FI60971C - Foerfarande foer foerbaettring av interferonutbyte - Google Patents

Description

RjSr^l ΓβΙ m>KUULUTUSJULKAISU /ng71

flgTi lBJ (11) UTLÄGGNINGSSKRIFT OUV/I

S54 C .... Patentti .nyinnelty 10 05 1932 ffigj (45) Patent ««Helat ^ (51) Kv.ik.3/bif.ci.3 A 61 K 4-5/02, C 07 G 7/00 SUOMI —FINLAND (21) 78221+9 (22) H»k*ml*pllvl — AnaBknlngtdag 11+.07.78 (23) AlkupUvi—Glttlghuodag lU.07.78 (41) Tullut luikituksi — Bllvlt offmtllg jg

Patentti- ja rekisterihallitus .... _ ... .......

. , ^ (44) NIhtivlkslpanon |a kuuLJulkaltun pvm. — OQ ηη oP

Patent- och registerstyrelsen Ansektn uthgd och uti.*krtft«n pubUcund ^y.ux.o^ (32)(33)(31) Pyydetty etuolkeut—Begird prloritut 15*07· 77

Englanti-England(GB) 29871/77 (71) The Wellcome Foundation Limited, 183-193 Euston Boad, London N.W.I., Englanti-England(GB) (72) Michael Denis Johnston, Beckenham, Kent, Englanti-England(GB) (7U) Oy Kolster Ab (5U) Menetelmä interferonin saannon parantamiseksi - Förfarande för förbättring av interferonutbyte

Keksinnön kohteena on menetelmä interferonin saannon parantamiseksi, lisäämällä interferonituotannon stimulaattoria varhais-imusoluihin tai epiteelisoluihin, jotka helposti voidaan indusoida muodostamaan interferonia.

Interferonit ovat virusvastaisia proteiinityyppisiä aineita, joita solu tuottaa vastauksena viruksen tai muun aineen aiheuttamalle ärsytykselle. Interferoneja voivat tuottaa useimmat solut, esimerkiksi valkoverisolut, fibroblastit, varhaisimusolut, epitee-lityyppiset solut, kuten munuaissolut tai HeLa-solut, luuydinsolut jne. Solutyypin valinta interferonin tuottamiseksi riippuu interferonin käyttötarkoituksesta, koska interferoneilla on niiden tuottajasta riippuvia ominaisuuksia. Jos interferonia tarvitaan käytettäväksi ihmiselle, ovat ihmisen solut edullinen lähde.

Solun tuottama interferoni erittyy solusta ja voi silloin olla vuorovaikutuksessa muiden solujen kanssa viruksen lisääntymisen estämiseksi tai muiden vaikutusten aikaansaamiseksi. Tämä virus-vastainen vaikutus ei ole spesifinen joillekin nimenomaisille 2 60971 viruksille; tosin jotkut virukset ovat herkempiä interferonien vaikutukselle kuin muut.

Interferonia on käytetty myös kemoterapeuttina tietyn-tyyppisten syöpien hoitoon ja sillä näyttää olevan hyödyllinen vaikutus (Stander. H., Cantell, K., et ai., Fogarty Intern. Center Proc., U.S. Govt. Printing Office, Washington C.D., 28: sivut 377-381, 1977, esitetty National Institute of Heath'in konferenssissa, Bethezdassa, 9-11/12, 1974).

Kolme päälähdettä, joista saadaan huomattavia määriä ihmisen interferonia, on kuvattu, nimittäin ihmisen ääreisverivalkosolut, ihmisen fibroblastit ja ihmisen varhaisimusolut. Kuitenkin on tähän asti ollut vaikeaa tuottaa merkittäviä määriä ihmisen interferonia, joka laadultaan olisi sopiva kliiniseen käyttöön. Esimerkiksi interferonin tuottamista ihmisen ääreisvalkosoluista rajoittaa ihmisveren saatavuus. Interferonin tuottamista suuressa mittakaavassa fibroblasteista estää se, että nämä solut kasvavat ainoastaan tarttuneina jollekin pinnalle. Varhaisimusoluilla on se etu, että niitä voidaan kasvattaa suurissa suspensioviljelmissä ja ne voidaan saattaa muodostamaan interferonia käsittelemällä viruksella.

