HRP20030147A2 - Vaccination aganist host cell-associated herpesviruses - Google Patents
Vaccination aganist host cell-associated herpesviruses Download PDFInfo
- Publication number
- HRP20030147A2 HRP20030147A2 HR20030147A HRP20030147A HRP20030147A2 HR P20030147 A2 HRP20030147 A2 HR P20030147A2 HR 20030147 A HR20030147 A HR 20030147A HR P20030147 A HRP20030147 A HR P20030147A HR P20030147 A2 HRP20030147 A2 HR P20030147A2
- Authority
- HR
- Croatia
- Prior art keywords
- mdv
- virus
- genome
- herpesvirus
- cells
- Prior art date
Links
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 title claims abstract description 49
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 title claims abstract description 20
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims abstract description 77
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims abstract description 76
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims abstract description 40
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims abstract description 17
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims abstract description 17
- 230000006798 recombination Effects 0.000 claims abstract description 9
- 238000005215 recombination Methods 0.000 claims abstract description 9
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 62
- 241000701047 Gallid alphaherpesvirus 2 Species 0.000 claims description 49
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 27
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 19
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 19
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 15
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 15
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 14
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 claims description 9
- 244000052769 pathogen Species 0.000 claims description 9
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims description 8
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims description 8
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 8
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 claims description 7
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 6
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 4
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 4
- 238000013519 translation Methods 0.000 claims description 4
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 claims description 3
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 claims description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 2
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 abstract description 13
- 241000701085 Human alphaherpesvirus 3 Species 0.000 abstract description 9
- 244000144977 poultry Species 0.000 abstract description 8
- 241001051756 Mardivirus Species 0.000 abstract description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 119
- 210000004436 artificial bacterial chromosome Anatomy 0.000 description 51
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 43
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 35
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 27
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 22
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 20
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 20
- 208000006758 Marek Disease Diseases 0.000 description 18
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 18
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 18
- 208000024191 minimally invasive lung adenocarcinoma Diseases 0.000 description 18
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 17
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 17
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 17
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 17
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 15
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 11
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 11
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 9
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 9
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 9
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 9
- LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 9H-xanthine Chemical compound O=C1NC(=O)NC2=C1NC=N2 LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 8
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 8
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 8
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 8
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 8
- 235000013594 poultry meat Nutrition 0.000 description 8
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 8
- 101100355997 Bacillus subtilis (strain 168) recA gene Proteins 0.000 description 7
- 101100301301 Escherichia coli (strain K12) recE gene Proteins 0.000 description 7
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 7
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 7
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 7
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 7
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 7
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 7
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 7
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 6
- 101150029683 gB gene Proteins 0.000 description 6
- 101150022010 gam gene Proteins 0.000 description 6
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 6
- AGBXEAQAOHJACV-UHFFFAOYSA-N 7-(2,3-dihydroxypropyl)-1,3-dimethyl-8-(pyridin-3-ylmethyl)purine-2,6-dione Chemical compound OCC(O)CN1C=2C(=O)N(C)C(=O)N(C)C=2N=C1CC1=CC=CN=C1 AGBXEAQAOHJACV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 5
- 241000700587 Alphaherpesvirinae Species 0.000 description 5
- SHIBSTMRCDJXLN-UHFFFAOYSA-N Digoxigenin Natural products C1CC(C2C(C3(C)CCC(O)CC3CC2)CC2O)(O)C2(C)C1C1=CC(=O)OC1 SHIBSTMRCDJXLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 5
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 5
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 5
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 5
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 5
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- QONQRTHLHBTMGP-UHFFFAOYSA-N digitoxigenin Natural products CC12CCC(C3(CCC(O)CC3CC3)C)C3C11OC1CC2C1=CC(=O)OC1 QONQRTHLHBTMGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- SHIBSTMRCDJXLN-KCZCNTNESA-N digoxigenin Chemical compound C1([C@@H]2[C@@]3([C@@](CC2)(O)[C@H]2[C@@H]([C@@]4(C)CC[C@H](O)C[C@H]4CC2)C[C@H]3O)C)=CC(=O)OC1 SHIBSTMRCDJXLN-KCZCNTNESA-N 0.000 description 5
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 5
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 5
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 5
- RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N Acetaminophen Chemical compound CC(=O)NC1=CC=C(O)C=C1 RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 4
- 101100356230 Escherichia coli (strain K12) recT gene Proteins 0.000 description 4
- 108700039887 Essential Genes Proteins 0.000 description 4
- 241000700588 Human alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 4
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000286209 Phasianidae Species 0.000 description 4
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 4
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 description 4
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 4
- HPNSFSBZBAHARI-RUDMXATFSA-N mycophenolic acid Chemical compound OC1=C(C\C=C(/C)CCC(O)=O)C(OC)=C(C)C2=C1C(=O)OC2 HPNSFSBZBAHARI-RUDMXATFSA-N 0.000 description 4
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- 229940075420 xanthine Drugs 0.000 description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 3
- 108010041986 DNA Vaccines Proteins 0.000 description 3
- 229940021995 DNA vaccine Drugs 0.000 description 3
- 101100522841 Drosophila melanogaster pygo gene Proteins 0.000 description 3
- 241001302160 Escherichia coli str. K-12 substr. DH10B Species 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 3
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 3
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 3
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 3
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 description 3
- 230000008774 maternal effect Effects 0.000 description 3
- HPNSFSBZBAHARI-UHFFFAOYSA-N micophenolic acid Natural products OC1=C(CC=C(C)CCC(O)=O)C(OC)=C(C)C2=C1C(=O)OC2 HPNSFSBZBAHARI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 3
- 229960000951 mycophenolic acid Drugs 0.000 description 3
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 3
- 230000007505 plaque formation Effects 0.000 description 3
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 241000230501 Equine herpesvirus sp. Species 0.000 description 2
- 241000700586 Herpesviridae Species 0.000 description 2
- 241000701024 Human betaherpesvirus 5 Species 0.000 description 2
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 2
- 101150027427 ICP4 gene Proteins 0.000 description 2
- XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N IDUR Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(I)=C1 XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 2
- 206010062016 Immunosuppression Diseases 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000701093 Suid alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 2
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 101150108190 US2 gene Proteins 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 210000003837 chick embryo Anatomy 0.000 description 2
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 2
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 2
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000007479 molecular analysis Methods 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 2
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 2
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 2
- 101150021083 recB gene Proteins 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 2
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 1
- 206010002942 Apathy Diseases 0.000 description 1
- 102100022717 Atypical chemokine receptor 1 Human genes 0.000 description 1
- 241000711404 Avian avulavirus 1 Species 0.000 description 1
- 102100032305 Bcl-2 homologous antagonist/killer Human genes 0.000 description 1
- 241000701066 Bovine gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 1
- 241001260012 Bursa Species 0.000 description 1
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 1
- 241000725585 Chicken anemia virus Species 0.000 description 1
- 108020004638 Circular DNA Proteins 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150026402 DBP gene Proteins 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- SNRUBQQJIBEYMU-UHFFFAOYSA-N Dodecane Natural products CCCCCCCCCCCC SNRUBQQJIBEYMU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000223924 Eimeria Species 0.000 description 1
- 108091092566 Extrachromosomal DNA Proteins 0.000 description 1
- 208000000666 Fowlpox Diseases 0.000 description 1
- 101150109586 Gk gene Proteins 0.000 description 1
- 102100021519 Hemoglobin subunit beta Human genes 0.000 description 1
- 108091005904 Hemoglobin subunit beta Proteins 0.000 description 1
- 208000007514 Herpes zoster Diseases 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000678879 Homo sapiens Atypical chemokine receptor 1 Proteins 0.000 description 1
- 101100048372 Human cytomegalovirus (strain AD169) H301 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100048373 Human cytomegalovirus (strain Merlin) UL18 gene Proteins 0.000 description 1
- 101001042049 Human herpesvirus 1 (strain 17) Transcriptional regulator ICP22 Proteins 0.000 description 1
- 101000999690 Human herpesvirus 2 (strain HG52) E3 ubiquitin ligase ICP22 Proteins 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-HWQSCIPKSA-N L-arabinopyranose Chemical compound O[C@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-HWQSCIPKSA-N 0.000 description 1
- 101710084021 Large envelope protein Proteins 0.000 description 1
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 1
- 101150047390 MCP gene Proteins 0.000 description 1
- 241000710118 Maize chlorotic mottle virus Species 0.000 description 1
- 241000701029 Murid betaherpesvirus 1 Species 0.000 description 1
- 101150041636 NEC1 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000012902 Nervous system disease Diseases 0.000 description 1
- 208000025966 Neurological disease Diseases 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 208000027954 Poultry disease Diseases 0.000 description 1
- 241000702263 Reovirus sp. Species 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- 108010008038 Synthetic Vaccines Proteins 0.000 description 1
- 206010042971 T-cell lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 208000027585 T-cell non-Hodgkin lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 101150048584 TRM3 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150037769 TRX2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101800000385 Transmembrane protein Proteins 0.000 description 1
- 101150018115 UL10 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150087840 UL11 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150109748 UL19 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150060044 UL26 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150003230 UL27 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150072074 UL28 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150008036 UL29 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150068034 UL30 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150011902 UL52 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 208000007502 anemia Diseases 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N arabinose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012411 cloning technique Methods 0.000 description 1
- 238000012761 co-transfection Methods 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000002194 freeze distillation Methods 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 101150055782 gH gene Proteins 0.000 description 1
- 101150040331 gM gene Proteins 0.000 description 1
- 238000012224 gene deletion Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- -1 herpes nucleic acid Chemical class 0.000 description 1
- 230000005571 horizontal transmission Effects 0.000 description 1
- 210000000688 human artificial chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000001926 lymphatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 210000000663 muscle cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 238000013492 plasmid preparation Methods 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 101150059999 pro gene Proteins 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 description 1
- ZSIALBZCWCLSOG-UHFFFAOYSA-N pyrimidine;hydroiodide Chemical compound I.C1=CN=CN=C1 ZSIALBZCWCLSOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007420 reactivation Effects 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 1
- 101150087770 recT gene Proteins 0.000 description 1
- 229940124551 recombinant vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000004621 scanning probe microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 229940031626 subunit vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 101150046896 trm1 gene Proteins 0.000 description 1
- 230000005760 tumorsuppression Effects 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 229940125575 vaccine candidate Drugs 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/245—Herpetoviridae, e.g. herpes simplex virus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
- A61P31/22—Antivirals for DNA viruses for herpes viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
- A61K2039/523—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells expressing foreign proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
- A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/16011—Herpesviridae
- C12N2710/16311—Mardivirus, e.g. Gallid herpesvirus 2, Marek-like viruses, turkey HV
- C12N2710/16322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Oncology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Description
Izum se odnosi na područje vakcinacije protiv takozvanih herpes virusa asociranih na stanice domaćina kao što je virus Marekove bolesti (MDV) peradi, i virus Varicella Zoster (VZV, uzrokovani kokošjom kugom i zoster nakon reaktivacije iz latencije) ljudi i vakcinacija protiv bolesti uzrokovanih tim virusima, i točnije odnosi se na bolesti peradi potanko na područje vakcinacije protiv Marekove bolesti.
Potanko, Marekova bolest postala je problem u peradarskoj industriji s početkom intenzivne proizvodnje mesa peradi. To je herpesvirusna bolest koja uzrok je vrlo različite simptome polazeći od imunosupresije, neuroloških smetnji, anemija i nespecifičnih apatija i završava brojnim limfatičnim karcinomima u kasnijem stadiju infekcije. Na početku povijesti Marekove bolesti nije bilo tretmana i preventivnih mjera. Potom je izoliran apatogeni (Serotip 3) virus iz purana (HVT) i u početku se koristio za vakcinaciju.
Međutim, kasnije nakon nekog vremena uvedena je vakcinacija s HVT, Marekova bolest se opet pojavila i postalo je očito, tako da je cirkulacijom divlji virus promjenjen i je spriječena zaštita s HVT-sojem. U to vrijeme je otkriven novi apatogeni virus (Rispens soj), koji općenito ima isti serotip kao virus koji uzrokuje bolest. Taj vakcinalni soj vrlo brzo je uveden na tržište i daje vrlo dobre rezultate vakcinacije.
Međutim, ponovo nakon desetak godina novo javljanje bolesti, ponovo cirkulacijom promjenjenog divljeg virusa inducirana je zaštita upotrebljenim vakcinalnim sojem. Potom je upotrebljena kombinacija u obliku vakcina (HVT i Rispensa) za zaštitu životinja, međutim, zadovoljavajući rezultati su bili samo privremeni. Općenito, nova probijanja bolesti javlja se usprkos svim tim vakcinacijama. Razlog za to nije još razumljiv ali je jasna potreba za uvođenje nove potentnije vakcine.
