HRP20010678A2 - CRYSTAL STRUCTURE OF cPLA2, AND METHODS OF IDENTIFYING AGONISTS AND ANTAGONISTS USING THE SAME - Google Patents

Description

Pozadina izuma

Leukotrieni i prostaglandini su upalni medijatori važni u slučajevima astme, artritisa i drugih upalnih bolesti. Leukotrieni uzrokuju astmatičku opstrukciju putem bronhokonstrikcije, povećane sekrecije mukusa i kemostatičkog privlačenja inflamatornih stanica (O'Byrne, 1997); prostaglandini uzrokuju bol i nastanak edema, koji su pak povezani s artritisom. Farmakološka intervencija koja blokira ili sintezu ili djelovanje ovih lipidnih medijatora, efikasna je u tretiranju humanih oboljenja, potvrđujući tako njihovo značenje i važnost (Simon et al., 1998; O'Bryne, 1997).

Citosolna fosfolipaza A2 (cPLA2) inicira produkciju leukotriena i prostaglandina, otpuštanjem arahidonske kiseline iz staničnih membrana. Arahidonska kiselina je zauzvrat metabolizirana u prostaglandine kroz ciklooksigenazni put i u leukotriene kroz 5-lipooksigenazni put. Popratno, uz otpuštanje arahidonske kiseline, stvara se lizo-trombocitni aktivirajući faktor (lizo-PAF), koji potom može biti acetiliran u PAF, molekulu koja je također implikator patofiziologije astme i artritisa (Venable et al., 1993). Tako reakcija katalizirana sa cPLA2 inicira produkciju tri klase upalnih medijatora: leukotriena, prostaglandina i PAF.

cPLA2 je član vrlo raznolike super-obitelji fosfolipaza A2 enzima koje odlikuje zajednička sposobnost da cijepaju sn-2 ester glicerofosfsolipida. Prvi članovi obitelji kojima je ustanovljena struktura bili su enzimi niske molekularne mase koji su bili izlučivani ili ekstracelularno ili u granulama (ovdje ih se zajednički naziva sPLA2; grupe I, II, III, V, VII i IX) (Dennis, 1997). PLA2 obitelj se proširila kloniranjem i karakterizacijom o kalciju ovisne arahidonil-selektivne cPLA2 (Clark et al., 1991; Kramer et al., 1991), o kalciju ovisne PLA2 (Tang et al., 1997; Balboa et al., 1997), te plazme i intracelularne PAF-acetilhidrolaze (Hattori et al., 1994, 1995). Svaki od ovih novih enzima nije pokazivao homologiju sekvenci s niskomolekularnim enzimima ili međusobno. Nadalje, za razliku od molekula sPLA2 koje koriste aktiviranu vodu za cijepanje fosfolipida, ovi enzimi izgleda da koriste nukleofilni serin. Izgleda da posjeduju više sličnosti sa drugim lipazama iz obitelji αβ hidrolaza nego sa molekulama sPLA2. Nedavno su klonirana dva dodatna enzima koji posjeduju 30% identičnosti sa katalitičkom domenom iz cPLA2; iz cPLA2β (c. Song et al., priručnik za pripravljanje) i iz cPLA2γ (Underwood et al., 1998).

Kloniranje cPLA2 se također opisuje u U.S. patentu br. 5,322,776,5,354,677,5,527698 i 5,593,878. Kloniranje o kalciju ovisne cPLA2 se također opisuje u U.S. patentu br. 5,466,595,5,554,511,5,589,170 i 5,840,511.

Mnogi su dokazi podržali središnju ulogu cPLA2 u biosintezi s lipidnim medijatorom. cPLA2 je jedini enzim koji je visoko selektivan za fosfolipide koji sadržavaju arahidonsku kiselinu na sn-2 poziciji (Clark et al., 1995; Hanel&Gelb, 1993). Aktivacija cPLA2 ili njezina pojačana ekspresija je povezana s povišenjem razine sinteze leukotriena i prostaglandina (Lin et al., 1992b). Tijekom aktivacije, cPLA2 se translocira na staničnu membranu, gdje biva ko-lokalizirana sa ciklooksigenazom i lipooksigenazom, koje metaboliziraju arahidonat u prostaglandine i leukotriene (Schievella et al., Glover et al., 1995). Iako su ovi podaci prinudni, krajnji dokaz središnje uloge cPLA2 u produkciji eikozanoida i PAF, dolazi iz eksperimenata s miševima koji su metodom homologne rekombinacije, deficijentni u cPLA2 (Uozumi et al., 1997; Bonventre et al., 1997). Peritonealni makrofagi dobiveni iz takvih životinja nisu proizvodili leukotriene, prostaglandine ili PAF. Miševi deficijentni u cPLA2 su također imali ulogu u stvaranju slike o ulozi cPLA2 kod bolesti, pošto su takvi miševi rezistentni na bronhijalnu hiperaktivnost kod anafilaktičkog modela koji je korišten za prikrivanje astme (Uozumi et al., 1997).

cPLA2 se sastoji od barem dvije funkcionalno različite domene: N-terminalne Ca2+-ovisne lipid-vezujuće (CaLB) domene i Ca2+-ovisne katalitičke domene (Nalefski et al., 1994). N-terminalna CaLB domena je član C2 obitelji i njezina je struktura poznata (Perisic et al., 1998; Xu et al., 1998); ona posreduje u regulaciji kalcija ko-lokaliziranjem katalitičke domene s njezinim membranskim supstratom (Nalefski et al., 1994). cPLA2 aktivnost je, nadalje, također regulirana fosforilacijom katalitičke domene (Lin et al., 1991; Leslie, 1997). Ser505 i Ser727 su jedinice konzervirane u svim vrstama i fosforilirane su u multiplim staničnim tipovima (de Carvalho et al., 1998). Fosforilacija Ser505 s članovima obitelji MAP-kinaza je uobičajen odgovor na ekstracelularni stimulans koji oslobađa arahidonsku kiselinu. Mutacija Ser505 u Ala smanjuje aktivaciju (Lin et al., 1993) dok analogna mutacija na Ser727 ne pokazuje sličan efekt (Leslie, 1998).

Nekoliko smjerova dokaza sugerira da katalitički mehanizam cPLA2 napreduje kroz serin-acil intermedijer (Trimble et al., 1993; Hanel&Gelb, 1995). Mutacija Ser228 uklanja cPLA2 aktivnost u svim supstratima, podrazumijevajući također i fosfolipide, lizofosfolipide i masni acilirani kumarin (Pickard et al., 1996; Huang et al., 1996). Ser228 je prisutan u pentapeptidnoj sekvenci G-1-S-G-S, koja je slična klasičnom «lipaza motivu» G-X-S-X-G (Schrag&Cygler, 1997) koji je pronađen kod mnogih lipaza u okvirima šire obitelji enzima koji se nazivaju αβ hidrolaze. Ovi enzimi posjeduju uobičajenu jezgru koja se sastoji od dobro konzerviranih miješanih β slojeva čiji su ogranci razasuti po α glomerulama. U svim αβ hidrolazama, katalitički serin je prisutan u uskom zavoju molekule između β-ogranka i α-heliksa, a naziva se «nukleofilni lakat» (pogledaj pregled od Schrag&Cygler, 1997). Ovaj zavoj usmjerava kratki serinski lanac od kostura proteina, reducirajući tako steričku zapreku i postavljajući zahtjev da +2 i –2 postrani lanci budu maleni, kako bi se izbjegao sterički sraz; što je i prevalencija G-X-S-X-G motiva (Derewenda&Derewenda, 1991).

Uz serin, αβ hidrolaze koriste histidin i kiselinu (aspartat/glutamat) kao i drugi članovi katalitičkih trijada, sličnih onima koje su prisutne u serin proteazama (Schrag&Cygler, 1997). Međutim, iako je u cPLA2 dokazano da je Asp549 esencijalan za aktivnost, niti jedna od 19 histidinskih jedinica to nije (Pickard et al., 1996). Za različitu jedinicu Arg200 je pokazano da igra ulogu u enzimatskom procesu, iako je mehanizam njezinog uključivanja ostao nepoznat. Ove su opservacije navele na mišljenje da cPLA2 djeluje kroz katalitički mehanizam, do sada nepoznat za acil hidrolaze.

Kao i obje molekule sPLA2 i lipaze iz obitelji αβ hidrolaza, cPLA2 prvenstveno cijepa suptrate prisutne u interfazi (Nalefski et al., 1994). Ovaj je fenomen, poznat kao interfacijalna aktivacija, pridodan: bilo konfomacijskim promjenama enzima ili favoriziranoj prezentaciji supstrata (Scott et al., 1990). Podrijetlo 1500-struke razlike u cPLA2 aktivnosti u odnosu na monomerni ili micelarni supstrat ostaje nepoznato.

I pored ključne uloge cPLA2 kod upalnih bolesti, njihova trodimenzionalna struktura ostaje neriješena, ostavljajući mnoga pitanja bez odgovora. Ovdje donosimo kristalnu strukturu humane molekule cPLA2 dobivene x-zrakama pri rezoluciji od 2.5 angstrema. Struktura omogućava uvid u podrijetlo selektivnosti arahidonata i interfacijalne aktivacije, rasvjetljuje uloge Ser228, Asp549 i Arg200 i razjašnjava međusobnu povezanost djelovanja CaLB i katalitičkih domena. Važno je da se struktura jedinstvene topologije razlikuje od one koja je prisutna kod članova obitelji αβ hidrolaza.

Sažetak izuma

Sve reference koje upućuju na amino kiseline u cPLA2 su ovdje napravljene uz korištenje brojeva jedinica koji se odnose na cPLA2 sekvencu iz Tablice I U.S. Patenta br. 5,527,698, s time da je prvi metionin proglašen kao jedninica 1 (Met1).

Ovaj izum daje kristalnu strukturu cPLA2. Preferabilno, molekula cPLA2 je ili humana ili iz stanice vrste ne-sisavaca. U nekim aspektima, cPLA2 je rekombinantna molekula cPLA2 i/ili podrazumijeva zrelu sekvencu molekule cPLA2 koja se normalno pojavljuje u prirodi.

Neki drugi aspekti pružaju kristalnu kompoziciju koja obuhvaća molekulu cPLA2 u asocijaciji s drugim kemijskim vrstama. Takve druge kemijske vrste su prvenstveno odabrane iz grupe koja se sastoji od potencijalnih inhibitora aktivnosti cPLA2 i potencijalnih inhibitora vezivanja molekule cPLA2 na membranu.

Neki drugi aspekti ovog izuma pružaju strukturni model cPLA2 koji podrazumijeva zbir podataka o strukturi cPLA2. Takav je zbir podataka prvenstveno dobiven kristalografskom analizom cPLA2, uključujući također i podatke dobivene NMR analizom. U nekim aspektima ovog izuma, podaci prikazuju dio strukture cPLA2, podrazumijevajući bez ograničenja aktivno mjesto na molekuli cPLA2 ili na CaLB domeni molekule cPLA2.

Svaka metoda koja stoji na raspolaganju se može koristiti za konstruiranje takvog modela iz podataka dobivenih kristalografski i/ili uz pomoć NMR analize, ili pak iz podataka dobivenih neovisnom analizom kristalne strukture cPLA2. Takav model može biti konstruiran iz raspoloživih analitičkih podataka uz korištenje poznatih software-skih paketa kao što su HKL, MOSFILM, XDS, CCP4, SHARP, PHASES, HEAVY, XPLOR, TNT, NMRCOMPASS, NMRPIPE, DIANA, NMRDRAW, FELIX, VNMR, MADIGRAS, QUANTA, BUSTER, SOLV, O, FRODO, RASMOL i CHAIN. Model konstruiran iz ovih podataka može potom biti vizualiziran uz korištenje raspoloživih sustava, podrazumijevajući primjerice Silicon Graphics, Evans and Sutherland, SUN, Hewlett and Packard, Apple Macintosh, DEC, IBM i Compaq. Ovaj izum također podrazumijeva računalni sustav koji pruža model obuhvaćen izumom i hardware korišten za konstrukciju, procesiranje i/ili vizualizaciju modela obuhvaćenog izumom.

Daljnji aspekti omogućavaju kompjutorski sustav koji podrazumijeva hardware i model obuhvaćen ovim izumom.

Metode su također namijenjene za identificiranje vrsta agonista ili antagonista aktivnosti cPLA2 ili vezivanja iste molekule, podrazumijevajući: (a) model obuhvaćen ovim izumom, (b) studiju interakcije odabranih vrsta s takvim modelom, i (c) selekciju vrsta za koje se pretpostavlja da djeluju kao ranije rečeni agonisti ili antagonisti. Vrste identificirane u skladu s takvim metodama su također navedene.

Drugi aspekti omogućavaju: (1) proces identifikacije supstance koja inhibira aktivnost cPLA2 ili vezivanje koje podrazumijeva determiniranje interakcije između supstance kandidata i modela strukture cPLA2, ili (2) proces identifikacije supstance koja prikriva aktivnost cPLA2 ili vezivanje koje podrazumijeva determiniranje interakcije između supstance kandidata i modela strukture cPLA2. Supstance identificirane u skladu s takvim procesima se također navode.