Eräs menetelmistä, jota on kaavattu ihmisen varhaisimusolu-interferonin tuottamiseksi, käsittää solususpension käsittelyn pienellä määrällä interferonia homologisista lajeista tarkoituksena herättää ne tuottamaan interferonia; tätä herätystä seuraa indusoriviruksen lisääminen (ks. Strander, H., et ai J. Clin. Micro., λ_, sivut 1 16-117, 1975). Samantapainen menetelmä on selitetty US-patentissa n:o 3 951 740; tämän patentin mukaan solut, interferonikäsittelyn jälkeen, vielä suspendoidaan väliaineeseen, joka sisältää L-glutamiinia, mikä varmistaa sen, että solut pysyvät aktiivisessa metabolisessa tilassa. Siegel (ks. Nature, 254 (1975) 531-532) selittää askorbiinihapon aktivoivaa vaikutusta interferonin muodostumiseen hiiren fibroblastisolulinjoissa.

On havaittu, että interferonimäärät, joita on todettu ihmisen varhaisimusoluista tällaisilla menetelmillä, voivat vaihdella huomattavasti, esimerkiksi niinkin suuria tiittereitä kuin 60-80 megayksikköä (megayksikkö on 10° yksikköä interferonia, Medical Research Council tutkimusstandardi 69/19, ks.N.Finter, Interferons, 1973, sivut 485-486, julkaissut North Holland) interferonia/1 litra 3 60971 9 voidaan saada, mikä vastaa 30-40 megayksikön saantoa 10 solua kohti; toisissa tapauksissa tiitterit saattavat olla ainoastaan 1 megayksikköä tai vähemmän litraa kohti (tai 0,5-0,7 megayksikköä/ g 10 solua) samanlaisissa soluissa, jotka on herätetty ja indusoitu näennäisesti samanlaisissa olosuhteissa. Syitä näihin vaihteluihin interferonin saannossa ei vielä tunneta.

Nyt on keksitty, että käsittelemällä tuotannossa käytettyjä soluja karboksyylihapolla tai sen suolalla ja saattamalla ne sitten muodostamaan interferonia, saadaan suhteellisen suuria interferonin saantoja.

Keksinnön mukaisessa menetelmässä käytetyt solut voivat olla epiteelisoluja tai varhaisimusoluja, kuten Namalva-soluja. Sopivia varhaisimusolulajeja voidaan helposti kehittää ihmisen ääreisveri-valkosolujen viljelmistä tunnetuin menetelmin (ks. esimerkiksi Hope, J.H.Horne, M.K., Scott, W. Int. J. Cancer, 3 (1978) 857-866, Hope, J.H., Horne, M.K., Scott, W., Int.J. Cancer, 4 (1969) 255-260, Chang E.S., Golden H:D:, Nature, 234 (1971 ) 359-360). Niinpä valkosoluja voidaan saada terveistä tai sairaistuneista yksiköistä, ja niitä saadaan spontaanisesti, jos solut jo on infektoitu Epstein-Barr -viruksella (EBV), tai niitä saadaan valkosoluviljelmistä, joita ei ole infektoitu EBVrlla, esim. napanuoran verivalkosolujen viljelmistä, joihin on lisätty EBV-rauhaskuumeen tai Burkitt-imukudoskasvainten alkuja.

Varhaisimusolulajeja saadaan potilaista, joilla on Burkittin imukudoskasvain, koska nämä solut on jo infektoitu EBVrlla Erään Namalvan erikoislajin kehitti Tukholmassa prof. G. Klein (Nyornoi, O., Klein G., Adams, A., Dombon, L., Int. J. Cancer, 12 (1973) 396-408).Tämän solulajin on havaittu tuottavan suuria määriä interferonia, kun sitä sopivasti stimuloidaan (Strander, H., Morgensen, K.E., Cantell, K., J.Clin Micro, sivut 116-117, (1975)). Tämän solulinjan alaviljelmä saatiin tri Ion Gresser'iltä (Villefuig, Ranska) tammikuussa 1975. Tämä solulinja adaptoitiin kasvamaan väliaineella RMPI 1640, jossa oli 10% vasikansikiösee-rumia. Se on myös adaptoitu kasvamaan RMPI-1640-väliaineella, jota on täydennetty 5-7%:11a seerumia, joka on saatu 6-8 kuukauden ikäisistä vasikoista, ja siitä on tehty alaviljelmät 2 tai 3 kertaa viikossa 18 kuukauden aikana. Varasto näitä soluja, joista käytetään nimitystä Namalva/WRL, on täytetty joukkoon ampulleja, joita varastoidaan nestemäisessä typessä. Näiden solujen on , 60971 4 osoitettu olevan vapaita mykoplasma-tartunnoista, ja näytteitä niistä on talletettu kokoelmaan American Type Culture Collection; deponointitunnus ATCC CRL 1432.