Problemi povezani s vakcinacijom protiv Marekove bolesti su usprkos činjenici, da se vakcine Marekove bolesti proizvode kroz duže razdoblje, metoda proizvodnje vakcine ne može se poboljšati. Razlog tomu je, taj da je općenito virus u suštini asociran na stanice domaćina može rasti u suštini samo na primarnim stanicama domaćina kao što je u slučaju MDV ili HVT u primarnim stanicama kao što su fibroblasti pripremljeni od peradi, kao što su pilići , slobodni od patogena a u slučaju Varicella Zoster virusa u (zapravo primarnim) humanim stanicama (opet, naravno slobodne od kontaminacije patogenima) i ne mogu ili samo s velikim poteškoćama se može postići izvan konteksta specifičnih stanica pojedinog domaćina. To čini općenito teškim da vakcine usmjerene protiv virusnih infekcija ili bolesti uzrokovanih s tim tipom virusa, ako nije skoro nemogućeg na praktičnom nivou, za proizvodnju i tako skupo.
Na primjer, Rispens vakcine usmjerene protiv Marekove bolesti, koja se sada smatra dovoljno potentnom, je kao svi serotipovi-1 Marekovog virusa točno asocirana na stanice domaćina. Infektivnost virusa asociranog na stanicu (kao naprimjer serotip 1 i 2) je potpuno izgubljeni tijekom normalnog smrzavanja ili liofilizacije. Zato proizvodnja vakcine uključuje vrlo komplicirane i skupe faze, gdje se cijele stanice mora smrznuti u tekućem dušiku. Vakcina se mora skladištiti i transportirati i čuvati u tekućem dušiku sve do upotrebe i radi toga se stvaraju veliki troškovi i problemi tijekom transporta.
Zatim, na mjestu upotrebe, vakcina se mora koristiti veoma pažljivo, jer su inficirane stanice jako osjetljive na faktore okoliša. Faktori kao što su povišena temperatura, izlaganje svjetlu i ostatak detergenata u korištenom sudu često su opasnost za virus tako da nije dovoljno sposoban za život serija koje se može proizvesti, dovodi do potpunog neuspjeha vakcine. Takav neuspjeh se može prepoznati samo kada je već bolest počela a napadnuta perad pokazuju simptome bolesti.
Ukratko, sve do sada pokušaji inaktivacije-, subjediničnih- i rekombiniranih vakcina za zaštitu protiv Marekove bolesti su manjkavi i zato nema alternative za živu, stanično asociranu vakcinu koja sadržava virus Marekove bolesti. Marekova bolest se kontrolira aplikacijom preparata inficiranih stanica kao vakcine. Ti preparati ne sadržavaju samo Žive stanice suspendirane u mediju koji sadržava DMSO i sve vrste celularnih antigena, i isto ih treba čuvati u tekućem dušiku. Otuda, da treba hladni lanac održavati od proizvodnje vakcine do korisnika vakcine i sve do aplikacije. Osim toga, jedanput odmrznutu vakcinu treba aplicirati unutar vrlo kratkog razdoblja i svaka ptica treba biti vakcinirana. Brojni od tih problema su uključeni s željom da se pripremi vakcina protiv drugih esencijalnih herpesvirusa stanično asociranih kao što je virus Varicella Zoster.
Virus Marekove bolesti (MDV) je iz skupine Alphaherpesvirinae subfamilije Herpes vi rida e, Lee et al., 2000, Murphy et al., 1995). Bazirano na virulenciji za piliće i mogućnosti induciranja lirafoma T stanica, MDV se općenito grupira u 3 serotipa (MDV-1, MDV-2, i MDV-3). MDV-3 predstavlja herpesvirus pura (HVT) koji se široko koristi za vakcinaciju protiv bolesti povezanih s MDV. Međutim, nakon manjkave vakcinacije i razvoja takozvanog virulentnog ili veoma virulentnog MDV-1 (Witter, 1985), atenuiranih MDV-2 sojeva i kasnije atenuiranih MDV-1 sojeva (npr. soj CVI 988 Rispens) koriste se u formulaciji vakcina (Winter, 1985). Zadnjih godina i prvi izvještaj u Sjedinjenim državama, čak i virulentniji MDV-1, takozvani jako plus virulentni (w+), MDV-1 varijante javljaju se i uzrokuju visoku incidenciju Marekove bolesti i mortalitet uzrokovan razvijanjem tumora i imunosupresije vrlo brzo nakon infekcije (Witter, 1997). Jedan w+ soj, 584A, pasiran je više od 100 puta na fibroblastima pilećih embrija (CEF) i pokazao je gubitak patogenosti za piliće (Witter, 1997). Međutim, molekularna osnova porasta patogenosti w+MDV-1 i slično za gubitak virulencije su teško razumljivi jer molekularnu analizu MDV-1 je teško izvesti. S jedne strane, ne ili samo mala količina progenog infektivnog virusa se otpušta u uzgojene stanice, a s druge strane produkcija MDV-1 rekombinanata je laboratorijska i zato priroda visoko stanično asociranih sredstava u staničnoj kulturi, potrebne su višekratne purifikacije rekombinati virusa (Cantello et al., 1991; Sakaguchi et al., 1993; Parcells et al., 1994; Schat et al., 1998; Anderson et al., 1998).
Na vrhu toga, kao što je već gore spomenuto, vakcinacija ne može garantirati zaštitu životinja od divljih virusa Marekove bolesti. Virus -kao svi herpes virusi- je sposoban naći put izmicanju imunom odgovoru induciranom vakcinom. Zbog toga je potrebna brza adaptacija vakcina na situaciju divljeg virusa. Općenito, to je sada učinjeno izolacijom divljih izolata (kao što je HVT ili Rispens) i/ili daljnjim atenuiranjem in vitro. Izolacija sama po sebi uzrokuje silne probleme jer je problemetično dobiti infektivni virus stanično asociran izvan pilića, i inficiranu stanicu u staničnoj kulturi. Fazu atenuiranja tako slijedi veoma težak postupak koji zahtjeva puno vremena osobito do purifikacije plakova koja je izuzetno teška, zbog prirode stanično asociranog virusa.
Rezultat atenuiranja uobičajeno nije definiran. Kao rezultat te činjenice nema vakcine koja će osigurati pomoć, gdje sadašnji HVT- i Rispens-tip vakcina nedostaje, za ulazak na tržište kroz duže vrijeme. Osim toga često ponovno-atenuiranj e se javlja tijekom proizvodnje vakcine kada je provedena pasaža virusa više puta. To dalje pogoršava nisku učinkovitost HVT- i Rispens-tipa vakcina. Ukratko, slijedeći problemi čine veliki dio sadašnje mrtve točke u kontroli MDV. Mala je reproducibilnost klasične produkcije vakcine, ponovno-atenuiranje vakcinalnog virusa, definirano atenuiranje valcinalnog virusa, visoka cijena proizvodnje, visoka cijena skladištenja i transporta, velika osjetljivost vakcine na faktore okoliša, i veoma spori razvoj novog vakcinalnog soja osobito stanično asociranih virusa.
Ti problemi su sastavljeni od činjenice da sada cirkulacija divljih virusa daje visoki porast titra protutijela u peradi u intenzivnoj proizvodnji, čime se taj visoki titar protutijela prenosi maternalnim protutijelima u jaja. Djelovanje tih maternalnih protutijela tijekom početne infekcije virusnom vakcine pada učinkovitost vakcinacije protiv Marekove bolesti.
Izum osigurava vakcinu protiv infekcija uzrokovanih herpesvirusom tako da zapravo asocirane stanice domaćina obuhvaćaju rekombinirani genom virusa izveden iz navedenog herpes virusa, navedeni genom dopušta rekombinaciju zapravo slobodne navedene stanice domaćina. Za taj učinak, izum s ovdje osiguranim rekombiniranim virusnim genomom deriviranim iz herpesvirusa tako se smatra da je uglavnom asociran u stanicu domaćina, navedeni genom preferirano je sposoban do najmanje neke mjere replicirati se i istovremeno omogućiti rekombinaciju uglavnom slobodnih ili neovisnih navedenih stanica domaćina, homologna rekombinacija u eukariotskim stanicama dalje se ne zahtjeva. Detaljni opis takvih genoma osiguran je za virus sličan Marekovoj bolesti.
U tom pogledu, kao primjer genoma seroptipa 1 virusa Marekove bolesti (MDV-1), soj 584Ap80C, je kloniran u Escherichia coli kao artificijelni bakterijski kromosom (BAC). BAC vektor sekvencije su uvedene u Us2 lokus MDV-1 genoma s homolognom rekombinacijom nakon co-transfekcije fibroblasta pilećih embrija (CEF) s virusnom DNA i rekombiniranim plazmidom pDS-pHA1 koji sadržava BAC sekvencije i Eco-gpt gen umjesto MDV-1 Us2 gen i postrane sekvencije. Progen transfekcija se pasira na CEF stanicama u prisutnosti mikofenolne kiseline i ksantina/hipoksantina. Nakon 4 kruga selekcije, virusna DNA se preperira i koristi za transformiranje Escherichia coli soj DH10B. Brojne kolonije sklanjaju kompletni MDV-1 genom koji je identificiran. Ti MDV-1 BACs su trensfektirani u CEF stanice i nakon 3 dana iza transfekcije inficirani MDV-1 je oporavljen. Rast oporavljene MDV-1 iz različitih BACs ne može se razlikovati od onih gdje je parenteralni virus ispitan s formiranjem plakova i determinacijom krivulje rasta.
Izum tako osigurava postupak proizvodnje ili dobivanje rekombiniranih zapravo stanično asociranih herpesvirusnih genoma koji sadržavaju (ako se zahtjeva skoro kompletne ili kompletne) inficirane herpesvirusne nukleinske kiseline derivirane iz MDV i/ili VZV izolata.
Naravno, sada tako čisti kompletni genom je dobiven bez stanica domaćina izvorno se mislilo da su izvorno nepromjenjivo asocirane, izum isto osigurava genom u skladu s izumom tako da dozvoljava potpunu aplikaciju svih tehnika rekombincije koje su dostupne stručnjacima molekularne biologije, to je na primjer tako da se osigura vakcinu u skladu s izumom koja sadržava najmanje(replicirajući) minigenom.
Na primjer, izum osigurava minigenome takve, tako da suosigurani za ekspresiju samo oni koji se mogu vezati na glikoproteine (kao što su gB, gC, gD ili njihove kombinacije) i npr. ICP4 ili druge produkte gena tako da pokazuju induciranje staničnog imuniteta herpesvirusa. Takvi minigenomi na primjer služe za identifikaciju gena, tako da su važni u zaštiti, uzevši u obzir tu replikaciju genoma u (eukariotskoj) stanici domaćina nisu dalje osigurani. Dodatni primjer HCMV ili SV40 promotora nasuprot svakom genu ili konstrukciji gena osigurati će za krajnju identifikaciju minimalnih protektivnih jedinica. Za replikacijsku komponentu minigenoma izuma osigurano je brisanje cjeline, ili glavnog djela US područja, i time nastaje replikacija minivirusa također u stanici domaćina.
U drugom ostvarenju, izum osigurava one genome koji obuhvaćaju čistu kopiju cijele dužine derivirane iz navedenog herpesvirusa, zapravo cijele dužine ovdje indicirane tako da je prisutan veliki dio genoma navedenog virusnog genoma, osim za neke koji su preferirano (najmanje funkcionalno) ispušteni kao što je čisti gen zapravo za replikaciju ili virus proširen u domaćinu ili kulturi stanica domaćina, kao što je ovdje detaljno opisano. U tom pogledu, na primjer, u jednom od traženih genoma u skladu s izumom, BAC20, sekvencije enkodiranog glikoproteina B (gB) biti će izbrisane s jednofaznom recE-posredovanom mutacijom linearnog fragmenta DNA. Glikoprotein B-negativnog MDV-a rekonstituiranog nakon transfekcije gB-negativnog BAC20 DNA (20DgB) samo su sposobne za rast stanica osiguravajući gB in trans/ pokazujući da gB je bitan za rast MVD-1 u kulturi stanica domaćina. Drugi gen bitan za rast, i za koji se mogu osigurati stanice koji proizvodi produkt gena in trans su gH, IPC4, ULI5, U128 i U19, ili drugi geni koji se smatraju bitnima za rast kao što je pobrojano dolje.