Studija interakcije vrsta kandidata s modelom, može biti izvedena uz korištenje raspoložive software platforme, podrazumijevajući QUANTA, RASMOL, O, CHAIN, FRODO, INSIGHT, DOCK, MCSS/HOOK, CHARMM, LEAPFROG, CAVEAT(UC Berkley), CAVEAT(MSI), MODELLER, CATALYST i ISIS.

Drugi aspekti pružaju metodu identificiranja inhibitora aktivnosti cPLA2 racionalnim kreiranjem aktivne supstance, što podrazumijeva: (a) kreiranje potencijalnog inhibitora koji će stvarati ne-kovalentne veze s jednom ili više amino kiselina u cPLA2 aktivnom mjestu, što je bazirano na kristalnoj strukturi koordinata cPLA2; (b) sintetiziranje inhibitora; i (c) determiniranje da li potencijalni inhibitor inhibira aktivnost cPLA2. Preferabilno, koordinate kristalne strukture cPLA2 korištene u takvim metodama dobivene su iz cPLA2 kristala prostorne grupe P21212 s vrijednosti a=153,59 angstrema, b=95,49 angstrema, i c=139,13 angstrema. U nekim drugim preferiranim aspektima, inhibitor je kreiran tako da stupa u interakciju s jednim ili više atoma rečene jedne ili više amino kiselina na cPLA2 aktivnom mjestu, i odabran je iz grupe koja se sastoji od:

CB i Oγ atoma iz Ser228;

Oβ1 i Oβ2 atoma iz Asp549 i Asp575;

CB, Cg, Cd, NE, CZ, NH1 i NH2 atoma iz Arg200, Arg413 i Arg579;

Kisik na ugljičnom kosturu Trp393;

Nδ2 i Oδ1 atomi iz Asn555;

Atomi CD1, CE1, CG, CZ, CE2 i CD2 iz Phe397, Phe681, Phe683 i Phe199;

CG, CD1, NE1, CE2, CZ2, CH2, CZ3, CE3 i CD2 iz Trp232 i Trp393;

CB i Oγ atomi iz Ser577;

Atomi CB i Sγ iz Cys331;

Atomi OE1 i OE2 iz Glu589;

Atomi CB, CG, CD, CE i NZ iz Lys588;

Oγ1 atom iz Thr680;

OE1 i OE2 atomi iz Glu418 i Glu422;

Atomi CB, CG, SD i CE iz Met417;

Atomi CB, CG, CD1 i CD2 iz Leu400 i Leu421;

Atomi CB, Cg1, CG2 ili CD1 iz Ile424;

Kostur NH i atomi ugljik oksida iz Ala578; i

Atomi CB, CG, ND1, CE1, NE2 i CD2 iz His639.

Agonisti i antagonisti identificirani rečenim metodama se također navode u okviru izuma.

Također su navedene metode za identificiranje inhibitora cPLA2 membranskog vezivanja sa racionalnom konstrukcijom aktivne supstance, što podrazumijeva: (a) kreiranje potencijalnog inhibitora koji će formirati ne-kovalentne veze s jednom ili više amino kiselina u cPLA2 elektrostatskoj regiji, što se bazira na koordinatama kristalne strukture cPLA2; (b) sintetiziranje inhibitora; i (c) determiniranje da li potencijalni inhibitor inhibira aktivnost cPLA2. Preferabilno, koordinate kristalne strukture cPLA2 korištene u takvim metodama dobivene su iz cPLA2 kristala prostorne grupe P21212 s vrijednosti a=153,59 angstrema, b=95,49 angstrema, i c=139,13 angstrema. U nekim drugim preferiranim aspektima, inhibitor je kreiran tako da stupa u interakciju s jednom ili više amino kiselina iz grupe koja se sastoji od Arg467, Arg485, Lys488, Lys544 i Lys543. Agonisti i antagonisti koji su identificirani takvim metodama, se također navode.

Kratak opis crteža

Slika 1. Eksperimentalna mapa dobivena MAD fazom koja je dobivena metodom raspršivanja jednog Tb atoma po 749 čestica cPLA2. Korišteno je poravnavanje otapala (60% sadržaja otapala) i dvostruko ne-kristalografsko ujednačavanje simetrije u DM.

Slika 2 (A). Linijski dijagram cPLA2 monomera. CaLB domena je prikazana zeleno, sa dva Ca2+ atoma prikazana crveno. Vršna struktura cPLA je obojena ljubičasto. Pokretne petlje niske elektronske gustoće prikazane su točkasto. Fleksibilni linker između CaLB i katalitičke domene je prikazan crveno. Pozicije 4 serinske podjedinice koje su fosforilirine u cPLA2 su također prikazane. Ilustracija je pripremljena sa Molscript (Kraulis, 1991) i RASTER3D (Bacon & Anderson, 1988).

(B) GRASP površinski dijagram cPLA2. Jedinice koje predstavljaju N15/NH pomake uslijed interakcije sa dodecilfosfoholinskim jedinicama u NMR eksperimentima koje je izveo Xu et al. (1998) obojene su ljubičasto. cPLA2 aktivne pukotine prikazane su crveno. Pokrovne jedinice nisu prikazane radi jasnoće prikaza.

(C) Prikaz površinskog potencijala cPLA2, s baznim jedinicama koje su plavo osjenčane i kiselinske jedinice osjenčane crveno. Pokrovne jedinice su uklonjene zbog jasnoće prikaza. Visoko bazični dijelovi su jasno vidljivi u veznoj regiji membrane molekule. Ilustracija je pripravljena sa GRASP (Nicholls, 1992). Svi su prikazi jednake orijentacije.

Slika 3 (A) Richardson prezentacija kanonskog αβ hidrolaza nabora. Β lanci su prikazani kao strelice, dok su α lanci u obliku pravokutnika. Brojanje sekundarnih strukturnih elemenata je u skladu sa pregledom od Schrag & Cygler (1997). Heliks C koji neposredno prati «nukleofilni lakat» je obojen ružičasto.

(B) Richardson dijagram nabora cPLA2. Shema brojanja je podijeljena tako da heliks koji neposredno prati Ser288 je keliks C, kao i u slučaju kanonskog αβ nabora. Središnji dio je obojen žuto za razvidniju usporedbu sa kanonskim αβ hidrolaza naborom u (A). Elementi koji čine vršni dio obojeni su ljubičasto; regije petlji prikazane crveno su vioko pokretne i ne predstavljaju trag elektronske gustoće.

Slika 4. Pružanje primarne strukture cPLA2. α, β i γ. Identične jedinice su povezane zajedno, dok su sekundarni strukturni elementi uočeni u x-kristalnoj strukturi cPLA2 2 α prikazani ispod sekvenci. Sekundarni strukturni elementi izvan vršne regije prikazani su žuto, dok su oni unutar vršne regije prikazani ljubičasto. Crne linije predstavljaju regije zaokreta ili petlji. Jedinice koje nisu identificirane crnim linijama ili ne predstavljaju sekundarne strukturne elemente nemaju značajnu elektronsku gustoću.

Slika 5 (A). Površinski dijagram koji prikazuje katalitičku domenu cPLA2 koje je pokrivena vršnom jedinicom. Ser288 je prikazan na dnu lijevka. Nastavak sekvence koji nije vidljiv na eksperimentalnim mapama predstavljen je crvenim točkama i pretpostavlja se da je uključen u oblikovanje vršnog zgloba. Jedinice za koje su u mapama elektronske gustoće vidljivi samo osnovni atomi su predstavljeni kao alanini. Izložene površine svih hidrofobnih jedinica obojene su plavo, dok je ona od Arg200 obojena crveno. Ilustracija je pripremljena sa GRASP (Nicholls, 1992).

(B) Zatvarajuć regija oko aktivnog mjesta cPLA2 u radijusu od 7 angstrema oko Ser228. Dvije jedinice koje su neposredno uključene u katalizu su obojene zeleno. Arg200 i petlja koja sadržava Gly jedinice 197 i 198 prikazane su žutim. Vodik iz jedne molekule vode koja vidljiva na vodikovim vezama eksperimentalnih mapa veže se za Asp549 i atome ugljika iz Trp393 i Thr330. Ilustracija je dobivena sa Molscript i RASTER3D.

Slika 6. Katalitički mehanizam pretpostavljen za cPLA2 koji uključuje napad Ser228 na sn-2 poziciju glicerofosfolipidnog supstrata. AA: arahidonska kiselina; HG: čelna grupa; C18: oktadecilna grupa. Za Gly 197 i 198 se pretpostavlja da su dio oksianionske rupe, dok Arg 200 stabilizira fosfatni dio čelne grupe.

Detaljni opis izuma i preferiranih slučajeva

Struktura cPLA2 je otkrivena uz korištenje jednog teškog atoma raspršenog po 749 jedinica

Puna dužina humane molekule cPLA2. je ekspresirana u CHO stanicama i purificirana modifikacijom metodologije koja je opisna u Clark et al., 1990 (Stahl et al., priručnik za pripravljanje). Kristali su dobiveni na 18 ̇C uz korištenje PEG 1000 kao precipitanta i korištene su standardne difuzijske tehnike hlapljenja. Kristali su rasli nekoliko dana do dimenzija iznad 0.6 mm x 0.5 mm x 0.1 mm, no bili su vrlo osjetljivi na oštećenje x-zrakama. Krugovi usisavanja kristala u krioprotektnim otopinama uz rastuće količine PEG 400 i DMSO, uz hlađenje posuda i izlaganje sinhrotronskoj radijaciji, bili su kritični u dobivanju difrakcije sa dobivanjem minimalnih Bragg pukotina od 2.5 angstrema. Kristali pripadaju prostornoj grupi P21212 (a=153.59 angstrema, b=95.49 angstrema, c=139.13 angstrema), s dva monomera (1498 jedinica) i 60% otapala po asimetričnoj jedinici.

Pokušaji da se pripreme kristali cPLA2 koji usisavaju teške atome uz korištenje gadolinijuma i terbijuma, mogu priskrbiti izomorfne derivate. Čak i lantanidi, zamijenjeni sa Ca2+ atomom u CaLB, omogućavaju jedinstveni teški atom za rasipanje po 749 amino kiselinskih jedinica. Informacija dobivena unutarnjim faziranjem iz ovakvih kristala nije bila dovoljne kvlitete da bi se dobila mapa inicijalne elektronske gustoće. Ovo razmatranje je pridodalo činjenicu da vezivanje najtežih atoma rezultira ne-izomorfizmom između nativnih i usisanih kristala, što dovodi do pokušaja da se odredi struktura cPLA2 uz pomoć fazne multivalne anomalijske disperzije (MAD) (Hendrickson, 1991).

Terbij-usisavajući kristali cPLA2 su pripravljeni, kriotretirani (pogledaj Metode) i hlađeni pod 100°K strujom dušika. Dobiveni su podaci na tri različite valne dužine na oko Tb LШ rubu (pogledaj Tablicu I) i sakupljeni iz jednog kristala koji je radi osjetljivosti na zračenje, translatiran uz os rotacije između sakupljenih podataka. Eksperimentalne faze do 3.2 angstrema su kalkulirane sa SHARP (de la Fortelle & Bricogne, 1997); potom je izvršeno nekoliko krugova ispiranja s otapalom i dvostruko ujednačavanje u DM (Cowtan et al., 1996) što nam je omogućilo da proširimo faze do 2.5 angstrema. Ovom je procedurom dobivena mapa elektronske gustoće visoke kvalitete (Slika 1) gdje obje domene svakog cPLA2 monomera mogu biti jasno određene. Inicijalno, CaLB (Perisic et al., 1998; 1RLW) je rotirana u gustoći i dobiven je polialaninski trag za vidljive regije katalitičke domene uz korištenje programa QUANTA (Molecular Simulations Inc.) čime dobivamo model s aproksimativno 550 jedinica za svaki monomer. Slijedi fino pročišćavanje ove inicijalne strukture s finalnim faznim kombinacijskim korakom (REFMAC; Murshudov et al., 1997) za čim slijedi ručno građenje modela (QUANTA) iz modela koji je dobiven pomću metode XPLOR (Brunger et al., 1992b). Sadašnji model sadržava 1258 građevnih jedinica (oba monomera) i 40 molekula vode (Tablica I).