Väliaineessa käytetyssä karboksyylihapossa on edullisesti 2-6 hiiliatomia, vielä edullisemmin 3-6 hiiliatomia ja kaikkein edullisimmin se on voihappo. Jos käytetään itse happoa, niin lisättäessä sitä väliaineeseen, joka sisältää erilaisia epäorgaanisia tai orgaanisia suoloja, muodostuu tavallisesti hapon suola. Vaihtoehtoisesti on mahdollista lisätä karboksyylihapon suola väliaineeseen, jossa tapauksessa voidaan suoloina käyttää natrium-, kalium- tai ammoniumsuoloja.

Interferonin tuottamiseksi täytyy valittuja soluja ensin kasvattaa olosuhteissa, jotka ovat sopivia kullekin solutyypille tai -kannalle. Esimerkiksi, ihmisen varhaisimusolut, kuten Namalva-solulinja, kasvavat helposti suspensiossa esimerkiksi sellaisessa RPMI 1640-väliaineessa (Moore, G.E., et ai., 1967, J. Amer. Med. Assoc. 199, 519-524), johon on lisätty seerumia, esimerkiksi vasikan tai hevosen seerumia, tavallisesti 5-10% (tilav./tilav.).

Interferonin tuottamiseksi varhaisimusoluista, esimerkiksi Namalva-soluista, kasvatetaan soluja suspensiossa, kunnes ne ovat f.

saavuttaneet riittävän pitoisuuden, esimerkiksi 0,5 - 10 x 10 solua/ml, minkä jälkeen niitä voidaan sopivasti käsitellä interferonin tuotantoa varten. Tätä tarkoitusta varten solupitoisuus säädetään välille 0,25-6 x 106 solua/ml, edullisesti välille 0,5 - 6 6 3 x 10 solua/ml ja kaikkein edullisimmin 1x10 solua/ml väliaineessa, joka voi olla joku seuraavista: (a) tuore kasvuväliaine, (b) käytetty kasvuväliaine, jossa solut aikaisemmin kasvatettiin, täydennettynä tuoreella kasvuväliaineella, tai (c) käytetty väliaine, jota on täydennetty tuoreilla ravintoaineilla.

Tässä vaiheessa karboksyylihappo tai sen suola voidaan lisätä soluviljelmään antamaan loppuväkevyydeksi 0,1-10 mM, edullisesti 0,2-5 mM ja kaikkein edullisimmin 0,5-2,0 mM. Tätä pitoisuutta rajoittaa karboksyylihapon myrkyllisyys soluille, mutta siitä tulisi olla läsnä määrä, joka on tehokas parantamaan interferonin tuotantoa ja siten optimitasapaino parantuneen interferoni-saaliin ja solumyrkyn isyyden välillä täytyy määrittää erikseen kullekin hapolle. Niinpä muilla karboksyylihapoilla kuin butyy-rihapolla erimolaarisuudet voivat olla edullisia. Näitä soluja inkuboidaan sitten 33-38°C;ssa, edullisesti 35-37°C:ssa, 12 tunnista 72 tuntiin riippuen käytetyn karboksyylihapon pitoisuudesta, 5 60971 esimerkiksi ihmisen varhaisimusolujen Namalva-linjän soluja inku-boidaan 48 tuntia butyyrihapon loppuväkevyyden ollessa 1 mM, ja pH:ssa väliltä 6,2-7,4, edullisesti välillä 6,6-7,2.

Inkuboinnin jälkeen solut erotetaan karboksyylihapon sisältävästä väliaineesta jollakin sopivalla menetelmällä, joka ei vahingoita niitä, esimerkiksi linkoamalla tai suodattamalla. Solut voidaan sen jälkeen tunnetun käytännön mukaan (Tovey M.G., et ai Proc. of Soc. for Exp. Biol. & Med., 146, 809-815 (1974))suspendoida uudelleen sopivaan väliaineeseen ja saattaa muodostamaan interferonia. Ne suspendoidaan uudelleen esimerkiksi RPMI-1640 väliaineeseen, joka ei sisällä seerumia tai johon on lisätty 5%: iin asti tilav./tilav. seerumia antamaan lopulliseksi konsentraa- 6 6 tioksi 0,25-8 x 10 solua/ml, edullisesti 0,5-4x10 solua/ml.