Nadalje, izum osigurava upotrebu genoma u skladu s izumom za proizvodnju vakcina, u jednom ostvarenju kao što je vakcina protiv bolesti uzrokovane infekcijom zapravo sa stanično asociranim herpes virusom, međutim, u drugom ostvarenju takva vakcina može sa koristiti kao vektor vakcine i može obuhvaćati druge ili dodatne patogene ili nukleinske kiseline zato različito enkodirane. Za MDV, preferirani dodatni patogene nukleinske kiseline obuhvaćaju nukleinske kiseline derivirane iz na primjer virusa njukaslske bolesti, Eimeria spp.f Salmonella spp, virusa anemije pilića, virusa zarazne bolesti burze, reovirusa, ili drugih virusa uobičajeno prisutnih u peradi.
Tako, izum isto osigurava vakcine gdje navedeni genom sadržava funkcionalno brisanje u genu bitno za replikaciju i/ili rašireni navedeni herpes virus u stanicu domaćina, ili gdje navedeni genom virusa najmanje sadržava nukleinsku kisleinu enkodiranu kao antigenu tvar sposobnu izvesti (preferirano čisti protektivni) imuni odgovor protiv pojedinih infekcija navedenim herpes virusom. Tipični čisti gen ili fragment iz tih koji će biti izbrisani može naprimjer biti MDV homolog UL1= glikoprotein L; UL5; UL8; UL9; UL15/ UL18; UL19; UL22 = glikoprotein H; UL26; UL26.5; UL27=glikoprotein B; UL28; UL29; UL30: UL52; UL53; ICP4 ili geni ili njihovi fragmenti odabrani iz US područja genoma (slika 1).
U preferiranom ostvarenju, izum osigurava vakcine koje obuhvaćaju funkcionalnu deleciju u genu bitnu za izvlačenje markera imunog odgovora specifičnog za navedeni herpes virus što se smatra imunološkom diskriminacijom između pojedinačno vakciniranih s navedenom vakcinom i pojedinačno inficiranih s navedenom čistim stanično asociranim herpes virusom. Preferirano markirani odgovori su na primjer izravno na gC, gM, gD, ili gE, s time da će detaljnijim opisom biti kasnije objašnjeno (ovdje u slučaju gM) takva delecija u genu bitnom za izvlačenje markera imunog odgovora.
Nadalje, izum osigurava vakcinu u skladu s izumom gdje navedeni virusni genom sadržava najmanje nukleinsku kiselinu enkodirane proteinske spojeve sposobne za moduliranje transkripcije i/ili translacije nukleinske kiseline enkodirane antigene tvari sposobne za izvlačenje imunog odgovora na infekciju s navedenim herpes virusom.
Preferirano, navedena vakcina obuhvaća zapravo cijelu dužinu kopije derivirane iz navedenog herpes virusa, za održavanje mnogih funkcija zahtjevanih za učinkovitu modulaciju transkripcije i/ili translacije genoma vakcine u vakciniranom domaćinu, međutim, minigenomna vakcinacija isto je osigurana ovdje. Naravno preferira se učinkovito modulirana transkripcija i/ili translacija nukleinske kiseline enkodirane za strani patogen, ili antigenu tvar deriviranju iz njega, kada je ekspresija dodatnog patogena ili antigene tvari derivirane iz tih navedenih genoma, a može biti promatrana isto kao strana (tj., ne-herpes virusni regulatorni elementi) osigurana za navedeni genom kada je osigurana vakcina u skladu s izumom s nukleinskom kiselinom koja enkodira dodatni patogen.
Potanko, izum osigurava vakcinu skladu s izumom gdje navedeni herpes virus obuhvaća Marekovoj bolesti sličan virus. Detaljnije preferira se osiguravanje vakcine gdje je virus Marekove bolesti obuhvaća serotip 1. Isto, sada te metode manipulacije genomom uključene u kasniji kontekst stanica domaćina s kojima je osiguran genom izvorno je asociran, vakcina je tako dobivena, umjesto da je derivirana iz uobičajeno atenuiranog ili avirulentnog izolata visusa Marekove bolesti, je deriviran umjesto iz virulentnog, jako virulentnog ili jako virulentnog plus divljeg virusa, jer brza izolacija infektivnog klona iz divljeg izolata sada je moguća, dozvoljava pripremu DNA vakcina za prevenciju Marekove bolesti vakcinom u pilića i pura, gdje mutacije u genomu može biti vrlo brzo uvedena. Isti sustav se može koristiti i za druge bitne stanično asocirane herpes viruse kao što je virus Varicella Zoster.
Upotreba repliciranih virusnih genoma koja osigurava ovdje sadržaj dijelova ili cjeline genoma virusa Marekove bolesti otvara nove mogućnosti za stvaranje učinkovitijih, biološki sigurnijih i stabilnijih MDV-1 vakcina. Radi činjenice da rekombinirani MDV-1 je ponovo oživljen iz klonirane DNA, progeni virus je rezulirao iz DNA transfekcije i može se bolje karakterizirati i "over-atenuiranje" vakcinalnih virusa može se izbjeći. Npr. broj 132-bp ponavlja koji se pojavljuje kao asocirani s atenuiranim (Maotani et al., 1986) može biti točno determiniran i -ako je potrebno- reduciran ili produžen u skladu s potrebnom za proizvodnju vakcine ili situacijom na terenu (vidi niže). Stvaranje mutanta MDV-1 je jako olakšano. Do sada, MDV-1 mutanti su stvarani laboratorijski i vremenski-konzumirani homolognom rekombinacijom i slekcijskom procedurom u eukariotskim stanicama. Taj postupak selekcije-kao što je izvješteno za druge herpesviruse- često je rezultat mutacije genoma različit od željenog, osobito u slučaju MDV-1 virusa bez stanice koji se može dobiti kada se radi selekcija i ponovo otkriva i razmnožava mutante čak i kompliciranije. Nasuprot tomu, izum osigurava postupak manipulacije virusnim genomom baziranom na mutagenezi preko recE, recT i recB/Osuprimirani X gam gena prisutnog u plazmidu pGETrec (Naravanan et al., 1999). Prednost sustava je (i) ta da samo 30 do 50 bp homolognih krakova je potrebno da ciljane specifične sekvencije koje će biti izbrisane, tj. brisanje bilo kojeg open reading frame može se ispuniti bez potrebe za kloniranjem rekombiniranih kaseta, (ii) metoda je veoma brza, i (iii) tako pGETrec vektor prenosi sustav mutageneze i eksperesije ampicilin rezistencije se vrlo brzo gubi iz bakterijskih stanica u odsutnosti ampicilina.
Upotrebom poznate tehnike koristeći postupak takozvanog E/T kloniranja, moguća je jedna faza mutacije i selekcije Escherichia coli (Muvrers et al., 1999; Naravanan et al., 1999; Zhang et al.,1998). Ta tehnika dozvoljava deleciju bitnog gena MDV-1 bez potrebe za upotrebom replikacije komplementnih linijskih stanica mutiranog genoma MDV-1 osiguranih ovdje ne zahtjeva se trans-komplementacija brisanih važnih gena. Osim toga, postupak kloniranja je potpuno nepotreban.
U drugom ostvarenju, izum osigurava metodu stvaranja MDV-1 ili drugih (važnih stanično asociranih herpes) virusa BACs, obuhvaća transformaciju naprimjer Escherichia coli DH10B stanica s plazmidom pBADapy, pGET ili svaki drugi plazmid tako induciran ili stabilno ekspresirani recE, recT i Kgam gen, sljedeći pripravom kružne DNA uzete od litičnih ili latentno inficiranih stanica naprimjer ex vivo ili iz stanične kulture. U paralelnom ili odvojenom postupku, linearna DNA zadržava vektor BAC sekvencija dopušta homolognu rekombinaciju vektora BAC sekvencije s virusnim DNA su opskrbljeni. Ta linearna DNA može npr. biti proizvedena s PCR ili s lineariziranim DNA plazmidom. Potom je osigurana ekspresija recE, recT i gam gen u Escherichia coli i elektrokompetentne stanice su osigurane (npr. Sambrook et al., 1989). DNA virusa je potom elektroporiran zajedno s zadržanim vectorom BAC sekvencije linearne DNA u kompetentnu Escherichia coli. Prevlačenje na agar koji sadržava određeni antibiotik osigurano je da bi sakupljene kolonija ili kolonije i BAC DNA pripravljene kao na primjer kao što je ovdje dato u detalj om opisu. Intenzitet kloniranog BAC DNA je provjeren transfekcijom primijivih stanica. U prilogu izuma dana je metoda genetske rekombinacije važnog genoma stanično asociranog herpes virusa dobivenog iz stanice domaćina ili tkiva bez potrebe za izvođenje (homologne) rekombinacije u eukariotskim stanicama kojom se može dobiti (ako se zahtjeva skoro kompletni ili kompletni) infekciozni genom ili nukleinska kiselina herpes virusa deriviranog iz terenskog izolata ili jednakog atenuiranog izolata.
Postupak ovdje osiguran isto će dati sljedeće atenuirane kandidate vakcine MDV-1 ili za stvaranje MDV-1 mutanata zadržanih gena drugih značajnih patogena pilića. Osim toga, razvijeno područje MDV-1 izolata s mogućim razlikama i promjenama antigenih svojstava može se računati za osiguravanje vakcina baziranih na promjenama pojedinih mutanata gena između kloniranih MDV-1 i ovih terenskih izolata. Te promjene-kao što je opisano gore- mogu se izvesti istom E/T tehnikom kloniranja i tako osigurati mogućnost vrlo brzog izvođenja promjena MDV-1. Atraktivna prednost ponovno dobivanje invektivnog MDV-1 iz gore opisanog, međutim, je upotreba genom da se osigura DNA vakcina. Sve do sada Marekova bolest je kontrolirana aplikacijom inficiranih-staničnih preparata.
Ti preparati ne sadržavaju samo žive stanice suspendirane u mediju koji sadržava DMSO i puno različitih celularnih antigena, isto se moraju čuvati u tekućem dušiku. Posljedično cijeli lanac se mora održavati od proizvodnje do korisnika vakcine i sve do aplikacije. Osim toga, jednom otopljena, vakcina se mora aplicirati unutar kratkog vremena i svaka ptica mora biti cjepljena. S MDV-1 genomom DNA kao što je osigurano ovdje, purifikacija "vakcine" (DNA) je jednostavno izvediva i reproducibilna. DNA je ekstremno stabilna, održavanje hladnog lanca nije neophodno, a infektivna DNA može se aplicirati na više načina (intramuskularno, intra-dermalno, u-jaje, oralno, respiratornim putem, itd.) i u različitim formulacijama (s ili bez nosača itd.). Osim toga, prisutnost maternalinih protutijela ne interferira s primarnom injekcijom imunogena. Kao takvi, MDV-1 genomi kao što su ovdje osigurani za prvo vrijeme dopuštaju mogućnost proizvodnje i stvaranja visoko učinkovitih i biološki sigurnih vakcina protiv tumorskih i ekonomski značajnih bolesti. Izum tako općenito osigurava metodu za ograničavanje rizika pojedinačnog javljanja ili potpunog manifestiranja bolesti uzrokovane infekcijom značajno sadržavaju stanično asocirane herpes viruse obuhvaćaju navedenu pojedinu vakcinu u skladu s izumom ili genomom u skladu s izumom.
Detaljan opis
Virus Marekove bolesti (MDV) je član Alphaherpesvirinae subfamilije Herpesviridae (van Reggenmortel et al., 1999). Bazirano na virulenciji za piliće, mogućnosti za induciranje limfoma T stanica i antigenih svojstava, MDV je grupira u tri serotipa (MDV-1, MDV-2, i MDV-3) (Payne, 1985) . MDV-3 predstavlja herpesvirus pura (HVT) koji se široko koristi za vakcinaciju protiv bolesti povezanih s MDV. U skladu s novijom nemonklaturom MDV-1 je klasificiran kao gallid herpesvirus 2 (GHV-2), MDV-2 kao GHV-3, i HVT kao meleagridni herpes virus. Sva tri virusa pripadaju u novi rod virusa sličnih Marekovoj bolesti unutar Alphaherpesvirinae.
Kontrola MDV-1 infekcija može se izvesti primarno vakcinacijom s HVT, međutim, neuspjeh nakon vakcinacije i opis takozvanog "jako virulentnog" MDV-1(Witter, 1989), MDV-2 soja i kasnije atenuiranog MDV-1 soja (npr. soj CVI 988 Rispens) koristi se u formulacijama vakcine (Witter, 1985).