Molekularna struktura

Monomer cPLA2 je elipsoidalna struktura sa dvije domene dimenzija od približno 100 angstrema x 55 angstrema x 45 angstrema (Slika 2a). N-terminal CaLB domene (jedinice 16-138) predstavlja β sendvič, povezan s katalitičkim domenom preko građevnih jedinica 139-143, s kojom stvara samo nekoliko protein-protein veza. Središnji dio katalitičke domene se sastoji od 10-lančanog središnjeg β sloja sa interno rasutim heliksima koji se razlikuju od onih kod kanonskog αβ hidrolaza nabora. Monomeri cPLA2 prisutni u asimetričnoj jedinici nisu savršeno superpozicionirani u kontekstu fleksibilnosti interdomenske petlje. Svakako, kada su CaLB domene superpozicionirane, postoji razlika od 4-5°između dvije katalitičke domene. Petlja koja međusobno povezuje domene ima preciznu konformaciju svakog monomera, čije građevne jedinice pokazuju visoke temperaturne faktore.

cPLA2 je citosolni protein koji se translocira na membranu kada se količina slobodnog Ca2+ podigne na submikromolekularnu razinu (Clark et al., 1990,1991). Organizacija domena u cPLA2 navodi na činjenicu na koji je način orijentirano aktivno mjesto u odnosu na staničnu membranu. Slika 2b je površinski dijagram koji pojašnjava rezultate HSQC studije koja je izvedena na CaLB; Xu i suradnici (1998). Građevne jedinice koje pokazuju N15/NH pomake za vrijeme inkubacije s dodecilfosfoholinom u ovim eksperimentima, prikazane su ljubičastom bojom. Jasno je da se obojane jedinice pojavljuju s iste strane molekule kao aktivno mjesto. Shodno tome, ako CaLB koristi te jedinice da bi se vezao za fosfolipidnu membranu, katalitička domena biva grubo pozicionirana na način da veže fosfolipidni supstrat na aktivnom mjestu. Fleksibilnost linkera između dvije domene, kao i manjak glavnih protein-protein interakcija između njih, navodi na činjenicu da već mala rotacija između domena može biti postignuta za slučaj optimalnih interakcija s membranom.

Kao što je prikazano na površinskom potencijalnom dijagramu na Slici 2c, postoji visoko bazična regija koja se proteže od aktivnog mjesta, kroz dio pozitivno nabijenih građevnih jedinica na β3 lancu CaLB. Ove bazne karakteristike bi se očekivale u regiji gdje postoje proteinski višestruki elektrostatski kontakti s negativno nabijenim fosfolipidnim čeonim grupama membranskog sloja (pogledaj dolje). Jedinice 434 do 456 su međutim, u neredu, onemogućavajući da se precizno odredi prava veličina bazičnog dijela. Pa ipak je značajno da su slični bazični dijelovi uočeni u PI4 kinazama, te u različitim vrstama sPLA2s molekula (Rao et al., 1998). Uzbudljivo je pretpostaviti da visok afinitet vezivanja cPLA2 na membranu koja se sastoji od fosfatidil metanol liposoma (Hixon & Gelb, 1998) je posredovan kroz spomenuti dio i bliske bazične ogranke β lanca 3 u CaLB domeni.

N-terminus CaLB domene

Struktura CaLB domene kod pune dužine molekule cPLA2 je veoma slična onima koje su razjašnjene sa NMR i x-kristalografijom (Xu et al., 1998; Perisic et al., 1998) s manjim razlikama. Ukratko, sastoji se od osam antiparalelnih β lanaca koji su međusobno povezani uz pomoć šest petlji, oblikujući β sendvič koji se uklapa u «tip II» topologiju za C2 domene (Nalefski et al., 1994b) Dva Ca2+ atoma su vezana na jednom kraju CaLB preko konstelacije Asp i Asn postranih lanaca, kao i atomima ugljika kostura, na pozicijama tri različite petlje (kalcij-vezujuće petlje; CBLs); isti atomski raspored uočen je u CaLB domeni koju se razjasniji Perisic i suradnici (1998). Ca2+ atomi su otprilike udaljeni 4 angstrena. Njihov okoliš u cPLA2 molekuli pune dužine, međutim ne pokazuje molekule vode prisutne u CaLB strukturi koju su razjasnili ovi autori; već naprotiv, koordinirana na kalcij mjesto 1 (definirano u Perisic et al., 1998) je molekula MES (2-[N-morfolino]etansulfonska kiselina) iz pufer akoji se koristi u kristalizaciji i krioprotekciji. U oba cPLA2 monomera, udaljenost između Ca2+1 i najbližeg MES sulfonat atoma kisika je otprilike 2.2 angstrema. Nadalje, morfolino grupa je također u dodiru sa postranim lancima His62 i Tyr96, tvoreći tako male hidrofobne niše. Pored kristalizacijskog artefakta, koordinacija Ca2+1 iz cPLA2 na sulfat molekule MES može biti natjecanje vezujućeg moda fosfatne grupe fosfolipidne molekule, sugerirajući na taj način da u molekuli cPLA2, Ca2+ igra ulogu mosta između proteina i fosforilirane membrane, više no jednostavnu ulogu alosteričkog aktivatora.

Novo otkrivena topologija cPLA2 molekule koja je razlikuje od αβ hidrolaze

Katalitička domena cPLA2 sastoji se od 14 β lanaca i 13 α heliksa; njezin središnji dio se sastoji od 10-lančane strukture središnje pomiješanog β sloja koji je okružen sa 9 α heliksa s ograncima β5 kroz β11 koji čine najočitiji dio spomenutog sloja (pogledaj Richardson dijagram n aSlici 3b). Ovaj β sloj sadržava superhelilani zavoj. Zbog jednostavnosti, sekundarni elementi cPLA2 identificirani su bazirajući se na αβ hidrolaza naboru čija je nomenklatura prezentirana u Schrag & Cygler (1997), gdje katalitičkom serinu uvijek prethodi β5 i prati ga heliks C.

Prvi β lanac u molekuli cPLA2 je β1, koji prati fleksibilnu vezu nakon CaLB. Produljena petlja koja sadržava jedan dugački heliks, čini vezu sa β4, u središnjem dijelu nabora. Ova konstrukcija β1/α-heliks je analogna onoj koja je uočena kod lipaze iz Humicola lanuginosa, gdje helikalna regija također nije razmatrana kao dio nabora, no povezuje β10 na prvi β lanac središnjeg dijela (ulazak 1TIB u PDB). Slijedeći paralelni β lanac, β5, prethodi katalitičkom serinu (228). Topologije β5, heliksa C (obojen ružičasto na Slikama 3a i 3b), te petlje koja ih povezuje su slične kao i u slučaju αβ hidrolaza. Ovo međuvezujuća petlja se naziva «nukleofilni lakat». Tri slijedeća α heliksa, koja su povezana petljama, omogućavaju vezu između ove regije i daljnja 4 β lanca ovog dijela nabora. Od četiri β lanca koja potom slijede (β6-β9), β6 je najduži i čini nekoliko vidikovih veza sa β7. Lanci β7 do β1, dakle, iako ne pokazuju kontinuitet u sekvenci, mogu biti razmatrani kao mali β sloj unutar veće strukture.

Nakon β9 pojavljuje se veća različitost u odnosu na središnji αβ dio. Sekvenca cPLA2 na ovom mjestu formira regiju koja je prikazana ljubičasto na Slikama 2a i 3b. Ovaj, 180-jedinica veliki dio čini vršak katalitičke domene. Asp549, katalitički partner Ser228, smjestio se unutar regije između kraja vrška i β10, koji je pak dio središnjeg dijela. Prateći vršnu strukturu, posljednja tri β lanca su pozicionirana na način da kompletiraju središnji β sloj i razasuta su između heliksa G do J.

Αβ hidrolaza nabor je uobičajen u mnogim esterazama i drugim hidrolitičkim enzimima (Schrag & Cygler, 1997). Richardson dijagram (Slika 3a) sastoji se od središnjeg β sloja čiji raspored β lanaca prati sekvencu linearno (uz izuzetak β3, koji je obično smješten između β4 i β5). Na prvi pogled, topologija cPLA2 izgleda da je cirkularna permutacija αβ hidrolaza nabora. Međutim, pažljiva usporedba Slika 3a & 3b jasno ukazuje da jedino regija koja okružuje «nukleofilni lakat» je zapravo neposredno usporedljiva (β5 sa heliksom C, jedinice 222-238). Najveće razlike uključuju antiparalelnu prirodu lanaca β6 i β9, multiplicitet heliksa između β5 i β6, te odsustvo intervenirajućeg heliksa između lanaca kasnijeg dijela cpla2 αβ središnjeg dijela.

Iako je vršna strktura u cPLA2 (jedinice 370-548) dio katalitičke domene, ona nije uključena u αβ središnji dio. Usporedba sekvenci katalitičkih domena humanih cPLA2 molekula α, β i γ (Slika 4) pokazuje da je homologija koncentrirana unutar αβ središnjeg dijela (elementi obojeni žuto) i β lanaca 9a i 9d. Tako, središnji dio vršnog dijela je različit između cPLA2 izooblika. Usporedba između linijskog dijagrama cPLA2 na Slici 2a gdje je vršna regija prikazana ljubičasto, i dijagram površinskog potencijala na Slici 2c, ukazuje da je visoko bazična regija koja je hipotetski predstavljena naprijed u tekstu, čineći elektrostatske kontakte s fosfolipidima membrane, zapravo u velikoj mjeri oblikovana građevnim jedinicama vršne regije.

Vršna regija cPLA2 također sadržava dvije od tri najmobilnije regije cijele strukture, građevne jedinice 433-456 i 500-536 (treća regija je C-terminus, građevne jedinice 728-749). Ovi amino-kiselinski lanci nemaju značajnu elektronsku gustoću i nisu obuhvaćeni modelom (prikazano točkicama na Slici 2a). Zanimljivo je da ove visoko fleksibilne regije vršnog dijela udomljavaju tri od četiri serinske jedinice koje postaju fosforilirane stimulacijom agonista (437, 454, 505). Uloga Ser437 i Ser454 nije razjašnjena, pošto ove jedinice nisu konzervirane između različitih vrsta. Nasuprot rečenom, Ser505 je konzerviran u cPLA2 iz evolucijski različitih vrsta (pile, čovjek, miš, štakor, riba mačka) i njegova fosforilacija MAP kinazom je potrebna radi maksimalne aktivacije cPLA2 u stanicama kukaca (Lin, et al., 1993; Qiu et al., 1998). Ser505 koji u našim kristalima izgleda heterogeno fosforiliran i smješten na visoko fleksibilnoj, otapalu izloženoj petlji, ne ostvaruje kontakt kako sa samim tijelom priteina, tako niti sa drugim susjednim molekulama cPLA2 monomerima. Ser505 je distalan u odnosu na oba aktivna mjesta i obje regije vezivanja na membranu (pogledaj Sliku 2a); a njegova je udaljenost od zgloba između CaLB i katalitičke domene je značajna (pogledaj diskusiju). Četvrto mjesto cPLA2 fosforilacije, Ser727, nalazi se na C-terminusu strukture. Iako je ovo mjesto konzervirano između vrsta, njegova funkcionalna važnost nije još razjašnjena.

Lijevak aktivnog mjesta je djelomično prekriven pokrovcem koji je dostupan otpalu

Najznačajnije svojstvo cPLA2 strukture je aktivno mjesto u obliku lijevka koji prodire jednom trećinom svoje dužine u katalitičku domenu do Ser228 i Asp 549 koji su smješteni na dnu dubokog, uskog procjepa. Iako širok na vrhu, lijevak se prema dolje sužava do dijametra od 7 angstrema na otvoru aktivnog mjesta, kako je to vidljivo na Slici 5a. Lijevak je prožet hidrofobnim građevnim jedinicama (označene plavo na Slici 5a) i čini oblik kolijevke u koju se mogu vezati masne acilne jedinice membranskih fosfolipidnih supstrata.

Aktivno mjesto cPLA2 molekule je djelomično pokriveno «poklopcem» koji se sastoji od 413-457 jedinica. Poklopac zalazi u regiju petlje i popraćen je malim helikalnim trakom i kratkom zavojitom strukturom (pogledaj Sliku 5a). Građevne jedinice 408-412 koje vode u regiju poklopca, pokazuju veoma velike temperaturne faktore, dok jedinice 434-456 ne posjeduju značajnu elektronsku gustoću. Ove opservacije navode na činjenicu da su ove regije visoko mobilne i mogu se smatrati kao svojevrstan «zglob poklopca». Vidljiva regija poklopca ima amfipatski karakter; strana izložena otapalu je formirana ranije od polarnih građevnih jedinica (T416, E418, E419, E420, N423) dok je unutarnja strana prožeta hidrofobnim amino-kiselinama (M417, L421, I424). Shvatljivo je da «dvostruki» karakter regije poklopca igra ulogu kod membranskog fosfolipidnog vezivanja, pošto jedna strana ima mogućnost stvaranja vodikovih veza, dok je druga više sklona hidrofobnim interakcijama sa supstratom, ili sa membranom.

Pokušaji da se načini model diacilfosfolipidne molekule u aktivnom naboru cPLA2 molekule s poklopcem, demonstrira da acil esterska veza ne može biti pozicionirana u blizini aktivnog mjesta serina bez stvaranja sraza s okolnim građevnim jedinicama. Shodno tome, shvatljivo je da stvaranje odgovarajućeg prostora za vezivanje supstrata zahtjeva pokretanja poklopca. Prijedlog je u skladu s opservacijom da cPLA2 molekula pokazuje veću aktivnost u prisustvu staničnih nego monomernih supstrata (Cygler & Schrag, 1997). Ta je fenomen poznat pod imenom interfacijalna aktivacija.

