KR870001194B1 - 정제 백일해 예방약의 제조방법 - Google Patents

Abstract

내용 없음.

Description

정제 백일해 예방약의 제조방법

본 발명은 부작용이 적은 정제백일해 예방약을 제조하는 방법에 관한 것으로 현재까지는 백일해 예방을 위하여 백일해균을 한천배지(solid charcoal agar)에서 배양한 균체를 사용하는 균체예방약으로 접종하고 있으며, 그 예방 효과에서는 현저한 공헌을 하여 왔으나, 접종후의 부작용으로 인하여 발열이 일어나고 경결, 발적(Redness)이 생기며, 드물게는 신경장해를 동반하여 뇌증(Encephalopathy)을 후유증으로 남기는가 하면 심한 경우 사망사고를 일으키는 등 문제점이 사회문제로 되자 정기 예방접종을 기피하는 현상이 나타나 백일해 환자발생율이 증가하는 등 국민보건에 막대한 지장을 초래하고 있다.

이와같은 문제점을 해결하기 위하여 개량 백일해 예방약의 개발이 요구되어 그동안 여러 학자들이 연구를 계속하여 새로운 감염 방어 항원연구에 관한 결과가 발표되고 있다.

예를들면, 일본 세균학잡지 34(2), 1979, pp.469에서는 백일해 톡소이드의 부작용의 주인은 세균이 산생하는 LPF, HSF 및 내독소등의 독성물질에 기인하며, 이들 물질을 백신으로부터 제거해야 하며, 배양액으로부터 이들 물질을 제거하기 위하여 67% 암모늄설페이트 분획을 행하고 있으며, 공지 방법에서는 공지균주인 보르데텔라 페르투시스 토하마상 I균주를 배지에서 배양한 후 원심분리하여 균체를 분리한 상증액에 20.2w/v%의 암모늄설페이트를 가하고 8000rpm으로 10분간 원심분리하여 상증액을 제거하고 침전물에 1M NaCl-0.05M 인산염 완충액(pH 8.0) 1/10부피를 가한 후 4℃에서 7일간 정치하여 추출하고 암모늄설페이트 부분을 20분간 1000rpm으로 원심분리하고 침전물에 1M NaCl-0.05M 인산염 완충액 1/300부피를 가하고 투석하여 암모늄 설페이트를 제거한 후 서당농축 원심분리하여 상증액에 포르마린 0.2v/v% 농도로 39℃에서 2일 배양하고 포르마린을 0.4v/v% 더 가하고 총 5일간 배양하여 투석후 포르마린을 제거하여 내독소 등을 제거한 백일해 톡소이드를 제조하였다.

본 발명자는 내독소를 제거하여 그 부작용을 최소로 경감시키고 고수율로 백일해 예방약을 제조하는 방법을 연구하던 중 역가가 대단히 높은 고도로 정제되어 부작용이 거의 없는 정제된 백일해 예방약을 제조하는 방법을 발견하였다.

본 발명의 특징은

1) 백일해톡소이드와 흡착시에 황산암모늄을 33%되게 서서히 가한다.

2) 백일해톡소이드 추출시에 0.05M PBS(1M-NaCl)을 가하고 10,000rpm으로 20분간 원심분리한다.

3) 서당밀도 구배 원심분리시 37,000rpm, 18시간 원심한다.

4) 무독화 공정시에 포르마린을 0.3-0.4% 되도록 가하고 37℃에서 2주간 무독화시킨다.

이렇게 행함으로서 고순도로 정제되고 고액가의 백일해 백신을 얻을 수 있다.

본 발명을 실시예로서 상세히 설명하면 다음과 같다.

[실시예 1]