Zadnjih godina i prvi izvještaj u Sjedinjenim državama, štoviše virulentni MDV-1, "vrlo virulentni plus" (w+), MDV1 varijante javljaju se i uzrokuju visoki mortalitet čak i u vakcinirane peradi (Witter, 1997). Jedan od tih w+ sojeva, 584A, serijski je pasiran na pilećim fibroblastima (CEF) i izgubio je patogenost za piliće (Witter, 1997). Molekularna osnova za porast patogenosti w+ MDV-1 i isto tako gubitak virulencije su slabo razumljivi jer molekularna analiza MDV-1 je problematična za izvođenje.
S jedne strane, razvoj neinfektivnih virusa je povezano s kultivacijom stanica, s druge strane proizvodnja MDV-1-rekombinananta u laboratoriju i zbog toga prirode sredstva jako asocira u stanice in vitro, potrebna je višestruka purifikacija rekombiniranih virusa (Cantello et al., 1991; Sakaguschi et al., 1993; Parcells et al., 1994,1995; Schat et al., 1998; Anderson et al., 1998). Osim toga primarne stanice moraju se koristiti za rast MDV-1 (Payne), što rezultira u činjenici da analiza bitnig MDV-1 gena je skoro nemoguća jer se ne mogu stvoriti trans-komplementirajuće linijske stanice Genomi murinog ili humanog citomegalovirusa (MCMV i HCMV; Messerle et al., 1997; Borst et al., 1999), herpes simplex virus tip 1 (HSV-1, Suter et al., 1998), virus pseudorabiesa (PrV; Smith et al.; 1999, 2000), i Epstein-Barr virus (EBV; Delecluse et al., 1998) klonirani su kao BACs upotrebom te tehnike.
Svrha te studije je osigurati bazu za brzu i učinkovitu produkciju MDV-1 rekombinanata kloniranjem kompletnog 180 kbp genoma u Escherichia coli. Infektivni MDV-1 je doveden gotovo u isti oblik nakon transfekcije kloniranog MDV-1 BAC DNA upotrebom CEF stanica i MDV-1 BACs su stabilni nakon nekoliko ciklusa rasta bakterija ili serijskog razmnožavanja u CEF stanicama.
Najnovije, moguće je zbog jedno-fazne delecije esencijalnog MDV-1 gena u Escherichia coli, sustav može imati veliki potencijal za olakšanje analize esencijalnih i neesencijalnih MDV-1 gena i korištenje kao sredstva za proizvodnju biološki sigurnog živog virusa i/ili DNA vakcina.
Materijal i metode:
Virus i stanice. Primarni i sekundarni fibroblasti pilećih embrija (CEF) ili mišićnih stanica prepelica (QM7) su održavane u Dulbecco modificiranom mediju (DMEM) s 5 do 10% fetalnog telećeg seruma (FCS). MDV-1 soj 584Ap80C ljubazno je osigurao Dr. Richard Witter, ADOL, East Lansing, Michigan, U.S.A. Soj 584Ap80C predstavlja avirulentnu staničnu kulturu pasiranih potomaka w+ soja 584A (Witter, 1997) i uzgojenog na primarnim ili sekundarnim CEF stanicama kao što je prethodno opisano (Osterrieder, 1999). QM7 stanice su testirane PCR-om na odsutnost MDV-1 sekvencija i Southern blot hibridizacijom određenih različitih područja genoma prije nego se koristi za razmnožavanje MDV-1 (Zelnik i Osterrieder, neobjavljeno). Krivulja rasta virusa je urađena kao što je opisano s malom modifikacijom (Parcells et al., 1994). Ukratko, 100 plak-formiranih jedinica (p.f.u.) koristi se za infekciju 2 X 106 svježih sjemenskih CEF stanica. Različito vrijeme nakon infekcije (O, 12, 24, 48, 72, 96, 120 sati), inficirane stanice se tripsiniziraju i titriraju na svježim CEF stanicama. Određuje se broj plakova a rezultat predstavlja srednju vrijednost od dva neovisna pokusa.
Linijske stanice QM7 sastavni dio ekspresiranih MDV-1 gB dobivene su transfekcijom 1X106 QM7 stanica s 10 µg pcMgB (Sl. 1), koji se baziraju na pcDNAS (Invitrogen) i sadržavaju MDV-1 gB gen iz soja Rispens CVI988 pod kontrolom humanog citomegalovirusa neposrednog ranog promotora. pcMgB-koji sadržavaju QM7 stanice odabran je u prisutnosti l mg/ml G418, i gB-ekspresiranog klona identificiranog upotrebom anti-gB monoklonskih protutijela (Mab) 2K11(osiguranih ljubaznošću Dr. Jean-Francois Vautherot, INRA, Tours, France). Nastale linijske stanice ekspresiranog MDV-1 gB su nazvane MgB1.
Konstrukcija MDV-1 BACs. MDV-1 DNA se purificiraju iz inficiranih stanica s natrij dodecil sulfatom-Proteinaza K ekstrakcijom kao što je ranije opisano (Morgan et al.,1990). Plazmid pDS-pHA1je konstruiran kao što slijedi. 2.1 i 3.1 kbp fragmenti s iste strane MDV-1 Us2 gena (slika 1) su povećani lančanom reakcijom polimeraze (PCR) upotrebom standardnih primera koji sadržavaju svojstvena mjesta restrikcijskih enzima (Tablica 1), i oba fragmenta su klonirana u pTZISR (Pharmacia-Amersham). BAC vektor sadržava Eco-gtp gen pod kontrolom HCMV neposrednog ranog promotora je otpušten iz plazmida pHAl (osiguranog ljubaznošću Dr. M.Messerle, LMU Minhen, Njemačka; Messerle et al., 1997) i insertiranog u Pad mjesto uvedenog i u 2.1 i 3.1 kbp fragment prisutan u plazmidu pDS (Slika 1).
Primarne CEF stanice su co-transfektirane s 2 μg 584Ap80C DNA i 10 μg pDS-pHAl. Pet dana nakon transfekcije, stanice su stavljene preko primarnih CEF stanica u prisutnosti 250 μg/ml mikofenolne kiseline (MPA), 50 μg/ml ksantina i 100 μg/ml hipoksantina. MPA/ksantin/hipoksantin selekcija se ponavlja ukupno četiri puta. Nakon kompletnog razvoja citopatogenog učinka (CPE) nakon četiri runde selekcije, virusni DNA se pripremi iz inficiranih stanica i 1 μg DNA inficiranih-stanica se elektroporira u DHB10 Escherichia coli stanica. Kolonije se određuju nakon 16 sati iza transfekcije na pločama agara koje sdražavaju 30 μg/ml kloramfenikola (Sambrook et al., 1989). Pojedine kolonije se sakupe i BAC DNA se preparira iz Escherichia coli slijedeći protokol standardne alkalne liže (Sambrook et al.,1989). Široka skala proizvodnje BAC DNA se izvodi sa silicij-baziranom afinitetnom kromatografijom upotrebom komercijalno dostupnih kitova (Qiagen, Macherev & Nage l) . Tri MDV-1 584Ap80C BAC klonova (BAC19, BAC29, BAC24) su izabrani za daljnju analizu.
Mutageneza MDV-1 BACs. Za mutagenezu kloniranih MDV-1 DNA u Escherichia coli, recE-katalizirane reakcije unapređuju homologne rekombinacije između linearnih DNA fragmenata, navedenih kao E/T klonovi, su izvedeni (Zhang et al., 1998; Naravanan et al., 1999). Plazmid pGETrec (osiguran ljubaznošću Dr. Panos loannou, Murdoch Institut, Melbourne, Australia) zadržanih recE, recT i bakteriofagi l gam gena su transformitani u BAC20-koji sadržavaju DH10B stanice (Naravanan et al., 1999). Nakon indukcije recE, recT i gam dodavanjem 0.2% arabinoze, elektrokompetentne stanice se proizvode u suštini kao što je opisano (Naravanan), Za deleciju gB gena u BAC20, kanamicin rezistentan gen (kanR) plazmida pEGFP-N1 (Clontech) povećava se PCR-om. Označeni primeri sadržavaju 50 nukleotidnih homolognih krakova omeđenih željenom delecijom unutar gB i 20 nukleotida za amplifikaciju kanR (Tablica 1). Nastali 1.6 kbp fragment se purificira iz agaroza gela (Qiagen) i elektroporacijom u pGETrec-koji sadržavaju BAC20 stanice. Kolonije koje sadržavaju camR i kamR gene su identificirane na pločama koje sadržavaju oba antibiotika (Naravanan et al., 1999).
DNA analize. BAC ili virusna 584Ap80C DNA bila je cijepana s EcdRIrBamHI, Bglll ili StuI i odvojeni na 0.8% agaroza gel. DNA fragmenti se transferiraju na pozitivno nabijene Nylon menbrane (Pharmacia-Amersham) i Southern bio t hibridizacija izvedena je upotrebom Digoxigenin-označenom BAC19DNA ili pojedinim BamHI fragmentima MDV-1 soja GA (Fukuchi et al., 1991; Osterrieder, 1999).
Osim toga, gB-specifična ispitivanje iz plazmida pcgB i ispitivanje zadržanog kanR gen je pripremljen za analizu gB-negativnog MDV-1 BAC. Kemoluminiscentna detekcija DNA hibrida upotrebom CSPD™ provedena je u skladu s uputama proizvođača (Roche Biochemicals).
Indirektna imunofluoroscencija. Za indirektnu imunofluoroescentnu analizu (IIF), stanice su rasle u pločama s 6- ili 24-jažica (Grenier) ili na pokrovnim stakalcima, i kasnije je indicirana infekcija. Stanice su fiksirane s 90% acetonom u različitim vremenima nakon infekcije ili transfekcije, a IIF je izvedena točno kao što je opisao (Meindl and Osterrieder, 1999). Uzorci su analizirani fluorescentnom mikroskopijom ili control laser scanning mikroskopijom (CLSM). Korištena protutijela su anti-gB mab 2K11, anti-pp38 mab H19 (dobiveno Ijubaznošću Dr. Lucy Lee, ADOL; East Lansing, MI) ili konvalescentnim serumom pilića inficiranih s MDV-1 (MDSI).
Rezultati:
Izrađivanje i analize BACs koji sadržava kompletne MDV-1 genome. Milion primarnih CEF bilo je inficirano s 1 X 104p.f. MDV-1 soja, tj. inficirane stanice su pomiješane s neinficiranim stanicama. Nakon što se kompletno razvio citopatogeni učinak, DNA se pripremi iz inficiranih stanica a 2 ng virusne DNA se transfektira u 1 X 106 primarnih CEF stanica zajedno s 10 ngpDS-pHA1 plazmida DNA. Pet dana nakon transfekcije, stanice se co-zasade sa svježim CEF i preliju s medijem za selekciju.
Taj postupak se ponovi ukupno četiri puta. Konačno, DNA iz rekombiniranog MDV-1 je sposoban za rast u prisutnosti MPA/ksantina/hipoksantina se izoliraju i predmet su ispitivanja Southern blot analize upotrebom označenog pHA1. Može se demonstrirati tako da dio virusne DNA sadržava virusnu DNA koja sadržava insertiranu F sekvenciju plasmida (podaci nisu pokazani). Jedan mikrogram te virusne DNA se koristi za transformaciju Escherichia coli DH10B stanice. Transformirane bakterije su stavljene na agar koji sadržava 30 μg/ml kloramfenikola i sakupljena je jedna kolonija. DNA bakterijske kolonije je ekstrahiran standardnim postupkom preparacije plasmida (Sambrook et.al., 1989) i nastavlja se na 0.8% agoroza gelu.
Više bakterijskih kolonija pokazalo je da sadržavaju ekstrakromosomalni DNA velike molekularne mase, a tri klona (BAC19, BAC20 i BAC24) su odabrana za daljnju analizu (Slika 2). Za daljnju karakterizaciju izoliranih BAC klonova provedena je Southern blot analiza 584Ap80C i BAC DNA nakon cjepanja s BamHI ili EcoRI s označenom BACI9 DNA. Može se pokazati da BAC19, BAC20 i BAC24 DNA pokazuju gotovo identične restrikcijske fragmente enzima kada se komparira s tim parenteralnim 584Ap80C (Slika 3A iB). Dvije očite iznimke, međutim, su uočene. 20kbp BamHI-A fragment prisutan u 584Ap80C DNA je odsutan u svim analiziranim BAC klenovima. Umjesto, fragmenata na mjestima 16 i 10 kbp određeni su u DNA BACI9, BAC20 i BAC24 (Slika 3B). Te dvije trake predstavljene širokogrudnim BamHI-A fragmentom u kojem na temelju insertacije F plazmida i delecije Us2 sekvencije i dodatno BamHI mjesta je uvedeno (Slika 1).