Mnoge lipaze pokazuju interfacijalnu aktivaciju kao rezultat konformacijskog premještanja poklopca koji prekriva aktivno mjesto kod «zatvorene» forme enzima. Poklopac se pomiče u stranu, stvarajući tako «otvorenu» formu, gdej su katalitičke jedinice izložene supstratu. X-kristalografija donosi niz primjera ovakvog aktivacijskog mehanizma kroz određivanje struktura lipaza u «zatvorenim» i «otvorenim» formama, a kasnije i za veći dio koji je kristaliziran u prisustvu inhibitora (Cygler & Schrag et al., 1997). Vjerojatno je da se mehanizam interfacijalne aktivacije cPLA2 može usporediti sa drugim lipazama koje sadržavaju «poklopac», i gdje je pokretanje poklopca ključni korak u povećavanju područja pristupačne površine lijevka aktivnog mjesta, kao i omogućavanje neometanog pristupa katalitičkim jedinicama.

Aktivno mjesto na cPLA2 sadržava katalitički par

Acilna hidroliza provedena uz pomoć αβ hidrolaza izvedena je sa (Ser-Asp/Glu-His) katalitičkom trijadom koja se sada nalazi u serin proteazi. Acil esterska veza supstrata biva napadnuta od strane nukleofilnog serina, nakon čega dobivamo kovalentno vezan acil-enzim intermedijer koji se odmah potom otpušta u koraku koji uključuje ulazak molekule vode. Iako svi enzimi koji metaboliziraju lipide preko αβ hidolaza nabora, nastavljaju metaboličkim putem koji koristi katalitičku trijadu, identifikacija svih članova takve trijade u molekuli cPLA2 pokazala se kao zahtjevni zadatak. Usmjerena mutageneza prema Sharp i suradnici (1994) potvrdila je ulogu Ser228 i Asp549 u katalizi; način raspada bilo koje od 19 histidinskih jedinica koje utječu na aktivnost, međutim, ukazuje na novi katalitički mehanizam (Pickard et al., 1996). Ove opservacije navele su mnoge da predlože da cPLA2 sadržava sasvim novi katalitički centar kojemu nije potrebno sudjelovanje histidina, dok je važnost Arg200 za aktivnost ostala nerazjašnjena (Leslie, 1997; Pickadr et al., 1996).

Kristalna struktura cPLA2 dobivena x-analizom jasno ukazuje na aktivno mjesto koje sadržava Ser228 na dnu pukotine u obliku lijevka; Oδ2 u Asp549 leži na udaljenosti od 2.9 angstrema od svog Oγ atoma (Slika 5b). Jasno je međutim, da u aktivnom mjestu cPLA2 nedostaje histidinska jedinica. Nadalje, nema drugih jedinica na udaljenosti od 6 angstrema koje bi mogle ispuniti funkciju aktivne baze. Svi polarni utjecaji u razmaku od 3.5 angstrema od obje jedinice, posljedica su utjecaja grupa koje pripadaju kosturu ili pak molekule vode koja je pozicionirana na udaljenosti od 3.2 angstrema od Oδ1 atoma u Asp549. Iako Asn555 leži u aktivnom mjestu u lijevku, njegov Nδ2 atom je otprilike 6 angstrema udaljen od obje jedinice, te on kao takav ne bi mogao predstavljati idealnog kandidata za ovu funkciju.

U acil hidrolazama, nakon napada na sn-2 poziciju glicerofosfolipidnog supstrata, tranzicijsko stanje zahtjeva stabilizaciju s «oksanionskom pukotinom», ili pak niz donatora vodikove veze (to su uobičajeno atomi amida) i/ili bazične jedinice s funkcijom stabiliziranja razvoja negativnog naboja tranzicijskog stanja. U nekoliko je lipaza slučaj da barem jedna jedinica koja pridonosi oksanionskoj pukotini je dio pokretne petlje, te je prava konformacija dobivena jedino na način kada je lipaza u «otvorenoj» formi; no to, međutim, nije apsolutan preduvjet. U cPLA2, Gly197 i 198 su dijelovi glicinom bogate fleksibilne petlje između β4 i heliksa B; što omogućava da amidni kosturi Gly197 i Gly198 budu dobri kandidati za članove pre-formirane oksanionske pukotine (pogledaj Sliku 5b). Nadalje, kosturna amidna grupa Gly229, koja predstavlja vrh zavoja između β5 i heliksa C, također upućuje na smjer Gly197 petlje; te kao takva također može biti dionikom pukotine. Shodno tome, ova regija, kao i u slučaju oksanionske pukotine kod kimotripsina, izgleda da je oblikovana na taj način da stabilizira tetrahedralni intermedijer dobiven nakon nukleofilnog napada estera.

Višestrukost uloga uočena je i u slučaju Arg200. Navodi se na mišljenje da on pomaže CaLB u vezivanju enzima za lipidnu površinu; stupajući u interakciju s fosfolipidnom membranom; sudjelujući kao katalitička jedinica; stabilizirajući acil-enzim intermedijer; ili vezujući se za fosforilnu grupu fosfolipidnog supstrata (Pickard et al., 1996). Pozicioniranje Arg200 unutar lijevka (njegova površina je prikazana crveno na Slici 5a) proizlazi iz omogućavanja pomoći vezivanju lipida na CaLB. Nadalje, postrani lanac je aproksimativno 9 angstrema udaljen od aktivnog mjesta serina, što ga onemogućava kao kandidata za aktivnu ulogu u katalizi. Arg200 međutim, čini nekoliko ključnih kontakata s jedinicama oko aktivnog mjesta u lijevku. Postrani lanac čini most sa Thr680 i kontaktira atome kostura u Phe678, od kojih obojica leže u petlji između heliksa H i I. Lokacija Arg200 na oksanionskoj pukotini petlje navodi na činjenicu da bi nedostatak ovih dvostrukih hidrogenskih veza u Arg200 Lys mutantu o kojem je pisao Pickard & suradnici (1996), mogao biti odgovoran za fine promjene u konformaciji oksanionske pukotine petlje, koje pak uzrokuju dramatične posljedice na aktivnost.

Kataliza sa cPLA2 nastavlja se putem mehanizma koji se razlikuje od onoga koji je prisutan kod drugih acil hidrolaza

Nedostatak histidinske jedinice ili bilo koje druge potenijalne baze u aktivnom mjestu cPLA2 navodi na činjenicu da enzim pokreće acil hidrolizu putem novog katalitičkog mehanizma. U serin proteazama i drugim hidrolazama, histidinska jedinica prihvaća proton iz hidroksilne grupe reaktivnog serina, sudjelujući tako u formiranju kovalentnog tetrahedralnog intermedijera. U drugom koraku, acil-enzim intermedijer biva hidroliziran s molekulom vode da bi otpustio produkt, vraćajući ser-hidroksil enzimu. TEM-1 β laktamaza Klase A, čiji katalitički put također podrazumijeva acilaciju aktivnog mjesta serina popraćenu hidrolizom esterske grupe, prenosi proton od aktivnog mjesta Ser70 na karboksilatnu grupu Glu166, ili neposredno (Gibson et al., 1990) ili preko molekule vode (Lamotte-Brasseur et al., 1991). Novija istraživanja (Damblon et al., 1996) sugeriraju da velika udaljenost između karboksilatnih oksigena u Glu166 i Ser70 pretpostavlja neposredan prijenos protona, no također pretpostavlja i sudjelovanje molekule vode premosnice za prijenos protona. U katalitičkom mehanizmu acilaze iz penicilina (Duggleby et al., 1995) koja sadržava jedinicu koja predstavlja jednostruko katalitičko središte na N-terminusu serina, molekula vode premosnica uvjetuje bazični karakter α-amino grupe u Ser1. Kao posljedica toga, Oγ atom u Ser1 posjeduje nekleofilnost koja je dovoljno pojačana sa amino-terminalnom grupom, te slijedi stvaranje acil-anzim intermedijera.

U cPLA2, jedina građevna jedinica koja ima sposobnost da odigra ulogu opće baze je Asp549, stoga što nema drugih postranih lanaca na udaljenosti od 3.5 angstrema od Oγ atoma Ser228. Slika 6 pokazuje predloženi model katalitičkog mehanizma cPLA2. Jednom kada je enzim vezan za membranu, jedna se fosfolipidna molekula veže na aktivno mjesto. Fosfatna jedinica čelne grupe (HG na Slici 6) stabilizirana je uz pomoć Arg200 postranog lanca. Oksanionska pukotina stvorena od kosturnih amidnih grupa Gly197 i Gly198 je također prikazana kao polarizirajući sn-2 ester i kao stabilizirajući faktor tetrahedralnog intermedijera koji se formirao na ploči B. Prateći formiranje enzim-supstrat kompleksa, Asp549 djeluje kao katalitička baza i izdvaja proton iz hidroksilne grupe reaktivnog Ser228, koji napada sn-2 ester i formira acil enzim preko stabiliziranog tetrahedralnog intermedijera. Acil enzim odmah potom biva hidroliziran s molekulom vode (ploča C) da bi se dobio slobodan lizo-fosfolipid, te nakon raspada dvostruke veze arahidonil intermedijera: slobodna arahidonska kiselina (AA na Slici 6; ploče D i E). cPLA2 se ada može odvojiti od površine membrane ili vezati drugi fosfolipidni supstrat i ponoviti ciklus. Tako je cPLA2 treći različiti primjer acilaze koja koristi nukleofilni serin bez cjelokupne katalitičke trijade.

Diskusija

Pored velike asimetrične jedinice (1498 amino kiselina) i fragilnosti cPLA2 kristala, MAD faziranje je bilo uspješno u dobivanju mapa s elektronskom gustoćom visoke kvalitete iz podataka koji su dobiveni i jednog kristala. Ključno za ovaj uspjeh su bile velike Bijvoet i razlike u disperziji, što je uobičajeno za LШ rubnu vrijednost atoma lantanida, popraćeno visokim protokom i stabilnošću valne duljine kod primjene metode Advanced Light Source (Berkeley, CA). Pojavom treće generacije sinhotrona, MAD bi se trebao koristiti rutinski tza rješavanje velikih makromolekularnih struktura.

cPLA2 je od najveće važnosti za biosintezu lipidnih medijatora upale, kao što je demonstrirano korištenjem cPLA2 deficijentnih miševa (Bonventre et al., 1997; Uozumi et al., 1997). Pošto leukotrieni, prostaglandini i PAF igraju značajnu ulogu u patofiziologiji bolesti, imperativ je razumjeti kako je regulirana njihova biositeza. Struktura cPLA2 omogućava novi uvid u podrijetlo selektivnosti arahidonila i regulaciju fosforilacijom. Nadalje, ona identificira i novu ulogu i mehanizam lipaza. Struktura cPLA2 je tek druga struktura u kojoj je vidljiva C2 domena u kontekstu cijelog proteina. Značajne su razlike uočljive između PLCδ1 i cPLA2.

cPLA2 nabor jasno pokazuje da se enzim sastoji iz dvije različite, neovisne domene. Ovaj rezultat nije bio neočekivan u odnosu na ranija istraživanja gdje su CaLB i katalitičke domene bile potpuno funkcionalne kada su se ekpresirale neovisno. Međutim, ono što je bilo neočekivano je oskudnost kontakata i potencijalna fleksibilnost između domena. Iako su C2 domene uobičajeno prisutne u signalnim molekulama, do danas je otkrivena samo kristalna struktura PLCδ1 gdje je uočeno da je C2 domena prisutna u kontekstu katalitičke domene (Essen et al., 1996). U ovom slučaju, ekstenzivni hidrofobni kontakti postoje između gotovo cjelokupne površine jednog lica C2 domene i katalitičke domene. Nasuprot tome, interakcije između katalitičke i CaLB domene cPLA2 su ograničene u dovoljnoj mjeri da su konformacije polipeptida koji veže dva različita monomera asimetrične jedinice, različiti. Ova je opservacija od mehanističke važnosti u tom smislu da optimalna orijentacija CaLB i katalitičke domene nije fiksna, no nasuprot tome može biti regulirana na isti način. Zanimljivo je za primijetiti da iako je regija proteina koji uključuje Ser505, a koji je esencijalan za optimalnu aktivnost u stanicama, poremećena, ovo važno MAP-kinaza mjesto smješteno je blizu regije zgloba.

Detaljna usporedba strukture cPLA2 i klasičnog αβ hidrolaza nabora jasno ukazuje na činjenicu da cPLA2 sadržava novu topologiju. Međutim, kao što je i ranije spomenuto, β ukosnica koja sadržava aktivno mjesto serina je strukturno analogna kao i «nukleofolni lakat» αβ hidrolaznog nabora. Blast istraživanje cPLA2 katalitičke domene pokazuje proširenu regiju homologije između PLB molekula i cPLA2 α,β i γ koja podrazumijeva jedinice od približno 190-232. Ova je homologija od funkcionalnog značaja stoga što sadržava Arg200, kosturne regije koje sadržavaju oksianionsku pukotinu kao i novo-otkriveni GXSXS lipazni uzorak u kome je drugi serin zamijenjen klasičnim glicinom. «Koncentriranost» homologije u kratkoj regiji se također objašnjava strukturom genoma, gdje su ove jedinice kodirane jednim eksonom (koji korespondira jedinicama 186-238).