Sopiva indusori, kuten virus, esimerkiksi Sendai-virus, lisätään solususpensioon antamaan loppuväkevyydeksi 5-200 HAU/ml, edullisesti 20-50 HAU/ml (HAU = hemagglutinaatioyksikkö). Perusteellisen sekoittamisen jälkeen solususpensiota inkuboidaan 12 tunnista 48 tuntiin lämpötilassa väliltä 34-37°C. Esimerkiksi 35°C:ssa soluviljelmää voidaan sopivasti inkuboida yli yön, jona aikana interferoni vapautuu soluista väliaineeseen. Inkuboinnin jälkeen solut poistetaan esimerkiksi linkoamalla, jolloin jäljelle jää sakan päällä oleva neste, joka sisältää raa'an interferonin.

Etu, joka saavutetaan solujen inkuboinnilla suoraketjuisen karboksyylihapon tai sen suolan läsnäollessa ennen niiden saattamista muodostamaan interferonia, on siinä, että saadaan suhteellisen suuria saantoja interferonia, ts. 5-50 megayksikköä/1 tai enemmän. Lisäksi solut, jotka on adaptoitu kasvamaan väliaineessa, joka sisältää niukasti seerumitäydennystä, esim. 1-2 tilav./tilav. -%, tuottavat yhtä paljon interferonia kuin solut, jotka kasvavat väliaineessa, johon on lisätty 3-4-kertainen määrä seerumia. Tämä seikka on huomattavan tärkeä, koska seerumin hinta muodostaa suuren osan interferonin tuotantokustannuksista.

Lisäetuna inkuboitaessa soluja karboksyylihapon läsnäollessa, on että suolojen viritysvaihe pienellä määrällä homologista interferonia tulee tarpeettomaksi, mistä on seurauksena tuotantokustannusten säästö.

Keksintöä kuvataan lähemmin seuraavien esimerkkien avulla.

6 60971

Esimerkki 1

Namalva/WRL-linjan ihmisen varhaisimusoluja kasvatettiin suspensiossa mekaanisesti sekoitettavassa 100 l:n astiassa kasvu-väliaineessa, joka käsitti väliaineen RPMI 1640, johon oli lisätty 7 % vasikanseerumia, neomysiiniä ja polymyksiiniä sekä bikarbonaat-tia pH:n säätöä varten. Kun solut olivat saavuttaneet pitoisuuden 2 x 10^ solua/ml, poistettiin astiasta 10 1 ja laimennettiin yhtä suurella tilavuusmäärällä tuoretta kasvuväliainetta. Lisättiin voihappoa antamaan loppuväkevyydeksi 1 mM ja soluja inkuboitiin 37°C:ssa 48 tuntia. Tänä aikana soluja sekoitettiin lasipulloissa ja solususpension tilavuuden suhde päällä olevaan ilmaan oli n.

2:5.

Tämän inkubointijakson jälkeen soluja lingottiin kierrosluvulla 2 500 r/min viiden minuutin ajan 20°C:ssa MSE Coolspin-sentrifugissa (valmistaja Measuring and Scientific Equipment Ltd, Englanti). Solupalloset suspendoitiin uudelleen väliaineeseen RMPI 1640, joka sisälsi 2% vasikan seerumia, ja solupitoisuus arvioitiin. Soluja laimennettiin lopulliseen pitoisuuteen 2,75 x g 10 solua/ml ia niiden virittämiseksi lisättiin ennalta muodostettua varhaisimusoluinterferonia antamaan loppupitoisuudeksi n. 100 standardi-interferoni -yksikköä/ml. Sitten lisättiin Sendai-virusta 75 HAU (hemagqlutinaatioyksikkö)/ml loppupitoisuuteen interferonin muodostumisen alulle panemiseksi. Perusteellisen sekoittamisen jälkeen solususpensio pantiin Thompson-pulloihin (300 ml/pullo; Thompson-pullo on iso, suorakaiteen muotoinen astia tasomaisine sivuineen, jota käytetään kudosviljelyä varten), joita inkuboitiin 35°C:ssa yli yön. Seuraavana päivänä solususpensiota lingottiin kierrosluvulla 3 000 r/min 10 minuuttia 4°C:ssa Coolspin-sentri-fugissa (valmistaja Measuring and Scientific Equipment Ltd,Englanti). Sakan päällä olevaa nestettä, joka sisälsi raa'an interferonin, pidettiin 24 tuntia pH 2:ssa ja pH nostettiin sitten arvoon pH 4 myöhempää varastointia varten.

Toinen osa solususpensiosta 100 l:n astiasta käsiteltiin täsmälleen samalla tavalla, paitsi että voihappoa ei lisätty.