U EcoRI-digestiranu BAC DNA, dodatna traka od 5.8 kbp (BAC sekvencija) i minimalne alternacije u veličini fragmenata uzrokovanih delecijom Us2 gena je uočeno (Slika 1 i 3B). Korektna insertacija BAC sekvencija u različitim klenovima je dalje analizirana sa Sauthern blot hibridizacijom upotrebom označenih inserata plazmida pDS ili pHA1 je ispitana, i zabilježen je očekivani reakcijski način u BamHI- ili £coRI-digestirane DNA. U BamHI-digestirani BAC DNAs, 16 i 10 kbp BamHI fragmenti specifično nasuprot ispitanom pDS budući da samo 10 kbp fragment je reagirao s deriviranim iz plazmida pHAl (Slika 1, Slika 3C i D) .
U EcoRI-degistiranim BAC19, BAC20 ili BAC24 DNA, fragmenti 4.3, 2.8 i 1.7 kbp specifično reagirana s pDS ispitivanjem, budući da 5.8 i 1.7 kbp fragmenti specifično hidratizirani s pHA1 ispitana (Sl. 1, Sl.3C i D). Ti fragmenti točno korespondiraju s tim predviđanjem nakon insertacije pHAl sekvencija (Slika 1), i zaključeno je da ta sekvencija F plazmida je točno insertirana umjesto Us2 ORF i svih analiziranih MDV-1 BAC. Osim toga, neke varijacije u načinu vezivanja BAC 19, BAC20 i BAC24 su zabilježeni u BamHI ili EcoRI digestiranom DNA, npr. dodatna skupina aproksimativno 6.2 kbp u BamHi-digestiranom BAC19 DNA ili dodatna skupinau EcoRI-digestiranom DNA BAC20 i BAC24 (SL. 2, 3A i B). Za upućivanje pitanja uočene su veličine varijacije pojedinog enzim a za restrikciju fragmenata, hibridizacije s označenim BamHI-D fragmentom izvedeno je zbog veličine varijacije u terminalnom i unutarnjem ponavljanju jednake dužine područja (TRL i IRL) su uobičajene.
Prikazano je sa Southern blotting tako da uočeni dodatni fragmenti i u BamHI- ili EcoRI-digestiranom DNA BAC19, BAC20, ili BAC24 rezultira umjesto varijacijama u TRL i IRL. Budući da dva proširenja mrlja s BamHI-D ispitivanjem je određeno u virusnom 584Ap80C DNA digestiranog s BamHI koji je rangiran od aproksimativno 9 do 15 kbp i od 4 do 8 kbp (odgovarajućeg na BamHI-D i -H fragmenti virulentnog MDV-1, Sl. 1), jasan ili različite strane su uočene u svim analiziranim BAC klonovima (Sl.4). Svi drugi fragmenti restrikcije enzima različitih BAC klonova su identični s onima virusnog 584Ap80C DNA. Potvrđeni su upotrebom više drugih označenih BamHI fragmenata kao radioaktivno označenih molekula DNA, uključujući BamHI-A, -B, -C i -I2 fragmenata (tipični podaci za BamHI-C radioaktivno označene molekule DNA su pokazani na Sl.4).
Rekonstrukcija infektivnih MDV-1 iz klonirane DNA. DNA BAC19, BAC20 ili BAC24 je transfektirana u primarne CEF. 3 i 7 dan nakon transfekcije, MDV-1 specifični virus plakovi pojavljuju se pokazujući s IIF upotrebom anti-MDV-1 gB mab. MDV-1 oslobođeni nakon transfekcije različitih BACs je potom co-zasijen sa svježim CEF a veličina plakova je komparirana tako da se inducira parenteralno s 584Ap80C. Kao izuzetak pokazan za plakove obojene drugi dan iza infekcije, ne mogu se procijeniti razlike u veličini plakova između rekombinantnih i parenteralnih virusa (Sl. 5A).
Za daljnju karakterizaciju bioloških svojstava MDV-1 ponovo dobivenih nakon BAC transfekcije, kinetika rasta tih virusa je komparirana tako da parenteralni 584Ap80C. U slučaju BACs, virus ponovo dobiven 5 dana nakon transfekcije korišten je za infekciju svježih CEF sjemenskih stanica na ploče sa 6-jažica (50 p.f.u. virusa korišteno je za infekciju jedne jažice koja sadržava 1 X 106 stanica). Isto tako, 50 p.f.u. 584Ap80C koristi se za infekciju svježih CEF na isti način, U različitim vremenima p.i., virus je sakupljeni titriran s co-sjemenom 10-puta dilucijom virusa sa svježim CEF stanicama. Rezultati tri eksperimenta su sumirani na Sl.5B.
Moguće je pokazati da svi MDV-1 BACs testirani pokazuju karakteristike rasta tako da su gotovo identične onima parenterlnim 584Ap80C (Sl. 5B) . Maksimalni titar je dobiven 72 sata p.i. a preostala virtualna konstanta sve do kraja perioda promatranja od 120 sati p.i. Prema veličini plakova i karakteristikama rasta zaključeno je da biološka svojstva MDV-1 BACs in vi tro se praktično ne mogu razlikovati od onih parenteralnih sojeva.
Za utvrđivanje stabiliteta BAC-deriviranih virusa, potomstvo BAC transfekcije BACI9 i BAC20 pasirano je četiri puta a virusna DNA je pripremljena. Virusna DNA se cijepa s BamHI ili EcoRIr odvaja s 0.8% agaroza gel elektroforezom, i transferirana na Nylon menbranu. Hibridizacija je provedena upotrebom pDS ili pHA1 radioaktivno označenim molekulama DNA. Jednaki fragmenti kao što je opisano gore uočeni su i vezani na način da se ne promjeni serijskim pasažama progenom transfekcijom kao što je analiziran s dvije radioaktivne označene molekule DNA (Sl. 6). Iz dobivenih rezultata je zaključeno da F plazmid-derivirane preostale sekvencije stabilno ponovno insertirane unutar 584Ap80C genoma iz pojedinog MDV-1 BAC klonova čak i nakon serijske pasaže u CEF stanice.
Međutim, kao što je pokazano hibridizacijom s BamHI-D fragment i PRC analizom, promjenjivost 132-bp ponovljene sekvencije je vraćena a difuzna mrlja reaktivne strane je uočena na BamHI- ili EcoRI-cjepanoj progenoj DNA transfekciji već nakon prve pasaže virusa (podaci nisu pokazani).
Mutageneza BAC20 i delecija gB-enkodirane sekvencije. U sljedećim pokusima, novo razvijenim metodama mutageneze BACs primjenjenim za odstranjivanje 2.3 kbp od 2.8 kbp gB gena iz BAC20 (Sl. 7). Nakon transformacije plazmida pGETrec (Naravanan) u Bac20-koji sadržava DH10B, kanR gen je iskorišten s primerima tako da se priznaje homologna rekombinacija s MDV-1 gB sekvencijama (Tablica 1; Sl.8) i elektroporacija u BAC20-pGETrec stanice. Bakterija je nanesena na LB agar koji sadržava kloramfenikol i kanamicin, a sakupljene su dvostruko rezistentne kolonije. Nakon izolacije DNA pojedinih kolonija, Southern blot analiza izvedena je rekombiniranim BAC20 zadržanim delecijom unutar gB gena (20DgB). KanR i gB-specifično istraživanje detektiranih fragmenata 20DgB nakon cijepanja s BamHI, EcoRI, Bg1II ili StuI tako da se savršeno slaže s onim izračunatim nakon insertacije kanR rezistentnog gena u gB-enkodiranih sekvencija (Fig.9). Zabilježeno je da - kao što je prije izvješteno-pGETrec koji daje ampicilin rezistentne je jednostavno izgubiti rast Escherichia coli stanica u odsutnosti antibiotika (Sl. 9). Iz tog rezultata je izračunati da gB otvoreni lanac je skoro kompletno zamjenjen s 20DgB.
Analiza gB-negativnog MDV-1 rekonstltuiranog iz 20DgB. Zbog toga što je gB esencijalan za rast svih herpes virusa analizirani su podaci (prikazanih od Pereira), QM7 linijske stanice koje su ekspresirane MDV-1 gB pod kontrolom HCMV neposredno generira rani promotor. Indirektna imunofluorescentne analize pokazuju da praktično svaka stanica od linijskih stanica MgB1 kasnije ekspresira MDV-1 gB kao što pokazuje upotreba mab 2K11 ili konvalescentni pileći serum (MDSI) (Sl. 10). Za analizu rasta BAC20 i 20DgB u različitim linijskim stanicama, DNA je pripremljena i korištena za transfekciju CEF, QM7 ili MgB1 stanica. Nakon 3 do 5 dana iza transfekcije, virusni plakovi su uočeni i svim stanicama transfektiranim s BAC20 (Sl.10).
Međutim nakon transfekcije 20DgB DNA, plakovi su uočeni samo u gB-ekspresiranim MgBl stanicama (Sl. 11). U CEF i QM7 stanicama transfektiranim s 20DgB, pojedine stanice ekspresirane ranim pp38 genom kao što je pokazano reaktivnosti s mab H19 (Lee et al., ali formiranje plakova je inhibirano (Sl. 11). Ti rezultati gB su bitni za proširivanje MDV-1 stanice-na-stanicu in vitro gdje učvršćivanje s co-s Jemenom 2ODgB-inficiranim MgB1 stanicama s CEF, Qm7 ili svježim MgB1 stanicama. Kao što je prikazano nakon primarne transfekcije, formiranje plakova je uočeno samo nakon co-sJemena s gB-ekspresiranim stanicama (Tablica 2). Iz tih rezultata izračunato je, da se MDV-1 gB u suštini zahtjeva za stanica -na-stanicu proširivanje MDV-1 u kulturi stanica.
Ito tako virus Marekove bolesti je značajan patogen pilića koji uzrokuje tumore T stanica i visoki mortalitet u zaraženih životinja, slabo je poznata funkcija pojedinih gena i proizvodnja gena u litičnoj, latentnoj ili tumorskoj fazi infekcije. Analize MDV-1 gena i proizvodnje gena znatno je oslabljena iz dva glavna razloga. Prvo, uzgoj stanica inficiranih s MDV-1 ne daje prinos slobodnih infektivnih virusa, a drugo, učinkovit rast MDV-1 u uzgojenim stanicama je ograničen na primarne ili sekundarne pileće fibroblaste.
Od sada, mutageneza koja koristi homolognu rekombinaciju koristi za mutagenozu drugih Alphaherpesvirinae je laboratorijska, vremenski ograničena i zahtjeva konstantnu prisutnost primarnih stanica. Dok mutagenoza HSV i PrV je stanovito olakšana upotrebom BAC tehnologije, konvencionalna mutageneza oslanja se na homolognu rekombinaciju u eukariotskim stanicama predstavljenim standardnom tehnikom za ta dva virusa i brojne mutante virusa koji se generiraju. Nasuprot tomu, za mutagenezu MDV-1 BAC kloniranje i meutageneza je velika prednost. Samo MDV-1 genom je kloniran kao BAC i može se stabilno održavati u Escherichia coli, generacija mutanata i analiza esencijalnih gena trebala bi biti relativno lagana. U stvari, moguće je kloniranje kompletnog genoma soja 584Ap80C kao infektivnog BAC. Soj 584Ap80C je potomak vrlo virulentnog plus (w+) MDV-1 soja 584A nakon 80 serijskih pasaža na CEF stanivama (Witter, 1997). Analiza kloniranih MDV-1 genoma prisutna u BAC 19, BAC20 i BAC24 očito pokazuje različite načine restrikcije enzima.
Ta različitost može biti svojstvo varijacija u BamHI-D i H-fragmentima. Poznato je da različiti broj 132-bp ponovljenih parova je prisutno u različitim MDV-1 sojevima i da taj broj ponavljanja raste nakon serijske pasaže u kulturi stanica (Maotani, Silva, Fukuchi). Osim toga, broj ponovljenih 132-bp parova je asocirano s gubitkom onkogeneze jer je konstantan broj tih jedinica prisutan u virulentnom soju (Fukuchi et al., 1985; Bradley et al., 1989), iako noviji radovi na širokoj upotrebi soja Rispens CVI 988 vakcine pokazuju da nemora biti korelacije malog broja ponavljanja 132-bp i virulencije. U slučaju MDV-1 soj 584Ap80C, hibridizacija restrikcije enzima digestirane virusne DNA s BamHI-D fragmenta nosi difuzan način vezivanja indiciranog za različiti broj prisutnog ponavljanja u različitim populacijama. Nasuprot tomu, samo jedno jako reaktivno vezanje je identificirano u svakom BAC kolonu s istom molekulom DNA. Međutim, veličina reaktivne trake nakon cijepanja s BamHI ili EcoRI varira između BACI9, BAC20 i BAC24 indicira da taj genom sadržava različiti broj 132-bp ponavljanja kada je kloniran. Ta interpretacija dokazana je s PCR analizom ciljanom na 132-bp ponavljanja. S obzirom na tipično spuštenu-sličnu pojavu PRC produktima dobije se s DNA 584Ap80C (Becker et al., 1993), razlika između traka povećava se za kloniranu virusnu DNA u slučaju BAC19, BAC29 ili BAC24.