Umjesto da sadržava katalitičku trijadu Ser, His, Asp/Glu kao što je to slučaj kod αβ hidrolaza, cPLA2 cijepa sn-2 ester uz korištenje para koji se sastoji od Ser228 i Asp549. Karboksilat iz Asp549 je jedina jedinica koja je dovoljno blizu smještena da bi vršila aktivaciju serina za nukleofilni napad. Slični katalitički par se predlaže za reakciju hidrolize amida koja je katalizirana β-laktamazama Klase A (Matagne et al., 1998). U ovom slučaju međutim, glutamatni postrani lanac aktivira serinsku jedinicu preko molekule vode. Iako je veoma komplicirano usporedno ispitati efikasnost parova u usporedbi s trijadama, značajan faktor je energija aktivacije potrebna za postizanje stanja prijenosa ključnog u katalizi. Dakle, stabiliziranje uslijed efikasne oksanionske pukotine može izjednačiti manjak nekleofilnog serina. U ovoj kristalnoj strukturi, kosturna amidna grupa glicina 197 i 198 koja pozicionira dvije jedinice iz kritičnog Arg200, je pogodno smještena da bi djelovala kao oksanionska pukotina. Kostur NH iz Gly229 vjerojatno također može pomagati u stabiliziranju oksanionskog razvijanja u stanje prijenosa i prisustvo tetrahedralnih intermedijera. Podaci o učinkovitosti oksanionske pukotine je u skladu sa NMR istraživanjima, gdje se izgleda arahidoniltrifluorometil keton veže za enzim kao ionizirani hemiketal.

Katalitički serin cPLA2 je prisutan u dubokom lijevku blizu središta katalitičke domene. Pokušaji da se napravi model fosfolipida u aktivnom mjestu, pokazali su da sada poznata konformacija lijevka aktivnog mjesta nije dovoljno velika. Stoga predlažemo da donekle pokretni poklopac, čiji je C-terminus povezan za u potpunosti neuređen ogranak od 23 amino-kiseline, se može pokretati tijekom vezivanja za membranu, omogućavajući tako veći dostupni volumen u blizini vrha lijevka za smještaj supstrata. Kristalne strukture lipaza/kolipaza iz pankreasa, u prisustvu i odsustvu supstrata/detergenta, prikazuju slučaj koji opravdava ovaj model (van Tilbeurgh et al., 1993). U ovom slučaju, dešava se dramatična promjena konformacije u prisustvu micelija ili inhibitora koji omogućava pokretanje strukture poklopca za 29 angstrema da bi se otkrio aktivni nabor i hidrofobna mrlja. Takva velika strukturna promjena uočena je i kod drugih αβ hidrolaza proteina. Ova konformacijska promjena tijekom vezivanja za površinu membrane, korištena je za objašnjavanje procesa interfacijalne aktivacije, u kojem je katalitička aktivnost lipaze veća u supstratu koji je prisutan u miceliju u obliku monomera.

U slučaju cPLA2, lizofosfolipaza je bila korištena radi usporedbe aktivnosti u odnosu na isti susptrat, prisutan u obliku monomera ili kao dio micelija. Takva mjerenja su otkrila da aktivnost cPLA2 raste i do 1500 puta, dok koncentracija 1-palmitoil-2-lizofosfatidilholina raste samo 10 puta. Tako je zaključeno da je cPLA2 mnogo aktivnija u odnosu na supstrat koji je prisutan na površini. Naša struktura sugerira da se promjena konformacije, diktirana pokretom fleksibilnog poklopca, dešava tijekom vezivanja na membranu; ova je opservacija u skladu sa prethodno uočenom interfacijalnom aktivacijom.

Osim pokretanja poklopca koji pokriva aktivno mjesto; i nekoliko je drugih struktura pokazalo da je oksanionska pukotina koja stabilizira stanje prijenosa, u potpunosti formirana samo u prisustvu vezanog supstrata ili inhibitora (Cygler & Scharg, 1997). Kutinaza je izuzetak iz ovog općeg pravila, na način da je oksanionska pukotina u potpunosti formirana u nativnoj strukturi. Važno je za naglasiti da kutinaza ne pokazuje interfacijalnu aktivaciju (Martinez et al., 1992).

Selektivnost cPLA2 za fosfolipide koji sadržavaju arahidonil, je razlikovno svojstvo. Molekule sPLA2 niske molekularne težine ne razlikuju druge različite masne kiseline, dok cPLA2 pokazuje visoku selektivnost za arahidonil i druge masne kiseline sa cis-dvostrukim vezama na 5 i 8 poziciji, u brojnim oblicima eseja (Clark et al., 1995; Gelb aasn-1 i sn-2, gelb hidrazin). Prije određivanja strukture, podrijetlo selektivnosti cPLA2 nije bilo poznato. Pretpostavljalo se da je katalitička mašinerija smještena blizu površine enzima, gdje bi mogla djelovati na sn-2 ester bez ekstrahiranja lipida iz dvostrukog sloja. Ovo bi bilo analogno stanjenoj kinaza domeni PI4 kinaze, gdje se smatra da enzim djeluje na lipidnu čeonu grupu bez ekstrahiranja samih fosfolipida (Rao et al., 1998). U slučaju cPLA2, pretpostavili bismo da je selektivnost povezana s većom izloženošću sn-2 astera, uslijed rjeđeg pakiranja poli-nezasićenih masnih kiselina. Međutim, kao što i vidimo iz strukture, fosfolipid mora vezati približno 8-10 angstrema u dubinu aktivnog mjesta. Tako selektivnost mora biti povezana s interakcijama između arahidonil čestica i enzima. Bilo bi korisno izvršiti mutaciju građevnih jedinica koje su različite između α i γ cPLA2, posebice na aktivnom mjestu i u potpunosti nekonzerviranoj regiji poklopca, kako bi se otkrile razlike u selektivnosti.

Preferirane metode aplikacije i doziranja otkrivenih supstanci, u skladu s izumom

Kako je to već ranije ovdje korišteno, «fosfolipazna enzimska aktivnost» znači pozitivnu aktivnost u eseju za ispitivanje metabolizma fosfolipida (preferabilno jedan od eseja opisanih u primjeru 2 dalje u tekstu, ili opisanih u nekoj od referenci koje se ovdje navode). Supstanca ima «aktivnost inihibiranja fosfolipaza enzima» onda kada inhibira aktivnost fosfolipaze (preferabilno cPLA2) u bilo kojem dostupnom eseju (preferabilno u eseju koji se opisuje nadalje u primjeru 70) za ispitivanje enzimske aktivnosti. U preferiranim slučajevima, supstanca ima (1) IC30 vrijednost manju od oko 25 μM u LysoPC eseju; (2) IC30 vrijednost manju od oko 50 μM u eseju vezikula; i/ili (3) IC30 vrijednost manju od oko 1 μM u PMN eseju.

Supstance u kontekstu ovog izuma i ursolna kiselina su korisne za inhibiranje aktivnosti fosfolipaza enzima (preferabilno cPLA2) i stoga su korisne u «tretiranju» (primjerice, tretiranju, prevenciji ili ublažavanju) inflamatornih ili s upalnim procesima povezanih stanja (primjerice, reumatoidni artritis, psorijaza, astma, inflamatorna bolest goveda i druge bolesti koje su posredovane prostaglandinima, leukotrienima ili PAF) i nekih drugih stanja kao što su osteoporoza, kolitis, mijelogena leukemija, dijabetes, mršavljenje i ateroskleroza.

Ovaj izum obuhvaća obje farmaceutske supstance i terapeutske metode tretmana ili korištenja u kojem se podrazumijevaju supstance iz ovog izuma.

Supstance iz ovog izuma mogu se koristiti u farmaceutskim spojevima u kombinaciji sa farmaceutski prihvatljivim nosačima. Takav spoj može također sadržavati (osim supstance ili supstanci u kontekstu ovog izuma i osim nosača) diluente, punjače, soli, pufere, stabilizatore, otapala i druge materijale koji se uobičajeno koriste u kontekstu struke. Izraz «farmaceutski prihvatljiv» znači netoksični materijal koji ne interferira sa učinkovitošću biološke aktivnosti aktivnih sastojaka. Karakteristike nosača ovisit će o načinu primjene. Farmaceutski spoj u kontekstu izuma može također sadržavati citokine, limfokine ili druge hematopoetske faktore kao što su M-CSF, GM-CSF, IL-1,IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, G-CSF, Meg-CSF, stem stanični faktor i eritropoetin. Farmaceutski spoj može nadalje sadržavati i druge anti-upalne agense. Takvi dodatni faktori i/ili agensi mogu biti uključeni u farmaceutski spoj da bi proizveli sinergijski efekt sa supstancom u kontekstu ovog izuma, ili minimalizirali dodatne efekte sa strane koje može uzrokovati supstanca u kontekstu ovog izuma. I na drugi način, supstance iz ovog izuma mogu biti uključene u formulacije pojedinih citokina, limfokina, drugih hematopoetskih faktora, trombolitika ili anti-trombotskih faktora, ili anti-upalnog agensa koji minimalizira postrane efekte citokina, limfokina, drugih hematopoetskih faktora, trombolitika ili anti-trombotskih faktora, ili anti-upalnog agensa.

Farmaceutski spoj iz ovog izuma može biti u obliku liposoma u kojem su supstance iz ovog izuma kombinirane, kao dodatak drugim farmaceutski prihvatljivim nosačima, s amfipatskim agensima kao što su lipidi koji egzistiraju u agregiranom obliku kao miceliji, netopivi mono-slojevi, tekući kristali ili lamelarni slojevi u vodenoj otopini. Pogodni lipidi za liposomalne formulacije uključuju bez ograničenja, monogliceride digliceride, sulfatide, lizolecitin, fosfolipide, saponin, žućne kiseline i slično. Pripravljanje takvih liposomalnih formulacija je unutar granice uobičajene prakse, kao što je primjerice navedeno u U.S. Patentu Br. 4,235,871; U.S. Patentu Br. 4,501,728; U.S: Patentu Br. 4,837,028; i U.S. Patentu Br. 4,737,323 od kojih su svi inkorporirani u ovaj izum u obliku reference.

Kao što je već ovdje ranije korišteno na isti način, izraz «terapeutski efikasna količina» znači ukupnu količinu svake aktivne komponente farmaceutskog spoja ili metodu koja je dovoljna da bi se pokazalo značajno poboljšanje za pacijenta; kao što je primjerice tretman, izlječenje, prevencija ili ublažavanje upalnog odgovorili stanja, ili povećanje razine tretmana, liječenja, prevencije ili ublažavanja takvih stanja. Kada se primjenjuje na zasebni aktivni sastojak, aplicira samostalno, izraz se odnosi na sam taj sastojak. Kada se aplicira u kombinaciji, izraz se odnosi na kombinirane količine aktivnih sastojaka koje rezultiraju terapeutskim efektom, bez obzira na to da li su aplicirane u kombinaciji, serijski ili simultano.

U prakticiranju metode tretmana ili korištenja u kontekstu ovog izuma, terapeutski efkasna količina supstance iz ovog izuma biva aplicirana u organizam sisavca koji pokazuje stanje koje se treba tretirati. Supstance iz ovog izuma mogu biti aplicirane u skladu s metodom izuma, zasebno ili u kombinaciji s drugim terapijama kao što su primjerice tretmani koji koriste druge anti-upalne agense, citokine, limfokine ili druge hematopoetske faktore. U slučaju paralelne aplikacije s jednim ili više drugih anti-upalnih agenasa, citokina, limfokina ili drugih hematopoetskih faktora, supstance iz ovog izuma mogu biti aplicirane ili simultano s drugim anti-upalnim agensima, citokinima, limfokinima, drugim hematopoetskim faktorima, tromboliticima ili anti-trombotskim faktorima; ili pak zasebno. Ukoliko su aplicirane zasebno, liječnik će odlučiti o pogodnom obliku aplikacije supstance iz ovog izuma u kombinaciji s drugim anti-uplanim agensima, citokinima, limfokinima, drugim hematopoetskim faktorima, tromboliticima ili anti-trombotskim faktorima.

Aplikacija supstanci iz ovog izuma koje su korištene u farmaceutskim spojevima ili u slučaju prakticiranja metode iz ovog izuma, može biti izvedena na mnogo konvencionalnih načina kao što je oralna ingestija, inhalacija, kutano, subkutano, ili intravensko injektiranje.

