	5
40 HAU/ml	+	4,56	36
20 HAU/ml		2,45	0,3
20 HAU/ml	+	3,19	2
10 pfu/cell	—	0,72	0,005
10 pfu/cell	+	1,22	0,02
100 ^g	—	0,92	0,008
100 μ%	+	1,66	0,05

Kyselina polyribosinová jako komplex polyribocytidylových kyselin byla získána z P—L Biochemicals lne. Lot č. 477 121.

Příklad 10

Zlepšení titru interferonu z buněk Namalva/WRL, adaptovaných pro růst na prostředí se sníženým množstvím séra.

Buňky Namalva/WRL, které běžně rostou v prostředí RMPI 1640 s obsahem 7 objemových %' telecího séra byly adaptovány pro růst prostředí, které obsahovalo pouze 2 % telecího séra. Tyto kultury obvykle dosahují koncentrace buněk 1,5 až 2,0 x x 106/ml.

Byl odebrán vzorek ze dvou kultur s obsahem buněk 1,67 a 2,05 x 106/ml a vzorky byly zředěny 1 polovinou čerstvého prostředí. Pak byla přidána kyselina máselná do koncentrace 1 mmol a kultury byly míchány 48 hodin při teplotě 37 °C.

Po působení . kyseliny máselné byla provedena indukce tvorby interferonu. Kontrolní indukce byla prováděna na týchž buňkách bez inkubace s kyselinou máselnou, tyto buňky byly pěstovány další 2 dny v běžném živném prostředí. Buňky po působení kyseliny máselné i kontrolní buňky byly odstředěny a znovu uvedeny v suspenzi v čerstvém prostředí při koncentraci 2,75 x 10⁶ buněk/ml. Byl přidán virus Sendai, a to 50 HAU/ml, a kultura byla inkubována přes noc při teplotě 35 °C.

Kultury obsahovaly tyto titry interferonu:

Kontroly bez kyseliny máselné:

log10 3,45 až 3,46/ml, tj. 3 megajednotky/1

Buňky po působení kyseliny., máselné: log_w 4,69 a 4,82/ml, tj. průměrně 58 megajednotek/1.

Claims

pRedmět vynalezu

1. Způsob výroby interferonu, spočívající v pěstování epitheliálních nebo lymfoblastoidních buněk, v nichž je možno tvorbu interferonu vyvolat na vhodném prostředí pro zvolené buňky při přidání indukčního činidla, například viru, s následnou izolací interferonu produkovaného buňkami, vyznačující se tím, že se před indukcí buňky inkubují v prostředí, které obsahuje účinné netoxické množství , nasycené karboxylové kyseliny o 2 až 6 atomech uhlíku s přímým řetězcem nebo její soli, například sodné, draselné nebo amonné, při teplotě 33 až 38 °C po dobu 12 až 72 hodin.
2. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se užije lymfoblastoidních buněk.
3. Způsob podle bodu 2, vyznačující se tím, že se užije lymfoblastoidních buněk linie Namalva.
4. Způsob podle bodů 1 až 3, vyznačující se tím, že se užije kyseliny máselné.
5. Způsob podle bodů 1 až 3, vyznačující se tím, že se kyselina nebo její sůl přidává k živnému prostředí do koncentrace 0,1 až 10 mmolů.
6. Způsob podle bodu 4, vyznačující se tím, že konečná koncentrace kyseliny nebo její· soli je 0,2 až 5 mmolů.