Može se zaključiti da različiti načini restrikcije enzima različitih BAC klonova rezultira različitim brojem parova 132-bp ponavljanja prisutnih u pojedinim klonovima koji nemaju utjecaja na infektivnost klonova DNA jer infektivni virusi su obnovljeni nakon transfekcije izolirane DNA iz svakog od različitih BAC klonova.
Nakon kloniranja kompletnog MDV-1 genoma i iskušavanja infektivnosti klonirane MDV-1 DNA, novi razvoj sustava mutageneze u kojem linearni fragment DNA može biti rekombiniran u bakterijsku rezidentnu DNA i koja je katalizirana s recE (Naravanan, muvrers) se koristi za deleciju gB enkodirane sekvencije BAC20. Mutageneza se bazira na recE, recT i recB/C-supresiji A, gam genu prisutnom u plazmidu pGETrec (Naravanan et al., 1999).
Velika prednost sustava je ta da se koristi u prvom redu za manipulaciju genomoma virusa je (i) da samo 30 do 50 bp homolognih izdanaka je potrebno za ciljane specifične sekvencije potrebno izbrisati, tj. delecija svakog otvorenog oblika može se postići bez potrebe da se klonira rekombinirane kazete, (ii) metoda je veoma brza, i (iii) taj pGETrec vektor daje da se sustav mutageneze i ekspresije rezistencije ampicilina brzo gubi iz bakterijskih stanica u odstunosti ampicilina. Nakon elektroporacije gB izbačeni PCR produkt u stanice BAC20 koje sadržavaju pGETrec, između 10 i 30 camR i kanR su dobivene dvostruko rezistentne kolonije. Jedna od kolonija je nazvana 20DgB-1 i odabrana je za daljnju analizu jer će izgubiti pGETrec odmah nakon nanošenja na agar koji sadržava kloramfenikol i kanamicin.
Sotern blot analiza pokazuje uspješnu deleciju gB gena i insertaciju kanR gena u 20DgB-1. Obnovljeni MDV-1 nakon transfekcije CEF stanica s 20DgB-1 je nesposoban za širenje iz inficiranih stanica na susjedne stanice indiciranih tako da MDV-1 gB slično je njihova kopija u drugih herpesvirusa je bitna za stanica-na-stanicu nesposobnih za infekciju. Zbog toga što su MDV-1 visoko asocirane stanice u kulturi stanica i da ne otpuštaju infektivni virus u medij kulture, ne možemo istražiti moguću ulogu MDV-1 gB u ulasku virusa. Stvaranje gB mutanta predstavlja prvi primjer MDV-1 s delecijom esencijalnog gena i pokazuje snagu BAC kloniranja i sustava mutageneze koji je posebno korišten u slučaju MDV-1. Upotreba MDV-1 BAC i permanentnih linijskih stanica QM7 koje razmnožavanje MDV-1 u kojima različiti fibroblasti prepelice QT35 linijske satnice- ne zadržavaju MDV-1 sekvencije (Zelnik et al., neobjavljeno), predstavljaju izvrsnu kombinaciju za temeljitu analizu esencijalnih MDV-1 gena. Osim toga, komparativna analiza funkcija gena različitih Alphaherpesvirinae može sada uključiti MDV-1 i dopustiti studiju na jako sličnim menbranama, kao što su VZV ili BHV-4 jedne virusne familije.
S kloniranim genomima kao što je ovdje osigurano, daljni detalji osiguravaju za virus određene litične, latentne i tumor-inducirajuče gene u kojima je korištena jako ograničena genetska manipulacija.
Referencije:
1. Anderson,A.S., Parcells,M.S., and R.W.Morgan. 1998. The glycoprotein D (US6) homolog is not essential for oncogenicity ili horizontal transmission of Marek's disease virus. J.Virol. 72: 2548-2553.
2. Decker,Y., E.Tabor, Y.Asher, I.Davidson, M.Malkinson, and R.L.Witter. 1993. PCR detection of amplified 132 bp repeats in Marek's disease virus type 1 (MDV-1) DNA can serve as an indicator for critical genomic rearrangement leading to the attenuation of virus virulence. Virus Genes 7: 277-287.
3. Borst,E.M., G.Hahn, U.H.Koszinovrski, and M.Messerle. 1999. Cloning of the human cvtomegalovirus (HCMV) genoma as an infectious becterial artificial chromosome in Escherichia coli: a new approach for construction of HCMV mutants. J.Virol. 73: 8320-8329.
4. Bradiey, G., M. Havashi, G. Lancz, A. Tanaka, and Nonovama. 1989. Structure od the Marek's Disease virus BamHi-H gen family; Genes of putative importance for tumor induction. J.Virol. 63: 2534-2542.
5. Bradley,G., G.Lancz, A.Tanaka, and M.Nonovama. 1989. Loss of Marek's disease virus tumorigenicity is associated with truncation of RNAs transcribed within BamHi-H. J.Virol. 63: 4129-4235.
6. Brune,W., C.Menard, U.Hobom, S.Odenbreit, M.Messerle, and U.H.Koszinovrski. 1999. Rapid Identification of essential and non essential herpesvirus genes by direct transposon mutagenesis. Nat.Điotechnol. 17: 360-364.
7. Brunovskis,P., and L. F. Veli cer. 1995. The Marek's disease virus (MDV) unique short region: alphaherpesvirus-homologous, fowlpox virus-homologous, and MDV-specific genes. Virology 206: 324-38.
8. Can telio, J. L., A.S.Anderson, A.Francesconi, and R.W.Morgan. 1991. Isolation of a Marek's disease virus (MDV) recombinant containing the lacZ gene of Escherichia coli stably inserted within the MDV US2 gene. J.Virol. 65: 1584-1588.
9. Cui,Z.Z., D.Yan, and L.F.Lee. 1990. Marek's disease virus gene clones encoding virus-specific phosphorylated polypeptides and serological characterization of fusion proteins. Virus Genes 3: 309-322.
10. Delecluse, H.J., T.Hilsendegen, D.Pich, R.Zeidler, and W.Hammerschmidt. 1998. Propagation and recovery of intact, infectious Epstein-Barr virus from prokaryotic to human cells. Proc.Natl.Acad.Sci. U. S.A. 95. 8245-8250.
11. Fuckuchi,K.,M.Sudo, Y.S.Lee, A.Tanaka, and M.Nonoyama. 1984. Structure of Marek's disease virus DNA: detailed restriction enzyme map. J.Virol. 51: 102-109.
12. Lee,L.F., P.Wu, D.Sui, D.Ran, J.Kamil, H.J.Kung, and R.L.Witter. 2000. The complete unique long sequence and the overall genomic organisation of the GA strain of Marek's disease virus. Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A. 97. 6091-6096.
13. Maotani,K., K.Kanamori, K.Ikuta, S.Ueda, S.Kato, i K.Hirai. 1986. Amplification of a tandem repeat within inverted repeats of Marek's disease virus DNA during serial in vitro passage. J.Virol. 58: 657-659.
14. Meindl, A. and N.Osterrieder. 1999. The equine herpesvirus type l Us2 homolog encodes a nonessential membrane-associated virion component. J. Virol. 73: 3430-3437.
15. Messerle.M., I.Crnkovic, W.Hammerschmidt, H.Ziegler, and U.H.Koszinovrski. 1997. Cloning and mutagenesis of herpesvirus genome as an infectious becterial artificial chromosome. Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A. 94. 14759-14763..
16. Morgan.R.W., J.L.Cantello, and C.H.McDermott. 1990. Transfection of chicken embryo fibroblasts with Marek's disease virus DNA. Avian Dis. 34: 345-351.
17. Muyrers, J.P., Y.Zhang, G.Testa, and A.F.Stewart. 1999. Rapid modification of bacterial artificial chromosomes by ET-recombination. Nucleic Acids Res. 27: 1555-1557.
18. Naravanan, K., R.Williamson, Y.Zhang, A.F.Stewart, and P.A.Ionnaou. 1999. Efficient and precise engineering of a 200 kb beta-globin human/bacterial artificial chromosome in E.coli DH10B using an inducible homologous recombination system. Gene. Ther. 6: 442-447.
19. Osterrieder,N. 1999. Sequence and initial character i zat ion of the UL10 (glikoprotein M) i UL11 homologous genes of serotype l Marek's Disease Virus. Arch.Virol. 144, 1853-63.
20. Osterrieder,N., A.Neubauer, C.Brandmuller, B.Braun, O.-R. Kaaden, and J.D.Baines. 1996. The equine herpesvirus type l glycoprotein gp21/22a, the herpes simplex virus type 1 gM-homolog, is involved in virus penetration and cell-to-cell spread of virions. J.Virol 70: 4110-4115.
21. Parcells, M.S., A.S.Anderson, J.L:Cantello, and R.W.Morgan. 1994 Characterization of Marek's disease virus insertation and deletion mutants that lack UŠI (ICP22 homolog), US10, and/ili US2 and neighboring short-component open reading frames. J.Virol.68: 8239-8253.
22. Parcells, M.S., A.S.Anderson, and R. W. Morgan. 1994. Retention of oncogenicity by Marek's disease virus mutant lacking six unigue short region genes. J.Virol. 69: 7888-7898.
23. Parcells, M.S., A.S.Anderson, and R.W.Morgan. 1994. Characterization of a Marek's disease virus mutant containing a lacZ insertion in the US6 (gD) homologue gene. Virus Genes 9: 5-13.
24. Payne,L.N. 1985. Pathology. In: LN Payne (ed) Marek's Disease. Kluwer Academic Publishers, Hingham, MA, U.S.A., pp 43-76.
25. Pereira,L. 1994. Function of glycoprotein B homologues of the family herpesviridae. Infect.Agents Dis. 3: 9-28.
26. Ross,N.L.J., Binns,M.M., and J.Pastorek. 1991. Dna sequence and organization of genes in 5.5 kbp EcoRi fragment mapping in the short unigue segment of Marek's disease virus (strain RB1B). J.Gen.Virol. 72: 949-954.
27. Sakaguchi,M., T.Urakawa, Y.Hirayama, N.Miki, M.Tamamoto, G.S.Zhu, and K.Hirai. 1993. Marek's disease virus protein kinse gene identified within the short unique region of the viral genome is not essential for viral replication in cell culture and vaccine-induced immunity in chickens. Virology 195: 140-1488.
28. Sambrook,J., D.F.Fritsch, and T.Maniatis. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor.
29. Senat, K.A. 1985. Characteristics of virus. In: LN Payne (ed) Marek's disease. Kluwer Academic Publishers, Hingham, MA, U.S.A., pp.77-112.
30. Senat,K.A., B.J.van Iddekinge, H.Đoerrigter, P.H.o'Conell, and g.Koch. 1998. Open reading f rame LI of Marek's disease herpesvirus is not essential for in vitro and in vivo virus replication and establichment of latecy. J. Gen.Virol. 79: 841-849.
31. Silva,R.F., and R.L.Witter. 1985. Genomic expansion of Marek's disease virus DNA in associated with serial in vitro passage. J.Virol. 54: 690-696.
32. Smith G.A., and L.W.Enquist. 1999. Constriuction and transposon mutagenesis in Escherichia coli of a full-length infectious clone of pseudorabies virus, an alphaherpesvirus. J.Virol. 73: 6405-6414.
33. Smith G.A., and L.W.Enquist. 2000. A self-recombining bacterial artificial chromosome and its application for analvsis of herpesvirus pathogenesis. Proc.Natl.Acad. Sci. U.S.A. 97: 4873-4878.
34. Suter,M., A.M.Lew, P.Grob, G.J.Adema, M.Ackarmann, K.Shortman, and C.Fraefel. 1999. BAC-VAC, a novel generation of (DNA) vaccines: A bacterial artificial chromosome (BAC) containing a replication-competent, pacaging-defective virus genome induces protective immunity against herpes simplex virus 1. Proc.Natl.Acad.Sci. U. S.A. 96: 12697-12702.
35. van Iddeking,B.J., L.Stenzler, K.A.Schat, H.Boerrigter, and G. Koch. 1999. Genome analysis of Marek's disease virus strain CVI-988: effect of cell culture passage on the inverted repeat regions, Avian Dis. 43: 182-188.