Kada terapeutski efikasna količina supstance iz ovog izuma biva aplicirana oralnim putem, supstance iz ovog izuma pojavit će se u obliku tableta, kapsula, praška, otopina ili eliksira. Kada se aplikacija radi u obliku tablete, farmaceutski spoj iz ovog izuma može dodatno sadržavati kruti nosač kao što je želatina ili adjuvans. Tableta, kapsula i prašak sadržavaju od oko 5 do 95% supstance iz ovog izuma, a u najboljem slučaju od oko 25 do 90% supstance iz ovog izuma. Kada se aplikacija vrši u tekućem obliku, može se dodati tekući nosač kao što je voda, petrolej, ulja životinjskog ili biljnog podrijetla kao što su ulje kikirikija, mineralno ulje, ulje soje, ulje sezama, sintetska ulja. Tekući oblik farmaceutskog spoja može nadalje sadržavati fiziološku slanu otopinu, dekstrozu ili druge saharidne otopine, ili pak glikole kao što su etilen glikol, propilen glikol ili polietilen glikol. Kod primjene u tekućem obliku, farmaceutski spoj sadržava od oko 0.5 do 90% težinskog udjela supstance iz ovog izuma, a u najboljem slučaju od oko 1 do 50% supstance iz ovog izuma.

Kada je terapeutski efikasna količina supstance iz ovog izuma primijenjena intravenskom, kutanom ili subkutanom injekcijom , supstanca iz ovog izuma će biti prisutna u obliku parenteralno prihvatljive vodene otopine, bez udjela pirogena. Pripravljanje takve parenteralno prihvatljive otopine proteina odgovarajućeg pH, odgovarajućeg izotoniteta, stabilnosti i slično je u okvirima strukovnog znanja. Preferirani farmaceutski spoj za intravensku, kutanu, ili subkutanu injekciju bi trebao sadržavati i pored supstanci iz ovog izuma, izotonični nosač kao što je injekcija natrij klorida, Ringer-ova injekcija, dekstrozna injekcija, dekstrozna i natrij klorid injekcija, laktidna Ringer-ova injekcija ili pak neki drugi nosač poznat u kontekstu struke. Farmaceutski spoj iz ovog izuma može također sadržavati stabilizatore, prezervative, pufere, antioksidanse ili druge aditive poznate u kontekstu struke.

Količina supstanci iz ovog izuma u farmaceutskom spoju iz ovog izuma će ovisiti o prirodi i ozbiljnosti stanja koje se tretira, te o prirodi prethodnog tretmana kroz kojeg je pacijent prošao. Ultimativno, liječnik će odlučiti o količini supstance iz ovog izuma pomoću koje će tretirati svakog pojedinog pacijenta. Na početku će dotični liječnik aplicirati niske doze supstance iz ovog izuma i promatrati odgovor pacijenta. Veće doze supstance iz ovog izuma se mogu aplicirati sve dok se ne postigne optimalni terapeutski efekt za pacijenta. Na toj se točki doziranje više ne povećava. Razmišlja se da različiti farmaceutski spojevi korišteni u prakticiranju metode iz ovog izuma bi trebali sadržavati oko 0.1 μg do oko 100 mg (preferabilno oko 100 μg do oko 50 mg, a u boljem slučaju oko 100 μg do oko 5 mg) supstance iz ovog izuma, po kg tjelesne težine.

Trajanje intravenske terapije uz korištenje farmaceutskog spoja iz ovog izuma će varirati u ovisnosti o stupnju ozbiljnosti bolesti koja se tretira, te stanju i potencijalnom idiosinkratičkom odgovoru svakog pojedinog pacijenta. Razmišlja se će da trajanje svake aplikacije supstance iz ovog izuma kretati unutar raspona od 12 do 14 sati kontinuirane intravenske aplikacije. Liječnik će odlučiti o odgovarajućem vremenu trajanja intravenske terapije uz korištenje farmaceutskog spoja iz ovog izuma.

Primjer 1

Proizvodnja proteina, kristalizacija i sakupljanje podataka

Humana molekula cPLA2 (jedinice 1-749) je klonirana u vektor pMT2-EMC-cPLA2, te potom prenesena u CHO stanice. Dobivena stanična linija E5-CHO je kultivirana na α mediju (Gibco) sadržavajući 10% (v/v) dijaliziranog fetalnog telećeg seruma i 10 μM metotreksata kao što je opisano u Lin et al., (1992). Palet asa stanicama je na uobičajen način lizirana u puferu pH 9.0 i cPLA2 iz supernatanta je potom precipitirala sa (NH4)2SO4. Višestrukim koracima koji podrazumijevaju afinitetnu i kromatografiju koja isključuje po veličini čestice, dobiveni su uzorci proteina koji su bili pogodni za eksperimente kristalizacije. Uobičajen produkt iz 100 g palete bio bi 15-25 mg čiste cPLA2.

Kristali cPLA2 su dobiveni uz pomoć hlapljive difuzije na 18°C uz korištenje PEG 1000 kao precipitanta, uz korištenje 12 mg/ml proteina. Uobičajeno je da se kristali u obliku palete pojave tijekom noći i nastave rasti do maksimalne veličine od 0.6 mm x 0.5 mm x 0.1 mm tijekom jednog tjedna. Nativni kristali i kristali koji su usisali teške atome su krioprotekcionirani prijenosom u rastuće količine PEG 400 i DMSO. Kristali modificirani teškim atomima su pripravljeni tako da nativni kristali usisavaju tijekom noći u krio-otopini sa CaCl2, koji biva zamijenjen sa 250 μM GdCl2 ili TbCl2. Krioprotektirani kristali se hlade u struji tekućeg dušika pri 100 K prije prikupljanja podataka.

Podaci o difrakciji nativnih, Gd- i Tb- sadržavajućih cPLA2 kristala se sakupljajuna liniji 5.0.2 metodom Advances Light Source uz korištenje Quantum 4 CCD detektora (Area Detector System). Poradi osjetljivosti kristala, orva slika u kontekstu svake grupe podataka se analizira sa SRATEGY (R. Ravelli) da bi se izračunala najmanja količina sakupljenih podataka koja je potrebna za kompletni set podataka. Nakon određivanja optimalne početne točke, podaci se sakupljaju kroz zamah od 90°, nakon čega se kristali rotiraju u poziciju 180° od početne točke, dok se drugi zamah od 90° skuplja s obzirom na maksimalnu Bijvoet parnu akumulaciju. Kristali započinju pokazivati osjetljivost na radijacijsko zračenje nakon aproksimativno 100° sakupljanja podataka, čime postaje neophodno translatirati ih duž osi rotacije između promjena valne duljine. Ova se metodologija pokazala kao uspješna u tome da podaci sakupljeni na tri različite valne dužine pokazuju sličnu statistiku. Vi su podaci sakupljeni na 100K i procesirani sa DENZO/SCALEPACK (Otwinowski, 1993).

Mjesta za teške atome – Oba Tb mjesta su otkrivena vizualnim pregledavanjem anomalijskih Patterson mapa uz korištenje difrakcijskih skupljenih podataka na vrhu valne duljine Tb LШ ruba (pogledaj Tablicu I), što je potvrdilo rezultate iz prijašnje korištene niže rezolucije Tb i Gb seta podataka, koji su sakupljeni na in-house Raxis IV detektoru. Finoća parametra teških metala i faziranje je postignuto sa SHARP (de la Fortelle & Bricogne, 1997). Modifikacija gustoće je izvedena u SOLOMON (CCP4) i primijenjena u SHARP. Visoko kvalitetna eksperimentalna mapa elektronske gustoće 3.2 angstrema dopušta pozicioniranje cjelokupne CaLB domene kao i inicijalno prikazivanje i određivanje sekvenci katalitičke domene (QUANTA); ovaj postupak je omogućio izračunavanje maske koja okružuje proteinsku regiju, a koja je uključena u daljnje izračune. Ovo je uključivalo procjenu slaganja histograma (Zhang i Main, 1990), prosječni prikaz dvostruke ne-kristalografske simetrije, te faznu ekstenziju od 3.2 do 2.5 angstrema uz korištenje podataka nativne difrakcije u DM (Cowtan et al., 1996). Ciklusi fazne kombinacije i razdvajanja su izvedeni sa REFMAC (Murshudov et al., 1997), te je dobivena mapa u kojoj je većina modela mogla biti identificirana, podrazumijevajući i središnje jedinice fleksibilnog poklopca.

Razdvajanje – Ciklusi ponovnog građenja kao i pozicijski i termalni parametri za razdvajanje u XPLO (Brunger, 1992b) su korišteni za unaprjeđivanje modela, koji je podvrgnut simuliranom razdvajanju uz zagrijavanje (12 – 2.5 angstrema) nakon što je Rfree vrijednost spuštena ispod 32% (Brunger et al., 1992a). Slijedeće faze izgradnje modela izvedene su uz pomoć ispuštenih mapa dobivenih maksimalnim razdvajanjem koje se može primijeniti na BUSTER (Bricogne, 1993). Razdvajanje također uključuje uniformnu korekciju otapala (Bsol=23.8 angstrem2; ksol=0.305 e/angstrem3) i primjenu ne-kristalografskih simetrijskih ograničenja. Svi difrakcijski podaci sa F>2.0 su korišteni kroz razdvajanje izuzev za 10% nasumce odabranih test uzoraka koji su korišteni za izračunavanje Rfree vrijednosti. Fo-Fc mape su korištene za lociranje molekula vode, koje su bile smještene na mjestima koja pokazuju vrijednost gustoća >3.0 σ i pokazuju značajne protein/otapalo hidrogen-vezujuće udaljenosti bez steričkog konflikta. Konačni model sadržava 1285 jedinica (molekula A: 9-433, 456-500, 537-727) i 40 molekula vode i pokazuje dobru stereokemiju, s prosječnom dužinom veza od 0.010 angstrema i devijacijom veznih zglobova od idealnog geometrijskog slučaja od 1.38°. Ukupna slobodna R-vrijednost je 29.7% i R vrijednost je 24.3% uz korištenje podataka o difrakciji između 12 i 2.5 angstrema (Tablica I).

[UMETNI TABLICU 1]

Rsym = Σ |Ih-<Ih>|/ ΣIh gdje <Ih> je prosječni intenzitet nad ekvivalentima simetrije.

Friedel parni separat.

Fazna snaga = Σ|FH|/Σ||FPHobs|-|FPHCalC||.

R = Σ||Fo|-|FC|/Σ|Fo|, gdje je Rfree vrijednost izračunata za nasumce odabranih 10% refleksije i R faktor je izračunat za preostalih 90% refleksije (F>2.0) korištene za strukturno razdvajanje.

Koordinate će biti deponirane u Brookhaven Protein Databank.

Primjer 2

Eseji aktivnosti

Vezikularni esej

1-palmitoil-2-[14C] arahidonil fosfotidilholin (58 mCi/mmol) (finalna koncentracija 6 μM) i 1,2-dioleiolglicerol (finalna koncentracija 3 μM) se miješaju i suše pod strujom dušika. U lipide se dodaje 50 mM Hepes-a, pH 7.5 (dvostruka finalna koncentracija lipida) i suspenzija potom biva sonicirana 3 minute na 4°C. U suspenziju se dodaje 50 mM Hepes-a pH 7.5, 300 mM NaCl, 2 mM DTT, 2 mM CaCl2 i 2 mg/ml goveđeg serum albumina (BSA)(Sigma A7511)(1.2 x finalna koncentracija lipida). Uobičajeni esej se sastojao od lipidne smjese (85 μl) u koju se konsekutivno dodaje inhibitor (5 μl u DMSO) i cPLA2, 10 ng za automatizirani sustav ili 1 ng za ručno izveden esej, u 10 μl BSA pufera. Ovaj je esej izveden prateći protokol za ručno izvođenje ili pak za automatizirano izvođenje, koji se opisuju u nastavku.

Esej topivi supstrat (LysoPC)

1-[14C]-palmitoil-2-hidroksifosfotidil-holin (57 mCi / mmol)(finalna koncentracija 4.4 μM) se suši pod strujom dušika. Lipidi se resuspendiraju sa 80 mM Hepes-a pH 7.5, 1 mM EDTA (1.2 finalna koncentracija). Uobičajeno se esej sastoji od lipidne suspenzije (85 μl) u koju se konsekutivno dodaje inhibitor (5 μl u DMSO) i cPLA2, 200 ng u 80 mM Hepes-a pH 7.5, 2 mM DTT i 1 M EDTA. Ovaj je esej izveden prateći protokol za ručno izvođenje ili pak za automatizirano izvođenje, koji se opisuju u nastavku.

(c) Automatizirani esej

Lipidna suspenzija i inhibitor se prethodno inkubiraju 7 minuta na 37°C. Dodaje se enzim i inkubacija se nastavlja daljnjih 30 minuta. Reakcija se potom zaustavlja dodavanjem dekan:izopropanol:trifluoroctena kiselina (192:8:1 W/v, 150 μl). Porcija sloja u kojem je reakcija tako zaustavljena (50 μl se provodi kroz Rainin Spheric-5-silika kolonu (5 μ, 30 x 2.1 mm) uz korištenje heptan:metanol:TFA kao eluenta (97:3:0.1 v/v). Razina [14C]-arahidonske kiseline se analizira uz pomoć in-line Radiomatic Flo-One/Beta brojača (Packard).