Vertailusolujen ja voihapolla käsiteltyjen solujen näytteet analysoitiin rinnakkain interferoni-sisältönsä suhteen. Saadut tulokset olivat:

Vertailusolut: 3,75 log. standardiyksikköä interferonia/ml, vastaa 6 megayksikköä/1.

7 60971

Voihapolla käsitellyt solut: 4,80 log. standardiyksikköä interferonia/ml vastaten 63 megayksikköä/1.

Esimerkki 2

Namalva/WRL-soluja kasvatettiin 2,5 x 10° solua/ml väkevyyteen väliaineessa, jota käytettiin esimerkissä 1, ja koottiin linkoamalla 800 x g:ssä 10 minuuttia; solupalloset suspendoitiin uudelleen tuoreeseen kasvuväliaineeseen. Solususpensio laimennettiin loppu- β pitoisuuteen 1,3 x 10 solua/ml ja 50 ml:n näytteitä jaettiin 2 75 cm :n muovisiin kudosviljelypulloihin. Eri määriä natriumbuty-raatin 100 mM liuosta fosfaatilla puskuroidussa suolaliuoksessa lisättiin sitten yksittäisiin pulloihin antamaan natriumbutyraatin loppuväkevyydeksi 0, 0,1, 0,2, 0,5, 1,0»2,0 ja 5,0 mM. Pulloja inkuboitiin 36°C:ssa 48 tuntia ja sitten solut kussakin pullossa tiivistettiin linkoamalla 800 x g:ssä viisi minuuttia. Jokainen β solupallonen suspendoitiin uudelleen 4,3 x 10 solua/ml loppupi- toisuuteen RMPI 1640-väliaineeseen, joka sisälsi 2% (tilav./tilav.) vasikan seerumia (elatusväliaine). 10 ml:n näytteitä kustakin solu- 2 suspensiosta sijoitettiin kahteen 25 cm :n muoviseen kudosviljely-pulloon ja indusoitiin muodostamaan interferonia lisäämällä Sendai-virusta antamaan loppupitoisuudeksi 40 HAU/ml.

Pullot siirrettiin 36°C:seen 20 tunniksi. Jokaisen viljelmän tuottama interferoni korjattiin talteen sedimentoimalla soluja 1 000 x g:ssä viisi minuuttia. Sakan päällä oleva neste, joka sisälsi interferonin, säädettiin pH 2,0:aan lisäämällä väkevää kloorivetyhappoa ja varastoitiin 4®C:ssa yli yön. Seuraavana päivänä pH säädettiin 7,0:aan ja jokainen näyte analysoitiin interferonisisällön suhteen.

8 60971

Solujen esikäsittelyyn Interferoni-tiitteri Interferonisaanto käytetyn natriumbuty- (log1-.standardi-in- (megayksiköitä/litra) raatin pitoisuus (mM) terferoni-yksiköitä/ ml) 0 4,09 12 0,1 4,05 11 0,2 4,26 18 0,5 4,62 42 1.0 4,92 83 2.0 4,96 91 5.0 4,70 50

Esimerkki 3

Meneteltiin kuten esimerkissä 2 , paitsi että natriumbuty-raatti korvattiin natriumasetaatilla ja käytetyt pitoisuudet olivat 0, 0,2, 1,0 ja 5,0 mM.

Tulokset olivat seuraavat:

Solujen esikäsittelyyn Interferoni-tiitteri Interferonisaanto käytetyn natriumase- (log^ standardi-inter-(megayksikköinä/ taatin pitoisuus (mM) feroni-yksiköitä ml) litra) 0 3,55 3,5 0,2 3,52 3,3 1.0 3,59 3,9 5.0 3,98 9,6

Esimerkki 4

Meneteltiin kuten esimerkissä 2, paitsi että natriumbutyraat-ti korvattiin natriumpropionaatilla ja käytetyt väkevyydet olivat 0, 0,5, 1,0, 2,0, 5,0 ja 10,0 mM.

Tulokset olivat seuraavat: 9 60971

Solujen esikäsittelyyn Interferoni-tiitteri Interferonisaan- käytetyn natriumpropio- (log^Q standardi-inter- to(megayksikköä/ naatin pitoisuus (mM) feroniyksikköä/ml) litra) 0 3,69 5 0,5 3,71 5 1.0 4,20 16 2.0 4,49 31 5.0 4,05 11 10,0 4,15 14

Esimerkki 5

Meneteltiin kuten esimerkissä 2, paitsi että natriumbutyraat-ti korvattiin natriumpentanoaatilla, ja käytetyt väkevyydet olivat 0, 0,2, 0,5, 1,0, 2,0 ja 5,0 mM. Tulokset olivat seuraavat:

Solujen esikäsittelyyn Interferoni-tiitteri Interferonisaan- käytetyn natriumpenta- (log^Q standardi-inter- to(megayksikköä/ noaatin väkevyys (mM) feroniyksikköä/ml) litra) 0 3,81 6 0,2 3,94 9 0,5 4,26 18 1.0 4,59 39 2.0 4,85 71 5, 0 4, 37 23

Esimerkki 6

Meneteltiin kuten esimerkissä 2, paitsi että natriumbutyraat-ti korvattiin heksanoaatilla ja käytetyt pitoisuudet olivat 0, 0,2, 0,5, 1,0 ja 2,0 mM. Tulokset olivat seuraavat:

Solujen esikäsittelyyn Interferoni-tiitteri Interferonisaan- käytetyn natriumheksa- (log^ standardi-inter- to(megayksikköä/ noaatin väkevyys (mM) feroniyksikköä/ml) litra) 0 3,20 2 0,2 3,69 5 0,5 3,63 4 1.0 3,80 6 2.0 3,99 10 10 60971

Esimerkki 7

Interferonin tuotannon parantumisen kesto

Namalva/WRL-solujen suspension, jonka pitoisuus oli 1,0 x 106 solua/ml tuoreessa RPMI 1640 -väliaineessa, joka sisälsi 7 tilav./tilav.-% vasikan seerumia, 50 ml:n eriä pantiin viiteen muoviseen kudosviljelypulloon, joiden solukasvua varten käytet- 2 tävissä oleva pinta-ala oli 75 cm . Natriumbutyraattia fosfaatilla puskuroidussa suolaliuoksessa lisättiin neljään pulloista loppuväkevyyteen 1 mM. Pulloja inkuboitiin 36°C:ssa 48 tuntia. Pullossa, johon ei lisätty natriumbutyraattia ja yhdessä pulloista, joihin lisättiin 1 mM natriumbutyraattia, olevien solujen annettiin laskeutua väliaineesta 1 000 x g:ssä viisi minuuttia, suspendoitiin uudelleen RPMI 1640 -väliaineeseen, joka sisälsi 2 tilav./tilav.-% vasikan seerumia ja asetettiin sisältämään 3,0 x 10^ solua/ml.

Solut indusoitiin syntetisoimaan interferonia lisäämällä Sendai-virusta loppuväkevyyteen 20 HAU/ml. Jäljelle jääneissä pulloissa olevat solut yhdistettiin, lingottiin 100 x g:ssä viisi minuuttia ja suspendoitiin uudelleen väkevyyteen 1,0 x 10^ solua/ml tuoreeseen RPMI-1640 -kasvuväliaineeseen, joka ei sisältänyt natriumbutyraattia. Nämä solut jaettiin 50 ml:n eriin kolmeen uuteen muoviseen kudosviljelupulloon, pinta-alaltaan 75 cm^, ja inkuboitiin 36°C:ssa. Soluja yhdestä näistä pulloista lingottiin peräkkäisinä päivinä 1 000 x g:ssä 5 minuuttia ja suspendoitiin uudelleen RPMI-1640 -väliaineeseen, joka sisälsi 2 tilav./tilav.-% vasikan seerumia, 3,0 x 10^ solua/ml:n pitoisuuteen, ja indusoitiin Sendai-viruksella, kuten edellä .

Tulokset on esitetty seuraavassa taulukossa.

11 60971

'ϊΰ Ο Μ Ρ Ρ C -H 03 pH

(O \ t/1 :(Q

H :θ

C AC

0 AC T- r- o σ> oo

Vt -H ro (N

tu tn m-ι λ; P >, (1) (tl P CT»

c <D

H g.

0 1 en" „

•H O »HI

e ή ε o — \ p -h «o m t" o m <n (U p :0 o un ro en <x\ (4-1(11,¾ *.»·»»··» ρ ρ A! a* a· ·*τ ro ro

Φ P -H

P -h tn C -h M

M P >,

•h tn P -H

e o •H Dj o XX e 3 -H (0 a: p tn ~ C li tn au

-H (tl CU -H

O Ρ Ή > O o >— (N ro

At >1 rH -H

P P O :(tl

(tl 3 (0 CA

*~i xx tn -- (tl tn M :(0 •H »H (0 •H C P -H (0 G P tn —» •H (0 tn :<tl

0 <0 0) -H

Ρ p rH > O (N (N <N (N

3 >1 rH -H

AC P O :<tl C 3 :(tl D<

M Λ G

•H

P tn P 3 O (0 3—»

Ai 3 tn S o t- j— t- jt-

Ai ρ ·α ε 3 >i O w

>A P P

3 3 -H

(0 m o.