백일해 독소 생산용균주(Bordetella Pertussis Tohama Phase I)을 사용하여 종균배양용 후라스크에 액체배지(stainer-scholte medium) 100㎖정도 넣고, 종균을 접종하여 24-48시간 동안 35℃에서 진탕 배양한 후 이 배양액을 독소생산용 병에(배지 250㎖씩 분주한 것) 10㎖씩 접종하고, 35℃에서 4-5일간 정치 배양한 후 균체를 제거한 여액에 황산암모늄을 포화농도 33%되게 서서히 가하여 녹인 후 4℃ 냉장고에서 6일간 정치한 후 10,000rpm, 20분간 원심분리하여 상청을 버리고 침전물을 인삼염 완충액(1M 염화나트륨 함유 pH 8.0)으로 5-10회 정도 소량씩 추출한 여액을 모아 다시 황산암모늄을 포화농도 50%되게 가하여 4℃에서 3일간 정치한 다음 10,000rpm, 20분간 원심분리하여 상청액을 버리고 침전물을 취하여 위의 인산염완충액으로 투석한 다음 밀리포아 여과기로 여과하여 조날서당밀도구배원심 분리법(Zonal sucrose density gradient centrifugation SW. 40Ti Rotor)으로 4℃에서 37,000rpm, 18시간 원심분리하여 프랙숀 콜렉타(Fraction collector)로 분획하여 ELISA법(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)으로 항원의 역가를 측정하고 방어획분만을 모아 다시 전기영동(Polyacrylamide gel electrophoresis)에 의하여 순수 분획여부를 확인하고, 면역 전기영동에 의하여 항원 항체반응을 시험하였으며, 이렇게 얻어진 순수한 항원의 역가는 400-1,000 Eu/㎖였으며, 분자량은 113,000 정도였다. 이 방어획분을 포르말린 0.3-0.4%되게 하여 37℃에서 2주간 무독화한 다음 인산염완충액으로 투석하여 포르말린을 제거하고, 적당한 공지 안정제와 알럼에 흡착시킨 것을 원액으로 하여 생물학적 제제 기준에 의한 최종원액 시험과 희석한 소분제품의 시험을 하였으며, 위의 전 공정중 온도는 2-20℃를 유지하였으며, 사용한 완충액은 발열성 물질이 함유되지 않은 것을 사용하였다.

[실험예 1]

마우스 체중 감소 시험법에 의하여 마우스는 생후 4주된 것을 사용하였으며, 본품과 독성 참조품을 대수적 등 간격으로 생리식염수에 희석하여 마리당 0.5㎖를 1회 복강내에 주사하고 16시간 후 그 결과를 평행선 검정법을 이용하여 상대역가와 신뢰한계의 추정까지 구하였다. 여기서 마우스 체중감소 활성은 7.437 BWD U/㎖였다(생물학적 제제기준 : 10BWD /㎖이하).

[실험예 2]

실험예 1에서 사용된 마우스를 주사 3일 후에 말초백혈구 수를 측정하는 것으로 꼬리끝에서 1-1.5cm 부근에서 나오는 혈액을 10μℓ 마이크로파이펫 (Micr opipet)으로 채취하여 쿨터계산용(Coulter counter용) 용액 10㎖에 희석한 것의 백혈구 수를 측정하여 통계학적인 처리를 한 결과 백혈구 수 증가활성은 0.292 LPF U/㎖였다(생물학적 제제기준 : 0.5 LPF U/㎖ 이하).

[실험예 3]

실험예 2에서 실험이 끝난 마우스를 1일 후 히스타민 디하이드로클로라이드 (Histamine dihydrochloride)를 생리식염 수로 희석하여 그 0.5㎖에 4mg씩 들어있게 하여 이것을 복강내에 주사한 다음 30분 후에 마우스의 직장내 체온을 전자체온계로 측정하고 이것을 통계처리한 결과 히스타민 증감활성은 0.129 HS U/㎖였다(생물학적 제제기준 : 0.8 HS u/㎖ 이하).

[실험예 4]

본품 및 표준품을 4배 또는 다른 대수적 등간격으로 3단계 희석한 다음 생후 4주된 마우스 16마리 이상을 한 그룹(Group)으로 하여 마리당 0.5㎖씩 복강내에 접종하며, 이때 동물은 동성을 한 그룹으로 하고, 면역주사후 21일에 마리당 공격용 균부유액 0.025㎖씩을 뇌내에 접종하였다. 접종후 14일간 관찰한 결과 본품의 역가는 15,856 IU/㎖로서(생물학적 제제기준 8 IU/㎖ 이상) 표준품 이상이었다.

실시예 1에서 제조된 백일해 예방약은 통상의 제제화 방법으로 제제화하여 사용될 수 있다.

Claims (1)

1. 백일해 독소생산용균주(Bordetella Pertussis Tohama Phase I)를 스타이너-숄테액체 배지에서 배양한 후 최초 황산암모늄 33%를 가하여 용해시키고 4℃에서 6일간 정치하고 10,000rpm, 20분간 원심분리한 침전물을 인산염 완충액(1M-NaCl, pH 8.0)으로 추출한 여액에 황산암모늄 50% 되게 가하여 4℃에서 3일간 정치한 후 10,000rpm, 20분간 원심분리한 침전물을 인산염 완충액으로 투석하고 여과한 후 조날 서당 밀도 구배 원심분리법으로 4℃에서 37,000rpm, 18시간 원심분리한 후, 얻어진 획분을 포르마린 0.3-0.4% 되게 가하고 37℃에서 2주간 무독화시킨 후 인산염완충액으로 투석하여 부작용을 1/10로 감소시킨 고도정제의 고순도 백일해 예방약을 제조하는 방법.