Ručni esej

Smjesa lipida, inhibitora i enzima se inkubira na 37°C tijekom 30 minuta. Reakcija se potom zaustavlja dodavanjem heptan:izopropanol:0.5 M sumporna kiselina (105:20:1 v/v, 200 μl). Polovica sloja se aplicira u slika gel kolonu (Whatman SIL, 1 ml) u vakuumu, smještenu iznad scintilacijske posudice. Slobodna [14C]-arahidonska kiselina se eluira dodavanjem etil etera (1 ml). Razina radioaktivnosti se mjeri tekućim scintilacijskim brojačem.

PMN esej

PMN molekule su izolirane uz korištenje Ficoll-Hypaque u skladu s uputama proizvođača. Crvena krvna zrnca koja su kontaminirala PMN se uklanjaju metodom hipotoničke lize i PMN paleta se ispire jedan put, te potom resuspendira u Hank-ovoj puferiranoj slanoj otopini pri koncentraciji od 2 x 106 stanica/ml. Stanice bivaju prethodno inkubirane s inhibitorima tijekom 15 minuta na 37°C i potom stimulirane sa 2 uM A23187. Kada se promatra LTB4 produkcija kao mjera cPLA2 inhibicije, reakcija se zaustavlja s jednakim volumenom ledeno hladne fosftne puferirane slane otopine. Stanice se uklanjaju centrifugiranjem i LTB4 koji je prisutan u staničnom supernatantu se mjeri uz korištenje LTB4 scintilacijskog eseja (Amersham) u skladu s uputama proizvođača. U esejima čiji se rezultati navode u Tablicama iznad,navedene su vrijednosti za LTB4. Kada se prati produkcija arahidonske kiseline, reakcija se zaustavlja s metanolom koji sadržava D8-arahidonsku kiselinu kao internu referencu. Lipidi bivaju ekstrahirani metodom koja je opisana u Bligh et al.,((1959) Can.J.Biochem.Physiol., 37,911-917) i masna kiselina se konvertira u pentafluorobenzil ester i analizira sa GC-MS na način koji je sličan onome koji se navodi u Ramesha i Taylor ((1991) Anal.Biochem. 192, 173-180).

Reference

Altschul, S.F., Madden, T.L., Schaffer, A.A., Zhang, J., Zhang, Z., Miller, W., i Lipman, D.J. (1997) BLAST i PSI-BLAST s gapovima: nova generacija programa za pretraživanje proteinske baze podataka. Nucleic Acids Res. 25, 3389-3402.

Bacon, D.J. i Anderson, W.F. (1988). Brzi algoritam za prikazivanje prostorno ispunjavajućih slika molekula. J.Mol.Graph. 6,219-220.

Balboa, M.A., Balsinde, J., Jones, S.S. i Dennis, E.A. (1997). Identitet između o Ca2+ neovisnih fosfolipaza A2 enzima iz P388D1 makrofaga i ovarijskih stanica kineskog hrčka. J. Biol. Chem. 272, 8576-8580.

Bonventre, J.V., Huang, Z., Reza Taheri, M., O'Leary, E., Li, E., Moskowitz, M.A. i Sapirstein, A. (1997). Reducirani fertilitet i postishemična povreda mozga kod miševa koji su deficijentni u citosolnoj količini fosfolipaza A2. Nature 390, 622-625.

Borsch-Haubold, A.G., Bartoli, F., Asselin, J., Dudler, T., Kramer, R.M., Apitz-Castro, R., Watson, S.P. i Gelb, M.H. (1998). Identifikacija fosforilacijskih mjesta citosolne fosfolipaze A2 u agonistom stimuliranim humanim trombocitima i HeLa stanicama. J.Biol.Chem. 273, 4449-4458.

Bricogne, G. (1993). Neposredna fazna determinacija entropijskom maksimizacijom i sličnim rangiranjem: izvješće o statusu i perspektivama. Acta Cryst.D49, 37-60.

Brunger, A.T., Krukowski, A. i Ericson J. (1990) Protokoli sporog hlađenja za kristalografsko razdvajanje sa simuliranim zagrijavanjem. Acta Cryst. A46, 585-593.

Brunger, A.T. (1992a). Slobodna R vrijednost: nova statistička kvantitativna vrijednost za ispitivanje vjerodostojnosti kristalne strukture. Nature 355, 472-474.

Brunger, A.T. (1992b). X-PLOR Verzija 3.1. Sustav za kristalografiju sa x-zrakama i NMR (New Haven: Yale University Press).

Clark, J.D., Lin, L.-L., Kriz, R.W., Ramesha, C.S., Sultzman, L.A., Lin, A.Y., Milona, N. i Knopf, J.L. (1991). Nova arahidonska kiselina-selektivna citosolna PLA2 koja sadržava Ca2+-ovisne translokacijske domene s homologijom prema PKC i GAP. Cell 65, 1043-1051.

Clark, J.D., Schievella, A.R., Nalefski, E.A. i Lin, L.-L. (1995). Citosolna fosfolipaza A2. J.Lipid Mediators Cell Signaling 12, 83-117.

Cleland, W.W. i Kreevoy, M.M. (1994). Nisko-barijerne vodikove veze i enzimska kataliza. Science 264, 1887-1890.

Kolaborativni računalni projekt broj 4 (1994). Acta Crystallogr. S760-763.

Cowtan, K.D. i Main, P. (1996). Fazna kombinacija i unakrsna validacija u ponavljanim modifikacijama izračuna gustoće. Acta Crystallogr. D42, 43-48.

Cygler, M. i Schrag, J.D. (1997). Struktura kao osnova za razumijevanje interfacijalnih svojstava lipaza. Meth. Enzymol. 284, 3-27.

Dennis, E.A. (1997). Rastuća obitelj fosfolipaza A2 signalnih transdukcijskih enzima. Trends Biochem. Sci. 22, 1-2.

De Carvahlo, M.G.S., McCormack, A.L., Olson, E., Ghomaschi, F., Gelb, M., Yates III, J.R. i Leslie, C.C. (1996). Identifikacija mjesta fosforilacije humane 85kda citosolne fosfolipaze A2 koja se ekspresira u stanicama kukaca i prisutna je u humanim monocitima. J.Biol.Chem. 271, 1-11.

De La Fortelle, E. i Bricogne, G. (1997). Maksimalno razdvajanje uz korištenje parametra teških atoma za višestruko izomorfno razmjenjivanje mjesta i metode anomalijske difrakcije kod višestrukih valnih duljina. Methpds Enzymol. 276, 494-523.

Derewenda, Z.S. i Derewenda, U. (1991). Odnosi kod serin hidrolaza: dokaz uobičajenog strukturnog motiva u triacilglicerid lipazama i esterazama. Biochem. Cell. Biol. 69, 842-851.

Duggleby, H.J., Tolley, S.P., Hill, C.P., Dodson, E.J., Dodson, G. i Moody, P.C.E. (1995). Penicilin acilaza ima jedno amino-kiselinsko katalitičko središte. Nature 373, 264-268.

Essen, L.O., Perisic, O., Cheung, R., Katan, M., & Williams, R.L. (1996). Kristalna struktura fosfoinozitid-specifične fosfolipaze C kod sisavaca. Nature 380, 595-602.

Glover, S., de Carvalho, M., Bayburt, T., Jonas, M., Chi, E., Leslie, E. i Gelb, M. (1995). Translokacija 85-kDa fosfolipaze A2 iz citosola u nuklearni omotač u stanicama bazofilne leukemije kod štakora, koje su stimulirane sa kalcij jonoforom ili IgE/antigenom. J.Biol. Chem. 270, 15359-15367.

Grobler, J.A., Essen, L.-O., Williams, R.L. i Hurley, J.H. (1996). C2 domena konformacijske promjene u fosfolipazi C. Nat. Struct.Biol. 3, 788-795.

Hanel, A.M. i Gelb, M.H. (1993). Procesivna interfacijalna kataliza sa 85-kDa fosfolipaza A2 enzimima iz sisavaca na vezikule koje sadržavaju produkt: aplikacija na determiniranje preferencija supstrata. Biochemistry 32, 5949-5958.

Hanel, A.M. i Gelb, M.H. (1995). Višestruke enzimske aktivnosti humane citosolne 85-kDa fosfolipaze A2: hidrolitičke reakcije i transfer acila na glicerol. Biochemistry 34, 7807-7818.

Hattori, M., Adachi, H., Tsujimoto, M., Arai, H. i Inoue, K. (1994). Katalitička podjedinica faktora acetilhidrolaze iz goveđeg mozga koji aktivira trombocite, koja predstavlja novi tip serin esteraze. J.Biol.Chem. 269, 23150-23155.

Hattori, M., Adachi, H., Aoki, J., Tsujimoto, M., Arai, H. i Inoue, K. (1995). Kloniranje i ekspresija cDNA koja kodira za beta-podjedinicu (30-kDa podjedinica) faktora acetilhidrolaze iz goveđeg mozga koji aktivira trombocite. J.Biol.Chem. 270, 31345-31352.

Hendrickson, W.A. (1991). Determinacija makromolekularnih struktura dobivenih anomalijskom difrakcijom sinhotronske radijacije. Science 254, 51-58.

Hixon, M.S., Ball, A. i Gelb, M.H. (1998). O kalciju-ovisno i -neovisno interfacijalno vezivanje i kataliza citosolne grupe IV fosfolipaze A2. Biochemistry 37, 8516-8526.

Huang, Z., Payette, P., Abdullah, K., Cromlish, W.A. i Kennedy, B.P. (1996). Funkcionalna identifikacija nukleofilnog aktivnog mjesta humane 85-kDa citosolne fosfolipaze A2. Biochemistry 35, 3712-3721.

Kramer, R.M., Roberts, E.F., Manetta, J. I Putnam, J.E. (1991). Na Ca2+-senzitivna citosolna fosfolipaza A2 je 100-kDa protein u humanim monoblastnim U937 stanicama. J.Biol.Chem. 266, 5268-u humanim monoblastnim U937 stanicama. J.Biol.Chem. 266, 5268-5272.

Kraulis, P.J. (1991). MOLSCRIPT: program za produkciju detaljnih i shematskih prikaza proteinskih struktura. J.Apply.Cryst. 24, 946-950.

Leslie, C.C. i Channon, J.Y. (1990). Anionski fosfolipidi stimuliraju arahidonoil-hidrolizirajuću fosfilipazu A2 iz makrofaga i reduciraju zahtjev za kalcijem u kontekstu aktivnosti. Biochem.Biophys.Acta 1045, 261-270.

Leslie, C.C. (1997). Svojstva i regulacija citosolne fosfolipaze A2. J.Biol.Chem. 272, 16709-16712.

Lin, L.-L., Lin, A.Y. i DeWitt, D.L. (1992a). Il-1 inducira akumulaciju cPLA2 i otpuštanje PGE2 u humanim fibroblastima. J.Biol.Chem. 267, 23451-23454.

Lin, L.-L., Lin, A.Y. i Knopf, J.L. (1992b). Citosolna fosfolipaza A2 je udvostručena do hormonski reguliranog otpuštanja arahidonske kiseline. Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89, 6147-6151.

Lin, L.-L., Wartmann, M., Lin, A.Y. i Knopf, J.L., Seth A. i Davis, R.J. (1993). CPLA2 je fosforilirana i aktivirana sa MAP kinazama. Cell 72, 269-278.

Matagne, A., Lamotte-Brasseur, J. I Frere, J.-M. (1998). Katalitička svojstva laktamaza klase A: učinkovitost i raznolikost. Biochem. J. 330, 581-598.

Mosior, M., Six, D.A. i Dennis, E.A. (1998). Citosolna fosfolipaza A2 grupe IV se veže visokim afinitetom i specifičnošću za fosfatidilinozitol 4,5-biofosfat što rezultira dramatičnim porastom aktivnosti. J.Biol.Chem. 273, 2184-2191.

Murshudov, G.N., Vagin, A.A. i Dodson, E.J. (1997). Acta Crystallogr.Sect.D. 53, 240-255.

Nalefski, E.A., Sultzman, L.A., Martin, D.M., Kriz, R.W., Towler, P.S., Knopf, J.L. i Clark, J.D. (1994). Prikaz dvije funkcionalno različite domene citosolne fosfolipaze A2, regulatorne, o Ca2+ ovisne domene za vezivanje lipida i o Ca2+ neovisne katalitičke domene. J.Biol.Chem. 269, 18239-18249.

Nalefski, E.A. i Falke, J.J. (1996). Kalcij-vezujući motiv C2 domene: strukturna i funkcionalna raznolikost. Protein Sci. 12, 2375-2390.

Nalefski, E.A., McDonagh, T., Somers, W., Seehra, J., Falke, J.J. i Clark, J.D. (1998). Neovisno nabiranje i specifičnost liganda C2 kalcij-ovisne domene koja veže lipide citosolne fosfolipaze A2. J.Biol.Chem. 273, 1365-1372.