EH

T— (N ro in 12 60971

Esimerkki 8

Interferonin tuottaminen vihreän apinan munuaissolulinjän V3-soluista, joita on käsitelty natriumbutyraatilla.

Muovikudosviljelypulloja, joiden solukasvua varten käytet- 2 tävissä oleva pinta-ala oli 25 cm , ympättiin V3-soluilla (ATCC CRL-1433), Christofinis G.J., J. Med. Micro, 3(2), 251-258, 1970, 5 pitoisuus 1,5 x 10 solua/ml) 10ml:ssa Eagles Basal-medium- väliainetta, joka sisälsi 4 tilav./tilav.-% vasikan sikiöseerumia.

Pullot pantiin 36°C:seen 24 tunniksi, jotta solut saisivat kiinnittyä muoviin ja stabiloitua. Kasvuväliaine poistettiin jokaisesta pullosta ja soluja ravittiin uudelleen 10 ml:n eräällä tuoretta kasvuväliainetta. Yhteen pulloon lisättiin natriumbuty-raattia fosfaatilla puskuroidussa suolaliuoksessa loppuväkevyy-teen 2 mM. Kumpaakin pulloa inkuboitiin sitten 36°C:ssa 48 tuntia. Kasvuväliaine poistettiin ja jokainen viljelmä ympättiin 0,5 ml:11a Sendai-virusta 2000 HAU/ml:n pitoisuuteen. Pullot palautettiin 36°C:seen yhdeksi tunniksi, jotta virus voisi kiinnittyä soluihin. Ymppi poistettiin ja solulevyt pestiin kerran fosfaatilla puskuroidulla suolaliuoksella ja lisättiin sitten uusi 10 ml:n erä Eagles Basal-medium -väliainetta, joka sisälsi 2 tilav./tilav.-% vasikan sikiöseerumia. Pulloja inkuboitiin 36°C:ssa 24 tuntia, minkä jälkeen sakan päällä olevassa väliaineessa oleva interferoni koottiin talteen. Interferonia sisältävää väliainetta käsiteltiin tavanomaisesti pH 2:ssa ja analysoitiin.

Interferoni- Interferoni-tiitteri saanto(mega- (login yksik- yksikköä/1) köä/mi) 1. V3-solulinja ilman natriumbutyraattia 0,66 0,005 2. V3-solulinja natriumbutyraatin kanssa 1,32 0,021

Esimerkki 9

Interferoni-tiittereiden paraneminen käytettäessä natriumbutyraatilla käsiteltyjä Namalva/WRL-soluja, joita on indusoitu eri indusoreilla.

Namalva/WRL-soluja saostettiin käytetystä kasvuväliaineesta (RPMI 1640, ks. sivu 4, toiseksi viimeinen kappale) ja suspendoitiin uudelleen tuoreeseen RPMI 1640 -väliaineeseen, joka sisälsi 7 tilav./ g tilav.-% vasikan seerumia, pitoisuuteen 1,38 x 10 solua/ml. 500 ml 13 60971 pantiin kumpaankin kahdesta yhden litran lasitölkistä ja toiseen viljelmään lisättiin natriumbutyraattia fosfaatilla puskuroidussa suolaliuoksessa loppuväkevyyteen 1 mM. Viljelmiä sekoitettiin 36°C:ssa 48 tuntia. Solut otettiin talteen linkoamalla ja sus-pendoitiin uudelleen RPMI 1640 -väliaineeseen, joka sisälsi 2 tilav./tilav.-% vasikan seerumia, väkevyyteen 5,0 x 10^ solua/ml. 10 ml:n tasaosia näistä soluvalmisteista indusoitiin testattavilla viruksilla. Viruksella indusoitujen viljelmien sakkojen päällä olevia nesteitä käsiteltiin, kuten tavallisesti pH 2:ssa ennen niiden analysoimista interferoni-sisällön suhteen. Tulokset on esitetty seuraavassa taulukossa.