36. van Regenmortel, M.H.V., C.M.Fauquet, D.H.L.Bishop, E.Carstens, M.K.Estes, S.Lemon, J.Maniloff, M.A. Mayo, D.McGeoch, C.R.Pringle, and R.B.Wickner (eds) . 1999. Virus Taxonomy. Seventh Report of the Interantional Committtee on Taxonomy of Viruses. Academic Press, New York, San Diego.
37. Wagner,M., S.Jonjic, U.H.Koszinovrski, and M.Masserle. 1999. Svstematic excision of vector seguences from BAC-cloned herpesvirus genome during virus recinstitution. J.Virol. 73: 7056-7060.
38. Witter,R.L. 1985. Principles of vaccination. In: L.N.Payne (ed): Marek's Disease. Kluwer Academic Publishers, Hingham, Ma, U.S.A., pp. 203-250.
39. Witter,R.L. 1997. Increased virulence of Marek's disease virus field isolates. Avian Dis. 41: 149-163.
40. Witter,R.L., J.M.Sharma, and A.M.Fadly. 1980. Pathogenicity of variant Marek's disease virus isolants in vaccinated and unvaccinated chickens. Avian.Dis. 24: 210-232.
41. Zhang,T., F.Buchholz, J.P.Muyrers, and A.F.Stewart. 1998. A new log for DNA engineering using recombination in Escherichia coli. Nature Genet. 20: 123-128.
[image]
Opis slika
Slika 1 Shematska ilustracija postupka kloniranja za stvaranje BACs zadržanih kompleta MDV-1 genoma. Prikazana je organizacija od aproksimativno 180 kbp MDV-1 genoma (A) i BamHI-restrikcijska mapa (B) u skladu s Fukuchi et al. (11) . Jedino kratko područje (Us) i ORFs locirani na Us su pokazani (C i D). A 2.1 i 3.1 kpb fragment okruženi s Us2 genom (sivi djelovi) su povećani s PCR i klonirani u plazmid pTZISR za se dobije porast na rekombiniranom plazmidu pDS. 7.2 kbp BAC vektor otpušten iz rekombiniranog plazmida pHAl (15) insertiran je u pDS daje plazmid pDS-pHAl (E) . Mjesta restrikcijskih enzima u skladu s (2) su skraćena: B=BamHI, E==EcoRi, P=PstI, Pa-PacI; S=SalI.
Slika 2 Digitalna scanned slika etidij bromida koncentracije 0.8% u agaroza gelu. DNA je izolirana iz Escherichia coli DH10B klonovi BACI9, BAC20 i BAC24 su cijepani s BamHI ili EcoRI i odvojeni. Digestirane restrikcijskim enzimom i tretirane s 1 kb ladder (Gibco-BRL). Dodatna strana označena je zvjezdicom ili veličinom različitih pojedinih fragmenata između tri BAC klona.
Slika 3 Digitalno skenirana DNA 584Ap80C(V), BAC19, BAC20i BAC24 cijepane su s BamHI ili EcoRI, odvojena s 0.8% agaroza gel elektorforezom, a mrlja s etidij bromidom (lijeva ploča). Nakon Southern transfera DNA fragmenata na Nylon menbranu, hibridizacija s Digoxigenin-označenim fragmentima iz plazmida pDS ili pHAl je izvedena. Veličina markera (1 kb ladder, Gibco-BRl) i data je veličina reaktivne strane.
Slika 4 Digitalno skenirana Southern blot analiza veličine varijacija u BAC19, BAC20 i BAC24DNA. Virusna DNA soja 584Ap80C(V) i pojedinih BACs cijepana je s BamHI ili EcoRI i trensferirana na Nylon menbrane. Ploče su inkubirane s Digoxigenin-označenim BACI9 DNA ili označene s BamHI-C ili BamHI-D fragmentima. Veličina markera (1 kb ladder, Gibco-BRL) je navedena. Razmazu-slična pojava na traki u slučaju 584Ap80C DNA kada je hibridizirana s BamHI-D sekvencijom su navedene u zagradi.
Slika 5 (A) Uf analiza MDV-1 plakova nakon transfekcije BAC19, BAC20 i BAC24 DNA. 5 dana nakon transfekcije, inficirane stanice su fiksirane i podvrgnute imunofluorescenciji upotrebom anti-gB mab 2K11. Detekcija vezanih antitijela provedena je s anti-mišjim Alexa™ 488 (Molecular probes) a jezgre su prebrojane s propidium jodidom. Povećanje= 400X.
(B) Krivulja rasta MDV-1 soja 584A i različitih BAKs. Nakon infekcije CEF stanica sa 100 p.f.u. 584Ap80C ili trensfekcijom progenog BAC19, BAC20 ili BAC24, titar virusa određen je u indicirano vrijeme p.i. sa co-s Jemenom sa svježim CEF stanicama. Plakovi su brojani nakon imunofluoroscentih tragova s mab 2K11.
Slika 6 Digitalno skenirana slika Soutern blot za analizu stabiliteta BAC vektor sekvencija virusa ponovo dobivenih nakon transfekcije BAC19 i BAC20. Progena transfekcija pasirana četiri puta a nakon svake pasaže, izolirana je DNA virusa. DNA virusa je cijepana s BamHI ili EcoRI, separirana s 0.8% agaroza gel elektroforezom i transferirana na Nylon menbrane. Soutern blot hibridizacija je provedena upotrebom Digoxigenin-označenim fragmentima plazmida pDS ili pHAl. Kratice: V=584Ap80C, 19= BAC19, 20= BAC 20. Pasaže l do 4 nakon transfekcije BAC19DNA su navedene brojevima 1 do 4. Pasaža 4 nakon transfekcije BAC20 DNA pretovarena u zadnjem putu, i pokazana je s 4a. Data je veličina reaktivnih fragmenata. Asteriks pokazuje reaktivnu 1.6 kb stranu markera (Ikb ladder, Gibco-BRL).
Slika 7 (A) Shematska ilustracija mutageneze BAC20 za odstranjivanje gB-enkodirane sekvencije. Rekombinirani plazmid pGETrec enkodirana L-arabinoza-inducirana recE, recT, i gam gen su transformirani u BAC20-koji sadržavaju DH10B stanice. Nakon PCR amplifikacije kanR gena iz plazmida pEGFP-N1 (Clontech) s primerima koji isto sadržavaju 50 nt homolognih izdanaka okruženih gB delecijom, 1.6 kbp PCR amplicon je elektroporiran u DH10B stanice zadržao BAC20 i pGETrec. Suspenzija bakterija je nanesena na agar koji sadržava 30 μg/ml kanamicina i 30 μg/ml kloramf enikola. Dvostruko rezistentne kolonije se sakupe i predmet su daljnje analize.
(B) Shematska ilustracija lokacije gB gena u MDV-1 i delecija prisutna u BAC20DgB.
Slika 8 Skenirana slika mrlje etidij bromida u 0.8% agaroza gelu koji sadržava BAC20 i 20DGB DNA cijepane s BamHI, EcoRI, BglI, ili StuI i odvojena s 0.8% agaroza gel elektroforezom (lijeva traka). DNA fragmenti se transferiraju na nylon menbrane i hibridiziraju s Digoxigenin-označenim kanR ili gB specifičnim ispitivanjem. Navedene su veličine reaktivnih DNA fragmenata. Kratice: B= BamHI, E= EcoRI, Bg= BglI, S= StuI.
Slika 9 Confocal laser scan analiza MgB1 osnovnih stanica ekspresije MDV-1 gB. MgB1 ili QM7 stanice su zasijene na staklenu pokrovnicu i inkubirane s anti-gB mab 2K1I ili konvalescentnim pilećim serumom MDSI. Sekundarna antitijela su anti-mišji ili anti-pileći IgG Alexa™488 konjugat (Molecular probe). Jezgre su prebrojane s pirimidin jodidom. Bar predstavlja 10 nm.
Slika 10 IIF analiza MgB1, QM7 ili CEF stanica nakon transfekcije s BAC20 (gornja ploča). 5 dana nakon transfekcije, stanice su fiksirane sa acetonom i inkubirane s anti-pp38 mab H19. Sekundarna protutijela su anti-mišji IgG Alexa ™488 (Molecular probe).
Budući da su MDV-1 plakovi zabilježeni na svim linijskim stanicama nakon transfekcije BAC20 DNA, virusni plakovi su zabilježeni samo na MgB1 stanicama nakon transfekcije s 20DgB. Samo pojedinačno inficirane stanice su zabilježene na (QM7 i Cef stanicama (šiljak strelice). Povećanje - 400X.
Claims (16)
1. Vakcine protiv infekcija uzrokovanih s zapravo stanice domaćina asociranim herpesvirusom, naznačena time, da navedena vakcina obuhvaća rekombinirani genom deriviran iz navedenog herpes virusa, navedeni genom dozvoljava rekombinaciju zapravo slobodnih navedenih stanica domaćina.
2. Vakcina u skladu sa zahtjevom 1, naznačena time, da navedeni genom obuhvaća funkcionalnu deleciju u genu bitnom za replikaciju u i/ili širi se na navedeni herpesvirus iz stanice domaćina.
3. Vakcina u skladu sa zahtjevom 1 ili 2, naznačena time, da navedeni genom sadržava najmanje nukleinsku kiselinu enkodiranu na antigenu substanciju sposobnu za dobivanje imunog odgovora protiv infekcije organizma s navedenim herpesvirusom.
4. Vakcina u skladu sa zahtjevom 1 do 3, naznačena time, da navedeni genom sadržava funkcionalnu deleciju u genu bitnom za dobivanje specifičnog markera imunog odgovora za navedeni herpesvirus, dozvoljava razlikovanje između pojedinih vakcinacija s navedenom vakcinom i pojedinih inficiranih s navedenim zapravo stanično asociranim herpesvirusom.
5. Vakcina u skladu s bilo kojim od zahtjeva 1 do 4, naznačena time, da navedeni genom najmanje sadržava nukleinsku kiselinu enkodiranu proteinskom tvari sposobnom za modulaciju transkripcije i/translacije nukleinske kisleine enkodirane antigene tvari sposobne za dobivanje imunog odgovora protiv infekcije organizma s navedenim herpesvirusom.
6. Vakcina u skladu s bilo kojim od zahtjeva 1 do 5, naznačena time, da navedeni genom sadržava zapravo cijelu-dužinu kopije derivirane iz navedenog herpesvirusa.
7. Vakcina u skladu s bilo kojim od gore spomenutih zahtjeva naznačena time, da dalje osigurava s nukleinskom kiselinom najmanje enkodiranu antigenu tvar dodatnog patogena.
8. Vakcina u skladu s bilo kojim od gore spomenutih zahtjeva naznačena time, da navedeni herpesvirus obuhvaća virus Marekove bolesti.
9. Vakcina u skladu sa zahtjevom 8, naznačena time, da navedeni virus Marekove bolesti obuhvaća serotip 1.
10. Vakcina u skladu sa zahtjevom 8 ili 9 naznačena time, da navedeni virus Marekove bolesti je deriviran iz virulentnog, jako virulentnog ili jako virulentnog + divljeg virusa.
11. Rekombinirani genom virusa, naznačen time, da je deriviran iz herpesvirusa da se zapravo asocirana stanica domaćina navedenog genoma smatra rekombinacijom esencijalno slobodnom od navedenih stanica domaćina.
12. Genom u skladu sa zahtjevom 11, naznačen time, da sadržava najmanje replikativni minigenom.
13. Genom u skladu sa zahtjevom 11, naznačen time, da navedeni genom sadržava u suštini punu-dužinu kopije derivirane iz navedenog herpesvirusa.
14. Upotreba genoma u skladu s bilo kojim od zahtjeva 11 do 13, naznačena time, da se proizvodi vakcina protiv bolesti uzrokovane infekcijom sa zapravo asociranim stanicama herpesvirusa.
15. Metoda za ograničavanje rizika pojedinih simptoma ili potpune manifestacije bolesti uzrokovane infekcijom s zapravo asociranim stanicama herpesvirusa naznačena time, da obuhvaća aplikaciju navedenih pojedinih vakcina u skladu s bilo kojim od zahtjeva 1 do 10 ili genoma u skladu sa bilo kojim od zahtjeva 11 do 13.