Nalefski, E.A. i Falke, J.J. (1998). Lokacija za skraćivanje membrane na Ca2+-aktiviranoj C2 domeni citosolne fosfolipaze A2. Biochemistry 37, 17642-17650.

Nicholls, A. (1992). GRASP: Grafička prezentacija i analiza površinskih svojstava (Columbia University, New York).

O'Byrne, P.M. (1997). Leukotrieni u patogenezi astme. Chest 111, 27S-34S.

Otwinowski, Z. (1993). Sakupljanje i procesiranje podataka. L. Sawyer, N. Isaacs, i S.W. Bailey, eds. (Daresbury, U.K.: Science and Engineering Council), pp. 56-62.

Perisic, O., Fong, S., Lynch, D.E., Bycroft, M., & Williams, R.L. (1998). Kristalna struktura kalcij-fosfolipid vezujuće domene iz citosolne fosfolipaze A2. J.Biol.Chem. 273, 1596-1604.

Pickard, R.T., Chiou, X.G., Strifler, B.A., DeFelippis, M.R., Hyslop, P.A., Tebbe, A.L., Yee, Y.K., Reynolds, L.J., Dennis, E.A., Kramer, R.M., & Sharp, J.D. (1996). Identifikacija esencijalnih građevnih jedinica zakatalitičku funkciju 85-kDa citosolne fosfolipaze A2. J.Biol.Chem. 271, 19225-19231.

Qiu, Z.-H., Gijon, M.A., de Carvalho, M.S., Spencer, D.M. i Leslie, C.C. (1998). Uloga kalcija i fosforilacije citosolne fosfolipaze A2 u reguliranju otpuštanja arahidonske kiseline u makrofagima. J.Biol.Chem. 273, 8203-8211.

Rao, V.D., Misra, S., Boronekov, I.V., Anderson, R.A. i Hurley, J.H. (1998). Struktura fosfatidilinozitol fosfat kinaze tipa IIbeta: protein kinaza nabor izravnat za interfacijalnu fosforilaciju. Cell 94, 829-839.

Reynolds, L.J., Hughes, L.L., Louis, A.I., Kramer, R.M. i Dennis, E.A. (1993). Efekti metalnih iona i soli na aktivnost fosfolipaze A2, lizofosfolipaze i transacilaze humane citosolne fosfolipaze A2. Biochim.Biophys.Acta 1167, 272-280.

Schievella, A.R., Regier, M.K., Smith, W.L. i Lin, L.-L. (1995). Kalcijem posredovana translokacija citosolne fosfolipaze A2 u nuklearni omotač i endoplazmatski retikulum. J.Biol.Chem. 270, 30749-30754.

Schrag, J.D. i Cyger, M. (1997). Nabiranje lipaza i hidrolaza. Meth. Enzymol. 284, 85-107.

Scott, D.L., White, S.P., Zbyszed, O., Yan, W., Gelb, M.H. i Sigler, P.B. (1990). Interfacijalna kataliza: meanizam fosfolipaze A2. Science 250, 1541-1546.

Sharp, J.D., White, D.L., Chiou, X.G., Goodson, T., Gamboa, G.C., McClure, D., Burgett, S., Hoskins, J., Skatrud, P.L., Sportsman, J.R., Becker, G.W., Kang, L.H., Roberts, E.F. i Kramer, R.M. (1991). Molekularno kloniranje i ekspresija humane Ca2+-senzitivne citosolne fosfolipaze A2. J.Biol.Chem. 266, 14850-14853.

Sharp, J.D., Pickard, R.T., Chiou, X.G., Manetta, J.V., Kovacevic, S., Miller, J.R., Varshavsky, A.D., Roberts, E.F., Strifler, B.A., Brems, D.N. et al. (1994). Serin 228 je esencijalan za katalitičke aktivnosti 85-kDA citosolne fosfolipaze A2. J.Biol.Chem. 269, 23250-23254.

Simon, L.S., Lanza, F.L., Lipsky, P.E., Hubbard, R.C., Talwalker, S., Schwartz, B.D., Isakson, P.C. i Geis, G.S. (1998). Preliminarna studija sigurnosti i učinkovitosti SC-58635, novog inihibitora ciklooksigenaze 2: učinkovitost i sigurnostu dva placebo kontrolirana slučaja osteoartritisa i reumatoidnog artritisa i studije efekata na gastrointestinalnom planu i na trombocitima. Arthritis Rheum. 41, 1591-1602.

Tang, J., Kriz, R.W., Wolfman, N., Shaffer, M., Seehra, J. I Jones S.S. (1997). Nova citosolna o kalciju neovisna fosfolipaza A2 koja sadržava osam anakrinih motiva. J.Biol.Chem. 272, 8567-8575.

Tjoelker, L.W., Wilder, C., Eberhardt, C., Stafforini, D.M., Dietsch, G., Schimpf, B., Hooper, S., Le Trong, H., Cousens, L.S., Zimmerman, G.A. et al (1995). Anti-upalna svojstva faktora acetilhidrolaze za aktiviranje trombocita. Nature 374, 549-553.

Trimble, L.A., Street, I.P., Perrier, H., Tremblay, N.M., Weech, P.K. i Bernstein, M.A. (1993). NMS strukturne studije kompleksa koji se sastoji od inhibitora trifluormetil ketona i 85-kDa humane fosfolipaze A2. Biochemistry 32, 12560-12565.

Underwood, K.W., Song, C., Kriz, R.W., Chang, X.J., Knopf, J.L. & Lin, L.-L. (1998). Nova kalcij-neovisna fosfolipaza A2, koja sadržava homologiju sa cPLA2. J.Biol.Chem. 273, 21926-21932.

Uozumi, N., Kume, K., Nagase, T., Nakatani, N., Ishii, S., Tashiro, F., Komagata, Y., Maki, K., Ikuta, K., Ouchi, Y., Miyazaki, J-i., & Shimizu, T. (1997). Uloga citosolne fosfolipaze A2 u alergijskom odgovoru i kod rađanja. Nature 390, 618-622.

Venable, M.E., Olson, S.C., Nieto, M.L. i Wykle, R.L. (1993). Enzimska ispitivanja lizo faktora acilacije koji aktivira trombocite u humanim neutrofolima i mijenja se tijekom stimulacije. J.Biol.Chem. 268, 7965-7975.

Xu, G.-Y., McDonagh, T., Yu, H.-A., Nalefski, E., Clark, J.D., & Cumming, D.A. (1998). Otkriće strukture i interakcija membrane C2 domene citosolne fosfolipaze A2. J.Mol.Biol. 280, 485-500.

Sve reference ovdje citirane inkorporirane su u obliku reference u cjelini ili djelomično, ako je tako ranije navedeno.

Ono što se zahtjeva je:

Claims (29)

1. Kristalna cPLA2.

2. Kristalna cPLA2 iz zahtjeva 1 naznačena time da se radi o humanoj cPLA2.

3. Kristalna cPLA2 iz zahtjeva 1 naznačena time da je cPLA2 iz stanica koje nisu od sisavaca.

4. Kristalna cPLA2 iz zahtjeva 1 naznačena time da se radi o rekombinantnoj cPLA2.

5. Kristalna cPLA2 iz zahtjeva 1 naznačena time da se radi o cPLA2 koja podrazumijeva zrelu sekvencu cPLA2 koja se normalno pojavljuje u prirodi.

6. Kristalna kompozicija naznačena time da se radi o cPLA2 vezanoj s drugim kemijskim vrstama.

7. Kompozicija iz zahtjeva 6 naznačena time da su spomenute kemijske vrste odabrane iz grupe koja se sastoji od potencijalnog inhibitora aktivnosti cPLA2 i potencijalnog inhibitora vezivanja cPLA2.

8. Model strukture cPLA2 naznačen time da podrazumijeva set podataka o strukturi cPLA2.

9. Model iz zahtjeva 8 naznačen time da je rečeni set podataka determiniran kristalografskom analizom cPLA2.

10. Model iz zahtjeva 8 naznačen time da je rečeni set podataka determiniran NMR analizom molekule cPLA2.

11. Model iz zahtjeva 8 naznačen time da rečeni set podataka predstavlja cijelu strukturu cPLA2.

12. Model iz zahtjeva 8 naznačen time da rečeni set podataka predstavlja dio strukture cPLA2.

13. Model iz zahtjeva 12 naznačen time da je rečeni dio strukture aktivno mjesto cPLA2.

14. Model iz zahtjeva 12 naznačen time da je rečeni dio strukture CaLB domena cPLA2.

15. Računalni sustav naznačen time da podrazumijeva hardware i model iz zahtjeva 8.

16. Metoda identifikacije vrsta naznačena time da predstavlja agonist ili antagonist aktivnosti cPLA2 ili pak vezivanja molekule, a podrazumijeva: (a) omogućavanje modela iz zahtjeva 8, (b) proučavanje interakcije odabranih vrsta s takvim modelom, i (c) odabiranje vrsta koje su predodređene da igraju ulogu rečenog agonista ili antagonista.

17. Vrste naznačene time da su identificirane u skladu s metodom iz zahtjeva 16.

18. Proces identificiranja supstance naznačene time da inhibira aktivnost cPLA2 ili vezivanje, što podrazumijeva determiniranje interakcije između odabrane supstance i modela strukture cPLA2.

19. Proces identificiranja supstance naznačene time da prikriva aktivnost cPLA2 ili vezivanje, što podrazumijeva determiniranje interakcije između odabrane supstance i modela strukture cPLA2.

20. Metoda identificiranja inhibitora aktivnosti cPLA2 racionalnim oblikovanjem lijeka, naznačena time da omogućava: a) oblikovanje potencijalnog inhibitora koji će stvarati ne-kovalentne veze s jednom ili više amino-kiselina unutar aktivnog mjesta u cPLA2, bazirajući se na koordinatama kristalne strukture cPLA2; b) sintetiziranje inhibitora; i c) utvrđivanje činjenice da li potencijalni inhibitor zaista inhibira aktivnost cPLA2.

21. Metoda iz zahtjeva 20 naznačena time da su koordinate kristalne strukture molekule cPLA2 dobivene iz kristala cPLA2 prostorne grupe P21212 s time da je a = 153.59 angstrema, b = 95.49 angstrema, i c = 139.13 angstrema.

22. Metoda iz zahtjeva 20 naznačena time da je rečeni inhibitor oblikovan za interakciju s jednim ili više atoma rečene jedne ili više amino-kiselina u aktivnom mjestu u molekuli cPLA2, te naznačena time da je rečenih jedan ili više atoma odabrano iz grupe koja se sastoji od: CB i Oγ atoma iz Ser228; Oδ1 i Oδ2 atomi iz Asp549 i Asp575; CB, CG, CD, NE, CZ, NH1 i NH2 atomi iz Arg200, Arg413 i Arg579; Kosturni karbonilni kisik iz Asn393; Nδ2 i Oδ1 atomi iz Asn555; Atomi CD1, CE1, CG, CZ, CE2 i CD2 iz Phe397, Phe681, Phe683 i Phe199; CG, CD1, NE1, CE2, CZ2, CH2, CZ3, CE3 i CD2 iz Trp232 i Trp393; CB i Oγ atomi iz Ser557; Atomi CB i Sγ iz Cys331; Atomi OE1 i OE2 iz Glu589; Atomi CB, CG, CD, CE i NZ iz Lys588; Oγ1 atom iz Thr680; OE1 i OE2 atomi iz Glu418 i Glu422; Atomi CB, CG, SD i CE iz Met417; Atomi CB, CG, CD1 i CD2 iz Leu400 i Leu421; Atomi CB, CG1, CG2, ili CD1 iz Ile424; Kosturni NH i karbonil atomi kisika iz Ala578; i Atomi CB, CG, ND1, CE1, NE2 i CD2 iz His639.

23. Metoda utvrđivanja inhibitora vezivanja cPLA2 za membranu uz racionalno oblikovanje lijeka, naznačena time da omogućava: a) oblikovanje potencijalnog inhibitora koji će stvarati ne-kovalentne veze s jednom ili više amino-kiselina u elektrostatskoj regiji cPLA2, bazirano na koordinatama kristalne strukture cPLA2; b) sintetiziranje inhibitora; i c) determiniranje da li potencijalni inhibitor zaista inhibira vezanje cPLA2 na membranu.

24. Metoda iz zahtjeva 23 naznačena time da su koordinate kristalne strukture molekule cPLA2 dobivene iz cPLA2 kristala prostorne grupe P21212 s vrijednostima a = 153.59 angstrema, b = 95.49 angstrema i c = 139.13 angstrema.

25. Metoda iz zahtjeva 23 naznačena time da su rečene amino-kiseline odabrane iz grupe koja se sastoji od Arg467, Arg485, Lys488, Lys544 i Lys543.

26. Agonist ili antagonist naznačen time da je identificiran metodom iz zahtjeva 20.

27. Agonist ili antagonist naznačen time da je identificiran metodom iz zahtjeva 23.

28. Supstanca naznačena time da je identificirana metodom iz zahtjeva 18.

29. Supstanca naznačena time da je identificirana metodom iz zahtjeva 19.