14 60971 f0 k

I I -P

•Η CCJ *P

C Ο1 Ή in oo 0 <u ^ o (N o m o J-ι E «noo o o·· (1) *0 ** ~ ^ c H-io>i m o o cn o o o o P x> X cn

Φ C -H

-P (0 to m C (fl Λί η ω >1 c ·· υ c

O M

1 O' cn

H o I—I I—I

G Ή & <tJ

0— \ co u

P -P :f0 T— IDinCTliNfN IN ΙΟ -P

Ο Ρ -Ό h in r- Γ' m <Tl » e ΉΦΜ - + - ' t- <u

Ρ -P Xi ΓΟΝ>(ΝΓΟΟί— O jC

Q> -Ρ -Η ϋ -Ρ -P CO 0 C ·Ρ ,¾ -p h +j >i cq (CJ >1 Ck »H rp

•H H C

•H Q) -H

•P -P -P

ITS -H 4J

ITS (0 (0 P :itS -Ρ ι + ι + ι + I + nj >1 M 3 C0 -P -H I—t

3 CO Ο -P

CQ CD CO CO

M

Φ

r—I

a ε H H 0 Ή Ή

I—I ip rp ip Q) Q) I

E E E E O O O

P \ \ \ \ \ \ (¾ :(T3 D D D D G 0 &> tnOi

«5 < < < < m MP i itS

s s a b s a a x:

O O P

OOOOOO O O rp ^TrrCNCMT-r- <- T- >-1 Ό I I Ή

0 0 -P

Λ Λ >1

-H ·· ·Η ·· CO

Ρ ·Ρ Ρ ·Ρ 0 >ι C0 >1 CO X! Η ,14 Η Μ ·Η co ω ο 0) ο 0) ρ 33Μ«ΛιΗ0<·-Ι >1 ρ ρ g g ι α ι Οι ή •ρ ·ρ Ρ Ρ Ο Ε ο ε ο >>·η·ηΟιΟ ο. ο α.

•Η ·Η > > Οι X Οι λ; I

-Ρ -Ρ I I (0 I ·Η nj I ·Ρ Ο 33-P-P-C0CJB0C a ranjcoco-HOiccJ-POiicS Cu CDCO-p-POOfiOinJGCliU! (0 G G Ρ Ρ ·Ρ (Tj p -P (Tj P X!

PPGCOO-PXi-P-PXix) -H

•H -H CU ω IP IP (0 -H CO CO -H CO C

> > I-H 1—I | I o Ή ^ o Ή Λί -H

ι I X) 4-1 -H -H X) >1 0) Λ >1 0) -H :ra •P -P CO CO M Λί -ρ > T3 -p >1 Ό CO x> o (dtacaccj-P-PPOiPtJi ocn ΌΌ O O·—ti—I >i -P W >1 -P Cd XI ·· χί ccs^EE'-i-prfjiH.prf: -Pr- g <ucua)(Da)(i)Oippqo>iw pcn ή WWZZCOCflPiCOQlXCOQ >ι <- G rp (0 ··-····· . O^ E-t r— <N O -3· in CO Τ'- 00 HiN· 15 60971

Esimerkki 10

Interferoni-saannon lisääntyminen voihapolla Namalva/WRL-soluilla, jotka on adaptoitu kasvamaan väliaineella, joka sisältää alennetun seerumimäärän.

Namalva/WRL-soluja, jotka normaalisti kasvavat RPMI 1640 -väliaineessa, joka sisältää 7% vasikan seerumia, adaptoitiin kasvamaan väliaineessa, joka sisälsi vain 2% vasikan seerumia. Näistä viljelmistä saatiin säännöllisesti solumääriä 1,5 - 2,0 x 10^/ml. Kummastakin kahdesta tällaisesta viljelmästä otettiin näyte ( 1,67 ja 2,05 x 10^solua/ml) ja laimennettiin suhteeseen 1:2 tuoreella kasvuväliaineella. Voihappoa lisättiin kumpaankin loppukonsentraatioon 1 mM ja kumpaankin viljelmää sekoitettiin 37°C:ssa 48 tuntia.

Voihappokäsittelyn jälkeen solut indusoitiin vamistamaan interferonia. Myös vertailuindusointeja suoritettiin käyttäen solunäytteitä kahdesta perusviljelmästä (ei voihapolla käsiteltyjä) , joita oli kasvatettu 2 päivää normaalissa kasvuväliaineessa. Voihapolla käsitellyt ja vertailusolut lingottiin ja suspendoitiin g uudelleen tuoreeseen väliaineeseen pitoisuuteen 2,75 x 10 solua/ ml. Lisättiin Sendai- virusta, 50 HAU/ml, ja viljelmiä inkuboitiin 35°C:ssa yli yön.

Interferoni-tiitterit olivat:

Vertailu (ei voihappoa):Log^^ 3,45 ja 3,46/ml eli 3 mega- yksikköä/1 .

Voihapolla käsitellyt solut: Log^ 4,69 ja 4,82/ml eli keskimäärin 58 megayksikköä/1.