16. Metoda u skladu sa zahtjevom 15, naznačena time, da navedeni organizam je ptica.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP00202757A EP1178111A1 (en) | 2000-08-03 | 2000-08-03 | Vaccination against host cell-associated herpesviruses |
| PCT/EP2001/008893 WO2002012288A2 (en) | 2000-08-03 | 2001-08-01 | Vaccination against host cell-associated herpesviruses |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HRP20030147A2 true HRP20030147A2 (en) | 2005-04-30 |
| HRP20030147B1 HRP20030147B1 (hr) | 2011-10-31 |
Family
ID=8171884
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HR20030147A HRP20030147B1 (hr) | 2000-08-03 | 2003-02-28 | Vakcinacija protiv herpesvirusa asociranih na stanice domaćina |
Country Status (24)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US9073979B2 (hr) |
| EP (2) | EP1178111A1 (hr) |
| JP (1) | JP4313036B2 (hr) |
| KR (1) | KR100633180B1 (hr) |
| CN (2) | CN102151333A (hr) |
| AT (1) | ATE412055T1 (hr) |
| AU (2) | AU2001291716B2 (hr) |
| BR (1) | BRPI0112989B1 (hr) |
| CA (1) | CA2417923C (hr) |
| CZ (1) | CZ303904B6 (hr) |
| DE (1) | DE60136278D1 (hr) |
| EA (1) | EA010721B1 (hr) |
| ES (1) | ES2315306T3 (hr) |
| HR (1) | HRP20030147B1 (hr) |
| HU (1) | HU228262B1 (hr) |
| IL (2) | IL154250A0 (hr) |
| MX (1) | MXPA03001027A (hr) |
| NO (1) | NO332621B1 (hr) |
| NZ (1) | NZ524066A (hr) |
| PL (1) | PL207958B1 (hr) |
| PT (1) | PT1307565E (hr) |
| UA (1) | UA84667C2 (hr) |
| WO (1) | WO2002012288A2 (hr) |
| ZA (1) | ZA200300842B (hr) |
Families Citing this family (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1178111A1 (en) | 2000-08-03 | 2002-02-06 | Lohmann Animal Health GmbH & Co. KG | Vaccination against host cell-associated herpesviruses |
| CA2558586A1 (en) * | 2004-03-05 | 2005-09-15 | The Research Foundation For Microbial Diseases Of Osaka University | Recombinant varicella-zoster virus |
| US9273326B2 (en) | 2004-04-30 | 2016-03-01 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Tetracycline-regulated gene expression in HSV-1 vectors |
| US20080226677A1 (en) * | 2004-05-06 | 2008-09-18 | Yasuko Mori | Recombinant virus vector for gene transfer into lymphoid cells |
| ES2732815T3 (es) | 2009-05-22 | 2019-11-26 | Genocea Biosciences Inc | Vacunas frente al virus del herpes simple de tipo 2: composiciones y métodos para provocar una respuesta inmunitaria |
| SI2516629T1 (sl) | 2009-12-21 | 2016-10-28 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Cepiva proti virusu herpes simplex |
| CA2856697A1 (en) * | 2010-11-24 | 2012-06-07 | Genocea Biosciences, Inc. | Vaccines against herpes simplex virus type 2: compositions and methods for eliciting an immune response |
| CA3206983A1 (en) * | 2011-10-21 | 2013-04-25 | Intervet International B.V. | Recombinant non-pathogenic marek's disease virus constructs encoding infectious laryngotracheitis virus and newcastle disease virus antigens |
| JP6199878B2 (ja) * | 2011-11-23 | 2017-09-20 | ジェノセア バイオサイエンシーズ， インコーポレイテッド | 単純ヘルペスウイルス２型に対する核酸ワクチン：免疫応答を誘発する組成物及び方法 |
| CN105561303B (zh) * | 2015-12-30 | 2019-04-05 | 暨南大学 | 单纯疱疹病毒i型ul5基因缺失的dna疫苗的制备方法 |
| CN105597095A (zh) * | 2015-12-30 | 2016-05-25 | 暨南大学 | 一种应用微载体培养Vero细胞制备基因缺失减毒疫苗的方法 |
| CN105641692A (zh) * | 2015-12-30 | 2016-06-08 | 暨南大学 | 单纯疱疹病毒ⅰ型基因重组减毒活疫苗及其制备方法 |
| JP2019537555A (ja) | 2016-09-28 | 2019-12-26 | ジェノセア バイオサイエンシーズ， インコーポレイテッド | ヘルペスを処置するための方法および組成物 |
| US11174322B2 (en) * | 2017-07-24 | 2021-11-16 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Antibodies and peptides to treat HCMV related diseases |
| MX2020006343A (es) * | 2017-12-20 | 2020-09-03 | Intervet Int Bv | Diluyente mejorado para vacuna de herpesvirus alfa asociado con celulas. |
| WO2019152821A1 (en) | 2018-02-05 | 2019-08-08 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Recombinant herpes simplex virus-2 expressing glycoprotein b and d antigens |
Family Cites Families (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3959466A (en) * | 1974-04-15 | 1976-05-25 | The Wistar Institute | Highly attenuated cytomegalovirus vaccine and production thereof |
| GB8821441D0 (en) | 1988-09-13 | 1988-10-12 | Animal Health Inst | Viral vectors |
| EP0486106A3 (en) | 1990-11-16 | 1992-12-23 | Akzo N.V. | Marek's disease virus vaccine |
| AU657144B2 (en) * | 1991-07-09 | 1995-03-02 | Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute | Recombinant Marek's disease virus, process for preparing the same and vaccine containing the same |
| JP3675569B2 (ja) | 1995-04-28 | 2005-07-27 | 日本ゼオン株式会社 | 組み換えウイルス及びそれよりなるワクチン |
| KR19990028766A (ko) | 1995-07-07 | 1999-04-15 | 나카노 가쓰히꼬 | 마렉 질환 바이러스 유전자 및 마렉 질환 예방용 백신에서그의 용도 |
| US6306387B1 (en) * | 1997-05-29 | 2001-10-23 | The Research Foundation Of State University Of New York | Antigen delivery system |
| DE19733364A1 (de) * | 1997-08-01 | 1999-02-04 | Koszinowski Ulrich H Prof | Verfahren zur Klonierung eines großen Virusgenoms |
| AUPP684998A0 (en) * | 1998-10-30 | 1998-11-26 | Murdoch Institute for Research into Birth Defects Limited, The | A method of recombination and agents useful for same |
| EP1038952A3 (en) | 1998-12-09 | 2001-06-27 | Pfizer Products Inc. | Processes for preparation of Marek's Disease Virus using continuous avian cell lines |
| US6410222B1 (en) * | 1998-12-14 | 2002-06-25 | Juridical Foundation The Chemosero-Therapeutic Research Institute | In ovo vaccination of marek's disease type I virus |
| US6299882B1 (en) | 1999-04-09 | 2001-10-09 | Schering Corporation | UL54.5 of Marek's disease virus (MDV) |
| EP1178111A1 (en) | 2000-08-03 | 2002-02-06 | Lohmann Animal Health GmbH & Co. KG | Vaccination against host cell-associated herpesviruses |
-
2000
- 2000-08-03 EP EP00202757A patent/EP1178111A1/en not_active Withdrawn
-
2001
- 2001-01-08 UA UA2003021829A patent/UA84667C2/ru unknown
- 2001-08-01 ES ES01971839T patent/ES2315306T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2001-08-01 CA CA2417923A patent/CA2417923C/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-08-01 AU AU2001291716A patent/AU2001291716B2/en not_active Ceased
- 2001-08-01 PT PT01971839T patent/PT1307565E/pt unknown
- 2001-08-01 KR KR1020037001366A patent/KR100633180B1/ko active IP Right Grant
- 2001-08-01 AU AU9171601A patent/AU9171601A/xx active Pending
- 2001-08-01 EA EA200300215A patent/EA010721B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2001-08-01 CN CN2011100310998A patent/CN102151333A/zh active Pending
- 2001-08-01 DE DE60136278T patent/DE60136278D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2001-08-01 AT AT01971839T patent/ATE412055T1/de active
- 2001-08-01 CN CNA018167950A patent/CN1503843A/zh active Pending
- 2001-08-01 IL IL15425001A patent/IL154250A0/xx unknown
- 2001-08-01 BR BRPI0112989A patent/BRPI0112989B1/pt active IP Right Grant
- 2001-08-01 EP EP01971839A patent/EP1307565B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-08-01 PL PL365190A patent/PL207958B1/pl unknown
- 2001-08-01 CZ CZ20030324A patent/CZ303904B6/cs not_active IP Right Cessation
- 2001-08-01 WO PCT/EP2001/008893 patent/WO2002012288A2/en active IP Right Grant
- 2001-08-01 JP JP2002518259A patent/JP4313036B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2001-08-01 MX MXPA03001027A patent/MXPA03001027A/es active IP Right Grant
- 2001-08-01 NZ NZ524066A patent/NZ524066A/en not_active IP Right Cessation
- 2001-08-01 HU HU0302664A patent/HU228262B1/hu unknown
-
2003
- 2003-01-30 ZA ZA200300842A patent/ZA200300842B/en unknown
- 2003-01-30 US US10/354,932 patent/US9073979B2/en active Active
- 2003-02-02 IL IL154250A patent/IL154250A/en not_active IP Right Cessation
- 2003-02-03 NO NO20030524A patent/NO332621B1/no not_active IP Right Cessation
- 2003-02-28 HR HR20030147A patent/HRP20030147B1/hr not_active IP Right Cessation
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6845266B2 (ja) | 多価組換型鳥ヘルペスウイルス及び鳥類を免疫化するためのワクチン | |
| Darteil et al. | Herpesvirus of turkey recombinant viruses expressing infectious bursal disease virus (IBDV) VP2 immunogen induce protection against an IBDV virulent challenge in chickens | |
| JP3339854B2 (ja) | ウイルスワクチン | |
| CA2417923C (en) | Vaccination against host cell-associated herpesviruses | |
| AU2001291716A1 (en) | Vaccination against host cell-associated herpesviruses | |
| HUE033886T2 (en) | For the preparation and use of a recombinant bird-paramyxovirus vaccine and method | |
| US5047237A (en) | Attenuated pseudorabies virus having a deletion of at least a portion of a gene encoding an antigenic, nonessential protein, vaccine containing same and methods of identifying animals vaccinated with the vaccine | |
| EP0520753B1 (en) | Recombinant fowlpox vaccine for protection against Marek's disease | |
| Sakaguchi et al. | Construction of recombinant Marek's disease virus type 1 (MDV1) expressing the Escherichia coli lacZ gene as a possible live vaccine vector: the US10 gene of MDV1 as a stable insertion site | |
| JP3964458B2 (ja) | 組換え型伝染性喉頭気管炎ウイルスおよびその使用 | |
| Sun et al. | Attenuation of a recombinant Marek's disease virus lacking the meq oncogene and evaluation on its immune efficacy against Marek's disease virus | |
| AU6635896A (en) | Marek's disease virus genes and their use in vaccines for protection against marek's disease | |
| JPH09505726A (ja) | 組換え感染性喉頭気管炎ウイルス及びそれらの使用 | |
| RU2777400C2 (ru) | Рекомбинантные непатогенные конструкции вируса болезни марека, кодирующие антигены вируса инфекционного ларинготрахеита и вируса инфекционного бурсита | |
| Krieter | Determining the role of the conserved Herpesviridae protein kinase (CHPK) in replication and transmission of avian herpesviruses | |
| Dong | The role of Marek's disease virus MEQ gene products on MDV pathogenicity and oncogenicity | |
| Amortegui | Sequence comparison of a bacterial artificial chromosome (BAC)-based infectious clone of the CVI988 (Rispens) strain of Marek's disease virus (CVI988-699-2) to a back-passaged isolate that has reverted to virulence (CVI988-699-2 RV) | |
| Shaikh | The role of a deletion in the glycoprotein l (gL) gene of Marek’s disease virus (MDV) on MDV virulence | |
| Kent | Isolation of a Marek's disease virus (MDV) glycoprotein C-negative mutant and regulation of major histocompatibility complex molecules during MDV infection | |
| McDowell | Characterization of a bacterial artificial chromosome (BAC)-based infectious clone of a low passage Marek's disease virus (MDV) vaccine strain, CVI988 | |
| Li | Characterization of Marek's disease virus serotype 1 phosphorylated polypeptide pp38 gene product and quail cell lines supporting replication of Marek's disease virus serotype 1 and 2 and herpesvirus of turkeys | |
| Grimsrud | Cytotoxic T lymphocyte responses to Marek's disease herpesvirus-encoded glycoproteins and their impairment by chicken infectious anemia virus |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A1OB | Publication of a patent application | ||
| ARAI | Request for the grant of a patent on the basis of the submitted results of a substantive examination of a patent application | ||
| B1PR | Patent granted | ||
| ODRP | Renewal fee for the maintenance of a patent |
Payment date: 20120713 Year of fee payment: 12 |
|
| PBON | Lapse due to non-payment of renewal fee |
Effective date: 20130801 |